JPH11285400A - ド―パミンリセプタ―及び遺伝子 - Google Patents
ド―パミンリセプタ―及び遺伝子Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 哺乳類Ｄ2 ドパミンレセプターの生物活性を
有するポリペプチドをコードする核酸配列の存在を検出
するためのオリゴヌクレオチドを提供し、さらに哺乳類
Ｄ2 ドパミンレセプターの抗原決定基を規定するアミノ
酸配列を同定する。 【解決手段】 前記プローブはラットまたはヒト起源の
Ｄ2 ドパミンレセプターをコードするｃＤＮＡの膜横断
領域と同一もしくは対応する配列を有するＤＮＡ分子、
またはそれに相補的なＤＮＡ分子へハイブリダイズする
オリゴヌクレオチドを含む。哺乳類Ｄ2 ドパミンレセプ
ターの抗原決定基を規定するフラグメントはラットまた
はヒト起源のＤ2 ドパミンレセプターの第３の細胞質ル
ープを含むアミノ酸配列のフラグメントに存在する。
有するポリペプチドをコードする核酸配列の存在を検出
するためのオリゴヌクレオチドを提供し、さらに哺乳類
Ｄ2 ドパミンレセプターの抗原決定基を規定するアミノ
酸配列を同定する。 【解決手段】 前記プローブはラットまたはヒト起源の
Ｄ2 ドパミンレセプターをコードするｃＤＮＡの膜横断
領域と同一もしくは対応する配列を有するＤＮＡ分子、
またはそれに相補的なＤＮＡ分子へハイブリダイズする
オリゴヌクレオチドを含む。哺乳類Ｄ2 ドパミンレセプ
ターの抗原決定基を規定するフラグメントはラットまた
はヒト起源のＤ2 ドパミンレセプターの第３の細胞質ル
ープを含むアミノ酸配列のフラグメントに存在する。
Description
【０００１】発明の背景 本発明は哺乳類からのドーパミンリセプター及びそれに
対応する遺伝子に関する。特に、本発明はＤ2 ドーパミ
ンリセプター遺伝子の単離、配列及び／又はクローニン
グ、変換細胞によるＤ2 ドーパミンリセプターの合成及
びドーパミンリセプターをコードするＤＮＡの同定及び
クローニングにより可能となる新規の産物の製造及び使
用に関する。
対応する遺伝子に関する。特に、本発明はＤ2 ドーパミ
ンリセプター遺伝子の単離、配列及び／又はクローニン
グ、変換細胞によるＤ2 ドーパミンリセプターの合成及
びドーパミンリセプターをコードするＤＮＡの同定及び
クローニングにより可能となる新規の産物の製造及び使
用に関する。
【０００２】ドーパミンリセプターは一般に非常に多く
の神経学的及び他の異常−例えば運動異常、精神分裂、
薬物依存、パーキンソン氏病、トゥレット症候群、晩発
性運動障害及びその他多く−に関与している。その結
果、ドーパミンリセプターは多くの薬理学的及び生化学
的研究の対象となってきた。
の神経学的及び他の異常−例えば運動異常、精神分裂、
薬物依存、パーキンソン氏病、トゥレット症候群、晩発
性運動障害及びその他多く−に関与している。その結
果、ドーパミンリセプターは多くの薬理学的及び生化学
的研究の対象となってきた。
【０００３】一般に、ドーパミンリセプターは、薬理学
的及び生化学的特徴に基づいてＤ1及びＤ2 のサブタイ
プに分類される（１，２）。Ｄ2 ドーパミンリセプター
は病理生理学及び上記の異常に関連づけられてきた。加
えて、Ｄ2 ドーパミンリセプターは第２のメッセンジャ
ー系を調節するためにグアニジンヌクレオチド結合蛋白
質と相互作用することが知られている（６，７）。
的及び生化学的特徴に基づいてＤ1及びＤ2 のサブタイ
プに分類される（１，２）。Ｄ2 ドーパミンリセプター
は病理生理学及び上記の異常に関連づけられてきた。加
えて、Ｄ2 ドーパミンリセプターは第２のメッセンジャ
ー系を調節するためにグアニジンヌクレオチド結合蛋白
質と相互作用することが知られている（６，７）。
【０００４】ドーパミンリセプター及びその遺伝子の存
在及び性質の解明について力点がおかれていたにも拘わ
らず、同定、単離、およびクローニングはこれまでなし
えなかった。Ｇリセプターと結合する類縁のリセプター
が、一次アミノ酸配列においてかなりの類似性を示し７
個の推定上の膜横断領域（８）よりなると予測される構
造形態を呈するということが知られているにもかかわら
ずそうであった。セロトニンリセプターに関しては、例
えば、Ｊｕｌｉｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，
２４１：５５８（１９８８）を参照のこと。
在及び性質の解明について力点がおかれていたにも拘わ
らず、同定、単離、およびクローニングはこれまでなし
えなかった。Ｇリセプターと結合する類縁のリセプター
が、一次アミノ酸配列においてかなりの類似性を示し７
個の推定上の膜横断領域（８）よりなると予測される構
造形態を呈するということが知られているにもかかわら
ずそうであった。セロトニンリセプターに関しては、例
えば、Ｊｕｌｉｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，
２４１：５５８（１９８８）を参照のこと。
【０００５】発明の概要 本発明は成功裏に人類を含む哺乳類のＤ2 ドーパミンリ
セプター遺伝子配列を同定し、単離し、クローン化しコ
ード化されたドーパミンリセプターを製造した。対応す
るポリペプチドが合成された。遺伝子とポリペプチド双
方の配列が決定された。本発明はまた、多くの新規で有
用な核酸、細胞ライン、ベクター、及びポリペプチド及
びとりわけ医薬品、並びにそれらを使用する方法を提供
する。
セプター遺伝子配列を同定し、単離し、クローン化しコ
ード化されたドーパミンリセプターを製造した。対応す
るポリペプチドが合成された。遺伝子とポリペプチド双
方の配列が決定された。本発明はまた、多くの新規で有
用な核酸、細胞ライン、ベクター、及びポリペプチド及
びとりわけ医薬品、並びにそれらを使用する方法を提供
する。
【０００６】このように、本発明はＤＮＡ配列─その同
定された部分は構造遺伝子であり哺乳類Ｄ2 ドーパミン
リセプターの生物学的活性を有するポリペプチドをコー
ドしている─の単離に関する。特にそれは、哺乳類Ｄ2
ドーパミンリセプターをコードするＤＮＡ配列にハイブ
リッドされる単離されたＤＮＡ配列に関する。それはま
た、特に哺乳類のドーパミンリセプターの生物学的活性
を有するポリペプチド、特に哺乳類Ｄ2 ドーパミンリセ
プター、をもコードするそのような配列のフラグメン
ト、変種及び突然変異体に関する。好ましくは、ヒトの
ドーパミンリセプターである。他に好ましくは、その配
列は図１ないし図７に示したようにラットのＤ2 ドーパ
ミンリセプターである。無論、本発明の核酸はまた、前
記の相補的ストランド、並びにコドンの変性による異な
った配列及び前記の配列とハイブリッドした配列をも含
むものである。
定された部分は構造遺伝子であり哺乳類Ｄ2 ドーパミン
リセプターの生物学的活性を有するポリペプチドをコー
ドしている─の単離に関する。特にそれは、哺乳類Ｄ2
ドーパミンリセプターをコードするＤＮＡ配列にハイブ
リッドされる単離されたＤＮＡ配列に関する。それはま
た、特に哺乳類のドーパミンリセプターの生物学的活性
を有するポリペプチド、特に哺乳類Ｄ2 ドーパミンリセ
プター、をもコードするそのような配列のフラグメン
ト、変種及び突然変異体に関する。好ましくは、ヒトの
ドーパミンリセプターである。他に好ましくは、その配
列は図１ないし図７に示したようにラットのＤ2 ドーパ
ミンリセプターである。無論、本発明の核酸はまた、前
記の相補的ストランド、並びにコドンの変性による異な
った配列及び前記の配列とハイブリッドした配列をも含
むものである。
【０００７】他に好ましくは、本発明は好ましくは放射
性又はビオチン標識等の検出し得る部分で標識した、オ
リゴヌクレオチドのプローブとして有用な核酸配列及び
フラグメントを含む。例えば、そのようなプローブは、
Ｄ2 ドーパミンリセプターの生物学的活性を有するポリ
ペプチドをコードするＤＮＡと又はそれに関連した例え
ば、Ｄ2 ドーパミンリセプター遺伝子若しくはそのイン
トロンの制御を提供するＤＮＡ等のＤＮＡとハイブリッ
ドさせることができる。本発明のＤＮＡはまたベクター
の部分であることもできる。
性又はビオチン標識等の検出し得る部分で標識した、オ
リゴヌクレオチドのプローブとして有用な核酸配列及び
フラグメントを含む。例えば、そのようなプローブは、
Ｄ2 ドーパミンリセプターの生物学的活性を有するポリ
ペプチドをコードするＤＮＡと又はそれに関連した例え
ば、Ｄ2 ドーパミンリセプター遺伝子若しくはそのイン
トロンの制御を提供するＤＮＡ等のＤＮＡとハイブリッ
ドさせることができる。本発明のＤＮＡはまたベクター
の部分であることもできる。
【０００８】本発明はまた、本発明のベクターで形質転
換される細胞及びこれらの細胞をポリペプチド─例えば
Ｄ2 ドーパミンリセプターの生物学的活性を有するもの
─を製造するために培養する方法をも含む。好ましく
は、該細胞はそのような方法に用いる場合には哺乳類起
源のものである。
換される細胞及びこれらの細胞をポリペプチド─例えば
Ｄ2 ドーパミンリセプターの生物学的活性を有するもの
─を製造するために培養する方法をも含む。好ましく
は、該細胞はそのような方法に用いる場合には哺乳類起
源のものである。
【０００９】本発明はまた、前記の核酸配列によりコー
ドされるポリペプチド、特に単離された哺乳類のドーパ
ミンリセプター─好ましくはヒト起源のもの─に関す
る。本発明は更に、かかるリセプターの突然変異体又は
変種、好ましくはリセプターから１又はより多くのアミ
ノ酸が置換され、挿入され及び／又は除去されたもの、
特にドーパミンリセプターの生物学的活性を保持してい
る突然変異体にも関する。本発明はまた、抗体であっ
て、好ましくは標識され、そして最も好ましくはモノク
ローナルであり、ドーパミンリセプター─好ましくはヒ
トのものである─のアミノ酸配列に結合することができ
るもの又はかかる抗体のフラグメントにも関する。
ドされるポリペプチド、特に単離された哺乳類のドーパ
ミンリセプター─好ましくはヒト起源のもの─に関す
る。本発明は更に、かかるリセプターの突然変異体又は
変種、好ましくはリセプターから１又はより多くのアミ
ノ酸が置換され、挿入され及び／又は除去されたもの、
特にドーパミンリセプターの生物学的活性を保持してい
る突然変異体にも関する。本発明はまた、抗体であっ
て、好ましくは標識され、そして最も好ましくはモノク
ローナルであり、ドーパミンリセプター─好ましくはヒ
トのものである─のアミノ酸配列に結合することができ
るもの又はかかる抗体のフラグメントにも関する。
【００１０】本発明は、上記の種々の産物の一、及び、
典型的には、薬剤学的に許容し得る担体を含んでなる組
成物に関し、並びに広範囲の効用のある結果を達成する
ためにこれらの産物を使用する方法にも関する。
典型的には、薬剤学的に許容し得る担体を含んでなる組
成物に関し、並びに広範囲の効用のある結果を達成する
ためにこれらの産物を使用する方法にも関する。
【００１１】図面の簡単な説明 本発明の種々の他の目的、態様及び付随する利点は、添
付の図面と連結して考慮され一層よく理解されるときに
一層完全に認識されるであろう。図において、図１ない
し図７は、ＲＧＢ2 ｃＤＮＡのための核酸配列及びそれ
から導かれるラットのＤ2 ドーパミンリセプターのアミ
ノ酸配列を示す。該核酸配列は、長い開環読み取りフレ
ームの第１のメチオニンに始まる番号を付与されてい
る。ヌクレオチド番号は、各行の右手末端におけるヌク
レオチド配列の下に現れている。導かれるアミノ酸配列
はヌクレオチド配列の上に示されている。二重下線は、
５’非翻訳領域における小さい開環読み取りフレームを
表す。仮定されるＮ−結合グリコシル化部位は、アスタ
リスクにより示されている。推定されるプロテインキナ
ーゼＡリン酸化部位にはその上に線を引いてある。イン
トロンの繋ぎ接合は矢印で示されている。ポリＡアデニ
ル化部位は下線が施されている。
付の図面と連結して考慮され一層よく理解されるときに
一層完全に認識されるであろう。図において、図１ない
し図７は、ＲＧＢ2 ｃＤＮＡのための核酸配列及びそれ
から導かれるラットのＤ2 ドーパミンリセプターのアミ
ノ酸配列を示す。該核酸配列は、長い開環読み取りフレ
ームの第１のメチオニンに始まる番号を付与されてい
る。ヌクレオチド番号は、各行の右手末端におけるヌク
レオチド配列の下に現れている。導かれるアミノ酸配列
はヌクレオチド配列の上に示されている。二重下線は、
５’非翻訳領域における小さい開環読み取りフレームを
表す。仮定されるＮ−結合グリコシル化部位は、アスタ
リスクにより示されている。推定されるプロテインキナ
ーゼＡリン酸化部位にはその上に線を引いてある。イン
トロンの繋ぎ接合は矢印で示されている。ポリＡアデニ
ル化部位は下線が施されている。
【００１２】図８は、ラットＤ2 ドーパミンリセプタ
ー、ハムスターβ2 −アドレナリンリセプター、ヒトα
2 −アドレナリンリセプター、ヒトＧ−２１（セロトニ
ン１ａ）リセプター、ブタのムスカリンＭリセプター及
び牛のサブスタンスＫリセプターのアミノ酸配列の並び
を示す。実線で囲み陰を付けたアミノ酸は、Ｄ2 ドーパ
ミンリセプターと比較したとき少なくとも２つの他の配
列において同一である残基を示している。推定される膜
横断ドメインはメインはローマ数字で標識した括弧で示
されている。変化しうる第３の細胞質ループ内の及びＣ
末端における残基の数は括弧に入れてある。
ー、ハムスターβ2 −アドレナリンリセプター、ヒトα
2 −アドレナリンリセプター、ヒトＧ−２１（セロトニ
ン１ａ）リセプター、ブタのムスカリンＭリセプター及
び牛のサブスタンスＫリセプターのアミノ酸配列の並び
を示す。実線で囲み陰を付けたアミノ酸は、Ｄ2 ドーパ
ミンリセプターと比較したとき少なくとも２つの他の配
列において同一である残基を示している。推定される膜
横断ドメインはメインはローマ数字で標識した括弧で示
されている。変化しうる第３の細胞質ループ内の及びＣ
末端における残基の数は括弧に入れてある。
【００１３】図９は、ラットの脳及び下垂体におけるＲ
ＧＢ−２トランスクリプトのＮｏｔｈｅｒｎブロット分
析を示す。各レーンは２０μｇの全ＲＮＡを含有する。
右の数字は、ＲＮＡサイズ標識（ＢＲＬ）で測定した分
子量を示す。Ａ：臭球、Ｂ：海馬、Ｃ：小脳、Ｄ：口部
皮質、Ｅ：前部皮質、Ｆ：視床、Ｇ：視床下部、Ｈ：髄
質、Ｉ：扁桃体、Ｊ：中脳、Ｋ：中隔、Ｌ：後部基底神
経節、Ｍ：前部基底神経節、Ｎ：下垂体神経性中葉、
Ｏ：下垂体前葉
ＧＢ−２トランスクリプトのＮｏｔｈｅｒｎブロット分
析を示す。各レーンは２０μｇの全ＲＮＡを含有する。
右の数字は、ＲＮＡサイズ標識（ＢＲＬ）で測定した分
子量を示す。Ａ：臭球、Ｂ：海馬、Ｃ：小脳、Ｄ：口部
皮質、Ｅ：前部皮質、Ｆ：視床、Ｇ：視床下部、Ｈ：髄
質、Ｉ：扁桃体、Ｊ：中脳、Ｋ：中隔、Ｌ：後部基底神
経節、Ｍ：前部基底神経節、Ｎ：下垂体神経性中葉、
Ｏ：下垂体前葉
【００１４】図１０〜１３は、Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１
細胞からの膜に対する 3Ｈ−スピペロンの結合を示す。
細胞からの膜に対する 3Ｈ−スピペロンの結合を示す。
【００１５】ａ）１：Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１細胞及び
ラット線条体から調製された膜に対する 3Ｈ−スピペロ
ンの特異的結合を飽和等温線。４つの独立した実験から
の結果を示す。（図１０）２：データのスカッチャード
分析。（図１１） ｂ）Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１膜を用いた競合曲線。Ｌ−
ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１細胞からの膜における 3Ｈ−スピペ
ロンの特異的結合の薬物による阻害を求めるための代表
的な曲線を示す。各薬物は３回試験した。（図１２） ｃ）Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１及びラット線条体に対する
Ｋｉの表。結果は、種々の濃度の非標識薬物で０．５ｎ
Ｍの 3Ｈ−スピペロンを阻害した３つの実験の幾何平均
である。いくつかの薬物にあっては、ラット線条体組織
における阻害曲線は、２つのクラスの結合部位の存在を
想定することによって最もよく当てはまった。阻害剤に
対する高い又は低い親和性を有する結合部位の比率は括
弧に示した。１０乃至２５％の特異的結合を示す結合部
位クラスについてのＫｉ値は、放射性リガンドがＫｄ値
１ｎＭでセロトニンリセプターに結合しているという仮
定のもとに算定した。（図１３）
ラット線条体から調製された膜に対する 3Ｈ−スピペロ
ンの特異的結合を飽和等温線。４つの独立した実験から
の結果を示す。（図１０）２：データのスカッチャード
分析。（図１１） ｂ）Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１膜を用いた競合曲線。Ｌ−
ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１細胞からの膜における 3Ｈ−スピペ
ロンの特異的結合の薬物による阻害を求めるための代表
的な曲線を示す。各薬物は３回試験した。（図１２） ｃ）Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１及びラット線条体に対する
Ｋｉの表。結果は、種々の濃度の非標識薬物で０．５ｎ
Ｍの 3Ｈ−スピペロンを阻害した３つの実験の幾何平均
である。いくつかの薬物にあっては、ラット線条体組織
における阻害曲線は、２つのクラスの結合部位の存在を
想定することによって最もよく当てはまった。阻害剤に
対する高い又は低い親和性を有する結合部位の比率は括
弧に示した。１０乃至２５％の特異的結合を示す結合部
位クラスについてのＫｉ値は、放射性リガンドがＫｄ値
１ｎＭでセロトニンリセプターに結合しているという仮
定のもとに算定した。（図１３）
【００１６】図１４は、図１〜７に示したアミノ酸配列
び疎水性プロット、図１５はβ2 −アドレナリンリセプ
ターのアミノ酸配列の疎水性プロットを示す。膜横断領
域はローマ数字で印を付してある。
び疎水性プロット、図１５はβ2 −アドレナリンリセプ
ターのアミノ酸配列の疎水性プロットを示す。膜横断領
域はローマ数字で印を付してある。
【００１７】図１６〜２０は、図１〜７に示した核酸配
列の２４７７塩基ＥｃｏＲＩフラグメントの計算された
制限地図である。
列の２４７７塩基ＥｃｏＲＩフラグメントの計算された
制限地図である。
【００１８】図２１〜２３は、ヒトＤ2 ドーパミンリセ
プターの部分的配列を示し、示された中央のアミノ酸配
列は正しいものである。
プターの部分的配列を示し、示された中央のアミノ酸配
列は正しいものである。
【００１９】図２４は、ＬＺＲ１及びＬＺＲ２細胞に対
する特異的な〔 3Ｈ〕スピペロン結合の飽和分析を示
す。結果は、示してあるように、対照成長培養液または
硫酸亜鉛を加えた培養液においてＬＺＲ１及びＬＺＲ２
細胞を成長させた代表的な実験からのものである。デー
タは、特異的に結合した放射性リガンドを遊離の放射性
リガンドの補正した濃度で割った値を、特異的に結合し
た放射性リガンドに対してプロットしたものである。亜
鉛処理のためには、成長培養液に１００μＭの硫酸亜鉛
を１６時間加えた。対照細胞と亜鉛処理細胞の双方を、
次いで洗浄しそして集める前に対照培養液で１日間成長
させた。示した実験においては、対照のＬＺＲ１細胞又
は亜鉛で処理したＬＺＲ１細胞についての、非線型回帰
分析で決定したＢｍａｘ値は、それぞれ８７６及び９１
４ｆｍｏｌ／ｍｇ蛋白質であった。対照の又は亜鉛処理
したＬＲＺ２細胞のＢｍａｘ値は、それぞれ３８５及び
５９３ｆｍｏｌ／ｍｇ蛋白質であった。
する特異的な〔 3Ｈ〕スピペロン結合の飽和分析を示
す。結果は、示してあるように、対照成長培養液または
硫酸亜鉛を加えた培養液においてＬＺＲ１及びＬＺＲ２
細胞を成長させた代表的な実験からのものである。デー
タは、特異的に結合した放射性リガンドを遊離の放射性
リガンドの補正した濃度で割った値を、特異的に結合し
た放射性リガンドに対してプロットしたものである。亜
鉛処理のためには、成長培養液に１００μＭの硫酸亜鉛
を１６時間加えた。対照細胞と亜鉛処理細胞の双方を、
次いで洗浄しそして集める前に対照培養液で１日間成長
させた。示した実験においては、対照のＬＺＲ１細胞又
は亜鉛で処理したＬＺＲ１細胞についての、非線型回帰
分析で決定したＢｍａｘ値は、それぞれ８７６及び９１
４ｆｍｏｌ／ｍｇ蛋白質であった。対照の又は亜鉛処理
したＬＲＺ２細胞のＢｍａｘ値は、それぞれ３８５及び
５９３ｆｍｏｌ／ｍｇ蛋白質であった。
【００２０】図２５〜２６は、アゴニストによる放射性
リガンドの結合の阻害を示す。結果は、競合薬物の不存
在下での特異的結合のパーセントとして表した特異的結
合を、競合薬物の濃度の対数に対してプロットしたもの
である。膜は、次に記述するようにしてＬＲＺ１細胞か
ら調製した。
リガンドの結合の阻害を示す。結果は、競合薬物の不存
在下での特異的結合のパーセントとして表した特異的結
合を、競合薬物の濃度の対数に対してプロットしたもの
である。膜は、次に記述するようにしてＬＲＺ１細胞か
ら調製した。
【００２１】Ａ． アゴニストによる〔 3Ｈ〕スピペロ
ンの結合の阻害を求めるために一回の実験からの曲線が
示されている。各薬物は２回試験した。この実験におい
ては、遊離の〔 3Ｈ〕スピロペリドール濃度は２３０ｐ
Ｍ、〔 3Ｈ〕スピロペリドールのＫD 値は６０ｐＭであ
った。この実験においては、Ｋ1 値及びＨｉｌｌ係数
は、ブロモクリプチンについてはそれぞれ５ｎＭ及び
１．０５、（−）３−ＰＰＰについては７９０ｍＭ及び
０．８９、キンピロールについては８μＭ及び１．０、
（＋）３−ＰＰＰに対しては３１μＭ及び１．０５、Ｌ
Ｙ１８１９９０に対しては０．３ｍＭ及び０．７２であ
った。（図２５） Ｂ． 〔 3Ｈ〕スピロペリドールの結合のＤＡによる阻
害に対するＧＴＰ及びＮａＣｌの効果を測定した４つの
独立した実験のうち１つの結果を示す。〔 3Ｈ〕スピロ
ペリドールの濃度は３２３から４９８ｐＭであった。こ
の実験においては、放射性リガンドの濃度は３２３ｐＭ
であった。白丸は０．１ｍＭのＧＴＰ及び１２０ｍＭの
ＮａＣｌの存在下でのＤＡによる阻害を表し、黒丸はＧ
ＴＰ及びＮａＣｌの添加なしの場合の阻害を表す。この
実験でのＩＣ50値及びＨｉｌｌ係数は、ＧＴＰ及びＮａ
Ｃｌの不存在下ではそれぞれ２９μＭ及び０．６５、存
在下ではそれぞれ１１５μＭ及び１．０３であった。
（図２６）
ンの結合の阻害を求めるために一回の実験からの曲線が
示されている。各薬物は２回試験した。この実験におい
ては、遊離の〔 3Ｈ〕スピロペリドール濃度は２３０ｐ
Ｍ、〔 3Ｈ〕スピロペリドールのＫD 値は６０ｐＭであ
った。この実験においては、Ｋ1 値及びＨｉｌｌ係数
は、ブロモクリプチンについてはそれぞれ５ｎＭ及び
１．０５、（−）３−ＰＰＰについては７９０ｍＭ及び
０．８９、キンピロールについては８μＭ及び１．０、
（＋）３−ＰＰＰに対しては３１μＭ及び１．０５、Ｌ
Ｙ１８１９９０に対しては０．３ｍＭ及び０．７２であ
った。（図２５） Ｂ． 〔 3Ｈ〕スピロペリドールの結合のＤＡによる阻
害に対するＧＴＰ及びＮａＣｌの効果を測定した４つの
独立した実験のうち１つの結果を示す。〔 3Ｈ〕スピロ
ペリドールの濃度は３２３から４９８ｐＭであった。こ
の実験においては、放射性リガンドの濃度は３２３ｐＭ
であった。白丸は０．１ｍＭのＧＴＰ及び１２０ｍＭの
ＮａＣｌの存在下でのＤＡによる阻害を表し、黒丸はＧ
ＴＰ及びＮａＣｌの添加なしの場合の阻害を表す。この
実験でのＩＣ50値及びＨｉｌｌ係数は、ＧＴＰ及びＮａ
Ｃｌの不存在下ではそれぞれ２９μＭ及び０．６５、存
在下ではそれぞれ１１５μＭ及び１．０３であった。
（図２６）
【００２２】図２７〜２８は、ＬＺＲ１細胞におけるア
デニレートサイクラーゼ活性の阻害を示す。アゴニスト
が、ＬＺＲ１細胞から調製した膜におけるアデニレート
サイクラーゼ活性の阻害を求めるために試験された。各
定量において５０乃至１００μｇの蛋白質が使用され
た。結果を、１０μＭのフォルスコリン存在下での全活
性に対するパーセントとして表し、〔32Ｐ〕ｃＡＭＰ／
ｍｇ蛋白質／分として示す。少なくとも各３回試験され
た６種の薬物について代表的な用量─作用曲線を示す。
データは、酵素活性を薬物濃度の対数に対してプロット
したものである。阻害が何らみられないから、（−）３
−ＰＰＰのデータについては曲線をプロットしていな
い。この図に示した実験においては、基準の及びフォル
スコリンにより刺激された活性は、それぞれ約、０．８
乃至１．５及び８．５乃至１５．８ｐｍｏｌ／ｍｇ蛋白
質／分であった。
デニレートサイクラーゼ活性の阻害を示す。アゴニスト
が、ＬＺＲ１細胞から調製した膜におけるアデニレート
サイクラーゼ活性の阻害を求めるために試験された。各
定量において５０乃至１００μｇの蛋白質が使用され
た。結果を、１０μＭのフォルスコリン存在下での全活
性に対するパーセントとして表し、〔32Ｐ〕ｃＡＭＰ／
ｍｇ蛋白質／分として示す。少なくとも各３回試験され
た６種の薬物について代表的な用量─作用曲線を示す。
データは、酵素活性を薬物濃度の対数に対してプロット
したものである。阻害が何らみられないから、（−）３
−ＰＰＰのデータについては曲線をプロットしていな
い。この図に示した実験においては、基準の及びフォル
スコリンにより刺激された活性は、それぞれ約、０．８
乃至１．５及び８．５乃至１５．８ｐｍｏｌ／ｍｇ蛋白
質／分であった。
【００２３】図２９は、ＤＡ感受性アデニレートサイク
ラーゼの阻害を示す。結果は３つの実験の平均±ＳＥで
あり、１０μＭのフォルスコリン存在下における全活性
のパーセントとしてプロットしてある。フォルスコリン
（ＦＳＫ）は、示されているように、１０μＭのドーパ
ミン（ＤＡ）又はＤＡ及び１０μＭの（＋）−ブタクラ
モール（ＢＵＴ）と共に、示した全ての実験において存
在している。細胞のいくつかは、酵素活性の測定のため
に集める前に、百日咳トキシン（ＰＴ）で処理した。対
照の基準活性及びＰＴ−処理細胞の活性は、それぞれ
１．２±０．０７及び１．６±０．１５ｐｍｏｌ／ｍｇ
蛋白質／分であった。対照細胞における全フォルスコリ
ン刺激活性（ＦＳＫ）は１１．９±１．０ｐｍｏｌ／ｍ
ｇ蛋白質／分であった。対平均に対してしたｔ−検定に
よると、対照細胞におけるＦＳＫとの比較は（＊）ｐ＜
０．０５。
ラーゼの阻害を示す。結果は３つの実験の平均±ＳＥで
あり、１０μＭのフォルスコリン存在下における全活性
のパーセントとしてプロットしてある。フォルスコリン
（ＦＳＫ）は、示されているように、１０μＭのドーパ
ミン（ＤＡ）又はＤＡ及び１０μＭの（＋）−ブタクラ
モール（ＢＵＴ）と共に、示した全ての実験において存
在している。細胞のいくつかは、酵素活性の測定のため
に集める前に、百日咳トキシン（ＰＴ）で処理した。対
照の基準活性及びＰＴ−処理細胞の活性は、それぞれ
１．２±０．０７及び１．６±０．１５ｐｍｏｌ／ｍｇ
蛋白質／分であった。対照細胞における全フォルスコリ
ン刺激活性（ＦＳＫ）は１１．９±１．０ｐｍｏｌ／ｍ
ｇ蛋白質／分であった。対平均に対してしたｔ−検定に
よると、対照細胞におけるＦＳＫとの比較は（＊）ｐ＜
０．０５。
【００２４】図３０〜３２は、百日咳トキシン処理によ
るドーパミン阻害の逆転を示す。膜アデニレートサイク
ラーゼ活性について下に掲げたデータは、平均（ｘ）と
標準誤差（Ｓ．Ｅ．）及び％阻害（％Ｉｎｈ．）を示
す。％阻害は方程式 １００×〔１−（Ｓ−Ｂ／Ｉ−Ｂ
I ）〕から算出した。ここにおいて、Ｂ、Ｓ及びＩはそ
れぞれ、基準活性、刺激剤（Ｓ）又は阻害剤（Ｉ）の存
在下での活性を示し、Ｂ I は阻害剤の存在下での基準活
性を示す。結果は、対照と、百日咳トキシン（＋Ｐ．
Ｔ．として示した）で前処理（１６時間、５０ｎｇ／ｍ
ｌ）した細胞における、平行測定から得られた。
るドーパミン阻害の逆転を示す。膜アデニレートサイク
ラーゼ活性について下に掲げたデータは、平均（ｘ）と
標準誤差（Ｓ．Ｅ．）及び％阻害（％Ｉｎｈ．）を示
す。％阻害は方程式 １００×〔１−（Ｓ−Ｂ／Ｉ−Ｂ
I ）〕から算出した。ここにおいて、Ｂ、Ｓ及びＩはそ
れぞれ、基準活性、刺激剤（Ｓ）又は阻害剤（Ｉ）の存
在下での活性を示し、Ｂ I は阻害剤の存在下での基準活
性を示す。結果は、対照と、百日咳トキシン（＋Ｐ．
Ｔ．として示した）で前処理（１６時間、５０ｎｇ／ｍ
ｌ）した細胞における、平行測定から得られた。
【００２５】（Ａ） アデニレートサイクラーゼ。 ア
デニレートサイクラーゼ測定用の膜は短時間１０μＭの
フォルスコリン（ＦＳＫ）又は１００μＭのドーパミン
（ＤＡ）に曝し、アデニレートサイクラーゼ活性は、ｐ
ｍｏｌ／ｍｇ蛋白質／分で表現した。（図３０） （Ｂ） 細胞内ｃＡＭＰ。 細胞を短時間ＶＩＰ（２０
０ｎＭ）及びドーパミン（１μＭ）で処理し、ｃＡＭＰ
蓄積量（ｐｍｏｌ／シャーレとして表現）を細胞抽出液
にて測定した。（図３１） （Ｃ） 細胞外ｃＡＭＰ。 同じ細胞のシャーレからの
培養液サンプルよりｃＡＭＰを測定しｐｍｏｌ／シャー
レで表した。（図３２）
デニレートサイクラーゼ測定用の膜は短時間１０μＭの
フォルスコリン（ＦＳＫ）又は１００μＭのドーパミン
（ＤＡ）に曝し、アデニレートサイクラーゼ活性は、ｐ
ｍｏｌ／ｍｇ蛋白質／分で表現した。（図３０） （Ｂ） 細胞内ｃＡＭＰ。 細胞を短時間ＶＩＰ（２０
０ｎＭ）及びドーパミン（１μＭ）で処理し、ｃＡＭＰ
蓄積量（ｐｍｏｌ／シャーレとして表現）を細胞抽出液
にて測定した。（図３１） （Ｃ） 細胞外ｃＡＭＰ。 同じ細胞のシャーレからの
培養液サンプルよりｃＡＭＰを測定しｐｍｏｌ／シャー
レで表した。（図３２）
【００２６】図３３〜３６は、特異的ドーパミンＤ2 リ
セプターｍＲＮＡの表現及びＧＨ4ＺＲ7 転換細胞にお
ける結合を示す。 （Ａ） ＧＨ4 Ｃ1 細胞の全ＲＮＡ（２０μｇ／レー
ン）のＮｏｔｈｅｒｎブロット分析。 Ｙ軸はＲＮＡ分
子量標準（ｋｂ）の移動を示す。（図３３） （Ｂ）（１） ＧＨ4 ＺＲ7 細胞より調製された膜への
3Ｈ−スピペロンの特異的結合が、飽和分析により特徴
づけられた（実施例２「実験手順」を参照）。４つの独
立した実験から得られたデータを、特異的に結合した放
射性リガンド（縦座標）を補正した遊離の放射性リガン
ド濃度（全量引く全結合量）に対してプロットしてあ
る。この実験ににおける算出されたＫD 及びＢｍａｘ値
は、６０ｐＭ及び１１６５ｆｍｏｌ／ｍｇ蛋白質であっ
た。（図３４） （Ｂ）（２） 特異的結合／遊離（Ｙ軸）を 3Ｈ−スピ
ペロンの特異的結合濃度（Ｘ軸）に対してプロットした
スキャッチャード法によるデータの変換。（図３５） （Ｃ）ドーパミンによる特異的 3Ｈ−スピペロン結合の
変位： ＧＴＰ／ＮａＣｌの効果。ＧＨ4 ＺＲ7 細胞膜
を、１００μＭＧＴＰ／１２０ｍＭＮａＣｌの不存在下
（〇）又は存在下（・）にて、 3Ｈ−スピペロン（０．
４７ｎＭ）及び示した濃度のドーパミン（Ｘ軸）と共に
インキュベートした。結果は４つの実験のうちの１つで
ある。示した実験におけるドーパミンについて算出され
たＩＣ50及びＨｉｌｌ係数値は、ＧＴＰ／ＮａＣｌの不
存在下では１６μＭ及び０．６１、ＧＴＰ／ＮａＣｌの
存在下では５６μＭ及び０．８５であった。（図３６）
セプターｍＲＮＡの表現及びＧＨ4ＺＲ7 転換細胞にお
ける結合を示す。 （Ａ） ＧＨ4 Ｃ1 細胞の全ＲＮＡ（２０μｇ／レー
ン）のＮｏｔｈｅｒｎブロット分析。 Ｙ軸はＲＮＡ分
子量標準（ｋｂ）の移動を示す。（図３３） （Ｂ）（１） ＧＨ4 ＺＲ7 細胞より調製された膜への
3Ｈ−スピペロンの特異的結合が、飽和分析により特徴
づけられた（実施例２「実験手順」を参照）。４つの独
立した実験から得られたデータを、特異的に結合した放
射性リガンド（縦座標）を補正した遊離の放射性リガン
ド濃度（全量引く全結合量）に対してプロットしてあ
る。この実験ににおける算出されたＫD 及びＢｍａｘ値
は、６０ｐＭ及び１１６５ｆｍｏｌ／ｍｇ蛋白質であっ
た。（図３４） （Ｂ）（２） 特異的結合／遊離（Ｙ軸）を 3Ｈ−スピ
ペロンの特異的結合濃度（Ｘ軸）に対してプロットした
スキャッチャード法によるデータの変換。（図３５） （Ｃ）ドーパミンによる特異的 3Ｈ−スピペロン結合の
変位： ＧＴＰ／ＮａＣｌの効果。ＧＨ4 ＺＲ7 細胞膜
を、１００μＭＧＴＰ／１２０ｍＭＮａＣｌの不存在下
（〇）又は存在下（・）にて、 3Ｈ−スピペロン（０．
４７ｎＭ）及び示した濃度のドーパミン（Ｘ軸）と共に
インキュベートした。結果は４つの実験のうちの１つで
ある。示した実験におけるドーパミンについて算出され
たＩＣ50及びＨｉｌｌ係数値は、ＧＴＰ／ＮａＣｌの不
存在下では１６μＭ及び０．６１、ＧＴＰ／ＮａＣｌの
存在下では５６μＭ及び０．８５であった。（図３６）
【００２７】図３７〜３９は、ＧＨ4 ＺＲ7 細胞におけ
る、ドーパミンによるｃＡＭＰの蓄積阻害及びＰＲＬの
放出を示す。インキュベーションは、実施例２の「実験
手順」に記述したように、３つ行った。 （Ａ）ドーパミンによる細胞外ｃＡＭＰ蓄積の阻害。
ＧＨ4 Ｃ1 及びＧＨ4ＺＲ7 細胞の平行なシャーレを、
種々の濃度のＶＩＰ、ドーパミン（Ｄ）並びに２５０ｎ
Ｍ、１０μＭ及び５μＭの（−）−スルピリド（−Ｓ）
をそれぞれ加えてインキュベートした。無処理対照は
「Ｃ」で表す。培養液は集められ、ｃＡＭ Ｐを測定し、ｐｍｏｌ／シャーレ（縦座標）で表した。
（図３７） （Ｂ）ＧＨ4 ＺＲ7 細胞におけるドーパミンによる細胞
内ｃＡＭＰの蓄積阻害。 細胞抽出液につきｃＡＭＰを
測定し、縦座標に表した。薬物濃度は、（Ａ）における
と同様に、（＋）−スルピリドを除いて５μＭであっ
た。（図３８） （Ｃ）ＧＨ4 ＺＲ7 細胞における刺激されたＰＲＬ放出
のドーパミンによる阻害。 示した処理の後、培養液サ
ンプルにつきＰＲＬ（縦座標）を測定した。ＶＩＰ、Ｔ
ＨＲ、ドーパミン（Ｄ）及び（−）−スルピリド（−
Ｓ）の濃度はそれぞれ２００ｎＭ，２００ｎＭ，１００
ｎＭ及び２μＭであった。（図３９）
る、ドーパミンによるｃＡＭＰの蓄積阻害及びＰＲＬの
放出を示す。インキュベーションは、実施例２の「実験
手順」に記述したように、３つ行った。 （Ａ）ドーパミンによる細胞外ｃＡＭＰ蓄積の阻害。
ＧＨ4 Ｃ1 及びＧＨ4ＺＲ7 細胞の平行なシャーレを、
種々の濃度のＶＩＰ、ドーパミン（Ｄ）並びに２５０ｎ
Ｍ、１０μＭ及び５μＭの（−）−スルピリド（−Ｓ）
をそれぞれ加えてインキュベートした。無処理対照は
「Ｃ」で表す。培養液は集められ、ｃＡＭ Ｐを測定し、ｐｍｏｌ／シャーレ（縦座標）で表した。
（図３７） （Ｂ）ＧＨ4 ＺＲ7 細胞におけるドーパミンによる細胞
内ｃＡＭＰの蓄積阻害。 細胞抽出液につきｃＡＭＰを
測定し、縦座標に表した。薬物濃度は、（Ａ）における
と同様に、（＋）−スルピリドを除いて５μＭであっ
た。（図３８） （Ｃ）ＧＨ4 ＺＲ7 細胞における刺激されたＰＲＬ放出
のドーパミンによる阻害。 示した処理の後、培養液サ
ンプルにつきＰＲＬ（縦座標）を測定した。ＶＩＰ、Ｔ
ＨＲ、ドーパミン（Ｄ）及び（−）−スルピリド（−
Ｓ）の濃度はそれぞれ２００ｎＭ，２００ｎＭ，１００
ｎＭ及び２μＭであった。（図３９）
【００２８】図４０〜４１は、ＧＨ4 ＺＲ7 細胞におけ
る基準の及びＶＩＰ刺激ｃＡＭＰ蓄積のドーパミン阻害
の用量−作用関係を示す。 （Ａ）示した各濃度のドーパミンの存在下における、細
胞内（・）及び細胞外（〇）蓄積。 ドーパミンの不存
在下において、基準のｃＡＭＰレベルは２２±６ｐｍｏ
ｌ／シャーレ（細胞内）及び１２．４±０．６ｐｍｏｌ
／シャーレ（細胞外）であった。ドーパミン作用のＥＣ
50は４．９ｎＭ（細胞内）及び８．５ｎＭ（細胞外）で
あった。（図４０） （Ｂ）各濃度のドーパミンの存在下における、細胞内
（・）及び細胞外（〇）蓄積。ＶＩＰ（２５０ｎＭ）−
刺激での細胞内及び細胞外ｃＡＭＰレベル（ドーパミン
の不存在下において）は、それぞれ１４５±２．８ｐｍ
ｏｌ／シャーレ及び１４６±２．８ｐｍｏｌ／シャー
レ、であり基準ｃＡＭＰレベルは、それぞれ３５±１．
６ｐｍｏｌ／シャーレ及び１５±０．２ｐｍｏｌ／シャ
ーレであった。ドーパミン阻害のＥＣ50は５．５ｎＭ
（細胞内）及び５．８ｎＭ（細胞外）であった。（図４
１）
る基準の及びＶＩＰ刺激ｃＡＭＰ蓄積のドーパミン阻害
の用量−作用関係を示す。 （Ａ）示した各濃度のドーパミンの存在下における、細
胞内（・）及び細胞外（〇）蓄積。 ドーパミンの不存
在下において、基準のｃＡＭＰレベルは２２±６ｐｍｏ
ｌ／シャーレ（細胞内）及び１２．４±０．６ｐｍｏｌ
／シャーレ（細胞外）であった。ドーパミン作用のＥＣ
50は４．９ｎＭ（細胞内）及び８．５ｎＭ（細胞外）で
あった。（図４０） （Ｂ）各濃度のドーパミンの存在下における、細胞内
（・）及び細胞外（〇）蓄積。ＶＩＰ（２５０ｎＭ）−
刺激での細胞内及び細胞外ｃＡＭＰレベル（ドーパミン
の不存在下において）は、それぞれ１４５±２．８ｐｍ
ｏｌ／シャーレ及び１４６±２．８ｐｍｏｌ／シャー
レ、であり基準ｃＡＭＰレベルは、それぞれ３５±１．
６ｐｍｏｌ／シャーレ及び１５±０．２ｐｍｏｌ／シャ
ーレであった。ドーパミン阻害のＥＣ50は５．５ｎＭ
（細胞内）及び５．８ｎＭ（細胞外）であった。（図４
１）
【００２９】図４２は、ＶＩＰ−刺激ｃＡＭＰ蓄積のド
ーパミンによる阻害の特異的阻止を示している。ＧＨ4
ＺＲ7 細胞を、２５０ｎＭのＶＩＰ及び１００ｎＭのド
ーパミン、並びに示した濃度の種々のドーパミンアンタ
ゴニストの存在下に、ＦＡＴ培養液（実施例２の「方
法」参照）中でインキュベートし、細胞外ｃＡＭＰレベ
ルを測定した。最大ｃＡＭＰレベルのパーセントを示し
た濃度のドーパミンアンタゴニストの対数に対してプロ
ットしてデータとした。３つの定量の標準誤差は８％未
満であった。基準の及びＶＩＰ−刺激ｃＡＭＰレベル
（ドーパミン及びアンタゴニストの不存在下にて）は２
５．８±１．６ｐｍｏｌ／シャーレ及び２１４±１４ｐ
ｍｏｌ／シャーレであった。ドーパミン作用のアンタゴ
ニストについてのＩＣ50及び推定Ｋｉ値は：スピペロン
０．５６ｎＭ及び３０ｐＭ； （＋）−ブタクラモー
ル ４．５ｎＭ及び０．２ｎＭ； （−）−スルピリド
３８ｎＭ及び１．８ｎＭ； ＳＣＨ２３３９０ ＞１
μＭ； （−）−ブタクラモール ＞１０μＭであっ
た。推定ＫI 値は方程式 ＫI −ＩＣ50／（１＋（値Ｄ
Ａ〕／ＥＣ50））で算出された。ここにおいて、〔Ｄ
Ａ〕は１００ｎＭ及びドーパミンのＥＣ50は６ｎＭであ
る。スピペロン、（＋）−ブタクラモール及び（−）−
スルピリドのみ、基準ｃＡＭＰレベルを変化させなかっ
た。
ーパミンによる阻害の特異的阻止を示している。ＧＨ4
ＺＲ7 細胞を、２５０ｎＭのＶＩＰ及び１００ｎＭのド
ーパミン、並びに示した濃度の種々のドーパミンアンタ
ゴニストの存在下に、ＦＡＴ培養液（実施例２の「方
法」参照）中でインキュベートし、細胞外ｃＡＭＰレベ
ルを測定した。最大ｃＡＭＰレベルのパーセントを示し
た濃度のドーパミンアンタゴニストの対数に対してプロ
ットしてデータとした。３つの定量の標準誤差は８％未
