JPH11287799A - 全血中の異常な有核細胞の検出、同定、計数及び確認方法 - Google Patents
全血中の異常な有核細胞の検出、同定、計数及び確認方法Info
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- JPH11287799A JPH11287799A JP10333047A JP33304798A JPH11287799A JP H11287799 A JPH11287799 A JP H11287799A JP 10333047 A JP10333047 A JP 10333047A JP 33304798 A JP33304798 A JP 33304798A JP H11287799 A JPH11287799 A JP H11287799A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 全血中の循環癌細胞及び／又は血液学的前駆
細胞の検出、同定、計数及び確認方法を提供すること。 【解決手段】（ａ）一般に円筒形のインサート４を含有
する孔を有する透明な管２を用意し、前記管とインサー
トとを組合わせて、充分に画定された帯を管中に形成す
る工程と；（ｂ）血液サンプルに１種類以上のエピトー
プ特異的な標識剤を混合する工程と；（ｃ）着色剤を血
液サンプルに混合する工程と；（ｄ）血液サンプルを管
に入れ、管中の血液サンプルを遠心分離して、血液サン
プル中に存在する如何なる異常な有核細胞をも管の前記
充分に画定された帯中に密度によって下降させる工程
と；（ｅ）管中の充分に画定された帯中に存在する如何
なる識別された細胞をも現場で計数する工程と；（ｆ）
管中の充分に画定された帯中の如何なる識別された細胞
の細胞形態をも現場で検査する工程とを含む。
細胞の検出、同定、計数及び確認方法を提供すること。 【解決手段】（ａ）一般に円筒形のインサート４を含有
する孔を有する透明な管２を用意し、前記管とインサー
トとを組合わせて、充分に画定された帯を管中に形成す
る工程と；（ｂ）血液サンプルに１種類以上のエピトー
プ特異的な標識剤を混合する工程と；（ｃ）着色剤を血
液サンプルに混合する工程と；（ｄ）血液サンプルを管
に入れ、管中の血液サンプルを遠心分離して、血液サン
プル中に存在する如何なる異常な有核細胞をも管の前記
充分に画定された帯中に密度によって下降させる工程
と；（ｅ）管中の充分に画定された帯中に存在する如何
なる識別された細胞をも現場で計数する工程と；（ｆ）
管中の充分に画定された帯中の如何なる識別された細胞
の細胞形態をも現場で検査する工程とを含む。
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は、透明なサンプリン
グ管アセンブリ中に含有される凝血防止された全血サン
プル中の循環癌細胞及び／又は血液学的前駆細胞を検出
し、同定し、計数し、確認するための方法とアセンブリ
とに関する。検出、同定、計数及び確認工程は全てサン
プリング管アセンブリ中で現場で行うことができる。よ
り詳しくは、本発明の方法は、血液サンプル中の如何な
る循環癌細胞及び／又は血液学的前駆細胞も血液サンプ
ル中及びサンプリング管アセンブリ中の予め定められた
軸方向の位置に、さらに、サンプリング管の壁に隣接す
る、サンプリング管アセンブリ中の限定された光学的面
中に、最終的にはその光学的面の非常に充分に画定され
た帯(very well-defined zone)中にそれらの密度によっ
て物理的に移動させられることを保証するやり方で、血
液サンプルの含有物を遠心力によって密度に基づいて分
離することを含む。
グ管アセンブリ中に含有される凝血防止された全血サン
プル中の循環癌細胞及び／又は血液学的前駆細胞を検出
し、同定し、計数し、確認するための方法とアセンブリ
とに関する。検出、同定、計数及び確認工程は全てサン
プリング管アセンブリ中で現場で行うことができる。よ
り詳しくは、本発明の方法は、血液サンプル中の如何な
る循環癌細胞及び／又は血液学的前駆細胞も血液サンプ
ル中及びサンプリング管アセンブリ中の予め定められた
軸方向の位置に、さらに、サンプリング管の壁に隣接す
る、サンプリング管アセンブリ中の限定された光学的面
中に、最終的にはその光学的面の非常に充分に画定され
た帯(very well-defined zone)中にそれらの密度によっ
て物理的に移動させられることを保証するやり方で、血
液サンプルの含有物を遠心力によって密度に基づいて分
離することを含む。
【０００２】
【従来の技術】細胞学は哺乳動物細胞の形態学的特徴付
けに関与する科学と技術である。細胞学はヒトの医学と
獣医学の両方における臨床的有用性を有する。細胞学は
（ａ）胸膜腔若しくは腹膜腔のような体腔中に流出され
る；又は（ｂ）例えば唾液若しくは尿として排泄される
体液中に流出される；又は（ｃ）例えば子宮頚部、子宮
腔若しくは気管支粘膜のような体表をスクラッピング若
しくはブラッシングすることによって得られる；又は
（ｄ）甲状腺、胸部、肺等の腫瘍のような腫瘍から直接
の針仲介吸引によって得られる、剥離された又は回収さ
れた細胞中の悪性度の有無を診断するために非常に頻繁
に用いられる。この場合に、剥離された又は回収された
細胞は典型的に固定され、染色され、通常は明視野顕微
鏡によって目視検査され、次に、必要な場合には、免疫
学的ステイン及び／又は他の分子的方法によって目視検
査される。
けに関与する科学と技術である。細胞学はヒトの医学と
獣医学の両方における臨床的有用性を有する。細胞学は
（ａ）胸膜腔若しくは腹膜腔のような体腔中に流出され
る；又は（ｂ）例えば唾液若しくは尿として排泄される
体液中に流出される；又は（ｃ）例えば子宮頚部、子宮
腔若しくは気管支粘膜のような体表をスクラッピング若
しくはブラッシングすることによって得られる；又は
（ｄ）甲状腺、胸部、肺等の腫瘍のような腫瘍から直接
の針仲介吸引によって得られる、剥離された又は回収さ
れた細胞中の悪性度の有無を診断するために非常に頻繁
に用いられる。この場合に、剥離された又は回収された
細胞は典型的に固定され、染色され、通常は明視野顕微
鏡によって目視検査され、次に、必要な場合には、免疫
学的ステイン及び／又は他の分子的方法によって目視検
査される。
【０００３】今年、アメリカ合衆国では、約５６０，０
００人が固体腫瘍(solid tumor) （主として、癌腫）に
よって死亡すると思われる。これらの死亡の多くは、こ
れらの悪性度の早期診断によって防止することができ
る。残念ながら、前立腺癌に対する前立腺特異的抗原
（ＰＳＡ）試験を考えられる例外として、血液分析によ
る固体腫瘍の早期検出のために有効であると判明してい
る実用的な、ルーチンの方法は存在しない。
００人が固体腫瘍(solid tumor) （主として、癌腫）に
よって死亡すると思われる。これらの死亡の多くは、こ
れらの悪性度の早期診断によって防止することができ
る。残念ながら、前立腺癌に対する前立腺特異的抗原
（ＰＳＡ）試験を考えられる例外として、血液分析によ
る固体腫瘍の早期検出のために有効であると判明してい
る実用的な、ルーチンの方法は存在しない。
【０００４】頚部癌の早期検出によって、Ｐａｐスミア
は合衆国における頚部癌による死亡率を７０％以上減じ
ている。他の固体腫瘍に対する同様な試験法の開発が総
合的な癌死亡率に同様な影響を与えることができると思
われる。
は合衆国における頚部癌による死亡率を７０％以上減じ
ている。他の固体腫瘍に対する同様な試験法の開発が総
合的な癌死亡率に同様な影響を与えることができると思
われる。
【０００５】腫瘍に酸素及び栄養素を供給する循環血流
中に癌腫瘍によって自然に流出される循環癌細胞の存在
は確認されている。血行性ルートとして述べられてお
り、ごく稀な場合にのみ血液サンプル中で可視化されて
いるものによる癌腫瘍の伝播のために、血流中のこのよ
うな細胞の存在は数十年前から推測されていた。最近、
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と組合せて逆転写酵素
を用いる複雑な方法が、かなりの数の癌患者において、
癌が局在しているとき及び癌が伝播した後の両方でそれ
らの分子シグネチャー(molecular signature) によって
腫瘍細胞の存在を検出することができている。
中に癌腫瘍によって自然に流出される循環癌細胞の存在
は確認されている。血行性ルートとして述べられてお
り、ごく稀な場合にのみ血液サンプル中で可視化されて
いるものによる癌腫瘍の伝播のために、血流中のこのよ
うな細胞の存在は数十年前から推測されていた。最近、
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と組合せて逆転写酵素
を用いる複雑な方法が、かなりの数の癌患者において、
癌が局在しているとき及び癌が伝播した後の両方でそれ
らの分子シグネチャー(molecular signature) によって
腫瘍細胞の存在を検出することができている。
【０００６】循環する癌細胞を検出する他の手段は、例
えばＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏ
ｍｐａｎｙ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，Ｎｅｗ
Ｊｅｒｓｅｙ）によって製造されたような、蛍光活性化
セルソルティング（Fluorescent Activated Cell Sorti
ng）（ＦＡＣＳ）として知られる技術を用いる。循環す
る癌細胞のＦＡＣＳ検出は、癌細胞上若しくは内に存在
し、正常な血液細胞上若しくは内には存在しない１種類
以上のエピトープに向けられ、これらのエピトープに結
合する蛍光標識抗体を検出する方法による、及び／又は
循環する正常な血液細胞上若しくは内に存在し、癌細胞
上若しくは内に存在する若しくは存在しないエピトープ
の組合せを検出する方法による、又は上記方法の組合せ
による癌細胞の検出を含む。
えばＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏ
ｍｐａｎｙ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，Ｎｅｗ
Ｊｅｒｓｅｙ）によって製造されたような、蛍光活性化
セルソルティング（Fluorescent Activated Cell Sorti
ng）（ＦＡＣＳ）として知られる技術を用いる。循環す
る癌細胞のＦＡＣＳ検出は、癌細胞上若しくは内に存在
し、正常な血液細胞上若しくは内には存在しない１種類
以上のエピトープに向けられ、これらのエピトープに結
合する蛍光標識抗体を検出する方法による、及び／又は
循環する正常な血液細胞上若しくは内に存在し、癌細胞
上若しくは内に存在する若しくは存在しないエピトープ
の組合せを検出する方法による、又は上記方法の組合せ
による癌細胞の検出を含む。
【０００７】したがって、ＦＡＣＳ方法は細胞強調(hig
hlighting)に基づく、即ち、ＦＡＣＳは測光法的であ
り、抗体−エピトープ特異性を利用するものであり、Ｆ
ＡＣＳ機器において細胞を現場で形態学的に分析するた
めに用いることはできない。逆転写酵素／ＰＣＲ（分子
的方法）とＦＡＣＳ（免疫−表現型方法）の両方は、特
異的分子種又は免疫−表現型シグナルを選択するために
腫瘍の起源を追及して知ることを必要とする。上記方法
は、癌細胞が血流中で循環するという理論の確立に寄与
しているが、これらの方法は、特に治療用途の観点か
ら、血流中の循環する腫瘍癌細胞の有無を検出するため
に、それらの費用及び／又は性質によって実用的ではな
い。したがって、患者における循環する癌細胞の悪性(m
alignant nature)を検出し、確認するための全般的又は
一般的な血液分析方法は存在しない。さらに、上記分子
的方法又は免疫−表現型方法のいずれも、現場で、即
ち、閉鎖型サンプリング系において、癌細胞の同定及び
確認を可能にする、循環する細胞の形態的特徴を測定す
るために細胞病理学に基づく分析を用いていない。
hlighting)に基づく、即ち、ＦＡＣＳは測光法的であ
り、抗体−エピトープ特異性を利用するものであり、Ｆ
ＡＣＳ機器において細胞を現場で形態学的に分析するた
めに用いることはできない。逆転写酵素／ＰＣＲ（分子
的方法）とＦＡＣＳ（免疫−表現型方法）の両方は、特
異的分子種又は免疫−表現型シグナルを選択するために
腫瘍の起源を追及して知ることを必要とする。上記方法
は、癌細胞が血流中で循環するという理論の確立に寄与
しているが、これらの方法は、特に治療用途の観点か
ら、血流中の循環する腫瘍癌細胞の有無を検出するため
に、それらの費用及び／又は性質によって実用的ではな
い。したがって、患者における循環する癌細胞の悪性(m
alignant nature)を検出し、確認するための全般的又は
一般的な血液分析方法は存在しない。さらに、上記分子
的方法又は免疫−表現型方法のいずれも、現場で、即
ち、閉鎖型サンプリング系において、癌細胞の同定及び
確認を可能にする、循環する細胞の形態的特徴を測定す
るために細胞病理学に基づく分析を用いていない。
【０００８】全ての癌の約８２％は起源が上皮であるの
で（その７２％は致命的である）、上皮癌細胞は循環す
る血液中で検出可能であるべきである。循環する血流中
の上皮細胞の存在は、それだけでは、悪性度を実証しな
いが、上皮細胞は循環血流中に通常見られないので、細
胞学者に悪性度の可能性が大きいと警告する。しかし、
例えば、手術後若しくは身体の外傷の結果若しくはデン
タルフロシング(dental flossing) の結果のような、あ
る一定の場合には、又は前立腺炎の場合には、循環する
血流中に非悪性の上皮細胞が存在しうる可能性がある。
細胞の視覚による形態学的分析は、循環する血液サンプ
