JPH11290071A - 抗ジンセノサイドＲｂ１モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ジンセノサイドＲｂ１の検出 【解決手段】 薬用人参固有の薬理作用を有する主要な
配糖体であるジンセノサイドＲｂ１(ＧＲｂ１)に対する
モノクローナル抗体およびそれを生産するハイブリドー
マ。このモノクロナール抗体を用いて各種人参のＧＲｂ
１を簡便に定量できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は薬用人参の主要な配
糖体であるジンセノサイドＲｂ１(ＧＲｂ１)に対するモ
ノクローナル抗体(ＭＡｂ)を産生するハイブリドーマお
よびそのＭＡｂに関する。

【０００２】

【従来の技術】細胞融合技術は、ケーラーとミルスタイ
ンの報告(Nature, 495-497頁、1975年)以来急速に発展
した。哺乳動物の脾臓細胞と癌細胞であるミエローマ細
胞を融合させた雑種細胞をハイブリドーマと称する。ハ
イブリドーマは用いた脾臓細胞が抗体産生能を有するこ
とから、多くの蛋白質やペプチド、ポリサッカライド、
糖蛋白の様な高分子化合物に対するＭＡｂの生産に用い
られてきた。しかし、人参の配糖体は低分子のため通常
抗原とはなりえないので、それに対するＭＡｂは作成さ
れていない。ジンセノサイドＲｂ１(ＧＲｂ１)(表−２
の構造式参照)は有用な薬理活性を有する人参の主要な
配糖体であり、医薬品としての候補化合物と目されてい
る物質である。しかしながら、人参中のＧＲｂ１の含有
量は少なく、その検出は容易ではない。ましてや漢方薬
中の含有量を精査するためには前処理等に多大な労力を
要する。このため前処理を必要とせず、再現性があり、
かつ高感度な評価方法が熱望されているが、未だ満足で
きる方法は見出されていない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明者等は、上述の
問題点を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ＧＲｂ１に
対するＭＡｂを用いることにより、人参中のジンセノサ
イド類を前処理を必要とせず高感度で再現性良く検出で
きることを見出し本発明を完成したものである。すなわ
ち、抗ＧＲｂ１ＭＡｂを生産する脾臓細胞とミエローマ
細胞をポリエチレングリコールで細胞融合により、ＧＲ
ｂ１に対するＭＡｂを産生するハイブリドーマを作成
し、このハイブリドーマを培養することによって抗ＧＲ
ｂ１ＭＡｂを大量に生産することができる。本抗体を用
いることによって高感度、再現性良好な、かつ前処理を
必要としない評価系を提供することが可能となった。

【０００４】

【課題を解決するための手段】抗ＧＲｂ１ＭＡｂを産生
するハイブリドーマは以下の様にして作成することがで
きる。 (１) 抗原としてＧＲｂ１−ＢＳＡ抱合体を作成し、こ
れで免疫した動物の抗体産生脾臓細胞を作成する。 (２) ミエローマ細胞を培養増殖し、調整する。 (３) 上記２種の細胞をポリエチレングリコールを媒体
として融合する。 (４) 得られたハイブリドーマをＨＡＴ培地にて選抜す
る。 (５) 抗ＧＲｂ１ＭＡｂ産生ハイブリドーマを選抜す
る。 (６) 選抜ハイブリドーマをクローニングする。 (７) 上記の抗体産生ハイブリドーマを培養して抗ＧＲ
ｂ１ＭＡｂを得る。 以下これらの工程について、詳細に説明する。

【０００５】(ａ) 抗体産生細胞の調整 抗原の調整： ＧＲｂ１を過ヨウ素酸ナトリウムで処理
し、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)を添加して、ＧＲｂ１
−ＢＳＡ抱合体(ｃｏｎｊｕｇａｔｅ)を得る。このＧＲ
ｂ１−ＢＳＡ抱合体で動物を免疫する。免疫法としては
フロイントのコンプリートアジュバンドを併用する手法
がとられる。動物としてはマウス、ラット、ウサギ、モ
ルモット、ヒツジなどが例示される。抗体産生細胞とし
ては脾臓、リンパ節、抹消血液等から分離した細胞が使
用される。 (ｂ) 骨髄腫細胞(ミエローマ細胞)の調整 細胞融合に使用するミエローマ細胞は特に限定されず、
各種の哺乳動物の細胞株が利用可能であるが、抗体産生
細胞の調整に用いた動物と同種の細胞株を使用するのが
好ましい。用いる細胞株は細胞融合の後に、未融合のミ
エローマ細胞が選択培地で生存できず、融合細胞である
ハイブリドーマのみが増殖可能なようにすることによっ
て、未融合細胞と融合細胞を選別することを考慮して、
特定の薬剤抵抗性を有するものが好ましい。例えば８−
アザグアニン抵抗性の細胞は、ＨＡＴ培地中で生育でき
ない性質を有するため好ましい。具体的には、マウスミ
エローマ細胞株、ＰＡＩ， Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８，
Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−ＵＩ， Ｐ３−ＮＳＩ／１−Ａ
ｇ４−１， Ｘ６３−Ａｇ８−６．５．３．， ＳＰ２
／０−Ａｇ１４， ＦＯ， Ｓ１９４／５ＸＸＯ， Ｂ
Ｕ．１， ＭＰＣ１１−４５．６．，ＴＧ．１．７等が
用いられる。