満であった。基準の及びＶＩＰ−刺激ｃＡＭＰレベル
（ドーパミン及びアンタゴニストの不存在下にて）は２
５．８±１．６ｐｍｏｌ／シャーレ及び２１４±１４ｐ
ｍｏｌ／シャーレであった。ドーパミン作用のアンタゴ
ニストについてのＩＣ50及び推定Ｋｉ値は：スピペロン
０．５６ｎＭ及び３０ｐＭ； （＋）−ブタクラモー
ル ４．５ｎＭ及び０．２ｎＭ； （−）−スルピリド
３８ｎＭ及び１．８ｎＭ； ＳＣＨ２３３９０ ＞１
μＭ； （−）−ブタクラモール ＞１０μＭであっ
た。推定ＫI 値は方程式 ＫI −ＩＣ50／（１＋（値Ｄ
Ａ〕／ＥＣ50））で算出された。ここにおいて、〔Ｄ
Ａ〕は１００ｎＭ及びドーパミンのＥＣ50は６ｎＭであ
る。スピペロン、（＋）−ブタクラモール及び（−）−
スルピリドのみ、基準ｃＡＭＰレベルを変化させなかっ
た。
【００３０】図４３〜４４は、ドーパミンＤ2 アゴニス
トによるアデニレートサイクラーゼの阻害を示す。アデ
ニレートサイクラーゼ活性の阻害は１０μＭのフォルス
コリンの存在下で測定した。全活性のパーセントとして
表した酵素活性の３つ測定の平均を薬物濃度の対数に対
してプロットしてデータとした。基準アデニレートサイ
クラーゼ活性の平均は４．６±０．２ｐｍｏｌ／ｍｇ蛋
白質／分であり、全フォルスコリン刺激活性は６３．８
±０．２ｐｍｏｌ／ｍｇ蛋白質／分であった。示した実
験におけるＥＣ50値及び最大阻害は、ドーパミンについ
てはそれぞれ７９ｎＭ及び５７％、。キンピロールにつ
いては２００ｎＭ及び４９％、ブロモクリプチンにおい
ては５ｎＭ及び２３％、そして（＋）−３−ＰＰＰにお
いては６００μＭ及び４０％であった。
トによるアデニレートサイクラーゼの阻害を示す。アデ
ニレートサイクラーゼ活性の阻害は１０μＭのフォルス
コリンの存在下で測定した。全活性のパーセントとして
表した酵素活性の３つ測定の平均を薬物濃度の対数に対
してプロットしてデータとした。基準アデニレートサイ
クラーゼ活性の平均は４．６±０．２ｐｍｏｌ／ｍｇ蛋
白質／分であり、全フォルスコリン刺激活性は６３．８
±０．２ｐｍｏｌ／ｍｇ蛋白質／分であった。示した実
験におけるＥＣ50値及び最大阻害は、ドーパミンについ
てはそれぞれ７９ｎＭ及び５７％、。キンピロールにつ
いては２００ｎＭ及び４９％、ブロモクリプチンにおい
ては５ｎＭ及び２３％、そして（＋）−３−ＰＰＰにお
いては６００μＭ及び４０％であった。
【００３１】図４５〜５４は、ヒト下垂体ドパミンＤ2
レセプターｃＤＮＡの核酸配列を２番目の列に示す。導
かれるアミノ酸配列は１番目の列に示してある。３番目
の列はクローン化したラットｃＤＮＡ（文献９，実施例
３）の核酸配列であり、それから導かれるアミノ酸配列
のヒトドパミンＤ2 レセプター配列との違いが４番目の
列に示されている。番号Ｉ−VII のボックスで囲んだ領
域は推定される膜横断領域を表す。三角はエキソン／イ
ントロンスプライシング接合を、ＤＮＡ配列中ピリオド
で結んだ部分は存在しない塩基対部分を、アステリスク
は可能性あるＮ−接合グリコシル化部位を示し、そして
タンパクキナーゼＡの標的にはアンダーラインを、ポリ
アデニル化信号には二重にアンダーラインを付してあ
る。
レセプターｃＤＮＡの核酸配列を２番目の列に示す。導
かれるアミノ酸配列は１番目の列に示してある。３番目
の列はクローン化したラットｃＤＮＡ（文献９，実施例
３）の核酸配列であり、それから導かれるアミノ酸配列
のヒトドパミンＤ2 レセプター配列との違いが４番目の
列に示されている。番号Ｉ−VII のボックスで囲んだ領
域は推定される膜横断領域を表す。三角はエキソン／イ
ントロンスプライシング接合を、ＤＮＡ配列中ピリオド
で結んだ部分は存在しない塩基対部分を、アステリスク
は可能性あるＮ−接合グリコシル化部位を示し、そして
タンパクキナーゼＡの標的にはアンダーラインを、ポリ
アデニル化信号には二重にアンダーラインを付してあ
る。
【００３２】図５５は、Ｌ−ｈＰｉｔＤ2 Ｚｅｍ膜への
〔 3Ｈ〕ドムペリドンの結合の競合曲線を示す。該放射
性リガンドは、１ｎＭの濃度で使用され、特異的結合は
１μＭの（＋）ブタクラモールを用いて決定した。デー
タは３つの実験のうち１つを示してある。
〔 3Ｈ〕ドムペリドンの結合の競合曲線を示す。該放射
性リガンドは、１ｎＭの濃度で使用され、特異的結合は
１μＭの（＋）ブタクラモールを用いて決定した。デー
タは３つの実験のうち１つを示してある。
【００３３】図５６は、ヒトゲノムＤＮＡのＳｏｕｔｈ
ｅｒｎブロットを示す。エキソン７を含んでいるゲノム
ＢａｍＨＩ １．６−ｋｂフラグメントは、λＨＤ２Ｇ
１から調製されプローブとして使用される（特異的活
性、２×１０8 ｃｐｍ）。ＤＮＡは、ＢａｍＨＩ（レー
ン１）、Ｂｇ１ＩＩ（レーン２）、ＢａｍＨＩ／Ｂｇ１
ＩＩ（レーン３）及びＨｉｎｄＩＩＩ（レーン４）で消
化した。
ｅｒｎブロットを示す。エキソン７を含んでいるゲノム
ＢａｍＨＩ １．６−ｋｂフラグメントは、λＨＤ２Ｇ
１から調製されプローブとして使用される（特異的活
性、２×１０8 ｃｐｍ）。ＤＮＡは、ＢａｍＨＩ（レー
ン１）、Ｂｇ１ＩＩ（レーン２）、ＢａｍＨＩ／Ｂｇ１
ＩＩ（レーン３）及びＨｉｎｄＩＩＩ（レーン４）で消
化した。
【００３４】図５７は、ヒトドーパミンＤ2 リセプター
遺伝子及び下垂体ｃＤＮＡの概念的表現である。 （ａ）２つの重複するゲノム相、λｈＤ２Ｇ１及びλｈ
Ｄ２Ｇ２； Ａ，ＡｐａＬＩ； Ｂ，ＢａｍＨＩ； Ｂ
ｇ，Ｂｇ１ＩＩ； Ｈ，ＨｉｎｄＩＩＩの制限地図。 （ｂ）ヒト遺伝子ローカスＤＲＤ２の図。 箱によって
示されたエクソンに番号が付されている。実線の箱はコ
ードしている配列を示し、開いた箱は翻訳されない配列
を示す。ゲノムの配列決定の戦略が遺伝上にも拡張され
る。これらの領域は一定のスケールでは描かれていな
い。ＤＮＡ配列（＋はセンス配列を、−はアンチセンス
配列を示す）は、各梯子を下から上へと矢印によって示
された方向へと読まれる（右を指して、５’から３’へ
そして左を指して、３’から５’へと）。８７−ｂｐエ
キソンは５番である。イントロンのサイズはＳｏｕｔｈ
ｅｒｎブロッティングと制限地図により決定され、一つ
の例外を除いて１０パーセント以内の正確さを有してい
る： すなわち、イントロン１は２０パーセント以内の
正確さである。 （ｃ）ヒト下垂体ｃＤＮＡの構造。 エキソン／イント
ロン繋ぎ接合が三角形により示されている。膜横断領域
をコードしている領域Ｉ−ＶＩＩは波線を含んだ箱によ
って囲まれている。８７−ｂｐ配列には斜線を付してあ
る。翻訳開始部位（ＡＴＧ）及び終止部位（ＴＡＧ）
は、ポリアデニル化信号配列（ＡＡＴＡＡＡＡ）と同様
に示されている。
遺伝子及び下垂体ｃＤＮＡの概念的表現である。 （ａ）２つの重複するゲノム相、λｈＤ２Ｇ１及びλｈ
Ｄ２Ｇ２； Ａ，ＡｐａＬＩ； Ｂ，ＢａｍＨＩ； Ｂ
ｇ，Ｂｇ１ＩＩ； Ｈ，ＨｉｎｄＩＩＩの制限地図。 （ｂ）ヒト遺伝子ローカスＤＲＤ２の図。 箱によって
示されたエクソンに番号が付されている。実線の箱はコ
ードしている配列を示し、開いた箱は翻訳されない配列
を示す。ゲノムの配列決定の戦略が遺伝上にも拡張され
る。これらの領域は一定のスケールでは描かれていな
い。ＤＮＡ配列（＋はセンス配列を、−はアンチセンス
配列を示す）は、各梯子を下から上へと矢印によって示
された方向へと読まれる（右を指して、５’から３’へ
そして左を指して、３’から５’へと）。８７−ｂｐエ
キソンは５番である。イントロンのサイズはＳｏｕｔｈ
ｅｒｎブロッティングと制限地図により決定され、一つ
の例外を除いて１０パーセント以内の正確さを有してい
る： すなわち、イントロン１は２０パーセント以内の
正確さである。 （ｃ）ヒト下垂体ｃＤＮＡの構造。 エキソン／イント
ロン繋ぎ接合が三角形により示されている。膜横断領域
をコードしている領域Ｉ−ＶＩＩは波線を含んだ箱によ
って囲まれている。８７−ｂｐ配列には斜線を付してあ
る。翻訳開始部位（ＡＴＧ）及び終止部位（ＴＡＧ）
は、ポリアデニル化信号配列（ＡＡＴＡＡＡＡ）と同様
に示されている。
【００３５】図５８は、Ｌ−ｈＰｉｔＤ２Ｚｅｍ，Ｌ−
ＲＧＢ２Ｚｅｍ１及びラット線条体のＩＣ50値（ｎＭ）
の比較を示している。
ＲＧＢ２Ｚｅｍ１及びラット線条体のＩＣ50値（ｎＭ）
の比較を示している。
【００３６】図５９は、ヒトドーパミンＤ2 リセプター
遺伝子におけるエキソン／イントロン接合を示してい
る。
遺伝子におけるエキソン／イントロン接合を示してい
る。
【００３７】考察 本発明は、Ｇ蛋白質に結合するリセプターをコードする
遺伝子ファミリー各々間の核酸配列の類似性を独特な方
法で利用したものである。ハイブリッド形成プローブと
して独特なハムスターβ2 −アドレナリンリセプター
（β2 ＡＲ）遺伝子を使用することにより、ラットのＤ
2 ドーパミンリセプターをコードしているｃＤＮＡが同
定され単離された。該リセプターは、３つの基準のもと
に特徴づけられる： １）Ｇ蛋白質結合受容体のファミ
リーのメンバーであることが明らかである誘導アミノ酸
配列、２）Ｄ2 ドーパミンリセプターに知られているの
と平行した対応するｍＲＮＡの組織分布、及び、３）該
ｃＤＮＡで形質転換されたＬｔｋ−細胞の薬理学的な性
質。
遺伝子ファミリー各々間の核酸配列の類似性を独特な方
法で利用したものである。ハイブリッド形成プローブと
して独特なハムスターβ2 −アドレナリンリセプター
（β2 ＡＲ）遺伝子を使用することにより、ラットのＤ
2 ドーパミンリセプターをコードしているｃＤＮＡが同
定され単離された。該リセプターは、３つの基準のもと
に特徴づけられる： １）Ｇ蛋白質結合受容体のファミ
リーのメンバーであることが明らかである誘導アミノ酸
配列、２）Ｄ2 ドーパミンリセプターに知られているの
と平行した対応するｍＲＮＡの組織分布、及び、３）該
ｃＤＮＡで形質転換されたＬｔｋ−細胞の薬理学的な性
質。
【００３８】ラットのゲノムライブラリーは、ハムスタ
ーのβ2 ＡＲ遺伝子のコード領域の大部分を含むｎｉｃ
ｋ−翻訳１．３ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントによ
って緩和なハイブリッド化の条件下でスクリーンされ
た。ハムスターβ2 ＡＲリセプター遺伝子は、部分的な
ハムスター肺λｇｔ１０ゲノムＤＮＡライブラリー（サ
イズ分画された（５−７ｋｂ）ＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡ）
から、Ｄｉｘｏｎ等（９）の配列から設計された２つの
オリゴヌクレオチドプローブ（３０−ｍｅｒ，ＴＣＴＧ
ＣＴＴＴＣＡＡＴＣＣＣＣＴＣＡＴＣＴＡＣＴＧＴＣＧ
Ｇ； ４０−ｍｅｒ，ＣＴＡＴＣＴＴＣＴＧＧＡＧＣＴ
ＧＣＣＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＣＴＧＧＡＡＧＡＣＣＣ
Ｔ）によってクローン化される。その遺伝子のコード配
列の大部分を含むハムスターβ2 ＡＲ遺伝子の１．３ｋ
ｂ ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントは、ｎｉｃｋ翻訳によ
って標識され、市販のファージＥＭＢＬ３におけるラッ
トゲノムＤＮＡライブラリーを探索するのに使用され
る。該ライブラリーは、コロニープラークスクリーンフ
ィルター（ＮＥＮ）に移され、次のハイブリッド化条件
下を用いて32Ｐ標識プローブでスクリーンされる：２５
％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ
ｓ，０．１％ピロリン酸ナトリウム、１％ＳＤＳ及びサ
ケ精子ＤＮＡ（１００μｇ／ｍｌ）、３７℃。フィルタ
ーは２×ＳＣＣで及び０．１％ＳＤＳで５５℃にて洗浄
した。
ーのβ2 ＡＲ遺伝子のコード領域の大部分を含むｎｉｃ
ｋ−翻訳１．３ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントによ
って緩和なハイブリッド化の条件下でスクリーンされ
た。ハムスターβ2 ＡＲリセプター遺伝子は、部分的な
ハムスター肺λｇｔ１０ゲノムＤＮＡライブラリー（サ
イズ分画された（５−７ｋｂ）ＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡ）
から、Ｄｉｘｏｎ等（９）の配列から設計された２つの
オリゴヌクレオチドプローブ（３０−ｍｅｒ，ＴＣＴＧ
ＣＴＴＴＣＡＡＴＣＣＣＣＴＣＡＴＣＴＡＣＴＧＴＣＧ
Ｇ； ４０−ｍｅｒ，ＣＴＡＴＣＴＴＣＴＧＧＡＧＣＴ
ＧＣＣＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＣＴＧＧＡＡＧＡＣＣＣ
Ｔ）によってクローン化される。その遺伝子のコード配
列の大部分を含むハムスターβ2 ＡＲ遺伝子の１．３ｋ
ｂ ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントは、ｎｉｃｋ翻訳によ
って標識され、市販のファージＥＭＢＬ３におけるラッ
トゲノムＤＮＡライブラリーを探索するのに使用され
る。該ライブラリーは、コロニープラークスクリーンフ
ィルター（ＮＥＮ）に移され、次のハイブリッド化条件
下を用いて32Ｐ標識プローブでスクリーンされる：２５
％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ
ｓ，０．１％ピロリン酸ナトリウム、１％ＳＤＳ及びサ
ケ精子ＤＮＡ（１００μｇ／ｍｌ）、３７℃。フィルタ
ーは２×ＳＣＣで及び０．１％ＳＤＳで５５℃にて洗浄
した。
【００３９】これらの条件を用いると数種のクローンが
ハムスタープローブにハイブリッド化することが見出さ
れた。ＲＧＢ−２と呼ばれる一つのクローンは、Ｓｏｕ
ｔｈｅｒｎブロット分析においてハムスターβ2 ＡＲプ
ローブとハイブリッドとなる０．８ｋｂ ＥｃｏＥＩ−
ＰｓｔＩフラグメントを有することが見出された。この
フラグメントは配列決定され、ハムスターβ2 ＡＲの膜
横断領域ＶＩＩの核酸配列に高度の同一性（４０塩基中
３２）を有する核酸鎖を有することが示された。可能な
読み取りフレームの一つは、ハムスターβ2 ＡＲの膜横
断領域ＶＩ及びＶＩＩのアミノ酸配列に有意な類似性を
示した。このゲノムフラグメント内に、３’イントロン
繋ぎ部位（１０）及び４００ｂｐの推定されるイントロ
ン配列がある。
ハムスタープローブにハイブリッド化することが見出さ
れた。ＲＧＢ−２と呼ばれる一つのクローンは、Ｓｏｕ
ｔｈｅｒｎブロット分析においてハムスターβ2 ＡＲプ
ローブとハイブリッドとなる０．８ｋｂ ＥｃｏＥＩ−
ＰｓｔＩフラグメントを有することが見出された。この
フラグメントは配列決定され、ハムスターβ2 ＡＲの膜
横断領域ＶＩＩの核酸配列に高度の同一性（４０塩基中
３２）を有する核酸鎖を有することが示された。可能な
読み取りフレームの一つは、ハムスターβ2 ＡＲの膜横
断領域ＶＩ及びＶＩＩのアミノ酸配列に有意な類似性を
示した。このゲノムフラグメント内に、３’イントロン
繋ぎ部位（１０）及び４００ｂｐの推定されるイントロ
ン配列がある。
【００４０】０．８ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩフラグ
メント（ｎｉｃｋ翻訳）が、５０％のホルムアミドを使
用する以外は上記と同じハイブリッド化条件で、λｇｔ
１０中のラット脳ｃＤＮＡライブラリーを探索するのに
用いられた。フィルターの洗浄は０．２×ＳＳＣ及び
０．１％ＤＳＤにて６５℃で行った。これらの高度に厳
しいハイブリッド化条件のもとで、サイズ約２．５ｋｂ
の２つの明らかなクローンが、５００，０００クローン
のライブラリーの中から同定された。両方の鎖から、シ
ーケネース（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を用い
たＳａｎｇｅｒジデオキシチェーン決定法により、ＤＮ
Ａ配列が得られた（２６）。配列と制限分析とが、これ
ら２つのクローンが単一のクローンのレプリカであり、
プローブとして使用されたゲノムフラグメントの配列を
含むものであることを示した。ラットの脳から単離され
たｍＲＮＡのＮｏｒｔｈｅｒｎブロット分析においてＲ
ＧＢ−２ ｃＤＮＡが使用されたときには、約２．５ｋ
ｂの帯が検出された。この発見は、ＲＧＢ−２クローン
が殆ど完全な長さのものであることを示すものであっ
た。
メント（ｎｉｃｋ翻訳）が、５０％のホルムアミドを使
用する以外は上記と同じハイブリッド化条件で、λｇｔ
１０中のラット脳ｃＤＮＡライブラリーを探索するのに
用いられた。フィルターの洗浄は０．２×ＳＳＣ及び
０．１％ＤＳＤにて６５℃で行った。これらの高度に厳
しいハイブリッド化条件のもとで、サイズ約２．５ｋｂ
の２つの明らかなクローンが、５００，０００クローン
のライブラリーの中から同定された。両方の鎖から、シ
ーケネース（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を用い
たＳａｎｇｅｒジデオキシチェーン決定法により、ＤＮ
Ａ配列が得られた（２６）。配列と制限分析とが、これ
ら２つのクローンが単一のクローンのレプリカであり、
プローブとして使用されたゲノムフラグメントの配列を
含むものであることを示した。ラットの脳から単離され
たｍＲＮＡのＮｏｒｔｈｅｒｎブロット分析においてＲ
ＧＢ−２ ｃＤＮＡが使用されたときには、約２．５ｋ
ｂの帯が検出された。この発見は、ＲＧＢ−２クローン
が殆ど完全な長さのものであることを示すものであっ
た。
【００４１】図１〜７は、ＲＧＢ−２ ｃＤＮＡの２４
４５塩基の核酸配列を示す。４１５アミノ酸蛋白質（相
対的分子量（Ｍｒ＝４７０６４））のｃＤＮＡコードに
おける最長の開いた読み取りフレームはまた、該図に示
されている。この分子量は、ＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により決定されたＤ2 リセプターのグリコ
シル化型について報告されている（１１）のと近似して
いる。推定開始部位から３６塩基上流にあるフレーム内
ジペプチドがＲＧＢ−２ ｃＤＮＡの５’非翻訳領域に
見出される。小さな開いた読み取りフレームがβ2 ＡＲ
ｍＲＮＡの５’非翻訳配列に認められる（９）。
４５塩基の核酸配列を示す。４１５アミノ酸蛋白質（相
対的分子量（Ｍｒ＝４７０６４））のｃＤＮＡコードに
おける最長の開いた読み取りフレームはまた、該図に示
されている。この分子量は、ＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により決定されたＤ2 リセプターのグリコ
シル化型について報告されている（１１）のと近似して
いる。推定開始部位から３６塩基上流にあるフレーム内
ジペプチドがＲＧＢ−２ ｃＤＮＡの５’非翻訳領域に
見出される。小さな開いた読み取りフレームがβ2 ＡＲ
ｍＲＮＡの５’非翻訳配列に認められる（９）。
【００４２】ＲＧＢ−２ ｃＤＮＡから導かれる蛋白質
の数種の構造的特徴が、それがＧ蛋白質結合リセプター
のファミリーに属することを示している。蛋白質配列の
疎水性プロット（図１４〜１５）が、７つの膜横断領域
（８）を表し得る７本の疎水性アミノ酸の鎖の存在を示
している。更に、ＲＧＢ−２の一次アミノ酸配列は、他
のＧ蛋白質結合リセプターと高度の類似性を示している
（図８）。最大のアミノ酸同一性は推定される膜横断領
域の内部に集まっている。これらの領域の内部におい
て、ＲＧＢ−２蛋白質は、ヒトα2 −アドレナリンリセ
プター（１２）とは５０％、ヒトＧ−２１リセプター
（１３）とは４２％、ハムスターβ2 ＡＲ−アドレナリ
ンリセプター（９）とは３８％、ブタＭ1 リセプター
（１４）とは２７％、及びウシｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｋ
−リセプター（１５）とは２５％、の同一性を有してい
る。
の数種の構造的特徴が、それがＧ蛋白質結合リセプター
のファミリーに属することを示している。蛋白質配列の
疎水性プロット（図１４〜１５）が、７つの膜横断領域
（８）を表し得る７本の疎水性アミノ酸の鎖の存在を示
している。更に、ＲＧＢ−２の一次アミノ酸配列は、他
のＧ蛋白質結合リセプターと高度の類似性を示している
（図８）。最大のアミノ酸同一性は推定される膜横断領
域の内部に集まっている。これらの領域の内部におい
て、ＲＧＢ−２蛋白質は、ヒトα2 −アドレナリンリセ
プター（１２）とは５０％、ヒトＧ−２１リセプター
（１３）とは４２％、ハムスターβ2 ＡＲ−アドレナリ
ンリセプター（９）とは３８％、ブタＭ1 リセプター
（１４）とは２７％、及びウシｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｋ
−リセプター（１５）とは２５％、の同一性を有してい
る。
【００４３】第３に、ＲＧＢ−２は、Ｇ蛋白質結合リセ
プターのファミリーのメンバーに共通ないくつかの構造
的特徴を有している。信号配列を有しないＮ末端にＮ結
合グリコシル化のための３個の一致配列がある。膜横断
領域ＩＩに見出されるＡｓｐ８０は、全ての知られてい
るＧ蛋白質結合リセプターにおいて保たれている。膜横
断領域ＩＩＩには、Ａｓｐ１１４があり、それには陽イ
オン性アミン類に結合するリセプターにのみ見出される
Ａｓｐ残基が対応する（１６）。リン酸化が、リセプタ
ー機能を制御する手段として提案されてきた（１７）。
プロテインキナーゼＡによるリン酸化の潜在的部位は、
第３の細胞質ループにあるＳｅｒ２２８に存在する。ロ
ドプシンとβ−アドレナリンリセプターのＣ末端部分に
は、リセプターキナーゼ類の潜在的基質である多くのＳ
ｅｒ及びＴｈｒ残基が見出される（１８）。これに対
し、ＲＧＢ−２の短いＣ末端はＳｅｒ及びＴｈｒ残基を
有しない。しかし、α2 −アドレナリンリセプターの場
合のように、ＲＧＢ−２はリン酸化基質として役立ち得
る第３の細胞質ループに多くのＳｅｒ及びＴｈｒ残基
（２２残基）を有する。ＲＧＢ−２は、膜横断領域Ｖと
ＶＩとの間に、短いＣ末端（１４アミノ酸）を伴った大
きな細胞質ループ（１３５アミノ酸）を含む。この構造
組織は、β2 −アドレナリンリセプターやＭ2 ムスカリ
ンリセプターのようなＧI （阻害的ＧI 蛋白質）によっ
て結合される他のリセプターに近似している。アドレナ
リンリセプター及びムスカリンリセプターのファミリー
とは異なり、ＲＧＢ−２遺伝子は、膜横断領域ＶＩに位
置するコード配列に少なくとも１つのイントロンを有す
る。
プターのファミリーのメンバーに共通ないくつかの構造
的特徴を有している。信号配列を有しないＮ末端にＮ結
合グリコシル化のための３個の一致配列がある。膜横断
領域ＩＩに見出されるＡｓｐ８０は、全ての知られてい
るＧ蛋白質結合リセプターにおいて保たれている。膜横
断領域ＩＩＩには、Ａｓｐ１１４があり、それには陽イ
オン性アミン類に結合するリセプターにのみ見出される
Ａｓｐ残基が対応する（１６）。リン酸化が、リセプタ
ー機能を制御する手段として提案されてきた（１７）。
プロテインキナーゼＡによるリン酸化の潜在的部位は、
第３の細胞質ループにあるＳｅｒ２２８に存在する。ロ
ドプシンとβ−アドレナリンリセプターのＣ末端部分に
は、リセプターキナーゼ類の潜在的基質である多くのＳ
ｅｒ及びＴｈｒ残基が見出される（１８）。これに対
し、ＲＧＢ−２の短いＣ末端はＳｅｒ及びＴｈｒ残基を
有しない。しかし、α2 −アドレナリンリセプターの場
合のように、ＲＧＢ−２はリン酸化基質として役立ち得
る第３の細胞質ループに多くのＳｅｒ及びＴｈｒ残基
（２２残基）を有する。ＲＧＢ−２は、膜横断領域Ｖと
ＶＩとの間に、短いＣ末端（１４アミノ酸）を伴った大
きな細胞質ループ（１３５アミノ酸）を含む。この構造
組織は、β2 −アドレナリンリセプターやＭ2 ムスカリ
ンリセプターのようなＧI （阻害的ＧI 蛋白質）によっ
て結合される他のリセプターに近似している。アドレナ
リンリセプター及びムスカリンリセプターのファミリー
とは異なり、ＲＧＢ−２遺伝子は、膜横断領域ＶＩに位
置するコード配列に少なくとも１つのイントロンを有す
る。
【００４４】ＲＧＢ−２の同定に向けた最初の段階とし
て、ＲＧＢ−２ｍＲＮＡの組織分布がＮｏｒｔｈｅｒｎ
ブロット分析で試験された（図９）。
て、ＲＧＢ−２ｍＲＮＡの組織分布がＮｏｒｔｈｅｒｎ
ブロット分析で試験された（図９）。
【００４５】雄性のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラッ
トから脳組織が切り取られ、Ｃｈｉｒｇｗｉｎ等（２
７）及びＵｌｌｒｉｃｈ等（２８）に従ってＲＮＡが単
離された。Ｎｏｒｔｈｅｒｎブロットには、ＲＮＡはグ
リオキサール及びＤＭＳＯを用いて変性し、そして１．
２％アガロースゲル上で展開した。電気泳動の後、ＲＮ
Ａはナイロン膜上にブロットし（Ｎ−Ｂｏｎｄ，Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ）、８０℃で２時間焼付けた。膜は、５０％
ホルムアミド、０．２％ＰＶＰ（Ｍ．Ｗ．４０，００
０）、０．２％ｆｉｃｏｌ（Ｍ．Ｗ．４００，００
０）、ｐＨ７．５の０．０５％トリス、１ＭのＮａＣ
ｌ、０．１％ＰＰｉ、１％ＳＤＳ及び変性サケ精子ＤＮ
Ａ（１００μｇ／ｍｌ）中で４２℃にて１６時間、前ハ
イブリッド化した。ＲＧＢ−２の１．６ｋｂ ＢａｍＨ
Ｉ−ＢｇｌＩＩフラグメントでこのクローンのコード領
域を含むものから製したランダムに標識した32Ｐ−標識
フラグメント（１−２ １０8 ｄｐｍ／μｇ）が、４２
℃で終夜該フィルターを探索するために、上記で得たハ
イブリッド化溶液中で１０7 ｄｐｍ／ｍｌの濃度で使用
された。ブロットは２ｘ ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳで
６５℃１０分間にて２回、０．５ｘ ＳＳＣ及び０．１
％ＳＤＳにて室温１５分間にて２回、そして０．１ｘＳ
ＳＣ及び０．１％ＳＤＳにて６５℃１５分間にて１回、
洗浄した。ブロットは増感スクリーンを有するＸ線フィ
ルムに−７０℃にて終夜曝した。
トから脳組織が切り取られ、Ｃｈｉｒｇｗｉｎ等（２
７）及びＵｌｌｒｉｃｈ等（２８）に従ってＲＮＡが単
離された。Ｎｏｒｔｈｅｒｎブロットには、ＲＮＡはグ
リオキサール及びＤＭＳＯを用いて変性し、そして１．
２％アガロースゲル上で展開した。電気泳動の後、ＲＮ
Ａはナイロン膜上にブロットし（Ｎ−Ｂｏｎｄ，Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ）、８０℃で２時間焼付けた。膜は、５０％
ホルムアミド、０．２％ＰＶＰ（Ｍ．Ｗ．４０，００
０）、０．２％ｆｉｃｏｌ（Ｍ．Ｗ．４００，００
０）、ｐＨ７．５の０．０５％トリス、１ＭのＮａＣ
ｌ、０．１％ＰＰｉ、１％ＳＤＳ及び変性サケ精子ＤＮ
Ａ（１００μｇ／ｍｌ）中で４２℃にて１６時間、前ハ
イブリッド化した。ＲＧＢ−２の１．６ｋｂ ＢａｍＨ
Ｉ−ＢｇｌＩＩフラグメントでこのクローンのコード領
域を含むものから製したランダムに標識した32Ｐ−標識
フラグメント（１−２ １０8 ｄｐｍ／μｇ）が、４２
℃で終夜該フィルターを探索するために、上記で得たハ
イブリッド化溶液中で１０7 ｄｐｍ／ｍｌの濃度で使用
された。ブロットは２ｘ ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳで
６５℃１０分間にて２回、０．５ｘ ＳＳＣ及び０．１
％ＳＤＳにて室温１５分間にて２回、そして０．１ｘＳ
ＳＣ及び０．１％ＳＤＳにて６５℃１５分間にて１回、
洗浄した。ブロットは増感スクリーンを有するＸ線フィ
ルムに−７０℃にて終夜曝した。
【００４６】ＲＧＢ─２のｍＲＮＡは、ラット脳の種々
の領域で異なったレベルに表現されるが、基底神経節が
最も高い濃度を示す。更に、ＲＧＢ−２のｍＲＮＡは、
ラットの下垂体神経性中葉に高濃度に見出され、この腺
の前葉には少ない程度にした見出されない。ＲＧＢ−２
のｍＲＮＡの表現パターンは、組織標本でのリセプター
オートラジオグラフィー及び結合研究によって決定され
たＤ2 ドーパミンリセプターの分布と著しく近似してい
る。ＲＧＢ−２によりコードされるリセプターの薬理学
的特徴を研究するために、ｃＤＮＡが親核細胞にて表現
された。全ＲＧＢ−２ ｃＤＮＡが：マウスのメタロチ
オネインプロモーター（２１）からの転写を開始させる
ユーカリオート表現ベクターｐＺｅｍ３（２０）中にク
ローン化された。このプラスミドは、選択的ネオマイシ
ンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子（ｐＲＳＶｎｅ
ｏ）と共に、標準ＣａＰＯ4 沈澱技術（２１）によりＬ
ｔｋ−マウス繊維芽細胞ライン中に同時トランスフェク
トされた。細胞は、３５０μｇ／ｍｌのＧ４１８中で選
別された。トランスフェクト体は分離され、Ｎｏｒｔｈ
ｅｒｎブロット分析により、ＲＧＢ−２ ｍＲＮＡの表
現の有無が試験された。ＲＧＢ−２に指令されたＬ−Ｒ
ＧＢ２Ｚｅｍ−１を表現している細胞ラインが単離され
た。ＲＧＢ−２ ｍＲＮＡは親Ｌｔｋ−細胞ラインには
検出されなかった。ＲＧＢ−２ ｍＲＮＡがＤ2 ドーパ
ミンリセプターに期待される組織分布を示したことか
ら、Ｄ2 リガンド 3Ｈ−スピペロンを用いて、Ｌ−ＲＧ
Ｂ２Ｚｅｍ−１細胞ライン、自然のＬｔｋ−細胞及びラ
ット線条体につき薬理学的研究が行われた。膜は、細胞
を４℃にて０．２５Ｍ蔗糖、ｐＨ７．４の２５ｍＭトリ
ス、６ｍＭＭｇＣｌ2 、１ｍＭ ＥＤＴＡ中でＤｏｕｎ
ｃｅホモジナイザーで細胞をホモジナイズすることによ
り調製した。ホモジナイズした溶液は８００×ｇで１０
分間遠心し、そしてペレットは前記と同様にホモジナイ
ズし遠心した。上澄は集められ、２００，０００×ｇで
１時間遠心された。この遠心のペレットは、２５ｍＭの
ｐＨ７．４のトリス、６ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍ
ＭのＥＤＴＡ中で、約２５０μｇ蛋白質／ｍｌの濃度に
再懸濁され、少量ずつ−７０℃にて保存された。放射性
リガンドの結合測定は、２ｍｌ（飽和分析）又は１ｍｌ
（阻害曲線）で各２つ行われた。液は（最終濃度とし
て）次のものを含む：５０ｍＭのｐＨ７．４のトリス、
０．９％塩化ナトリウム、０．０２５％アスコルビン
酸、０．００１％牛血清アルブミン、 3Ｈ−スピペロン
（Ａｍｅｒｓｈａｍ，９５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）及び適当な
薬物。いくつかの実験においては、１００μＭのグアノ
シン５’−トリフォスフェートが含まれた。（＋）−ブ
タクラモール（２μＭ）が、非特異的結合を明らかにす
るために使用された。各測定において、インキュベーシ
ョンは、１５−４０μｇの蛋白質の添加により開始さ
れ、３７℃で５０分間行われ、１０ｍｌの氷冷洗浄用緩
衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ７．４及び０．９％塩化ナ
トリウム）の添加によって停止された。サンプルは、硝
子繊維フィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ及びＳｃｈｕ
ｅｌｌ Ｎｏ．３０）にて濾過され、追加の１０ｍｌの
洗浄用緩衝液にて洗浄された。フィルター上に保持され
た放射活性は、Ｂｅｃｋｍａｎ ＬＳ １７０１シンチ
レーションカウンターを用いてカウントされた。データ
は、データ解析プログラムＥｎｚｆｉｔｔｅｒを用いて
描く以外は、前記（２９）の通りにして解析された。得
られたＩＣ50値は、Ｃｈｅｎｇ及びＰｒｕｓｏｆｆ（３
０）の方法によりＫi 値へと変換された。
の領域で異なったレベルに表現されるが、基底神経節が
最も高い濃度を示す。更に、ＲＧＢ−２のｍＲＮＡは、
ラットの下垂体神経性中葉に高濃度に見出され、この腺
の前葉には少ない程度にした見出されない。ＲＧＢ−２
のｍＲＮＡの表現パターンは、組織標本でのリセプター
オートラジオグラフィー及び結合研究によって決定され
たＤ2 ドーパミンリセプターの分布と著しく近似してい
る。ＲＧＢ−２によりコードされるリセプターの薬理学
的特徴を研究するために、ｃＤＮＡが親核細胞にて表現
された。全ＲＧＢ−２ ｃＤＮＡが：マウスのメタロチ
オネインプロモーター（２１）からの転写を開始させる
ユーカリオート表現ベクターｐＺｅｍ３（２０）中にク
ローン化された。このプラスミドは、選択的ネオマイシ
ンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子（ｐＲＳＶｎｅ
ｏ）と共に、標準ＣａＰＯ4 沈澱技術（２１）によりＬ
ｔｋ−マウス繊維芽細胞ライン中に同時トランスフェク
トされた。細胞は、３５０μｇ／ｍｌのＧ４１８中で選
別された。トランスフェクト体は分離され、Ｎｏｒｔｈ
ｅｒｎブロット分析により、ＲＧＢ−２ ｍＲＮＡの表
現の有無が試験された。ＲＧＢ−２に指令されたＬ−Ｒ
ＧＢ２Ｚｅｍ−１を表現している細胞ラインが単離され
た。ＲＧＢ−２ ｍＲＮＡは親Ｌｔｋ−細胞ラインには
検出されなかった。ＲＧＢ−２ ｍＲＮＡがＤ2 ドーパ
ミンリセプターに期待される組織分布を示したことか
ら、Ｄ2 リガンド 3Ｈ−スピペロンを用いて、Ｌ−ＲＧ
Ｂ２Ｚｅｍ−１細胞ライン、自然のＬｔｋ−細胞及びラ
ット線条体につき薬理学的研究が行われた。膜は、細胞
を４℃にて０．２５Ｍ蔗糖、ｐＨ７．４の２５ｍＭトリ
ス、６ｍＭＭｇＣｌ2 、１ｍＭ ＥＤＴＡ中でＤｏｕｎ
ｃｅホモジナイザーで細胞をホモジナイズすることによ
り調製した。ホモジナイズした溶液は８００×ｇで１０
分間遠心し、そしてペレットは前記と同様にホモジナイ
ズし遠心した。上澄は集められ、２００，０００×ｇで
１時間遠心された。この遠心のペレットは、２５ｍＭの
ｐＨ７．４のトリス、６ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍ
ＭのＥＤＴＡ中で、約２５０μｇ蛋白質／ｍｌの濃度に
再懸濁され、少量ずつ−７０℃にて保存された。放射性
リガンドの結合測定は、２ｍｌ（飽和分析）又は１ｍｌ
（阻害曲線）で各２つ行われた。液は（最終濃度とし
て）次のものを含む：５０ｍＭのｐＨ７．４のトリス、
０．９％塩化ナトリウム、０．０２５％アスコルビン
酸、０．００１％牛血清アルブミン、 3Ｈ−スピペロン
（Ａｍｅｒｓｈａｍ，９５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）及び適当な
薬物。いくつかの実験においては、１００μＭのグアノ
シン５’−トリフォスフェートが含まれた。（＋）−ブ
タクラモール（２μＭ）が、非特異的結合を明らかにす
るために使用された。各測定において、インキュベーシ
ョンは、１５−４０μｇの蛋白質の添加により開始さ
れ、３７℃で５０分間行われ、１０ｍｌの氷冷洗浄用緩
衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ７．４及び０．９％塩化ナ
トリウム）の添加によって停止された。サンプルは、硝
子繊維フィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ及びＳｃｈｕ
ｅｌｌ Ｎｏ．３０）にて濾過され、追加の１０ｍｌの
洗浄用緩衝液にて洗浄された。フィルター上に保持され
た放射活性は、Ｂｅｃｋｍａｎ ＬＳ １７０１シンチ
レーションカウンターを用いてカウントされた。データ
は、データ解析プログラムＥｎｚｆｉｔｔｅｒを用いて
描く以外は、前記（２９）の通りにして解析された。得
られたＩＣ50値は、Ｃｈｅｎｇ及びＰｒｕｓｏｆｆ（３
０）の方法によりＫi 値へと変換された。
【００４７】対照Ｌｔｋ−細胞から調製された膜は、 3
Ｈ−スピペロンの、（＋）−ブタクラモール−又はスル
ピリド置換性の結合を示さなかった。Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅ
ｍ−１細胞から調製した膜への 3Ｈ−スピペロンの結合
は、Ｋｄ値４８ｐＭ（図１０）で飽和した。この値は、
平行実験におけるラット線条体膜はの 3Ｈ−スピペロン
の結合において観察されたもの（５２ｐＭ）と一致す
る。図１０に示した実験において、Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ
−１から調製された膜についてのＫｄ及びＢｍａｘ値
は、４０ｐｍ及び８７６ｆｍｏｌ／ｍｇ蛋白質であり、
一方、線条体膜の対応する値は３７ｐｍ及び５４７ｆｍ
ｏｌ／ｍｇ蛋白質であった。結合部位の濃度は、４つの
実験で測定したところでは、Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１膜
においては９４５ｆｍｏｌ／ｍｇ蛋白質及びラット線条
体膜においては４５４ｆｍｏｌ／ｍｇ蛋白質であった。
Ｈ−スピペロンの、（＋）−ブタクラモール−又はスル
ピリド置換性の結合を示さなかった。Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅ
ｍ−１細胞から調製した膜への 3Ｈ−スピペロンの結合
は、Ｋｄ値４８ｐＭ（図１０）で飽和した。この値は、
平行実験におけるラット線条体膜はの 3Ｈ−スピペロン
の結合において観察されたもの（５２ｐＭ）と一致す
る。図１０に示した実験において、Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ
−１から調製された膜についてのＫｄ及びＢｍａｘ値
は、４０ｐｍ及び８７６ｆｍｏｌ／ｍｇ蛋白質であり、
一方、線条体膜の対応する値は３７ｐｍ及び５４７ｆｍ
ｏｌ／ｍｇ蛋白質であった。結合部位の濃度は、４つの
実験で測定したところでは、Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１膜
においては９４５ｆｍｏｌ／ｍｇ蛋白質及びラット線条
体膜においては４５４ｆｍｏｌ／ｍｇ蛋白質であった。
【００４８】Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１細胞からの膜への
3Ｈ−スピペロンの結合は、多くの薬物により阻害さ
れ、得られたＫi 値は線条体膜を用いて得られたものと
よく一致した（図１２，１３）。Ｄ2 アゴニストである
（＋）−ブタクラモール及びハロペリドールは、最も強
い阻害剤であり、スルピリドがこれに続いた。Ｄ1 ドー
パミンアンタゴニストであるＳＣＨ２３３９０及びセロ
トニン５ＨＴ2 アンタゴニストであるケタンセリンは、
3Ｈ−スピペロン結合の阻止力がずっと弱かった。結合
の阻害において（＋）−ブタクラモールが（−）−ブタ
クラモールよりずっと強かったことから、結合は立体選
択性を有するものと思われた。これらの実験において
は、ドーパミンアンタゴニストの絶対的親和性と薬物の
強さの序列（スピペロン＞ハロペリドール＞スルピリド
＞＞（−）−ブタクラモール）は、前に公表されたＤ2
ドーパミンリセプターの値（２）とよく一致しているＬ
−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１膜の全ての結合データは、単一の
クラスの結合部位の存在を想定することにより最も良く
当てはまった。他方、ラット線条体膜への 3Ｈ−スピペ