ル中に存在する良性の上皮細胞から癌にかかった上皮細
胞を区別するための現在、最も信頼できる方法である。
血液中の循環する癌細胞を形態学的分析によって検出し
ようとする試みに関連して存在する１つの問題は、血液
中の循環する癌細胞が循環する血液学的前駆細胞又は芽
細胞から細胞学的分析のみによっては実際にはしばしば
識別不能であるという事実に関する。
で（その７２％は致命的である）、上皮癌細胞は循環す
る血液中で検出可能であるべきである。循環する血流中
の上皮細胞の存在は、それだけでは、悪性度を実証しな
いが、上皮細胞は循環血流中に通常見られないので、細
胞学者に悪性度の可能性が大きいと警告する。しかし、
例えば、手術後若しくは身体の外傷の結果若しくはデン
タルフロシング(dental flossing) の結果のような、あ
る一定の場合には、又は前立腺炎の場合には、循環する
血流中に非悪性の上皮細胞が存在しうる可能性がある。
細胞の視覚による形態学的分析は、循環する血液サンプ
ル中に存在する良性の上皮細胞から癌にかかった上皮細
胞を区別するための現在、最も信頼できる方法である。
血液中の循環する癌細胞を形態学的分析によって検出し
ようとする試みに関連して存在する１つの問題は、血液
中の循環する癌細胞が循環する血液学的前駆細胞又は芽
細胞から細胞学的分析のみによっては実際にはしばしば
識別不能であるという事実に関する。
【０００９】循環血液のサンプル中に存在しうる癌細胞
が少ないことは、１つの癌細胞を発見するために細胞病
理学者に約１０，０００，０００個の有核血液細胞(nuc
leated blood cell)を細心に検査することを必要とさせ
る、この１個の癌細胞は１０，０００，０００個の有核
血液細胞中にランダムに存在すると考えられ、これらの
有核血液細胞自体は非常に多くの５０億個の非有核細胞
の血液成分、即ち、赤血球プラス２５０，０００，００
０個の血小板中に均一に分散されており、これらの全て
が１ｍｌの血液中に存在する。このような仕事は非常に
時間を要するので、癌細胞の有無に関して患者の血液を
分析するために用いるには非実用的である。
が少ないことは、１つの癌細胞を発見するために細胞病
理学者に約１０，０００，０００個の有核血液細胞(nuc
leated blood cell)を細心に検査することを必要とさせ
る、この１個の癌細胞は１０，０００，０００個の有核
血液細胞中にランダムに存在すると考えられ、これらの
有核血液細胞自体は非常に多くの５０億個の非有核細胞
の血液成分、即ち、赤血球プラス２５０，０００，００
０個の血小板中に均一に分散されており、これらの全て
が１ｍｌの血液中に存在する。このような仕事は非常に
時間を要するので、癌細胞の有無に関して患者の血液を
分析するために用いるには非実用的である。
【００１０】血液サンプル中に検出されうる、他の種類
の稀な循環有核細胞は芽細胞、幹細胞を包含する血液学
的前駆細胞（ＨＰＣ）であり、通常の循環細胞の他の前
駆体は循環血液のサンプル中に、例えばインピーダンス
カウンター(impedance counter) のような、現在利用可
能なヘマトトピック(hematotopic) 機器の使用及び染色
した(stained) 末梢血液の検査によって検出可能である
レベルでは通常存在しない。化学療法を受けている患者
及びヒト顆粒球コロニー刺激因子（ＨＧＣＳＦ）及び他
の同様なサイトカインを受容している患者では、ＨＰＣ
が存在する可能性が大きいと思われる、但し、一般に、
非常に低い数で、即ち、サンプル１ｍｌにつき約１〜１
０００個又はそれ以下で存在すると思われる。したがっ
て、血液サンプル中のＨＰＣが低濃度であることは、Ｈ
ＰＣをルーチン方法によって検出不能にする。
の稀な循環有核細胞は芽細胞、幹細胞を包含する血液学
的前駆細胞（ＨＰＣ）であり、通常の循環細胞の他の前
駆体は循環血液のサンプル中に、例えばインピーダンス
カウンター(impedance counter) のような、現在利用可
能なヘマトトピック(hematotopic) 機器の使用及び染色
した(stained) 末梢血液の検査によって検出可能である
レベルでは通常存在しない。化学療法を受けている患者
及びヒト顆粒球コロニー刺激因子（ＨＧＣＳＦ）及び他
の同様なサイトカインを受容している患者では、ＨＰＣ
が存在する可能性が大きいと思われる、但し、一般に、
非常に低い数で、即ち、サンプル１ｍｌにつき約１〜１
０００個又はそれ以下で存在すると思われる。したがっ
て、血液サンプル中のＨＰＣが低濃度であることは、Ｈ
ＰＣをルーチン方法によって検出不能にする。
【００１１】ＨＰＣの計数は臨床的に重要な幹細胞移植
療法のためのＨＰＣのより大きく効果的な回収を可能に
しうるので、ＨＰＣを検出し、計数することは重要であ
る。同様に、そのＨＰＣを回収されつつある患者におけ
る循環癌細胞の検出は、回収された循環癌細胞が患者に
再注入されることを最小にすることができるので、重要
である。
療法のためのＨＰＣのより大きく効果的な回収を可能に
しうるので、ＨＰＣを検出し、計数することは重要であ
る。同様に、そのＨＰＣを回収されつつある患者におけ
る循環癌細胞の検出は、回収された循環癌細胞が患者に
再注入されることを最小にすることができるので、重要
である。
【００１２】インサート、典型的にはフロートを含有す
る毛細管又は他の管中で物質混合物サンプルを遠心分離
することによって、複雑な物質混合物中の成分層を測定
するための方法が開発されている。フロートは好ましく
は円筒形であり、測定されるべき層（単数又は複数）が
沈降する環状自由容積を管中に形成するような程度に、
遠心分離済み混合物中にフロートを沈降させる比重を有
する。測定されるべき層はしたがって物理的に細長くな
り、したがってより容易にかつ正確に測定されることが
できる。上記方法は米国特許第４，０２７，６６０号
（１９７７年６月７日発行）；第４，０８２，０８５号
（１９７８年４月４日発行）；第４，１５６，５７０号
（１９７９年５月２９日発行）等に述べられている。こ
の方法はＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ
Ｃｏｍｐａｎｙによって登録商標“ＱＢＣ”で現在市販
されている。凝血防止された全血を種々な分析物に関し
て分析するため、さらに、分析前に組織サンプルに生理
的食塩水バッファー溶液を混合して、組織サンプルを癌
腫瘍細胞の有無に関して分析するための上記“ＱＢＣ”
方法の使用を述べている、米国特許第４，１９０，３２
８号（１９８０年２月２６日発行）；米国特許第５，４
０３，７１４号（１９９５年４月４日発行）；第５，４
９６，７０４号（１９９６年３月５日発行）；第５，５
０６，１４５号（１９９６年４月９日発行）等に記載さ
れているように、この“ＱＢＣ”方法は血液サンプルの
ミクロフィラリア・インフェステーション(microfilari
al infestation) の単離及び同定に用いるために適用さ
れている。
る毛細管又は他の管中で物質混合物サンプルを遠心分離
することによって、複雑な物質混合物中の成分層を測定
するための方法が開発されている。フロートは好ましく
は円筒形であり、測定されるべき層（単数又は複数）が
沈降する環状自由容積を管中に形成するような程度に、
遠心分離済み混合物中にフロートを沈降させる比重を有
する。測定されるべき層はしたがって物理的に細長くな
り、したがってより容易にかつ正確に測定されることが
できる。上記方法は米国特許第４，０２７，６６０号
（１９７７年６月７日発行）；第４，０８２，０８５号
（１９７８年４月４日発行）；第４，１５６，５７０号
（１９７９年５月２９日発行）等に述べられている。こ
の方法はＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ
Ｃｏｍｐａｎｙによって登録商標“ＱＢＣ”で現在市販
されている。凝血防止された全血を種々な分析物に関し
て分析するため、さらに、分析前に組織サンプルに生理
的食塩水バッファー溶液を混合して、組織サンプルを癌
腫瘍細胞の有無に関して分析するための上記“ＱＢＣ”
方法の使用を述べている、米国特許第４，１９０，３２
８号（１９８０年２月２６日発行）；米国特許第５，４
０３，７１４号（１９９５年４月４日発行）；第５，４
９６，７０４号（１９９６年３月５日発行）；第５，５
０６，１４５号（１９９６年４月９日発行）等に記載さ
れているように、この“ＱＢＣ”方法は血液サンプルの
ミクロフィラリア・インフェステーション(microfilari
al infestation) の単離及び同定に用いるために適用さ
れている。
【００１３】毛細血管血液又は静脈血液のサンプルを迅
速にかつ正確に循環癌細胞及び／又は血液学的前駆細胞
の有無に関して分析することができる、簡単な方法と、
このような方法を実施するための系とに対する切実な必
要性が存在することは明らかである。さらに、この方法
は人が癌細胞を血液学的前駆細胞から識別することを可
能にするべきであり；さらに、人が血液サンプリング装
置において、全て現場で、検出された細胞の性質(natur
e)を確認することを可能にするべきである。
速にかつ正確に循環癌細胞及び／又は血液学的前駆細胞
の有無に関して分析することができる、簡単な方法と、
このような方法を実施するための系とに対する切実な必
要性が存在することは明らかである。さらに、この方法
は人が癌細胞を血液学的前駆細胞から識別することを可
能にするべきであり；さらに、人が血液サンプリング装
置において、全て現場で、検出された細胞の性質(natur
e)を確認することを可能にするべきである。
【００１４】本発明は、透明なサンプリング管中に含有
される凝血防止された全血サンプル中の循環癌細胞及び
／又は血液学的前駆細胞を視覚によって又は測光法によ
って検出するための方法及び装置に関する。上皮起源で
ある循環癌細胞と血液学的前駆細胞とが、循環血流中に
存在する場合に、血液の他の有核成分とは異なる密度を
有し、重量によって(gravimetrically) 分離すると、上
皮癌細胞及び／又は血液学的前駆細胞が遠心分離済み血
液サンプルの血小板層中に又は血小板層に隣接して層を
形成するという事実を利用することによって、血液サン
プル中の循環癌細胞及び／又は血液学的前駆細胞の検出
及び確認を数分間内に達成することができる。循環上皮
癌細胞及び／又は血液学的前駆細胞は遠心分離済み血液
サンプル中で沈降によって、即ち、大きさによって層を
形成するのではなく、むしろ密度によって遠心分離済み
血液サンプル中に層を形成することが判明している。血
小板層は、一般に有核細胞を有さず、ＤＮＡ染色を受け
易い物質をも含まない血液成分層であるので、血小板層
に近接する有核細胞の迅速な同定を可能にする。
される凝血防止された全血サンプル中の循環癌細胞及び
／又は血液学的前駆細胞を視覚によって又は測光法によ
って検出するための方法及び装置に関する。上皮起源で
ある循環癌細胞と血液学的前駆細胞とが、循環血流中に
存在する場合に、血液の他の有核成分とは異なる密度を
有し、重量によって(gravimetrically) 分離すると、上
皮癌細胞及び／又は血液学的前駆細胞が遠心分離済み血
液サンプルの血小板層中に又は血小板層に隣接して層を
形成するという事実を利用することによって、血液サン
プル中の循環癌細胞及び／又は血液学的前駆細胞の検出
及び確認を数分間内に達成することができる。循環上皮
癌細胞及び／又は血液学的前駆細胞は遠心分離済み血液
サンプル中で沈降によって、即ち、大きさによって層を
形成するのではなく、むしろ密度によって遠心分離済み
血液サンプル中に層を形成することが判明している。血
小板層は、一般に有核細胞を有さず、ＤＮＡ染色を受け
易い物質をも含まない血液成分層であるので、血小板層
に近接する有核細胞の迅速な同定を可能にする。
【００１５】本発明は、遠心分離済み血液サンプル中に
存在する、疑わしい細胞、即ち、低比重の大きい細胞、
有核細胞の視覚による外形計測分析(visual morphometr
ic analysis)、さらに標識エピトープ分析及び同定を現
場で、即ち、サンプリング装置において可能にする。本
発明はまた、サンプリング管アセンブリ中で疑わしい細
胞の現場での分析を可能にすることができる。このよう
な分析は、個々の疑わしい細胞が上皮細胞かつ悪性であ
るか、又は上皮細胞かつ良性であるか、又は起源におい
て上皮ではないが血液学的前駆細胞であるかを全てサン
プリング管から血液サンプルを取り出さずに確認するこ
とができる。凝血防止された全血中の循環癌細胞及び／
又は血液学的前駆細胞を単離し、同定するために“ＱＢ
Ｃ”装置を用いることの重要な利点は、“ＱＢＣ”装置
が、他のサンプルからの交差汚染(cross contaminatio
n) を受け易くない閉鎖系を提供することである。この
利点は、信頼できる稀有イベント検出系(rare event de
tection system) において非常に重要である。
存在する、疑わしい細胞、即ち、低比重の大きい細胞、
有核細胞の視覚による外形計測分析(visual morphometr
ic analysis)、さらに標識エピトープ分析及び同定を現
場で、即ち、サンプリング装置において可能にする。本
発明はまた、サンプリング管アセンブリ中で疑わしい細
胞の現場での分析を可能にすることができる。このよう
な分析は、個々の疑わしい細胞が上皮細胞かつ悪性であ
るか、又は上皮細胞かつ良性であるか、又は起源におい
て上皮ではないが血液学的前駆細胞であるかを全てサン
プリング管から血液サンプルを取り出さずに確認するこ
とができる。凝血防止された全血中の循環癌細胞及び／
又は血液学的前駆細胞を単離し、同定するために“ＱＢ
Ｃ”装置を用いることの重要な利点は、“ＱＢＣ”装置
が、他のサンプルからの交差汚染(cross contaminatio
n) を受け易くない閉鎖系を提供することである。この