【０００６】(ｃ) 融合細胞 細胞融合は通常ＭＥＭ培地、ＲＭＩ１６４０培地、ＩＭ
ＤＭ培地等の培地中で、ミエローマ細胞と抗体産生細胞
を混合(混合比は通常１：４〜１：１０)することにより
行われる。融合促進剤としては平均分子量１，０００〜
６，０００のポリエチレングリコール(ＰＥＧ)が使用で
きる。ＰＥＧの使用濃度は通常３０〜５０％である。 (ｄ) ハイブリドーマの選択的増殖 融合を終えた細胞は、１０％FeＳ含有ＩＭＤＭ培地など
で適当に希釈し、遠心分離する。沈査を選択培地(例え
ばＨＡＴ培地)で浮遊し、９６穴ウエルマイクロプレー
トに接種した後に、５％炭酸ガス培養装置で培養する。
選択培地で生育してくる細部はハイブリドーマである。 (ｅ) 抗体産生ハイブリドーマの検索 抗体産生ハイブリドーマの検索は常法に従えばよく、特
に限定されない。例えばハイブリドーマの増殖した培養
液を採取し、ＧＲｂ１−ＨＳＡ(ヒト血清アルブミン)と
反応させ、酵素、蛍光物質、発光物質などでラベルした
２次抗体との反応により検索できる。

【０００７】(ｆ) クローニング 抗体産生ハイブリドーマを含むことを確認した培養ウエ
ル中の細胞を限界希釈法などによりクローニングを行
い、ＭＡｂ産生ハイブリドーマを得る。以上の操作によ
り抗ＧＲｂ１ＭＡｂ産生ハイブリドーマ９Ｇ７、９Ｇ
９、９Ｇ１００、および９Ｇ８０を得た。これらのハイ
ブリドーマはそれぞれＧＲｂ１に対する特異的なＭＡｂ
を産生する新規な細胞である。

【０００８】(ｇ) 抗ＧＲｂ１ＭＡｂの調整 上記で得られたハイブリドーマを適切な培地中で培養す
ることにより、その培養上清から本発明のＭＡｂが得ら
れる。大量に生産する方法としてはミエローマ細胞由来
動物と同種の動物にプリスタン等の鉱物油を腹腔内投与
後、ハイブリドーマを接種する。接種後、腹水を採取
し、通常の抗体分離操作により抗ＧＲｂ１ＭＡｂを得
る。また、無血清培地で培養し、通常の手法で抗ＧＲｂ
１ＭＡｂを得る。

【０００９】(ｈ) 抗ＧＲｂ１ＭＡｂの特性 精製した抗ＧＲｂ１ＭＡｂのサブクラス、軽鎖等をオク
タロニイ(Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ)法などの通常の方法
で測定し、ＩｇＧ２ｂクラスのＩｇＧでκ軽鎖を有する
ことが判明した。 また、分子量をシナピン酸をマトリ
ックスとする方法によりマルデイトフマス(ｍａｔｒｉ
ｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒｄｅｓｏｒｐｔｉｏ
ｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏ
ｍｅｔｒｙ)にて測定し、１４８，６００と決定した。