ロンの結合の数種の薬物による阻害は、２つのクラスの
結合部位の存在を想定することにより最もよく当てはま
った。こうして、ＳＣＨ２３３９０及びケタンセリン
は、ラット線条体膜への 3Ｈ−スピペロンの結合の１０
−２０％を高い親和性をもって阻害した（図１３）。ラ
ット線条体膜においては、スルピリドによる放射性リガ
ンドの結合の阻害は、１つのクラスの結合部位により最
もよく当てはまったが、（＋）−ブタクラモール置換性
結合の１０−１５％は、使用した濃度のスルピリドでは
阻害されなかった。ケタンセリン及びＳＣＨ２３３９０
に高い親和性を有し且つスルピリドによっては置換され
ない結合部位は、ラット線条体膜の５ＴＨ2 セロトニン
リセプターへの 3Ｈ−スピペロンの結合を示しているも
のと思われる。５ＴＨ2 リセプターへのＳＣＨ２３３９
０の結合は既に記述されている（２２）。ラット線条体
膜においては、Ｄ2 ドーパミンリセプター─８０乃至９
０％の 3Ｈ−スピペロン結合を含んでなるクラスの結合
部位─についての薬物の見かけの親和性は、Ｌ−ＲＧＢ
２Ｚｅｍ−１細胞から調製するされた膜への薬物の見か
けの親和性と区別のつかないものであった（図１３）。
3Ｈ−スピペロンの結合は、多くの薬物により阻害さ
れ、得られたＫi 値は線条体膜を用いて得られたものと
よく一致した（図１２，１３）。Ｄ2 アゴニストである
（＋）−ブタクラモール及びハロペリドールは、最も強
い阻害剤であり、スルピリドがこれに続いた。Ｄ1 ドー
パミンアンタゴニストであるＳＣＨ２３３９０及びセロ
トニン５ＨＴ2 アンタゴニストであるケタンセリンは、
3Ｈ−スピペロン結合の阻止力がずっと弱かった。結合
の阻害において（＋）−ブタクラモールが（−）−ブタ
クラモールよりずっと強かったことから、結合は立体選
択性を有するものと思われた。これらの実験において
は、ドーパミンアンタゴニストの絶対的親和性と薬物の
強さの序列（スピペロン＞ハロペリドール＞スルピリド
＞＞（−）−ブタクラモール）は、前に公表されたＤ2
ドーパミンリセプターの値（２）とよく一致しているＬ
−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１膜の全ての結合データは、単一の
クラスの結合部位の存在を想定することにより最も良く
当てはまった。他方、ラット線条体膜への 3Ｈ−スピペ
ロンの結合の数種の薬物による阻害は、２つのクラスの
結合部位の存在を想定することにより最もよく当てはま
った。こうして、ＳＣＨ２３３９０及びケタンセリン
は、ラット線条体膜への 3Ｈ−スピペロンの結合の１０
−２０％を高い親和性をもって阻害した（図１３）。ラ
ット線条体膜においては、スルピリドによる放射性リガ
ンドの結合の阻害は、１つのクラスの結合部位により最
もよく当てはまったが、（＋）−ブタクラモール置換性
結合の１０−１５％は、使用した濃度のスルピリドでは
阻害されなかった。ケタンセリン及びＳＣＨ２３３９０
に高い親和性を有し且つスルピリドによっては置換され
ない結合部位は、ラット線条体膜の５ＴＨ2 セロトニン
リセプターへの 3Ｈ−スピペロンの結合を示しているも
のと思われる。５ＴＨ2 リセプターへのＳＣＨ２３３９
０の結合は既に記述されている（２２）。ラット線条体
膜においては、Ｄ2 ドーパミンリセプター─８０乃至９
０％の 3Ｈ−スピペロン結合を含んでなるクラスの結合
部位─についての薬物の見かけの親和性は、Ｌ−ＲＧＢ
２Ｚｅｍ−１細胞から調製するされた膜への薬物の見か
けの親和性と区別のつかないものであった（図１３）。
【００４９】Ｄ2 ドーパミンリセプターの刺激の生理学
的効果は、Ｇi により仲介されるように見える。ＧＴＰ
によるＤ2 ドーパミンリセプターへのアゴニストの結合
の阻害は、アゴニストに対して高い親和性を有するリセ
プターＧi 複合体のＧＴＰ−誘導性の解離（２３、２
４）によるものと考えられる。 3Ｈ−スピペロン結合が
Ｋi 値１７μｍにてＬ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１膜において
阻害されたとはいえ、このドーパミン結合は追加のＧＴ
Ｐには反応しなかった。しかしこの知見は、報告されて
いるＬ細胞におけるＧi の欠如（２５）と符合してい
る。ここに提示した薬理学的データは、Ｄ2 ドーパミン
リセプターの結合特性がＲＧＢ−２ ｃＤＮＡを表現し
ているＬｔｋ−細胞において見出されたことを証明して
いる。
的効果は、Ｇi により仲介されるように見える。ＧＴＰ
によるＤ2 ドーパミンリセプターへのアゴニストの結合
の阻害は、アゴニストに対して高い親和性を有するリセ
プターＧi 複合体のＧＴＰ−誘導性の解離（２３、２
４）によるものと考えられる。 3Ｈ−スピペロン結合が
Ｋi 値１７μｍにてＬ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１膜において
阻害されたとはいえ、このドーパミン結合は追加のＧＴ
Ｐには反応しなかった。しかしこの知見は、報告されて
いるＬ細胞におけるＧi の欠如（２５）と符合してい
る。ここに提示した薬理学的データは、Ｄ2 ドーパミン
リセプターの結合特性がＲＧＢ−２ ｃＤＮＡを表現し
ているＬｔｋ−細胞において見出されたことを証明して
いる。
【００５０】前述のデータは、ＲＧＢ−２ ｃＤＮＡ
が、親核細胞にトランスフェクトされたとき、Ｄ2 ドー
パミン結合蛋白質の表現を指令することを示している。
このｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡがＤ2 ドーパミンリセ
プターの存在が知られている組織に局在していることか
ら、そして、このｍＲＮＡがＧ蛋白質結合リセプターの
全ての予期される特徴を有する蛋白質をコードすること
から、ＲＧＢ−２はラットＤ2 ドーパミンリセプターの
クローンである。
が、親核細胞にトランスフェクトされたとき、Ｄ2 ドー
パミン結合蛋白質の表現を指令することを示している。
このｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡがＤ2 ドーパミンリセ
プターの存在が知られている組織に局在していることか
ら、そして、このｍＲＮＡがＧ蛋白質結合リセプターの
全ての予期される特徴を有する蛋白質をコードすること
から、ＲＧＢ−２はラットＤ2 ドーパミンリセプターの
クローンである。
【００５１】図１〜７に示した核酸配列は、例えばＥｃ
ｏＲＩ部位又は他の適当な部位を用いて、広範な種類の
通常のそして好ましくは市販のプラスミドに挿入するこ
とができる。図１６〜２０は、図１〜７の配列の制限地
図である。
ｏＲＩ部位又は他の適当な部位を用いて、広範な種類の
通常のそして好ましくは市販のプラスミドに挿入するこ
とができる。図１６〜２０は、図１〜７の配列の制限地
図である。
【００５２】この開示に基づく本発明のドーパミンリセ
プター遺伝子、特に哺乳類Ｄ2 ドーパミンリセプター遺
伝子は、多くの通常の方法をもちいて今や日常的に製造
し、単離し及び／又はクローン化することができる。例
えば、ここに開示した手順は、ドーパミンリセプターＤ
ＮＡ配列を含むライブラリーについて実質的に反復する
ことができる。代わりに、ドーパミンリセプター遺伝
子、特にヒトドーパミンＤ2 リセプター遺伝子、に選択
的なオリゴヌクレオチドのプローブが、例えば図１の配
列及び／又は省略されたイントロンから、日常的に設計
され得る。これらは、ドーパミンリセプター核酸配列を
含む核酸ライブラリーをスクリーニングするのに用いる
ことができる。該プローブ、特にそのようなプローブの
複数（例えば２又は３）の全て、にハイブリッドするこ
れらのライブラリーにおける配列は、高い確率をもって
本発明のＤＮＡ配列であろう。無論、通常の方法を用い
て図１〜７又はそのいかなるフラグメントの配列をも合
成することが可能である。
プター遺伝子、特に哺乳類Ｄ2 ドーパミンリセプター遺
伝子は、多くの通常の方法をもちいて今や日常的に製造
し、単離し及び／又はクローン化することができる。例
えば、ここに開示した手順は、ドーパミンリセプターＤ
ＮＡ配列を含むライブラリーについて実質的に反復する
ことができる。代わりに、ドーパミンリセプター遺伝
子、特にヒトドーパミンＤ2 リセプター遺伝子、に選択
的なオリゴヌクレオチドのプローブが、例えば図１の配
列及び／又は省略されたイントロンから、日常的に設計
され得る。これらは、ドーパミンリセプター核酸配列を
含む核酸ライブラリーをスクリーニングするのに用いる
ことができる。該プローブ、特にそのようなプローブの
複数（例えば２又は３）の全て、にハイブリッドするこ
れらのライブラリーにおける配列は、高い確率をもって
本発明のＤＮＡ配列であろう。無論、通常の方法を用い
て図１〜７又はそのいかなるフラグメントの配列をも合
成することが可能である。
【００５３】本発明はまた、広範囲にわたる有用な産物
の製造及び広範囲にわたる種々の有用な方法の使用を可
能にし、並びにドーパミンリセプターの研究及び制御の
ための基礎的な道具を提供する。
の製造及び広範囲にわたる種々の有用な方法の使用を可
能にし、並びにドーパミンリセプターの研究及び制御の
ための基礎的な道具を提供する。
【００５４】これら産物及び方法は、よく知られた組み
換えＤＮＡ、免疫化学的な及びその他のバイオテクノロ
ジー産業の方法を用いて、それぞれ生産され及び実施さ
れることができる。次を参照のこと： 米国特許第４２
３７２２４号、米国特許第４２６４７３１号、米国特許
第４２７３８７５号、米国特許第４２９３６５２号、ヨ
ーロッパ特許第０９３６１９号、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａ
ｌ．，”Ａ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＡｄｖａｎｃｅｄＢａｃｔｅ
ｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ”，Ｃｏｌｄ Ｓｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８
０）；Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｄａｖｉｓ ｅｔａ
ｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．
Ｙ．（１９８６）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ，Ｂｅｒｇｅｒ ＆ Ｋｉｍｍｅｌ（Ｅｄ
ｓ．），（１９８７）．
換えＤＮＡ、免疫化学的な及びその他のバイオテクノロ
ジー産業の方法を用いて、それぞれ生産され及び実施さ
れることができる。次を参照のこと： 米国特許第４２
３７２２４号、米国特許第４２６４７３１号、米国特許
第４２７３８７５号、米国特許第４２９３６５２号、ヨ
ーロッパ特許第０９３６１９号、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａ
ｌ．，”Ａ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＡｄｖａｎｃｅｄＢａｃｔｅ
ｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ”，Ｃｏｌｄ Ｓｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８
０）；Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｄａｖｉｓ ｅｔａ
ｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．
Ｙ．（１９８６）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ，Ｂｅｒｇｅｒ ＆ Ｋｉｍｍｅｌ（Ｅｄ
ｓ．），（１９８７）．
【００５５】本発明は、第一に、ドーパミンＤ2 リセプ
ターの１次アミノ酸配列の全て並びにその生物学的性質
を有する、精製され及び単離されたポリペプチド産物を
提供する。それは次のものを含む： リン酸化及びグリ
コシル化のような共有結合的修飾のための全ての部位、
機能的蛋白質の２次、３次及び４次構造を決定する全て
の１次アミノ酸配列、抗原性及び抗体結合部位を提供す
る全ての分子部分、資質、炭水化物、及び蛋白質例えば
グアニンヌクレオチド結合調節蛋白質のような他の生物
学的分子との非共有結合的相互作用を提供する全ての蛋
白質部分、アゴニスト、部分的アゴニストおよびアンタ
ゴニストその他のリガンドへの結合部位を形成する全蛋
白質部分、脱感作のような正常な生物学的活性に含まれ
る機能的なコンフォメーション変化のために必要な全蛋
白質部分、及びこのリセプターの遺伝子のそのたの繋ぎ
により生じ得る全蛋白質。
ターの１次アミノ酸配列の全て並びにその生物学的性質
を有する、精製され及び単離されたポリペプチド産物を
提供する。それは次のものを含む： リン酸化及びグリ
コシル化のような共有結合的修飾のための全ての部位、
機能的蛋白質の２次、３次及び４次構造を決定する全て
の１次アミノ酸配列、抗原性及び抗体結合部位を提供す
る全ての分子部分、資質、炭水化物、及び蛋白質例えば
グアニンヌクレオチド結合調節蛋白質のような他の生物
学的分子との非共有結合的相互作用を提供する全ての蛋
白質部分、アゴニスト、部分的アゴニストおよびアンタ
ゴニストその他のリガンドへの結合部位を形成する全蛋
白質部分、脱感作のような正常な生物学的活性に含まれ
る機能的なコンフォメーション変化のために必要な全蛋
白質部分、及びこのリセプターの遺伝子のそのたの繋ぎ
により生じ得る全蛋白質。
【００５６】これらのポリペプチドは、例えば培養した
細菌、酵母又は哺乳類細胞のような、原核又は親核ホス
トにより、完全に慣用の形質転換又はトランスフェクシ
ョン（例えば哺乳類細胞ではリン酸カルシウムによる）
技術を用いて、本発明の核酸から表現させることができ
る。脊椎動物（例えば哺乳類及び鳥類）細胞におけるそ
のような表現の産物は、自然の形態では関連するであろ
う他のヒト例えば又は夾雑物を含まないものとして得ら
れるという点において、特に有利である。表現のための
好ましいホストは、哺乳類でありこれは例えば、マウス
Ｌｋｔ細胞、ハムスターＣＨＯ細胞、マウスＧＨ4 細
胞、マウスＣ6 細胞、マウス／ラットＮＧ１０８−１５
細胞及びマウスＡｔＴ２０細胞を含む。例えば、図１〜
７の遺伝子が市販の成長ホルモンＧＨ4 細胞にトランス
フェクトされると、ｃＡＭＰセカンドメッセンジャー系
が調節されるのが認められた。好ましいベクターには、
ｐＺｅｍ又はｐＲＳＶ又はワクチニアウイルス及びレト
ロウイルスのようなウイルスのベクターが含まれる。
細菌、酵母又は哺乳類細胞のような、原核又は親核ホス
トにより、完全に慣用の形質転換又はトランスフェクシ
ョン（例えば哺乳類細胞ではリン酸カルシウムによる）
技術を用いて、本発明の核酸から表現させることができ
る。脊椎動物（例えば哺乳類及び鳥類）細胞におけるそ
のような表現の産物は、自然の形態では関連するであろ
う他のヒト例えば又は夾雑物を含まないものとして得ら
れるという点において、特に有利である。表現のための
好ましいホストは、哺乳類でありこれは例えば、マウス
Ｌｋｔ細胞、ハムスターＣＨＯ細胞、マウスＧＨ4 細
胞、マウスＣ6 細胞、マウス／ラットＮＧ１０８−１５
細胞及びマウスＡｔＴ２０細胞を含む。例えば、図１〜
７の遺伝子が市販の成長ホルモンＧＨ4 細胞にトランス
フェクトされると、ｃＡＭＰセカンドメッセンジャー系
が調節されるのが認められた。好ましいベクターには、
ｐＺｅｍ又はｐＲＳＶ又はワクチニアウイルス及びレト
ロウイルスのようなウイルスのベクターが含まれる。
【００５７】本発明のポリペプチドは、例えばグリコシ
ル化及び非グリコシル化形態の双方の全ての可能な変種
を含む。含まれる特定の炭水化物は、表現のために使用
した哺乳類又は他の親核細胞に依存するであろう。本発
明のポリペプチドはまた、先頭メチオニンアミノ酸残基
を含むこともできる。
ル化及び非グリコシル化形態の双方の全ての可能な変種
を含む。含まれる特定の炭水化物は、表現のために使用
した哺乳類又は他の親核細胞に依存するであろう。本発
明のポリペプチドはまた、先頭メチオニンアミノ酸残基
を含むこともできる。
【００５８】更に本発明には、合成的又は他の方法で、
図１〜７のアミノ酸配列及び／又は本発明のドーパミン
リセプター自身を複製した、又はこれを部分的にのみ複
製した、ポリペプチドも含まれる。これら全体または部
分的に複製したポリペプチドは、好ましくはまた、ドー
パミンリセプター自身の生物学的及び／又は免疫学的活
性を保持するであろう。更に本発明の範囲には、そのよ
うなポリペプチドと免疫学的に反応性のあるモノクロー
ナルまたはポリクローナル抗体（慣用の技術で生産され
好ましくは標識された）をも含む。
図１〜７のアミノ酸配列及び／又は本発明のドーパミン
リセプター自身を複製した、又はこれを部分的にのみ複
製した、ポリペプチドも含まれる。これら全体または部
分的に複製したポリペプチドは、好ましくはまた、ドー
パミンリセプター自身の生物学的及び／又は免疫学的活
性を保持するであろう。更に本発明の範囲には、そのよ
うなポリペプチドと免疫学的に反応性のあるモノクロー
ナルまたはポリクローナル抗体（慣用の技術で生産され
好ましくは標識された）をも含む。
【００５９】好ましい部分的ポリペプチド（フラグメン
ト）は図８に示した疎水性膜横断領域Ｖ，ＶＩ及びＶＩ
Ｉに位置する配列の一部を少なくとも含むものである。
これらは、リガンド結合部位、特に領域ＶＩＩの位置に
近似している。第３の細胞質ループもまた重要なフラグ
メント領域である。すなわち例えばＧ−蛋白質結合はこ
の領域及び領域Ｖ及びＶＩを必要とする。特定の領域リ
セプターに高度に選択的な抗体を得たい場合には、その
ような抗体を生産するフラグメントが、膜横断領域Ｖ及
びＶＩの間の高度に特徴的な領域、すなわちいずれも他
のリセプターとは相同性が低いものである第３の細胞質
ループ、又はＣ末端領域が選別され及び／又はこれらの
領域にあるエピトープに特異的な抗体が選別されるであ
ろう。他のリセプター／遺伝子の特異的領域は、イント
ロン配列、例えば上記のＲＧＢ−２の領域である。合成
された特に好ましいペプチドは（図１〜７のアミノ酸番
号を参照して）：（Ａ）２−１３；（Ｂ）１８２−１９
２；（Ｃ）２６４−２７７；（Ｄ）２８７−２９８；及
び（Ｅ）４０４−４１４である。これらは次の原理に基
づいて選別される。すなわち、大きな数のＰｒｏ残基
（Ｂ／Ｃ／Ｄ）を含むペプチドの知られた抗原性、Ｎ及
びＣ末端（Ａ）及び（Ｅ）のカバリッジ、リセプター反
応をブロックするに効果的な細胞外領域（リセプター反
応領域）に抗体を向かわせる能力（Ａ／Ｃ／Ｄ）。これ
らフラグメントに対する抗体、例えば完全に慣用のハイ
ブリドーマ技術によるモノクローナル抗体、は慣用の方
法で作られる。
ト）は図８に示した疎水性膜横断領域Ｖ，ＶＩ及びＶＩ
Ｉに位置する配列の一部を少なくとも含むものである。
これらは、リガンド結合部位、特に領域ＶＩＩの位置に
近似している。第３の細胞質ループもまた重要なフラグ
メント領域である。すなわち例えばＧ−蛋白質結合はこ
の領域及び領域Ｖ及びＶＩを必要とする。特定の領域リ
セプターに高度に選択的な抗体を得たい場合には、その
ような抗体を生産するフラグメントが、膜横断領域Ｖ及
びＶＩの間の高度に特徴的な領域、すなわちいずれも他
のリセプターとは相同性が低いものである第３の細胞質
ループ、又はＣ末端領域が選別され及び／又はこれらの
領域にあるエピトープに特異的な抗体が選別されるであ
ろう。他のリセプター／遺伝子の特異的領域は、イント
ロン配列、例えば上記のＲＧＢ−２の領域である。合成
された特に好ましいペプチドは（図１〜７のアミノ酸番
号を参照して）：（Ａ）２−１３；（Ｂ）１８２−１９
２；（Ｃ）２６４−２７７；（Ｄ）２８７−２９８；及
び（Ｅ）４０４−４１４である。これらは次の原理に基
づいて選別される。すなわち、大きな数のＰｒｏ残基
（Ｂ／Ｃ／Ｄ）を含むペプチドの知られた抗原性、Ｎ及
びＣ末端（Ａ）及び（Ｅ）のカバリッジ、リセプター反
応をブロックするに効果的な細胞外領域（リセプター反
応領域）に抗体を向かわせる能力（Ａ／Ｃ／Ｄ）。これ
らフラグメントに対する抗体、例えば完全に慣用のハイ
ブリドーマ技術によるモノクローナル抗体、は慣用の方
法で作られる。
【００６０】本発明はまた、 ドーパミンリセプター全
体又はそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列、並び
に、そのような全体又は部分的配列を含んだ表現ベクタ
ー（例えばウイルス及び環状プラスミドベクター）にも
関するものである。同様に、ホスト（例えば細菌、酵母
及び哺乳類）又はそのようなベクターで形質転換され又
はトランスフェクトされた細胞も含まれる。そのような
ベクターにある配列に対応するポリペプチドを表現させ
る対応した方法もまた含まれるが、それらは例えば、外
因性配列の大きい規模での表現のための及び例えば成長
培養液、細胞溶解液又は細胞膜分画からのポリペプチド
の単離のための、適当な条件のもとで形質転換され又は
トランスフェクト細胞を培養することを含んでなるもの
である。
体又はそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列、並び
に、そのような全体又は部分的配列を含んだ表現ベクタ
ー（例えばウイルス及び環状プラスミドベクター）にも
関するものである。同様に、ホスト（例えば細菌、酵母
及び哺乳類）又はそのようなベクターで形質転換され又
はトランスフェクトされた細胞も含まれる。そのような
ベクターにある配列に対応するポリペプチドを表現させ
る対応した方法もまた含まれるが、それらは例えば、外
因性配列の大きい規模での表現のための及び例えば成長
培養液、細胞溶解液又は細胞膜分画からのポリペプチド
の単離のための、適当な条件のもとで形質転換され又は
トランスフェクト細胞を培養することを含んでなるもの
である。
【００６１】本発明のＤＮＡ配列はまた、ここに記述さ
れた自然の配列と異なるポリペプチドの変種、突然変異
又は類縁体をコードするものをも含む。そのような相違
は、自然の配列から１又はより多くのアミノ酸残基を除
去することにより、そのような残基を置換することによ
り及び／又は自然の配列に１又はより多くのアミノ酸残
基を加える添加により、誘導することができる。好まし
くは、得られる修飾されたポリペプチドはドーパミンリ
セプターの生物学的又は免疫学的活性のうち少なくとも
１つを保持するであろう。ドーパミン親和性活性に影響
を及ぼしそうな突然変異は、膜横断領域Ｖ，ＶＩ若しく
はＶＩＩにおける又は第３の細胞質ループにおけるもの
であろう。加えて、ＤＮＡ配列はまた、ここにおいて述
べられた、特に各図にて示した、他のＤＮＡ鎖のいかな
る相補的な配列をも含む。すなわち、典型的にはここに
述べたハイブリッド化条件下にて若しくはより激しい条
件下にてここに述べたＤＮＡ配列にハイブリッドする又
はそのようなＤＮＡ配列のフラグメントとハイブリッド
するＤＮＡ配列、及び遺伝子コードの変性によりここに
示したものと異なっているＤＮＡ配列。こうして、本発
明は、ドーパミンリセプターをコードし及びここに示し
た配列の１又はより多くのものとハイブリッドする全て
のＤＮＡ配列を含む。これらには、対立変種及びここに
記述した実験にて述べた種以外の哺乳類からのドーパミ
ンリセプターが含まれる。ｃＤＮＡ又はゲノムドーパミ
ンリセプターＤＮＡの修飾は、部位指向性の突然変異技
術を含むよく知られた技術により容易に達成することが
できる。そのような修飾されたＤＮＡ配列は、ドーパミ
ンリセプターの生物学的活性の保持が望まれる場合には
例えば膜横断領域Ｖ、ＶＩ若しくはＶＩＩや第３の細胞
質ループではない選ばれた領域おいてなされた、除去、
付加及び／又は置換を含むことができる。前述の生物学
的活性及び／又は対応するＤＮＡ配列を保持しない修飾
された蛋白質もまた、例えば本発明の種々の測定におい
て、有用であろう。そのような特に好ましいものにおい
ては、膜横断領域Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ又は第３の細胞質ル
ープは、配列の修飾により除去又は不活化されるであろ
う。グリコシル化部位の除去もまた、例えば酵母細胞に
おけるポリペプチドの表現のためには有用な変種であ
る。
れた自然の配列と異なるポリペプチドの変種、突然変異
又は類縁体をコードするものをも含む。そのような相違
は、自然の配列から１又はより多くのアミノ酸残基を除
去することにより、そのような残基を置換することによ
り及び／又は自然の配列に１又はより多くのアミノ酸残
基を加える添加により、誘導することができる。好まし
くは、得られる修飾されたポリペプチドはドーパミンリ
セプターの生物学的又は免疫学的活性のうち少なくとも
１つを保持するであろう。ドーパミン親和性活性に影響
を及ぼしそうな突然変異は、膜横断領域Ｖ，ＶＩ若しく
はＶＩＩにおける又は第３の細胞質ループにおけるもの
であろう。加えて、ＤＮＡ配列はまた、ここにおいて述
べられた、特に各図にて示した、他のＤＮＡ鎖のいかな
る相補的な配列をも含む。すなわち、典型的にはここに
述べたハイブリッド化条件下にて若しくはより激しい条
件下にてここに述べたＤＮＡ配列にハイブリッドする又
はそのようなＤＮＡ配列のフラグメントとハイブリッド
するＤＮＡ配列、及び遺伝子コードの変性によりここに
示したものと異なっているＤＮＡ配列。こうして、本発
明は、ドーパミンリセプターをコードし及びここに示し
た配列の１又はより多くのものとハイブリッドする全て
のＤＮＡ配列を含む。これらには、対立変種及びここに
記述した実験にて述べた種以外の哺乳類からのドーパミ
ンリセプターが含まれる。ｃＤＮＡ又はゲノムドーパミ
ンリセプターＤＮＡの修飾は、部位指向性の突然変異技
術を含むよく知られた技術により容易に達成することが
できる。そのような修飾されたＤＮＡ配列は、ドーパミ
ンリセプターの生物学的活性の保持が望まれる場合には
例えば膜横断領域Ｖ、ＶＩ若しくはＶＩＩや第３の細胞
質ループではない選ばれた領域おいてなされた、除去、
付加及び／又は置換を含むことができる。前述の生物学
的活性及び／又は対応するＤＮＡ配列を保持しない修飾
された蛋白質もまた、例えば本発明の種々の測定におい
て、有用であろう。そのような特に好ましいものにおい
ては、膜横断領域Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ又は第３の細胞質ル
ープは、配列の修飾により除去又は不活化されるであろ
う。グリコシル化部位の除去もまた、例えば酵母細胞に
おけるポリペプチドの表現のためには有用な変種であ
る。
【００６２】上記のように、ドーパミンリセプターをコ
ードするＤＮＡ配列のかなりの部分が種々の哺乳類種で
保存されているということが確立されている。従って、
日常的な実験を用いるのみで、熟練した当業者は、５’
側、図１〜７に示したイントロン性及び構造遺伝子配列
並びに図２１〜２３に示したヒト配列を含むここに示し
た配列の詳細に従って製造されたプローブを用いて、他
のドーパミンリセプター遺伝子特にＤ2 ドーパミンリセ
プターの存在を求めて、例えば与えられた哺乳類からの
ＤＮＡゲノムライブラリー又は好ましくはｃＤＮＡライ
ブラリーを、容易にスクリーニングすることができる。
プローブは好ましくは、図８に示した７つの高度に保存
された膜横断領域、好ましくは領域ＶＩ及びＶＩＩ、か
ら選ばれるであろう。そのような日常的スクリーニング
は、プローブとハイブリッドするクローンを同定するで
あろう。これらから、ここに記述した技術を用いてドー
パミンリセプターは日常的に選別されることができる。
ヒトＤ2 ドーパミンリセプターに関しては、特に有用な
原料としては、ｃＤＮＡには線条体、下垂体、神経芽細
胞種、腎臓、胎盤細胞等が、ゲノムＤＮＡには肝臓、胎
盤細胞等が含まれる。例えば赤毛ザルのような霊長類に
関しては、特に有用なゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブ
ラリーとしては、脳、腎臓及び胎盤細胞が含まれる。
ードするＤＮＡ配列のかなりの部分が種々の哺乳類種で
保存されているということが確立されている。従って、
日常的な実験を用いるのみで、熟練した当業者は、５’
側、図１〜７に示したイントロン性及び構造遺伝子配列
並びに図２１〜２３に示したヒト配列を含むここに示し
た配列の詳細に従って製造されたプローブを用いて、他
のドーパミンリセプター遺伝子特にＤ2 ドーパミンリセ
プターの存在を求めて、例えば与えられた哺乳類からの
ＤＮＡゲノムライブラリー又は好ましくはｃＤＮＡライ
ブラリーを、容易にスクリーニングすることができる。
プローブは好ましくは、図８に示した７つの高度に保存
された膜横断領域、好ましくは領域ＶＩ及びＶＩＩ、か
ら選ばれるであろう。そのような日常的スクリーニング
は、プローブとハイブリッドするクローンを同定するで
あろう。これらから、ここに記述した技術を用いてドー
パミンリセプターは日常的に選別されることができる。
ヒトＤ2 ドーパミンリセプターに関しては、特に有用な
原料としては、ｃＤＮＡには線条体、下垂体、神経芽細
胞種、腎臓、胎盤細胞等が、ゲノムＤＮＡには肝臓、胎
盤細胞等が含まれる。例えば赤毛ザルのような霊長類に
関しては、特に有用なゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブ
ラリーとしては、脳、腎臓及び胎盤細胞が含まれる。
【００６３】ヒトＤ2 ドーパミンリセプター遺伝子に関
しては、図２１〜２３に示した部分的配列は、λｇｔ１
０中のラット脳ｃＤＮＡの０．８ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｐ
ｓｔＩフラグメントによる探索のための上記の激しいハ
イブリッド化条件の下で、全長ラットｃＤＮＡ、ＲＧＢ
−２であるプローブを用いて下垂体ｃＤＮＡライブラリ
ーを慣用によりスクリーニングすることによって同定さ
れた。ここに述べたｃＤＮＡライブラリーは、例えば上
に引用した、例えばＤａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．の参考文
献に記載されたような、完全に慣用の方法により調製す
ることができる。この配列又はそのフラグメントもま
た、ヒトドーパミンリセプター遺伝子を求めて上記の及
び他の全く慣用の手順に従って、例えば上記の慣用のラ
イブラリーをスクリーニングするために、プローブとし
て有用であり得る。図２１〜２３の配列と図１〜８に示
した配列とを比較すればわかるように、図２１〜２３の
部分的なヒトの配列は、図１〜７の第２５９番のアミノ
酸に始まるＲＧＢ−２と高い相同性を有している。
しては、図２１〜２３に示した部分的配列は、λｇｔ１
０中のラット脳ｃＤＮＡの０．８ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｐ
ｓｔＩフラグメントによる探索のための上記の激しいハ
イブリッド化条件の下で、全長ラットｃＤＮＡ、ＲＧＢ
−２であるプローブを用いて下垂体ｃＤＮＡライブラリ
ーを慣用によりスクリーニングすることによって同定さ
れた。ここに述べたｃＤＮＡライブラリーは、例えば上
に引用した、例えばＤａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．の参考文
献に記載されたような、完全に慣用の方法により調製す
ることができる。この配列又はそのフラグメントもま
た、ヒトドーパミンリセプター遺伝子を求めて上記の及
び他の全く慣用の手順に従って、例えば上記の慣用のラ
イブラリーをスクリーニングするために、プローブとし
て有用であり得る。図２１〜２３の配列と図１〜８に示
した配列とを比較すればわかるように、図２１〜２３の
部分的なヒトの配列は、図１〜７の第２５９番のアミノ
酸に始まるＲＧＢ−２と高い相同性を有している。
【００６４】同様に、本発明はより一般的に、最も広い
意味における哺乳類Ｄ2 ドーパミンリセプター遺伝子、
例えばそのような調節及び構造遺伝子を、例えば読み取
りフレーム中に、単体で又は組み合わせで、含むもので
ある。例えば、ここに論ずる日常的な方法を用いて、そ
のような遺伝子が哺乳類ＤＮＡライブラリーからクロー
ン化されてきたし、またそうされ得る。同様に、本発明
は、生物学的に活性なそのような遺伝子のフラグメン
ト、例えば哺乳類Ｄ2 ドーパミンリセプターの生物学的
活性を有するポリペプチドをコードするフラグメント、
又はそのようなコードするフラグメントの表現を調節す
るのに有用なフラグメント、又は、例えばそれとハイブ
リッドさせることにより、そのような遺伝子若しくはフ
ラグメントのためのプローブとして有用なフラグメン
ト、を含む。
意味における哺乳類Ｄ2 ドーパミンリセプター遺伝子、
例えばそのような調節及び構造遺伝子を、例えば読み取
りフレーム中に、単体で又は組み合わせで、含むもので
ある。例えば、ここに論ずる日常的な方法を用いて、そ
のような遺伝子が哺乳類ＤＮＡライブラリーからクロー
ン化されてきたし、またそうされ得る。同様に、本発明
は、生物学的に活性なそのような遺伝子のフラグメン
ト、例えば哺乳類Ｄ2 ドーパミンリセプターの生物学的
活性を有するポリペプチドをコードするフラグメント、
又はそのようなコードするフラグメントの表現を調節す
るのに有用なフラグメント、又は、例えばそれとハイブ
リッドさせることにより、そのような遺伝子若しくはフ
ラグメントのためのプローブとして有用なフラグメン
ト、を含む。
【００６５】本発明の種々のポリペプチド及び配列は、
検出マーカー物質、典型的には共有結合により、及び更
に典型的には放射性標識により、又はＤＮＡの場合には
ビオチンのような非同位体標識により、慣用のように標
識することができる。該ポリペプチド産物（例えば標識
抗体）は、種々のサンプル中のドーパミンリセプターの
存在の検出及び定量のために慣用の方法で使用すること
ができる。すなわち、該標識ＤＮＡ産物は、通常のハイ
ブリッド法（例えばＮｏｒｔｈｅｒブロット、Ｓｏｕｔ
ｈｅｒｎブロット、スポットアッセイ等）において、例
えば、種々の哺乳類染色体地図におけるドーパミン遺伝
子の位置をつきとめるため、標準レベルに比較してｍＲ
ＮＡ又はリセプター濃度が異常に高い又は低いか否かを
測定するため等の目的に、サンプル中の関連核酸（ＤＮ
Ａ、ＲＮＡ）の存在を検出し及び定量するため、慣用の
方法で使用することができる。それらはまた、やはり全
く慣用の手順を用いて、例えば染色体異常を検出する等
のため、例えばＲＦＬＰ分析（例えばＧｅｎｅｓ ＩＩ
Ｉ，Ｌｅｖｉｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄＳｏｎ
ｓ（１９８７）を参照）を用いて、与えられた患者から
のＤＮＡサンプルに基づくｉｎ ｖｉｔｒｏの診断にて
ドーパミンリセプター遺伝子異常を同定するために、有
用であろう。例えば、ドーパミンリセプターが精神分裂
症に関与することが言われれいることから、本発明の産
物及び方法は、精神分裂症の患者からの核酸を例えばサ
イズ分画形態で特徴づけ、とりわけ患者を精神分裂症サ
ブグループに分類し、標準ＤＮＡ分画列との比較に基づ
き診断する等のために、使用することができる。無論、
それらはまた、ヒト又は他の哺乳類ゲノムのマッピング
において、随伴する遺伝子を、例えばＲＦＬＰ分析及び
適用しうるときは他の異常の分析において、同定するた
めの遺伝子マーカーとして使用することもできる。上に
論じた遺伝子の特徴的領域、例えばイントロン領域、第
３の細胞質ループ等は、この点特に有用であろう。
検出マーカー物質、典型的には共有結合により、及び更
に典型的には放射性標識により、又はＤＮＡの場合には
ビオチンのような非同位体標識により、慣用のように標
識することができる。該ポリペプチド産物（例えば標識
抗体）は、種々のサンプル中のドーパミンリセプターの
存在の検出及び定量のために慣用の方法で使用すること
ができる。すなわち、該標識ＤＮＡ産物は、通常のハイ
ブリッド法（例えばＮｏｒｔｈｅｒブロット、Ｓｏｕｔ
ｈｅｒｎブロット、スポットアッセイ等）において、例
えば、種々の哺乳類染色体地図におけるドーパミン遺伝
子の位置をつきとめるため、標準レベルに比較してｍＲ
ＮＡ又はリセプター濃度が異常に高い又は低いか否かを
測定するため等の目的に、サンプル中の関連核酸（ＤＮ
Ａ、ＲＮＡ）の存在を検出し及び定量するため、慣用の
方法で使用することができる。それらはまた、やはり全
く慣用の手順を用いて、例えば染色体異常を検出する等
のため、例えばＲＦＬＰ分析（例えばＧｅｎｅｓ ＩＩ
Ｉ，Ｌｅｖｉｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄＳｏｎ
ｓ（１９８７）を参照）を用いて、与えられた患者から
のＤＮＡサンプルに基づくｉｎ ｖｉｔｒｏの診断にて
ドーパミンリセプター遺伝子異常を同定するために、有
用であろう。例えば、ドーパミンリセプターが精神分裂
症に関与することが言われれいることから、本発明の産
物及び方法は、精神分裂症の患者からの核酸を例えばサ
イズ分画形態で特徴づけ、とりわけ患者を精神分裂症サ
ブグループに分類し、標準ＤＮＡ分画列との比較に基づ
き診断する等のために、使用することができる。無論、
それらはまた、ヒト又は他の哺乳類ゲノムのマッピング
において、随伴する遺伝子を、例えばＲＦＬＰ分析及び
適用しうるときは他の異常の分析において、同定するた
めの遺伝子マーカーとして使用することもできる。上に
論じた遺伝子の特徴的領域、例えばイントロン領域、第
３の細胞質ループ等は、この点特に有用であろう。
【００６６】本発明のポリペプチドが使用できる典型的
な測定には、ＲＩＡ：ＥＬＩＳＡその他の、ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ双方の、よく知られたイムノ
アッセイ技術のあらゆるものが含まれる。ドーパミンリ
セプターのポリペプチド配列の種々のフラグメントはま
た、与えられたフラグメント内のエピトープを求めて、
対応するポリクローナル抗体又は好ましくはモノクロー
ナル抗体（例えば、対応するハイブリドーマの慣用の調
製及び表現により）を製造するために慣用のようにして
使用することができる。抗体は、しばしば慣用のように
して、例えば放射性又は酵素的に標識されよう。好まし
くは、得られるポリクローナル又はモノクローナル抗体
はまた、上述のフラグメントに対してのみならず全蛋白
質に対しても免疫特異的であろう。そのような抗体は、
例えば、ドーパミンリセプター及び関連産物の検出及び
アフィニティー精製又はクロマトグラフィーにおいて、
慣用のようにして使用されよう。
な測定には、ＲＩＡ：ＥＬＩＳＡその他の、ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ双方の、よく知られたイムノ
アッセイ技術のあらゆるものが含まれる。ドーパミンリ