利点は、信頼できる稀有イベント検出系(rare event de
tection system) において非常に重要である。
【００１６】問題の癌細胞及び／又は血液学的前駆細胞
は、血液サンプルを適当に拡大して検査する場合に、上
記“ＱＢＣ”管及びインサート装置中で遠心分離した血
液サンプル中で血小板層に近接することが発見される。
したがって、本発明の方法は２工程を含み、これらの工
程はそれぞれ、血液サンプルがサンプリング管中にまだ
存在するときに現場で行われる。
は、血液サンプルを適当に拡大して検査する場合に、上
記“ＱＢＣ”管及びインサート装置中で遠心分離した血
液サンプル中で血小板層に近接することが発見される。
したがって、本発明の方法は２工程を含み、これらの工
程はそれぞれ、血液サンプルがサンプリング管中にまだ
存在するときに現場で行われる。
【００１７】１工程は、管中に認められる有核細胞が上
皮起源であるか又は血液学的前駆体起源であるかを決定
するために、細胞上の特徴的なエピトープ強調(epitopi
c highlighting) の検出に関与する。この工程は“エピ
トープ”分析として特徴付けることができる。このエピ
トープ工程の実施には、特に上皮起源の細胞の検出のた
めに、例えばＥ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｃａｄｈｅｒｉｎ
１１、上皮膜抗原（ＥＭＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥ
Ａ）、インテグリン、ＥＰ−ＣＡＭ、ＭＵＣ３、ＣＤ−
４４のような上皮特異的抗原、例えば表皮増殖因子（Ｅ
ＧＦ）受容体、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）受容体のよう
な増殖因子受容体を用いることができる。
皮起源であるか又は血液学的前駆体起源であるかを決定
するために、細胞上の特徴的なエピトープ強調(epitopi
c highlighting) の検出に関与する。この工程は“エピ
トープ”分析として特徴付けることができる。このエピ
トープ工程の実施には、特に上皮起源の細胞の検出のた
めに、例えばＥ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｃａｄｈｅｒｉｎ
１１、上皮膜抗原（ＥＭＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥ
Ａ）、インテグリン、ＥＰ−ＣＡＭ、ＭＵＣ３、ＣＤ−
４４のような上皮特異的抗原、例えば表皮増殖因子（Ｅ
ＧＦ）受容体、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）受容体のよう
な増殖因子受容体を用いることができる。
【００１８】ＨＰＣ起源の細胞を検出するためには、例
えば、ＣＤ−３３、ＣＤ３４に対して向けられるＨＰＣ
エピトープ特異的標識抗体を用いることができる。上皮
細胞は上記ＨＰＣ特異的な抗体によって認識されず、Ｈ
ＰＣ細胞は標識上皮特異的抗体又は他の結合粒子によっ
て認識されない。ラベルのリポソーム被包(liposomeenc
apsulation)を用いて、シグナルのノイズに対する比率
を高める、及び／又は標的細胞の密度を変えることがで
きる。リポソーム中への染料の被包、結合剤によるリポ
ソームの修飾、及び標識リポソームのサンプル中の標的
分析物への付着はＲ．Ａ．Ｌｅｖｉｎｅ等へ１９９７年
１月１４日に発行された米国特許第５，５９３，８４８
号（この特許の内容は、その全体において、本明細書に
援用される）に全て述べられている。
えば、ＣＤ−３３、ＣＤ３４に対して向けられるＨＰＣ
エピトープ特異的標識抗体を用いることができる。上皮
細胞は上記ＨＰＣ特異的な抗体によって認識されず、Ｈ
ＰＣ細胞は標識上皮特異的抗体又は他の結合粒子によっ
て認識されない。ラベルのリポソーム被包(liposomeenc
apsulation)を用いて、シグナルのノイズに対する比率
を高める、及び／又は標的細胞の密度を変えることがで
きる。リポソーム中への染料の被包、結合剤によるリポ
ソームの修飾、及び標識リポソームのサンプル中の標的
分析物への付着はＲ．Ａ．Ｌｅｖｉｎｅ等へ１９９７年
１月１４日に発行された米国特許第５，５９３，８４８
号（この特許の内容は、その全体において、本明細書に
援用される）に全て述べられている。
【００１９】他方の工程は、疑わしい細胞を同定するか
又は細胞の悪性を確認するための細胞の形態学的検査に
関与する。それ故、他方の工程は“外形計測的”又は
“形態学的”分析として特徴付けることができる。例え
ば、アクリジンオレンジ、ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ若
しくは“ＳＹＴＯ”ブランド染料等のような、万能的な
外形計測用ステインをこの工程に用いることができる。
これらの２工程はいずれの順序でも用いることができ
る、即ち、いずれか一方の工程を用いて、血液サンプル
中の疑わしい細胞を同定し、他方の工程を用いて、疑わ
しい細胞が悪性であるか又は良性であるかを確認するこ
とができる。細胞の悪性度を判定するためのエピトープ
分析又は外形計測的分析又は両方に基づく決定は、直面
される腫瘍（単数又は複数種類）の種類に依存する。場
合によっては、外形計測的態様(morphometric feature)
のみで、付加的な確認試験を必要としないほど、充分に
特徴的である。他の場合には、エピトープ分析のみで充
分でありうる。血液サンプルの検定に、エピトープ分析
と外形計測的分析の両方を用いることが一般に望まし
く、賢明である。
又は細胞の悪性を確認するための細胞の形態学的検査に
関与する。それ故、他方の工程は“外形計測的”又は
“形態学的”分析として特徴付けることができる。例え
ば、アクリジンオレンジ、ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ若
しくは“ＳＹＴＯ”ブランド染料等のような、万能的な
外形計測用ステインをこの工程に用いることができる。
これらの２工程はいずれの順序でも用いることができ
る、即ち、いずれか一方の工程を用いて、血液サンプル
中の疑わしい細胞を同定し、他方の工程を用いて、疑わ
しい細胞が悪性であるか又は良性であるかを確認するこ
とができる。細胞の悪性度を判定するためのエピトープ
分析又は外形計測的分析又は両方に基づく決定は、直面
される腫瘍（単数又は複数種類）の種類に依存する。場
合によっては、外形計測的態様(morphometric feature)
のみで、付加的な確認試験を必要としないほど、充分に
特徴的である。他の場合には、エピトープ分析のみで充
分でありうる。血液サンプルの検定に、エピトープ分析
と外形計測的分析の両方を用いることが一般に望まし
く、賢明である。
【００２０】遠心分離済み血液サンプル中の血小板層に
近接して検出される疑わしい有核細胞の外形計測的分析
は、細胞病理学者が管中で現場で血液サンプルを目視分
析することによって、又は細胞病理学者が管中で現場で
技術者操作カメラによって手動で記録された、若しくは
自動化イメージング機器によって自動的に記録された、
疑わしい細胞の画像若しくは一連の画像を目視分析する
ことによって達成されることができる。本発明の血液分
析方法の目視及び画像分析工程又は記録工程は全て、遠
心分離済み血液サンプルがまだサンプリング管中に存在
するときにこのサンプルを光学的に拡大して行われる。
血液サンプルからの有核細胞の記録された画像の外形計
測的分析は、記録された画像上で遠隔的に行うことがで
きる。
近接して検出される疑わしい有核細胞の外形計測的分析
は、細胞病理学者が管中で現場で血液サンプルを目視分
析することによって、又は細胞病理学者が管中で現場で
技術者操作カメラによって手動で記録された、若しくは
自動化イメージング機器によって自動的に記録された、
疑わしい細胞の画像若しくは一連の画像を目視分析する
ことによって達成されることができる。本発明の血液分
析方法の目視及び画像分析工程又は記録工程は全て、遠
心分離済み血液サンプルがまだサンプリング管中に存在
するときにこのサンプルを光学的に拡大して行われる。
血液サンプルからの有核細胞の記録された画像の外形計
測的分析は、記録された画像上で遠隔的に行うことがで
きる。
【００２１】遠心分離済み血液サンプル中の血小板層に
近接して存在する、癌である又は血液学的前駆体起源で
あると疑われる有核細胞の検出は、大抵の上皮細胞上に
及び／又は大抵の上皮癌細胞及び／又は血液学的前駆細
胞上に存在する若しくは存在しないことが知られてお
り、正常な循環する有核及び非有核血液細胞又はそれら
の先駆体上には存在しないことも知られている表面エピ
トープの存在及び／又は不存在の結果としての、疑わし
い細胞の示差染色(differential staining) に基づくこ
とができる。例えば、ローダミン、フルオレセイン、Ｃ
ｙ３、Ｃｙ５、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｂｏｄｉｐｙ等の
ような、特有の発光を有する、発蛍光団又は他の検出可
能な染料又はマーカーを抗原又は抗体に、直接に、又は
上記米国特許第５，５９３，８４８号に述べられている
ようにリポソーム中に被包された後に結合させることが
できる。
近接して存在する、癌である又は血液学的前駆体起源で
あると疑われる有核細胞の検出は、大抵の上皮細胞上に
及び／又は大抵の上皮癌細胞及び／又は血液学的前駆細
胞上に存在する若しくは存在しないことが知られてお
り、正常な循環する有核及び非有核血液細胞又はそれら
の先駆体上には存在しないことも知られている表面エピ
トープの存在及び／又は不存在の結果としての、疑わし
い細胞の示差染色(differential staining) に基づくこ
とができる。例えば、ローダミン、フルオレセイン、Ｃ
ｙ３、Ｃｙ５、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｂｏｄｉｐｙ等の
ような、特有の発光を有する、発蛍光団又は他の検出可
能な染料又はマーカーを抗原又は抗体に、直接に、又は
上記米国特許第５，５９３，８４８号に述べられている
ようにリポソーム中に被包された後に結合させることが
できる。
【００２２】血液サンプル中の有核細胞を検出するため
の他の方法は、血液サンプル中の有核細胞の全ての形態
を示差的に強調して、明確にするように、血液サンプル
中に発見されることができる全ての有核細胞を示差染色
することができる、例えばアクリジンオレンジ、Ｈｏｅ
ｓｃｈｔ、ＤＡＰＩ若しくは“ＳＹＴＯ”ブランド染料
のような、万能的な有核細胞ステインを血液サンプルに
添加することを含む。
の他の方法は、血液サンプル中の有核細胞の全ての形態
を示差的に強調して、明確にするように、血液サンプル
中に発見されることができる全ての有核細胞を示差染色
することができる、例えばアクリジンオレンジ、Ｈｏｅ
ｓｃｈｔ、ＤＡＰＩ若しくは“ＳＹＴＯ”ブランド染料
のような、万能的な有核細胞ステインを血液サンプルに
添加することを含む。
【００２３】エピトープ染料及び万能的染料は異なる波
長において最大に蛍光を発光するので、疑わしい細胞の
視覚による又は自動化機器を用いる検出を可能にする。
例えば、問題の領域内の全ての有核細胞を同定するため
に、遠心分離済み血液サンプルを適当な機器によって走
査して、次に、血液サンプル中の全ての上皮細胞を同定
するための異なる光フィルターセットによって、再び走
査することができる。このようにして、異常な形態に関
する目視検査を必要とする細胞を同定することができ
る。外形計測的目視検査は予備検出試験として行うこと
ができる、又は疑わしい細胞の性質についての後続確認
試験として行うことができる。
長において最大に蛍光を発光するので、疑わしい細胞の
視覚による又は自動化機器を用いる検出を可能にする。
例えば、問題の領域内の全ての有核細胞を同定するため
に、遠心分離済み血液サンプルを適当な機器によって走
査して、次に、血液サンプル中の全ての上皮細胞を同定
するための異なる光フィルターセットによって、再び走
査することができる。このようにして、異常な形態に関
する目視検査を必要とする細胞を同定することができ
る。外形計測的目視検査は予備検出試験として行うこと
ができる、又は疑わしい細胞の性質についての後続確認
試験として行うことができる。
【００２４】予備の外形計測的目視分析又は測光法的エ
ピトープ分析は、血液サンプル中の膨張した軟層(expan
ded buffy coat) の血小板層に近接して行われる。特に
肺癌、前立腺癌、胸部癌、直腸／結腸癌、卵巣癌及び腎
臓癌によって例示されるような、上皮起源の循環癌細胞
が凝血防止された全血の遠心分離済みサンプル中で、本
質に関係のない(extraneous)密度勾配を必要とせずに、
血小板層に近接して発見されることができ、血液サンプ
ル管中で、現場で、形態学的に又は比色計によって癌で
あると同定されることができるという事実は、文献に述
べられていない。さらに、骨髄に由来し、白血病の先駆
体(precursor of leukemia) である循環する血液学的前
駆物質が凝血防止された全血の遠心分離済みサンプル中
で、本質に関係のない密度勾配を必要とせずに、血小板
層に近接して発見されることができ、エピトープ的に同
定されることができるという事実も、同様に、文献に述
べられていない。
ピトープ分析は、血液サンプル中の膨張した軟層(expan
ded buffy coat) の血小板層に近接して行われる。特に
肺癌、前立腺癌、胸部癌、直腸／結腸癌、卵巣癌及び腎
臓癌によって例示されるような、上皮起源の循環癌細胞
が凝血防止された全血の遠心分離済みサンプル中で、本
