JPH1129561A - 新規化合物ａｍ６１０５及びその製法 - Google Patents

新規化合物ａｍ６１０５及びその製法

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JPH1129561A
JPH1129561A JP18137797A JP18137797A JPH1129561A JP H1129561 A JPH1129561 A JP H1129561A JP 18137797 A JP18137797 A JP 18137797A JP 18137797 A JP18137797 A JP 18137797A JP H1129561 A JPH1129561 A JP H1129561A
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Satoru Ishikawa
覚 石川
Satoshi Yaginuma
慧 柳沼
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Asahi Chemical Industry Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 シュードアレッシェリア属に属する微生物の
培養物から取得される式（Ｉ） 【化１】 で表される化合物、およびその化合物を有効成分とする
ＩｇＥ産生抑制剤、またはＩｇＥの異常産生に基づく免
疫疾患の予防・治療剤等の医薬。 【効果】 新規な医薬を提供しえる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＩｇＥ抗体産生を
抑制する作用を有する新規化合物、その製法と用途、お
よび生産菌に関する。
【０００２】
【従来の技術】アレルギ−反応はその発症の機序、症状
の違いなどによりＩ型アレルギ−反応、ＩＩ型アレルギ
−反応、ＩＩＩ型アレルギ−反応およびＩＶ型アレルギ
−反応に区別されている。アレルギ−反応の代表的なも
のは、即時型アレルギ−反応ともいわれているＩ型アレ
ルギ−反応である。Ｉ型アレルギ−反応においては、生
体内に入った抗原によりＩｇＥが生起し、これが組織の
肥満細胞または血中の好塩基性細胞の細胞膜に固着した
ＩｇＥ抗体が抗原と反応することにより、当該細胞から
ヒスタミン、セロトニン、その他の種々の化学伝達物質
を遊離する。該化学伝達物質は平滑筋の収縮、血管透過
性の亢進など様々な組織反応を引き起こす。Ｉ型アレル
ギ−の病態としては、アトピ−性気管支喘息、アトピ−
性皮膚炎、アレルギ−性鼻炎、花粉症、アナフィラキシ
−、食物アレルギ−などが挙げられる。
【０００３】現在のところ、Ｉ型アレルギ−反応を抑制
する薬剤として、肥満細胞および好塩基性細胞からの化
学伝達物質遊離抑制薬、化学伝達物質拮抗薬が開発され
ている。しかしながら、化学伝達物質の遊離もしくは生
成を特異的に抑制する薬剤または特異的な拮抗薬が知ら
れている化学伝達物質は少なく、また化学伝達物質は多
種多様であるため、Ｉ型アレルギ−反応を抑制するため
には、種々の化学伝達物質の相互作用の解析が必要とさ
れているのが現状である。さらに、上記の薬剤は、アレ
ルギ−反応の根本的原因であるＩｇＥの産生を抑制する
ことではなく、その意味で根本的治療剤にはなり得な
い。
【０００４】また、サイクロスポリンＡのような免疫抑
制剤によってＩｇＥ産生を抑制し、アレルギ−疾患を治
療しようとする試みも行われているが、非特異的免疫抑
制を伴うため、副作用の問題を克服することは困難であ
る。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従来より、ＩｇＥ産生
を特異的に抑制する免疫抑制剤として有用な新規化合物
の提供が求められている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＩｇＥ抗
体産生を特異的に阻害する新規な生理活性物質を微生物
代謝産物より見出すべく鋭意探索を行った。その結果、
シュードアレッシェリア（Pseudallescheria) 属に属す
るＭ６１０５株の培養液からＩｇＥ抗体産生に対して阻
害活性を示す新規生理活性物質が産生されることを見出
し本発明を完成させた。
【０００７】即ち、本発明は、式（Ｉ）
【０００８】
【化２】
【０００９】で表される化合物である（以下、本発明の
化合物をＡＭ６１０５、またはＡＭ６１０５化合物と称
することがある）。本発明のＡＭ６１０５化合物の性状