セプターのポリペプチド配列の種々のフラグメントはま
た、与えられたフラグメント内のエピトープを求めて、
対応するポリクローナル抗体又は好ましくはモノクロー
ナル抗体（例えば、対応するハイブリドーマの慣用の調
製及び表現により）を製造するために慣用のようにして
使用することができる。抗体は、しばしば慣用のように
して、例えば放射性又は酵素的に標識されよう。好まし
くは、得られるポリクローナル又はモノクローナル抗体
はまた、上述のフラグメントに対してのみならず全蛋白
質に対しても免疫特異的であろう。そのような抗体は、
例えば、ドーパミンリセプター及び関連産物の検出及び
アフィニティー精製又はクロマトグラフィーにおいて、
慣用のようにして使用されよう。
【００６７】無論、本発明のポリペプチドは、上記のよ
うにして細胞から慣用の手順に従って表現されたもの及
びやはり慣用の手順を用いて合成したものを含む。本発
明は、第１に、自然環境の成分を実質上含まない哺乳類
ドーパミンリセプターの非自然的調製を可能にする。
「実質上純粋な」の語はここではこの意味、すなわち実
質上これらの自然の成分を含まないという意味、で用い
られている。本発明はまた、上記の種々の原料より単離
することのできる又は全く慣用の方法を用いて合成的に
調製することのできるＤＮＡ配列を含む。
うにして細胞から慣用の手順に従って表現されたもの及
びやはり慣用の手順を用いて合成したものを含む。本発
明は、第１に、自然環境の成分を実質上含まない哺乳類
ドーパミンリセプターの非自然的調製を可能にする。
「実質上純粋な」の語はここではこの意味、すなわち実
質上これらの自然の成分を含まないという意味、で用い
られている。本発明はまた、上記の種々の原料より単離
することのできる又は全く慣用の方法を用いて合成的に
調製することのできるＤＮＡ配列を含む。
【００６８】更に本発明の範囲に含まれるのは、本発明
のポリペプチド産物の１若しくはより多くの又は本発明
の核酸配列の１若しくはより多くのものの有効量を、製
薬産業においてよく知られている適当な慣用の賦形剤、
補助薬及び／又は単体と混合してなる、薬剤学的組成物
である。これらは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの使用、例えば、
サンプル中のドーパミンリセプターの存在の若しくはサ
ンプル中の遺伝子若しくは異常遺伝子の存在の検出のた
め、又はサンプル中のリセプター若しくはその遺伝子の
濃度を高めるため、又は遺伝子治療のようなｉｎ ｖｉ
ｖｏでの使用（例えば欠損遺伝子若しくは遺伝子を不活
化し、例えば適当なモノクローナル抗体によりそれをブ
ロックすること）のため及び／又は新しい機能的遺伝子
（例えばレトロウイルスベクターを使用して）を提供す
るため、または与えられた位置におけるドーパミンリセ
プターの濃度を高めるため、例えばアンチセンスオリゴ
配列を投与することによりリセプター表現及び／又は活
性を調節するために、ヒトを含む全ての哺乳類におい
て、使用することができる。かくして、これらの組成物
は、疾患状態、とりわけ上述のようなドーパミンリセプ
ターやその遺伝子の構造、表現又は濃度の異常に関連す
るものを、治療するに有用であろう。与えられた患者に
おけ与えられた状態に対する有効な個々の投与量は、よ
く知られているように、患者の全身状態、体重、特定の
ドーパミン欠乏疾患状態の同一性及び重症度を含む通常
の状態によって変化するであろう。
のポリペプチド産物の１若しくはより多くの又は本発明
の核酸配列の１若しくはより多くのものの有効量を、製
薬産業においてよく知られている適当な慣用の賦形剤、
補助薬及び／又は単体と混合してなる、薬剤学的組成物
である。これらは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの使用、例えば、
サンプル中のドーパミンリセプターの存在の若しくはサ
ンプル中の遺伝子若しくは異常遺伝子の存在の検出のた
め、又はサンプル中のリセプター若しくはその遺伝子の
濃度を高めるため、又は遺伝子治療のようなｉｎ ｖｉ
ｖｏでの使用（例えば欠損遺伝子若しくは遺伝子を不活
化し、例えば適当なモノクローナル抗体によりそれをブ
ロックすること）のため及び／又は新しい機能的遺伝子
（例えばレトロウイルスベクターを使用して）を提供す
るため、または与えられた位置におけるドーパミンリセ
プターの濃度を高めるため、例えばアンチセンスオリゴ
配列を投与することによりリセプター表現及び／又は活
性を調節するために、ヒトを含む全ての哺乳類におい
て、使用することができる。かくして、これらの組成物
は、疾患状態、とりわけ上述のようなドーパミンリセプ
ターやその遺伝子の構造、表現又は濃度の異常に関連す
るものを、治療するに有用であろう。与えられた患者に
おけ与えられた状態に対する有効な個々の投与量は、よ
く知られているように、患者の全身状態、体重、特定の
ドーパミン欠乏疾患状態の同一性及び重症度を含む通常
の状態によって変化するであろう。
【００６９】本発明のポリペプチドはまた、薬物のよう
な候補化合物のそれに対する親和性、例えばＤ2 ドーパ
ミンリセプターに対する（例えばアゴニスト的又はアン
タゴニスト的な）親和性、を試験するために、例えば競
合的結合測定において使用することができる。そのよう
な手順は、例えば、ここにおいて及び／又はドーパミン
リセプターの自然の原料に基づく知られた慣用のプロト
コールに類似の、例えば、Ｓｃｈｗａｒｃｚ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４（１９
８０），７７２−７７８及びＣｒｅｅｓｅ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，
４６（１９７７），３７７−３８１の方法に従って、線
条体リセプター、及び他のリセプターに対するトリチル
化したドーパミンアゴニスト及びアンタゴニストの結合
の阻害のための知られた試験と類似の、全く慣用の手順
を用いて行うことができる。ドーパミンリセプターへの
リガンドの結合によって開始される反応、例えばセカン
ドメッセンジャー系の調節のような細胞反応、を修正し
又は開始させる能力を求めて物質をスクリーニングする
ことも可能である。そのような分析は、本発明の核酸配
列で形質転換した本発明の細胞を利用することができ
る。
な候補化合物のそれに対する親和性、例えばＤ2 ドーパ
ミンリセプターに対する（例えばアゴニスト的又はアン
タゴニスト的な）親和性、を試験するために、例えば競
合的結合測定において使用することができる。そのよう
な手順は、例えば、ここにおいて及び／又はドーパミン
リセプターの自然の原料に基づく知られた慣用のプロト
コールに類似の、例えば、Ｓｃｈｗａｒｃｚ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４（１９
８０），７７２−７７８及びＣｒｅｅｓｅ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，
４６（１９７７），３７７−３８１の方法に従って、線
条体リセプター、及び他のリセプターに対するトリチル
化したドーパミンアゴニスト及びアンタゴニストの結合
の阻害のための知られた試験と類似の、全く慣用の手順
を用いて行うことができる。ドーパミンリセプターへの
リガンドの結合によって開始される反応、例えばセカン
ドメッセンジャー系の調節のような細胞反応、を修正し
又は開始させる能力を求めて物質をスクリーニングする
ことも可能である。そのような分析は、本発明の核酸配
列で形質転換した本発明の細胞を利用することができ
る。
【００７０】ドーパミンリセプターに対する又はドーパ
ミンリセプター遺伝子、特にＤ2 ドーパミンリセプタ
ー、に対する本発明の抗体は、例えば放射線診断、ＭＲ
Ｉ又はポジトロン造影による、診断的造影技術にも使用
することができる。放射性、パラマグネティック又はポ
ジトロン標識は、抗体（好ましくは自然のモノクローナ
ルな）に慣用の方法、例えばポジトロン放射、放射性核
種若しくはパラマグネティック金属のためにはキレート
性基の共有結合、により取りつけることができる。ＭＲ
Ｉ、放射線感受性又はポジトロン造影は、これらの試薬
を用いて慣用の方法で達成することができる。例えば、
Ｍａｚｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ．，ＬｉｆｅＳｃｉ．，３
５，１３４９（１９８４）を参照。
ミンリセプター遺伝子、特にＤ2 ドーパミンリセプタ
ー、に対する本発明の抗体は、例えば放射線診断、ＭＲ
Ｉ又はポジトロン造影による、診断的造影技術にも使用
することができる。放射性、パラマグネティック又はポ
ジトロン標識は、抗体（好ましくは自然のモノクローナ
ルな）に慣用の方法、例えばポジトロン放射、放射性核
種若しくはパラマグネティック金属のためにはキレート
性基の共有結合、により取りつけることができる。ＭＲ
Ｉ、放射線感受性又はポジトロン造影は、これらの試薬
を用いて慣用の方法で達成することができる。例えば、
Ｍａｚｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ．，ＬｉｆｅＳｃｉ．，３
５，１３４９（１９８４）を参照。
【００７１】適当な薬剤学的担体としては、水、生理的
食塩水、ヒト血清アルブミン等が含まれる。組成物はま
た、慣用のドーパミンアゴニスト、ドーパミンアンタゴ
ニスト等の、関与する特定の疾患状態の緩和に適した他
の活性成分を含むこともできる。組成物は、例えば抗体
又はＤＮＡプローブ（例えば、遺伝子の相同性や異常を
検出できるもの）を、例えば酵素、基質、ＤＮＡ制限フ
ラグメント分析用材料のような検出方法に特異的な試薬
と共に含有する、慣用のキットの形態で提供することが
できる。本発明はまた、例えば米国特許第４７３６８６
６号に記載されているのに類似の、知られた方法を用い
て、対応する形質転換動物、特に例えばラット、サル等
のヒト以外の哺乳類、を製造するためにも有用である。
そのような動物は例えば、特に商業的な研究目的に有用
である。ＤＮＡ配列又は対応するｍＲＮＡはまた、例え
ばカエルからの卵母細胞に注入するのに慣用のようにし
て使用することができ、それは次いで慣用のようにして
結合やセカンドメッセンジャーの解析に使用することが
できる。更に、１次アミノ酸配列が入手しうること自
体、ドーパミンリセプターの２次及び３次構造について
の実験的及びコンピューターモデル化と理解とを可能な
らしめるものである。この３次元的情報は、例えば細胞
膜、そのリガンド（結合ポケット）、関連蛋白質、メッ
センジャー系等との相互作用等のリセプター機能の詳細
をモデル化して理解するのに基礎を提供する。そのよう
な解析は、理性的な薬物設計を可能にし、それによって
例えば新しいドーパミンリセプター調節化学薬剤がこの
相互作用の詳細に従って設計されることができる。
食塩水、ヒト血清アルブミン等が含まれる。組成物はま
た、慣用のドーパミンアゴニスト、ドーパミンアンタゴ
ニスト等の、関与する特定の疾患状態の緩和に適した他
の活性成分を含むこともできる。組成物は、例えば抗体
又はＤＮＡプローブ（例えば、遺伝子の相同性や異常を
検出できるもの）を、例えば酵素、基質、ＤＮＡ制限フ
ラグメント分析用材料のような検出方法に特異的な試薬
と共に含有する、慣用のキットの形態で提供することが
できる。本発明はまた、例えば米国特許第４７３６８６
６号に記載されているのに類似の、知られた方法を用い
て、対応する形質転換動物、特に例えばラット、サル等
のヒト以外の哺乳類、を製造するためにも有用である。
そのような動物は例えば、特に商業的な研究目的に有用
である。ＤＮＡ配列又は対応するｍＲＮＡはまた、例え
ばカエルからの卵母細胞に注入するのに慣用のようにし
て使用することができ、それは次いで慣用のようにして
結合やセカンドメッセンジャーの解析に使用することが
できる。更に、１次アミノ酸配列が入手しうること自
体、ドーパミンリセプターの２次及び３次構造について
の実験的及びコンピューターモデル化と理解とを可能な
らしめるものである。この３次元的情報は、例えば細胞
膜、そのリガンド（結合ポケット）、関連蛋白質、メッ
センジャー系等との相互作用等のリセプター機能の詳細
をモデル化して理解するのに基礎を提供する。そのよう
な解析は、理性的な薬物設計を可能にし、それによって
例えば新しいドーパミンリセプター調節化学薬剤がこの
相互作用の詳細に従って設計されることができる。
【００７２】
【表１】
【００７３】さらに研究することなく、以上の説明を利
用して、当業者は本発明のその全範囲において利用する
ことができるものと信じられる。それ故言及した具体例
は単に例示と考えるべきであり、開示の残部の限定と考
えるべきではない。
用して、当業者は本発明のその全範囲において利用する
ことができるものと信じられる。それ故言及した具体例
は単に例示と考えるべきであり、開示の残部の限定と考
えるべきではない。
【００７４】以上の説明から、当業者は本発明の本質的
特徴を容易に確かめることができ、そしてその精神およ
び範囲から逸脱することなく、種々の使用および条件に
適応させるため本発明の種々の変更および修飾を行うこ
とができる。
特徴を容易に確かめることができ、そしてその精神およ
び範囲から逸脱することなく、種々の使用および条件に
適応させるため本発明の種々の変更および修飾を行うこ
とができる。
【００７５】上に引用したすべての出願、特許および文
献のすべては参照のためここに取入れる。
献のすべては参照のためここに取入れる。
【００７６】実施例 実施例１要約 我々は最近ラットドパミンＤ−２レセプターに対する相
補的ＤＮＡをクローンし、このレセプターを発現する細
胞ラインをつくることを可能にした。Ｄ−２ｃＤＮＡ
（ＲＧＢ−２）をマウスフィブロブラストＬｔｋ- 細胞
中にトランスフェクトすることによって細胞ライン（Ｌ
ＺＲ１）がつくられた。以前Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１と
して記載された（１）ＬＺＲ１細胞はＤ−２レセプター
の高密度を発現したが、野性タイプの細胞は発現しなか
った。ＲＧＢ−２ｃＤＮＡのトランスフェクションは亜
鉛誘発マウスメタロチオネインプロモーターによって調
節されるけれども、ＬＺＲ１から調製された膜上のＤ−
２レセプターの密度は該細胞を亜鉛で処理後も増加しな
かった。ＬＺＲ２と命名されたＬｔｋ- 細胞から誘導さ
れた第２の細胞ラインは非誘発状態においてＤ−２レセ
プターの低密度を持っていたが、亜鉛による処理はレセ
プター密度に５０％増加を誘発した。多数のアゴニスト
は、発現したＤ−２レセプターに対する〔 3Ｈ〕スピロ
ペリドールの結合を競合的にそして選択的に阻害した。
ＬＺＲ１細胞においては、ドパミンはＧＴＰおよびＮａ
Ｃｌの存在したよりも不存在下において放射性リガンド
結合のより強力な阻害剤であった。ドパミンは、ＬＺＲ
１細胞から調製した膜においてフォルコリン刺激アデニ
レートサイクラーゼ活性を２７％減少させた。ドパミン
による阻害は（＋）ブタクラモールにより、または無傷
の細胞の百日咳トキシンによる前処理によってブロック
された。これらデータは、ＲＧＢ−２ ｃＤＮＡはグア
ニンヌクレオチド結合タンパクと相互作用し、そしてア
デニレートサイクラーゼ活性を阻害することができるド
パミンＤ−２レセプターの発現を命令することを指示す
る。さらにＲＧＢ−２ ｃＤＮＡは、ドパミンＤ−２レ
セプターの生物学的および薬理学的特徴化のための道具
として有用な多数の細胞ラインをつくる手段を提供す
る。
補的ＤＮＡをクローンし、このレセプターを発現する細
胞ラインをつくることを可能にした。Ｄ−２ｃＤＮＡ
（ＲＧＢ−２）をマウスフィブロブラストＬｔｋ- 細胞
中にトランスフェクトすることによって細胞ライン（Ｌ
ＺＲ１）がつくられた。以前Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１と
して記載された（１）ＬＺＲ１細胞はＤ−２レセプター
の高密度を発現したが、野性タイプの細胞は発現しなか
った。ＲＧＢ−２ｃＤＮＡのトランスフェクションは亜
鉛誘発マウスメタロチオネインプロモーターによって調
節されるけれども、ＬＺＲ１から調製された膜上のＤ−
２レセプターの密度は該細胞を亜鉛で処理後も増加しな
かった。ＬＺＲ２と命名されたＬｔｋ- 細胞から誘導さ
れた第２の細胞ラインは非誘発状態においてＤ−２レセ
プターの低密度を持っていたが、亜鉛による処理はレセ
プター密度に５０％増加を誘発した。多数のアゴニスト
は、発現したＤ−２レセプターに対する〔 3Ｈ〕スピロ
ペリドールの結合を競合的にそして選択的に阻害した。
ＬＺＲ１細胞においては、ドパミンはＧＴＰおよびＮａ
Ｃｌの存在したよりも不存在下において放射性リガンド
結合のより強力な阻害剤であった。ドパミンは、ＬＺＲ
１細胞から調製した膜においてフォルコリン刺激アデニ
レートサイクラーゼ活性を２７％減少させた。ドパミン
による阻害は（＋）ブタクラモールにより、または無傷
の細胞の百日咳トキシンによる前処理によってブロック
された。これらデータは、ＲＧＢ−２ ｃＤＮＡはグア
ニンヌクレオチド結合タンパクと相互作用し、そしてア
デニレートサイクラーゼ活性を阻害することができるド
パミンＤ−２レセプターの発現を命令することを指示す
る。さらにＲＧＢ−２ ｃＤＮＡは、ドパミンＤ−２レ
セプターの生物学的および薬理学的特徴化のための道具
として有用な多数の細胞ラインをつくる手段を提供す
る。
【００７７】序論 ドパミン（ＤＡ）レセプターは、機能的および薬理学的
プロフィルに基いて二つのサブタイプに分けられている
（２）。ＤＡ Ｄ−２レセプターはそれらのアデニレー
トサイクラーゼ活性を阻害する能力によって機能的に特
徴化される（３）。Ｄ−２レセプターの活性化はカルシ
ウムチャンネルを阻害し（４，５）、カリウム伝導度を
増加し（６）、そしてイノシトールフォスフェートの蓄
積を阻害し得る（７，８）。ＤＡレセプターの調節およ
び機能的特徴の研究を妨げていた一つの要因は、該レセ
プターを発現する細胞ラインがないことであった。プロ
ラクチン分泌腫瘍から誘導された一つの細胞ラインが最
近その中でＤＡがアデニレートサイクラーゼ活性および
プロラクチン分泌を阻害すると記載された（９）。
プロフィルに基いて二つのサブタイプに分けられている
（２）。ＤＡ Ｄ−２レセプターはそれらのアデニレー
トサイクラーゼ活性を阻害する能力によって機能的に特
徴化される（３）。Ｄ−２レセプターの活性化はカルシ
ウムチャンネルを阻害し（４，５）、カリウム伝導度を
増加し（６）、そしてイノシトールフォスフェートの蓄
積を阻害し得る（７，８）。ＤＡレセプターの調節およ
び機能的特徴の研究を妨げていた一つの要因は、該レセ
プターを発現する細胞ラインがないことであった。プロ
ラクチン分泌腫瘍から誘導された一つの細胞ラインが最
近その中でＤＡがアデニレートサイクラーゼ活性および
プロラクチン分泌を阻害すると記載された（９）。
【００７８】我々は最近、β2 −アドレナリンレセプタ
ーおよびグラニンヌクレオチド結合タンパクと相互作用
する他のレセプターと著名な同族性を有する、ＲＧＢ−
２と命名したラット脳相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をクロー
ンした。三系統の証拠がＲＧＢ−２ ｃＤＮＡはＤＡ
Ｄ−２レセプターをコードすることを指示する。（１）
このタンパクの推定アミノ酸配列はグアニンヌクレオチ
ド結合タンパクへ結合するレセプターに典型的である７
個の膜スパニング領域（１０）の存在を指示する。
（２）ｃＤＮＡとハイブリダイズするメッセンジャＲＮ
Ａの分布がＤ−２レセプターの分布と平行している。
（３）ＲＧＢ−２ ｃＤＮＡをＤ−２選択性リガンド〔
3Ｈ〕スピロペリドールの高いアフィニティー結合を欠
く細胞中へトランスフェクトする時、細胞はＤ−２レセ
プターの薬理学的プロフィル特徴（１）を有する放射性
リガンドのための結合部位を発現する。
ーおよびグラニンヌクレオチド結合タンパクと相互作用
する他のレセプターと著名な同族性を有する、ＲＧＢ−
２と命名したラット脳相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をクロー
ンした。三系統の証拠がＲＧＢ−２ ｃＤＮＡはＤＡ
Ｄ−２レセプターをコードすることを指示する。（１）
このタンパクの推定アミノ酸配列はグアニンヌクレオチ
ド結合タンパクへ結合するレセプターに典型的である７
個の膜スパニング領域（１０）の存在を指示する。
（２）ｃＤＮＡとハイブリダイズするメッセンジャＲＮ
Ａの分布がＤ−２レセプターの分布と平行している。
（３）ＲＧＢ−２ ｃＤＮＡをＤ−２選択性リガンド〔
3Ｈ〕スピロペリドールの高いアフィニティー結合を欠
く細胞中へトランスフェクトする時、細胞はＤ−２レセ
プターの薬理学的プロフィル特徴（１）を有する放射性
リガンドのための結合部位を発現する。
【００７９】Ｄ−２レセプターｃＤＮＡのクローニング
は、レセプター活性化の効果が容易に決定できる細胞ラ
イン中にＤＡレセプターを発現させることが可能にな
る。我々は、マウスＬ細胞を亜鉛誘発マウスメタロチオ
ネインプロモーターの規制のもとでＲＧＢ−２でトラン
スフェクトすることによって得られた細胞ラインへ〔 3
Ｈ〕スピロペリドールおよび他のＤ−２アンタゴニスト
の結合を以前記載した（１）。我々はまた、以前使用し
たアッセイ条件のもとでは、ＤＡのＬＺＲ１膜への結合
はＧＴＰへ応答しなかったことを報告した。我々は今
や、ＲＧＢ−２ ｃＤＮＡによってコードされたＤ−２
レセプターはアゴニストの結合のグアニンヌクレオチド
感受性およびアゴニストがアデニレートサイクラーゼ活
性を阻害する能力に関して機能的であることを示す。
は、レセプター活性化の効果が容易に決定できる細胞ラ
イン中にＤＡレセプターを発現させることが可能にな
る。我々は、マウスＬ細胞を亜鉛誘発マウスメタロチオ
ネインプロモーターの規制のもとでＲＧＢ−２でトラン
スフェクトすることによって得られた細胞ラインへ〔 3
Ｈ〕スピロペリドールおよび他のＤ−２アンタゴニスト
の結合を以前記載した（１）。我々はまた、以前使用し
たアッセイ条件のもとでは、ＤＡのＬＺＲ１膜への結合
はＧＴＰへ応答しなかったことを報告した。我々は今
や、ＲＧＢ−２ ｃＤＮＡによってコードされたＤ−２
レセプターはアゴニストの結合のグアニンヌクレオチド
感受性およびアゴニストがアデニレートサイクラーゼ活
性を阻害する能力に関して機能的であることを示す。
【００８０】方法 材料 ：〔α−32Ｐ〕アデノシン−５’−トリリン酸（Ａ
ＴＰ，１０〜５０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）および〔 3Ｈ〕サイ
クリックＡＴＰ（３１．９Ｃｉ／ｍｍｏｌ）はＮｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ（Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍ
Ａ）から購入し、〔 3Ｈ〕スピロペリドール（９５Ｃｉ
／ｍｍｏｌ）はＡｍｅｒｓｈａｍ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ
Ｈｅｉｇｈｔｓ，Ｉ１）から購入した。グアノシン−
５’−トリリン酸（ＧＴＰ），ＤＡ，サイクリックＡＴ
Ｐ，３−イソブチル−１−メチルキサンチン、ＡＴＰお
よびフォルコリンはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し
た。キンピロール，ＬＹ１８１９９０（Ｌｉｌｌｙ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），ブロモクリプチン（Ｓａｎ
ｄｏｚ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ），
（＋）および（−）３−ＰＰＰ（Ａｓｔｒａ）は親切な
贈与品であった。
ＴＰ，１０〜５０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）および〔 3Ｈ〕サイ
クリックＡＴＰ（３１．９Ｃｉ／ｍｍｏｌ）はＮｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ（Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍ
Ａ）から購入し、〔 3Ｈ〕スピロペリドール（９５Ｃｉ
／ｍｍｏｌ）はＡｍｅｒｓｈａｍ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ
Ｈｅｉｇｈｔｓ，Ｉ１）から購入した。グアノシン−
５’−トリリン酸（ＧＴＰ），ＤＡ，サイクリックＡＴ
Ｐ，３−イソブチル−１−メチルキサンチン、ＡＴＰお
よびフォルコリンはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し
た。キンピロール，ＬＹ１８１９９０（Ｌｉｌｌｙ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），ブロモクリプチン（Ｓａｎ
ｄｏｚ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ），
（＋）および（−）３−ＰＰＰ（Ａｓｔｒａ）は親切な
贈与品であった。
【００８１】トランスフェクション：全ＲＧＢ−２ ｃ
ＤＮＡはプラスドｐＺｅｍ３（１１）にクローンされ
た。ｃＤＮＡおよびベクターはベクター上のＢｇ１ II
部位およびｃＤＮＡアダプター上のＳａ１ Ｉ部位へ部
分的にはめ込むことによって両立性とされた。このプラ
スミドはプラスミドｐＲＳＶｎｅｏと共にアウスＬｔｋ
- 細胞中へＣａＰＯ4 沈澱技術（１２）によって同時ト
ランスフェクトされた。トランスフェクタントはＧ４１
８の３５０μｇ／ｍｌ中で選択され、単離され、ノーザ
ンブロット分析によってＲＧＢ−２ ｍＲＮＡの発現に
ついてスクリーンされた。ＲＧＢ−２ ｍＲＮＡの高い
発現に基いで選択されたサブクローンＬＺＲ１は以前Ｌ
−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１として一部特徴化された（１）。
第２の細胞ライン、ＬＺＲ２は同じ方法で単離された。
ＤＮＡはプラスドｐＺｅｍ３（１１）にクローンされ
た。ｃＤＮＡおよびベクターはベクター上のＢｇ１ II
部位およびｃＤＮＡアダプター上のＳａ１ Ｉ部位へ部
分的にはめ込むことによって両立性とされた。このプラ
スミドはプラスミドｐＲＳＶｎｅｏと共にアウスＬｔｋ
- 細胞中へＣａＰＯ4 沈澱技術（１２）によって同時ト
ランスフェクトされた。トランスフェクタントはＧ４１
８の３５０μｇ／ｍｌ中で選択され、単離され、ノーザ
ンブロット分析によってＲＧＢ−２ ｍＲＮＡの発現に
ついてスクリーンされた。ＲＧＢ−２ ｍＲＮＡの高い
発現に基いで選択されたサブクローンＬＺＲ１は以前Ｌ
−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１として一部特徴化された（１）。
第２の細胞ライン、ＬＺＲ２は同じ方法で単離された。
【００８２】組織培養：細胞は、１５０ｍｍ直径のＦａ
ｌｃｏｎ組織培養プレート（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋ
ｉｎｓｏｎ，Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｐａｒｋ，ＮＪ）中２
０，０００細胞／ｃｍ2 の密度においてプレートされ、
成育培地をトリプシン−ＥＤＴＡ（０．１％トリプシ
ン，０．０２％ＥＤＴＡ，リン酸塩緩衝食塩水中）で交
換するか３日目に供給することによってサブカルチャー
され、そして５日または６日目に収穫された。細胞は、
５％ウシ胎児血清および５％鉄補給子ウシ血清（Ｈｙｃ
ｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）を補強したＤｕｌｂｅｃ
ｃｏ修正イーグル培地（Ｓｉｇｍａ）中、１０％ＣＯ2
／９０％空気雰囲気中３７℃で成育された。細胞は、成
育培地を氷冷低張緩衝液（１ｍＭ Ｎａ+ −ＨＥＰＥ
Ｓ，ｐＨ７．４，２ｍＭ ＥＤＴＡ）で交換することに
よって溶解された。１０〜１５分間膨潤後、細胞をプレ
ートからかき落とし、２４，０００ｘｇにおいて２０分
遠心した。得られた粗膜分画をＢｒｉｎｋｍａｎｎ Ｐ
ｏｌｙｔｒｏｎホモジナイザーでセッティング６におい
て１０秒トリス等張食塩水（５０ｍＭトリスＨＣｌ，ｐ
Ｈ７．４，０．９％ＮａＣｌ）中に再懸濁し、レセプタ
ー結合実験のため−７０℃で貯蔵するか、または直ちに
アデニレートサイクラーゼ実験に使用するためトリス等
張食塩水に再懸濁し、２４，０００ｘｇで２０分遠心
し、トリス等張食塩水に再懸濁した。
ｌｃｏｎ組織培養プレート（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋ
ｉｎｓｏｎ，Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｐａｒｋ，ＮＪ）中２
０，０００細胞／ｃｍ2 の密度においてプレートされ、
成育培地をトリプシン−ＥＤＴＡ（０．１％トリプシ
ン，０．０２％ＥＤＴＡ，リン酸塩緩衝食塩水中）で交
換するか３日目に供給することによってサブカルチャー
され、そして５日または６日目に収穫された。細胞は、
５％ウシ胎児血清および５％鉄補給子ウシ血清（Ｈｙｃ
ｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）を補強したＤｕｌｂｅｃ
ｃｏ修正イーグル培地（Ｓｉｇｍａ）中、１０％ＣＯ2
／９０％空気雰囲気中３７℃で成育された。細胞は、成
育培地を氷冷低張緩衝液（１ｍＭ Ｎａ+ −ＨＥＰＥ
Ｓ，ｐＨ７．４，２ｍＭ ＥＤＴＡ）で交換することに
よって溶解された。１０〜１５分間膨潤後、細胞をプレ
ートからかき落とし、２４，０００ｘｇにおいて２０分
遠心した。得られた粗膜分画をＢｒｉｎｋｍａｎｎ Ｐ
ｏｌｙｔｒｏｎホモジナイザーでセッティング６におい
て１０秒トリス等張食塩水（５０ｍＭトリスＨＣｌ，ｐ
Ｈ７．４，０．９％ＮａＣｌ）中に再懸濁し、レセプタ
ー結合実験のため−７０℃で貯蔵するか、または直ちに
アデニレートサイクラーゼ実験に使用するためトリス等
張食塩水に再懸濁し、２４，０００ｘｇで２０分遠心
し、トリス等張食塩水に再懸濁した。
【００８３】レセプター結合アッセイ：膜調製物は解凍
し、２４，０００ｘｇで２０分遠心し、指示した場合を
除きトリス等張食塩水に再懸濁した。膜調製物の部分標
本は、（最終濃度）５０ｍＭトリスＨＣｌ，ｐＨ７．
４，０．９％ ＮａＣｌ，０．０２５アスコルビン酸、
０．００１％ウシ血清アルブミン、〔 3Ｈ〕スピロペリ
ドール、および適当な薬物を含んでいるアッセイチュー
ブへ加えた。（＋）ブタクラモール（２μＭ）は、ＫD
値に近い放射性リガンドの濃度においては典型的には総
結合の１０％以下である非特異性結合を決定するために
使用された。アッセイは、飽和分析のためには２ｍｌ，
阻害分析のためには１ｍｌの容積を実施された。インキ
ュベーションはタンパク１５〜５０μｇの添加によって
開始され、３７℃で５０分実施され、そして各アッセイ
へ氷冷緩衝液（１０ｍＭトリス，ｐＨ７．４，０．９％
ＮａＣｌ）を加えることによって停止された。サンプル
はガラス繊維フィルター（Ｓｃｈｌｉｃｈｅｒ ＆ Ｓ
ｃｈｕｅｌｌ Ｎｏ．３０）を通して濾過され、洗浄緩
衝液の１０ｍｌで洗浄された。フィルターに残っている
放射能をＢｅｃｋｍａｎＬＳ １７０１シンチレーショ
ンカウンターを用いてカウントした。データは、データ
解析プログラムＥｎｚｆｉｔｔｅｒ（Ｅ１ｓｅｖｉｅｒ
−Ｂｉｏｓｏｆｔ）を用いて非直線回帰によって解析さ
れた。競合実験においては、ＫI 値が実験的に決定した
ＩＣ50値からＣｈｅｎｇおよびＰｒｕｓｏｆｆ法によっ
て計算された。ＫI およびＫD の平均値は幾何平均であ
る。ＤＡの結合に対するＧＴＰおよびＮａＣｌの効果を
評価するために仕組まれた実験においては、新鮮な組織
が使用される。細胞が収穫され、遠心され、そしてトリ
スＭｇ++（５０ｍＭトリス，ｐＨ７．４，４ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2 ）中にＭｇ++再懸濁された。組織は再遠心前にこ
の緩衝液中３７℃で１５分インキュベートされた。再懸
濁したタンパクは、添加したＮａＣｌまたはＧＴＰなし
のトリスＭｇ++か、または１２０ｍＭ ＮａＣｌおよび
１００μＭ ＧＴＰを含むアッセイへ添加された。
し、２４，０００ｘｇで２０分遠心し、指示した場合を
除きトリス等張食塩水に再懸濁した。膜調製物の部分標
本は、（最終濃度）５０ｍＭトリスＨＣｌ，ｐＨ７．
４，０．９％ ＮａＣｌ，０．０２５アスコルビン酸、
０．００１％ウシ血清アルブミン、〔 3Ｈ〕スピロペリ
ドール、および適当な薬物を含んでいるアッセイチュー
ブへ加えた。（＋）ブタクラモール（２μＭ）は、ＫD
値に近い放射性リガンドの濃度においては典型的には総
結合の１０％以下である非特異性結合を決定するために
使用された。アッセイは、飽和分析のためには２ｍｌ，
阻害分析のためには１ｍｌの容積を実施された。インキ
ュベーションはタンパク１５〜５０μｇの添加によって
開始され、３７℃で５０分実施され、そして各アッセイ
へ氷冷緩衝液（１０ｍＭトリス，ｐＨ７．４，０．９％
ＮａＣｌ）を加えることによって停止された。サンプル
はガラス繊維フィルター（Ｓｃｈｌｉｃｈｅｒ ＆ Ｓ
ｃｈｕｅｌｌ Ｎｏ．３０）を通して濾過され、洗浄緩
衝液の１０ｍｌで洗浄された。フィルターに残っている
放射能をＢｅｃｋｍａｎＬＳ １７０１シンチレーショ
ンカウンターを用いてカウントした。データは、データ
解析プログラムＥｎｚｆｉｔｔｅｒ（Ｅ１ｓｅｖｉｅｒ
−Ｂｉｏｓｏｆｔ）を用いて非直線回帰によって解析さ
れた。競合実験においては、ＫI 値が実験的に決定した
ＩＣ50値からＣｈｅｎｇおよびＰｒｕｓｏｆｆ法によっ
て計算された。ＫI およびＫD の平均値は幾何平均であ
る。ＤＡの結合に対するＧＴＰおよびＮａＣｌの効果を
評価するために仕組まれた実験においては、新鮮な組織
が使用される。細胞が収穫され、遠心され、そしてトリ
スＭｇ++（５０ｍＭトリス，ｐＨ７．４，４ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2 ）中にＭｇ++再懸濁された。組織は再遠心前にこ
の緩衝液中３７℃で１５分インキュベートされた。再懸
濁したタンパクは、添加したＮａＣｌまたはＧＴＰなし
のトリスＭｇ++か、または１２０ｍＭ ＮａＣｌおよび
１００μＭ ＧＴＰを含むアッセイへ添加された。
【００８４】アデニレートサイクラーゼアッセイ：〔α
32Ｐ〕ＡＴＰの〔32Ｐ〕ｃＡＭＰへの変換はＳａｌｏｍ
ｏｎ ｅｔ ａｌ．（１４）が記載したのと実質的に同
じようにして決定した。トリス等張食塩水に再懸濁した
膜（５０〜１００μｇタンパク）は、５０ｍＭ トリス
ＨＣｌ，ｐＨ７．４，５ｍＭ ｃＡＭＰ，１ｍＭ ３−
イソブチル−１−メチルキサンチン、１ｍＭ ＭｇＣｌ
2 ，０．５ｍＭ ＥＤＴＡ，０．２５ｍＭ ＡＴＰ，３
０μＭ ＧＴＰ，約２×１０6 ｃｐｍ〔α32Ｐ〕ＡＴ
Ｐ，および種々の薬物を含む０．２ｍｌのアッセイへ
０．１ｍｌの容積で加えられた。アッセイは２５ｃＤＮ
Ａへ加温することにより開始され、２０分後０℃へ冷却
し、次に各アッセイへトリクロル酢酸（３０％溶液１０
０μｌ）を加えることによって停止された。〔 3Ｈ〕サ
イクリックＡＴＰ（約３０，０００ｃｐｍ）を内部標準
として各アッセイへ加えた。アッセイ容積を水で１ｍｌ
とし、チューブを２０００ｘｇで１０分遠心した。上清
中のサイクリックＡＭＰは、Ｄｏｗｅｘ ＡＧ５０Ｗ−
Ｘ４および中性アルミナを含むカラム上の逐次クロマト
グラフィーによって単離した。各アルミナカラムからの
２ｍｌ溶離液は液体シンチレーションカウントのためＢ
ｉｏ−Ｓａｆｅ ＩＩ（ＲＰＩ，Ｍｏｕｎｔ Ｐｒｏｓ
ｐｅｃｔ，ＩＬ）１０ｍｌに溶かした。アルゴニストに
よるアデニレートサイクラーゼの阻害のための投与量レ
スポンス曲線は、プログラムＥｎｚｆｉｔｔｅｒを使用
する非直線回帰により解析した。データは以下の式にあ
てはめた。
32Ｐ〕ＡＴＰの〔32Ｐ〕ｃＡＭＰへの変換はＳａｌｏｍ
ｏｎ ｅｔ ａｌ．（１４）が記載したのと実質的に同
じようにして決定した。トリス等張食塩水に再懸濁した
膜（５０〜１００μｇタンパク）は、５０ｍＭ トリス
ＨＣｌ，ｐＨ７．４，５ｍＭ ｃＡＭＰ，１ｍＭ ３−
イソブチル−１−メチルキサンチン、１ｍＭ ＭｇＣｌ
2 ，０．５ｍＭ ＥＤＴＡ，０．２５ｍＭ ＡＴＰ，３
０μＭ ＧＴＰ，約２×１０6 ｃｐｍ〔α32Ｐ〕ＡＴ
Ｐ，および種々の薬物を含む０．２ｍｌのアッセイへ
０．１ｍｌの容積で加えられた。アッセイは２５ｃＤＮ
Ａへ加温することにより開始され、２０分後０℃へ冷却
し、次に各アッセイへトリクロル酢酸（３０％溶液１０
０μｌ）を加えることによって停止された。〔 3Ｈ〕サ
イクリックＡＴＰ（約３０，０００ｃｐｍ）を内部標準
として各アッセイへ加えた。アッセイ容積を水で１ｍｌ
とし、チューブを２０００ｘｇで１０分遠心した。上清
中のサイクリックＡＭＰは、Ｄｏｗｅｘ ＡＧ５０Ｗ−
Ｘ４および中性アルミナを含むカラム上の逐次クロマト
グラフィーによって単離した。各アルミナカラムからの
２ｍｌ溶離液は液体シンチレーションカウントのためＢ
ｉｏ−Ｓａｆｅ ＩＩ（ＲＰＩ，Ｍｏｕｎｔ Ｐｒｏｓ
ｐｅｃｔ，ＩＬ）１０ｍｌに溶かした。アルゴニストに
よるアデニレートサイクラーゼの阻害のための投与量レ
スポンス曲線は、プログラムＥｎｚｆｉｔｔｅｒを使用
する非直線回帰により解析した。データは以下の式にあ
てはめた。
【００８５】Ｅ＝（１００−Ｅｍａｘ）／１＋（Ａ／Ｅ
Ｃ50）N ＋Ｅｍａｘ
Ｃ50）N ＋Ｅｍａｘ
【００８６】ここでＥは総刺激活性の％で表した酵素活
性の量であり、Ａはアゴニストの濃度、ＥＣ50は酵素活
性の５０％最高阻害を生ずるアゴニストの濃度、Ｅｍａ
ｘはアゴニストの最高に阻害する濃度の存在下観察され
た酵素活性（総刺激活性の％で表す）、Ｎは傾斜計数で
ある。ＥＣ50値の平均値は幾何平均である。タンパク濃
度はＰｅｔｅｒｓｏｎ法（１５）によって決定した。
性の量であり、Ａはアゴニストの濃度、ＥＣ50は酵素活
性の５０％最高阻害を生ずるアゴニストの濃度、Ｅｍａ
ｘはアゴニストの最高に阻害する濃度の存在下観察され
た酵素活性（総刺激活性の％で表す）、Ｎは傾斜計数で
ある。ＥＣ50値の平均値は幾何平均である。タンパク濃
度はＰｅｔｅｒｓｏｎ法（１５）によって決定した。
【００８７】結果 〔 3 Ｈ〕スピロプリドール結合の飽和分析 ：ＬＺＲ１細
胞から調製した膜上のＤ−２レセプターの密度は
〔 3Ｈ〕スピロペリドール結合の飽和分析によって決定
された。ＲＧＢ−２は亜鉛誘発マウスメタロチオネイン
プロモーターの制御下にあるので、細胞の１００μＭ硫
酸亜鉛前処理の〔 3Ｈ〕スピロペリドール結合に対する
効果も決定した。結合部位の密度は、対照ＬＺＲ１細胞
においては７３６±１４０ｆｍｏｌ／ｍｇタンパクであ
