JPH11276191A - スフィンゴ糖脂質の製造法 - Google Patents
スフィンゴ糖脂質の製造法Info
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- JPH11276191A JPH11276191A JP8839398A JP8839398A JPH11276191A JP H11276191 A JPH11276191 A JP H11276191A JP 8839398 A JP8839398 A JP 8839398A JP 8839398 A JP8839398 A JP 8839398A JP H11276191 A JPH11276191 A JP H11276191A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 糖受容体となるスフィンゴ脂質又はスフ
ィンゴ糖脂質と２以上の糖供与体とを、２種以上のスフ
ィンゴ糖脂質合成酵素を含有する脂質ベシクルの存在下
に反応させる糖受容体に２以上の糖が結合したスフィン
ゴ糖脂質の製造法。 【効果】 ２段階以上のスフィンゴ糖脂質合成酵素によ
る反応を、１ポットにより、簡便かつ効率的に行うこと
ができ、種々のスフィンゴ糖脂質を効率よく製造するこ
とができる。
ィンゴ糖脂質と２以上の糖供与体とを、２種以上のスフ
ィンゴ糖脂質合成酵素を含有する脂質ベシクルの存在下
に反応させる糖受容体に２以上の糖が結合したスフィン
ゴ糖脂質の製造法。 【効果】 ２段階以上のスフィンゴ糖脂質合成酵素によ
る反応を、１ポットにより、簡便かつ効率的に行うこと
ができ、種々のスフィンゴ糖脂質を効率よく製造するこ
とができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はスフィンゴ糖脂質の
製造法に関し、更に詳細には２種以上の糖が結合したス
フィンゴ糖脂質の効率的な製造法に関する。
製造法に関し、更に詳細には２種以上の糖が結合したス
フィンゴ糖脂質の効率的な製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】スフィンゴ糖脂質は、スフィンゴシン等
の長鎖塩基と長鎖脂肪酸と糖とが結合した複合脂質の１
種であり、下等動物から高等動物まで広く分布してお
り、動物中では細胞表層に存在し、各種の認識機構に関
与するといわれている。
の長鎖塩基と長鎖脂肪酸と糖とが結合した複合脂質の１
種であり、下等動物から高等動物まで広く分布してお
り、動物中では細胞表層に存在し、各種の認識機構に関
与するといわれている。
【０００３】かかるスフィンゴ糖脂質は、例えばＮ−ア
シルスフィンゴシンであるセラミドに種々の糖鎖が順次
結合して生合成されることが判明している。そして、当
該セラミドに代表される糖受容体と、これに反応する糖
供与体とは、これら糖受容体と糖供与体の組み合せに特
異的なスフィンゴ糖脂質合成酵素の作用により反応する
こともまた判明している。このスフィンゴ糖脂質合成酵
素としては、ガラクトシルセラミド合成酵素（セラミド
とＵＤＰ−ガラクトースとからガラクトシルセラミドを
合成する酵素）、グルコシルセラミド合成酵素（セラミ
ドとＵＤＰ−グルコースとからグルコシルセラミドを合
成する酵素）、ラクトシルセラミド合成酵素（グルコシ
ルセラミドとＵＤＰ−ガラクトースとからラクトシルセ
ラミドを合成する酵素）、等の外、ＧＤ３合成酵素、Ｇ
Ｍ２／ＧＤ２合成酵素、ＧＤ１ｂ／ＧＭ１／ＧＡ１合成
酵素等が知られている。
シルスフィンゴシンであるセラミドに種々の糖鎖が順次
結合して生合成されることが判明している。そして、当
該セラミドに代表される糖受容体と、これに反応する糖
供与体とは、これら糖受容体と糖供与体の組み合せに特
異的なスフィンゴ糖脂質合成酵素の作用により反応する
こともまた判明している。このスフィンゴ糖脂質合成酵
素としては、ガラクトシルセラミド合成酵素（セラミド
とＵＤＰ−ガラクトースとからガラクトシルセラミドを
合成する酵素）、グルコシルセラミド合成酵素（セラミ
ドとＵＤＰ−グルコースとからグルコシルセラミドを合
成する酵素）、ラクトシルセラミド合成酵素（グルコシ
ルセラミドとＵＤＰ−ガラクトースとからラクトシルセ
ラミドを合成する酵素）、等の外、ＧＤ３合成酵素、Ｇ
Ｍ２／ＧＤ２合成酵素、ＧＤ１ｂ／ＧＭ１／ＧＡ１合成
酵素等が知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】このようにスフィンゴ
糖脂質は、糖受容体及び糖供与体を原料とし、これらの
原料に特異的なスフィンゴ糖脂質合成酵素の作用によ
り、順次糖が結合していくのであるから、２以上の糖が
結合したスフィンゴ糖脂質を得るためには、糖受容体
と、２以上の糖供与体と、２種以上の対応するスフィン
ゴ糖脂質合成酵素とを作用させればいいはずである。と
ころが、このような２段階以上の酵素反応は１ポットで
は生起せず、２以上の糖が結合したスフィンゴ糖脂質を
製造するためには、１段階目の反応を行い、当該１段階
目の反応物を単離した後に２段階目の反応を行わなけれ
ばならなかった。
糖脂質は、糖受容体及び糖供与体を原料とし、これらの
