JPH11286616A - 核酸染色剤、それを用いた二本鎖核酸の検出方法及び標的核酸の検出試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 二本鎖核酸と相互作用することによって蛍光
特性が変化する核酸染色剤及びそれを用いた二本鎖核酸
の検出方法及び検出試薬を提供する。 【解決手段】 下記一般式（１）で示される３，８−ジ
アゾ−６−フェニルフェナンスリジン誘導体を含有して
なることを特徴とする核酸染色剤。 【化１】 （なお、式中のＲ₁ はアルキル基を表し、Ｒ₂ はハロゲ
ンイオンを表し、Ｒ₃ 及びＲ₄ はフェニル基、アニリノ
基、ヒドロキシフェニル基、アルキルアニリノ基、ジア
ルキルアニリノ基、ジヒドロキシアルキルアニリノ基、
２−（Ｎ−アルキルアニリノ）エタノール基、ナフチル
基、ナフトール基を表す。）

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はウイルス、微生物、
動植物、ヒト等の核酸の特定の塩基配列を光学的手段を
用いて検出、同定、もしくは各種塩基配列における変異
の有無の検出に有用な核酸染色剤及びそれを用いた遺伝
子診断、有用遺伝子のクローニング、未知遺伝子の探索
等における二本鎖核酸の検出方法及び検出試薬に関する
ものである。

【０００２】

【従来の技術】核酸の分析技術の発達により種々の変異
遺伝子が多く見いだされ、遺伝子の変異はタンパク質の
変異を起こし、それによってさまざまな疾病が引き起こ
されていることが明らかになってきた。現在、これらの
疾病は酵素によるアッセイや抗体による免疫的な方法に
よって診断、発見されることが主流であるが、早期発見
及び早期治療という観点から、遺伝子上での変異を早期
に発見することのできる遺伝子診断の重要性が指摘され
ている。また、遺伝子診断は、感染した細菌の同定にも
多く利用されている。

【０００３】細菌感染症における原因細菌の遺伝子の検
出又は同定の分野においては、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリ
ダイゼーション法又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼー
ション法を用いる試みがなされている。この方法は、細
菌の核酸の特定部分に着目して、その部分の塩基配列が
対象とする被検核酸サンプル中に存在するか否かをハイ
ブリダイゼーション法によって測定することによってサ
ンプル中に問題となる細菌が存在するか否かを判定する
方法である。

【０００４】ハイブリダイゼーション法の典型的な手順
としては、被検核酸を変性して不溶性担体に結合し、こ
れを酵素やラジオアイソトープで標識された標的核酸と
相補的な塩基配列を有するプローブとインキュベートし
てハイブリッド体を形成させ、その後、不溶性担体を洗
浄して標的配列と結合していないプローブを洗い流し、
酵素反応やラジオアイソトープ等により標的核酸量を定
量する操作である。

【０００５】しかし、上記のような不溶性担体を用いた
ハイブリダイゼーション法では、未反応プローブの除去
（Ｂ／Ｆ分離）が必要であり、その操作は極めて煩雑で
ある。さらに、プローブがこの不溶性担体に吸着してし
まうため、不溶性担体上のハイブリッド体の標識物質を
測定する段階でこの不溶性担体に吸着したプローブに由
来する信号が測定結果に紛れ込み、試料中の標的核酸の
有無及びその量の測定結果に誤差が生じ、正しい判定が
困難であるという問題がある。

【０００６】そこで、これらの問題を回避する方法とし
て、溶液中でのハイブリダイゼーション法、いわゆる、
均一系での方法の開発が望まれている。この均一系での
最大の課題は、標的核酸に結合しているプローブと結合
していないプローブを識別する必要があることである。