り、亜鉛で処理したＬＺＲ１細胞では７５９±１５５ｆ
ｍｏｌ／ｍｇタンパクであった。ＬＺＲ２と命名した第
２の細胞ラインは、Ｄ−２レセプターの低い密度（平均
Ｂｍａｘ±ＳＥ，４３５±７１ｆｍｏｌ／ｍｇタンパ
ク）を持っていた。ＬＺＲ１細胞と対照的に、ＬＺＲ２
細胞の結合部位密度は亜鉛処理により、６３０±５２ｆ
ｍｏｌ／ｍｇタンパクへ５０％増加した（ｎ＝２）。対
照ＬＺＲ１およびＬＺＲ２細胞のための４２ｐＭの平均
ＫD （ｐＫD ±ＳＥ，１０．３７±０．１５，ｎ＝４）
は、亜鉛処理細胞の４７ｐＭの平均ＫD 値（１０．３３
±０．１７）と有意差はなかった。すべての実験からの
飽和分析のＳｃａｔｃｈａｒｄトランスフォーメーショ
ンは直線を与えた。野性タイプＬｔｋ- 細胞は〔 3Ｈ〕
スピロペリドールの置換結合が検出されなかった（デー
タ示さず）。ＬＺＲ１細胞はＤ−２レセプターの高密度
を有するので、これら細胞はすべての以後のすべての実
験に使用された。
胞から調製した膜上のＤ−２レセプターの密度は
〔 3Ｈ〕スピロペリドール結合の飽和分析によって決定
された。ＲＧＢ−２は亜鉛誘発マウスメタロチオネイン
プロモーターの制御下にあるので、細胞の１００μＭ硫
酸亜鉛前処理の〔 3Ｈ〕スピロペリドール結合に対する
効果も決定した。結合部位の密度は、対照ＬＺＲ１細胞
においては７３６±１４０ｆｍｏｌ／ｍｇタンパクであ
り、亜鉛で処理したＬＺＲ１細胞では７５９±１５５ｆ
ｍｏｌ／ｍｇタンパクであった。ＬＺＲ２と命名した第
２の細胞ラインは、Ｄ−２レセプターの低い密度（平均
Ｂｍａｘ±ＳＥ，４３５±７１ｆｍｏｌ／ｍｇタンパ
ク）を持っていた。ＬＺＲ１細胞と対照的に、ＬＺＲ２
細胞の結合部位密度は亜鉛処理により、６３０±５２ｆ
ｍｏｌ／ｍｇタンパクへ５０％増加した（ｎ＝２）。対
照ＬＺＲ１およびＬＺＲ２細胞のための４２ｐＭの平均
ＫD （ｐＫD ±ＳＥ，１０．３７±０．１５，ｎ＝４）
は、亜鉛処理細胞の４７ｐＭの平均ＫD 値（１０．３３
±０．１７）と有意差はなかった。すべての実験からの
飽和分析のＳｃａｔｃｈａｒｄトランスフォーメーショ
ンは直線を与えた。野性タイプＬｔｋ- 細胞は〔 3Ｈ〕
スピロペリドールの置換結合が検出されなかった（デー
タ示さず）。ＬＺＲ１細胞はＤ−２レセプターの高密度
を有するので、これら細胞はすべての以後のすべての実
験に使用された。
【００８８】アゴニストによる放射性リガンド結合の阻
害：いくつかのアゴニストおよび関連化合物に対するＤ
−２レセプターの見掛けアフィニティーを二つの実験に
おいて決定した（第２５図，表２）。試験した６化合物
のうち、ブロモクリプチンが最強力であり、平均ＫI 値
２ｎＭであったが、Ｄ−２選択性アゴニストキンピロー
ルの不活性エナンチオマーであるＬＹ１８１９９０は最
も弱かった。すべてのアッセイは、ＬＺＲ１細胞から調
製した膜を用いて、０．１ｍＭ ＧＴＰおよび１２０ｍ
Ｍ ＮａＣｌの存在下実施された。
害：いくつかのアゴニストおよび関連化合物に対するＤ
−２レセプターの見掛けアフィニティーを二つの実験に
おいて決定した（第２５図，表２）。試験した６化合物
のうち、ブロモクリプチンが最強力であり、平均ＫI 値
２ｎＭであったが、Ｄ−２選択性アゴニストキンピロー
ルの不活性エナンチオマーであるＬＹ１８１９９０は最
も弱かった。すべてのアッセイは、ＬＺＲ１細胞から調
製した膜を用いて、０．１ｍＭ ＧＴＰおよび１２０ｍ
Ｍ ＮａＣｌの存在下実施された。
【００８９】他の実験においては、ＤＡによる放射性リ
ガンド結合の阻止に対するＧＴＰおよびＮａＣｌの影響
が決定された（第２６図）。これらの実験には新たに調
製された膜が使用され、ホモジネーションおよびアッセ
イ緩衝液へ４ｍＭ ＭｇＣｌ 2 が加えられた。ＧＴＰお
よびＮａＣｌの不存在下、平均ＩＣ50は２５μＭ（平均
−ｌｏｇ（ＩＣ50）±ＳＥ＝４．６±０．３）であっ
た。アッセイ緩衝液へＧＴＰおよびＮＣｌの添加は平均
ＩＣ50値を、〔 3Ｈ〕スピロぺリドールの結合を変える
ことなく１６７μＭ（３．８±０．３，ｎ＝４）へ上昇
させた。ＧＴＰおよびＮａＣｌの不存在下のＨｉｌｌ計
数は０．５０ないし０．６８（平均０．６４）の範囲で
あったが、ＧＴＰおよびＮａＣｌの存在下の値は０．７
７ないし１．１（平均０．９４）の範囲であった。ＧＴ
ＰおよびＮａＣｌの不存在下で、ＤＡの阻害曲線は、結
合部位に二つクラスが存在すると仮定することによって
最良に適中し得る。高いアフィニティーの一クラスは、
レセプター総数の４８±１４％を表わし、０．３μＭの
ＤＡに対する平均ＫI を持っていた。レセプター総数の
５２±１３％を占める第２のクラスは平均ＫI 値２４μ
Ｍを持っていた。
ガンド結合の阻止に対するＧＴＰおよびＮａＣｌの影響
が決定された（第２６図）。これらの実験には新たに調
製された膜が使用され、ホモジネーションおよびアッセ
イ緩衝液へ４ｍＭ ＭｇＣｌ 2 が加えられた。ＧＴＰお
よびＮａＣｌの不存在下、平均ＩＣ50は２５μＭ（平均
−ｌｏｇ（ＩＣ50）±ＳＥ＝４．６±０．３）であっ
た。アッセイ緩衝液へＧＴＰおよびＮＣｌの添加は平均
ＩＣ50値を、〔 3Ｈ〕スピロぺリドールの結合を変える
ことなく１６７μＭ（３．８±０．３，ｎ＝４）へ上昇
させた。ＧＴＰおよびＮａＣｌの不存在下のＨｉｌｌ計
数は０．５０ないし０．６８（平均０．６４）の範囲で
あったが、ＧＴＰおよびＮａＣｌの存在下の値は０．７
７ないし１．１（平均０．９４）の範囲であった。ＧＴ
ＰおよびＮａＣｌの不存在下で、ＤＡの阻害曲線は、結
合部位に二つクラスが存在すると仮定することによって
最良に適中し得る。高いアフィニティーの一クラスは、
レセプター総数の４８±１４％を表わし、０．３μＭの
ＤＡに対する平均ＫI を持っていた。レセプター総数の
５２±１３％を占める第２のクラスは平均ＫI 値２４μ
Ｍを持っていた。
【００９０】アゴニストによるアデニレートサイクラー
ゼ活性の阻害：ＬＺＲ１細胞からの新たに調製した膜に
おいて、しかし野性タイプＬｔｋ- 細胞からの膜ではな
くて、ＤＡはフォルスコリン刺激アデニレートサイクラ
ーゼ活性の濃度依存変調を生ぜしめる。最大阻害は６２
４ｎＭのＥＣ50値をもって総活性の２７％であった（第
２７図、表２）。キンピロールはドパミンと大体同じく
有効であり、すなわちキンピロールによって誘発される
最高阻害はＤＡによる誘発と類似であった。ＬＹ１８１
９９０はその活性異性体より強力でなくそして有効でな
く（第２８図、表２）、アデニレートサイクラーゼ活性
のＤ−２レセプター仲介阻害は立体選択的であることを
示す。３実験のうち２実験だけにおいて、ＬＹ１８１９
９０が測定し得る酵素活性阻害を示した（表２）との知
見は、この化合物はアゴニスト活性を少ししかまたは全
く持っていないことを示唆する。同様に、（−）３−Ｐ
ＰＰは検出し得るアゴニスト活性を持っていなかった。
ブロモクリプチンは、ＥＣ50値４５ｎＭを持ち、最も強
力なアゴニストであった。ブロモクリプチンおよび
（＋）３−ＰＰＰはＤＡより有効でなく、このためこれ
ら薬物は部分的アゴニストであるように見える。
ゼ活性の阻害：ＬＺＲ１細胞からの新たに調製した膜に
おいて、しかし野性タイプＬｔｋ- 細胞からの膜ではな
くて、ＤＡはフォルスコリン刺激アデニレートサイクラ
ーゼ活性の濃度依存変調を生ぜしめる。最大阻害は６２
４ｎＭのＥＣ50値をもって総活性の２７％であった（第
２７図、表２）。キンピロールはドパミンと大体同じく
有効であり、すなわちキンピロールによって誘発される
最高阻害はＤＡによる誘発と類似であった。ＬＹ１８１
９９０はその活性異性体より強力でなくそして有効でな
く（第２８図、表２）、アデニレートサイクラーゼ活性
のＤ−２レセプター仲介阻害は立体選択的であることを
示す。３実験のうち２実験だけにおいて、ＬＹ１８１９
９０が測定し得る酵素活性阻害を示した（表２）との知
見は、この化合物はアゴニスト活性を少ししかまたは全
く持っていないことを示唆する。同様に、（−）３−Ｐ
ＰＰは検出し得るアゴニスト活性を持っていなかった。
ブロモクリプチンは、ＥＣ50値４５ｎＭを持ち、最も強
力なアゴニストであった。ブロモクリプチンおよび
（＋）３−ＰＰＰはＤＡより有効でなく、このためこれ
ら薬物は部分的アゴニストであるように見える。
【００９１】１０ｍＭ ＤＡによるＬＺＲ１細胞中のア
デニレートサイクラーゼ活性の阻害は、アッセイへ
（＋）ブタクモール１０μＭの添加によって防止され
（第２９図）、ＤＡの阻害はレセプター仲介であること
を示す。また、百日咳トキシンによるＬＺＲ１細胞の処
理（５０ｎｇ／ｍｌ成育培地，１６時間）は、細胞から
調製した膜においてＤＡ−阻害酵素活性をブロックし
（第１０Ｃ図）、Ｇｉは酵素活性のＤＡによる阻害を仲
介することを示す。興味あることに、百日咳トキシン処
理細胞からの膜中のフォルスコリン刺激アデニレートサ
イクラーゼ活性は、対照膜中の活性よりも２．５倍大で
あった。
デニレートサイクラーゼ活性の阻害は、アッセイへ
（＋）ブタクモール１０μＭの添加によって防止され
（第２９図）、ＤＡの阻害はレセプター仲介であること
を示す。また、百日咳トキシンによるＬＺＲ１細胞の処
理（５０ｎｇ／ｍｌ成育培地，１６時間）は、細胞から
調製した膜においてＤＡ−阻害酵素活性をブロックし
（第１０Ｃ図）、Ｇｉは酵素活性のＤＡによる阻害を仲
介することを示す。興味あることに、百日咳トキシン処
理細胞からの膜中のフォルスコリン刺激アデニレートサ
イクラーゼ活性は、対照膜中の活性よりも２．５倍大で
あった。
【００９２】
【表２】
【００９３】議論 以前に報告したように、ラットＤ−２レセプターｃＤＮ
Ａで形質転換したＬｔｋ- 細胞はＲＡ Ｄ−２レセプタ
ーの高密度を発現する（１）。我々は、Ｄ−２レセプタ
ーを７５０ないし１０００ｆｍｏｌ／ｍｇタンパクの密
度で安定に発現する（現在の結果；１を参照）、ＬＺＲ
１と命名したこれら細胞のサブクローンの一つを特徴化
した。
Ａで形質転換したＬｔｋ- 細胞はＲＡ Ｄ−２レセプタ
ーの高密度を発現する（１）。我々は、Ｄ−２レセプタ
ーを７５０ないし１０００ｆｍｏｌ／ｍｇタンパクの密
度で安定に発現する（現在の結果；１を参照）、ＬＺＲ
１と命名したこれら細胞のサブクローンの一つを特徴化
した。
【００９４】Ｄ−２ ｃＤＮＡはプライミド ｐＺｅｍ
３に含まれるので、亜鉛誘発プロモーターの規制のもと
で、放射性リガンド結合の性質に対する亜鉛処理の効果
が決定された。ＬＺＲ１細胞上のＤ−２レセプターは亜
鉛の不存在下において最大に発現されるように思われ、
そのため亜鉛処理はレセプターの密度に増加を生じなか
った。亜鉛に対する応答性の欠如はＬｔｋ- 細胞ライン
の特徴ではない。我々はＬｔｋ- 細胞の第２の形質転換
されたラインＬＺＲ２を分離し、それではＤ−２レセプ
ターの密度は４３５ないし６３０ｆｍｏｌ／ｍｇタンパ
クから亜鉛処理によって約５０％上昇される。〔 3Ｈ〕
スピロペリドールに対するＤ−２レセプターのアフィニ
ティーは亜鉛処理によって有意に変化しなかった。
３に含まれるので、亜鉛誘発プロモーターの規制のもと
で、放射性リガンド結合の性質に対する亜鉛処理の効果
が決定された。ＬＺＲ１細胞上のＤ−２レセプターは亜
鉛の不存在下において最大に発現されるように思われ、
そのため亜鉛処理はレセプターの密度に増加を生じなか
った。亜鉛に対する応答性の欠如はＬｔｋ- 細胞ライン
の特徴ではない。我々はＬｔｋ- 細胞の第２の形質転換
されたラインＬＺＲ２を分離し、それではＤ−２レセプ
ターの密度は４３５ないし６３０ｆｍｏｌ／ｍｇタンパ
クから亜鉛処理によって約５０％上昇される。〔 3Ｈ〕
スピロペリドールに対するＤ−２レセプターのアフィニ
ティーは亜鉛処理によって有意に変化しなかった。
【００９５】ＬＺＲ１細胞上のＤ−２レセプターのいく
つかのアゴニストおよび関連する薬物に対する見掛けア
フィニティーは〔 3Ｈ〕スピロペリドールの特異結合の
ＧＴＰ存在下での薬物による阻害に決定された。ブロモ
クリプチンは２ｎＭのＫI 値をもって極めて強力なアゴ
ニストであった。キンピロールの強度は、ＤＡと同様に
約１０μＭであった。アゴニストの結合は立体選択的で
あった。これはＬＹ１８１９９０はその活性エチナチオ
マーであるキンピロールよりかなり弱く、そして（−）
３−ＰＰＰは（＋）３−ＰＰＰより強力であるからであ
る。これらデータはＬＺＲ１細胞上のＤ−２レセプター
に対するアンダゴニストの結合の我々の以前の研究
（１）を拡大する。
つかのアゴニストおよび関連する薬物に対する見掛けア
フィニティーは〔 3Ｈ〕スピロペリドールの特異結合の
ＧＴＰ存在下での薬物による阻害に決定された。ブロモ
クリプチンは２ｎＭのＫI 値をもって極めて強力なアゴ
ニストであった。キンピロールの強度は、ＤＡと同様に
約１０μＭであった。アゴニストの結合は立体選択的で
あった。これはＬＹ１８１９９０はその活性エチナチオ
マーであるキンピロールよりかなり弱く、そして（−）
３−ＰＰＰは（＋）３−ＰＰＰより強力であるからであ
る。これらデータはＬＺＲ１細胞上のＤ−２レセプター
に対するアンダゴニストの結合の我々の以前の研究
（１）を拡大する。
【００９６】Ｄ−２レセプターの刺激の生理学的効果
は、アデニレートライクラーゼ活性を阻害するグアニン
ヌクレオチド結合タンパクＧｉによって仲介されるもの
と考えられる（１６）。アゴニストの高いアフィニティ
ー結合は、アゴニスト、レセプター、およびＧｉのα−
サブユニット（Ｇｉα）よりなる三元複合体であると考
えられ、ＧＴＰによるＤ−２レセプターへのアゴニスト
結合の阻害はＧｉαからのＤ−２レセプターのＧＴＰ誘
発解離を表明する。ＲＧＢ−２ ｃＤＮＡによってコー
ドされたＤ−２レセプターのＧタンパクへ結合する能力
を評価するため、放射性リガンド結合の阻害に対するＤ
Ａの強度に対するＧＴＰの効果が決定された。ＬＺＲ１
細胞を用いた予備研究において、我々は１２０ｍＭ Ｎ
ａＣｌを含みそして添加したＭｇ++を含まない我々の標
準アッセイ緩衝液において、ＤＡの結合はＧＴＰへ感受
性ではないが（１）、同じ条件下でラット線条体膜への
ＤＡの結合はＧＴＰによって阻害される（データ示さ
ず）ことを発見した。ＬＺＲ１膜におけるＧＴＰへの感
受性の欠如については三つの可能性ある説明が存在し
た。（１）Ｌｔｋ- 細胞から誘導したＬＺＲ１細胞は適
当なＧタンパクを欠いている可能性がある。（２）ＲＧ
Ｂ−２ ｃＤＮＡはＤ−２レセプターの結合サブユニッ
トだけをコードする。ＲＧＢ−２によってコードされた
このタンパクの予想された主要構造とグアニンヌクレオ
チド結合タンパクへ結合した他のレセプター間の類似性
のため、この可能性はありそうもなかった。（３）結合
アッセイのイオン性条件が三元複合体の形成または不安
定化のために適性ではなかった可能性がある。ここに記
載した研究においては、イオン性条件はＧＴＰ感受性結
合を観察する可能性を増すように変化された。高アフィ
ニティーアゴニスト結合を最大にするため、組織はＭｇ
Ｃｌ2 と前インキュベートされ、そしてＭｇＣｌ2 はア
ッセイ緩衝液中に含めされた（１７）。三元複合体のＧ
ＴＰ誘発不安定を最大にするため、ＮａＣｌをＧＴＰと
共に加えた（１７）。これらの条件下、ＧＴＰおよびＮ
ａＣｌの添加はＤ−２レセプターに対するＤＡの強度を
低下させ、ＬＺＲ１細胞からの膜において阻害曲線の傾
斜を増加させた。三元複合体の形成および不安定化のた
めのイオン必要性はＬＺＲ細胞からの膜においてラット
線条体からの膜におけるよりも一層急務であったことは
興味がある。
は、アデニレートライクラーゼ活性を阻害するグアニン
ヌクレオチド結合タンパクＧｉによって仲介されるもの
と考えられる（１６）。アゴニストの高いアフィニティ
ー結合は、アゴニスト、レセプター、およびＧｉのα−
サブユニット（Ｇｉα）よりなる三元複合体であると考
えられ、ＧＴＰによるＤ−２レセプターへのアゴニスト
結合の阻害はＧｉαからのＤ−２レセプターのＧＴＰ誘
発解離を表明する。ＲＧＢ−２ ｃＤＮＡによってコー
ドされたＤ−２レセプターのＧタンパクへ結合する能力
を評価するため、放射性リガンド結合の阻害に対するＤ
Ａの強度に対するＧＴＰの効果が決定された。ＬＺＲ１
細胞を用いた予備研究において、我々は１２０ｍＭ Ｎ
ａＣｌを含みそして添加したＭｇ++を含まない我々の標
準アッセイ緩衝液において、ＤＡの結合はＧＴＰへ感受
性ではないが（１）、同じ条件下でラット線条体膜への
ＤＡの結合はＧＴＰによって阻害される（データ示さ
ず）ことを発見した。ＬＺＲ１膜におけるＧＴＰへの感
受性の欠如については三つの可能性ある説明が存在し
た。（１）Ｌｔｋ- 細胞から誘導したＬＺＲ１細胞は適
当なＧタンパクを欠いている可能性がある。（２）ＲＧ
Ｂ−２ ｃＤＮＡはＤ−２レセプターの結合サブユニッ
トだけをコードする。ＲＧＢ−２によってコードされた
このタンパクの予想された主要構造とグアニンヌクレオ
チド結合タンパクへ結合した他のレセプター間の類似性
のため、この可能性はありそうもなかった。（３）結合
アッセイのイオン性条件が三元複合体の形成または不安
定化のために適性ではなかった可能性がある。ここに記
載した研究においては、イオン性条件はＧＴＰ感受性結
合を観察する可能性を増すように変化された。高アフィ
ニティーアゴニスト結合を最大にするため、組織はＭｇ
Ｃｌ2 と前インキュベートされ、そしてＭｇＣｌ2 はア
ッセイ緩衝液中に含めされた（１７）。三元複合体のＧ
ＴＰ誘発不安定を最大にするため、ＮａＣｌをＧＴＰと
共に加えた（１７）。これらの条件下、ＧＴＰおよびＮ
ａＣｌの添加はＤ−２レセプターに対するＤＡの強度を
低下させ、ＬＺＲ１細胞からの膜において阻害曲線の傾
斜を増加させた。三元複合体の形成および不安定化のた
めのイオン必要性はＬＺＲ細胞からの膜においてラット
線条体からの膜におけるよりも一層急務であったことは
興味がある。
【００９７】ＤＡ Ｄ−２レセプターによるアデニレー
トサイクラーゼ活性の阻害は良く特徴化された現象であ
る（３，１８，１９）。いくつかの薬物によるアデニレ
ートサイクラーゼ活性の阻害はＬＺＲ１細胞からの膜に
おいて評価された。ＤＡおよびＤ−２選択性アゴニスト
であるキンピロールの最大有効濃度は、フォルスコリン
刺激酵素活性を約３０％減少させた。ＤＡによる酵素活
性の阻害はＤ−２アンタゴニストである（＋）ブタクラ
モールによってブロックされた。試験した最も強力なア
ゴニストであるブロモクリプチンは、他によって報告さ
れたように（１９，２０）、部分的アゴニストのようで
あった。アゴニストによるアデニレートサイクラーゼの
阻害は、キンピロールの右旋性エナンチオマーであるＬ
Ｙ１８１９９０は少ししかまたは全く有効性を持ってい
なかったので、立体選択的であった。以前報告されたよ
うに、部分的アゴニスト（＋）３−ＰＰＰは（−）３−
ＰＰＰより強いアゴニストであるが、（−）３−ＰＰＰ
は高いアフィニティーをもってＤ−２レセプターへ結合
する（２１，２２）。我々はＬＺＲ１細胞からの膜にお
いては（−）３−ＰＰＰによるアデニレートサイクラー
ゼ活性の阻害を観察しなかった。アゴニストによるアデ
ニレート活性の阻害について決定したＥＣ50値は、リガ
ンド結合のアッセイにおいて決定したＫI 値よりも一般
に低かった（表１）。これはこれら細胞上のレセプター
予備の存在のためかも知れないが、薬物は酵素活性の最
高阻害において異なるとの観察は、最も有効なアゴニス
トであるＤＡおよびキンピロールに対してさえも多くの
レセプター予備は存在しないことを示唆する。さらに、
（＋）３−ＰＰＰのような部分的アゴニストのためのレ
セプター予備も存在しないであろう。代りの説明は、ア
ゴニレートサイクラーゼ活性の阻害は、後部下垂体中の
ＤＡによる酵素活性の阻害について提案されているよう
に（２３）、三元複合体の形成によって誘発された高ア
フィニティー状態におけるアゴニストのＤ−２レセプタ
ーへの結合に関係していることである。他方、ＧＴＰお
よびＮａＣｌの存在下決定された本報告中のＫI 値は、
低アフィニティー状態におけるアゴニストのレセプター
への結合を表明する。アデニレートサイクラーゼおよび
放射性結合アッセイは異なる温度で実施されたので直接
比較は困難であるが、高アフィニティークラスの部位へ
のＤＡ結合のＫI 値（０．３μＭ）は、ＤＡ阻害アデニ
レートサイクラーゼに対するＥＣ50値（０．６μＭ）に
近く、低アフィニティークラスの部位へのＤＡの結合の
ためのＫI 値（２４μＭ）およびＧＴＰ存在下の結合の
ためのＫI 値（１７μＭ）はかなり高い。
トサイクラーゼ活性の阻害は良く特徴化された現象であ
る（３，１８，１９）。いくつかの薬物によるアデニレ
ートサイクラーゼ活性の阻害はＬＺＲ１細胞からの膜に
おいて評価された。ＤＡおよびＤ−２選択性アゴニスト
であるキンピロールの最大有効濃度は、フォルスコリン
刺激酵素活性を約３０％減少させた。ＤＡによる酵素活
性の阻害はＤ−２アンタゴニストである（＋）ブタクラ
モールによってブロックされた。試験した最も強力なア
ゴニストであるブロモクリプチンは、他によって報告さ
れたように（１９，２０）、部分的アゴニストのようで
あった。アゴニストによるアデニレートサイクラーゼの
阻害は、キンピロールの右旋性エナンチオマーであるＬ
Ｙ１８１９９０は少ししかまたは全く有効性を持ってい
なかったので、立体選択的であった。以前報告されたよ
うに、部分的アゴニスト（＋）３−ＰＰＰは（−）３−
ＰＰＰより強いアゴニストであるが、（−）３−ＰＰＰ
は高いアフィニティーをもってＤ−２レセプターへ結合
する（２１，２２）。我々はＬＺＲ１細胞からの膜にお
いては（−）３−ＰＰＰによるアデニレートサイクラー
ゼ活性の阻害を観察しなかった。アゴニストによるアデ
ニレート活性の阻害について決定したＥＣ50値は、リガ
ンド結合のアッセイにおいて決定したＫI 値よりも一般
に低かった（表１）。これはこれら細胞上のレセプター
予備の存在のためかも知れないが、薬物は酵素活性の最
高阻害において異なるとの観察は、最も有効なアゴニス
トであるＤＡおよびキンピロールに対してさえも多くの
レセプター予備は存在しないことを示唆する。さらに、
（＋）３−ＰＰＰのような部分的アゴニストのためのレ
セプター予備も存在しないであろう。代りの説明は、ア
ゴニレートサイクラーゼ活性の阻害は、後部下垂体中の
ＤＡによる酵素活性の阻害について提案されているよう
に（２３）、三元複合体の形成によって誘発された高ア
フィニティー状態におけるアゴニストのＤ−２レセプタ
ーへの結合に関係していることである。他方、ＧＴＰお
よびＮａＣｌの存在下決定された本報告中のＫI 値は、
低アフィニティー状態におけるアゴニストのレセプター
への結合を表明する。アデニレートサイクラーゼおよび
放射性結合アッセイは異なる温度で実施されたので直接
比較は困難であるが、高アフィニティークラスの部位へ
のＤＡ結合のＫI 値（０．３μＭ）は、ＤＡ阻害アデニ
レートサイクラーゼに対するＥＣ50値（０．６μＭ）に
近く、低アフィニティークラスの部位へのＤＡの結合の
ためのＫI 値（２４μＭ）およびＧＴＰ存在下の結合の
ためのＫI 値（１７μＭ）はかなり高い。
【００９８】ＤＡは、百日咳トキシンで処理したＬＺＲ
１細胞からの膜中ではアデニレートサイクラーゼ活性を
阻害しなかった。百日咳トキシン触媒ＧｉのＡＤＰリボ
シル化はアデニレートサイクラーゼのＧｉ仲介阻害を防
止するので、この知見はＤ−２レセプターは形質転換し
たＬＺＲ１細胞中のＧｉαと相互作用するとの仮説と一
致する。他の細胞タイプの百日咳トキシン処理後アデニ
レートサイクラーゼのイソプレテレノールによる刺激に
ついて観察されたように（２４）、百日咳トキシンによ
る無傷のＬＺＲ１細胞の処理はアデニレートサイクラー
ゼを刺激するフォルスコリンの能力を増強し、ある種の
細胞ラインにおいてはＧｉはフォルスコリンおよびホル
モン刺激アデニレートサイクラーゼ活性を変調するよう
に通常作用することを示唆した。
１細胞からの膜中ではアデニレートサイクラーゼ活性を
阻害しなかった。百日咳トキシン触媒ＧｉのＡＤＰリボ
シル化はアデニレートサイクラーゼのＧｉ仲介阻害を防
止するので、この知見はＤ−２レセプターは形質転換し
たＬＺＲ１細胞中のＧｉαと相互作用するとの仮説と一
致する。他の細胞タイプの百日咳トキシン処理後アデニ
レートサイクラーゼのイソプレテレノールによる刺激に
ついて観察されたように（２４）、百日咳トキシンによ
る無傷のＬＺＲ１細胞の処理はアデニレートサイクラー
ゼを刺激するフォルスコリンの能力を増強し、ある種の
細胞ラインにおいてはＧｉはフォルスコリンおよびホル
モン刺激アデニレートサイクラーゼ活性を変調するよう
に通常作用することを示唆した。
【００９９】我々は、Ｄ−２レセプターの高密度を安定
して発現する、ＲＧＢ−２ ｃＤＮＡでトランスフェク
トした細胞ラインを特徴化した。この細胞ラインをもっ
て、アデニレートサイクラーゼ活性を阻害するようにグ
アニンヌクレオチド結合タンパクと生産的に相互作用す
るＤＡ Ｄ−２レセプターをコードするｃＤＮＡが決定
された。ＲＧＢ−２ ｃＤＮＡは、殆どすべてのタイプ
の細胞において機能的Ｄ−２レセプターの発現を命令す
るように見える。例えば、ラット下垂体腫瘍から得たＧ
Ｈ4 Ｃ1 細胞は、ラット前部下垂体中のラクトトロフは
Ｄ−２レセプターを発現するけれども、ＤＡレセプター
を欠くプロラクチン分泌細胞である。ＧＨ4 Ｃ1 細胞へ
のＲＧＢ−２ ｃＤＮＡのトランスフェクションは、こ
こに記載したものと似た機能的特徴を有するＤ−２レセ
プターの発現を生ずる（２６）。Ｄ−２レセプターｃＤ
ＮＡでのトランスフェクションによってつくられた細胞
ラインは、Ｄ−２レセプターの作用および規制のメカニ
ズムの研究に有用であろう。
して発現する、ＲＧＢ−２ ｃＤＮＡでトランスフェク
トした細胞ラインを特徴化した。この細胞ラインをもっ
て、アデニレートサイクラーゼ活性を阻害するようにグ
アニンヌクレオチド結合タンパクと生産的に相互作用す
るＤＡ Ｄ−２レセプターをコードするｃＤＮＡが決定
された。ＲＧＢ−２ ｃＤＮＡは、殆どすべてのタイプ
の細胞において機能的Ｄ−２レセプターの発現を命令す
るように見える。例えば、ラット下垂体腫瘍から得たＧ
Ｈ4 Ｃ1 細胞は、ラット前部下垂体中のラクトトロフは
Ｄ−２レセプターを発現するけれども、ＤＡレセプター
を欠くプロラクチン分泌細胞である。ＧＨ4 Ｃ1 細胞へ
のＲＧＢ−２ ｃＤＮＡのトランスフェクションは、こ
こに記載したものと似た機能的特徴を有するＤ−２レセ
プターの発現を生ずる（２６）。Ｄ−２レセプターｃＤ
ＮＡでのトランスフェクションによってつくられた細胞
ラインは、Ｄ−２レセプターの作用および規制のメカニ
ズムの研究に有用であろう。
【０１００】
【表３】
【０１０１】
【表４】
【０１０２】
【表５】
【０１０３】
【表６】
【０１０４】実施例２要約 我々は、Ｄ2 −ドパミンレセプターの薬理学との結合部
位をエンコードするｃＤＮＡを記載した（Ｂｕｎｚｏ
ｗ，Ｊ．Ｒ．ら（１９６８）Ｎａｔｕｒｅ ３３６，７
８３−７８７）。我々は、このタンパクは機能性レセプ
ターであること、すなわちｃＡＭＰ生産およびホルモン
分泌を阻害するようにＧ−タンパクと結合することをこ
こに明らかにする。このｃＤＮＡはドパミンレセプター
を欠くラット体泌乳刺激ホルモン細胞株であるＧＨ4 Ｃ
1 に表現された。安定なトランスフェクタントが単離さ
れ、ノーザン班上のＤ2 −ドパミンレセプターｍＲＮＡ
の最高レベルを持つ一クローンＧＨ4 ＺＲ7 が詳細に研
究された。ＧＨ4 ＺＲ7 から単離された膜へのＤ2 −ド
パミン拮抗体 3Ｈ−スピペロンの結合は、ＫD ＝９６ｐ
ＭおよびＢｍａｘ＝２３００ｆｍｏｌ／ｍｇタンパクで
飽和し得る。ＧＴＰ／ＮａＣｌの添加は、 3Ｈ−スピペ
ロン結合に対してドパミン競合のＩＣ50値を２倍増加さ
せ、Ｄ2 −ドパミンレセプターは一種以上のＧタンパク
と相互作用することを示した。ドパミン結合部位の機能
へアクセスするため、ドパミンの急性生物学的作用がＧ
Ｈ4 ＺＲ7 細胞中で特徴化された。ドパミンは休止細胞
内および細胞外ｃＡＭＰレベルを５０〜７０％（ＥＣ50
＝８±２ｎＭ）減少し、そして基準レベルの８〜１２倍
であるｃＡＭＰレベルのＶＩＰ−誘発増強を完全にブロ
ックした（ＥＣ50＝６±１ｎＭ）。スピペロン，（＋）
−ブタクラモール，（−）−スルピライドおよびＳＣＨ
２３３９０によるＶＩＰ−増強ｃＡＭＰレベルのドパミ
ン誘発阻害の拮抗作用は、Ｄ2 −レセプターにおけるこ
れら拮抗体のＫ1 値から予期される濃度において発生
し、そして立体選択的であった。ドパミン（およびいく
つかのＤ2 −選択的アゴニスト）は、ＧＨ4 ＺＲ7 膜中
５００〜８００ｎＭのＥＣ50をもって、フオルスコリン
刺激アデニレートサクラーゼ活性を４５±６％阻害し
た。細胞ｃＡＭＰおよび膜調製物中におけるアデニレー
トサイクラーゼ活性のドパミン阻害は、百日咳トキシン
による前処理（５０ｎＭ／ｍｌ，１６ｈ）によって停止
された。ドパミン（２００ｎＭ）はＶＩＰおよびＴＲＨ
−誘発プロラクチン放出を停止した。これらデータは、
このｃＤＮＡクローンは、Ｇタンパクへ結合し、アデニ
ルサイクラーゼと、そしてｃＡＭＰ依存および非依存ホ
ルモン分泌を阻害する機能的ドパミン−Ｄ2 レセプター
をエンコードすることを結論的に示す。ＧＨ4 ＺＲ7 細
胞は、ドパミンＤ2 レセプターの生化学のそれ以上の解
明に有用であることを証明するであろう。
位をエンコードするｃＤＮＡを記載した（Ｂｕｎｚｏ
ｗ，Ｊ．Ｒ．ら（１９６８）Ｎａｔｕｒｅ ３３６，７
８３−７８７）。我々は、このタンパクは機能性レセプ
ターであること、すなわちｃＡＭＰ生産およびホルモン
分泌を阻害するようにＧ−タンパクと結合することをこ
こに明らかにする。このｃＤＮＡはドパミンレセプター
を欠くラット体泌乳刺激ホルモン細胞株であるＧＨ4 Ｃ
1 に表現された。安定なトランスフェクタントが単離さ
れ、ノーザン班上のＤ2 −ドパミンレセプターｍＲＮＡ
の最高レベルを持つ一クローンＧＨ4 ＺＲ7 が詳細に研
究された。ＧＨ4 ＺＲ7 から単離された膜へのＤ2 −ド
パミン拮抗体 3Ｈ−スピペロンの結合は、ＫD ＝９６ｐ
ＭおよびＢｍａｘ＝２３００ｆｍｏｌ／ｍｇタンパクで
飽和し得る。ＧＴＰ／ＮａＣｌの添加は、 3Ｈ−スピペ
ロン結合に対してドパミン競合のＩＣ50値を２倍増加さ
せ、Ｄ2 −ドパミンレセプターは一種以上のＧタンパク
と相互作用することを示した。ドパミン結合部位の機能
へアクセスするため、ドパミンの急性生物学的作用がＧ
Ｈ4 ＺＲ7 細胞中で特徴化された。ドパミンは休止細胞
内および細胞外ｃＡＭＰレベルを５０〜７０％（ＥＣ50
＝８±２ｎＭ）減少し、そして基準レベルの８〜１２倍
であるｃＡＭＰレベルのＶＩＰ−誘発増強を完全にブロ
ックした（ＥＣ50＝６±１ｎＭ）。スピペロン，（＋）
−ブタクラモール，（−）−スルピライドおよびＳＣＨ
２３３９０によるＶＩＰ−増強ｃＡＭＰレベルのドパミ
ン誘発阻害の拮抗作用は、Ｄ2 −レセプターにおけるこ
れら拮抗体のＫ1 値から予期される濃度において発生
し、そして立体選択的であった。ドパミン（およびいく
つかのＤ2 −選択的アゴニスト）は、ＧＨ4 ＺＲ7 膜中
５００〜８００ｎＭのＥＣ50をもって、フオルスコリン
刺激アデニレートサクラーゼ活性を４５±６％阻害し
た。細胞ｃＡＭＰおよび膜調製物中におけるアデニレー
トサイクラーゼ活性のドパミン阻害は、百日咳トキシン
による前処理（５０ｎＭ／ｍｌ，１６ｈ）によって停止
された。ドパミン（２００ｎＭ）はＶＩＰおよびＴＲＨ
−誘発プロラクチン放出を停止した。これらデータは、
このｃＤＮＡクローンは、Ｇタンパクへ結合し、アデニ
ルサイクラーゼと、そしてｃＡＭＰ依存および非依存ホ
ルモン分泌を阻害する機能的ドパミン−Ｄ2 レセプター
をエンコードすることを結論的に示す。ＧＨ4 ＺＲ7 細
胞は、ドパミンＤ2 レセプターの生化学のそれ以上の解
明に有用であることを証明するであろう。
【０１０５】序論 下垂体からのＰＲＬ分泌を支配する主要エレメントは、
下垂体門血流中のドパミン濃度である（１）。ドパミン
は下垂体ラクトトロフ上のドパミン−Ｄ2 レセプターを
介して基本およびホルモン刺激ＰＲＬ分泌を阻害するよ
うに作用する（１−５）。ドパミン−Ｄ2 レセプターは
百日咳トキシン感受性阻害Ｇタンパクと相互作用し（６
−９）、アゼニレートサイクラーゼ活性を減らし、そし
て他の剤によるｃＡＭＰレベルの増強をブロックする
（６，１０−１２）。ドパミンはまた、ラクトトロフ中
の〔Ｃａ++〕を減少させ、そして特にＴＲＨのような他
の剤による〔Ｃａ++〕の上昇を阻害する（１３−１
５）。ドパミンのｃＡＭＰおよび〔Ｃａ++〕の阻害は、
一つ以上の百日咳トキシン感受性Ｇタンパクへの結合に
よって仲介され、そしてＰＲＬ分泌のドパミン阻害に貢
献するように見える（１５）。ドパミン作用のこれらの
要素間の正確な関係は、非均質細胞タイプの存在、細胞
数の制限、および広汎なラクトトロフ調製物の応答性の
変動のため、研究することが困難であった（１５，１
６）。 ドパミン−Ｄ2 レセプターｃＤＮＡの最近のク
ローニング（１７）は、このレセプターの細胞内作用お
よび調節を検討するための有用な道具を提供する。この
Ｄ2 −ドパミンレセプタークローンが機能的レセプター
の合成を指令し、ドパミン−Ｄ2 レセプター活性化を生
物学的効果の間の経路を規定するかどうかを検討するた
め、我々は下垂体由来細胞株ＧＨ 4 Ｃ1 細胞中へドパミ
ン−Ｄ2 レセプターｃＤＮＡをトランスフェクトした。
ＧＨ4 Ｃ1 細胞はラット下垂体細胞であり、これはＰＲ
ＬおよびＧＨを合成分泌し、そして種々のホルモン、成
長因子、神経伝達レセプター、二次メッセンジャーシス
テムおよびイオンチャンネルを有し、そしてラクトトロ
フ機能のアクセスし得るモデルを提供した（１８，１
９）。しかしながら、これら細胞は正常ラクトトロフ上
に存在するドパミン−Ｄ2 レセプターを欠いており、こ
のためドパミン−Ｄ2 レセプターの機能の研究のための
理想的ホストを提供する。本報告は、ｃＤＮＡクローン
の遺伝子生産物はドパミン−Ｄ2 レセプターとして機能
し、そして阻害Ｇタンパクへ結合し、ｃＡＭＰ蓄積およ
びＰＲＬ放出を減少させることを明らかにする。ここで
特徴化されたＧＨ4 Ｃ1 トランスフェクタントは、Ｄ2
レセプターにおけるドパミン作用のメカニズムをさらに
研究することができる有用な細胞システムを提供するに
違いない。
下垂体門血流中のドパミン濃度である（１）。ドパミン
は下垂体ラクトトロフ上のドパミン−Ｄ2 レセプターを
介して基本およびホルモン刺激ＰＲＬ分泌を阻害するよ
うに作用する（１−５）。ドパミン−Ｄ2 レセプターは
百日咳トキシン感受性阻害Ｇタンパクと相互作用し（６
−９）、アゼニレートサイクラーゼ活性を減らし、そし
て他の剤によるｃＡＭＰレベルの増強をブロックする
（６，１０−１２）。ドパミンはまた、ラクトトロフ中
の〔Ｃａ++〕を減少させ、そして特にＴＲＨのような他
の剤による〔Ｃａ++〕の上昇を阻害する（１３−１
５）。ドパミンのｃＡＭＰおよび〔Ｃａ++〕の阻害は、
一つ以上の百日咳トキシン感受性Ｇタンパクへの結合に
よって仲介され、そしてＰＲＬ分泌のドパミン阻害に貢
献するように見える（１５）。ドパミン作用のこれらの
要素間の正確な関係は、非均質細胞タイプの存在、細胞
数の制限、および広汎なラクトトロフ調製物の応答性の
変動のため、研究することが困難であった（１５，１
６）。 ドパミン−Ｄ2 レセプターｃＤＮＡの最近のク
ローニング（１７）は、このレセプターの細胞内作用お
よび調節を検討するための有用な道具を提供する。この
Ｄ2 −ドパミンレセプタークローンが機能的レセプター
の合成を指令し、ドパミン−Ｄ2 レセプター活性化を生
物学的効果の間の経路を規定するかどうかを検討するた
め、我々は下垂体由来細胞株ＧＨ 4 Ｃ1 細胞中へドパミ
ン−Ｄ2 レセプターｃＤＮＡをトランスフェクトした。
ＧＨ4 Ｃ1 細胞はラット下垂体細胞であり、これはＰＲ
ＬおよびＧＨを合成分泌し、そして種々のホルモン、成
長因子、神経伝達レセプター、二次メッセンジャーシス
テムおよびイオンチャンネルを有し、そしてラクトトロ
フ機能のアクセスし得るモデルを提供した（１８，１
９）。しかしながら、これら細胞は正常ラクトトロフ上
に存在するドパミン−Ｄ2 レセプターを欠いており、こ
のためドパミン−Ｄ2 レセプターの機能の研究のための
理想的ホストを提供する。本報告は、ｃＤＮＡクローン
の遺伝子生産物はドパミン−Ｄ2 レセプターとして機能
し、そして阻害Ｇタンパクへ結合し、ｃＡＭＰ蓄積およ
びＰＲＬ放出を減少させることを明らかにする。ここで
特徴化されたＧＨ4 Ｃ1 トランスフェクタントは、Ｄ2
レセプターにおけるドパミン作用のメカニズムをさらに
研究することができる有用な細胞システムを提供するに
違いない。
【０１０６】実験操作 材料：ドパミンアゴニストおよびアンタゴニストは、キ
ンピロール（リリー）、ブロモクリプチン（サンド研究
所）、および（＋）および（−）３−ＰＰＰ（アトラ
ス）を除いて、リサーチ、バイオケミカルズ、インコー
ポレーテッド（マサチューセッツ州ウオルサム）からの
ものであった。２−Ｏ−スクシニル−ｃＡＭＰに対する
ウサギ抗体−ウシ血清アルブミン複合体は、ＩＣＮ（カ
リフォルニア州アービン）から得、そしてｒＰＲＬ標準
および抗−ｒＰＲＬ抗体はメリーランド州ベセスダ、Ｎ
ＩＤＤＫ、Ｓａｌｖａｔｏｒｅ Ｒａｉｔｉ博士からの
ものであった。ペプチド類はＰｅｎｉｎｓｕｌａ社（カ
リフォルニア）またはＳｉｇｍａ社（ミズリー州セント
ルイス）からのものであった。α32Ｐ−ｄＣＴＰ（２，
２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ） 125Ｉ−２−Ｏ−（ヨードチロ
シルメチルエステル）スクシニルｃＡＭＰ（２，２００
Ｃｉ／ｍｍｏｌ）， 3Ｈ−ｃＡＭＰ（３１．９Ｃｉ／ｍ
ｍｏｌ）はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ社
（マサチューセッツ州ボストン）からのものであった。
すべての他の薬品は主としてＳｉｇｍａ社から得た試薬
級であった。
ンピロール（リリー）、ブロモクリプチン（サンド研究
所）、および（＋）および（−）３−ＰＰＰ（アトラ
ス）を除いて、リサーチ、バイオケミカルズ、インコー
ポレーテッド（マサチューセッツ州ウオルサム）からの
ものであった。２−Ｏ−スクシニル−ｃＡＭＰに対する
ウサギ抗体−ウシ血清アルブミン複合体は、ＩＣＮ（カ
リフォルニア州アービン）から得、そしてｒＰＲＬ標準
および抗−ｒＰＲＬ抗体はメリーランド州ベセスダ、Ｎ
ＩＤＤＫ、Ｓａｌｖａｔｏｒｅ Ｒａｉｔｉ博士からの
ものであった。ペプチド類はＰｅｎｉｎｓｕｌａ社（カ
リフォルニア）またはＳｉｇｍａ社（ミズリー州セント
ルイス）からのものであった。α32Ｐ−ｄＣＴＰ（２，
２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ） 125Ｉ−２−Ｏ−（ヨードチロ
シルメチルエステル）スクシニルｃＡＭＰ（２，２００
Ｃｉ／ｍｍｏｌ）， 3Ｈ−ｃＡＭＰ（３１．９Ｃｉ／ｍ
ｍｏｌ）はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ社
（マサチューセッツ州ボストン）からのものであった。
すべての他の薬品は主としてＳｉｇｍａ社から得た試薬
級であった。
【０１０７】方法：ｐＺＥＭ−Ｄ2 −ｃＤＮＡの構築：