質に関係のない(extraneous)密度勾配を必要とせずに、
血小板層に近接して発見されることができ、血液サンプ
ル管中で、現場で、形態学的に又は比色計によって癌で
あると同定されることができるという事実は、文献に述
べられていない。さらに、骨髄に由来し、白血病の先駆
体(precursor of leukemia) である循環する血液学的前
駆物質が凝血防止された全血の遠心分離済みサンプル中
で、本質に関係のない密度勾配を必要とせずに、血小板
層に近接して発見されることができ、エピトープ的に同
定されることができるという事実も、同様に、文献に述
べられていない。
【００２５】
【発明が解決しようとする課題】それ故、透明な管中に
含有される、遠心分離済みの凝血防止された全血サンプ
ル中の循環癌細胞及び／又は血液学的前駆細胞の有無を
検出し、同定し、確認するための方法及び装置を提供す
ることが、本発明の目的である。
含有される、遠心分離済みの凝血防止された全血サンプ
ル中の循環癌細胞及び／又は血液学的前駆細胞の有無を
検出し、同定し、確認するための方法及び装置を提供す
ることが、本発明の目的である。
【００２６】血液サンプル中の大部分の非癌細胞及び非
血液学的前駆体の有核血液細胞から循環癌細胞及び／又
は血液学的前駆細胞を単離する、上記特徴の方法及び装
置を提供することが、本発明の他の目的である。
血液学的前駆体の有核血液細胞から循環癌細胞及び／又
は血液学的前駆細胞を単離する、上記特徴の方法及び装
置を提供することが、本発明の他の目的である。
【００２７】予備検出工程を視覚的に又はエピトープ的
に適当な機器の使用によって行うことができ、さらに、
後続確認工程を視覚的に又はエピトープ的に行うことが
できる、上記特徴の方法及び装置を提供することが、本
発明の他の目的である。
に適当な機器の使用によって行うことができ、さらに、
後続確認工程を視覚的に又はエピトープ的に行うことが
できる、上記特徴の方法及び装置を提供することが、本
発明の他の目的である。
【００２８】遠心分離済み血液サンプル中の単離された
有核細胞を悪性若しくは良性（陰性）として、又は血液
学的前駆細胞として管中で、現場で、確認することがで
きる、上記特徴の方法及び装置を提供することが、本発
明の追加の目的である。
有核細胞を悪性若しくは良性（陰性）として、又は血液
学的前駆細胞として管中で、現場で、確認することがで
きる、上記特徴の方法及び装置を提供することが、本発
明の追加の目的である。
【００２９】血液サンプル中の検出された循環癌細胞及
び／又は血液学的前駆細胞の計数を可能にする、上記特
徴の方法及び装置を提供することが、本発明のさらなる
目的である。
び／又は血液学的前駆細胞の計数を可能にする、上記特
徴の方法及び装置を提供することが、本発明のさらなる
目的である。
【００３０】血液サンプル分析が、周囲環境からの汚染
に耐性である閉鎖系中で現場で行われ、それによって偽
陽性結果の可能性を減ずる、上記特徴の方法及び装置を
提供することが、本発明の他の目的である。
に耐性である閉鎖系中で現場で行われ、それによって偽
陽性結果の可能性を減ずる、上記特徴の方法及び装置を
提供することが、本発明の他の目的である。
【００３１】本発明の上記及び他の目的及び利点は、本
発明の下記詳細な説明から、添付図面と共に検討するな
らば、さらに容易に明らかになるであろう。
発明の下記詳細な説明から、添付図面と共に検討するな
らば、さらに容易に明らかになるであろう。
【００３２】
【課題を解決するための手段】図面を参照すると、図１
には、細長いプラスチック・インサート又はフロート４
を含有する透明なサンプリング管２を包含する、サンプ
リング管及びフロート・アセンブリ（以下では、一般的
に“装置”と呼ぶ）の側面図を示す。管２はクロージャ
ーキャップ１０によって閉鎖される下端部６を有する。
管２は毛細管であることができる、又は例えば米国特許
第５，０８６，７８４号（１９９２年２月１１日発行）
に述べられているような、より大きい管であることがで
きる。管孔とインサート４との間のギャップの厚さは、
標的細胞にアクセス可能であるために、少なくとも約１
０μである。
には、細長いプラスチック・インサート又はフロート４
を含有する透明なサンプリング管２を包含する、サンプ
リング管及びフロート・アセンブリ（以下では、一般的
に“装置”と呼ぶ）の側面図を示す。管２はクロージャ
ーキャップ１０によって閉鎖される下端部６を有する。
管２は毛細管であることができる、又は例えば米国特許
第５，０８６，７８４号（１９９２年２月１１日発行）
に述べられているような、より大きい管であることがで
きる。管孔とインサート４との間のギャップの厚さは、
標的細胞にアクセス可能であるために、少なくとも約１
０μである。
【００３３】図２は、数字１２によって一般に表示する
自動化比色法顕微鏡機器アセンブリ(automated colorim
etric microscopical instrument assembly)の概略図で
あり、これは図１に示した装置に含有される遠心分離済
み血液サンプルを走査するために用いることができ、人
の介入なしに、走査される層中の異なる種類の細胞を比
色法によって識別することができ、走査される細胞層の
画像を生じて、記憶する又は伝送することができる。機
器アセンブリ１２は、サンプル管２の端部に係合して、
管２の内容物が走査されるときに、サンプル管２をその
軸を中心に回転させることを可能にする少なくとも１つ
の回転可能なサポート１６を包含するステージ１４を含
む。可逆的電気モーター１８はドライブ・スクリュー２
０を相対する方向に選択的に回転させるので、管２はス
テージ１４内で段階的に回転しながら、管２は軸方向に
(axially) １方向に移動し、次に逆の方向に移動するこ
とができる。この方法で、管２の全円周内容物が走査さ
れることができる。機器アセンブリ１２の自動式実施態
様はＣＣＤカメラ２２を包含し、カメラ２２はビーム・
スプリッタ２４とレンズ２６によって管アセンブリ２内
の、管孔壁とインサート４の外面との間に位置付けられ
る、環状サンプル含有ギャップ上に焦点を合わせる。レ
ンズ２６の操作範囲が管２内の管孔とインサート４との
間のギャップの厚さに少なくとも等しいことは理解され
るであろう。ＣＣＤカメラ２２は、選択的に回転可能な
フィルター・ホイール３４上に取り付けられた複数個の
異なる発光波フィルター(emission light wave filter)
２８、３０及び３２を通してサンプルの画像を検査し、
記録する。機器アセンブリ１２はまた、励起光源３５を
含み、これは励起光線をビーム・スプリッタ２４と集束
レンズ２６に通してサンプル管２に向ける。一連の励起
光波長フィルター３６、３８及び４０は選択的に回転可
能なフィルターホイール４２上に取り付けられる。励起
光線はビーム・スプリッタ２４によって集束レンズ２６
方向に屈折されて、レンズ２６によってサンプル管２上
に集束させられる。したがって、２個のフィルター・ホ
イール３４と４２が励起光源と発光源との波長を選択的
に制御し、変化させることを可能にする。予めプログラ
ムされたマイクロプロセッサー制御装置４４がサンプル
管２の回転、フィルター・ホイール３４と４２の回転、
及びＣＣＤカメラ２２の操作を選択的に制御するために
使用可能である。制御装置４４はこのように機器アセン
ブリ１２の完全自動操作を、人の介入を必要とせずに可
能にする。
自動化比色法顕微鏡機器アセンブリ(automated colorim
etric microscopical instrument assembly)の概略図で
あり、これは図１に示した装置に含有される遠心分離済
み血液サンプルを走査するために用いることができ、人
の介入なしに、走査される層中の異なる種類の細胞を比
色法によって識別することができ、走査される細胞層の
画像を生じて、記憶する又は伝送することができる。機
器アセンブリ１２は、サンプル管２の端部に係合して、
管２の内容物が走査されるときに、サンプル管２をその
軸を中心に回転させることを可能にする少なくとも１つ
の回転可能なサポート１６を包含するステージ１４を含
む。可逆的電気モーター１８はドライブ・スクリュー２
０を相対する方向に選択的に回転させるので、管２はス
テージ１４内で段階的に回転しながら、管２は軸方向に
(axially) １方向に移動し、次に逆の方向に移動するこ
とができる。この方法で、管２の全円周内容物が走査さ
れることができる。機器アセンブリ１２の自動式実施態
様はＣＣＤカメラ２２を包含し、カメラ２２はビーム・
スプリッタ２４とレンズ２６によって管アセンブリ２内
の、管孔壁とインサート４の外面との間に位置付けられ
る、環状サンプル含有ギャップ上に焦点を合わせる。レ
ンズ２６の操作範囲が管２内の管孔とインサート４との
間のギャップの厚さに少なくとも等しいことは理解され
るであろう。ＣＣＤカメラ２２は、選択的に回転可能な
フィルター・ホイール３４上に取り付けられた複数個の
異なる発光波フィルター(emission light wave filter)
２８、３０及び３２を通してサンプルの画像を検査し、
記録する。機器アセンブリ１２はまた、励起光源３５を
含み、これは励起光線をビーム・スプリッタ２４と集束
レンズ２６に通してサンプル管２に向ける。一連の励起
光波長フィルター３６、３８及び４０は選択的に回転可
能なフィルターホイール４２上に取り付けられる。励起
光線はビーム・スプリッタ２４によって集束レンズ２６
方向に屈折されて、レンズ２６によってサンプル管２上
に集束させられる。したがって、２個のフィルター・ホ
イール３４と４２が励起光源と発光源との波長を選択的
に制御し、変化させることを可能にする。予めプログラ
ムされたマイクロプロセッサー制御装置４４がサンプル
管２の回転、フィルター・ホイール３４と４２の回転、
及びＣＣＤカメラ２２の操作を選択的に制御するために
使用可能である。制御装置４４はこのように機器アセン
ブリ１２の完全自動操作を、人の介入を必要とせずに可
能にする。
【００３４】機器アセンブリ１２は下記方法で、管２内
に含有される血液サンプルを疑わしい有核細胞に関して
走査した結果の画像を捕捉して、記録し、さらに血液サ
ンプル中の観察された疑わしい細胞が悪性又は良性であ
るかを現場で確認するために作動する。凝血防止された
全血の静脈又は毛細血管サンプルをサンプリング管２及
びインサート４・アセンブリ中に入れる。血液サンプル
に管２中で、又は管２に入れる前に、血液サンプル中で
観察される有核細胞の形態学的特徴を分析することがで
きるように、例えばアクリジンオレンジのような形態学
的蛍光ステインを混合する。血液サンプルに、血液サン
プル中に認められる疑わしい細胞が上皮起源であるかど
うかを判定するために用いられる上皮細胞特異的マーカ
ーをも混合する。この確認方法は、分析されている腫瘍
癌細胞の全てが上皮細胞であるので、選択された。上皮
細胞上の表面受容体に対して非常に特異的である好まし
い抗原はＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎである。上皮細胞にタグ
を付けるために、本発明者等はＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎに
直接コンジュゲートするＣｙ３を好んで用いる。Ｃｙ３
はアクリジンオレンジとは異なる波長で蛍光を発光する
マーカーである。凝血防止された全血と、アクリジンオ
レンジと、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ／Ｃｙ３との混合物を
サンプリング管−インサート・アセンブリ中で約５分間
遠心分離する。遠心分離済みサンプルを次にステージ１
４上のサポート１６に配置して、機器１２を始動させ
る。遠心分離済み血液サンプルがカメラ２２の焦点面を
通して回転し、前後に往復運動するときに、ＣＣＤカメ
ラ２２が遠心分離済み血液サンプルの一部の画像を記録
する。したがって、血液サンプル中の標的帯の全円周の
画像がカメラ２２によって得られる。別々のスキャンが
行われ、その１つが、サンプルに加えられたアクリジン
オレンジ・ステインを示差的に蛍光発光させるように選
択されるフィルター２８、３０、３２、３６、３８及び
４０の適当な組合せによって定義される血液サンプル画
像を記録する。このスキャンは、走査される血液サンプ
ル帯中の全ての有核細胞の画像を作成する。他のスキャ
ンは、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｃｙ３又は他のラベルを
示差的に蛍光発光させるように選択されるフィルター２
８、３０、３２、３６、３８及び４０の第２の適当な組
合せによって定義される血液サンプル画像を記録する。
このスキャンは、上皮細胞である、血液サンプルの走査
される帯中の全ての有核細胞の画像を作成する。
に含有される血液サンプルを疑わしい有核細胞に関して
走査した結果の画像を捕捉して、記録し、さらに血液サ
ンプル中の観察された疑わしい細胞が悪性又は良性であ
るかを現場で確認するために作動する。凝血防止された
全血の静脈又は毛細血管サンプルをサンプリング管２及
びインサート４・アセンブリ中に入れる。血液サンプル
に管２中で、又は管２に入れる前に、血液サンプル中で
観察される有核細胞の形態学的特徴を分析することがで
きるように、例えばアクリジンオレンジのような形態学
的蛍光ステインを混合する。血液サンプルに、血液サン
プル中に認められる疑わしい細胞が上皮起源であるかど
うかを判定するために用いられる上皮細胞特異的マーカ
ーをも混合する。この確認方法は、分析されている腫瘍
癌細胞の全てが上皮細胞であるので、選択された。上皮
細胞上の表面受容体に対して非常に特異的である好まし
い抗原はＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎである。上皮細胞にタグ