【０００７】Ｂ／Ｆ分離を行わずにハイブリッド体を検
出する方法としては、蛍光偏光解消法を利用した方法が
提案されている（特開平２−７５９５８号公報、特開平
２−２９５４９６号公報）。この方法は、蛍光色素標識
されたプローブを用い、一本鎖核酸の蛍光偏光とハイブ
リッド体の蛍光偏光の違いにより標的核酸の有無を判定
する方法であり、その原理は、プローブに結合した蛍光
色素が二本鎖になったことにより運動しにくくなり、蛍
光異方性が増大することを利用している。しかし、この
方法では検体中にタンパク質等の夾雑物が含まれている
と、プローブがそれらに非特異的に吸着し、ハイブリッ
ド体検出のバックグランドを上昇させる原因となるた
め、あらかじめこれらの夾雑物を完全に除去するという
煩雑な操作が必要となる。

【０００８】また、光励起エネルギーの移動を利用した
ハイブリッド体の検出法が提案されている（Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, 85, 8790-8794 ）。この方法は、
エネルギー供与体化合物とエネルギー受容体化合物とか
ら構成されており、プローブが標的核酸にハイブリッド
した時、両化合物が近接に存在するためエネルギー供与
体から励起エネルギーが受容体に移動することで、エネ
ルギー供与体の励起寿命及び蛍光強度の減少又は受容体
の蛍光強度の増加が観測される。これらの現象を利用す
ることによりハイブリダイゼーションの有無を溶液のま
ま測定でき、一連の煩雑な操作を省くことができる画期
的な方法であるが、感度が既存の方法に比べて数オーダ
ー低く、実用化には到っていないのが現状である。

【０００９】さらに、インターカレーター性蛍光色素を
用いたハイブリッド体の検出方法が提案されている（特
開平８−２１１０５０号公報）。この方法は、色素がハ
イブリッド体にインターカレーションしたときの蛍光特
性の変化を測定することによりハイブリッド体を検出す
る方法である。また、特開平９−４０６６１１号公報に
は、ピリリウム塩又はその類似塩をインターカレーター
性色素として利用することができることが開示されてい
る。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】しかし、これらの色素
は、二本鎖核酸の有無に対する蛍光強度の変化が小さい
という問題点があった。本発明は、二本鎖核酸の有無に
対する蛍光特性の変化、特に蛍光強度の変化が大きい核
酸染色剤及びそれを用いた二本鎖核酸の検出方法及び検
出試薬を提供することを目的とするものである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者は、このような
核酸染色剤を提供するために鋭意検討の結果、３，８−
ジアゾ−６−フェニルフェナンスリジン誘導体は核酸と
相互作用することによりその蛍光強度及び蛍光波長が変
化するということを見い出し、本発明に到達した。

【００１２】すなわち、第１の発明は、下記一般式
（１）で示される３，８−ジアゾ−６−フェニルフェナ
ンスリジン誘導体（以下、エチジウムブロミド誘導体と
記載する）を含有してなることを特徴とする核酸染色剤
を要旨とするものである。

【００１３】

【化２】

【００１４】（なお、式中のＲ₁ はアルキル基を表し、
Ｒ₂ はハロゲンイオンを表し、Ｒ₃ 及びＲ₄ はフェニル
基、アニリノ基、ヒドロキシフェニル基、アルキルアニ
リノ基、ジアルキルアニリノ基、ジヒドロキシアルキル
アニリノ基、２−（Ｎ−アルキルアニリノ）エタノール
基、ナフチル基、ナフトール基を表す。）

【００１５】また、第２の発明は、前記一般式（１）で
示されるエチジウムブロミド誘導体が二本鎖核酸と相互
作用することによって生じる蛍光特性の変化を測定する
ことを特徴とする二本鎖核酸の検出方法を要旨とするも
のである。さらに第３の発明は、標的核酸に相補的な核
酸配列を有する一本鎖ヌクレオチドからなるプローブ
と、前記一般式（１）で示されるエチジウムブロミド誘
導体を含有してなることを特徴とする標的核酸の検出試
薬を要旨とするものである。