原料に特異的なスフィンゴ糖脂質合成酵素の作用によ
り、順次糖が結合していくのであるから、２以上の糖が
結合したスフィンゴ糖脂質を得るためには、糖受容体
と、２以上の糖供与体と、２種以上の対応するスフィン
ゴ糖脂質合成酵素とを作用させればいいはずである。と
ころが、このような２段階以上の酵素反応は１ポットで
は生起せず、２以上の糖が結合したスフィンゴ糖脂質を
製造するためには、１段階目の反応を行い、当該１段階
目の反応物を単離した後に２段階目の反応を行わなけれ
ばならなかった。
【０００５】従って、本発明の目的は、糖受容体に２以
上の糖が結合したスフィンゴ糖脂質を、容易な操作で製
造するための方法を提供することにある。
上の糖が結合したスフィンゴ糖脂質を、容易な操作で製
造するための方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】そこで本発明者は、２段
階以上の酵素反応を途中の単離操作なしに進行させ、糖
受容体に２以上の糖が結合したスフィンゴ糖脂質を効率
良く得るべく種々検討した結果、２種以上のスフィンゴ
糖脂質合成酵素を一の脂質ベシクル中に含有させ、当該
脂質ベシクルの存在下に糖受容体と２以上の糖供与体と
を反応させれば、所望の２以上の糖が結合したスフィン
ゴ糖脂質が得られることを見出し、本発明を完成するに
至った。
階以上の酵素反応を途中の単離操作なしに進行させ、糖
受容体に２以上の糖が結合したスフィンゴ糖脂質を効率
良く得るべく種々検討した結果、２種以上のスフィンゴ
糖脂質合成酵素を一の脂質ベシクル中に含有させ、当該
脂質ベシクルの存在下に糖受容体と２以上の糖供与体と
を反応させれば、所望の２以上の糖が結合したスフィン
ゴ糖脂質が得られることを見出し、本発明を完成するに
至った。
【０００７】すなわち、本発明は、糖受容体となるスフ
ィンゴ脂質又はスフィンゴ糖脂質と２以上の糖供与体と
を、２種以上のスフィンゴ糖脂質合成酵素を含有する脂
質ベシクルの存在下に反応させることを特徴とする糖受
容体に２以上の糖が結合したスフィンゴ糖脂質の製造法
を提供するものである。
ィンゴ脂質又はスフィンゴ糖脂質と２以上の糖供与体と
を、２種以上のスフィンゴ糖脂質合成酵素を含有する脂
質ベシクルの存在下に反応させることを特徴とする糖受
容体に２以上の糖が結合したスフィンゴ糖脂質の製造法
を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明方法は、糖受容体に２以上
の糖が結合する２段階以上の酵素反応を連続して行わせ
ようとするものであり、当該反応を触媒する２種以上の
スフィンゴ糖脂質合成酵素を一の脂質ベシクル中に含有
させて用いることを特徴とする。糖受容体は、スフィン
ゴ脂質又はスフィンゴ糖脂質であり、スフィンゴ脂質と
しては、セラミド（Ｎ−アシルスフィンゴシン）、フィ
トスフィンゴシン等が挙げられる。スフィンゴ糖脂質と
しては、当該スフィンゴ脂質に糖が結合したものであ
り、ガラクトシルセラミド（Ｇａｌ−Ｃｅｒ）、ＧＭ４
（Ｓｉａ−Ｇａｌ−Ｃｅｒ）、ＳＭ４（ＨＳＯ3−Ｇａ
ｌ−Ｃｅｒ）、グルコシルセラミド（Ｇｌｃ−Ｃｅ
ｒ）、ラクトシルセラミド（Ｇａｌ−Ｇｌｃ−Ｃｅ
ｒ）、Ｇｂ３Ｃｅｒ（Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−Ｃｅ
ｒ）、ＧＭ３（Ｓｉａ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−Ｃｅｒ）、Ｇ
Ｄ３（Ｓｉａ−Ｓｉａ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−Ｃｅｒ）、Ｌ
ｃ３Ｃｅｒ（ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−Ｃｅｒ）
等が挙げられる。
の糖が結合する２段階以上の酵素反応を連続して行わせ
ようとするものであり、当該反応を触媒する２種以上の
スフィンゴ糖脂質合成酵素を一の脂質ベシクル中に含有
させて用いることを特徴とする。糖受容体は、スフィン
ゴ脂質又はスフィンゴ糖脂質であり、スフィンゴ脂質と
しては、セラミド（Ｎ−アシルスフィンゴシン）、フィ
トスフィンゴシン等が挙げられる。スフィンゴ糖脂質と
しては、当該スフィンゴ脂質に糖が結合したものであ
り、ガラクトシルセラミド（Ｇａｌ−Ｃｅｒ）、ＧＭ４
（Ｓｉａ−Ｇａｌ−Ｃｅｒ）、ＳＭ４（ＨＳＯ3−Ｇａ
ｌ−Ｃｅｒ）、グルコシルセラミド（Ｇｌｃ−Ｃｅ
ｒ）、ラクトシルセラミド（Ｇａｌ−Ｇｌｃ−Ｃｅ
ｒ）、Ｇｂ３Ｃｅｒ（Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−Ｃｅ
ｒ）、ＧＭ３（Ｓｉａ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−Ｃｅｒ）、Ｇ
Ｄ３（Ｓｉａ−Ｓｉａ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−Ｃｅｒ）、Ｌ
ｃ３Ｃｅｒ（ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−Ｃｅｒ）