【００１０】

【発明の実施の形態】実施例 抗ＧＲｂ１ＭＡｂ産生ハイブリドーマの製造 (１) 抗原の調整： ＧＲｂ１(１０ｍｇ)を８０％メタ
ノール０.７ｍｌに溶かした溶液を、４ｍｇの過ヨウ素
酸ナトリウムを水０．５ｍｌに溶かした溶液に撹拌しな
がら添加する。１時間反応後、ＢＳＡを溶かした炭酸塩
バッファーを上記反応液に添加して、５時間撹拌反応す
る。反応後透析して１７ｍｇのＧＲｂ１−ＢＳＡ抱合体
を得た。ＧＲｂ１−ＨＳＡ抱合体も同様にして得た。 (２) 抗原中のハプテン数の検討： 得られたＧＲｂ１
−ＢＳＡ抱合体の微量をとり、過剰のアジピン酸を添加
して混合する。混合物の小量をカセットのウエルに入
れ、マルデイトフマスにて測定する。 (３) 免疫脾臓細胞の調整：ＧＲｂ１−ＢＳＡ抱合体５
０μgをフロイント−コンプリート−アジュバントに乳
濁化させ、ＢＡＬＢ／Ｃ系マウスの腹腔内に投与した。
以後、２週間の間隔で５０μｇのＧＲｂ１−ＢＳＡ抱合
体アジュバント溶液を２回同様に投与し、最後にＧＲｂ
１−ＢＳＡ抱合体のみを１００μｇ投与し免疫を完了し
た。３日後にマウスを麻酔下屠殺し、脾臓を摘出した。
脾臓を細断した後、１００メッシュのナイロン網でろ過
し、脾臓の単離細胞を得た。

【００１１】(４) ハイブリドーマの調整：単離した免
疫脾臓細胞に低張液(１５５ｍＭ塩化アンモニウム)を加
えて赤血球を溶血した後、Iscove's Modified Dulbecc
o'sMedium (ＩＭＤＭ)で細胞を３回洗う。マウスミエロ
ーマ細胞もＩＭＤＭで３回洗浄した。両細胞数を計測し
脾臓細胞と骨髄腫細胞を１０：１の割合として遠心をす
る。上清を捨て、沈殿した細胞を充分解きほぐし、ポリ
エチレングリコール(ＰＥＧ)４０００を培地で希釈した
４５％液を０．５ｍｌ滴下して融合を行った。３７℃、
３０秒間静置した後、ＩＭＤＭ(１ｍｌ)を１分間かけて
添加した。引き続き１０ｍｌを５分間かけて添加した。
１，０００ｒｐｍで１０分間遠心した。沈殿を１０％Fe
Ｓ添加ＩＭＤＭにより洗い、遠心して上清を捨てた。ヒ
ポキサンチン１０^-4Ｍ、アミノプテリン４ｘ１０^-7Ｍお
よびチミジン１．５ｘ１０^-5Ｍを加えた(ＨＡＴ−)１０
％FeＳ添加ＩＭＤＭを用いて沈殿を再び浮遊させ、９６
ウエルマイクロプレートに１００μｌずつ分注した。３
日毎に同一培地を５０μｌ追加し、細胞の増殖を確認し
た。

【００１２】(５) 抗体産生ハイブリドーマの検索：ハ
イブリドーマが増殖したウエルの液を採取し、ＧＲｂ１
−ＨＳＡ抱合体を結合させた別のウエルに添加し、直接
ＥＬＩＳＡ(ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎ
ｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ)によりＧＲｂ１に対す
るＭＡｂ産生ハイブリドーマを検索した。すなわち、９
６ウエルマイクロプレートにＧＲｂ１−ＨＳＡ抱合体
０．１μｇ／１００μｌ／ウエルを分注し、２５℃で５
時間インキュベートしてウエルに吸着させた。このウエ
ルに培養上清を１００μｌずつ分注し抗原抗体反応を行
った。０.０５％ツイーン２０含有リン酸緩衝食塩水(Ｔ
−ＰＢＳ)で３回洗浄した。パーオキシダーゼ標識ヤギ
抗マウスＩｇＧ抗体１，０００倍希釈液をウエルあたり
１００μｌ添加し、１時間後にＴ−ＰＢＳで洗浄した。
０.００３％過酸化水素、ＡＢＴＳ(２，２’−ａｚｉｎ
ｏ−ｂｉｓ(３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌ
ｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ)ｄｉａｍｍ
ｏｎｉｕｍ ｓａｌｔ) ０.３ｍｇ／ｍｌ含有クエン酸
緩衝液を添加して発色させた。２０分後プレートリーダ
ーを用いて４０５ｎｍの波長で吸光度を測定した。発色
したウエルの細胞を採取した。 (６) 抗ＧＲｂ１ＭＡｂ産生ハイブリドーマのクローニ
ング：抗体産生ハイブリドーマを限界希釈してウエルに
分注した。抗体産生能を持ち、かつ増殖したハイブリド
ーマを同様に３回クローニングしてクローンを得た。 (７) 抗ＧＲｂ１ＭＡｂの調整：上記の抗体産生ハイブ
リドーマを無血清培地(１０μｇ／ｍｌインスリン、３
５μｇ／ｍｌトランスフェリン、２０μＭエタノールア
ミン、２５ｎＭセレニューム添加ｅＲＤＦ培地)で３７
℃、炭酸ガス培養器で培養した。上清をプロテインＧＦ
Ｆカラムを用いて精製した。すなわち、上清をトリス緩
衝液でｐＨ７に調整し、カラムに付す。カラムを１０ｍ
Ｍリン酸緩衝液で洗浄後、吸着している抗体を１００ｍ
Ｍクエン酸緩衝液で溶出する。得られた抗体溶液はＰＢ
Ｓ(リン酸緩衝液)に対して３回透析し、最後に凍結乾燥
して精製抗体をえた。