【００１６】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に用いられるエチジウムブロミド誘導体は上記一
般式（１）で示されるものである。上記一般式中のＲ₁
としてはメチル基、エチル基、プロピル基等のアルキル
基が挙げられ、Ｒ₂ としては、臭素、塩素等のハロゲン
イオンが挙げられ、Ｒ₃ 及びＲ₄ としては、電子供与基
であるフェニル基、アニリノ基、ヒドロキシフェニル
基、メチルアニリノ基、エチルアニリノ基等のアルキル
アニリノ基、ジメチルアニリノ基、ジエチルアニリノ基
等のジアルキルアニリノ基、ジメタノールアニリノ基、
ジエタノールアニリノ基等のジヒドロキシアルキルアニ
リノ基、２−（Ｎ−エチルアニリノ）エタノール基等の
２−（Ｎ−アルキルアニリノ）エタノール基、ナフチル
基、ナフトール基が挙げられる。

【００１７】本発明の核酸染色剤は、上記のエチジウム
ブロミド誘導体をそのまま用いてもよく、また、適当な
溶媒や分散剤に溶解又は分散させてもよい。このような
溶媒及び分散剤としては、水、アセトニトリル、ジメチ
ルスルホキシド、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液等の各種緩
衝液等が挙げられる。このときのエチジウムブロミド誘
導体の濃度としては、１×１０^-8〜１×１０^-5Ｍが好ま
しい。

【００１８】また、本発明の核酸染色剤は、上記のエチ
ジウムブロミド誘導体が標的核酸を検出するためのプロ
ーブに結合した形であってもよい。プローブとしては、
標的核酸中の特定の塩基配列に対して完全に相補的な核
酸配列を有することが好ましいが、一部の塩基が相補的
配列でなくても標的核酸との結合に支障がなければ問題
はない。特定の塩基配列は、標的核酸中の１０〜３０塩
基からなる核酸配列であり、この配列が他の核酸と識別
可能な配列であることが好ましい。

【００１９】エチジウムブロミド誘導体とプローブとの
結合は、プローブにエチジウムブロミド誘導体を直接結
合させてもよく、適当な分子長のリンカーを介して結合
させてもよい。リンカーとしては、ハイブリッド体形成
及びエチジウムブロミド誘導体と二本鎖核酸との相互作
用を妨げない分子であれば特に限定されるものではない
が、結合操作の容易性等の観点から、両末端に官能基を
有する二官能性炭化水素を用いることが好適である。

【００２０】エチジウムブロミド誘導体とプローブとの
結合部位としては、同じくハイブリッド体形成及びエチ
ジウムブロミド誘導体と二本鎖核酸との相互作用を妨げ
ない部位であれば特に限定されるものではなく、プロー
ブの５’末端、３’末端又は中央部分のいずれであって
もよい。ただし、プローブを共存させた状態でＰＣＲ法
等の遺伝子増幅を実施する場合には、ＤＮＡ合成酵素に
よる核酸の伸長反応を阻害しないようにエチジウムブロ
ミド誘導体をプローブの５’末端に結合させることが好
ましい。

【００２１】次に、本発明の二本鎖核酸の検出方法につ
いて説明する。本発明の二本鎖核酸の検出方法は、上記
のエチジウムブロミド誘導体を核酸染色剤として用い、
エチジウムブロミド誘導体が二本鎖核酸と相互作用する
ことにより生じる蛍光特性の変化を測定することによっ
て行う。なお、エチジウムブロミド誘導体と二本鎖核酸
との相互作用とは、エチジウムブロミド誘導体が二本鎖
核酸にインターカレートしている状態であると思われる
が、特に本発明でいう相互作用は、インターカレーショ
ンに限定されるものではない。

【００２２】本発明においては、二本鎖核酸と相互作用
する前のエチジウムブロミド誘導体は親水性の高い水分
子に囲まれた状況にあるが、二本鎖核酸と相互作用する
と、その化合物は疎水性の高い核酸塩基に囲まれた状況
となるため、蛍光特性が変化する。このため、この蛍光
特性の変化を例えば、特定波長における蛍光強度の変化
や極大最大波長の変化等によって測定することにより、
二本鎖核酸を検出、定量することができるのである。