等が挙げられる。
【０００９】また、糖供与体としては、糖ヌクレオチド
であれば特に制限されないが、ガラクトシルヌクレオチ
ド、グルコシルヌクレオチド、シアリルヌクレオチド、
ＧｌｃＮＡｃヌクレオチド、ＧａｌＮＡｃヌクレオチド
等が挙げられる。ここで、ヌクレオチド部としては、Ｕ
ＤＰ、ＣＭＰ、ＧＤＰ等が挙げられる。本発明において
は、これらの糖供与体の２以上が組み合せて用いられ
る。例えばグルコースとガラクトースを結合させようと
する場合、ＵＤＰ−Ｇｌｃ及びＵＤＰ−Ｇａｌが用いら
れる。
であれば特に制限されないが、ガラクトシルヌクレオチ
ド、グルコシルヌクレオチド、シアリルヌクレオチド、
ＧｌｃＮＡｃヌクレオチド、ＧａｌＮＡｃヌクレオチド
等が挙げられる。ここで、ヌクレオチド部としては、Ｕ
ＤＰ、ＣＭＰ、ＧＤＰ等が挙げられる。本発明において
は、これらの糖供与体の２以上が組み合せて用いられ
る。例えばグルコースとガラクトースを結合させようと
する場合、ＵＤＰ−Ｇｌｃ及びＵＤＰ−Ｇａｌが用いら
れる。
【００１０】また、目的物である原料糖受容体に２以上
の糖が結合したスフィンゴ糖脂質としては、少なくとも
２個以上の糖が結合したスフィンゴ糖脂質、例えばＧＭ
４、ＳＭ４、Ｌａｃ−Ｃｅｒ、Ｇｂ３Ｃｅｒ、Ｇｂ４Ｃ
ｅｒ、ＧＭ３、ＧＤ３、ＧＭ２、ＧＤ２、ＧＭ１、ＧＤ
１、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１
ｂ、ＧＴ１ｃ、ＧＱ１ｃ、ＧＡ２、ＧＡ１、Ｌｃ３Ｃｅ
ｒ、Ｌｃ４Ｃｅｒ、ｎＬｃ４Ｃｅｒ、ｎＬｃ６Ｃｅｒ等
が挙げられる。
の糖が結合したスフィンゴ糖脂質としては、少なくとも
２個以上の糖が結合したスフィンゴ糖脂質、例えばＧＭ
４、ＳＭ４、Ｌａｃ−Ｃｅｒ、Ｇｂ３Ｃｅｒ、Ｇｂ４Ｃ
ｅｒ、ＧＭ３、ＧＤ３、ＧＭ２、ＧＤ２、ＧＭ１、ＧＤ
１、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１
ｂ、ＧＴ１ｃ、ＧＱ１ｃ、ＧＡ２、ＧＡ１、Ｌｃ３Ｃｅ
ｒ、Ｌｃ４Ｃｅｒ、ｎＬｃ４Ｃｅｒ、ｎＬｃ６Ｃｅｒ等
が挙げられる。
【００１１】本発明に用いられる２種以上のスフィンゴ
糖脂質合成酵素は、２段階以上の連続して生起し得る糖
結合反応を触媒する２種以上の酵素であり、前記糖受容
体と２以上の糖供与体との組み合せにより適宜選択して
用いればよい。具体的には、ガラクトシルセラミド合成
酵素、グルコシルセラミド合成酵素、ラクトシルセラミ
ド合成酵素、ＧＤ３合成酵素、ＧＭ２／ＧＤ２合成酵
素、ＧＤ１ｂ／ＧＭ１／ＧＡ１合成酵素等の他、種々の
フコシルトランスフェラーゼ等から２種以上を選択して
用いる。
糖脂質合成酵素は、２段階以上の連続して生起し得る糖
結合反応を触媒する２種以上の酵素であり、前記糖受容
体と２以上の糖供与体との組み合せにより適宜選択して
用いればよい。具体的には、ガラクトシルセラミド合成
酵素、グルコシルセラミド合成酵素、ラクトシルセラミ
ド合成酵素、ＧＤ３合成酵素、ＧＭ２／ＧＤ２合成酵
素、ＧＤ１ｂ／ＧＭ１／ＧＡ１合成酵素等の他、種々の
フコシルトランスフェラーゼ等から２種以上を選択して
用いる。
【００１２】本発明に用いられる脂質ベシクルは、一の
脂質ベシクル中に前記２種以上のスフィンゴ糖脂質合成
酵素を含有しているものであれば特に制限されず、前記
２種以上のスフィンゴ糖脂質合成酵素を添加する以外は
通常のリポソーム等の脂質ベシクル調製法に従って調製
すればよいが、前記２種以上のスフィンゴ糖脂質合成酵
素は、脂質ベシクル中の膜の構成成分として含有せしめ
るのが望ましい。このような脂質ベシクルの調製法とし
ては、リン脂質等のベシクル形成能のある脂質、界面活
性剤及び酵素の混合ミセルから界面活性剤を除く方法が
一般的である。界面活性剤を除く方法としては透析、ゲ
ル濾過、希釈法等が挙げられる。
脂質ベシクル中に前記２種以上のスフィンゴ糖脂質合成
酵素を含有しているものであれば特に制限されず、前記
２種以上のスフィンゴ糖脂質合成酵素を添加する以外は
通常のリポソーム等の脂質ベシクル調製法に従って調製
すればよいが、前記２種以上のスフィンゴ糖脂質合成酵
素は、脂質ベシクル中の膜の構成成分として含有せしめ
るのが望ましい。このような脂質ベシクルの調製法とし
ては、リン脂質等のベシクル形成能のある脂質、界面活
性剤及び酵素の混合ミセルから界面活性剤を除く方法が
一般的である。界面活性剤を除く方法としては透析、ゲ
ル濾過、希釈法等が挙げられる。
【００１３】ここで用いられる脂質としてはレシチン
類、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミ
ン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロー
ル、ホスファチジルイノシトール、プラズマローゲン、
カルジオリピン、コレステロール等が挙げられる。ま
た、界面活性剤としては、ＣＨＡＰＳ、ＢＩＧＣＨＡ
Ｐ、コール酸ナトリウム、オクチルグルコシド等が用い
られる。
類、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミ
ン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロー
ル、ホスファチジルイノシトール、プラズマローゲン、
カルジオリピン、コレステロール等が挙げられる。ま
た、界面活性剤としては、ＣＨＡＰＳ、ＢＩＧＣＨＡ
Ｐ、コール酸ナトリウム、オクチルグルコシド等が用い
られる。
【００１４】また、本発明で用いる脂質ベシクルは、通
常のリポソームの形態でもよいが、粒子の表面を脂質で
コートした形態、磁性化無機コロイド表面を脂質膜でコ
ートした形態、ゲルマトリックスにリポソームが不動化
された形態、あるいはシリカゲルビーズ上に脂質膜が形
成された形態であってもよい。
常のリポソームの形態でもよいが、粒子の表面を脂質で
コートした形態、磁性化無機コロイド表面を脂質膜でコ
ートした形態、ゲルマトリックスにリポソームが不動化
された形態、あるいはシリカゲルビーズ上に脂質膜が形
成された形態であってもよい。
【００１５】反応は、糖受容体と、２以上の糖供与体
と、２種以上のスフィンゴ糖脂質合成酵素を含有する脂
質ベシクルとを混合し、通常の酵素反応の条件（例え
ば、２０〜５０℃）に従って行えばよい。
と、２種以上のスフィンゴ糖脂質合成酵素を含有する脂
質ベシクルとを混合し、通常の酵素反応の条件（例え
ば、２０〜５０℃）に従って行えばよい。
【００１６】反応終了後の目的物の単離は、目的スフィ
ンゴ糖脂質の性質に応じた手段で行えばよい。
ンゴ糖脂質の性質に応じた手段で行えばよい。
【００１７】以上の方法はスフィンゴ糖脂質の一種であ
るスルファチドの合成にも、供与体としてホスホアデノ
シンホスホ硫酸を、酵素の一つとして糖脂質スルホトラ
ンスフェラーゼを用いることにより応用することができ
る。
るスルファチドの合成にも、供与体としてホスホアデノ
シンホスホ硫酸を、酵素の一つとして糖脂質スルホトラ
ンスフェラーゼを用いることにより応用することができ
る。
【００１８】
【実施例】次に実施例を挙げて、本発明を更に詳細に説
明するが、本発明は何らこれに限定されるものではな
い。
明するが、本発明は何らこれに限定されるものではな
い。
【００１９】実施例１ （１）グルコシルセラミド合成酵素の調製 ラット脳のホモジェネートを８００×ｇにて１０分間遠
心した上清を１０，０００×ｇにて３０分間遠心して得
られた膜画分を０．２５Ｍ蔗糖、１mM ＤＴＴを含む１
０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、pH７．４に懸濁し、界
面活性剤ＣＨＡＰＳを加え、最終蛋白質濃度４mg／ml、
ＣＨＡＰＳ濃度３％（ｗ／ｖ）とし、４℃にて２時間攪
拌した。これを１００，０００×ｇにて６０分間遠心
し、上清を可溶化酵素とした。１％ＣＨＡＰＳを含む上
記緩衝液（０．２５Ｍ蔗糖、１mMＤＴＴを含む１０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、pH７．４）で平衡化したＤＥ
ＡＥ−トヨパールカラムに可溶化酵素溶液を添加、洗浄
した後、２５０mM ＮａＣｌを含む同緩衝液で蛋白質を
溶出した。これをグルコシルセラミド合成酵素とした。
心した上清を１０，０００×ｇにて３０分間遠心して得
られた膜画分を０．２５Ｍ蔗糖、１mM ＤＴＴを含む１
０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、pH７．４に懸濁し、界
面活性剤ＣＨＡＰＳを加え、最終蛋白質濃度４mg／ml、
ＣＨＡＰＳ濃度３％（ｗ／ｖ）とし、４℃にて２時間攪
拌した。これを１００，０００×ｇにて６０分間遠心
し、上清を可溶化酵素とした。１％ＣＨＡＰＳを含む上
記緩衝液（０．２５Ｍ蔗糖、１mMＤＴＴを含む１０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、pH７．４）で平衡化したＤＥ
ＡＥ−トヨパールカラムに可溶化酵素溶液を添加、洗浄
した後、２５０mM ＮａＣｌを含む同緩衝液で蛋白質を
溶出した。これをグルコシルセラミド合成酵素とした。
【００２０】（２）ラクトシルセラミド合成酵素の精製 ラット脳のホモジェネートの１０，０００×ｇ沈殿画分
を０．２５Ｍ蔗糖、１mM ＤＴＴを含む５０mM Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ緩衝液pH７．４に懸濁し、界面活性剤Ｔｒｉ
ｔｏｎ Ｘ−１００を加え、最終蛋白質濃度４mg／ml、
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００濃度１％（ｗ／ｖ）とし、２時
間氷中で処理した後、１００，０００×ｇにて６０分間
遠心し、上清を得た。この上清画分を可溶化酵素液とし
て下記精製過程に供した。上記可溶化酵素液にＮａＣｌ
を加え５０mMとし、サンプル液と同じ緩衝液にて平衡化
したＷＧＡ−アガロースカラムに供与し、同緩衝液にて
洗浄した後、ＧｌｃＮＡｃを２００mM含む同緩衝液で溶
出した。この溶出画分にＭｎＣｌ2を加えて１０mMと
し、サンプル液と同じ緩衝液にて平衡化したＵＤＰ−ヘ
キサノールアミンアガロースカラムに供与、洗浄後、１