【００１３】(８) 精製した抗ＧＲｂ１ＭＡｂを微量と
り、アジピン酸を添加し混合する。この混合物をマルデ
イトフマスにて測定し、純度を確認した。(図１) (９) 競合的ＥＬＩＳＡによる定量：ＧＲｂ１−ＨＳＡ
抱合体溶液(１μ／ｍｌ)を１００μｌずつウエルに添加
し１時間反応し吸着させる。比特異的結合を除去するた
めにスキンミルク添加ＰＢＳ溶液３００μlを加え１時
間反応してブロッキングする。５０μｌの各種濃度のＧ
Ｒｂ１２０％メタノール溶液を加え、さらに抗ＧＲｂ１
ＭＡｂ溶液(０.４１８μg／ｍｌ)５０μｌを添加して１
時間インキュベートした。Ｔ−ＰＢＳで３回洗浄し、１
０００倍希釈したパーオキシダーゼ標識抗マウス抗体１
００μｌを加え１時間反応した。１時間後にＴ−ＰＢＳ
で洗浄した。０.００３％過酸化水素、ＡＢＴＳ０.３ｍ
ｇ／ｍｌ含有クエン酸緩衝液を添加して発色させた。１
５分後に発色を４０５ｎｍで測定。各濃度のＧＲｂ１の
吸光度から検量線を作成した。(図２)

【００１４】(１０) 交叉反応性の調査：ジンセノサイ
ドＲｃ、ジンセノサイドＲｄ、ジンセノサイドＲｅ、ジ
ンセノサイドＲｇ１(表−２参照)等の人参固有のダンマ
ラン配糖体類、およびグリチルリチン、ヂギトキシン、
チクセツサポニン等ダンマラン骨格以外のアグリコンを
持つサポニンを測定した。表−１に見られる通り、ＧＲ
ｂ１に特異的に親和性を持つ抗体であることが明らかと
なった。その他の成分には殆ど交差反応性を示さなかっ
た。 (１１) 各種人参のＧＲｂ１含有量：各種人参の粉末１
０ｍｇをメタノール１ｍｌで５回抽出する。抽出液を合
わせて遠心にかける。上清を２０％メタノールで適切な
濃度に希釈して実施例の(９)に準じて定量する。結果を
表−３に示す。 (１２) 表４に示すような人参配合漢方薬と人参を含ま
ない漢方薬のエキス剤を各１０ｍｇとり、２０％メタノ
ールを加え不溶物を遠心にて除去し、セッパックプレカ
ラムに付し実施例の(９)に準じて定量した。

【００１５】

【発明の効果】本抗体は極めて特異性が高いので通常の
ＥＬＩＳＡに用いることにより、再現性が高く、高感
度、かつ前処理が不要な定量が可能となり、各種の人
参、各種人参の各器官、人参含有漢方処方等のＧＲｂ１
含有量を簡便に定量することができる。また、本法を応
用することにより多大な植物を短期間に精査することが
可能である。

【表１】

【表２】

【表３】

【表４】

【図面の簡単な説明】

【図１】 抗ＧＲｂ１ＭＡｂの純度の確認を行ったマル
ディマススペクトルである。

【図２】 ジンセノサイドＲｂ１の検量線の模式図であ
る。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ジンセノサイドＲｂ１に対するモノクロ
   ーナル抗体であって、下記の特性を有する抗体を産生す
   るハイブリドーマ。 (１) 分子量１４８，６００ (２) ＩｇＧ２ｂクラスのＩｇＧ (３) κ軽鎖保有
2. 【請求項２】 ジンセノサイドＲｂ１に対するモノクロ
   ーナル抗体であって、下記の特性を有する抗体。 (１) 分子量１４８，６００ (２) ＩｇＧ２ｂクラスのＩｇＧ (３) κ軽鎖保有
3. 【請求項３】 薬用人参の主要な配糖体であるジンセノ
   サイドＲｂ１で免疫した動物脾臓細胞とミエローマ細胞
   により抗ジンセノサイドＲｂ１モノクローナル抗体産生
   ハイブリドーマを作成するに際し、抗原として過ヨウ素
   酸ナトリウムで処理したジンセノサイドＲｂ１とウシ血
   清アルブミンとの抱合体を用いることを特徴とする該ハ
   イブリドーマの作成法。