【００２３】本発明の検出方法は、プローブを用いたハ
イブリダイゼーション法において、プローブと標的核酸
のハイブリッド体を検出するのに利用することができ
る。この場合、予めエチジウムブロミド誘導体をプロー
ブに結合させておいてこれを標的核酸とハイブリダイズ
させて検出することもできるし、エチジウムブロミド誘
導体の結合していないプローブをまず標的核酸とハイブ
リダイズさせ、これにエチジウムブロミド誘導体を添加
して検出することもできる。また、本発明の検出方法
は、プローブあるいは試料を固定した状態及び溶液中で
のハイブリダイゼーションに適応することができる。

【００２４】二本鎖核酸に添加するエチジウムブロミド
誘導体の量としては、二本鎖核酸に対してエチジウムブ
ロミド誘導体が過剰となることが好ましく、１×１０^-8
〜１×１０^-5Ｍとなるように添加することが好ましい。

【００２５】蛍光特性の変化の測定方法としては、二本
鎖核酸と共存させない状態で測定したエチジウムブロミ
ド誘導体の蛍光スペクトルと二本鎖核酸と共存させた状
態で測定した蛍光性物質の蛍光スペクトルから蛍光極大
波長を比較することにより、又は両スペクトルの蛍光極
大波長における両スペクトルの蛍光強度を比較すること
によって蛍光特性の変化を測定すればよい。

【００２６】また、本発明の標的核酸の検出試薬は、プ
ローブとエチジウムブロミド誘導体を含有してなるもの
であり、エチジウムブロミド誘導体はプローブに結合し
た形でもよく、結合していない形でもよい。

【００２７】

【実施例】以下、本発明を実施例によって具体的に説明
する。 実施例１ 下記構造式（２）で示されるエチジウムブロマイド１ｇ
（２．５mmol）を５０ｍｌのアセトンに溶解し、そこへ
２．８ｍｌの６Ｍの塩酸（１５mmol）、１０ｍｌの水及
び３４０ｍｇ（５．０mmol）の亜硝酸ナトリウムを加
え、０℃で２時間攪拌した。その後、８２６ｍｇ（５．
０mmol）の２−（Ｎ−エチルアニリノ）エタノールを添
加し、０℃で２０時間攪拌した。炭酸水素ナトリウムを
添加して溶液を中性にした後、沈殿物をろ取し、水で洗
浄した。沈殿物を塩化メチレンに溶解し、シルカゲルカ
ラムで精製することにより下記構造式（３）で示される
エチジウムブロミド誘導体（以下、ＥＢ２ＮＥＥと記載
する）を得た（収量０．７８ｇ）。

【００２８】

【化３】

【００２９】

【化４】

【００３０】得られたＥＢ２ＮＥＥを核酸染色剤として
用い、溶液中の二本鎖核酸の測定を行った。なお、二本
鎖核酸としては、市販のもの（Calf thymus DNA,ベーリ
ンガー社製）を用いた。まず、ジメチルスルホキシドに
１００ｍＭの濃度となるようにＥＢ２ＮＥＥを溶解した
後、５０ｍＭのＮａＣｌを含む５ｍＭのTrisHCl 緩衝液
（ｐＨ７．５）で１００倍に希釈し、励起波長３５０ｎ
ｍにおける蛍光スペクトルを蛍光分光計ＦＰ−７７７
（日本分光社製）を用いて測定した（図１の点線）。次
に、二本鎖核酸の塩基対濃度がＥＢ２ＮＥＥ濃度の２５
倍となるように二本鎖核酸を添加し、その蛍光スペクト
ルを同様の励起波長で測定した（図１の実線）。図１
は、二本鎖核酸の存在下及び非存在下でのＥＢ２ＮＥＥ
の蛍光スペクトルを示す図であり、縦軸に蛍光強度を、
横軸に蛍光波長を示している。図１からわかるように二
本鎖核酸の非存在下でのＥＢ２ＮＥＥの蛍光極大波長は
４２５ｎｍであるが、二本鎖核酸が存在する時の蛍光極
大波長は３９８ｎｍであり、ＥＢ２ＮＥＥが二本鎖核酸
と相互作用することにより、蛍光波長が２７ｎｍ移動し
た。また、二本鎖核酸が存在する時の３９８ｎｍの蛍光
強度は、存在しない時のそれの約５０倍であった。この
ことから、蛍光波長３９８ｎｍの蛍光強度を測定するこ
とによって二本鎖核酸を検出することが可能であること
がわかる。