mM ＵＤＰを含む同緩衝液にて酵素を溶出した。
を０．２５Ｍ蔗糖、１mM ＤＴＴを含む５０mM Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ緩衝液pH７．４に懸濁し、界面活性剤Ｔｒｉ
ｔｏｎ Ｘ−１００を加え、最終蛋白質濃度４mg／ml、
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００濃度１％（ｗ／ｖ）とし、２時
間氷中で処理した後、１００，０００×ｇにて６０分間
遠心し、上清を得た。この上清画分を可溶化酵素液とし
て下記精製過程に供した。上記可溶化酵素液にＮａＣｌ
を加え５０mMとし、サンプル液と同じ緩衝液にて平衡化
したＷＧＡ−アガロースカラムに供与し、同緩衝液にて
洗浄した後、ＧｌｃＮＡｃを２００mM含む同緩衝液で溶
出した。この溶出画分にＭｎＣｌ2を加えて１０mMと
し、サンプル液と同じ緩衝液にて平衡化したＵＤＰ−ヘ
キサノールアミンアガロースカラムに供与、洗浄後、１
mM ＵＤＰを含む同緩衝液にて酵素を溶出した。
【００２１】この溶出画分中の緩衝液をゲル濾過により
１mM ＤＴＴ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む１０
mMリン酸緩衝液pH６．８に交換した。これを同緩衝液で
平衡化したヒドロキシアパタイトカラムに供与し、活性
のある非吸着画分を集めた。この活性画分を同緩衝液で
平衡化したＭｉｎｉＱカラム（ファルマシア社製）に供
与後、界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の代
わりに１％ＣＨＡＰＳを加えた同緩衝液で洗浄した後、
ＮａＣｌの直線的濃度勾配により吸着蛋白質の溶出を行
い、塩濃度約２５０mM付近に精製酵素を得た。
１mM ＤＴＴ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む１０
mMリン酸緩衝液pH６．８に交換した。これを同緩衝液で
平衡化したヒドロキシアパタイトカラムに供与し、活性
のある非吸着画分を集めた。この活性画分を同緩衝液で
平衡化したＭｉｎｉＱカラム（ファルマシア社製）に供
与後、界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の代
わりに１％ＣＨＡＰＳを加えた同緩衝液で洗浄した後、
ＮａＣｌの直線的濃度勾配により吸着蛋白質の溶出を行
い、塩濃度約２５０mM付近に精製酵素を得た。
【００２２】（３）リン脂質ベシクルへの酵素の再構成 再構成の方法 リン脂質、界面活性剤、膜蛋白質の混合ミセルから界面
活性剤を除くことによりリン脂質ベシクルへ膜酵素を再
構成した。界面活性剤を除く方法としてセファデックス
Ｇ１００によるゲル濾過法を用いた。すなわち、１ml容
のセファデックス Ｇ−１００の小カラムを作製し、１
５０mMのＮａＣｌ、１mM ＤＴＴを含む１０mM Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌバッファーpH７．４で洗浄した。これを１０
００rpmで５分間遠心した後、１５０μｌのサンプルを
添加し再度１５００rpm で５分間遠心し、得られた濾液
を再構成サンプルとした。全ての操作は氷上、又は５℃
で行った。
活性剤を除くことによりリン脂質ベシクルへ膜酵素を再
構成した。界面活性剤を除く方法としてセファデックス
Ｇ１００によるゲル濾過法を用いた。すなわち、１ml容
のセファデックス Ｇ−１００の小カラムを作製し、１
５０mMのＮａＣｌ、１mM ＤＴＴを含む１０mM Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌバッファーpH７．４で洗浄した。これを１０
００rpmで５分間遠心した後、１５０μｌのサンプルを
添加し再度１５００rpm で５分間遠心し、得られた濾液
を再構成サンプルとした。全ての操作は氷上、又は５℃
で行った。
【００２３】再構成の際、脂質と基質濃度を保つために
サンプル５０μｌに対して１５mg／mlの大豆レシチン、
１mg／mlのセラミド（タイプ３）を含むＣＨＡＰＳ溶液
５０μｌを添加した。これに５０μｌのもう１つの酵素
サンプル又は１％ＣＨＡＰＳを含み、脂質や基質を含ま
ないバッファーを添加し再構成に供した。この脂質、基
質添加のための溶液（ＰＣ／Ｃｅｒ／ＣＨＡＰＳ液）は
以下のように作製した。１．５mlのクロロホルム：メタ
ノール２：１に溶かした１５mgの大豆レシチン（シグマ
Ｐ３６４４）、１mlのメタノールに溶かした１０mgＣＨ
ＡＰＳ、１mlのクロロホルム：メタノール＝２：１に溶
かした１mgセラミド（シグマＣ２１３７、Ｎｏｎ−ｈｙ
ｄｒｏｘｙ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｃｅｒａｍｉｄ
ｅ）を混合し、窒素ガスで溶媒を蒸発させた後、真空下
で１時間以上減圧することによりリピッドフィルムを作
製した。これを１mlの水にサスペンド、温浴で超音波処
理して得られた均一な液をＰＣ／Ｃｅｒ／ＣＨＡＰＳ液
とした。
サンプル５０μｌに対して１５mg／mlの大豆レシチン、