ｐＺＥＭ−３プラスミド（２０）をメタロチオネインプ
ロモーターとｈＧＨ３’−フランキング配列の間のＢｇ
１ II部位において切断した。ドパミン−Ｄ2 ｃＤＮＡ
全長（１７）は、λＧＴ１０からＳａ１ Ｉで切開し、
そしてｄＡＴＰおよびｄＧＴＰ（２５０μＭ）の存在下
切断したｐＺＥＭ−３プラスミドヘリゲートし、そして
Ｅ．Ｃｏｌｉ株ＸＬ−１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中へ
形質転換した。組換え物はそれらの32Ｐ標識Ｄ2 −ｃＤ
ＮＡへのハイブリダイゼーションと、次に制限分析およ
びＤＮＡ配列によって特徴化された。オリエンテーショ
ンの意味におけるｃＤＮＡ挿入物による組換え物を調製
し、真核細胞中へのトランスフェクションのためＣｓＣ
ｌ勾配遠心によって精製した。
ｐＺＥＭ−３プラスミド（２０）をメタロチオネインプ
ロモーターとｈＧＨ３’−フランキング配列の間のＢｇ
１ II部位において切断した。ドパミン−Ｄ2 ｃＤＮＡ
全長（１７）は、λＧＴ１０からＳａ１ Ｉで切開し、
そしてｄＡＴＰおよびｄＧＴＰ（２５０μＭ）の存在下
切断したｐＺＥＭ−３プラスミドヘリゲートし、そして
Ｅ．Ｃｏｌｉ株ＸＬ−１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中へ
形質転換した。組換え物はそれらの32Ｐ標識Ｄ2 −ｃＤ
ＮＡへのハイブリダイゼーションと、次に制限分析およ
びＤＮＡ配列によって特徴化された。オリエンテーショ
ンの意味におけるｃＤＮＡ挿入物による組換え物を調製
し、真核細胞中へのトランスフェクションのためＣｓＣ
ｌ勾配遠心によって精製した。
【０１０８】細胞培養：Ａ．Ｈ．Ｔａｓｈｉｊｉａｎ，
Ｊｒ．博士（マサチューセッツ州ボストン、ハーバート
大学）から得たＧＨ4 Ｃ1 細胞およびサブクローンを、
１０％ウシ胎児血液を補給したＨａｍ Ｆ１０培地中、
３７℃において５％ＣＯ2 中で発育させた。３Ｈ−スピ
ペロン結合またはアデニレートサイクラーゼ活性の研究
のため、細胞は１０％ウシ胎児血清を補給したＤｕｌｂ
ｅｃｃｏの修正イーグル培地中、３７℃で１０％ＣＯ2
中で成育させた。培地はトランスフェクションまたは実
験前１２〜２４時間に交換した。トランスフェクション
のため、ＧＨ4Ｃ1 細胞は２〜４×１０6 細胞／１０cm
皿へ成育させた。２０μｇのｐＺＥＭ−Ｄ2 ｃＤＮＡお
よび１μｇのｐＲＳＶ−ネオを２ｍｌのＨｅｐｅｓ緩衝
化食塩水中リン酸カルシウムで共沈させ、細胞上に１０
〜２０分置いた。加温Ｆ１０＋１０％ウシ胎児血清（ｐ
Ｈ７．０）８ｍｌを加え、細胞を３７℃で４〜５時間イ
ンキュベートした。プレートを洗浄し、細胞をインキュ
ベーター中に１６〜２０時間置いた。７００μｇ／ｍｌ
のＧ４１８（ジェネチシン，Ｇｉｂｃｏ，Ｎ．Ｙ．）を
補給した新しい培地を次の３〜４週にわたって添加し、
ネオ抵抗を発現する安定なトランスフェクタントを選別
した。個々のコロニー３〜５μｌを採取するため無菌マ
イクロピペットを使用して単一コロニーを単離した。ト
ランスフェクタント細胞ラインのストックを液体窒素中
に貯蔵冷凍すれば、Ｇ４１８は成育培地から排除した。
Ｊｒ．博士（マサチューセッツ州ボストン、ハーバート
大学）から得たＧＨ4 Ｃ1 細胞およびサブクローンを、
１０％ウシ胎児血液を補給したＨａｍ Ｆ１０培地中、
３７℃において５％ＣＯ2 中で発育させた。３Ｈ−スピ
ペロン結合またはアデニレートサイクラーゼ活性の研究
のため、細胞は１０％ウシ胎児血清を補給したＤｕｌｂ
ｅｃｃｏの修正イーグル培地中、３７℃で１０％ＣＯ2
中で成育させた。培地はトランスフェクションまたは実
験前１２〜２４時間に交換した。トランスフェクション
のため、ＧＨ4Ｃ1 細胞は２〜４×１０6 細胞／１０cm
皿へ成育させた。２０μｇのｐＺＥＭ−Ｄ2 ｃＤＮＡお
よび１μｇのｐＲＳＶ−ネオを２ｍｌのＨｅｐｅｓ緩衝
化食塩水中リン酸カルシウムで共沈させ、細胞上に１０
〜２０分置いた。加温Ｆ１０＋１０％ウシ胎児血清（ｐ
Ｈ７．０）８ｍｌを加え、細胞を３７℃で４〜５時間イ
ンキュベートした。プレートを洗浄し、細胞をインキュ
ベーター中に１６〜２０時間置いた。７００μｇ／ｍｌ
のＧ４１８（ジェネチシン，Ｇｉｂｃｏ，Ｎ．Ｙ．）を
補給した新しい培地を次の３〜４週にわたって添加し、
ネオ抵抗を発現する安定なトランスフェクタントを選別
した。個々のコロニー３〜５μｌを採取するため無菌マ
イクロピペットを使用して単一コロニーを単離した。ト
ランスフェクタント細胞ラインのストックを液体窒素中
に貯蔵冷凍すれば、Ｇ４１８は成育培地から排除した。
【０１０９】ＲＮＡ単離およびノーザン斑分析：細胞を
カルシウム不含Ｈｅｐｅｓ緩衝化食塩水＋０．０２％Ｅ
ＤＴＡ中で洗い、そしてトリス緩衝化グアニジウム塩酸
塩で抽出し、１．７ｇ／ｍｌ ＣｓＣｌパッドを通して
遠心し（３３，０００ｒｐｍ，１６ｈ）、そしてペレッ
トをフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノール沈
澱させる（２１）。ＲＮＡを再懸濁し、ＯＤ＝２６０ｎ
ｍにおけるＵＶ吸収によって定量する。ノーザン斑のた
め、ＲＮＡをグリオキサール／ＤＭＳＯ中で変性し（１
ｈ，５０℃）、１０ｍＭリン酸ナトリウム中１％アガロ
ースゲル上へ流した。ＲＮＡをナイロン膜（Ｎ−結合，
Ａｍｅｒｓｈａｍ）上に一夜しませ、８０℃で２時間焼
付けした。プレハイブリッド化は６時間４２℃において
記載したように行った。ランダムにプライムしたＤ2 −
ｃＤＮＡの32Ｐ標準１．６ＫｂＢａｍＨＩ−Ｂｇ１ II
フラグメント（１〜２×１０6 ｄｐｍ／μｇ）を５０％
ホルムアミド中４２℃における１６〜２０ｈのハイブリ
ッド化のために使用した。斑点を２×ＳＳＣ中１０分間
室温で洗浄し、０．２×ＳＳＣ，０．５％ＳＤＳ中７０
℃における３×１５分洗浄を行い、そして増感スクリー
ンを使用してＸ線フィルムへ一夜−８０℃において露出
した。
カルシウム不含Ｈｅｐｅｓ緩衝化食塩水＋０．０２％Ｅ
ＤＴＡ中で洗い、そしてトリス緩衝化グアニジウム塩酸
塩で抽出し、１．７ｇ／ｍｌ ＣｓＣｌパッドを通して
遠心し（３３，０００ｒｐｍ，１６ｈ）、そしてペレッ
トをフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノール沈
澱させる（２１）。ＲＮＡを再懸濁し、ＯＤ＝２６０ｎ
ｍにおけるＵＶ吸収によって定量する。ノーザン斑のた
め、ＲＮＡをグリオキサール／ＤＭＳＯ中で変性し（１
ｈ，５０℃）、１０ｍＭリン酸ナトリウム中１％アガロ
ースゲル上へ流した。ＲＮＡをナイロン膜（Ｎ−結合，
Ａｍｅｒｓｈａｍ）上に一夜しませ、８０℃で２時間焼
付けした。プレハイブリッド化は６時間４２℃において
記載したように行った。ランダムにプライムしたＤ2 −
ｃＤＮＡの32Ｐ標準１．６ＫｂＢａｍＨＩ−Ｂｇ１ II
フラグメント（１〜２×１０6 ｄｐｍ／μｇ）を５０％
ホルムアミド中４２℃における１６〜２０ｈのハイブリ
ッド化のために使用した。斑点を２×ＳＳＣ中１０分間
室温で洗浄し、０．２×ＳＳＣ，０．５％ＳＤＳ中７０
℃における３×１５分洗浄を行い、そして増感スクリー
ンを使用してＸ線フィルムへ一夜−８０℃において露出
した。
【０１１０】リガンド結合：細胞膜は、最初成育培地を
氷冷した低張緩衝液（１ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．
４，２ｍＭ ＥＤＴＡ）で交換することによって調製し
た。１０〜１５分膨潤した後、細胞をプレートからかき
落し、２４，０００ｇにおいて２０分遠心し、トリス等
張食塩水（５０ｍＭトリス，ｐＨ７．４，０．９ＮａＣ
ｌ）中セッティング６においてＢｒｉｎｋｍａｎ Ｐｏ
ｌｙｔｒｏｎホモジナイザーで１０秒分解し、レセプタ
ー結合実験のための−７０℃において貯蔵するか、また
はアデニレートサイクサラーゼアッセイ（後記）に直ち
に使用するため、５０ｍＭトリス，ｐＨ７．４中に再懸
濁し、上記のように遠心し、５０ｍＭトリス中に再懸濁
した。結合アッセイのため、膜調製物は解凍し、遠心し
（２４，０００ｇ×２０分）、特記した場合を除きトリ
ス等張食塩水中に再懸濁した。膜調製物の部分標本を５
０ｍＭトリス，ｐＨ７．４，０．９％ＮａＣｌ，０．０
２５％アスコルビン酸、０．００１％ウシ血清アルブミ
ン、 3Ｈ−スピペロンおよび指示した薬物を含んでいる
試験管へ加える。（＋）−ブタクラモール（２μＭ）は
非特異性結合を規定するために使用した。これは放射性
リガンドのＫD 値近くの濃度における総結合の１０％以
下であった。アッセイは、飽和分析のため２ｍｌのまた
は阻害分析のため１ｍｌの容積において二度実施した。
インキュベーションは膜タンパク１０〜５０μｇの添加
によって関しされ、そして３７℃において５０分実施
し、そして各試験管へ氷冷した緩衝液（１０ｍＭトリ
ス，ｐＨ７．４，０．９％ＮＣｌ）１０ｍｌの添加によ
って停止した。サンプルはガラス繊維フィルター（Ｓｃ
ｈｌｉｃｈｅｒおよびＳｃｈｕｅｌｌ Ｎｏ．３０）を
通して直ちに濾過し、氷冷緩衝液１０ｍｌで洗った。フ
ィルター上に保持された放射能をベックマンＬＳ１７０
１シンチレーションカウンターを用いてカウントした。
ドパミン結合に対するＧＴＰの効果を調べる実験におい
ては、細胞を収穫し、遠心し、トリス−Ｍｇ++（５０ｍ
Ｍトリス，ｐＨ７．４，５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ）中に再懸
濁し、１５分間３７℃でインキューベートした。遠心後
再懸濁したタンパクを、ＧＴＰまたはＮａＣｌを添加し
ないトリス−Ｍｇ++，または１２０ｍＭＮａＣｌおよび
１００μＭ ＧＴＰを添加したトリス−Ｍｇ++を含むア
ッセイへ加えた。
氷冷した低張緩衝液（１ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．
４，２ｍＭ ＥＤＴＡ）で交換することによって調製し
た。１０〜１５分膨潤した後、細胞をプレートからかき
落し、２４，０００ｇにおいて２０分遠心し、トリス等
張食塩水（５０ｍＭトリス，ｐＨ７．４，０．９ＮａＣ
ｌ）中セッティング６においてＢｒｉｎｋｍａｎ Ｐｏ
ｌｙｔｒｏｎホモジナイザーで１０秒分解し、レセプタ
ー結合実験のための−７０℃において貯蔵するか、また
はアデニレートサイクサラーゼアッセイ（後記）に直ち
に使用するため、５０ｍＭトリス，ｐＨ７．４中に再懸
濁し、上記のように遠心し、５０ｍＭトリス中に再懸濁
した。結合アッセイのため、膜調製物は解凍し、遠心し
（２４，０００ｇ×２０分）、特記した場合を除きトリ
ス等張食塩水中に再懸濁した。膜調製物の部分標本を５
０ｍＭトリス，ｐＨ７．４，０．９％ＮａＣｌ，０．０
２５％アスコルビン酸、０．００１％ウシ血清アルブミ
ン、 3Ｈ−スピペロンおよび指示した薬物を含んでいる
試験管へ加える。（＋）−ブタクラモール（２μＭ）は
非特異性結合を規定するために使用した。これは放射性
リガンドのＫD 値近くの濃度における総結合の１０％以
下であった。アッセイは、飽和分析のため２ｍｌのまた
は阻害分析のため１ｍｌの容積において二度実施した。
インキュベーションは膜タンパク１０〜５０μｇの添加
によって関しされ、そして３７℃において５０分実施
し、そして各試験管へ氷冷した緩衝液（１０ｍＭトリ
ス，ｐＨ７．４，０．９％ＮＣｌ）１０ｍｌの添加によ
って停止した。サンプルはガラス繊維フィルター（Ｓｃ
ｈｌｉｃｈｅｒおよびＳｃｈｕｅｌｌ Ｎｏ．３０）を
通して直ちに濾過し、氷冷緩衝液１０ｍｌで洗った。フ
ィルター上に保持された放射能をベックマンＬＳ１７０
１シンチレーションカウンターを用いてカウントした。
ドパミン結合に対するＧＴＰの効果を調べる実験におい
ては、細胞を収穫し、遠心し、トリス−Ｍｇ++（５０ｍ
Ｍトリス，ｐＨ７．４，５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ）中に再懸
濁し、１５分間３７℃でインキューベートした。遠心後
再懸濁したタンパクを、ＧＴＰまたはＮａＣｌを添加し
ないトリス−Ｍｇ++，または１２０ｍＭＮａＣｌおよび
１００μＭ ＧＴＰを添加したトリス−Ｍｇ++を含むア
ッセイへ加えた。
【０１１１】ｃＡＭＰおよびＰＲＬアッセイ：細胞を実
験３〜７日前に６ウエル，３５ｍｍ皿中にプレートし
た。細胞は２ｍｌ／ウエルの加温下１０＋０．１％
（−）アスコルビン酸＋２ｍＭトリス（ｐＨ７．２）
（ＦＡＴ）中５〜１０分プレインキュベートし、１ｍｌ
／ウエルのＦＡＴ＋１００μｍ ＩＢＭＸ＋実験化合物
を加え、３７℃において３０分間インキュベートした。
実験化合物はアッセイ直前につくったストック溶液から
２００〜１０００倍希釈した。最終エタノール濃度はＧ
Ｈ4 ＺＲ7 細胞中の基準またはＶＩＰ増強ｃＡＭＰまた
はＰＲＬレベルに対し影響のない濃度である、０．１％
を決してこえなかった。培地を集め、細胞を沸騰水１ｍ
ｌ中で直ちに分解した。細胞分解物および培地を遠心し
（２０００ｇ，１０分，４℃），上清を細胞抽出物とし
てアッセイのため集めた。細胞抽出物および培地サンプ
ルは、もし直ちにアッセイしなければアッセイまで−２
０℃で冷凍した。ｃＡＭＰは、使用した抗体を１：５０
０希釈して記載した特異性ラジオイムノアッセイ（２
２）によってアッセイした。４℃において１６時間イン
キュベーション後、１０％ＢＳＡ２０μｌおよび９５％
エタノール１ｍｌを続いて加え、抗体−抗原複合体を沈
澱させた。標準曲線はｃＡＭＰを標準として用い、０．
５±０．２ｐｍｏｌのＩＣ50を示した。ＰＲＬは、ＦＡ
Ｔ培地中３０分インキュベーションの間ＩＢＭＸを省略
したことを除き、上記のようにして得た培地サンプル中
でアッセイした。ＰＲＬレベルは抗体−抗原複合体を沈
澱するためＳｔａｐｈｙｌｏｃｃｕｓ Ａ分解物（Ｉｇ
Ｓｏｒｎｂ，Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｍ
ａｌｄｅｎ，ＭＡ）を使用する特異性ラジオイムノアッ
セイ（２３）によって測定した。
験３〜７日前に６ウエル，３５ｍｍ皿中にプレートし
た。細胞は２ｍｌ／ウエルの加温下１０＋０．１％
（−）アスコルビン酸＋２ｍＭトリス（ｐＨ７．２）
（ＦＡＴ）中５〜１０分プレインキュベートし、１ｍｌ
／ウエルのＦＡＴ＋１００μｍ ＩＢＭＸ＋実験化合物
を加え、３７℃において３０分間インキュベートした。
実験化合物はアッセイ直前につくったストック溶液から
２００〜１０００倍希釈した。最終エタノール濃度はＧ
Ｈ4 ＺＲ7 細胞中の基準またはＶＩＰ増強ｃＡＭＰまた
はＰＲＬレベルに対し影響のない濃度である、０．１％
を決してこえなかった。培地を集め、細胞を沸騰水１ｍ
ｌ中で直ちに分解した。細胞分解物および培地を遠心し
（２０００ｇ，１０分，４℃），上清を細胞抽出物とし
てアッセイのため集めた。細胞抽出物および培地サンプ
ルは、もし直ちにアッセイしなければアッセイまで−２
０℃で冷凍した。ｃＡＭＰは、使用した抗体を１：５０
０希釈して記載した特異性ラジオイムノアッセイ（２
２）によってアッセイした。４℃において１６時間イン
キュベーション後、１０％ＢＳＡ２０μｌおよび９５％
エタノール１ｍｌを続いて加え、抗体−抗原複合体を沈
澱させた。標準曲線はｃＡＭＰを標準として用い、０．
５±０．２ｐｍｏｌのＩＣ50を示した。ＰＲＬは、ＦＡ
Ｔ培地中３０分インキュベーションの間ＩＢＭＸを省略
したことを除き、上記のようにして得た培地サンプル中
でアッセイした。ＰＲＬレベルは抗体−抗原複合体を沈
澱するためＳｔａｐｈｙｌｏｃｃｕｓ Ａ分解物（Ｉｇ
Ｓｏｒｎｂ，Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｍ
ａｌｄｅｎ，ＭＡ）を使用する特異性ラジオイムノアッ
セイ（２３）によって測定した。
【０１１２】アデニレートサイクラーゼアッセイ：α32
Ｐ−ＡＴＰの32Ｐ−ｃＡＭＰへの転換は、本質上Ｓａｌ
ｏｍｏｎ ｅｔ ａｌ（２４）によって記載されたよう
に測定された。膜（１０〜５０μｇ）は１００μｌの容
積において、５０ｍＭトリス，ｐＨ７．４，５ｍＭ ｃ
ＡＭＰ，１ｍＭ ＩＢＭＸ，１ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，０．
５ｍＭ ＥＤＴＡ，０．２５ｍＭ ＡＴＰ，３０μｍ
ＧＴＰ，約２×１０6ｃｐｍのα32Ｐ−ＡＴＰおよび種
々の薬物を含んでいるアッセイ２００μｌへ添加され
た。３回実施されたアッセイは、２５℃へ加温すること
によって開始され、０℃へ冷却することにより停止され
た。各アッセイへトリクロル酢酸（３０％溶液１００μ
ｌ）を加え、そして各チューブ 3Ｈ−ｃＡＭＰ（３０，
０００ｃｐｍ）を内部標準として加えた。アッセイ容積
は水の添加によって１ｍｌへ増量され、チューブは遠心
（２０００ｇ×１０分）された。上清中のｃＡＭＰはＤ
ｏｗｅｘ ＡＧ５０Ｗ−Ｘ4 樹脂および中性アルミナを
含むカラム上のシーケンシアルクロマトグラフィーによ
って単離された。各アルミナカラムからの２ｍｌ溶離物
を液体シンチレーション計数のため１０ｍｌのＢｉｏ−
ＳａｆｅII（ＲＰＩ，Ｍｏｕｎｔ Ｐｒｏｓｐｅｃｔ，
ＩＬ）中に溶解した。
Ｐ−ＡＴＰの32Ｐ−ｃＡＭＰへの転換は、本質上Ｓａｌ
ｏｍｏｎ ｅｔ ａｌ（２４）によって記載されたよう
に測定された。膜（１０〜５０μｇ）は１００μｌの容
積において、５０ｍＭトリス，ｐＨ７．４，５ｍＭ ｃ
ＡＭＰ，１ｍＭ ＩＢＭＸ，１ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，０．
５ｍＭ ＥＤＴＡ，０．２５ｍＭ ＡＴＰ，３０μｍ
ＧＴＰ，約２×１０6ｃｐｍのα32Ｐ−ＡＴＰおよび種
々の薬物を含んでいるアッセイ２００μｌへ添加され
た。３回実施されたアッセイは、２５℃へ加温すること
によって開始され、０℃へ冷却することにより停止され
た。各アッセイへトリクロル酢酸（３０％溶液１００μ
ｌ）を加え、そして各チューブ 3Ｈ−ｃＡＭＰ（３０，
０００ｃｐｍ）を内部標準として加えた。アッセイ容積
は水の添加によって１ｍｌへ増量され、チューブは遠心
（２０００ｇ×１０分）された。上清中のｃＡＭＰはＤ
ｏｗｅｘ ＡＧ５０Ｗ−Ｘ4 樹脂および中性アルミナを
含むカラム上のシーケンシアルクロマトグラフィーによ
って単離された。各アルミナカラムからの２ｍｌ溶離物
を液体シンチレーション計数のため１０ｍｌのＢｉｏ−
ＳａｆｅII（ＲＰＩ，Ｍｏｕｎｔ Ｐｒｏｓｐｅｃｔ，
ＩＬ）中に溶解した。
【０１１３】計算：ｃＡＭＰおよびＰＲＬアッセイから
のデータは、３回測定の平均±標準誤差として表わされ
る。曲線あてはめパラメータは、Ｅｎｚｆｉｔｔｅｒプ
ログラム（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｂｉｏｓｏｆｔ）を使い
る非直線回帰分析によって得られた。平均アフィニティ
ー，ＥＣ50およびＩＣ50値は、実験の指示数の幾何平均
である。競合実験においては、Ｋ1 値はＣｈｅｎｇおよ
びＰｒｕｓｏｆｆの方法（２５）により実験的に決定し
たＩＣ50値から計算された。すべての実験は第４２図に
提供したもの（２回）を除いて、独立した３〜５回の試
験の代表であった。
のデータは、３回測定の平均±標準誤差として表わされ
る。曲線あてはめパラメータは、Ｅｎｚｆｉｔｔｅｒプ
ログラム（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｂｉｏｓｏｆｔ）を使い
る非直線回帰分析によって得られた。平均アフィニティ
ー，ＥＣ50およびＩＣ50値は、実験の指示数の幾何平均
である。競合実験においては、Ｋ1 値はＣｈｅｎｇおよ
びＰｒｕｓｏｆｆの方法（２５）により実験的に決定し
たＩＣ50値から計算された。すべての実験は第４２図に
提供したもの（２回）を除いて、独立した３〜５回の試
験の代表であった。
【０１１４】結果：安定なトランスフェクタントの特徴
化：ＧＨ4 Ｃ1 細胞は、ｐＺＥＭ−Ｄ2 −ｃＤＮＡおよ
びｐＲＳＶ−ネオで同時トランスフェクトされ、抗生物
質Ｇ４１８へ抵抗性のコロニーが単離され、最初ノーザ
ン斑分析によって特徴化された。一クローンＧＨ4 ＺＲ
7 は、他のクローンより高い２．５ｋｂ Ｄ2 ＲＡＡレ
ベルを持っていた（第３３図）。野性タイプ（トランス
フェクトしない）ＧＨ4 Ｃ1細胞、そしてｐＺＥＭ−３
ベクター３中にラット５−ＨＴ1Aレセプター遺伝子を発
現するＧＨ4 Ｃ1 細胞トランスフェクタント（ＧＨ4 Ｚ
Ｄ10）は、Ｄ2 −レセプタープローブへハイブリッド化
を示さなかった。３６時間１０μＭ ＺｎＳＯ 4 による
ＧＨ4 ＺＲ4 細胞の前処理は、Ｄ2 レセプターｍＲＮＡ
の著しい増強を誘発し、転写されたｍＲＮＡは亜鉛感受
性メタロチオネインプロモーターによって調節されるこ
と（２０）を示す。ＧＨ4 ＺＲ7 クローンは、このクロ
ーンにおけるドパミン−Ｄ2 レセプター発現の高レベル
のため、以後の分析（後記）のために使用された。
化：ＧＨ4 Ｃ1 細胞は、ｐＺＥＭ−Ｄ2 −ｃＤＮＡおよ
びｐＲＳＶ−ネオで同時トランスフェクトされ、抗生物
質Ｇ４１８へ抵抗性のコロニーが単離され、最初ノーザ
ン斑分析によって特徴化された。一クローンＧＨ4 ＺＲ
7 は、他のクローンより高い２．５ｋｂ Ｄ2 ＲＡＡレ
ベルを持っていた（第３３図）。野性タイプ（トランス
フェクトしない）ＧＨ4 Ｃ1細胞、そしてｐＺＥＭ−３
ベクター３中にラット５−ＨＴ1Aレセプター遺伝子を発
現するＧＨ4 Ｃ1 細胞トランスフェクタント（ＧＨ4 Ｚ
Ｄ10）は、Ｄ2 −レセプタープローブへハイブリッド化
を示さなかった。３６時間１０μＭ ＺｎＳＯ 4 による
ＧＨ4 ＺＲ4 細胞の前処理は、Ｄ2 レセプターｍＲＮＡ
の著しい増強を誘発し、転写されたｍＲＮＡは亜鉛感受
性メタロチオネインプロモーターによって調節されるこ
と（２０）を示す。ＧＨ4 ＺＲ7 クローンは、このクロ
ーンにおけるドパミン−Ｄ2 レセプター発現の高レベル
のため、以後の分析（後記）のために使用された。
【０１１５】選択的ドパミン−Ｄ2 レセプターアンタゴ
ニストである 3Ｈ−スピペロンの特異的結合は、ＧＨ4
ＺＲ4 細胞から調製した粗製膜中でアッセイされた（第
３４図）。ＧＨ4 ＺＲ7 膜は、ＺｕＭ（＋）ブタクラモ
ールによって置換された 3Ｈ−スピペロン結合の飽和し
得る成分を示したが、野性タイプＧＨ4 Ｃ1 細胞からの
膜は特異的 3Ｈ−スピペロン結合を示さなかった（デー
タ示さず）。５回の実験において、ＧＨ4 ＺＲ7 細胞膜
は２０４６±３１５ｆｍｏｌ／ｍｇタンパクの最高特異
性 3Ｈ−スピペロン結合と、９６±１ｐＭの平均ＫD 値
を示した。これらの値は、これら細胞中のドパミン−Ｄ
2 結合部位の強い発現と、そしてラット線状膜中に、そ
してｐＺＥＭ−Ｄ2 −ｃＤＮＡでトランスフェクトした
Ｌｔｋ-細胞中に得られるもの（１７）に匹敵する 3Ｈ
−スピペロンに対する親和性を指示する。
ニストである 3Ｈ−スピペロンの特異的結合は、ＧＨ4
ＺＲ4 細胞から調製した粗製膜中でアッセイされた（第
３４図）。ＧＨ4 ＺＲ7 膜は、ＺｕＭ（＋）ブタクラモ
ールによって置換された 3Ｈ−スピペロン結合の飽和し
得る成分を示したが、野性タイプＧＨ4 Ｃ1 細胞からの
膜は特異的 3Ｈ−スピペロン結合を示さなかった（デー
タ示さず）。５回の実験において、ＧＨ4 ＺＲ7 細胞膜
は２０４６±３１５ｆｍｏｌ／ｍｇタンパクの最高特異
性 3Ｈ−スピペロン結合と、９６±１ｐＭの平均ＫD 値
を示した。これらの値は、これら細胞中のドパミン−Ｄ
2 結合部位の強い発現と、そしてラット線状膜中に、そ
してｐＺＥＭ−Ｄ2 −ｃＤＮＡでトランスフェクトした
Ｌｔｋ-細胞中に得られるもの（１７）に匹敵する 3Ｈ
−スピペロンに対する親和性を指示する。
【０１１６】発現されたドパミン結合部位がＧタンパク
と相互作用するかどうか確かめるため、ドパミンによる
3Ｈ−スピペロン結合の阻害を１００μＭ ＧＴＰおよ
び１２０ｍＭ ＮａＣｌの不存在または存在下において
ＧＨ4 ＺＲ7 細胞膜中でアッセイした（第３６図）。ア
ッセイはドパミンの高いアフィニティー結合を向上させ
るため４ｍＭ ＭｇＣｌ2 の存在下で実施された。添加
したＧＴＰおよびＮａＣｌの不存在下では、ドパミンは
ＩＣ50＝４９±１５μＭと、Ｈｉｌｌ計数０．６９をも
って 3Ｈ−スピペロン結合を阻害し、ドパミンに対し高
いおよび低いアフィニティー部位の存在を示唆した。２
種類の結合部位の存在を推測させるモデルに従ったデー
タの解析は、レセプターの４６±１５％はドパミンに対
し高いアフィニティー（ＫD ＝０．５μＭ）を有し、残
りのレセプターはアゴニスト煮対して低いアフィニティ
ー（３０μＭ）を持っていることを示した。ＧＴＰおよ
びＮａＣｌの存在下においては、ドパミンに対するＩＣ
50は、単一性（０．９３）へ近いＨｉｌｌ計数をもって
１０９±２０μＭ（ＫI ＝１７μＭ）へ２倍シフトし
た。このように、ＧＴＰ／ＮａＣｌの存在は、線条細胞
調製物中で観察されたように（６，７）、ドパミンレセ
プターを高いおよび低いアフィニティーレセプターの不
均質集団から低アフィニティーアゴニスト集団状態にあ
るレセプターの殆ど均質な集団へコンバートする。これ
らのデータは、クローン化したドパミン結合部位はＧＨ
4 細胞中に発現させる時Ｇタンパクと相互作用すること
を示唆する。
と相互作用するかどうか確かめるため、ドパミンによる
3Ｈ−スピペロン結合の阻害を１００μＭ ＧＴＰおよ
び１２０ｍＭ ＮａＣｌの不存在または存在下において
ＧＨ4 ＺＲ7 細胞膜中でアッセイした（第３６図）。ア
ッセイはドパミンの高いアフィニティー結合を向上させ
るため４ｍＭ ＭｇＣｌ2 の存在下で実施された。添加
したＧＴＰおよびＮａＣｌの不存在下では、ドパミンは
ＩＣ50＝４９±１５μＭと、Ｈｉｌｌ計数０．６９をも
って 3Ｈ−スピペロン結合を阻害し、ドパミンに対し高
いおよび低いアフィニティー部位の存在を示唆した。２
種類の結合部位の存在を推測させるモデルに従ったデー
タの解析は、レセプターの４６±１５％はドパミンに対
し高いアフィニティー（ＫD ＝０．５μＭ）を有し、残
りのレセプターはアゴニスト煮対して低いアフィニティ
ー（３０μＭ）を持っていることを示した。ＧＴＰおよ
びＮａＣｌの存在下においては、ドパミンに対するＩＣ
50は、単一性（０．９３）へ近いＨｉｌｌ計数をもって
１０９±２０μＭ（ＫI ＝１７μＭ）へ２倍シフトし
た。このように、ＧＴＰ／ＮａＣｌの存在は、線条細胞
調製物中で観察されたように（６，７）、ドパミンレセ
プターを高いおよび低いアフィニティーレセプターの不
均質集団から低アフィニティーアゴニスト集団状態にあ
るレセプターの殆ど均質な集団へコンバートする。これ
らのデータは、クローン化したドパミン結合部位はＧＨ
4 細胞中に発現させる時Ｇタンパクと相互作用すること
を示唆する。
【０１１７】ｃＡＭＰおよびＰＲＬレベルに対するドパ
ミンの作用：発現したドパミン−Ｄ 2 レセプタークロー
ンの機能を直接テストするため、細胞ｃＡＭＰレベルに
対するドパミンの作用を測定した。これらのアッセイ
は、これら細胞中のフオスフオジエステラーゼ活性を阻
害するため、１００μＭ ＩＢＭＸの存在下で実施した
（２２）。このように、ｃＡＭＰレベルの観察された変
化は、ｃＡＭＰの分解の変化ではなくその合成速度の変
化を表わす。ベースｃＡＭＰレベルに対するドパミンの
作用と、そしてｃＡＭＰのＶＩＰ−増強レベルのドパミ
ン阻害が測定された。ＧＨ4 Ｃ1 細胞は、他者により記
載されたように（２２，２６）、ｃＡＭＰ蓄積の増強を
もってＶＩＰに応答する（第３７図）。ドパミンは、イ
ンキュベーションの間ＶＩＰが存在してもしなくても、
野性タイプＧＨ4 Ｃ1 細胞における細胞外ｃＡＭＰレベ
ルに対して効果を持たなかった。この結果Ｄ2 −ドパミ
ンレセプターｍＲＮＡおよびＧＨ4 Ｃ1 細胞中の結合欠
如（第３４〜３６図）と一致し、これら細胞はドパミン
がｃＡＭＰ濃度を上昇させないため検知し得るＤ2 −ド
パミンレスポンスを欠いていることを指示する。ＧＨ4
ＺＲ7 からの培地においては、ドパミンはベースｃＡＭ
Ｐレベルを阻害し（５０〜７０％）、そしてＶＩＰ−増
強ｃＡＭＰをベースレベルへ減少させた。ｃＡＭＰレベ
ルを減少させるドパミンのこれらの作用は、すべて実験
に一貫して観察され、そしてドパミンは細胞内ｃＡＭＰ
レベルの低下にも等しく有効であった（第３８図）。Ｇ
Ｈ4 Ｃ1細胞において以前観察されたように、細胞内お
よび細胞外ｃＡＭＰレベルは平行して変化するが、ｃＡ
ＭＰの低回収率のために一層著明であり得る。ｃＡＭＰ
蓄積に対するドパミンの作用は、高度に選択的なドパミ
ン−Ｄ2 アンタゴニストである（−）スルピライドによ
ってブロックされるが、非活性立体異性体（＋）スルピ
ライドはｃＡＭＰ蓄積に対するドパミン阻害をブロック
しなかった。スルピライドによる立体選択的ブロック
は、ドパミンによるＧＨ4 ＺＲ7 中のｃＡＭＰレベルの
阻害は野性タイプＧＨ4 Ｃ1 細胞中に存在しないドパミ
ン−Ｄ2 レセプターの活性化によって仲介されたことを
示した。
ミンの作用：発現したドパミン−Ｄ 2 レセプタークロー
ンの機能を直接テストするため、細胞ｃＡＭＰレベルに
対するドパミンの作用を測定した。これらのアッセイ
は、これら細胞中のフオスフオジエステラーゼ活性を阻
害するため、１００μＭ ＩＢＭＸの存在下で実施した
（２２）。このように、ｃＡＭＰレベルの観察された変
化は、ｃＡＭＰの分解の変化ではなくその合成速度の変
化を表わす。ベースｃＡＭＰレベルに対するドパミンの
作用と、そしてｃＡＭＰのＶＩＰ−増強レベルのドパミ
ン阻害が測定された。ＧＨ4 Ｃ1 細胞は、他者により記
載されたように（２２，２６）、ｃＡＭＰ蓄積の増強を
もってＶＩＰに応答する（第３７図）。ドパミンは、イ
ンキュベーションの間ＶＩＰが存在してもしなくても、
野性タイプＧＨ4 Ｃ1 細胞における細胞外ｃＡＭＰレベ
ルに対して効果を持たなかった。この結果Ｄ2 −ドパミ
ンレセプターｍＲＮＡおよびＧＨ4 Ｃ1 細胞中の結合欠
如（第３４〜３６図）と一致し、これら細胞はドパミン
がｃＡＭＰ濃度を上昇させないため検知し得るＤ2 −ド
パミンレスポンスを欠いていることを指示する。ＧＨ4
ＺＲ7 からの培地においては、ドパミンはベースｃＡＭ
Ｐレベルを阻害し（５０〜７０％）、そしてＶＩＰ−増
強ｃＡＭＰをベースレベルへ減少させた。ｃＡＭＰレベ
ルを減少させるドパミンのこれらの作用は、すべて実験
に一貫して観察され、そしてドパミンは細胞内ｃＡＭＰ
レベルの低下にも等しく有効であった（第３８図）。Ｇ
Ｈ4 Ｃ1細胞において以前観察されたように、細胞内お
よび細胞外ｃＡＭＰレベルは平行して変化するが、ｃＡ
ＭＰの低回収率のために一層著明であり得る。ｃＡＭＰ
蓄積に対するドパミンの作用は、高度に選択的なドパミ
ン−Ｄ2 アンタゴニストである（−）スルピライドによ
ってブロックされるが、非活性立体異性体（＋）スルピ
ライドはｃＡＭＰ蓄積に対するドパミン阻害をブロック
しなかった。スルピライドによる立体選択的ブロック
は、ドパミンによるＧＨ4 ＺＲ7 中のｃＡＭＰレベルの
阻害は野性タイプＧＨ4 Ｃ1 細胞中に存在しないドパミ
ン−Ｄ2 レセプターの活性化によって仲介されたことを
示した。
【０１１８】ドパミン作用の生理学的成果は分泌の阻害
であり、それはＧＨ4 ＺＲ7 細胞中の急性（３０分）Ｐ
ＲＬ放出を測定することによってアッセイされた（第３
９図）。ＶＩＰおよびＴＲＨはＰＲＬ分泌をそれぞれ
１．５倍および３倍増強した。ＶＩＰはｃＡＭＰ依存メ
カニズムによってＰＲＬ放出を増強するものと考えられ
（２２，２３，２６）、他方ＴＲＨはカルシウム代謝へ
リンクしたｃＡＭＰ非依存メカニズムによって作用する
（１９，２７）。ドパミンはベースＰＲＬ放出を阻害し
ないが、ＶＩＰおよびＴＲＨ誘発ＰＲＬ分泌の増強はド
パミンによってブロックされた。このようにドパミンは
ＧＨ4 ＺＲ7 細胞においてｃＡＭＰ依存およびｃＡＭＰ
非依存分泌をブロックした。ドパミンのこれらの作用は
（−）スルピライドによって逆転されるが、しかし
（＋）スルピライドによっては逆転されない。ＧＨ4 Ｃ
1 細胞においては、ドパミンはＰＲＬのベース、ＶＩＰ
刺激またはＴＲＨ刺激分泌に対して効果を持たなかった
（データ示さず）。
であり、それはＧＨ4 ＺＲ7 細胞中の急性（３０分）Ｐ
ＲＬ放出を測定することによってアッセイされた（第３
９図）。ＶＩＰおよびＴＲＨはＰＲＬ分泌をそれぞれ
１．５倍および３倍増強した。ＶＩＰはｃＡＭＰ依存メ
カニズムによってＰＲＬ放出を増強するものと考えられ
（２２，２３，２６）、他方ＴＲＨはカルシウム代謝へ
リンクしたｃＡＭＰ非依存メカニズムによって作用する
（１９，２７）。ドパミンはベースＰＲＬ放出を阻害し
ないが、ＶＩＰおよびＴＲＨ誘発ＰＲＬ分泌の増強はド
パミンによってブロックされた。このようにドパミンは
ＧＨ4 ＺＲ7 細胞においてｃＡＭＰ依存およびｃＡＭＰ
非依存分泌をブロックした。ドパミンのこれらの作用は
（−）スルピライドによって逆転されるが、しかし
（＋）スルピライドによっては逆転されない。ＧＨ4 Ｃ
1 細胞においては、ドパミンはＰＲＬのベース、ＶＩＰ
刺激またはＴＲＨ刺激分泌に対して効果を持たなかった
（データ示さず）。
【０１１９】生物学的応答に必要な濃度がドパミン−Ｄ
2 レセプターに対するアフィニティーと相関するかどう
かを調べるため、ｃＡＭＰレベルに対するドパミン作用
について投与量レスポンス関係を調べた（第１５図）。
ドパミンは似たｃＡＭＰレベルを強力に阻害した。さら
に、ドパミンは、それぞれ８±２ｎＭおよび６±１ｎＭ
のＥＣ50値をもって、ベースおよびＶＩＰ増強ｃＡＭＰ
蓄積を阻害した。これらのデータは、ドパミンは大体等
しい強度をもってベースおよび促進ｃＡＭＰ蓄積を阻害
することを示す。ドパミンのこれら阻害作用の高強度
は、ＧＨ4 ＺＲ7細胞が機能的ドパミン−Ｄ2 レセプタ
ーを発現するとの主張を支持する。
2 レセプターに対するアフィニティーと相関するかどう
かを調べるため、ｃＡＭＰレベルに対するドパミン作用
について投与量レスポンス関係を調べた（第１５図）。
ドパミンは似たｃＡＭＰレベルを強力に阻害した。さら
に、ドパミンは、それぞれ８±２ｎＭおよび６±１ｎＭ
のＥＣ50値をもって、ベースおよびＶＩＰ増強ｃＡＭＰ
蓄積を阻害した。これらのデータは、ドパミンは大体等
しい強度をもってベースおよび促進ｃＡＭＰ蓄積を阻害
することを示す。ドパミンのこれら阻害作用の高強度
は、ＧＨ4 ＺＲ7細胞が機能的ドパミン−Ｄ2 レセプタ
ーを発現するとの主張を支持する。
【０１２０】ＧＨ4 ＺＲ7 中のｃＡＭＰのＶＩＰ増強レ
ベルのドパミン阻害の薬理学的特異性は、特異性レセプ
ターアンタゴニストを使用してさらに検討された（第４
２図）。このデータは、ある種のレセプターアンタゴニ
ストは細胞外ｃＡＭＰのＶＩＰ増強レベルのドパミン誘
発阻害を逆転することを示す。最高ｃＡＭＰ（１００
％）はＶＩＰ単独の存在下におけるｃＡＭＰレベルに相
当した。ドパミン−Ｄ2アンタゴニスト（スピペロン，
（＋）ブタクラモール，（−）スルピライド）の低濃度
はドパミン作用をブロックしたが、特異性ドパミンアン
タゴニストであるＳＣＨ２３３９０は非常に高濃度にお
いてのみ活性であった。Ｄ2 −アンタゴニストの不活性
立体異性体（−）ブタクラモール，（＋）スルピライド
（第３９図）はドパミン作用に対し少ししかまたは全く
効果がなかった。ドパミン不存在下添加したアンタゴニ
ストはｃＡＭＰ濃度を変えなかった。アンタゴニストに
対するＩＣ50値から得た推測ＫI 値（第４２図の説明を
見よ）は、ドパミンレセプターの結合競合研究（１７）
から決定した値に似ており、ＧＨ4 ＺＲ7 細胞中ドパミ
ンによるｃＡＭＰレベルの阻害は、ドパミン−Ｄ2 レセ
プターと薬理学的に区別されるレセプターによって仲介
されることを示す。
ベルのドパミン阻害の薬理学的特異性は、特異性レセプ
ターアンタゴニストを使用してさらに検討された（第４
２図）。このデータは、ある種のレセプターアンタゴニ
ストは細胞外ｃＡＭＰのＶＩＰ増強レベルのドパミン誘
発阻害を逆転することを示す。最高ｃＡＭＰ（１００
％）はＶＩＰ単独の存在下におけるｃＡＭＰレベルに相
当した。ドパミン−Ｄ2アンタゴニスト（スピペロン，
（＋）ブタクラモール，（−）スルピライド）の低濃度
はドパミン作用をブロックしたが、特異性ドパミンアン
タゴニストであるＳＣＨ２３３９０は非常に高濃度にお
いてのみ活性であった。Ｄ2 −アンタゴニストの不活性
立体異性体（−）ブタクラモール，（＋）スルピライド
（第３９図）はドパミン作用に対し少ししかまたは全く
効果がなかった。ドパミン不存在下添加したアンタゴニ
ストはｃＡＭＰ濃度を変えなかった。アンタゴニストに
対するＩＣ50値から得た推測ＫI 値（第４２図の説明を
見よ）は、ドパミンレセプターの結合競合研究（１７）
から決定した値に似ており、ＧＨ4 ＺＲ7 細胞中ドパミ
ンによるｃＡＭＰレベルの阻害は、ドパミン−Ｄ2 レセ
プターと薬理学的に区別されるレセプターによって仲介
されることを示す。
【０１２１】アデニレートサイクラーゼの阻害：ドパミ
ンレセプターアゴニストによるアデニレートサイクラー
ゼ活性の阻害を直接評価するため、32Ｐ−ＡＴＰの32Ｐ
−ｃＡＭＰへの変換をＧＨ4 ＺＲ7 細胞から調製した膜
中で測定した（第４３図）。ドパミンは総フォルスコリ
ン（１０μＭ）刺激活性を０．３６μＭ（ｎ＝５）の平
均ＥＣ50値をもって４５％阻害した。下垂体において
（１１）そして線状（２８）膜において観察されたよう
に、ブロモクリプチンは部分的アゴニストとして行動
し、酵素活性を最高２３％阻害した（ＥＣ5 ＝６ｎ
Ｍ）。選択的Ｄ2 −アゴニストによるアデニレートサイ
クラーゼ活性の阻害は立体選択的であった。例えば、キ
ンピロールはフォルスコリン刺激サイクラーゼ活性を４
１％（ＥＣ50＝０．３２ｎＭ）阻害したが、ＬＹ１８１
９９０すなわちキンピロールの不活性（＋）エナンチオ
マーは酵素活性の一貫した減少を生じなかった。同様
に、（＋）３−ＰＰＰ（ＥＣ50＝０．８６ｎＭ）はドパ
ミンのように有効であったが、エナンチオマー（−）３
−ＰＰＰはアデニレートサイクラーゼ活性を一貫して減
少しなかった。ＶＩＰもＧＨ4 ＺＲ7 細胞膜において、
野性タイプＧＨ4 Ｃ1 細胞膜について報告されているよ
うに（２９）、アデニレートサイクラーゼ活性を刺激し
た。２００ｍＭ ＶＩＰにより刺激された総活性は２２
±７ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク／分（ｎ＝３）であり、そ
してＶＩＰ増強活性はラット前下垂体膜中５０〜５０％
阻害（１１）と比較して、ドパミン（１００μＭ）によ
って４１％阻害された。これら調製物においてベースア
デニレートサイクラーゼ活性に対するドパミンの効果は
観察されなかった。それにもかかわらず、ドパミンによ
るフォルスコリンまたはＶＩＰ刺激アデニレートサイク
ラーゼ活性の阻害は、ＧＨ4 ＺＲ7細胞におけるドパミ
ンによるｃＡＭＰ蓄積の阻害の可能性あるメカニズムを
提供する。
ンレセプターアゴニストによるアデニレートサイクラー
ゼ活性の阻害を直接評価するため、32Ｐ−ＡＴＰの32Ｐ
−ｃＡＭＰへの変換をＧＨ4 ＺＲ7 細胞から調製した膜
中で測定した（第４３図）。ドパミンは総フォルスコリ
ン（１０μＭ）刺激活性を０．３６μＭ（ｎ＝５）の平