を付けるために、本発明者等はＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎに
直接コンジュゲートするＣｙ３を好んで用いる。Ｃｙ３
はアクリジンオレンジとは異なる波長で蛍光を発光する
マーカーである。凝血防止された全血と、アクリジンオ
レンジと、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ／Ｃｙ３との混合物を
サンプリング管−インサート・アセンブリ中で約５分間
遠心分離する。遠心分離済みサンプルを次にステージ１
４上のサポート１６に配置して、機器１２を始動させ
る。遠心分離済み血液サンプルがカメラ２２の焦点面を
通して回転し、前後に往復運動するときに、ＣＣＤカメ
ラ２２が遠心分離済み血液サンプルの一部の画像を記録
する。したがって、血液サンプル中の標的帯の全円周の
画像がカメラ２２によって得られる。別々のスキャンが
行われ、その１つが、サンプルに加えられたアクリジン
オレンジ・ステインを示差的に蛍光発光させるように選
択されるフィルター２８、３０、３２、３６、３８及び
４０の適当な組合せによって定義される血液サンプル画
像を記録する。このスキャンは、走査される血液サンプ
ル帯中の全ての有核細胞の画像を作成する。他のスキャ
ンは、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｃｙ３又は他のラベルを
示差的に蛍光発光させるように選択されるフィルター２
８、３０、３２、３６、３８及び４０の第２の適当な組
合せによって定義される血液サンプル画像を記録する。
このスキャンは、上皮細胞である、血液サンプルの走査
される帯中の全ての有核細胞の画像を作成する。
【００３５】如何なる付加的細胞情報が求められている
かに依存して、付加的スキャンのために付加的なフィル
ター組合せを用いることができる。このような付加的な
有用な情報は、細胞病理学者が癌細胞の起源を同定す
る、即ち、癌細胞が前立腺癌細胞、胸部癌細胞、肺癌細
胞、卵巣癌細胞等のいずれであるかを同定することを可
能にする、付加的な癌細胞特異的エピトープと、いずれ
のエピトープ情報が現在入手可能であるか又は今後知ら
れるようになるかを包含することができる。血液サンプ
ルの上記分析は図２に示す機器によって自動的に行うこ
とができる、又はサンプルを目視走査することによって
行うことができる。走査工程と、走査工程の結果の分析
とはいずれの順序でも(in either order) 行うことがで
きる。アクリジンオレンジ強調細胞の走査は走査された
帯中の有核細胞の全てを人が同定することを可能にし、
悪性度を示す形態を有するように思われる如何なる細胞
をも同定するために、有核細胞の形態を人が分析するこ
とも可能にする。Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ／Ｃｙ３強調細
胞の走査は走査された帯中の有核細胞のいずれが上皮細
胞であるかを人が同定することを可能にする。遠心分離
済み血液サンプル中の異常な細胞形態（アクリジンオレ
ンジ強調）を有する上皮細胞の存在（Ｅ−ｃａｄｈｅｒ
ｉｎ／Ｃｙ３強調）の確認は、細胞病理学者に血液サン
プルドナーに癌腫瘍の大きな可能性があることを警告す
る。同様なプロトコールを用いて、疑わしい有核細胞が
血液学的前駆細胞であるかどうかを判定することができ
る。
かに依存して、付加的スキャンのために付加的なフィル
ター組合せを用いることができる。このような付加的な
有用な情報は、細胞病理学者が癌細胞の起源を同定す
る、即ち、癌細胞が前立腺癌細胞、胸部癌細胞、肺癌細
胞、卵巣癌細胞等のいずれであるかを同定することを可
能にする、付加的な癌細胞特異的エピトープと、いずれ
のエピトープ情報が現在入手可能であるか又は今後知ら
れるようになるかを包含することができる。血液サンプ
ルの上記分析は図２に示す機器によって自動的に行うこ
とができる、又はサンプルを目視走査することによって
行うことができる。走査工程と、走査工程の結果の分析
とはいずれの順序でも(in either order) 行うことがで
きる。アクリジンオレンジ強調細胞の走査は走査された
帯中の有核細胞の全てを人が同定することを可能にし、
悪性度を示す形態を有するように思われる如何なる細胞
をも同定するために、有核細胞の形態を人が分析するこ
とも可能にする。Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ／Ｃｙ３強調細
胞の走査は走査された帯中の有核細胞のいずれが上皮細
胞であるかを人が同定することを可能にする。遠心分離
済み血液サンプル中の異常な細胞形態（アクリジンオレ
ンジ強調）を有する上皮細胞の存在（Ｅ−ｃａｄｈｅｒ
ｉｎ／Ｃｙ３強調）の確認は、細胞病理学者に血液サン
プルドナーに癌腫瘍の大きな可能性があることを警告す
る。同様なプロトコールを用いて、疑わしい有核細胞が
血液学的前駆細胞であるかどうかを判定することができ
る。
【００３６】次に図３〜１４に関しては、“ＱＢＣ”装
置によって、上記方法を用いて行った血液サンプルのス
キャンの測光法イメージングの結果を示す。
置によって、上記方法を用いて行った血液サンプルのス
キャンの測光法イメージングの結果を示す。
【００３７】本発明者等は、腫瘍細胞検出の限界を試験
し、重量的に形成された血液成分密度勾配における腫瘍
細胞の位置付けを確認する両方のために、培養した癌腫
瘍細胞を血液サンプルに加えた実験を行った。これらの
実験は凝血防止された全血サンプル中の循環腫瘍癌細胞
の存在を単離し、分析し、確認するための上記方法の正
確さを実証した。
し、重量的に形成された血液成分密度勾配における腫瘍
細胞の位置付けを確認する両方のために、培養した癌腫
瘍細胞を血液サンプルに加えた実験を行った。これらの
実験は凝血防止された全血サンプル中の循環腫瘍癌細胞
の存在を単離し、分析し、確認するための上記方法の正
確さを実証した。
【００３８】図３と４は、アクリジンオレンジ染色した
培養胸部癌細胞系統、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（図３）
と、アクリジンオレンジ染色した培養結腸癌細胞系統、
ＨＴ−２９（図４）との形態学的外観の記録された画像
を示す、これらの培養癌細胞系統は凝血防止された全血
のそれぞれ１００μｌサンプルに加えた。次に、スパイ
クされた(spiked)血液サンプルを本発明の方法によって
分析した。血液サンプル分析は、血液サンプル中の培養
胸部癌細胞と培養結腸癌細胞とを確実にかつ再現可能に
同定した。これらの細胞は一般に、血小板−血漿界面近
くの血小板層中に見られた。サンプル中の現場で行われ
た強調細胞の目視分析は、それらが悪性であることを実
証した。
培養胸部癌細胞系統、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（図３）
と、アクリジンオレンジ染色した培養結腸癌細胞系統、
ＨＴ−２９（図４）との形態学的外観の記録された画像
を示す、これらの培養癌細胞系統は凝血防止された全血
のそれぞれ１００μｌサンプルに加えた。次に、スパイ
クされた(spiked)血液サンプルを本発明の方法によって
分析した。血液サンプル分析は、血液サンプル中の培養
胸部癌細胞と培養結腸癌細胞とを確実にかつ再現可能に
同定した。これらの細胞は一般に、血小板−血漿界面近
くの血小板層中に見られた。サンプル中の現場で行われ
た強調細胞の目視分析は、それらが悪性であることを実
証した。
【００３９】図５は、低濃度の培養ＨＴ−２９癌細胞を
ドープされた１００μｌの血液サンプル中に単離され
た、単一のかなり大きいアクリジンオレンジ染色したＨ
Ｔ−２９結腸癌細胞の記録された画像である。癌細胞の
右の明色層は血液サンプル中の遠心分離された血小板層
の界面である。この画像は５００Ｘ倍率で記録された。
サンプル中の現場で行われた強調細胞の目視分析は、そ
れらが悪性であることを実証した。
ドープされた１００μｌの血液サンプル中に単離され
た、単一のかなり大きいアクリジンオレンジ染色したＨ
Ｔ−２９結腸癌細胞の記録された画像である。癌細胞の
右の明色層は血液サンプル中の遠心分離された血小板層
の界面である。この画像は５００Ｘ倍率で記録された。
サンプル中の現場で行われた強調細胞の目視分析は、そ
れらが悪性であることを実証した。
【００４０】図６は、図５と同様な、但し、Ｅ−ｃａｄ
ｈｅｒｉｎ／Ｃｙ３フィルターセットを通して検査した
場合に出現したような単離ＨＴ−２９結腸癌細胞を示す
図である。視野中の他の全ての細胞は強調されていない
が、ＨＴ−２９結腸癌細胞は明確に目視可能であること
が認められるので、このことは大きな細胞が上皮細胞で
あるという事実を実証した。サンプル中の現場で行われ
た強調細胞の目視分析は、それが悪性であることを実証
した。
ｈｅｒｉｎ／Ｃｙ３フィルターセットを通して検査した
場合に出現したような単離ＨＴ−２９結腸癌細胞を示す
図である。視野中の他の全ての細胞は強調されていない
が、ＨＴ−２９結腸癌細胞は明確に目視可能であること
が認められるので、このことは大きな細胞が上皮細胞で
あるという事実を実証した。サンプル中の現場で行われ
た強調細胞の目視分析は、それが悪性であることを実証
した。
【００４１】図７は、培養癌細胞の大きな集団が血液サ
ンプルに加えられた場合に、２００Ｘ倍率で撮影された
アクリジンオレンジ染色した培養ＨＴ−２９結腸癌細胞
の記録された画像を示す。大きな集団の結腸癌細胞によ
って、癌細胞が血小板層全体に広く分布しているのが見
られ、幾つかの位置に、１つの位置はリンパ球−血小板
界面に、もう１つの位置は血小板−血漿界面に集中して
いた。サンプル中の現場で行われた強調細胞の目視分析
は、それが悪性であることを実証した。
ンプルに加えられた場合に、２００Ｘ倍率で撮影された
アクリジンオレンジ染色した培養ＨＴ−２９結腸癌細胞
の記録された画像を示す。大きな集団の結腸癌細胞によ
って、癌細胞が血小板層全体に広く分布しているのが見
られ、幾つかの位置に、１つの位置はリンパ球−血小板
界面に、もう１つの位置は血小板−血漿界面に集中して
いた。サンプル中の現場で行われた強調細胞の目視分析
は、それが悪性であることを実証した。
【００４２】図８は、図７と同様な、但し、強調細胞の
上皮起源を実証する、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ／Ｃｙ３染
色結腸癌細胞の記録された画像を示す図である。サンプ
ル中の現場で行われた強調細胞の目視分析は、それらが
悪性であることを実証した。
上皮起源を実証する、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ／Ｃｙ３染
色結腸癌細胞の記録された画像を示す図である。サンプ
ル中の現場で行われた強調細胞の目視分析は、それらが
悪性であることを実証した。
【００４３】図９と１０とは、血液サンプルに加えら
れ、１０Ｘ倍率で撮影されたアクリジンオレンジ染色し
た培養ＨＴ−２９結腸癌細胞の記録された画像を示す。
癌細胞が血小板−血漿界面近くに集中しているのが見ら
れた。図９はアクリジンオレンジによって形態学的に強
調された癌細胞を示し、図１０はＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ
／Ｃｙ３によってエピトープ的に強調された癌細胞を示
す。したがって、図９は遠心分離済み血液サンプルの血
小板層に隣接した血漿層中の有核細胞の存在を実証し；
図１０は、検出された有核細胞のうちのある一定の有核
細胞が上皮細胞であることを実証する。サンプル中の現
場で行われた強調細胞の目視分析は、それらが悪性であ
ることを実証した。
れ、１０Ｘ倍率で撮影されたアクリジンオレンジ染色し
た培養ＨＴ−２９結腸癌細胞の記録された画像を示す。
癌細胞が血小板−血漿界面近くに集中しているのが見ら
れた。図９はアクリジンオレンジによって形態学的に強
調された癌細胞を示し、図１０はＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ
／Ｃｙ３によってエピトープ的に強調された癌細胞を示
す。したがって、図９は遠心分離済み血液サンプルの血
小板層に隣接した血漿層中の有核細胞の存在を実証し；
図１０は、検出された有核細胞のうちのある一定の有核
細胞が上皮細胞であることを実証する。サンプル中の現
場で行われた強調細胞の目視分析は、それらが悪性であ
ることを実証した。
【００４４】図１１と１２は、転移胸部癌に罹患してい
ると知られた患者から採取された血液サンプル中のアク
リジンオレンジ染色した循環胸部癌細胞の記録された画
像を示す。癌細胞が血小板−血漿界面近くに集中してい
るのが見られた。図１１はアクリジンオレンジによって
形態学的に強調された癌細胞を示し、図１２はＥ−ｃａ
ｄｈｅｒｉｎ／Ｃｙ３によってエピトープ的に強調され
た癌細胞を示す。したがって、図１１は遠心分離済み血
液サンプルの血小板層に隣接した血漿層中の有核細胞の
存在を実証し；図１２は、検出された有核細胞のうちの
ある一定の有核細胞が上皮細胞であることを実証する。
サンプル中の現場で行われた強調細胞の目視分析は、そ
れらが悪性であることを実証した。
ると知られた患者から採取された血液サンプル中のアク
リジンオレンジ染色した循環胸部癌細胞の記録された画
像を示す。癌細胞が血小板−血漿界面近くに集中してい
るのが見られた。図１１はアクリジンオレンジによって
形態学的に強調された癌細胞を示し、図１２はＥ−ｃａ
ｄｈｅｒｉｎ／Ｃｙ３によってエピトープ的に強調され
た癌細胞を示す。したがって、図１１は遠心分離済み血
液サンプルの血小板層に隣接した血漿層中の有核細胞の
存在を実証し；図１２は、検出された有核細胞のうちの