１mg／mlのセラミド（タイプ３）を含むＣＨＡＰＳ溶液
５０μｌを添加した。これに５０μｌのもう１つの酵素
サンプル又は１％ＣＨＡＰＳを含み、脂質や基質を含ま
ないバッファーを添加し再構成に供した。この脂質、基
質添加のための溶液（ＰＣ／Ｃｅｒ／ＣＨＡＰＳ液）は
以下のように作製した。１．５mlのクロロホルム：メタ
ノール２：１に溶かした１５mgの大豆レシチン（シグマ
Ｐ３６４４）、１mlのメタノールに溶かした１０mgＣＨ
ＡＰＳ、１mlのクロロホルム：メタノール＝２：１に溶
かした１mgセラミド（シグマＣ２１３７、Ｎｏｎ−ｈｙ
ｄｒｏｘｙ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｃｅｒａｍｉｄ
ｅ）を混合し、窒素ガスで溶媒を蒸発させた後、真空下
で１時間以上減圧することによりリピッドフィルムを作
製した。これを１mlの水にサスペンド、温浴で超音波処
理して得られた均一な液をＰＣ／Ｃｅｒ／ＣＨＡＰＳ液
とした。
【００２４】混合酵素の再構成 前記（１）及び（２）の方法により得られたグルコシル
セラミド合成酵素、ラクトシルセラミド合成酵素を混合
した後、ゲル濾過で再構成を行った。すなわち、５０μ
ｌのグルコシルセラミド合成酵素可溶化画分に５０μｌ
のラクトシルセラミド合成酵素（いずれもバッファー中
の界面活性剤はＣＨＡＰＳ）、５０μｌの１５mg／ml大
豆ＰＣ、１mg／mlセラミド（タイプ３）を含む１％ＣＨ
ＡＰＳ（ＰＣ／Ｃｅｒ／ＣＨＡＰＳ液）を加えよく混合
した後、１ml容のセファデックスＧ−１００のスピンカ
ラムによりＣＨＡＰＳを除き再構成を行った（サンプル
Ａ）。
セラミド合成酵素、ラクトシルセラミド合成酵素を混合
した後、ゲル濾過で再構成を行った。すなわち、５０μ
ｌのグルコシルセラミド合成酵素可溶化画分に５０μｌ
のラクトシルセラミド合成酵素（いずれもバッファー中
の界面活性剤はＣＨＡＰＳ）、５０μｌの１５mg／ml大
豆ＰＣ、１mg／mlセラミド（タイプ３）を含む１％ＣＨ
ＡＰＳ（ＰＣ／Ｃｅｒ／ＣＨＡＰＳ液）を加えよく混合
した後、１ml容のセファデックスＧ−１００のスピンカ
ラムによりＣＨＡＰＳを除き再構成を行った（サンプル
Ａ）。
【００２５】ラクトシルセラミド合成酵素の再構成 前記（２）の方法により得られたバッファーの界面活性
剤をＣＨＡＰＳに置換されたラクトシルセラミド合成酵
素の５０μｌに５０μｌの１％ＣＨＡＰＳ、５０μｌの
ＰＣ／Ｃｅｒ／ＣＨＡＰＳ液を加え混合した後、１ml容
のセファデックスＧ−１００のスピンカラムに添加しＣ
ＨＡＰＳを除き再構成を行った（サンプルＢ）。
剤をＣＨＡＰＳに置換されたラクトシルセラミド合成酵
素の５０μｌに５０μｌの１％ＣＨＡＰＳ、５０μｌの
ＰＣ／Ｃｅｒ／ＣＨＡＰＳ液を加え混合した後、１ml容
のセファデックスＧ−１００のスピンカラムに添加しＣ
ＨＡＰＳを除き再構成を行った（サンプルＢ）。
【００２６】グルコシルセラミド合成酵素の再構成 前記（１）の方法で得られた５０μｌのグルコシルセラ
ミド合成酵素可溶化画分に５０μｌの１％ＣＨＡＰＳ、
５０μｌのＰＣ／Ｃｅｒ／ＣＨＡＰＳ液を加え混合した
後、１ml容のセファデックスＧ−１００のスピンカラム
に添加しＣＨＡＰＳを除き再構成を行った（サンプル
Ｃ）。
ミド合成酵素可溶化画分に５０μｌの１％ＣＨＡＰＳ、
５０μｌのＰＣ／Ｃｅｒ／ＣＨＡＰＳ液を加え混合した
後、１ml容のセファデックスＧ−１００のスピンカラム
に添加しＣＨＡＰＳを除き再構成を行った（サンプル
Ｃ）。
【００２７】（４）酵素反応 それぞれの酵素及び、２段階酵素反応は以下のように別
々な反応系で行った。混合ミセル系では界面活性剤を加
えて、また、再構成酵素の系では界面活性剤を加えずに
反応を行った。
々な反応系で行った。混合ミセル系では界面活性剤を加
えて、また、再構成酵素の系では界面活性剤を加えずに
反応を行った。
【００２８】再構成グルコシルセラミド合成酵素の活
性 この反応は界面活性剤非存在下で行った。１アッセイに
つき１０μｌの０．５Ｍ ＭＥＳ pH６．４（５０mM
ＭｎＣｌ2 、２５mM ＭｇＣｌ2 、５０mM ＤＴＴを含
む）及び、水５０μｌを混合した反応液に再構成サンプ
ル（サンプルＣ）を１５μｌ、〔14Ｃ〕ＵＤＰ−Ｇｌｕ
２５μｌを添加し３７℃、３０分反応を行った。
性 この反応は界面活性剤非存在下で行った。１アッセイに
つき１０μｌの０．５Ｍ ＭＥＳ pH６．４（５０mM
ＭｎＣｌ2 、２５mM ＭｇＣｌ2 、５０mM ＤＴＴを含
む）及び、水５０μｌを混合した反応液に再構成サンプ
ル（サンプルＣ）を１５μｌ、〔14Ｃ〕ＵＤＰ−Ｇｌｕ
２５μｌを添加し３７℃、３０分反応を行った。
【００２９】再構成ラクトシルセラミド合成酵素の活
性 この反応は界面活性剤非存在下で行った。１アッセイに
つき２０μｌの１Ｍカコジル酸バッファー pH７．２、
５μｌの２００mM ＭｇＣｌ2 、更に、１５mg／mlのＤ
ＯＰＣを１０μｌ、７５mM ＣＤＰコリンを１０μｌ添
加、攪拌し、基質液とした。これにサンプルＢ１５μ
ｌ、水１５μｌ、〔14Ｃ〕ＵＤＰ−Ｇａｌ２５μｌを添
加し３７℃、３０分反応を行った。