は以下の通りである。 １）外観：無色柱状結晶 ２）酸性、塩基性、中性の区別：中性物質 ３）比旋光度：［α］D 23＋４２．３°（Ｃ＝１．０，
ＣＨＣｌ3 ） ４）分子式：Ｃ16Ｈ24Ｏ5 ５）分子量：ＦＡＢ−ＭＳ ｍ／ｚ ２９７（Ｍ＋Ｈ）
+ ６）元素分析：計算値（％）（Ｃ16Ｈ24Ｏ5 に対し）
Ｃ，６４．８４；Ｈ，８．１６ 実測値（％） Ｃ，６４．８８；Ｈ，８．２４ ７）紫外部吸収スペクトル：末端吸収（ＭｅＯＨ） ８）赤外部吸収スペクトル：（ＫＢｒ、ｃｍ-1）図１に
示す通りである。
【００１０】主な吸収は次の通りである。３４６９、２
９７１、２９２５、１７２９、１４５７、１３８６、１
２０９、１１４９、１１１２、１０３９ ９） 1Ｈ−ＮＭＲスペクトル：（４００ＭＨｚ，ＣＤＣ
ｌ3 ）図２に示す通りである。 １０）13Ｃ−ＮＭＲスペクトル：（１００ＭＨｚ，ＣＤ
Ｃｌ3 ）δ（ｐｐｍ）２０４．２（ｓ）、１３４．７
（ｓ）、１１８．５（ｄ）、８９．９（ｄ）、７６．２
（ｓ）、６２．４（ｓ）、６０．８（ｓ）、６０．７
（ｑ）、５８．７（ｄ）、４９．２（ｔ）、３６．２
（ｔ）、２８．３（ｔ）、２７．２（ｔ）、２５．９
（ｑ）、１８．２（ｑ）、１４．１（ｑ） １１）溶解性：クロロホルム、酢酸エチル、アセトン、
メタノールに可溶で、水に不溶である。
【００１１】１２）呈色試験：ヨウ素蒸気との反応、過
マンガン酸カリウム脱色反応に陽性を示し、塩化第二鉄
反応、ニンヒドリン反応に陰性を示す。 １３）薄層クロマトグラフィ−：固定相 展開溶媒 Ｒｆ値 シリカゲルｆ Ｓ２０１ ヘキサン：アセトン ０．３７ （東京化成社製） （２：１） １４）高速液体クロマトグラフィ−： 分離カラム：Ｓｈｏｄｅｘ Ｃ１８−５Ａ（カラムサイ
ズ φ４．５×１５０ｍｍ、昭和電工社製） 溶媒：３５％アセトニトリル 流速：１．０ｍｌ／分 検出：ＵＶ ２０５ｎｍ 保持時間：７．９分 本発明の化合物ＡＭ６１０５と同一の分子式を有し、類
似の物理化学的性状を示す化合物として式（II）で示さ
れ、シュードユーロチュウム・オバリス（Pseudeurotiu
m ovalis）が生産するオバリシン［H.P.Sigg et al.,He
lv.Chim.Acta,51:1395(1968) ］
【００１２】
【化３】
【００１３】が知られている。しかしながら、オバリシ
ンはマイナスの旋光度を示し［H.P.Sigg et al.,Helv.C
him.Acta, 51:1395(1968) ； 特開平3-4712号公報] 、
本発明の化合物ＡＭ６１０５はプラスの旋光度を示す。
よって本発明化合物ＡＭ６１０５はオバリシンとは明確
に区別される。本発明者らは本発明の化合物の構造を詳
細に検討した結果、その構造はメトキシ基と結合する不
斉炭素の配置がＲ配置であり、オバリシンのジアステレ
オマーである事が判明した。またオバリシンは化学合成
［E.J.Corey et al.,J.Am.Chem.Soc,107,256(1985)] や
前駆体からの生合成［D.E.Cane et al.,Tetrahedron Le
tt.,28,6545(1987)]による製法が知られているが本発明
化合物ＡＭ６１０５の記載はない。従って、本発明の化
合物は、新規な化合物と判明した。
【００１４】また、本発明は、ＡＭ６１０５化合物を産
生する能力を有するシュードアレッシェリア属に属する
微生物を培養し、その培養物よりＡＭ６１０５化合物を
採取することを特徴とするＡＭ６１０５の製造方法であ
る。本発明のＡＭ６１０５化合物を産生する能力を有す
るシュードアレッシェリア属に属する微生物としては、
本発明の化合物を生産する能力があれば特に限定されな
いが、例えば、下記のシュードアレッシェリア・エスピ
ー（Pseudallescheria sp.) Ｍ６１０５株（ＦＥＲＭ
Ｐ−１６３０８）が例示される。
【００１５】上記Ｍ６１０５株は、静岡県の水田土壌か
ら分離した糸状菌であり、その菌学的性状は次の通りで
ある。 １．各培地上での生育状態 １）イ−スト・リン酸・可溶性澱粉（ＹｐＳｓ）寒天培
地 ２５℃、７日間の培養でコロニ−の直径は３７〜３７．
５ｍｍとなり、表面は白色（１Ａ１）フェルト状であ
る。コロニ−の裏面は黄白色（１Ａ２）〜灰色（１Ｂ
２）である。２５℃、３０日間の培養では、コロニ−は
シャーレ（９０ｍｍ）全面に広がり、表面はフェルト状
となる。コロニーの色は淡灰色（１Ｂ１）〜パステル灰
色（１Ｃ１）である。コロニー裏面の色は灰色（１Ｂ
２）〜淡灰色（１Ｂ１）を主体とし、裏面には閉子嚢果
が散在する。３７℃でのコロニーの生長は７日間で直径