ある一定の有核細胞が上皮細胞であることを実証する。
サンプル中の現場で行われた強調細胞の目視分析は、そ
れらが悪性であることを実証した。
【００４５】図１３と１４は、前立腺癌に罹患している
と知られた患者から採取された血液サンプル中のアクリ
ジンオレンジ染色した循環前立腺癌細胞の記録された画
像を示す。癌細胞が血小板−血漿界面近くに集中してい
るのが見られた。図１３はアクリジンオレンジによって
形態学的に強調された癌細胞を示し、図１４はＥ−ｃａ
ｄｈｅｒｉｎ／Ｃｙ３によってエピトープ的に強調され
た癌細胞を示す。したがって、図１３は遠心分離済み血
液サンプルの血小板層に隣接した血漿層中の有核細胞の
存在を実証し；図１４は、検出された有核細胞のうちの
ある一定の有核細胞が上皮細胞であることを実証する。
サンプル中の現場で行われた強調細胞の目視分析は、そ
れらが悪性であることを実証した。全ての細胞がＣｙ３
マーカーによって強調されるとは限らないという事実
は、エピトープ的に強調された細胞が起源において上皮
であることを実証する内部陰性対照(internal negative
control) を提供する。非エピトープ的に強調された有
核細胞はリンパ球である。
と知られた患者から採取された血液サンプル中のアクリ
ジンオレンジ染色した循環前立腺癌細胞の記録された画
像を示す。癌細胞が血小板−血漿界面近くに集中してい
るのが見られた。図１３はアクリジンオレンジによって
形態学的に強調された癌細胞を示し、図１４はＥ−ｃａ
ｄｈｅｒｉｎ／Ｃｙ３によってエピトープ的に強調され
た癌細胞を示す。したがって、図１３は遠心分離済み血
液サンプルの血小板層に隣接した血漿層中の有核細胞の
存在を実証し；図１４は、検出された有核細胞のうちの
ある一定の有核細胞が上皮細胞であることを実証する。
サンプル中の現場で行われた強調細胞の目視分析は、そ
れらが悪性であることを実証した。全ての細胞がＣｙ３
マーカーによって強調されるとは限らないという事実
は、エピトープ的に強調された細胞が起源において上皮
であることを実証する内部陰性対照(internal negative
control) を提供する。非エピトープ的に強調された有
核細胞はリンパ球である。
【００４６】上記分析の感度を調べるために、さらに実
験をおこなった。標準“ＱＢＣ”毛細管は、１Ｘ１０9
赤血球（ＲＢＣ）と１Ｘ１０6 有核細胞（顆粒球、リン
パ球等）を含有する１００μｌの血液を保持する。した
がって、試験の規模を変えないならば、感度の理論的限
界は１Ｘ１０6 の有核細胞中に１細胞である。ＨＴ−２
９結腸癌細胞の連続希釈を用いて、１〜１０細胞を含有
する又は１０〜１００細胞を含有するペアを含有する多
重ペアの(multiple paired) １０μｌアリコートを得
た。ペアの第１アリコートを“ＱＢＣ”管に加え、第２
アリコートを標準血球計によって計数した。これらの実
験は、１１０μｌ管を用いて、この分析の感度の限界が
１Ｘ１０6 の有核細胞中に１細胞の理論的限界に接近す
るという結論を生じた。１ｍｌの血液サンプリング管内
で分析を行うことによって、この試験の感度を理論的に
１０倍まで高めることができる。
験をおこなった。標準“ＱＢＣ”毛細管は、１Ｘ１０9
赤血球（ＲＢＣ）と１Ｘ１０6 有核細胞（顆粒球、リン
パ球等）を含有する１００μｌの血液を保持する。した
がって、試験の規模を変えないならば、感度の理論的限
界は１Ｘ１０6 の有核細胞中に１細胞である。ＨＴ−２
９結腸癌細胞の連続希釈を用いて、１〜１０細胞を含有
する又は１０〜１００細胞を含有するペアを含有する多
重ペアの(multiple paired) １０μｌアリコートを得
た。ペアの第１アリコートを“ＱＢＣ”管に加え、第２
アリコートを標準血球計によって計数した。これらの実
験は、１１０μｌ管を用いて、この分析の感度の限界が
１Ｘ１０6 の有核細胞中に１細胞の理論的限界に接近す
るという結論を生じた。１ｍｌの血液サンプリング管内
で分析を行うことによって、この試験の感度を理論的に
１０倍まで高めることができる。
【００４７】外形計測的分析は癌細胞を同定するために
充分でありうるが、他の実証方法も必要になる可能性が
ある。本発明の分析は、この分析が異常な細胞形態を検
出することができ、同時に、血液サンプル中に認められ
た異常な有核細胞の上皮起源又は血液学的前駆体起源を
実証することもできるという事実を利用する。本発明の
分析は細胞に対して非破壊的であるので、例えば先行技
術に述べられているＰＣＲ方法のような他の方法による
又は生化学的アッセイによる他の分析のために、細胞を
サンプリング管から取り出すことができる。
充分でありうるが、他の実証方法も必要になる可能性が
ある。本発明の分析は、この分析が異常な細胞形態を検
出することができ、同時に、血液サンプル中に認められ
た異常な有核細胞の上皮起源又は血液学的前駆体起源を
実証することもできるという事実を利用する。本発明の
分析は細胞に対して非破壊的であるので、例えば先行技
術に述べられているＰＣＲ方法のような他の方法による
又は生化学的アッセイによる他の分析のために、細胞を
サンプリング管から取り出すことができる。
【００４８】１例として、本発明者等はＥ−ｃａｄｈｅ
ｒｉｎを選択したが、その理由はこの抗原が上皮細胞に
非常に特異的であり、細胞膜の外面上に提示されるから
である。これらの試験のために、本発明者等はＣｙ３を
用いた、Ｃｙ３はシアナミンに基づく発蛍光団であり、
Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎモノクローナル抗体に直接コンジ
ュゲートして、細胞染色をアクリジンオレンジ誘導蛍光
を用いる外形計測的検査に用いられる波長以外の波長に
おいて可視化することができるからである。
ｒｉｎを選択したが、その理由はこの抗原が上皮細胞に
非常に特異的であり、細胞膜の外面上に提示されるから
である。これらの試験のために、本発明者等はＣｙ３を
用いた、Ｃｙ３はシアナミンに基づく発蛍光団であり、
Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎモノクローナル抗体に直接コンジ
ュゲートして、細胞染色をアクリジンオレンジ誘導蛍光
を用いる外形計測的検査に用いられる波長以外の波長に
おいて可視化することができるからである。
【００４９】本発明の方法を用いて、凝血防止された全
血の遠心分離済みサンプル中で、悪性有核上皮細胞を外
形計測的に同定することができることを、本発明者等は
実証している。管アセンブリ内の現場で、血液サンプル
中で可視化することができる適当な外形計測的基準は、
特に、細胞内の核／細胞質比率；細胞内の核サイズと形
状；細胞内の核クロマチン・パターン；核膜の厚さとサ
イズ；及び核小体の数とサイズを包含する。上皮癌細胞
と血液学的前駆細胞とが血液サンプル中にサイズによっ
て沈降することによるよりもむしろ、遠心分離済み凝血
防止された全血サンプル中で密度によって層を形成する
ことも、本発明者等は確認している。この確認は、遠心
分離済み血液サンプル中の予め定められ、知られている
帯中、即ち、遠心分離済み血液サンプル中の血小板が層
を形成する帯中で、循環癌細胞及び／又は血液学的前駆
細胞の検出を可能にする。循環癌細胞及び／又は血液学
的前駆細胞が血液サンプル中でサイズによって沈殿した
ならば、癌細胞及び／又は血液学的前駆細胞が検出され
ると予想される“問題の帯”を定義することはできない
と考えられる。癌細胞及び／又は血液学的前駆細胞は主
として血小板／血漿界面近く；リンパ球／血小板界面近
くの血小板層中で；又は人為的に過負荷な(artificiall
y over-loaded)場合にリンパ球層中に、全て、血液サン
プル中の癌細胞及び／又は血液学的前駆細胞の濃度に依
存して、検出されている。１Ｘ１０6有核細胞を含有す
る１００μｌ毛細管を用いる場合に、本発明の方法の理
論的感度は、１００μｌ血液サンプル中の１Ｘ１０6 有
核血液細胞中で１個の検出癌細胞及び／又は血液学的前
駆細胞が得られるような感度である。上述したように、
理論的感度の１０倍の上昇は、血液サンプル量が約１ｍ
ｌまで１０倍に増加したならば達成されるべきである。
血液サンプル中の癌細胞及び／又は血液学的前駆細胞の
起源の確認は疑わしい細胞の免疫蛍光標識によって実証
されることができる。したがって、細胞の目視検査は、
細胞が癌の外形計測的特徴を表示するかどうかを判定
し、免疫蛍光は検査される疑わしい細胞の起源を実証す
る。
血の遠心分離済みサンプル中で、悪性有核上皮細胞を外
形計測的に同定することができることを、本発明者等は
実証している。管アセンブリ内の現場で、血液サンプル
中で可視化することができる適当な外形計測的基準は、
特に、細胞内の核／細胞質比率；細胞内の核サイズと形
状；細胞内の核クロマチン・パターン；核膜の厚さとサ
イズ；及び核小体の数とサイズを包含する。上皮癌細胞
と血液学的前駆細胞とが血液サンプル中にサイズによっ
て沈降することによるよりもむしろ、遠心分離済み凝血
防止された全血サンプル中で密度によって層を形成する
ことも、本発明者等は確認している。この確認は、遠心
分離済み血液サンプル中の予め定められ、知られている
帯中、即ち、遠心分離済み血液サンプル中の血小板が層
を形成する帯中で、循環癌細胞及び／又は血液学的前駆
細胞の検出を可能にする。循環癌細胞及び／又は血液学
的前駆細胞が血液サンプル中でサイズによって沈殿した
ならば、癌細胞及び／又は血液学的前駆細胞が検出され
ると予想される“問題の帯”を定義することはできない
と考えられる。癌細胞及び／又は血液学的前駆細胞は主
として血小板／血漿界面近く；リンパ球／血小板界面近
くの血小板層中で；又は人為的に過負荷な(artificiall
y over-loaded)場合にリンパ球層中に、全て、血液サン
プル中の癌細胞及び／又は血液学的前駆細胞の濃度に依
存して、検出されている。１Ｘ１０6有核細胞を含有す
る１００μｌ毛細管を用いる場合に、本発明の方法の理
論的感度は、１００μｌ血液サンプル中の１Ｘ１０6 有
核血液細胞中で１個の検出癌細胞及び／又は血液学的前
駆細胞が得られるような感度である。上述したように、
理論的感度の１０倍の上昇は、血液サンプル量が約１ｍ
ｌまで１０倍に増加したならば達成されるべきである。
血液サンプル中の癌細胞及び／又は血液学的前駆細胞の
起源の確認は疑わしい細胞の免疫蛍光標識によって実証
されることができる。したがって、細胞の目視検査は、
細胞が癌の外形計測的特徴を表示するかどうかを判定
し、免疫蛍光は検査される疑わしい細胞の起源を実証す
る。
【００５０】上記方法及び装置が癌細胞の有無に関して
患者をスクリーニングするために使用可能であり；悪性
腫瘍のステージングの評価に使用可能であり；癌に関し
て治療される患者に対する化学療法の効果を評価するた
めに使用可能であり；血液サンプル中の血液学的前駆細
胞を同定し、計数するために使用可能であることは理解
されるであろう。血液学的前駆細胞及び癌細胞の検出と
計数とは、幹細胞回収と、回収された幹細胞からの癌細
胞のパージングとのために臨床的に重要である。化学療
法の効果を評価するための手段としての本発明の使用
は、現在、腫瘍のサイズをモニターするために用いられ
ているＣＡＴスキャニング、Ｘ線等よりも、療法を評価
するために非常に大きく敏感で、かつ迅速な方法を提供
する。化学療法の効果は血液サンプル中の癌細胞の数を
計数することによって評価することができる。計数方法
は管の充分に画定された帯の全円周を通して行うことが
できる、又は管の上記帯の円周の一部のみを通して行う
ことができる。後者のアプローチを採用する場合に、サ
ンプル中の癌細胞数は下記式を解くことによって推定す
ることができる：
患者をスクリーニングするために使用可能であり；悪性
腫瘍のステージングの評価に使用可能であり；癌に関し
て治療される患者に対する化学療法の効果を評価するた
めに使用可能であり；血液サンプル中の血液学的前駆細
胞を同定し、計数するために使用可能であることは理解
されるであろう。血液学的前駆細胞及び癌細胞の検出と
計数とは、幹細胞回収と、回収された幹細胞からの癌細
胞のパージングとのために臨床的に重要である。化学療
法の効果を評価するための手段としての本発明の使用
は、現在、腫瘍のサイズをモニターするために用いられ
ているＣＡＴスキャニング、Ｘ線等よりも、療法を評価
するために非常に大きく敏感で、かつ迅速な方法を提供
する。化学療法の効果は血液サンプル中の癌細胞の数を
計数することによって評価することができる。計数方法
は管の充分に画定された帯の全円周を通して行うことが
できる、又は管の上記帯の円周の一部のみを通して行う
ことができる。後者のアプローチを採用する場合に、サ
ンプル中の癌細胞数は下記式を解くことによって推定す
ることができる：
【００５１】Ｃ＝Ｎ（３６０゜／ｄ）÷Ｖ 式中、“Ｃ”は結果の細胞濃度であり；“Ｎ”は計数さ
れた標的細胞数であり；“ｄ”は標的細胞に関して検査
される管の回転度であり、除数“Ｖ”はサンプリング管
の容積である。細胞計数は測光法カウンターを用いて行
うことができる、又は視覚によって行うことができる。
測光法アプローチは癌細胞及び／又は血液学的前駆細胞
又は他の非癌細胞を示差的に強調するエピトープ・ラベ
ルの組合せを用いることができる。この方法で、強調さ
れた細胞及び／又は強調されない細胞が計数される。外
形計測的分析は測光法的に行うこともできる。この目視
アプローチは例えばアクリジンオレンジのような外形計
測的ステイン又は上記で同定したような他の外形計測的
ステインを用いることができる。
れた標的細胞数であり；“ｄ”は標的細胞に関して検査
される管の回転度であり、除数“Ｖ”はサンプリング管
の容積である。細胞計数は測光法カウンターを用いて行
うことができる、又は視覚によって行うことができる。
測光法アプローチは癌細胞及び／又は血液学的前駆細胞