性 この反応は界面活性剤非存在下で行った。１アッセイに
つき２０μｌの１Ｍカコジル酸バッファー pH７．２、
５μｌの２００mM ＭｇＣｌ2 、更に、１５mg／mlのＤ
ＯＰＣを１０μｌ、７５mM ＣＤＰコリンを１０μｌ添
加、攪拌し、基質液とした。これにサンプルＢ１５μ
ｌ、水１５μｌ、〔14Ｃ〕ＵＤＰ−Ｇａｌ２５μｌを添
加し３７℃、３０分反応を行った。
【００３０】２段階反応 ａ．サンプルＡの反応 ２つの酵素を混合した後、リン脂質ベシクルに再構成し
たサンプルＡを用いた２段階反応の測定は以下のように
行った。すなわち、１アッセイにつき１０μｌの０．５
Ｍ ＭＥＳ pH６．４（５０mM ＭｎＣｌ2 、２５mM
ＭｇＣｌ2 、５０mM ＤＴＴを含む）及び、５μｌの５
mM ＵＤＰ−Ｇａｌ（非標識）、３０μｌの水を混合し
た反応液にサンプルＡを２５μｌ、水５μｌ、〔14Ｃ〕
ＵＤＰ−Ｇｌｃ ２５μｌを添加し３７℃、３０分、１
時間、２時間、４時間反応を行った。
たサンプルＡを用いた２段階反応の測定は以下のように
行った。すなわち、１アッセイにつき１０μｌの０．５
Ｍ ＭＥＳ pH６．４（５０mM ＭｎＣｌ2 、２５mM
ＭｇＣｌ2 、５０mM ＤＴＴを含む）及び、５μｌの５
mM ＵＤＰ−Ｇａｌ（非標識）、３０μｌの水を混合し
た反応液にサンプルＡを２５μｌ、水５μｌ、〔14Ｃ〕
ＵＤＰ−Ｇｌｃ ２５μｌを添加し３７℃、３０分、１
時間、２時間、４時間反応を行った。
【００３１】ｂ．サンプルＢとサンプルＣの混合物の反
応 コントロール実験として、２つの酵素をそれぞれ別々に
再構成したサンプルＢ及びサンプルＣを混合して２段階
反応が行われるか否かを検討した。上記ａ．の測定系で
はサンプルＡの代わりにサンプルＢを、水の代わりにサ
ンプルＣを添加し同様に反応を行った。すなわち、１ア
ッセイにつき１０μｌの０．５Ｍ ＭＥＳ pH６．４
（５０mM ＭｎＣｌ2 、２５mM ＭｇＣｌ2 、５０mM
ＤＴＴを含む）及び、５μｌの５mM ＵＤＰ−Ｇａｌ
（非標識）を混合した反応液にサンプルＢ２５μｌ、サ
ンプルＣ２５μｌ、水１０μｌ、〔14Ｃ〕ＵＤＰ−Ｇｌ
ｃ ２５μｌを添加し３７℃、３０分、１時間、２時
間、４時間反応を行った。２段階反応では、生成したグ
ルコシルセラミド、ラクトシルセラミドをＴＬＣで分離
（クロロホルム：メタノール：水＝６５：２５：４で展
開）して各々のバンドを定量した。
応 コントロール実験として、２つの酵素をそれぞれ別々に
再構成したサンプルＢ及びサンプルＣを混合して２段階
反応が行われるか否かを検討した。上記ａ．の測定系で
はサンプルＡの代わりにサンプルＢを、水の代わりにサ
ンプルＣを添加し同様に反応を行った。すなわち、１ア
ッセイにつき１０μｌの０．５Ｍ ＭＥＳ pH６．４
（５０mM ＭｎＣｌ2 、２５mM ＭｇＣｌ2 、５０mM
ＤＴＴを含む）及び、５μｌの５mM ＵＤＰ−Ｇａｌ
（非標識）を混合した反応液にサンプルＢ２５μｌ、サ
ンプルＣ２５μｌ、水１０μｌ、〔14Ｃ〕ＵＤＰ−Ｇｌ
ｃ ２５μｌを添加し３７℃、３０分、１時間、２時
間、４時間反応を行った。２段階反応では、生成したグ
ルコシルセラミド、ラクトシルセラミドをＴＬＣで分離
（クロロホルム：メタノール：水＝６５：２５：４で展
開）して各々のバンドを定量した。
【００３２】（５）結果 再構成グルコシルセラミド合成酵素の活性 サンプルＣをＣＨＡＰＳを含まない系で活性測定を行っ
た。グルコシルセラミド合成酵素に大豆レシチンと基質
のセラミドを添加して再構成したサンプルＣのグルコシ
ルセラミド合成酵素の比活性は１０〜２０pmol／mg／mi
nであった。１mlの酵素液当りの活性は５〜１０pmol／n
imであった。
た。グルコシルセラミド合成酵素に大豆レシチンと基質
のセラミドを添加して再構成したサンプルＣのグルコシ
ルセラミド合成酵素の比活性は１０〜２０pmol／mg／mi
nであった。１mlの酵素液当りの活性は５〜１０pmol／n
imであった。
【００３３】ラクトシルセラミド合成酵素 ラット脳から精製したラクトシルセラミド合成酵素とグ
ルコシルセラミド合成酵素を混合して再構成したサンプ
ルＡ、ラクトシルセラミド合成酵素だけを再構成したサ
ンプルＢ中のラクトシルセラミド合成酵素活性はそれぞ
れ６．８、６．０pmol／min／mlであった。
ルコシルセラミド合成酵素を混合して再構成したサンプ
ルＡ、ラクトシルセラミド合成酵素だけを再構成したサ
ンプルＢ中のラクトシルセラミド合成酵素活性はそれぞ
れ６．８、６．０pmol／min／mlであった。
【００３４】２段階反応 ２つの酵素を界面活性剤存在下で混合した後、界面活性
剤を除去し、リン脂質ベシクルに再構成したサンプルＡ
はサンプルＢ、Ｃの混合サンプルと比べ、同一脂質ベシ
クルにグルコシルセラミド合成酵素、ラクトシルセラミ
ド合成酵素の２つの酵素が存在する確立が高いと考えら
れる。このサンプルＡには１段階目の基質であるセラミ
ドが含まれているが、これに14ＣラベルＵＤＰ−Ｇｌｃ
と２段階目の反応の基質である（非標識）ＵＤＰ−Ｇａ
ｌを添加して行った反応では３０分、１時間、２時間、
４時間と、時間の経過と共にラクトシルセラミドの生成