均ＥＣ50値をもって４５％阻害した。下垂体において
（１１）そして線状（２８）膜において観察されたよう
に、ブロモクリプチンは部分的アゴニストとして行動
し、酵素活性を最高２３％阻害した（ＥＣ5 ＝６ｎ
Ｍ）。選択的Ｄ2 −アゴニストによるアデニレートサイ
クラーゼ活性の阻害は立体選択的であった。例えば、キ
ンピロールはフォルスコリン刺激サイクラーゼ活性を４
１％（ＥＣ50＝０．３２ｎＭ）阻害したが、ＬＹ１８１
９９０すなわちキンピロールの不活性（＋）エナンチオ
マーは酵素活性の一貫した減少を生じなかった。同様
に、（＋）３−ＰＰＰ（ＥＣ50＝０．８６ｎＭ）はドパ
ミンのように有効であったが、エナンチオマー（−）３
−ＰＰＰはアデニレートサイクラーゼ活性を一貫して減
少しなかった。ＶＩＰもＧＨ4 ＺＲ7 細胞膜において、
野性タイプＧＨ4 Ｃ1 細胞膜について報告されているよ
うに（２９）、アデニレートサイクラーゼ活性を刺激し
た。２００ｍＭ ＶＩＰにより刺激された総活性は２２
±７ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク／分（ｎ＝３）であり、そ
してＶＩＰ増強活性はラット前下垂体膜中５０〜５０％
阻害（１１）と比較して、ドパミン（１００μＭ）によ
って４１％阻害された。これら調製物においてベースア
デニレートサイクラーゼ活性に対するドパミンの効果は
観察されなかった。それにもかかわらず、ドパミンによ
るフォルスコリンまたはＶＩＰ刺激アデニレートサイク
ラーゼ活性の阻害は、ＧＨ4 ＺＲ7細胞におけるドパミ
ンによるｃＡＭＰ蓄積の阻害の可能性あるメカニズムを
提供する。
【０１２２】百日咳トキシン感受性：百日咳トキシンに
対する感受性は、レスポンスを誘発するように阻害Ｇタ
ンパク（例えばＧｉまたはＧｏ）へ結合する、ドパミン
−Ｄ 2 レセプター（６〜１２，１５）のようなレセプタ
ーの品質証明である。１６時間の百日咳トキシンによる
ＧＨ4 ＺＲ7 細胞の前処理（第３０図）は、フォルスコ
リン刺激膜アデニレートサイクラーゼ活性のドパミン仲
介阻害を解離し、ドパミンによるベースおよびＶＩＰ刺
激ｃＡＭＰ蓄積の阻害を破壊した。使用した百日咳トキ
シン濃度およびインキュベーション時間は野性タイプ細
胞におけるソマトスタチンレスポンスの最高ブロックを
生じ（３０）、そしてドパミンレスポンスはこれらの条
件下で殆ど完全に阻害された。対照的に、ベースおよび
ＶＩＰ刺激ｃＡＭＰ蓄積、およびベースおよびフォルス
コリン刺激サイクラーゼ活性は百日咳トキシン前処理に
よって有意に変化しなかった。これらデータは、発現さ
れたｃＤＮＡクローンはＧＨ4 細胞中に存在する阻害Ｇ
タンパクへ機能的に結合し、そのため善意のレセプター
を代表するドパミン−Ｄ2 結合部位をコードするという
主張を支持する。
対する感受性は、レスポンスを誘発するように阻害Ｇタ
ンパク（例えばＧｉまたはＧｏ）へ結合する、ドパミン
−Ｄ 2 レセプター（６〜１２，１５）のようなレセプタ
ーの品質証明である。１６時間の百日咳トキシンによる
ＧＨ4 ＺＲ7 細胞の前処理（第３０図）は、フォルスコ
リン刺激膜アデニレートサイクラーゼ活性のドパミン仲
介阻害を解離し、ドパミンによるベースおよびＶＩＰ刺
激ｃＡＭＰ蓄積の阻害を破壊した。使用した百日咳トキ
シン濃度およびインキュベーション時間は野性タイプ細
胞におけるソマトスタチンレスポンスの最高ブロックを
生じ（３０）、そしてドパミンレスポンスはこれらの条
件下で殆ど完全に阻害された。対照的に、ベースおよび
ＶＩＰ刺激ｃＡＭＰ蓄積、およびベースおよびフォルス
コリン刺激サイクラーゼ活性は百日咳トキシン前処理に
よって有意に変化しなかった。これらデータは、発現さ
れたｃＤＮＡクローンはＧＨ4 細胞中に存在する阻害Ｇ
タンパクへ機能的に結合し、そのため善意のレセプター
を代表するドパミン−Ｄ2 結合部位をコードするという
主張を支持する。
【０１２３】議論 ドパミン−Ｄ2 結合部位をコードするｃＤＮＡクローン
は、該クローンがアデニレートサイクラーゼ阻害、ｃＡ
ＭＰ蓄積、およびＰＲＬ分泌の阻害（６〜１２，１５）
へ百日咳トキシン感受性阻害Ｇタンパクによって結合さ
れる、機能的Ｄ 2 レセプターを発現するかどうかを決定
するため、ＧＨ4 Ｃ1 細胞中に発現された。ドパミン−
Ｄ2 レセプターは、ＧＨ4 ＺＲ7 トランスフェクタント
中のＤ2レセプターｍＲＮＡの存在によって証明される
ように、マウスメタロチオネインプロモーター（２０）
の制御下Ｄ2 −ｃＤＮＡ構造から特異的に発現された。
ドパミン−Ｄ2 レセプターｍＲＮＡレベルはトランスフ
ェクトしないＧＨ4 Ｃ1 細胞中、またはラット５−ＨＴ
1Aレセプターサブタイプでトランスフェクトした細胞中
において検出できなかった（第３３図）。ＧＨ4 ＺＲ7
細胞中に発見されたｍＲＮＡスペシスはラット脳中に見
られるＤ2 レセプターｍＲＮＡと大体同じ分子量であっ
た（１７）。ドパミン−Ｄ2 ｍＲＮＡのレベルはＧＨ4
ＺＲ7 細胞中１００μＭ Ｚｎ++の添加によって増加
し、ｍＲＮＡの発現はＺｎ++感受性マウスメタロチオネ
インプロモーターによって制御され、内因性遺伝子の転
写を表わさないことを指示する。 3Ｈ−スピペロン結合
の特異的結合はＧＨ4 ＺＲ7 細胞のみに存在し、１００
μＭ Ｚｎ++によって増加され、そのためこれら細胞に
おけるドパミン−Ｄ2 レセプターｍＲＮＡの発現に相関
した。Ｄ2 −レセプターｍＲＮＡはＧＨ4 ＺＲ7 細胞中
の高アフィニティードパミンＤ2 結合部位の強力な発現
が得られるように転写された。
は、該クローンがアデニレートサイクラーゼ阻害、ｃＡ
ＭＰ蓄積、およびＰＲＬ分泌の阻害（６〜１２，１５）
へ百日咳トキシン感受性阻害Ｇタンパクによって結合さ
れる、機能的Ｄ 2 レセプターを発現するかどうかを決定
するため、ＧＨ4 Ｃ1 細胞中に発現された。ドパミン−
Ｄ2 レセプターは、ＧＨ4 ＺＲ7 トランスフェクタント
中のＤ2レセプターｍＲＮＡの存在によって証明される
ように、マウスメタロチオネインプロモーター（２０）
の制御下Ｄ2 −ｃＤＮＡ構造から特異的に発現された。
ドパミン−Ｄ2 レセプターｍＲＮＡレベルはトランスフ
ェクトしないＧＨ4 Ｃ1 細胞中、またはラット５−ＨＴ
1Aレセプターサブタイプでトランスフェクトした細胞中
において検出できなかった（第３３図）。ＧＨ4 ＺＲ7
細胞中に発見されたｍＲＮＡスペシスはラット脳中に見
られるＤ2 レセプターｍＲＮＡと大体同じ分子量であっ
た（１７）。ドパミン−Ｄ2 ｍＲＮＡのレベルはＧＨ4
ＺＲ7 細胞中１００μＭ Ｚｎ++の添加によって増加
し、ｍＲＮＡの発現はＺｎ++感受性マウスメタロチオネ
インプロモーターによって制御され、内因性遺伝子の転
写を表わさないことを指示する。 3Ｈ−スピペロン結合
の特異的結合はＧＨ4 ＺＲ7 細胞のみに存在し、１００
μＭ Ｚｎ++によって増加され、そのためこれら細胞に
おけるドパミン−Ｄ2 レセプターｍＲＮＡの発現に相関
した。Ｄ2 −レセプターｍＲＮＡはＧＨ4 ＺＲ7 細胞中
の高アフィニティードパミンＤ2 結合部位の強力な発現
が得られるように転写された。
【０１２４】ＧＨ4 ＺＲ7 トランスフェクタント中のド
パミン−Ｄ2 結合の存在は、ｃＡＭＰの強力な阻害およ
びＰＲＬ放出と、フォルスコリン刺激アデニレートサイ
クラーゼ活性の阻害に相関したが、ドパミンの作用はト
ランスフェクトしないＧＨ4Ｃ1 細胞に見られなかっ
た。ドパミンのこれら阻害作用は、下垂体ラクトトロフ
中のドパミンの既知の生理学的作用（１，２）と正確に
一致する。特に、ドパミンは、これらのプロセスの刺激
はドパミン濃度が低濃度へ減少しない限り発生しないよ
うに、ラクトトロフ中のＰＲＬ分泌およびｃＡＭＰ蓄積
を制御する（１，３〜５）。同様に、ドパミンの最高濃
度の存在下、ＶＩＰはＧＨ4 ＺＲ7 細胞中のｃＡＭＰレ
ベルまたはＰＲＬ分泌を増強しない（第３９図）。ＧＨ
4 ＺＲ7 細胞中のベースおよびＶＩＰ増強ｃＡＭＰ蓄積
のドパミン阻害の強度（第４０図）は、下垂体門血流中
のドパミン濃度が発情前記のメスラットにおいて７ｎＭ
から発情中２０ｎＭに変化し、そしてオスラットにおい
ては３ｎＭであること（３１）を考慮に入れ、ラクトト
ロフについて期待される濃度範囲内であった。特異性ア
ゴニストおよびアンタゴニストを使用するアデニレート
サイクラーゼおよびｃＡＭＰ蓄積のドパミン誘発阻害の
薬理の詳細な解析は、ＧＨ4 ＺＲ7 細胞中のドパミン作
用はドパミン−Ｄ2 レセプターとは区別し得るレセプタ
ーによって仲介されるとの結論と完全に一致する。
パミン−Ｄ2 結合の存在は、ｃＡＭＰの強力な阻害およ
びＰＲＬ放出と、フォルスコリン刺激アデニレートサイ
クラーゼ活性の阻害に相関したが、ドパミンの作用はト
ランスフェクトしないＧＨ4Ｃ1 細胞に見られなかっ
た。ドパミンのこれら阻害作用は、下垂体ラクトトロフ
中のドパミンの既知の生理学的作用（１，２）と正確に
一致する。特に、ドパミンは、これらのプロセスの刺激
はドパミン濃度が低濃度へ減少しない限り発生しないよ
うに、ラクトトロフ中のＰＲＬ分泌およびｃＡＭＰ蓄積
を制御する（１，３〜５）。同様に、ドパミンの最高濃
度の存在下、ＶＩＰはＧＨ4 ＺＲ7 細胞中のｃＡＭＰレ
ベルまたはＰＲＬ分泌を増強しない（第３９図）。ＧＨ
4 ＺＲ7 細胞中のベースおよびＶＩＰ増強ｃＡＭＰ蓄積
のドパミン阻害の強度（第４０図）は、下垂体門血流中
のドパミン濃度が発情前記のメスラットにおいて７ｎＭ
から発情中２０ｎＭに変化し、そしてオスラットにおい
ては３ｎＭであること（３１）を考慮に入れ、ラクトト
ロフについて期待される濃度範囲内であった。特異性ア
ゴニストおよびアンタゴニストを使用するアデニレート
サイクラーゼおよびｃＡＭＰ蓄積のドパミン誘発阻害の
薬理の詳細な解析は、ＧＨ4 ＺＲ7 細胞中のドパミン作
用はドパミン−Ｄ2 レセプターとは区別し得るレセプタ
ーによって仲介されるとの結論と完全に一致する。
【０１２５】ドパミンの測定されたアフィニティー（第
３６図）とｃＡＭＰ蓄積阻害するドパミンの強度（第３
６図）との間の食い違いは、ＧＨ4 ＺＲ7 細胞は全分の
レセプターを持っていること、すなわち生物学的作用の
ためのＥＣ50をＫD 値より低い値シフトされるのに十分
に過剰の結合部位を持っている可能性を生ずる。代りの
説明の一つは、膜調製物中のレセプターは細胞自体より
もアゴニストに対して低アフィニティーを持っている
（しかし測定したＩＣ50値はＫI ）値に相関しているか
らアンタゴニストに対するアフィニティーは不変）とい
うことである。そのままの細胞中に存在する細胞質ゾル
または膜関連成分は膜結合およびアデニレートサイクラ
ラーゼアッセイ条件では完全に置換されないから、膜調
製物中のドパミンレセプターの最適機能を許容する成分
が欠けている可能性がある。この主張はドパミンによる
粒状アデニレートサイクラーゼの阻害に対するＥＤ
50値、すなわち結合競合実験からドパミンに対して得ら
れたＫI 値（５００ｎＭ）に近い値と、しかしそのまま
の細胞においてドパミンによるｃＡＭＰレベルの阻害に
対して得られた１００倍高いＥＣ50値（６〜８ｎＭ）に
よって支持される。この条件の差はそのままの細胞対細
胞調製物間のアッセイに見られた差を説明し得る。しか
しながら、アンタゴニストのアフィニティーはｃＡＭＰ
蓄積実験から得られた推定ＫI 値（第４２図）と良く相
関し、アンタゴニスト結合は膜および全細胞において同
様であることを指示した。
３６図）とｃＡＭＰ蓄積阻害するドパミンの強度（第３
６図）との間の食い違いは、ＧＨ4 ＺＲ7 細胞は全分の
レセプターを持っていること、すなわち生物学的作用の
ためのＥＣ50をＫD 値より低い値シフトされるのに十分
に過剰の結合部位を持っている可能性を生ずる。代りの
説明の一つは、膜調製物中のレセプターは細胞自体より
もアゴニストに対して低アフィニティーを持っている
（しかし測定したＩＣ50値はＫI ）値に相関しているか
らアンタゴニストに対するアフィニティーは不変）とい
うことである。そのままの細胞中に存在する細胞質ゾル
または膜関連成分は膜結合およびアデニレートサイクラ
ラーゼアッセイ条件では完全に置換されないから、膜調
製物中のドパミンレセプターの最適機能を許容する成分
が欠けている可能性がある。この主張はドパミンによる
粒状アデニレートサイクラーゼの阻害に対するＥＤ
50値、すなわち結合競合実験からドパミンに対して得ら
れたＫI 値（５００ｎＭ）に近い値と、しかしそのまま
の細胞においてドパミンによるｃＡＭＰレベルの阻害に
対して得られた１００倍高いＥＣ50値（６〜８ｎＭ）に
よって支持される。この条件の差はそのままの細胞対細
胞調製物間のアッセイに見られた差を説明し得る。しか
しながら、アンタゴニストのアフィニティーはｃＡＭＰ
蓄積実験から得られた推定ＫI 値（第４２図）と良く相
関し、アンタゴニスト結合は膜および全細胞において同
様であることを指示した。
【０１２６】発現されたドパミン−Ｄ2 結合部位のＧタ
ンパクへの結合の別の証拠は、ＧＴＰの存在下ドパミン
結合アフィニティーの低アフィニティーへのシフトであ
る。このようなアフィニティーのＧＴＰ誘発シフトはラ
ット脳からの膜におけるドパミン結合について報告され
ており（６，７）、そしてレセプターとＧタンパクとの
相互作用のためである（８，９）。ＧＴＰの存在下、Ｇ
タンパクはレセプターから解離し、レセプターを低アフ
ィニティーアゴニスト状態に置く（６，７）。ドパミン
の場合、この二つの状態間のアフィニティーの差は小さ
く、そのため低アフィニティー状態へのＧＴＰ誘発シフ
トは小さく（２倍）、そしてＧタンパクの解離を最大に
するためＮａ+ イオンの存在を必要とする（２８）。ド
パミンアフィニティーにおけるＧＴＰ−誘発シフトの観
察は、発現されたレセプターはＧＨ4 ＺＲ7 細胞中の一
種以上のＧタンパクと関連していることを示唆する。
ンパクへの結合の別の証拠は、ＧＴＰの存在下ドパミン
結合アフィニティーの低アフィニティーへのシフトであ
る。このようなアフィニティーのＧＴＰ誘発シフトはラ
ット脳からの膜におけるドパミン結合について報告され
ており（６，７）、そしてレセプターとＧタンパクとの
相互作用のためである（８，９）。ＧＴＰの存在下、Ｇ
タンパクはレセプターから解離し、レセプターを低アフ
ィニティーアゴニスト状態に置く（６，７）。ドパミン
の場合、この二つの状態間のアフィニティーの差は小さ
く、そのため低アフィニティー状態へのＧＴＰ誘発シフ
トは小さく（２倍）、そしてＧタンパクの解離を最大に
するためＮａ+ イオンの存在を必要とする（２８）。ド
パミンアフィニティーにおけるＧＴＰ−誘発シフトの観
察は、発現されたレセプターはＧＨ4 ＺＲ7 細胞中の一
種以上のＧタンパクと関連していることを示唆する。
【０１２７】ドパミンの阻害作用は、レセプターが阻害
Ｇタンパクへ結合することを指示するが、これは阻害Ｇ
タンパクを不活性化するようにＧＨ4 ＺＲ7 細胞を百日
咳トキシンで前処理することによって一層直接的にテス
トされた（３０）。百日咳トキシン前処理は、ベースま
たはＶＩＰ誘発ｃＡＭＰ蓄積を変えることなく、ドパミ
ン作用を完全にブロックした。このように、百日咳トキ
シンは、多分ドパミン−Ｄ2 レセプターを阻害Ｇタンパ
クから解離することにより、生物学的レスポンスのドパ
ミン増強形質導入を阻止した。他の系（３２）と異なっ
て、しかし野性タイプＧＨ4 Ｃ1 細胞（３０）と同様
に、スチミュレーター（例えばＶＩＰ）によるｃＡＭＰ
レベルの増強は百日咳トキシン処理ＧＨ4 ＺＲ7 細胞に
おいては増強されないし、ベースｃＡＭＰレベルも百日
咳トキシンによって変化しなかった。これはＧＨ4 ＺＲ
7 細胞中に存在する阻害ＧタンパクはｃＡＭＰ生産を強
くするように阻害しないことを示唆する。
Ｇタンパクへ結合することを指示するが、これは阻害Ｇ
タンパクを不活性化するようにＧＨ4 ＺＲ7 細胞を百日
咳トキシンで前処理することによって一層直接的にテス
トされた（３０）。百日咳トキシン前処理は、ベースま
たはＶＩＰ誘発ｃＡＭＰ蓄積を変えることなく、ドパミ
ン作用を完全にブロックした。このように、百日咳トキ
シンは、多分ドパミン−Ｄ2 レセプターを阻害Ｇタンパ
クから解離することにより、生物学的レスポンスのドパ
ミン増強形質導入を阻止した。他の系（３２）と異なっ
て、しかし野性タイプＧＨ4 Ｃ1 細胞（３０）と同様
に、スチミュレーター（例えばＶＩＰ）によるｃＡＭＰ
レベルの増強は百日咳トキシン処理ＧＨ4 ＺＲ7 細胞に
おいては増強されないし、ベースｃＡＭＰレベルも百日
咳トキシンによって変化しなかった。これはＧＨ4 ＺＲ
7 細胞中に存在する阻害ＧタンパクはｃＡＭＰ生産を強
くするように阻害しないことを示唆する。
【０１２８】ＧＨ4 Ｃ1 細胞上のソマトスタチンレセプ
ターの存在は、ソマトスタチンとドパミンの阻害作用の
直接比較を許容する。ドパミンと同様に、ソマトスタチ
ンはベースアデニレートサイクラーゼ活性（２９）また
はベースＰＲＬ分泌（３０）を阻害しない。ＧＨ4 Ｃ1
細胞におけるＶＩＰ刺激サイクラーゼ活性（２９）、Ｖ
ＩＰ増強ｃＡＭＰ蓄積（２２）、およびＰＲＬ分泌（２
３，３０）のソマトスタチン誘発阻害は、すべてＧＨ4
ＺＲ7 細胞においてドパミンによって誘発された最大阻
害の約半分であった。ドパミンの大きな効果はＤ2 レセ
プターの過剰数の存在のためではなかった。これはｃＡ
ＭＰ蓄積およびＰＲＬ分泌実験の条件下でのレセプター
数は、ＧＨ4 Ｃ1 細胞中のソマトスタチンレセプター数
（１３，０００部位／細胞）（３３）より少ない１０，
０００部位／細胞以下であったからである。
ターの存在は、ソマトスタチンとドパミンの阻害作用の
直接比較を許容する。ドパミンと同様に、ソマトスタチ
ンはベースアデニレートサイクラーゼ活性（２９）また
はベースＰＲＬ分泌（３０）を阻害しない。ＧＨ4 Ｃ1
細胞におけるＶＩＰ刺激サイクラーゼ活性（２９）、Ｖ
ＩＰ増強ｃＡＭＰ蓄積（２２）、およびＰＲＬ分泌（２
３，３０）のソマトスタチン誘発阻害は、すべてＧＨ4
ＺＲ7 細胞においてドパミンによって誘発された最大阻
害の約半分であった。ドパミンの大きな効果はＤ2 レセ
プターの過剰数の存在のためではなかった。これはｃＡ
ＭＰ蓄積およびＰＲＬ分泌実験の条件下でのレセプター
数は、ＧＨ4 Ｃ1 細胞中のソマトスタチンレセプター数
（１３，０００部位／細胞）（３３）より少ない１０，
０００部位／細胞以下であったからである。
【０１２９】これら細胞に発現されたドパミンレセプタ
ーは形質導入阻害作用においてソマトスタチンよりも有
効であることが明らかであり、ＧＨ細胞に存在するＧタ
ンパクに対するドパミンレセプターの一層効果的な結合
を示唆する。
ーは形質導入阻害作用においてソマトスタチンよりも有
効であることが明らかであり、ＧＨ細胞に存在するＧタ
ンパクに対するドパミンレセプターの一層効果的な結合
を示唆する。
【０１３０】ＧＨ4 Ｃ1 細胞におけるドパミン−Ｄ2 レ
セプターｃＤＮＡの発現の第２の理由は、ドパミン作用
およびＤ2 レセプターメカニズムを研究する新しいモデ
ルを確立することである。今日までドパミンＤ2 レセプ
ターを発現する最も入手し易い細胞系であるラットラク
トトロフ中のドパミン作用の現在の研究は、ドパミン阻
害のメカニズムについて多岐の結論へ導いた。ノイロン
において、ドパミンはＤ2 レセプターが阻害Ｇタンパク
へ結合することによって仲介される作用である（１
５）、カリウムチャンネルを開くこと（３５）による膜
電位を高分極する（３４）。ラクトトロフにおけるドパ
ミンによって誘発された膜高分極（３６）はカルシウム
チャンネルを閉じ、ベースカルシウム流入束を減らし、
ドパミンによって誘発されたベース〔Ｃａ++〕の観察さ
れた低下（１３〜１５，３７，３８）を説明するであろ
う。しかしながら、ドパミンはある種の下垂体細胞にお
いて〔Ｃａ++〕を増加することが観察されている（３
７）。ＧＨ4 ＺＲ7 細胞中の〔Ｃａ++〕のドパミン誘発
変化を検討することにより、Ｄ2 レセプターが〔Ｃ
ａ++〕の変化に特異的に関連し、そしてホルモン分泌の
ドパミン阻害の仲介において〔Ｃａ++〕の役割を確かめ
ることが可能になるであろう。他の解決されない論争の
一つは、ドパミンが分泌の増強を阻止し、そしてＴＲＨ
のようなカルシウム移動ホルモンによって阻害するメカ
ニズムである。あるものはフォスファチジルイノシトー
ル代謝（３９，４０）および〔Ｃａ++〕（１３，１４）
のＴＲＨ誘発増強のドパミンによる阻害を報告し、他の
ものは変化を認めていない（３８，４１）。ＧＨ4 ＺＲ
7 細胞においてドパミンによるＴＲＨ誘発ＰＲＬ放出の
認められた阻害は、ドパミンはＴＲＨ誘発カルシウム移
動またはフォスファチジルイノシトール代謝を変えるブ
ロセス（例えばカリウムチャンネルの開口）へＧタンパ
クによって結合されることができることを示唆する。Ｇ
Ｈ4 ＺＲ7 細胞は、ドパミン−Ｄ2 レセプターのメカニ
ズムに関するこれらおよび他の疑問を研究するための均
質な、豊富なそして高度に応答性の調製物を提供するで
あろう。
セプターｃＤＮＡの発現の第２の理由は、ドパミン作用
およびＤ2 レセプターメカニズムを研究する新しいモデ
ルを確立することである。今日までドパミンＤ2 レセプ
ターを発現する最も入手し易い細胞系であるラットラク
トトロフ中のドパミン作用の現在の研究は、ドパミン阻
害のメカニズムについて多岐の結論へ導いた。ノイロン
において、ドパミンはＤ2 レセプターが阻害Ｇタンパク
へ結合することによって仲介される作用である（１
５）、カリウムチャンネルを開くこと（３５）による膜
電位を高分極する（３４）。ラクトトロフにおけるドパ
ミンによって誘発された膜高分極（３６）はカルシウム
チャンネルを閉じ、ベースカルシウム流入束を減らし、
ドパミンによって誘発されたベース〔Ｃａ++〕の観察さ
れた低下（１３〜１５，３７，３８）を説明するであろ
う。しかしながら、ドパミンはある種の下垂体細胞にお
いて〔Ｃａ++〕を増加することが観察されている（３
７）。ＧＨ4 ＺＲ7 細胞中の〔Ｃａ++〕のドパミン誘発
変化を検討することにより、Ｄ2 レセプターが〔Ｃ
ａ++〕の変化に特異的に関連し、そしてホルモン分泌の
ドパミン阻害の仲介において〔Ｃａ++〕の役割を確かめ
ることが可能になるであろう。他の解決されない論争の
一つは、ドパミンが分泌の増強を阻止し、そしてＴＲＨ
のようなカルシウム移動ホルモンによって阻害するメカ
ニズムである。あるものはフォスファチジルイノシトー
ル代謝（３９，４０）および〔Ｃａ++〕（１３，１４）
のＴＲＨ誘発増強のドパミンによる阻害を報告し、他の
ものは変化を認めていない（３８，４１）。ＧＨ4 ＺＲ
7 細胞においてドパミンによるＴＲＨ誘発ＰＲＬ放出の
認められた阻害は、ドパミンはＴＲＨ誘発カルシウム移
動またはフォスファチジルイノシトール代謝を変えるブ
ロセス（例えばカリウムチャンネルの開口）へＧタンパ
クによって結合されることができることを示唆する。Ｇ
Ｈ4 ＺＲ7 細胞は、ドパミン−Ｄ2 レセプターのメカニ
ズムに関するこれらおよび他の疑問を研究するための均
質な、豊富なそして高度に応答性の調製物を提供するで
あろう。
【０１３１】この報告に提供されたデータは、発現され
たクローン（１７）は、ＰＲＬ分泌、ｃＡＭＰ生産、お
よびアデニレートサイクラーゼ活性を含む検討されたす
べての作用において、ドパミン−Ｄ2 レセプターの薬理
を持っていることを指示する。Ｄ2 クローン、１）ドパ
ミン−Ｄ2 結合部位のためのｃＤＮＡクローンはＧタン
パク結合レセプターの原型構造を有する；２）該クロー
ンは飽和し得るそして特異性結合性質を持ったタンパク
を発現する；３）発現された結合部位に対するアゴニス
ト結合アフィニティーはＧＴＰの存在下減少する；４）
発現されたレセプターはＧタンパクによって規制される
ことが既知の機能（例えばアデニレートサイクラーゼの
阻害）へ結合される；５）Ｇタンパクを解離する剤（例
えば百日咳トキシン）は適当するレスポンスの発生から
発現されたレセプターの活性化を解離する；との機能的
Ｇタンパク結合レセプターとしての分類のための五つの
基本的基準を満たす。結論として、クローン化したドパ
ミン−Ｄ2 レセプターとＧタンパクとの相互作用は生産
的であり、αi またはαo サブユニットへ導びき、そし
てｃＡＭＰ依存性およびｃＡＭＰ非依存性メカニズムに
よるｃＡＭＰおよびＰＲＬレベルの阻害へ導びく。
たクローン（１７）は、ＰＲＬ分泌、ｃＡＭＰ生産、お
よびアデニレートサイクラーゼ活性を含む検討されたす
べての作用において、ドパミン−Ｄ2 レセプターの薬理
を持っていることを指示する。Ｄ2 クローン、１）ドパ
ミン−Ｄ2 結合部位のためのｃＤＮＡクローンはＧタン
パク結合レセプターの原型構造を有する；２）該クロー
ンは飽和し得るそして特異性結合性質を持ったタンパク
を発現する；３）発現された結合部位に対するアゴニス
ト結合アフィニティーはＧＴＰの存在下減少する；４）
発現されたレセプターはＧタンパクによって規制される
ことが既知の機能（例えばアデニレートサイクラーゼの
阻害）へ結合される；５）Ｇタンパクを解離する剤（例
えば百日咳トキシン）は適当するレスポンスの発生から
発現されたレセプターの活性化を解離する；との機能的
Ｇタンパク結合レセプターとしての分類のための五つの
基本的基準を満たす。結論として、クローン化したドパ
ミン−Ｄ2 レセプターとＧタンパクとの相互作用は生産
的であり、αi またはαo サブユニットへ導びき、そし
てｃＡＭＰ依存性およびｃＡＭＰ非依存性メカニズムに
よるｃＡＭＰおよびＰＲＬレベルの阻害へ導びく。
【０１３２】
【表７】
【０１３３】
【表８】
【０１３４】
【表９】
【０１３５】脚注 １ 使用した略語は以下のとおり。ＰＲＬ，プロラクチ
ン；ＧＨ，成長ホルモン；〔Ｃａ++〕，細胞質ゾル不含
カルシウム濃度；ＶＩＰ，血管活性腸ペプチド；ＴＲ
Ｈ，タイロトロピン放出ホルモン；ＩＢＭＸ，３−イソ
ブチル−１−メチルキサンチン；ＫD ，平衡解離定数；
ＥＣ50（ＩＣ50），５０％最大効果（阻害）を誘発する
のに必要な濃度。 ２ これらの結果は一部第７１回Ａｎｎｕａｌ Ｅｎｄ
ｏｃｒｉｎｅ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ
において発表。抄録＃１２７８ ３ Ａｌｂｅｒｔ，Ｐ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，投稿準備中
ン；ＧＨ，成長ホルモン；〔Ｃａ++〕，細胞質ゾル不含
カルシウム濃度；ＶＩＰ，血管活性腸ペプチド；ＴＲ
Ｈ，タイロトロピン放出ホルモン；ＩＢＭＸ，３−イソ
ブチル−１−メチルキサンチン；ＫD ，平衡解離定数；
ＥＣ50（ＩＣ50），５０％最大効果（阻害）を誘発する
のに必要な濃度。 ２ これらの結果は一部第７１回Ａｎｎｕａｌ Ｅｎｄ
ｏｃｒｉｎｅ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ
において発表。抄録＃１２７８ ３ Ａｌｂｅｒｔ，Ｐ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，投稿準備中
【０１３６】実施例３要約 ヒトドパミンＤ2 レセプターをコードするクローンを下
垂体ｃＤＡＮライブラリーから単離し、配列化した。推
論されたタンパク配列は、一つの主な差をもってクロー
ン化したラットレセプター〔Ｂｕｎｚｏｗ ｅｔ ａ
ｌ．（１９８８），Ｎａｔｕｒｅ ３３６，７８３−７
８７〕と９６％同じである。ヒトレセプターはその推定
３番目細胞質ループ中に追加の２９個のアミノ酸を含ん
でいる。サウザン班は１種だけのヒトドパミンＤ2 レセ
プター遺伝子の存在を示した。この遺伝子を含む２種の
重複するファージが単離され、特徴化された。これらク
ローンのＤＮＡ配列分析は、コーディング配列は６個の
イントロンによって中断され、そしてヒト下垂体レセプ
ター中に存在する追加のアミノ酸は８７ベースペアの単
一エキソンによってコードされることを示した。代替ス
プライシングにおけるこの配列の関与およびその生物学
的意義が論ぜられる。
垂体ｃＤＡＮライブラリーから単離し、配列化した。推
論されたタンパク配列は、一つの主な差をもってクロー
ン化したラットレセプター〔Ｂｕｎｚｏｗ ｅｔ ａ
ｌ．（１９８８），Ｎａｔｕｒｅ ３３６，７８３−７
８７〕と９６％同じである。ヒトレセプターはその推定
３番目細胞質ループ中に追加の２９個のアミノ酸を含ん
でいる。サウザン班は１種だけのヒトドパミンＤ2 レセ
プター遺伝子の存在を示した。この遺伝子を含む２種の
重複するファージが単離され、特徴化された。これらク
ローンのＤＮＡ配列分析は、コーディング配列は６個の
イントロンによって中断され、そしてヒト下垂体レセプ
ター中に存在する追加のアミノ酸は８７ベースペアの単
一エキソンによってコードされることを示した。代替ス
プライシングにおけるこの配列の関与およびその生物学
的意義が論ぜられる。
【０１３７】序説 霊長類中枢神経系中のドパミンニューロンは、運動の開
始および実行、感情安定性の推持、および下垂体機能の
調節に関与する。パーキンソン病（１）および分裂症
（２）を含むヒト神経病は、ドパミンレセプターとドパ
ミンの間のインバランスの発現であると考えられる。ド
パミンの効果を仲介するレセプターはＤ1およびＤ2 サ
ブタイプに分けられ、それらはそれらのＧタンパク結合
（３，４），リガンド特異性、解剖学的分布および生理
学的効果（５）によって区別し得る。ドパミンＤ2 レセ
プターは、プロラクチン分泌の調節（６）および抗精神
薬に対するアフィニティー（７，８）の故に特別の臨床
的関心である。
始および実行、感情安定性の推持、および下垂体機能の
調節に関与する。パーキンソン病（１）および分裂症
（２）を含むヒト神経病は、ドパミンレセプターとドパ
ミンの間のインバランスの発現であると考えられる。ド
パミンの効果を仲介するレセプターはＤ1およびＤ2 サ
ブタイプに分けられ、それらはそれらのＧタンパク結合
（３，４），リガンド特異性、解剖学的分布および生理
学的効果（５）によって区別し得る。ドパミンＤ2 レセ
プターは、プロラクチン分泌の調節（６）および抗精神
薬に対するアフィニティー（７，８）の故に特別の臨床
的関心である。
【０１３８】ドパミンＤ2 レセプターはＧタンパク結合
レセプターのファミリーに属す。このファミリーのメン
バーが占める配列類似性は、我々がラット脳ドパミンＤ
2 レセプターｃＤＮＡをクローンすることを可能にする
（９）。我々は、ここに記載するヒト下垂体ドパミンＤ
2 レセプターｃＤＮＡを単離するためのこのクローンを
使用した。これら二つのレセプターの推論されたアミノ
酸配列は一つの著しい相違点を除いて非常に似ている。
ヒトレセプターは、遺伝子のエクソンの一つによってコ
ードされるその推定３番目細胞質レープ中に追加の２９
個のアミノ酸を含んでいる。このゲノム組織は、２種の
ドパミンＤ2 レセプターｍＲＮＡの存在は代替スライシ
ングイベントの結果であることを示唆する。
レセプターのファミリーに属す。このファミリーのメン
バーが占める配列類似性は、我々がラット脳ドパミンＤ
2 レセプターｃＤＮＡをクローンすることを可能にする
（９）。我々は、ここに記載するヒト下垂体ドパミンＤ
2 レセプターｃＤＮＡを単離するためのこのクローンを
使用した。これら二つのレセプターの推論されたアミノ
酸配列は一つの著しい相違点を除いて非常に似ている。
ヒトレセプターは、遺伝子のエクソンの一つによってコ
ードされるその推定３番目細胞質レープ中に追加の２９
個のアミノ酸を含んでいる。このゲノム組織は、２種の
ドパミンＤ2 レセプターｍＲＮＡの存在は代替スライシ
ングイベントの結果であることを示唆する。
【０１３９】材料および方法 ヒト下垂体ｃＤＮＡのクローニング ヒト下垂体組織はカナダのＣｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｄｅ ｏｆ Ｍｏｎｔｒｅａｌ
のＮ．ＳｅｉｄａｈおよびＭ．Ｃｈｒｅｔｉｅｎ博士か
らの親切な贈物であった。ポリ（Ａ）ｍＲＮＡおよびｃ
ＤＮＡは以前記載された方法（９）で調製した。ｃＤＮ
Ａはアガロースゲル上でサイズ選別（１〜６ｋｂ）し、
Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ（Ｂｉｏ １０１）を使用して単離
し、ＥｃｏＲＩアダプターへリゲートし、そしてパッケ
ージ（Ｇｉｇａｐａｋ Ｇｏｌｄ）した。組換物（１．
５×１０6 ）はレプリカナイロンフィルター（デュポン
プラック／コロニーハイブリダイゼーションフィルタ
ー）上で〔32Ｐ〕標識ハイブリダイゼーションプローブ
でスクリーンされた。前ハイブリダイゼーションおよび
ハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアミド、１％
ＳＤＳ，２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣ
ｌ／０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム，ｐＨ７）中３
７℃で実施された。ＤＮＡの両方のストランドの完全な
配列は、合成オリゴヌクレオチドをプライムしたシーケ
ナーゼ（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いてＭ
１３ｍｐ１９中で決定された。
ａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｄｅ ｏｆ Ｍｏｎｔｒｅａｌ
のＮ．ＳｅｉｄａｈおよびＭ．Ｃｈｒｅｔｉｅｎ博士か
らの親切な贈物であった。ポリ（Ａ）ｍＲＮＡおよびｃ
ＤＮＡは以前記載された方法（９）で調製した。ｃＤＮ
Ａはアガロースゲル上でサイズ選別（１〜６ｋｂ）し、
Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ（Ｂｉｏ １０１）を使用して単離
し、ＥｃｏＲＩアダプターへリゲートし、そしてパッケ
ージ（Ｇｉｇａｐａｋ Ｇｏｌｄ）した。組換物（１．
５×１０6 ）はレプリカナイロンフィルター（デュポン
プラック／コロニーハイブリダイゼーションフィルタ
ー）上で〔32Ｐ〕標識ハイブリダイゼーションプローブ
でスクリーンされた。前ハイブリダイゼーションおよび
ハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアミド、１％
ＳＤＳ，２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣ
ｌ／０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム，ｐＨ７）中３
７℃で実施された。ＤＮＡの両方のストランドの完全な
配列は、合成オリゴヌクレオチドをプライムしたシーケ
ナーゼ（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いてＭ
１３ｍｐ１９中で決定された。
【０１４０】発現および薬理 ２．５ｋｂヒト下垂体とｃＤＮＡ（ｈＰｉｔＤ2 ）はｐ
Ｚｅｍ3 （Ｄｒ．Ｅ．Ｍｕｌｖｉｈｉｌｌ，Ｚｙｍｏｇ
ｅｎｅｔｉｃｓからの贈物）へクローンされ、ＣａＰＯ
4 沈澱によってマウスＬｔＫ- 中へｐＲＳＶｎｅｏと共
に同時トランスフェクトされた。安定なトランスフェク
タントが選ばれ、Ｇ４１８（ゲネチシン硫酸塩，Ｇｉｂ
ｃｏ）の７５０μｇ／ｍｌ中に保持された。膜収穫２０
時間前に、これら細胞は７０μＭ硫酸亜鉛とインキュベ
ートされた。膜はＬ−ＨＰｉＤ2Ｚｉｍから、クローン
したラットドパミンＤ2 レセプターを発現するＬｔＫ-
細胞ライン（Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１）から、そして新
たに分離したラット線条体（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒ
ｍ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）から、
以前記載された（１１，１２）ように調製された。結合
アッセイのため、膜タンパクはＬ−ｈＰｉｔＤ2 Ｚｅｍ
からは１０〜１５μｇにおいて、Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−
１からは５０〜７５μｇにおいて、ラット線条体からは
２２０〜２５０μｇにおいて使用された。結合アッセイ
は、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ，１２０ｍＭ ＮａＣｌ，
５ｍＭ ＫＣｌ，２ｍＭ ＣａＣｌ2 ，１ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2 ，ｐＨ７．４中３７℃で６０分インキュベートさ
れ、そしてガラスフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ
ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｎｏ．３２）上の急速濾過に
よって停止された。フィルターは０．５％ポリエチレン
イミン中に事前浸漬した。フィルターは氷冷５０ｍＭト
リス−ＨＣｌ，ｐＨ７．４中で２回洗った。飽和曲線は
高度にＤ2 特異性アンタゴニスト〔 3Ｈ〕ドムペリドン
（１３）の上昇する濃度を使用して発生させた。アンタ
ゴニスト薬物はそれらの特異性結合〔 3Ｈ〕ドムペリド
ン（１ｎＭ）を阻害するそれらの能力について評価し
た。Ｂｍａｘ，Ｋｄ，およびＩＣ50値は以前記載された
方法（１４）のように決定した。
Ｚｅｍ3 （Ｄｒ．Ｅ．Ｍｕｌｖｉｈｉｌｌ，Ｚｙｍｏｇ
ｅｎｅｔｉｃｓからの贈物）へクローンされ、ＣａＰＯ
4 沈澱によってマウスＬｔＫ- 中へｐＲＳＶｎｅｏと共
に同時トランスフェクトされた。安定なトランスフェク
タントが選ばれ、Ｇ４１８（ゲネチシン硫酸塩，Ｇｉｂ
ｃｏ）の７５０μｇ／ｍｌ中に保持された。膜収穫２０
時間前に、これら細胞は７０μＭ硫酸亜鉛とインキュベ
ートされた。膜はＬ−ＨＰｉＤ2Ｚｉｍから、クローン
したラットドパミンＤ2 レセプターを発現するＬｔＫ-
細胞ライン（Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１）から、そして新
たに分離したラット線条体（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒ
ｍ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）から、
以前記載された（１１，１２）ように調製された。結合
アッセイのため、膜タンパクはＬ−ｈＰｉｔＤ2 Ｚｅｍ
からは１０〜１５μｇにおいて、Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−
１からは５０〜７５μｇにおいて、ラット線条体からは
２２０〜２５０μｇにおいて使用された。結合アッセイ
は、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ，１２０ｍＭ ＮａＣｌ，