【００３１】実施例２ １本鎖Ｍ１３ｍｐ１８DNA （宝酒造社製）と部分的に相
補的な塩基配列を有する配列番号１に示す２０量体オリ
ゴヌクレオチドをアプライドバイオシステムズ社製３９
１DNA 自動合成機を用いて合成した。ＣＰＧ担体からの
切り出し、脱保護、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）による精製はアプライドバイオシステムズ社指定
の方法により行った。このオリゴヌクレオチドの５’末
端に、グレンリサーチ社製の試薬５’チオールモディフ
ァイアーＣ６を用いてチオールリンカーを結合させた。

【００３２】得られたオリゴヌクレオチド（２６０ｎｍ
における吸光度が５）を１００ｍＭのTrisHCl 緩衝液
（ｐＨ７．５）５０ｍｌに溶解し、これに１Ｍの硝酸銀
溶液を７．５ｍｌ加え、攪拌後、室温で４０分放置し
た。１Ｍのジチオスレイトール（ＤＴＴ）溶液を１０ｍ
ｌ加えて攪拌後、室温で３０分放置した。遠心分離によ
り沈殿物を除き、高速液体クロマトグラフィーでプロー
ブを精製した。これに０．０１ＭのＤＴＴを２０ｍｌ加
え、攪拌後、アルゴン置換を行った。（溶液１）

【００３３】１ｇ（１．３mmol）のＥＢ２ＮＥＥと０．
０８ｇ（１．４mmol）の水酸化カリウムを１０ｍｌのグ
リコールモノメチルエーテルに溶解し、そこに０．２３
ｇ（１．４mmol）の１，３−ジヨードプロパンを加え、
５時間加熱還流した。これに１０ｍｌの水を加え、よく
振り混ぜた後、水層を除去した。これにヘキサンを加え
て析出した固体を濾過して集めた（収量０．５８ｇ）。
この析出した固体の１５ｍｇをジメチルホルムアミド２
００ｍｌ、１Ｍのリン酸緩衝液（pH１０．０）３００ｍ
ｌ及び水５００ｍｌを加え、その後アルゴン置換した。
（溶液２）

【００３４】この溶液２に溶液１を容量が２：１になる
ように混合し、室温で２時間放置した後、セファデック
スＧ−２５（ファルマシア社製）を用いたゲル濾過に供
し、取得物を乾燥後、高速液体クロマトグラフィーで精
製することにより下記構造式（４）で示されるＥＢ２Ｎ
ＥＥの結合したプローブを得た。なお、高速液体クロマ
トグラフィー操作において使用した緩衝液は、０．１Ｍ
のTrisHCl （ｐＨ７．５）／５０重量％アセトニトリル
であり、セファデックスＧ−２５のゲル濾過操作に用い
た緩衝液は、０．１ＭのTrisHCl （ｐＨ７．５）／５重
量％アセトニトリルである。