量が増加した（図１サンプルＡ）。これに対して、２つ
の酵素をそれぞれ別々に再構成したサンプルＢ及びサン
プルＣの混合サンプルで同様に反応を行った場合、全く
ラクトシルセラミドの生成は認められなかった（図１サ
ンプルＢ＋Ｃ）。以上の結果から、２つ以上の膜酵素に
よる２段階反応は２つ以上の酵素が同一の脂質ベシクル
上に存在することが必須であることが判明した。
剤を除去し、リン脂質ベシクルに再構成したサンプルＡ
はサンプルＢ、Ｃの混合サンプルと比べ、同一脂質ベシ
クルにグルコシルセラミド合成酵素、ラクトシルセラミ
ド合成酵素の２つの酵素が存在する確立が高いと考えら
れる。このサンプルＡには１段階目の基質であるセラミ
ドが含まれているが、これに14ＣラベルＵＤＰ−Ｇｌｃ
と２段階目の反応の基質である（非標識）ＵＤＰ−Ｇａ
ｌを添加して行った反応では３０分、１時間、２時間、
４時間と、時間の経過と共にラクトシルセラミドの生成
量が増加した（図１サンプルＡ）。これに対して、２つ
の酵素をそれぞれ別々に再構成したサンプルＢ及びサン
プルＣの混合サンプルで同様に反応を行った場合、全く
ラクトシルセラミドの生成は認められなかった（図１サ
ンプルＢ＋Ｃ）。以上の結果から、２つ以上の膜酵素に
よる２段階反応は２つ以上の酵素が同一の脂質ベシクル
上に存在することが必須であることが判明した。
【００３５】
【発明の効果】本発明によれば２段階以上のスフィンゴ
糖脂質合成酵素による反応を、１ポットにより、簡便か
つ効率的に行うことができ、種々のスフィンゴ糖脂質を
効率よく製造することができる。
糖脂質合成酵素による反応を、１ポットにより、簡便か
つ効率的に行うことができ、種々のスフィンゴ糖脂質を
効率よく製造することができる。
【図１】２段階反応による反応量を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 瀧澤 稔 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 (72)発明者 吉塚 直伸 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内
Claims (1)
- 【請求項１】 糖受容体となるスフィンゴ脂質又はスフ
ィンゴ糖脂質と２以上の糖供与体とを、２種以上のスフ
ィンゴ糖脂質合成酵素を含有する脂質ベシクルの存在下
に反応させることを特徴とする糖受容体に２以上の糖が
結合したスフィンゴ糖脂質の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP08839398A JP3545595B2 (ja) | 1998-04-01 | 1998-04-01 | スフィンゴ糖脂質の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP08839398A JP3545595B2 (ja) | 1998-04-01 | 1998-04-01 | スフィンゴ糖脂質の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11276191A true JPH11276191A (ja) | 1999-10-12 |
| JP3545595B2 JP3545595B2 (ja) | 2004-07-21 |
Family
ID=13941562
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP08839398A Expired - Fee Related JP3545595B2 (ja) | 1998-04-01 | 1998-04-01 | スフィンゴ糖脂質の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3545595B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8324283B2 (en) | 2003-04-08 | 2012-12-04 | Novartis Ag | Solid pharmaceutical compositions comprising a SIP receptor agonist and a sugar alcohol |
-
1998
- 1998-04-01 JP JP08839398A patent/JP3545595B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8324283B2 (en) | 2003-04-08 | 2012-12-04 | Novartis Ag | Solid pharmaceutical compositions comprising a SIP receptor agonist and a sugar alcohol |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3545595B2 (ja) | 2004-07-21 |
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