５ｍＭ ＫＣｌ，２ｍＭ ＣａＣｌ2 ，１ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2 ，ｐＨ７．４中３７℃で６０分インキュベートさ
れ、そしてガラスフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ
ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｎｏ．３２）上の急速濾過に
よって停止された。フィルターは０．５％ポリエチレン
イミン中に事前浸漬した。フィルターは氷冷５０ｍＭト
リス−ＨＣｌ，ｐＨ７．４中で２回洗った。飽和曲線は
高度にＤ2 特異性アンタゴニスト〔 3Ｈ〕ドムペリドン
（１３）の上昇する濃度を使用して発生させた。アンタ
ゴニスト薬物はそれらの特異性結合〔 3Ｈ〕ドムペリド
ン（１ｎＭ）を阻害するそれらの能力について評価し
た。Ｂｍａｘ，Ｋｄ，およびＩＣ50値は以前記載された
方法（１４）のように決定した。
【０１４１】サウザンブロッティング 正常男性ドナーから調製したヒトゲノムＤＮＡはＭ．Ｌ
ｉｔｔからの贈物であった。ＤＮＡ ３μｇを制限酵素
で消化し、フラグメントを０．７％アガロース中で電気
泳動し、ニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｉｃｈ
ｅｒ ａｎｄＳｃｈｕｅｌｌ）上へブロットした。前ハ
イブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション
は、以前記載されたように（１５）５０％ホルムアミド
中３７℃において実施された。
ｉｔｔからの贈物であった。ＤＮＡ ３μｇを制限酵素
で消化し、フラグメントを０．７％アガロース中で電気
泳動し、ニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｉｃｈ
ｅｒ ａｎｄＳｃｈｕｅｌｌ）上へブロットした。前ハ
イブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション
は、以前記載されたように（１５）５０％ホルムアミド
中３７℃において実施された。
【０１４２】ゲノム配列決定 正常ヒト男性ＤＮＡから調製したゲノムバクテリオファ
ージラムダライブラリーは、Ｓｔｒａｔｒａｇｅｎｅ
ａｎｄ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ，Ｉｎｃ．から購入し、そしてクローンしたラットド
パミンＤ2 レセプターｃＤＮＡの一部分づつでスクリー
ンした。ＤＮＡ配列はゲノム配列決定アプローチ（１
６，１７）によって決定された。要約すると、使用した
各制限酵素について、クローンしたゲノムファージＤＮ
Ａ（５０μｇ）が消化され、化学的開裂にかけられ、そ
して得られたフラグメントが変性するポリアクリルアミ
ドゲル中で分割された。次にＤＮＡはゲルから移された
ナイロンフィルター（Ｐｌａｓｃｏ Ｇｅｎｅｔｒａ
ｎ）上に固定された。〔32Ｐ〕末端標識合成オリゴマー
を使用して、配列の梯子がエクソン内に可視化され、隣
接するイントロン中に読取られた。次にフィルターは異
なるオリゴマーでプローブされるか、またはエクソンを
横断して戻る補完的配列を読取るため新しいフィルター
がつくられた。コーディング区域の両方のスタンダード
が配列決定された。
ージラムダライブラリーは、Ｓｔｒａｔｒａｇｅｎｅ
ａｎｄ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ，Ｉｎｃ．から購入し、そしてクローンしたラットド
パミンＤ2 レセプターｃＤＮＡの一部分づつでスクリー
ンした。ＤＮＡ配列はゲノム配列決定アプローチ（１
６，１７）によって決定された。要約すると、使用した
各制限酵素について、クローンしたゲノムファージＤＮ
Ａ（５０μｇ）が消化され、化学的開裂にかけられ、そ
して得られたフラグメントが変性するポリアクリルアミ
ドゲル中で分割された。次にＤＮＡはゲルから移された
ナイロンフィルター（Ｐｌａｓｃｏ Ｇｅｎｅｔｒａ
ｎ）上に固定された。〔32Ｐ〕末端標識合成オリゴマー
を使用して、配列の梯子がエクソン内に可視化され、隣
接するイントロン中に読取られた。次にフィルターは異
なるオリゴマーでプローブされるか、またはエクソンを
横断して戻る補完的配列を読取るため新しいフィルター
がつくられた。コーディング区域の両方のスタンダード
が配列決定された。
【０１４３】結果 ヒト下垂体ｃＤＮＡのクローニングおよび配列分析 プローブとしてラット脳Ｄ2 レセプターｃＤＮＡを使用
し、ヒト下垂体ライブラリーから３種の部分的ｃＤＮＡ
が単離され、配列決定された。これら配列に基づく２種
のオリゴヌクレオチドプローブがレセプタータンパクの
全長（第４５〜５４図）をコードする４番目のｃＤＮＡ
ｈＰｉｔＤ2 を単離するために使用された。ヒト下垂
体レセプターは７個の推定トランスメンブレン領域を含
み、そしてシグナル配列を欠いている。全体として、ヒ
トおよびラットヌクレオチド配列は９０％類似であり、
アミノ酸レベルにおいて９６％同一であることを示す。
Ｎ−結合グリコシル化、タンパクキナーゼＡフォスフォ
リル化およびパルミトイル化のためのいくつかの一致し
た配列（１８）がヒトおよびラットレセプター間に保存
される。これらタンパク間には１８個のアミノ酸の違い
（１個の欠如を含む）があり、驚くべきことにヒトレセ
プターはその推定３番目細胞ループ中追加のアミノ酸２
９個を含んでいる。
し、ヒト下垂体ライブラリーから３種の部分的ｃＤＮＡ
が単離され、配列決定された。これら配列に基づく２種
のオリゴヌクレオチドプローブがレセプタータンパクの
全長（第４５〜５４図）をコードする４番目のｃＤＮＡ
ｈＰｉｔＤ2 を単離するために使用された。ヒト下垂
体レセプターは７個の推定トランスメンブレン領域を含
み、そしてシグナル配列を欠いている。全体として、ヒ
トおよびラットヌクレオチド配列は９０％類似であり、
アミノ酸レベルにおいて９６％同一であることを示す。
Ｎ−結合グリコシル化、タンパクキナーゼＡフォスフォ
リル化およびパルミトイル化のためのいくつかの一致し
た配列（１８）がヒトおよびラットレセプター間に保存
される。これらタンパク間には１８個のアミノ酸の違い
（１個の欠如を含む）があり、驚くべきことにヒトレセ
プターはその推定３番目細胞ループ中追加のアミノ酸２
９個を含んでいる。
【０１４４】ｈＰｉｔ Ｄ 2 ｃＤＮＡの発現および薬
理学的評価 ヒト下垂体レセプターの薬理学的特徴を評価するため、
そのｃＤＮＡをｐＺｅｍ３中にサブクローンし、マウス
Ｌｔｋ- 細胞中に発現させた（Ｌ−ｈＰｉｔＤ 2 Ｚｅ
ｍ）。これら細胞から調製した膜は、４．０５±０．３
ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク（ｎ＝２）のＢｍａｘおよび
０．７４±０．１１ｎＭ（ｎ＝２）のＫｄ値をもって、
Ｄ2 選択性アンタゴニストである（１２，１３）
〔 3Ｈ〕ドムペリドンとの特異性結合を示した。このＫ
ｄ値は、マウス脳細胞膜中の公表された値０．７４ｍＭ
と良く一致している。このデータのＳｃａｔｃｈａｒｄ
プロットは直線であった。ｐＺｅｍ３のみでトランスフ
ェクトした細胞から調製した膜には検出し得る〔 3Ｈ〕
ドムペリドン結合は存在しなかった（データ示さず）。
Ｌ−ｈＰｉｔＤ2 Ｚｅｍに対する〔 3Ｈ〕ドムペリドン
結合は多数のドパミンＤ2 特異性薬物によって阻害され
た（第５４図）。それらの強さの順序は、スピペロン，
（＋）ブタクラモール，ハロペリドールおよびスルピラ
イドの順であった。セロトニン選択性アンタゴニストで
あるミアンセリンおよびＤ1 選択性アンタゴニストであ
るＳＣＨ−２３３９０は、不活性異性体（−）ブタクラ
モールと同様に、非常に高濃度においてのみドムペリド
ン結合を阻害した。これらの値は、クローンしたラット
ドパミンＤ2 レセプターｃＤＮＡでトランスフェクトし
たＬｔｋ-細胞（Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１）から、そし
てラット線条細胞からの膜について得たものに実質上同
じである（第５８図）。
理学的評価 ヒト下垂体レセプターの薬理学的特徴を評価するため、
そのｃＤＮＡをｐＺｅｍ３中にサブクローンし、マウス
Ｌｔｋ- 細胞中に発現させた（Ｌ−ｈＰｉｔＤ 2 Ｚｅ
ｍ）。これら細胞から調製した膜は、４．０５±０．３
ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク（ｎ＝２）のＢｍａｘおよび
０．７４±０．１１ｎＭ（ｎ＝２）のＫｄ値をもって、
Ｄ2 選択性アンタゴニストである（１２，１３）
〔 3Ｈ〕ドムペリドンとの特異性結合を示した。このＫ
ｄ値は、マウス脳細胞膜中の公表された値０．７４ｍＭ
と良く一致している。このデータのＳｃａｔｃｈａｒｄ
プロットは直線であった。ｐＺｅｍ３のみでトランスフ
ェクトした細胞から調製した膜には検出し得る〔 3Ｈ〕
ドムペリドン結合は存在しなかった（データ示さず）。
Ｌ−ｈＰｉｔＤ2 Ｚｅｍに対する〔 3Ｈ〕ドムペリドン
結合は多数のドパミンＤ2 特異性薬物によって阻害され
た（第５４図）。それらの強さの順序は、スピペロン，
（＋）ブタクラモール，ハロペリドールおよびスルピラ
イドの順であった。セロトニン選択性アンタゴニストで
あるミアンセリンおよびＤ1 選択性アンタゴニストであ
るＳＣＨ−２３３９０は、不活性異性体（−）ブタクラ
モールと同様に、非常に高濃度においてのみドムペリド
ン結合を阻害した。これらの値は、クローンしたラット
ドパミンＤ2 レセプターｃＤＮＡでトランスフェクトし
たＬｔｋ-細胞（Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１）から、そし
てラット線条細胞からの膜について得たものに実質上同
じである（第５８図）。
【０１４５】ヒトドパミンＤ 2 レセプター遺伝子 プローブとしてラットｃＤＮＡを一部分づつ使用し、ヒ
トゲノムライブラリーからクローンを単離した。このゲ
ノムクローン，λＨＨ２Ｇ１は、ヒトＤ2 レセプターの
最後の６４個のアミノ酸をコードする１．６ｋｂ Ｂａ
ｍＨＩフラグメントと、そして３’非コード配列の１．
２ｋｂを含んでいた。１．６ｋｂフラグメントは３種の
制限酵素を消化したヒトゲノムＤＮＡのサウザンブロッ
トをプローブするために使用された。各酵素はプローブ
へハイブリッド化された単一フラグメントを生成し（第
５６図）、多分１種だけのヒトドパミンＤ2 レセプター
遺伝子が存在することを指示する。
トゲノムライブラリーからクローンを単離した。このゲ
ノムクローン，λＨＨ２Ｇ１は、ヒトＤ2 レセプターの
最後の６４個のアミノ酸をコードする１．６ｋｂ Ｂａ
ｍＨＩフラグメントと、そして３’非コード配列の１．
２ｋｂを含んでいた。１．６ｋｂフラグメントは３種の
制限酵素を消化したヒトゲノムＤＮＡのサウザンブロッ
トをプローブするために使用された。各酵素はプローブ
へハイブリッド化された単一フラグメントを生成し（第
５６図）、多分１種だけのヒトドパミンＤ2 レセプター
遺伝子が存在することを指示する。
【０１４６】ヒトレセプタータンパクのＮ末端をコード
するゲノムクローンを単離するため、クローンしたラッ
トドパミンＤ2 レセプターｃＤＮＡからの１１８ｂｐ制
限フラグメント（アミノ酸残基１−３９に相当）が２番
目のゲノムライブラリーをスクリーンするために使用さ
れた。λＨＤ２Ｇ２が単離され、４００個のヌクレオチ
ドだけλＨＤ２Ｇ１と重複することが発見された。これ
らファージはヒトドパミンＤ2 レセプター遺伝子位置の
３４ｋｂ ＤＲＤ２をスパンし（１９）、そしてｈＰｉ
ｔＤ2 ｃＤＮＡに見られる配列と、それにポリアデニル
化シグナルの下流３．７ｋｂおよびほん訳開始部位の上
流３．７ｋｂを延びる配列を含んでいる。この遺伝子の
イントロン／エキソン構造を特徴化するため、オリゴヌ
クレオチドプローブおよび化学的開裂を採用するゲノム
配列決定アプローチが使用された（第５７図）。このレ
セプターファミリーのヒトおよびラットメンバー間のヌ
クレオチド配列の違いは約１０％（未発表所見）である
ため、我々はクローンしたラットドパミンＤ2 レセプタ
ーｃＤＮＡ中に存在するハイブリダイゼーションプロー
ブおよび制限部位に依存してゲノム配列決定を開始する
ことができた。我々の結果は、ヒトドパミンＤ2 レセプ
ター遺伝子のコーディング部分は７個のエキソンに分れ
ることを示した（第５７図）。興味あることに、エキソ
ン５は８７ｂｐ長さであり、そしてクローンしたヒト下
垂体レセプターに存在する２９個のアミノ酸配列全体を
コードすることを発見した（第４５〜５４，５７図）。
６個のイントロンの分析は、第２３図に要約するよう
に、各自ＧＴ／ＡＧ規則（２０）に一致するアクセプタ
ーおよびドナー配列を含むことを明らかにした。これら
イントロンの大体のサイズはサウザンブロティング実験
の結果に基いたものである（データ示さず）。比較する
時、ゲノムおよびｃＤＮＡ配列は二つの過渡点、一つは
９３９（遺伝子においてＴからＣ）および他は９５７
（遺伝子においてＣからＴ）において異なるだけである
ことが判明した。
するゲノムクローンを単離するため、クローンしたラッ
トドパミンＤ2 レセプターｃＤＮＡからの１１８ｂｐ制
限フラグメント（アミノ酸残基１−３９に相当）が２番
目のゲノムライブラリーをスクリーンするために使用さ
れた。λＨＤ２Ｇ２が単離され、４００個のヌクレオチ
ドだけλＨＤ２Ｇ１と重複することが発見された。これ
らファージはヒトドパミンＤ2 レセプター遺伝子位置の
３４ｋｂ ＤＲＤ２をスパンし（１９）、そしてｈＰｉ
ｔＤ2 ｃＤＮＡに見られる配列と、それにポリアデニル
化シグナルの下流３．７ｋｂおよびほん訳開始部位の上
流３．７ｋｂを延びる配列を含んでいる。この遺伝子の
イントロン／エキソン構造を特徴化するため、オリゴヌ
クレオチドプローブおよび化学的開裂を採用するゲノム
配列決定アプローチが使用された（第５７図）。このレ
セプターファミリーのヒトおよびラットメンバー間のヌ
クレオチド配列の違いは約１０％（未発表所見）である
ため、我々はクローンしたラットドパミンＤ2 レセプタ
ーｃＤＮＡ中に存在するハイブリダイゼーションプロー
ブおよび制限部位に依存してゲノム配列決定を開始する
ことができた。我々の結果は、ヒトドパミンＤ2 レセプ
ター遺伝子のコーディング部分は７個のエキソンに分れ
ることを示した（第５７図）。興味あることに、エキソ
ン５は８７ｂｐ長さであり、そしてクローンしたヒト下
垂体レセプターに存在する２９個のアミノ酸配列全体を
コードすることを発見した（第４５〜５４，５７図）。
６個のイントロンの分析は、第２３図に要約するよう
に、各自ＧＴ／ＡＧ規則（２０）に一致するアクセプタ
ーおよびドナー配列を含むことを明らかにした。これら
イントロンの大体のサイズはサウザンブロティング実験
の結果に基いたものである（データ示さず）。比較する
時、ゲノムおよびｃＤＮＡ配列は二つの過渡点、一つは
９３９（遺伝子においてＴからＣ）および他は９５７
（遺伝子においてＣからＴ）において異なるだけである
ことが判明した。
【０１４７】議論 我々のヒト下垂体Ｄ2 レセプターｃＤＮＡクローンに存
在する余分の配列についていくつかの仮説を立てること
ができる。一つの可能性は、ヒト遺伝子はラット遺伝子
が持っていない余分の８７個の塩基を含んでいることで
ある。他の一つは、ヒトおよびラットの両方は２種の異
なるドパミンＤ2 レセプターをコードする２種の異なる
遺伝子を持っていることである。最後に、単一転写の代
替スプライシングは１個のｍＲＮＡとそして８７個塩基
なしの他のものを生ずることがあり得る。この最後の仮
説の支持として、我々は多分１種だけのヒトドパミンＤ
2レセプター遺伝子ＤＲＤ２が存在すること、および８
７ｂｐ配列はその遺伝子の別のエキソン上に含まれてい
ることを示した。さらに、我々は８７ｂｐ配列を含むラ
ット脳ｃＤＮＡをクローンした（未発表結果）。この配
列はヒトｃＤＮＡに高度に類似であり、２９残基を含ん
でいるドパミンＤ2 レセプターはヒト下垂体独自のもの
でないことを確立した。
在する余分の配列についていくつかの仮説を立てること
ができる。一つの可能性は、ヒト遺伝子はラット遺伝子
が持っていない余分の８７個の塩基を含んでいることで
ある。他の一つは、ヒトおよびラットの両方は２種の異
なるドパミンＤ2 レセプターをコードする２種の異なる
遺伝子を持っていることである。最後に、単一転写の代
替スプライシングは１個のｍＲＮＡとそして８７個塩基
なしの他のものを生ずることがあり得る。この最後の仮
説の支持として、我々は多分１種だけのヒトドパミンＤ
2レセプター遺伝子ＤＲＤ２が存在すること、および８
７ｂｐ配列はその遺伝子の別のエキソン上に含まれてい
ることを示した。さらに、我々は８７ｂｐ配列を含むラ
ット脳ｃＤＮＡをクローンした（未発表結果）。この配
列はヒトｃＤＮＡに高度に類似であり、２９残基を含ん
でいるドパミンＤ2 レセプターはヒト下垂体独自のもの
でないことを確立した。
【０１４８】Ｌ−ｈＰｉｔＤ2 Ｚｅｍに発現されたヒト
ドパミンＤ2 レセプターは、ラット線条およびＬ−ＧＢ
２Ｚｅｍ−１膜と実質上同じ薬物結合プロフィルを有す
る。それ故、アミノ酸２９個は結合に影響しないから、
それらはレセプター機能の他のレベルにおいて関与し得
る。例えば、β2 −アドレナリンレセプターの３番目の
細胞質ループは適切なＧタンパク結合に必要であること
が示されている（２１）。それ故、一つの可能性は、こ
の配列はドパミンＤ2 レセプター刺激がアデニルサイク
ラーゼを阻害し、カリウムチャンネル伝導度を活性化す
るかまたはカルシウム移動を阻害するかどうかに影響し
得ること（２２）である。他の可能性の一つは、２９個
アミノ酸が後部シナプスドパミンＤ2 レセプターを前記
シナプス自己レセプターから分化すること（２３）であ
る。コンピューター検索（ＶＡＸ／Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ）は有意な同族性の他の配列を同定するの
に失敗したので、我々はこの配列はＤ2 レセプター独自
のものであると考える。
ドパミンＤ2 レセプターは、ラット線条およびＬ−ＧＢ
２Ｚｅｍ−１膜と実質上同じ薬物結合プロフィルを有す
る。それ故、アミノ酸２９個は結合に影響しないから、
それらはレセプター機能の他のレベルにおいて関与し得
る。例えば、β2 −アドレナリンレセプターの３番目の
細胞質ループは適切なＧタンパク結合に必要であること
が示されている（２１）。それ故、一つの可能性は、こ
の配列はドパミンＤ2 レセプター刺激がアデニルサイク
ラーゼを阻害し、カリウムチャンネル伝導度を活性化す
るかまたはカルシウム移動を阻害するかどうかに影響し
得ること（２２）である。他の可能性の一つは、２９個
アミノ酸が後部シナプスドパミンＤ2 レセプターを前記
シナプス自己レセプターから分化すること（２３）であ
る。コンピューター検索（ＶＡＸ／Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ）は有意な同族性の他の配列を同定するの
に失敗したので、我々はこの配列はＤ2 レセプター独自
のものであると考える。
【０１４９】ゲノムおよびｃＤＮＡ配列の比較に基い
て、ヒトドパミンＤ2 レセプター遺伝子は少なくとも７
種のエキソンに分けられる。ムスカリンレセプター遺伝
子の場合そうであることが示されたように（２４），遺
伝子の５’端に一以上の追加のエキソンが固定されずに
残っていることもあり得る。
て、ヒトドパミンＤ2 レセプター遺伝子は少なくとも７
種のエキソンに分けられる。ムスカリンレセプター遺伝
子の場合そうであることが示されたように（２４），遺
伝子の５’端に一以上の追加のエキソンが固定されずに
残っていることもあり得る。
【０１５０】イントロンによるコーディング配列の中断
はヒトドパミンＤ2 レセプター遺伝子を、オプシン遺伝
子（２５）を除いてＧタンパク結合レセプター遺伝子フ
ァミリーの大多数の他のメンバーから区別する。有意義
な観察の一つは、このヒト遺伝子中二つのイントロン
（Ｎｏ．３および５）の配置はウシおよびＤｒｏｓｏｐ
ｈｉａオプシン遺伝子（２６，２７）に保存されたイン
トロン位置に殆ど正確に対応することである。この発見
の最も簡単な解釈は、約１０億年令の遺伝子であるそれ
らの共通の祖先（２８）がこれらのイントロンを含んで
いたことである。我々の遺伝子構造の特徴化は、エキソ
ンがタンパク構造の認識し得るエレメントをコードする
証拠を提供する（２９）。そのようなイントロンはトラ
ンスメンブレンセグメントII，III ，およびIVの後に見
られ（第４５〜５４，５７図を見よ）、繰り返し構造が
これらレセプターの特徴をモチーフするとの議論が内部
重複化によって発生し得る。さらに、３番目細胞質ルー
プ内のいくつかのイントロンの存在は、ファミリーにわ
たって観察された長さの実質的変動の良い説明を提供す
る（３０）。
はヒトドパミンＤ2 レセプター遺伝子を、オプシン遺伝
子（２５）を除いてＧタンパク結合レセプター遺伝子フ
ァミリーの大多数の他のメンバーから区別する。有意義
な観察の一つは、このヒト遺伝子中二つのイントロン
（Ｎｏ．３および５）の配置はウシおよびＤｒｏｓｏｐ
ｈｉａオプシン遺伝子（２６，２７）に保存されたイン
トロン位置に殆ど正確に対応することである。この発見
の最も簡単な解釈は、約１０億年令の遺伝子であるそれ
らの共通の祖先（２８）がこれらのイントロンを含んで
いたことである。我々の遺伝子構造の特徴化は、エキソ
ンがタンパク構造の認識し得るエレメントをコードする
証拠を提供する（２９）。そのようなイントロンはトラ
ンスメンブレンセグメントII，III ，およびIVの後に見
られ（第４５〜５４，５７図を見よ）、繰り返し構造が
これらレセプターの特徴をモチーフするとの議論が内部
重複化によって発生し得る。さらに、３番目細胞質ルー
プ内のいくつかのイントロンの存在は、ファミリーにわ
たって観察された長さの実質的変動の良い説明を提供す
る（３０）。
【０１５１】構造的に別の形へ発展する代替的にスプラ
イスされたドパミンＤ2 レセプターｍＲＮＡの可能性は
興味深い。ドパミンＤ2 レセプターｍＲＮＡの一つの形
または他の形の発現は、ヒト疾病に関する含蓄を持ち得
るコントロールレベルを表わす。
イスされたドパミンＤ2 レセプターｍＲＮＡの可能性は
興味深い。ドパミンＤ2 レセプターｍＲＮＡの一つの形
または他の形の発現は、ヒト疾病に関する含蓄を持ち得
るコントロールレベルを表わす。
【０１５２】
【表１０】
【０１５３】
【表１１】
【図１】全体で、ＲＧＢ2 ｃＤＮＡのための核酸配列お
よびそれから導かれるラットＤ 2 ドパミンレセプターの
アミノ酸配列を示す図。
よびそれから導かれるラットＤ 2 ドパミンレセプターの
アミノ酸配列を示す図。
【図２】全体で、ＲＧＢ2 ｃＤＮＡのための核酸配列お
よびそれから導かれるラットＤ 2 ドパミンレセプターの
アミノ酸配列を示す図。
よびそれから導かれるラットＤ 2 ドパミンレセプターの
アミノ酸配列を示す図。
【図３】全体で、ＲＧＢ2 ｃＤＮＡのための核酸配列お
よびそれから導かれるラットＤ 2 ドパミンレセプターの
アミノ酸配列を示す図。
よびそれから導かれるラットＤ 2 ドパミンレセプターの
アミノ酸配列を示す図。
【図４】全体で、ＲＧＢ2 ｃＤＮＡのための核酸配列お
よびそれから導かれるラットＤ 2 ドパミンレセプターの
アミノ酸配列を示す図。
よびそれから導かれるラットＤ 2 ドパミンレセプターの
アミノ酸配列を示す図。
【図５】全体で、ＲＧＢ2 ｃＤＮＡのための核酸配列お
よびそれから導かれるラットＤ 2 ドパミンレセプターの
アミノ酸配列を示す図。
よびそれから導かれるラットＤ 2 ドパミンレセプターの
アミノ酸配列を示す図。
【図６】全体で、ＲＧＢ2 ｃＤＮＡのための核酸配列お
よびそれから導かれるラットＤ 2 ドパミンレセプターの
アミノ酸配列を示す図。
よびそれから導かれるラットＤ 2 ドパミンレセプターの
アミノ酸配列を示す図。
【図７】全体で、ＲＧＢ2 ｃＤＮＡのための核酸配列お
よびそれから導かれるラットＤ 2 ドパミンレセプターの
アミノ酸配列を示す図。
よびそれから導かれるラットＤ 2 ドパミンレセプターの
アミノ酸配列を示す図。
【図８】ラットＤ2 ドパミンレセプター、ハムスターＢ
2 アドレナリンレセプター、ヒトα2 −アドレナリンレ
セプター、ブタムスカリンＭレセプターおよびウシサブ
スタンスＫレセプターのアミノ酸配列を示す図。
2 アドレナリンレセプター、ヒトα2 −アドレナリンレ
セプター、ブタムスカリンＭレセプターおよびウシサブ
スタンスＫレセプターのアミノ酸配列を示す図。
【図９】ラットの脳および下垂体ＲＧＢ−２トランスク
リプトのノーザンブロット分析図。
リプトのノーザンブロット分析図。
【図１０】Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１細胞およびラット線
条体から調製した膜に対する 3Ｈ−スピペロンの特異的
結合の飽和等温線。
条体から調製した膜に対する 3Ｈ−スピペロンの特異的
結合の飽和等温線。
【図１１】図１０のデータのスカッチャード変換図。
【図１２】Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１膜を用いた競合曲
線。
線。
【図１３】Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅｍ−１およびラット線条体
についてのＫｉ値の表。
についてのＫｉ値の表。
【図１４】図１〜７に示したアミノ酸配列の疎水性プロ
ット。
ット。
【図１５】β2 −アドレナリンレセプターアミノ酸配列
の疎水性プロット。
の疎水性プロット。
【図１６】全体で図１〜７に示した核酸配列の２４７７
塩基ＥｃｏＲＩフラグメントの計算された制限マップ。
塩基ＥｃｏＲＩフラグメントの計算された制限マップ。
【図１７】全体で図１〜７に示した核酸配列の２４７７
塩基ＥｃｏＲＩフラグメントの計算された制限マップ。
塩基ＥｃｏＲＩフラグメントの計算された制限マップ。
【図１８】全体で図１〜７に示した核酸配列の２４７７
塩基ＥｃｏＲＩフラグメントの計算された制限マップ。
塩基ＥｃｏＲＩフラグメントの計算された制限マップ。
【図１９】全体で図１〜７に示した核酸配列の２４７７
塩基ＥｃｏＲＩフラグメントの計算された制限マップ。
塩基ＥｃｏＲＩフラグメントの計算された制限マップ。
【図２０】全体で図１〜７に示した核酸配列の２４７７
塩基ＥｃｏＲＩフラグメントの計算された制限マップ。
塩基ＥｃｏＲＩフラグメントの計算された制限マップ。
【図２１】全体でヒトＤ2 ドパミンレセプターの部分的
配列。
配列。
【図２２】全体でヒトＤ2 ドパミンレセプターの部分的
配列。
配列。
【図２３】全体でヒトＤ2 ドパミンレセプターの部分的
配列。
配列。
【図２４】ＬＺＲ１およびＬＺＲ２に対する特異的〔 3
Ｈ〕スピペロン結合の飽和分析。
Ｈ〕スピペロン結合の飽和分析。
【図２５】アゴニストによる〔 3Ｈ〕スピペロン結合阻
害曲線のグラフ。
害曲線のグラフ。
【図２６】ＤＡによる〔 3Ｈ〕スピロペリドール結合阻
害に対するＧＴＰおよびＮａＣｌの効果を示すグラフ。
害に対するＧＴＰおよびＮａＣｌの効果を示すグラフ。
【図２７】ＬＺＲ１細胞におけるアデニレートサイクラ
ーゼの阻害を示すグラフ。
ーゼの阻害を示すグラフ。
【図２８】ＬＺＲ１細胞におけるアデニレートサイクラ
ーゼの阻害を示すグラフ。
ーゼの阻害を示すグラフ。
【図２９】ＤＡ感受性アデニレートサイクラーゼの阻害
を示すグラフ。
を示すグラフ。
【図３０】百日咳トキシン前処理によるトパミン阻害の
逆転を示す表。
逆転を示す表。
【図３１】百日咳トキシン前処理によるトパミン阻害の
逆転を示す表。
逆転を示す表。
【図３２】百日咳トキシン前処理によるトパミン阻害の
逆転を示す表。
逆転を示す表。
【図３３】ＧＨ4 Ｃ1 細胞の全ＲＮＡ（２０μｇ／レー
ン）のノーザンブロット分析。
ン）のノーザンブロット分析。
【図３４】ＧＨ4 Ｃ1 細胞から調製した膜に対する 3Ｈ
−スピペロン結合の飽和曲線。
−スピペロン結合の飽和曲線。
【図３５】図３４のデータのスカッチャード法による転
換図。
換図。
【図３６】ドパミンによる特異的 3Ｈ−スピペロン結合
の移動のグラフ。
の移動のグラフ。
【図３７】ＧＨ4 ＺＲ7 細胞におけるドパミンによるｃ
ＡＭＰ蓄積およびＰＲＬ放出の阻害を示すグラフ。
ＡＭＰ蓄積およびＰＲＬ放出の阻害を示すグラフ。
【図３８】ＧＨ4 ＺＲ7 細胞におけるドパミンによるｃ
ＡＭＰ蓄積およびＰＲＬ放出の阻害を示すグラフ。
ＡＭＰ蓄積およびＰＲＬ放出の阻害を示すグラフ。
【図３９】ＧＨ4 ＺＲ7 細胞におけるドパミンによるｃ
ＡＭＰ蓄積およびＰＲＬ放出の阻害を示すグラフ。
ＡＭＰ蓄積およびＰＲＬ放出の阻害を示すグラフ。
【図４０】ＧＨ4 ＺＲ7 細胞における基準およびＶＩＰ
刺激ｃＡＭＰ蓄積のドパミンによる阻害の用量依存曲
線。
刺激ｃＡＭＰ蓄積のドパミンによる阻害の用量依存曲
線。
【図４１】ＧＨ4 ＺＲ7 細胞における基準およびＶＩＰ
刺激ｃＡＭＰ蓄積のドパミンによる阻害の用量依存曲
線。
刺激ｃＡＭＰ蓄積のドパミンによる阻害の用量依存曲
線。
【図４２】ＶＩＰ−刺激ｃＡＭＰ蓄積のドパミン誘発阻
害の特異的ブロック曲線。
害の特異的ブロック曲線。
【図４３】ドパミンＤ2 アゴニストによるアデニレート
サクラーゼの阻害を示すグラフ。
サクラーゼの阻害を示すグラフ。
【図４４】ドパミンＤ2 アゴニストによるアデニレート
サクラーゼの阻害を示すグラフ。
サクラーゼの阻害を示すグラフ。
【図４５】全体でヒト下垂体ドパミンＤ2 レセプターｃ
ＤＮＡの核酸配列およびそれから導かれるアミノ酸配列
をクローン化したラットの対応するｃＤＮＡ配列および
アミノ酸配列と対比して示す図。
ＤＮＡの核酸配列およびそれから導かれるアミノ酸配列
をクローン化したラットの対応するｃＤＮＡ配列および
アミノ酸配列と対比して示す図。
【図４６】全体でヒト下垂体ドパミンＤ2 レセプターｃ
ＤＮＡの核酸配列およびそれから導かれるアミノ酸配列
をクローン化したラットの対応するｃＤＮＡ配列および
アミノ酸配列と対比して示す図。
ＤＮＡの核酸配列およびそれから導かれるアミノ酸配列
をクローン化したラットの対応するｃＤＮＡ配列および
アミノ酸配列と対比して示す図。
【図４７】全体でヒト下垂体ドパミンＤ2 レセプターｃ
ＤＮＡの核酸配列およびそれから導かれるアミノ酸配列
をクローン化したラットの対応するｃＤＮＡ配列および
アミノ酸配列と対比して示す図。
ＤＮＡの核酸配列およびそれから導かれるアミノ酸配列
をクローン化したラットの対応するｃＤＮＡ配列および
アミノ酸配列と対比して示す図。
【図４８】全体でヒト下垂体ドパミンＤ2 レセプターｃ
ＤＮＡの核酸配列およびそれから導かれるアミノ酸配列
をクローン化したラットの対応するｃＤＮＡ配列および
アミノ酸配列と対比して示す図。
ＤＮＡの核酸配列およびそれから導かれるアミノ酸配列
をクローン化したラットの対応するｃＤＮＡ配列および
アミノ酸配列と対比して示す図。
【図４９】全体でヒト下垂体ドパミンＤ2 レセプターｃ
ＤＮＡの核酸配列およびそれから導かれるアミノ酸配列
をクローン化したラットの対応するｃＤＮＡ配列および
アミノ酸配列と対比して示す図。
ＤＮＡの核酸配列およびそれから導かれるアミノ酸配列
をクローン化したラットの対応するｃＤＮＡ配列および
アミノ酸配列と対比して示す図。
【図５０】全体でヒト下垂体ドパミンＤ2 レセプターｃ
ＤＮＡの核酸配列およびそれから導かれるアミノ酸配列
をクローン化したラットの対応するｃＤＮＡ配列および
アミノ酸配列と対比して示す図。
ＤＮＡの核酸配列およびそれから導かれるアミノ酸配列
をクローン化したラットの対応するｃＤＮＡ配列および
アミノ酸配列と対比して示す図。
【図５１】全体でヒト下垂体ドパミンＤ2 レセプターｃ
ＤＮＡの核酸配列およびそれから導かれるアミノ酸配列
をクローン化したラットの対応するｃＤＮＡ配列および
アミノ酸配列と対比して示す図。
ＤＮＡの核酸配列およびそれから導かれるアミノ酸配列
をクローン化したラットの対応するｃＤＮＡ配列および
アミノ酸配列と対比して示す図。
【図５２】全体でヒト下垂体ドパミンＤ2 レセプターｃ
ＤＮＡの核酸配列およびそれから導かれるアミノ酸配列
をクローン化したラットの対応するｃＤＮＡ配列および
アミノ酸配列と対比して示す図。
ＤＮＡの核酸配列およびそれから導かれるアミノ酸配列
をクローン化したラットの対応するｃＤＮＡ配列および
アミノ酸配列と対比して示す図。
【図５３】全体でヒト下垂体ドパミンＤ2 レセプターｃ
ＤＮＡの核酸配列およびそれから導かれるアミノ酸配列
をクローン化したラットの対応するｃＤＮＡ配列および
アミノ酸配列と対比して示す図。
ＤＮＡの核酸配列およびそれから導かれるアミノ酸配列
をクローン化したラットの対応するｃＤＮＡ配列および
アミノ酸配列と対比して示す図。
【図５４】全体でヒト下垂体ドパミンＤ2 レセプターｃ
ＤＮＡの核酸配列およびそれから導かれるアミノ酸配列
をクローン化したラットの対応するｃＤＮＡ配列および
アミノ酸配列と対比して示す図。
ＤＮＡの核酸配列およびそれから導かれるアミノ酸配列
をクローン化したラットの対応するｃＤＮＡ配列および
アミノ酸配列と対比して示す図。
【図５５】Ｌ−ｈＰｉｔＤ2 Ｚｅｍ膜への〔 3Ｈ〕ドム
ペリドン結合の競合曲線。
ペリドン結合の競合曲線。
【図５６】ヒトゲノムＤＮＡのサザンブロット図。
【図５７】ヒトドパミンレセプター遺伝子および下垂体
ｃＤＮＡの概略図。
ｃＤＮＡの概略図。
【図５８】Ｌ−ｈＰｉｔＤ２Ｚｅｍ，Ｌ−ＲＧＢ２Ｚｅ
ｍ１およびラット線条体についてのＩＣ50値（ｎＭ）の
比較表。
ｍ１およびラット線条体についてのＩＣ50値（ｎＭ）の
比較表。
【図５９】ヒトドパミンＤ2 レセプター遺伝子における
エキソン／イントロン接合を示す図。
エキソン／イントロン接合を示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 ブンゾウ，ジェームス アール アメリカ合衆国97219オレゴン、ポートラ ンド、エスダブリューフィフティーシック ススアベニュー9904 (72)発明者 グランディー，デービッド ケイ アメリカ合衆国97221オレゴン、ポートラ ンド、エスダブリューパットンロード3730 (72)発明者 マチダ，カーチス エイ アメリカ合衆国97229オレゴン、ポートラ ンド、12720
Claims (15)
- 【請求項１】図４５〜図４８および図５１〜図５２の領
域ＩないしVII から選ばれた膜横断領域をコードする、
ラットもしくはヒト起源の天然ＤＮＡ配列のＤＮＡ分子
配列へ、またはそれに対し相補的なＤＮＡ分子へ高度に
厳格な条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
を含む、核酸ハイブリダイゼーションプローブを調製す
るための試薬。 - 【請求項２】（ａ）図４５〜図４８および図５１と図５
２の領域ＩないしVII から選ばれた膜横断領域をコード
しかつラットまたはヒト起源のＤ2 ドパミンレセプター
ｃＤＮＡのヌクレオチド１１２−１８０（Ｉ），２１４
−２９１（II），３２５−３９０（III ），４５４−５
２２（IV），５５９−６３０（Ｖ），１１２０−１１９
１（VI）および１２１６−１２８７（VII ）と同一もし
くは対応する配列から選ばれた図１ないし図５または図
４５ないし図５４のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分
子、または（ｂ）該ＤＮＡ分子へ相補的なＤＮＡ分子
へ、高度に厳格な条件下でハイブリダイズするオリゴヌ
クレオチドを含む、核酸ハイブリダイゼーションプロー
ブを調製するための試薬。 - 【請求項３】検出し得る標識基で標識した請求項１また
は２の試薬を含む、核酸ハイブリダイゼーションプロー
ブ。 - 【請求項４】核酸サンプルを請求項３の核酸ハイブリダ
イゼーションプローブとハイブリダイズすることを含
む、哺乳類Ｇタンパク結合ドパミンレセプターをコード
する配列とハイブリダイズする配列の存在について核酸
サンプルをプローブする方法。 - 【請求項５】（ａ）図１ないし図５または図４５ないし
図５２に示したアミノ酸配列、 （ｂ）図４５ないし図５２に示した配列からアミノ酸残
基２４２−２７０が欠除しそしてアミノ酸残基２７１が
アスパラギン酸残基に置換された配列を有し、かつ第３
の細胞質ループを規定するアミノ酸配列を有し、そして
哺乳類Ｄ2 ドパミンレセプターの抗原決定基を規定する
アミノ酸配列を有するフラグメントである、哺乳類Ｄ2
ドパミンレセプターのフラグメント。 - 【請求項６】前記レセプターの第３の細胞質ループから
選ばれた該レセプターの抗原決定基を規定するアミノ酸
配列を有する請求項５のフラグメント。 - 【請求項７】図１ないし図５に示したアミノ酸配列のア
ミノ酸２−１３，アミノ酸１８２−１９２，アミノ酸２
６４−２７７，アミノ酸２８７−２９８およびアミノ酸
４０４−４１４からなる群から選ばれたアミノ酸配列を
有する請求項５のフラグメント。 - 【請求項８】図１ないし図５に示したアミノ酸配列のア
ミノ酸２−１３，アミノ酸１８２−１９２，アミノ酸２
６４−２７７，アミノ酸２８７−２９８およびアミノ酸
４０４−４１４からなる群から選ばれたアミノ酸配列を
有する、哺乳類Ｄ2 ドパミンレセプターのペプチドフラ
グメント。 - 【請求項９】神経伝達レセプターをコードする配列とハ
イブリダイズする配列の存在について核酸サンプルをプ
ローブする方法であって、前記サンプルをハムスターβ
2 ＡＲの１．３ｋｂ Ｈｉｎｄ IIIフラグメントとハイ
ブリダイズするか、または前記フラグメントとハイブリ
ダイズするプローブとハイブリダイズさせることを含む
前記方法。 - 【請求項１０】哺乳類Ｄ2 ドパミンレセプター活性を有
するポリペプチドをコードする単離したＤＮＡ配列をあ
る座に配置するかまたは該座において発現させるか、ま
たはそのようなポリペプチドを純粋な形において該座に
配置することを含む、ある座において哺乳類Ｄ2 ドパミ
ンレセプター活性を増加させる方法。 - 【請求項１１】哺乳類Ｄ2 ドパミンレセプターに対する
条件または物質の効果を決定する方法であって、哺乳類
Ｄ2 ドパミンレセプター活性を有する純粋なポリペプチ
ドに対して前記条件または物質を曝露することを含む前
記方法。 - 【請求項１２】哺乳類Ｄ2 ドパミンレセプターに対する
親和性について、または哺乳類Ｄ2 ドパミンレセプター
へ結合するリガンドによってトリガされるレスポンスを
修正もしくは開始するその能力について化合物をスクリ
ーニングすることを含む請求項１１の方法。 - 【請求項１３】サンプルの少なくとも一成分をドパミン
レセプターへ独特に関連した核酸もしくはアミノ酸配列
へ曝露することを含む、サンプルのドパミンレセプター
関連性質を決定する方法。 - 【請求項１４】前記サンプルはヒトからのものであり、
そしてドパミンレセプターに関連した病的状態が診断ま
たは特徴化される請求項１３の方法。 - 【請求項１５】前記病的状態は分裂症である請求項１４
の方法。
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