【００３５】

【化５】

【００３６】実施例３ 実施例２で作製したＥＢ２ＮＥＥ結合プローブを用いて
Ｍ１３ｍｐ１８DNA の検出を行った。Ｍ１３ｍｐ１８DN
A （宝酒造社製）２００pmolとＢＥ２ＮＥＥ結合プロー
ブ２００pmolを５０ｍＭのＮａＣｌを含む５ｍＭのTris
HCl 緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍｌに溶解し、９０℃まで
加熱後、放冷して徐々に室温（約２０℃）までもどして
Ｍ１３ｍｐ１８DNA にプローブをハイブリダイズさせ
た。このハイブリッド体の励起波長３５０ｎｍにおける
蛍光スペクトルを測定した。また、Ｍ１３ｍｐ１８DNA
を添加しない以外は同様にして蛍光スペクトルを測定し
た。この結果、プローブだけの溶液では蛍光極大波長が
４２５ｎｍであったのに対し、ハイブリッド体の場合で
は、蛍光極大波長は３９９ｎｍであり、また、ハイブリ
ッド体の場合の蛍光強度はプローブだけの場合の蛍光強
度の約５倍であった。これらの結果から、試料中にＥＢ
２ＮＥＥ結合プローブを添加することにより特定核酸の
検出を行うことが可能であることがわかる。

【００３７】実施例４ 実施例２で作製したＥＢ２ＮＥＥ結合プローブ２００pm
olに、Ｍ１３ｍｐ１８DNA （宝酒造社製）の０．１、
０．２、０．５、１．０、２．０、３．０、５．０、
７．５、１０．０、１５．０又は２０．０当量添加し、
実施例１と同様にして励起波長３５０ｎｍ、蛍光波長３
９８ｎｍの蛍光強度を測定した。その結果を図２に示
す。図２は、ＥＢ２ＮＥＥ結合プローブを用いてＭ１３
ｍｐ１８DNA を定量したときの結果を示す図であり、縦
軸に蛍光強度を、横軸にプローブ量を示している。図２
より、試料中の標的核酸の量に比例して蛍光強度が増加
していることがわかる。従って、試料にＥＢ２ＮＥＥ結
合プローブを添加し、その蛍光強度を測定することによ
り試料中の特定核酸の定量を行うことができることがわ
かる。

【００３８】

【発明の効果】本発明の核酸染色剤は、二本鎖核酸と相
互作用することにより、蛍光強度及び蛍光波長が変化す
るため、均一系での標的核酸の検出及び定量に利用する
ことができる。また、本発明の二本鎖核酸の検出方法及
び検出試薬によれば、標識プローブの除去操作を行うこ
となしに、標的核酸の存在の有無及び量を決定すること
が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】二本鎖核酸の存在下及び非存在下でのＥＢ２Ｎ
ＥＥの蛍光スペクトルを示す図である。

【図２】ＥＢ２ＮＥＥで標識されたプローブを用いて標
的核酸を定量したときの結果を示す図である。

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧ ＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴ
２０

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/533 Ｇ０１Ｎ 33/533 33/566 33/566

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記一般式（１）で示される３，８−ジ
   アゾ−６−フェニルフェナンスリジン誘導体を含有して
   なることを特徴とする核酸染色剤。 【化１】 （なお、式中のＲ₁ はアルキル基を表し、Ｒ₂ はハロゲ
   ンイオンを表し、Ｒ₃ 及びＲ₄ はフェニル基、アニリノ
   基、ヒドロキシフェニル基、アルキルアニリノ基、ジア
   ルキルアニリノ基、ジヒドロキシアルキルアニリノ基、
   ２−（Ｎ−アルキルアニリノ）エタノール基、ナフチル
   基、ナフトール基を表す。）
2. 【請求項２】 前記一般式（１）で示される３，８−ジ
   アゾ−６−フェニルフェナンスリジン誘導体が二本鎖核
   酸と相互作用することによって生じる蛍光特性の変化を
   測定することを特徴とする二本鎖核酸の検出方法。
3. 【請求項３】 標的核酸に相補的な核酸配列を有する一
   本鎖ヌクレオチドからなるプローブと、前記一般式
   （１）で示される３，８−ジアゾ−６−フェニルフェナ
   ンスリジン誘導体を含有してなることを特徴とする標的
   核酸の検出試薬。