又は他の非癌細胞を示差的に強調するエピトープ・ラベ
ルの組合せを用いることができる。この方法で、強調さ
れた細胞及び／又は強調されない細胞が計数される。外
形計測的分析は測光法的に行うこともできる。この目視
アプローチは例えばアクリジンオレンジのような外形計
測的ステイン又は上記で同定したような他の外形計測的
ステインを用いることができる。
【００５２】循環血液中の癌細胞を診断し、計数するた
めの“ＱＢＣ”方法と装置の、ＦＡＣＳ及び分子的方法
を凌駕する利点は、（１）血液分析を行うために必要な
時間が比較的短時間；（２）系を標準実験室装置に統合
することができ、全ての病理学者が過度な訓練なしに用
いることができるという事実；（３）流体媒質中で非固
定細胞を検査することができ、固定アーチファクト(fix
ation artifacts)を省略することができること；（４）
分析の実施に比較的少量の血液のみが必要であること；
（５）この方法は、１０6 〜１０7 正常有核細胞を含有
するサンプル中で１個の癌細胞を検出することができる
点で、分子的方法と同様な感度であること；（６）“Ｑ
ＢＣ”方法は閉鎖サンプリング及び分析系を用いるの
で、分子的方法において主要な問題である交差汚染を排
除することができるという事実；（７）ルーチンの細胞
学的方法で用いられる固定ステイン中でフローティング
(floating)細胞を汚染することによる細胞汚染の回避；
及び（８）本発明の方法は、分析を行う技術者が分析さ
れるべき血液サンプルに暴露されないので、このような
技術者に対して安全であること；を包含する。
めの“ＱＢＣ”方法と装置の、ＦＡＣＳ及び分子的方法
を凌駕する利点は、（１）血液分析を行うために必要な
時間が比較的短時間；（２）系を標準実験室装置に統合
することができ、全ての病理学者が過度な訓練なしに用
いることができるという事実；（３）流体媒質中で非固
定細胞を検査することができ、固定アーチファクト(fix
ation artifacts)を省略することができること；（４）
分析の実施に比較的少量の血液のみが必要であること；
（５）この方法は、１０6 〜１０7 正常有核細胞を含有
するサンプル中で１個の癌細胞を検出することができる
点で、分子的方法と同様な感度であること；（６）“Ｑ
ＢＣ”方法は閉鎖サンプリング及び分析系を用いるの
で、分子的方法において主要な問題である交差汚染を排
除することができるという事実；（７）ルーチンの細胞
学的方法で用いられる固定ステイン中でフローティング
(floating)細胞を汚染することによる細胞汚染の回避；
及び（８）本発明の方法は、分析を行う技術者が分析さ
れるべき血液サンプルに暴露されないので、このような
技術者に対して安全であること；を包含する。
【００５３】図面に示した特定のインサート及び管は円
筒形であるが、これらを多角形に作成することもでき
る。管及びインサートの横断形態に関する唯一の限定要
素は、それらが相互にコンプリメンタリー(complimenta
ry) であることである。血液サンプルの分析は、好まし
くはＣＣＤカメラを装備した顕微鏡機器によって適当に
拡大して行われる。管内に、管とインサートとの間に形
成されるギャップは、個々の標的細胞がギャップ内で単
離され、容易に認識され、計数され、外形計測的に分析
されることができるような横断サイズを有する(transve
rsely sized)。このギャップの横断厚さ(transverse th
ickness)は、ギャップの分析に用いられる顕微鏡機器の
焦点操作範囲内でもある。
筒形であるが、これらを多角形に作成することもでき
る。管及びインサートの横断形態に関する唯一の限定要
素は、それらが相互にコンプリメンタリー(complimenta
ry) であることである。血液サンプルの分析は、好まし
くはＣＣＤカメラを装備した顕微鏡機器によって適当に
拡大して行われる。管内に、管とインサートとの間に形
成されるギャップは、個々の標的細胞がギャップ内で単
離され、容易に認識され、計数され、外形計測的に分析
されることができるような横断サイズを有する(transve
rsely sized)。このギャップの横断厚さ(transverse th
ickness)は、ギャップの分析に用いられる顕微鏡機器の
焦点操作範囲内でもある。
【００５４】本発明の方法が、その最も広い意味で、一
般的に円筒形のインサートをも含有する管中に含有され
る凝血防止された全血の遠心分離済みサンプル中の個々
の循環標的有核細胞の有無を検出することを含む。イン
サートは管中に充分に画定された環状帯を形成する。血
液サンプルに、標的有核細胞上に特徴的なシグナル結果
を生じるために使用可能である、１種類以上のエピトー
プ特異的標識剤を混合する、前記結果はシグナルが全く
ないことを包含することができ、標的有核細胞上の１種
類以上のエピトープの有無を明示する。血液サンプルに
血液サンプル中の全ての有核細胞の細胞形態を明確にす
るために使用可能である着色剤をも混合する。このよう
にして、循環有核細胞は細胞形態によって同定され、そ
れらの形態によって標的細胞でありうる、全ての同定さ
れた有核細胞はさらにエピトープによって標的細胞とし
て又は非標的細胞として特徴付けられる。さらに詳しい
説明のために、エピトープ“Ａ”と“Ｂ”の特定の組合
せが標的細胞に特徴的であり、血液サンプル中の他の細
胞に特徴的ではないと想定する。これらのエピトープの
一方のみの有無；又はこれらのエピトープの両方の有無
は標的細胞に特徴的でありうる。したがって、４種類の
異なる各エピトープ特異的標識剤のシグナル結果：Ａあ
り、Ｂなし；Ｂあり、Ａなし；ＡとＢの両方あり；又は
Ａなし、Ｂなし；のいずれかを用いて、標的細胞を特徴
付けることができる。同定工程と特徴付け工程とは管内
で現場で行うことができる。明らかに、２種類の異なる
エピトープより多い又は少ないエピトープを標的細胞の
特徴付けに用いることができる。
般的に円筒形のインサートをも含有する管中に含有され
る凝血防止された全血の遠心分離済みサンプル中の個々
の循環標的有核細胞の有無を検出することを含む。イン
サートは管中に充分に画定された環状帯を形成する。血
液サンプルに、標的有核細胞上に特徴的なシグナル結果
を生じるために使用可能である、１種類以上のエピトー
プ特異的標識剤を混合する、前記結果はシグナルが全く
ないことを包含することができ、標的有核細胞上の１種
類以上のエピトープの有無を明示する。血液サンプルに
血液サンプル中の全ての有核細胞の細胞形態を明確にす
るために使用可能である着色剤をも混合する。このよう
にして、循環有核細胞は細胞形態によって同定され、そ
れらの形態によって標的細胞でありうる、全ての同定さ
れた有核細胞はさらにエピトープによって標的細胞とし
て又は非標的細胞として特徴付けられる。さらに詳しい
説明のために、エピトープ“Ａ”と“Ｂ”の特定の組合
せが標的細胞に特徴的であり、血液サンプル中の他の細
胞に特徴的ではないと想定する。これらのエピトープの
一方のみの有無；又はこれらのエピトープの両方の有無
は標的細胞に特徴的でありうる。したがって、４種類の
異なる各エピトープ特異的標識剤のシグナル結果：Ａあ
り、Ｂなし；Ｂあり、Ａなし；ＡとＢの両方あり；又は
Ａなし、Ｂなし；のいずれかを用いて、標的細胞を特徴
付けることができる。同定工程と特徴付け工程とは管内
で現場で行うことができる。明らかに、２種類の異なる
エピトープより多い又は少ないエピトープを標的細胞の
特徴付けに用いることができる。
【００５５】本発明の開示した実施態様の多くの変化及
び変更が本発明の要旨から逸脱せずに行われうるので、
本発明を請求の範囲によって要求される以外に限定する
ことは意図されない。
び変更が本発明の要旨から逸脱せずに行われうるので、
本発明を請求の範囲によって要求される以外に限定する
ことは意図されない。
【図１】本発明の方法を実施するために用いることがで
きる管及びフロート装置アセンブリの側面図。
きる管及びフロート装置アセンブリの側面図。
【図２】本発明の方法を実施するために図１の装置と組
合せて用いるために適した自動化顕微鏡機器アセンブリ
の概略図。
合せて用いるために適した自動化顕微鏡機器アセンブリ
の概略図。
【図３】アクリジンオレンジ染色した、凝血防止された
全血サンプルに加えられ、遠心分離済み血液サンプル中
で単離、視覚によって同定及び視覚によって確認された
培養胸部癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８）を適当な形状
の顕微鏡機器アセンブリ中の１０Ｘ対物レンズを用い
て、撮影した顕微鏡写真のグラフィック図。
全血サンプルに加えられ、遠心分離済み血液サンプル中
で単離、視覚によって同定及び視覚によって確認された
培養胸部癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８）を適当な形状
の顕微鏡機器アセンブリ中の１０Ｘ対物レンズを用い
て、撮影した顕微鏡写真のグラフィック図。
【図４】アクリジンオレンジ染色した、凝血防止された
全血サンプルに加えられ、遠心分離済み血液サンプルを
含有する管中で現場で単離、視覚によって同定及び視覚
によって確認されたＨＴ−２９結腸癌細胞を適当な形状
の顕微鏡機器アセンブリ中の１０Ｘ対物レンズを用い
て、撮影した顕微鏡写真のグラフィック図。
全血サンプルに加えられ、遠心分離済み血液サンプルを
含有する管中で現場で単離、視覚によって同定及び視覚
によって確認されたＨＴ−２９結腸癌細胞を適当な形状
の顕微鏡機器アセンブリ中の１０Ｘ対物レンズを用い
て、撮影した顕微鏡写真のグラフィック図。
【図５】アクリジンオレンジ染色した、凝血防止された
全血サンプルに加えられ、遠心分離済み血液サンプルを
含有する管中で現場で単離、視覚によって同定及び視覚
によって確認された単一培養ＨＴ−２９結腸癌細胞を、
適当な形状の顕微鏡機器アセンブリ中でオイル中に浸漬
された５０Ｘ対物レンズを用いて、撮影した顕微鏡写真
のグラフィック図。
全血サンプルに加えられ、遠心分離済み血液サンプルを
含有する管中で現場で単離、視覚によって同定及び視覚
によって確認された単一培養ＨＴ−２９結腸癌細胞を、
適当な形状の顕微鏡機器アセンブリ中でオイル中に浸漬
された５０Ｘ対物レンズを用いて、撮影した顕微鏡写真
のグラフィック図。
【図６】アクリジンオレンジ染色した、凝血防止された
全血サンプル中の単一培養ＨＴ−２９結腸癌細胞であっ
て、遠心分離済み血液サンプル中でＣｙ３標識Ｅ−ｃａ
ｄｈｅｒｉｎによって強調された細胞をサンプリング管
中で現場で、適当な形状の顕微鏡機器アセンブリ中でオ
イル中に浸漬された５０Ｘ対物レンズを用いて、撮影し
た顕微鏡写真の、図５と同様なグラフィック図。
全血サンプル中の単一培養ＨＴ−２９結腸癌細胞であっ
て、遠心分離済み血液サンプル中でＣｙ３標識Ｅ−ｃａ
ｄｈｅｒｉｎによって強調された細胞をサンプリング管
中で現場で、適当な形状の顕微鏡機器アセンブリ中でオ
イル中に浸漬された５０Ｘ対物レンズを用いて、撮影し
た顕微鏡写真の、図５と同様なグラフィック図。
【図７】アクリジンオレンジ染色した、凝血防止された
全血サンプルに加えられ、単離、視覚によって検出及び
確認された培養ＨＴ−２９結腸癌細胞をサンプリング管
中で現場で、適当な形状の顕微鏡機器アセンブリ中でオ
イル中に浸漬された２００Ｘ対物レンズを用いて、撮影
した顕微鏡写真のグラフィック図。
全血サンプルに加えられ、単離、視覚によって検出及び
確認された培養ＨＴ−２９結腸癌細胞をサンプリング管
中で現場で、適当な形状の顕微鏡機器アセンブリ中でオ
イル中に浸漬された２００Ｘ対物レンズを用いて、撮影
した顕微鏡写真のグラフィック図。
【図８】アクリジンオレンジ染色した、凝血防止された
全血サンプルに加えられ、単離、視覚によって検出及び
確認された培養ＨＴ−２９結腸癌細胞を適当な形状の顕
微鏡機器アセンブリ中でオイル中に浸漬された２００Ｘ
対物レンズを用いて、撮影した顕微鏡写真の図７と同様
なグラフィック図、この癌細胞は遠心分離済み血液サン
プル中でＣｙ３標識Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎによって強調
されたものである。
全血サンプルに加えられ、単離、視覚によって検出及び
確認された培養ＨＴ−２９結腸癌細胞を適当な形状の顕
微鏡機器アセンブリ中でオイル中に浸漬された２００Ｘ
対物レンズを用いて、撮影した顕微鏡写真の図７と同様
なグラフィック図、この癌細胞は遠心分離済み血液サン
プル中でＣｙ３標識Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎによって強調
されたものである。
【図９】アクリジンオレンジ染色した、凝血防止された
全血サンプルに加えられ、遠心分離済み血液サンプル中
で単離され、２００Ｘ倍率で視覚によって同定され、視
覚によって確認された培養ＨＴ−２９結腸癌細胞を撮影
した顕微鏡写真のグラフィック図。
全血サンプルに加えられ、遠心分離済み血液サンプル中
で単離され、２００Ｘ倍率で視覚によって同定され、視
覚によって確認された培養ＨＴ−２９結腸癌細胞を撮影
した顕微鏡写真のグラフィック図。
【図１０】アクリジンオレンジ染色した、凝血防止され
た全血サンプル中の培養ＨＴ−２９結腸癌細胞を２００
Ｘ倍率で撮影した顕微鏡写真の、図９と同様なグラフィ
ック図、この癌細胞は遠心分離済み血液サンプル中でＣ
ｙ３標識Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎによって強調されたもの
である。
た全血サンプル中の培養ＨＴ−２９結腸癌細胞を２００
Ｘ倍率で撮影した顕微鏡写真の、図９と同様なグラフィ
ック図、この癌細胞は遠心分離済み血液サンプル中でＣ
ｙ３標識Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎによって強調されたもの
である。
【図１１】転移胸部癌を有することが知られた患者から
採取された、アクリジンオレンジ染色した、凝血防止さ
れた全血サンプル中で検出され、遠心分離済み血液サン
プルを含有する管中で現場で、単離され、５０Ｘ対物レ
ンズを有する顕微鏡アセンブリを用いて視覚によって同
定され、視覚によって確認された循環胸部癌細胞を撮影
した顕微鏡写真のグラフィック図。
採取された、アクリジンオレンジ染色した、凝血防止さ
れた全血サンプル中で検出され、遠心分離済み血液サン
プルを含有する管中で現場で、単離され、５０Ｘ対物レ
ンズを有する顕微鏡アセンブリを用いて視覚によって同
定され、視覚によって確認された循環胸部癌細胞を撮影
した顕微鏡写真のグラフィック図。
【図１２】遠心分離済み血液サンプル中でＣｙ３標識Ｅ
−ｃａｄｈｅｒｉｎによって強調された循環胸部癌細胞
を示す、図１１と同様なグラフィック図。
−ｃａｄｈｅｒｉｎによって強調された循環胸部癌細胞
を示す、図１１と同様なグラフィック図。
【図１３】転移前立腺癌を有することが知られた患者か
ら採取され、遠心分離済み血液サンプルを含有する管中
で現場で、単離され、５００Ｘ倍率で視覚によって同定
され、視覚によって確認された循環前立腺癌細胞を撮影
した顕微鏡写真のグラフィック図。
ら採取され、遠心分離済み血液サンプルを含有する管中
で現場で、単離され、５００Ｘ倍率で視覚によって同定
され、視覚によって確認された循環前立腺癌細胞を撮影
した顕微鏡写真のグラフィック図。
【図１４】遠心分離済み血液サンプル中でＣｙ３標識Ｅ
−ｃａｄｈｅｒｉｎによって強調された循環前立腺癌細
胞を示す、図１３と同様なグラフィック図。
−ｃａｄｈｅｒｉｎによって強調された循環前立腺癌細
胞を示す、図１３と同様なグラフィック図。
２ サンプリング管 ４ インサート又はフロート ６ 下端部 １０ クロージャーキャップ １２ 機器アセンブリ １４ ステージ １６ 回転可能なサポート １８ 可逆的電気モーター ２０ ドライブ・スクリュー ２２ ＣＣＤカメラ ２４ ビーム・スプリッタ ２６ レンズ ２８ 発光波フィルター ３０ 発光波フィルター ３２ 発光波フィルター ３４ フィルター・ホイール ３５ 励起光源 ３６ 波長フィルター ３８ 波長フィルター ４０ 波長フィルター ４２ フィルター・ホイール ４４ 制御装置
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 スチーブン シー．ワードロウ アメリカ合衆国 コネチカット州オールド セイブルック，ノース コウブ ロード 191 (72)発明者 ロバート エイ．レビン アメリカ合衆国 コネチカット州ギルフォ ード，ピルグリム レーン 31 (72)発明者 ポール フィードラー アメリカ合衆国 コネチカット州ニュー ヘイブン，ジルノック ドライブ 90
Claims (14)
- 【請求項１】 凝血防止された全血サンプル中の循環す
る異常な標的有核細胞の有無の検出方法であって、 （ａ）一般に円筒形のインサートを含有する孔を有する
透明な管を用意し、前記管とインサートとを組合わせ
て、充分に画定された帯を管中に形成する工程と； （ｂ）血液サンプル中の如何なる異常な標的有核細胞を
も識別するために血液サンプルに１種類以上のエピトー
プ特異的な標識剤を混合する工程と； （ｃ）血液サンプル中の全ての有核細胞の細胞形態を明
確にするために使用可能である着色剤を血液サンプルに
混合する工程と； （ｄ）血液サンプルを管に入れ、管中の血液サンプルを
遠心分離して、血液サンプル中に存在する如何なる異常
な有核細胞をも管の前記充分に画定された帯中に密度に
よって下降させる工程と； （ｅ）管中の充分に画定された帯中に存在する如何なる
識別された細胞をも現場で計数する工程と； （ｆ）管中の充分に画定された帯中の如何なる識別され
た細胞の細胞形態をも現場で検査する工程とを含み、 （ｇ）前記混合工程が、血液サンプルを管中に入れる前
又は入れた後に行われ、 （ｈ）前記計数工程と検査工程とが不特定な順序で行わ
れる上記方法。 - 【請求項２】 管が管中に充分に画定された環状帯を形
成する一般に円筒形のインサートをも含有し、血液サン
プルが異常な標的有核細胞上の１種類以上のエピトープ
に特異的である１種類以上の標識剤を混合されたもので
あり、該血液サンプルが血液サンプル中の全ての有核細
胞の細胞形態を明確にするために使用可能である着色剤
をも混合されたものである、管中に含有される凝血防止
された全血の遠心分離済みサンプル中の循環する異常な
標的有核細胞の有無を検出する方法であって、管中の前
記充分に画定された環状帯中に配置される全ての標識細
胞の割合を現場で同定する工程と、管中のこのような同
定された細胞の細胞形態を現場で検査して、このような
同定された細胞が異常な細胞形態を示すか否かを決定す
る工程とを含む上記方法。 - 【請求項３】 サンプルが透明な管中に含有され、管が
一般に円筒形のインサートをも含有し、血液サンプルが
少なくとも１種類の上皮細胞エピトープに特異的である
少なくとも１種類の標識剤を混合されたものであり、該
血液サンプルが有核細胞の形態を明確にする着色剤をも
混合されたものである、凝血防止された全血の遠心分離
済みサンプル中の循環する上皮細胞を計数する方法であ
って、血液サンプル中の血小板が遠心分離中に下降して
いる管中の充分に画定された帯を検査する工程と、管中
の前記充分に画定された帯中に遠心分離中に細胞が密度
によって下降している管中の異常な形態を有する如何な
る標識上皮細胞をも現場で計数する工程とを含む上記方
法。 - 【請求項４】 凝血防止された全血サンプル中の血液学
的前駆細胞及び他の有核細胞から癌細胞を識別する方法
であって、 （ａ）管中に充分に画定された帯を形成するために使用
可能であるインサートをも含有する透明な管中に含有さ
れるサンプル中の癌細胞と血液学的前駆細胞とを相互か
ら及び他の有核細胞から識別するために使用可能である
エピトープ細胞標識物質を含有する、凝血防止された全
血サンプルを用意する工程と； （ｂ）血液サンプルをその構成成分に重量によって分離
させるため、及びサンプル中の通常の血液細胞ではない
如何なる有核細胞をも管中の前記充分に画定された帯中
に密度によって沈降させるために、管中の血液サンプル
を遠心分離する工程と； （ｃ）如何なる識別された有核細胞も管の前記充分に画
定された帯中に存在するかどうかを知るために、管中の
前記充分に画定された帯を検査する工程とを含む上記方
法。 - 【請求項５】 凝血防止された全血サンプル中の癌細胞
及び／又は血液学的前駆細胞を計数する方法であって、 （ａ）管中に充分に画定された帯を形成するために使用
可能であるインサートをも含有する透明な管中に含有さ
れるサンプル中の癌細胞と血液学的前駆細胞とを相互か
ら及び他の有核細胞から識別するために使用可能である
エピトープ細胞標識物質を含有する、凝血防止された全
血サンプルを用意する工程と； （ｂ）血液サンプルをその構成成分に重量によって分離
させるため、及びサンプル中の如何なる有核細胞をも管
の前記充分に画定された帯中に密度によって沈降させる
ために、管中の血液サンプルを遠心分離する工程と； （ｃ）如何なる識別された有核細胞も管の前記充分に画
定された帯中に存在するかどうかを知るために、管中の
前記充分に画定された帯を検査する工程と； （ｄ）管の前記充分に画定された帯中に存在することが
判明した如何なる癌細胞及び／又は血液学的前駆細胞を
も計数する工程とを含む上記方法。 - 【請求項６】 サンプル中の癌細胞及び／又は血液学的
前駆細胞の有無を判定するために、凝血防止された全血
サンプルを分析する方法であって、 （ａ）管中に充分に画定された帯を形成するために使用
可能であるインサートをも含有する透明な管中に含有さ
れるサンプル中の癌細胞と血液学的前駆細胞とを相互か
ら及び他の有核細胞から識別するために使用可能である
エピトープ細胞標識物質と、細胞形態を明確にするステ
インとを含有する、凝血防止された全血サンプルを用意
する工程と； （ｂ）血液サンプルをその構成成分に重量によって分離
させるため、及びサンプル中の血液細胞ではない如何な
る有核細胞をも管の前記充分に画定された帯中に密度に
よって堆積させるために、管中の血液サンプルを遠心分
離する工程と； （ｃ）如何なる識別された有核細胞も管の前記充分に画
定された帯中に存在するかどうかを確認するために、管
中の前記充分に画定された帯を検査する工程とを含む上
記方法。 - 【請求項７】 サンプルが、軸方向に細長いインサート
をも含有する透明な管中に含有されており、この血液サ
ンプルに少なくとも１種類の上皮細胞エピトープに特異
的である少なくとも１種類の標識剤が混合されている、
凝血防止された全血の遠心分離済みサンプル中の循環す
る上皮細胞を同定する方法であって、血液サンプル中の
血小板が遠心分離中に沈下している、管中の充分に画定
された帯を検査する工程と、管中のサンプルの遠心分離
中に標識細胞が管中の前記充分に画定された帯中に密度
によって沈下している管中の如何なる標識上皮細胞をも
現場で同定する工程とを含む上記方法。 - 【請求項８】 サンプルが、一般に円筒形のインサート
をも含有する透明な管中に含有されており、血液サンプ
ルに上皮細胞の細胞形態を明確にするためのステインを
混合されている、異常な循環上皮細胞に関して遠心分離
済みの凝血防止された血液サンプルを外形計測的に分析
する方法であって、血液サンプル中の血小板が遠心分離
中に沈下している、管中の充分に画定された帯を検査す
る工程と、管中のサンプルの遠心分離中に上皮細胞が管
中の前記充分に画定された帯中に密度によって沈下して
いる管中の如何なる上皮細胞をも現場で外形計測的に検
査して、如何なるこのような細胞も異常な形態を有する
かどうかを判定する工程とを含む上記方法。 - 【請求項９】 凝血防止された全血サンプル中の循環す
る異常な標的有核細胞の有無の検出方法であって、 （ａ）軸方向に円筒形のインサートを含有する孔を有す
る透明な管を用意し、前記管とインサートとを組合わせ
て、充分に画定された帯を管中に形成する工程と； （ｂ）血液サンプル中の如何なる異常な標的有核細胞を
も示差的に強調するために血液サンプルに１種類以上の
エピトープ特異的な標識剤を混合する工程と； （ｃ）血液サンプル中の全ての有核細胞の細胞形態を明
確にするために使用可能である着色剤を血液サンプルに
混合する工程と； （ｄ）血液サンプルを管に入れ、管中の血液サンプルを
遠心分離して、血液サンプル中に存在する如何なる異常
な有核細胞をも管の前記充分に画定された帯中に密度に
よって下降させる工程と； （ｅ）管の充分に画定された帯中に存在する如何なる標
識細胞をも現場で計数する工程と； （ｆ）管中の充分に画定された帯中の如何なる標識細胞
の細胞形態をも現場で検査する工程とを含み、 （ｇ）前記混合工程が、血液サンプルを管中に入れる前
又は入れた後に行われ、 （ｈ）前記計数工程と検査工程とが不特定な順序で行わ
れる上記方法。 - 【請求項１０】 前記計数工程と検査工程とが顕微鏡機
器によって行われる、請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】 前記充分に画定された帯が予め定めら
れた倍率における顕微鏡機器の焦点操作範囲に本質的に
等しい横断厚さを有する、請求項１０記載の方法。 - 【請求項１２】 前記横断厚さが約１０μ〜約１００μ
の範囲内である、請求項１１記載の方法。 - 【請求項１３】 凝血防止された全血サンプル中の循環
する異常な標的有核細胞の有無の検出方法であって、 （ａ）軸方向に細長いインサートを含有する孔を有する
透明な管を用意し、前記管とインサートとを組合わせ
て、少なくとも約１０μである横断厚さを有する、充分
に画定された帯を管中に形成する管を用意する工程と； （ｂ）血液サンプル中の如何なる異常な標的有核細胞を
も識別するために血液サンプルに１種類以上のエピトー
プ特異的な標識剤を混合する工程と； （ｃ）血液サンプル中の全ての有核細胞の細胞形態を明
確にするために使用可能である着色剤を血液サンプルに
混合する工程と； （ｄ）血液サンプルを管に入れ、管中の血液サンプルを
遠心分離して、血液サンプル中に存在する如何なる異常
な有核細胞をも管中の前記充分に画定された帯中に密度
によって沈下させる工程と； （ｅ）充分に画定された帯を拡大して検査し、管の充分
に画定された帯中に存在する如何なる識別された細胞を
も現場で計数する工程と； （ｆ）管中の充分に画定された帯中の如何なる識別され
た細胞の細胞形態をも現場で拡大して検査する工程とを
含み、 （ｇ）前記混合工程が、血液サンプルを管中に入れる前
又は入れた後に行われ、 （ｈ）前記計数工程と検査工程とが不特定な順序で行わ
れる上記方法。 - 【請求項１４】 管が管中に充分に画定された環状帯を
形成する一般に円筒形のインサートをも含有しており、
血液サンプルに標的有核細胞上に特徴的なシグナル結果
を生じるために使用可能である１種類以上のエピトープ
特異的な標識剤が混合されており、前記結果が全くシグ
ナルなしを含有することができ、標的有核細胞上の１種
類以上のエピトープの有無によって定義されるものであ
り、前記血液サンプルに血液サンプル中の全ての有核細
胞の細胞形態を明確にするために使用可能である着色剤
をも混合されている、管中の凝血防止された全血の遠心
分離済みサンプル中の循環する標的有核細胞の有無を検
出する方法であって、標的細胞であることができ、前記
充分に画定された環状帯に配置される全ての有核細胞を
細胞形態によって同定する工程と、全ての同定された有
核細胞を標的細胞又は非標的細胞としてさらに特徴付け
る工程とを含み、前記同定工程と特徴付け工程とが管中
で現場で行われる上記方法。
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