２３〜２４ｍｍである。
【００１６】２）ポテト・グルコ−ス寒天培地 ２５℃、７日間の培養でコロニ−の直径は３２〜３３ｍ
ｍとなり、表面は綿毛状〜羊毛状で色は白色（１Ａ１）
である。コロニ−の裏面は白色（１Ａ１）〜黄白色（３
Ａ２）である。２５℃、３０日間培養した場合、コロニ
−はシャーレ（９０ｍｍ）全面に広がり、表面はフェル
ト状〜羊毛状で色は白色（１Ａ１）〜黄灰色（４Ｂ２）
である。裏面の色は白色（１Ａ１）〜茶橙色（６Ｃ３）
である。３７℃でのコロニーの生長は７日間で直径１９
〜２０ｍｍである。
【００１７】３）オートミール寒天培地 ２５℃、７日間の培養でコロニーの直径は３７〜３９ｍ
ｍとなり、表面はフェルト状で白色（１Ａ１）である。
コロニーの裏面は白色（１Ａ１）である。２５℃で３０
日間培養した場合、コロニーはシャーレ（９０ｍｍ）全
面に広がり、表面は白色（１Ａ１）〜鈍緑色（３０Ｄ
４）〜暗緑色（３０Ｆ４）である。裏面全体に閉子嚢果
が粒子状に散在する。３７℃でのコロニーの生長は７日
間で直径２０〜２１ｍｍである。 ２．生理学的性状 ポテト・グルコ−ス液体培地で培養した場合、生育し得
るｐＨの範囲は、４．０〜８．０であり、最適生育ｐＨ
は、４．０〜８．０である。ポテト・グルコ−ス寒天培
地で培養した場合、生育し得る温度の範囲は、１６〜３
７℃であり、最適生育温度は、２８〜３１℃である。
【００１８】３．顕微鏡下における形態的特徴 本菌は有性世代と無性世代を形成する。有性世代では暗
褐色（７Ｆ６）で球形、直径１３０〜１７０μｍの閉子
嚢果を形成する。閉子嚢果の殻壁は厚さ５〜６μｍ、暗
褐色（７Ｆ６）で多角形の細胞で構成される。子嚢は消
失性で大きさは１３〜１６×１０〜１２μｍ、形は球形
または亜球形で８胞子性である。子嚢胞子は単細胞性の
楕円形で、大きさは５．５〜６×３．５〜４μｍであ
る。両端に発芽孔を有するが、発芽孔が不明瞭な胞子も
ある。子嚢胞子の表面は滑面で、色は成熟したものは淡
黄色（４Ｂ４）〜淡橙色（５Ｃ５）である。無性世代で
は透明〜黄白色（３Ａ２）で滑面のＳｃｅｄｏｓｐｏｒ
ｉｕｍ型の分生子を形成する。分生子形の大きさは５〜
８×２〜４μｍである。分生子は単細胞性で球形、亜球
形、卵形、楕円形、棒状と様々な形態のものが認められ
るが、基部に切り取った様な跡が共通して認められる。
【００１９】４．同定 本菌は有性世代に閉子嚢果の形成が認められることから
子嚢菌類に属する。また、子嚢胞子が単細胞であり、滑
面で小型であること、色が淡黄色（４Ｂ４）〜淡橙色
（５Ｃ５）であること、子嚢胞子の両端の発芽孔がしば
しば不明瞭であることからＭｉｃｒｏａｓｃｕｓ科に属
1)する。本菌の形態的特徴は閉子嚢果の大きさが１３０
〜１７０μｍ、子嚢の大きさが１３〜１６×１０〜１２
μｍ、子嚢胞子が楕円形で大きさが５．５〜６×３．５
〜４μｍである。また、Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ型の
無性世代（分生子）が存在し、大きさは５〜８×２〜４
μｍである。これらの特徴からＰｓｅｕｄａｌｌｅｓｃ
ｈｅｒｉａ属に属する。1)2)従って、本菌株をシュード
アレッシェリア・エスピー（Pseudallscheria sp. ）Ｍ
６１０５と呼称することにした。尚本菌株は、工業技術
院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１６３０８
として寄託されている。
【００２０】各培地における生育状態の色の表示は、Ko
rnerup A. and Wanscher J.H.1978"Methuen Handbook o
f Colour 3rd ed."Eyre Methuen,London の表示に従っ
た。 参考文献 １）．von Arx,J.A.1973.The Genera petriellidium an
d Pithoascus (Microascaceae).Persoonia 7:365-375 ２）．McGinnis,M.R.,Padhye,A.A.and Ajello,L.1970.P
seudallescheria Negroni et Fischer,1943 and itslat
er synonym petriellidium Malloch.1970.Mycotaxon 1
4:94-102 ． 本発明に係わるＡＭ６１０５の典型的で好ましい製造方
法は、シュードアレッシェリア属に属する該化合物生産
菌（例えばPseudallescheria sp. Ｍ６１０５）を好適
な培地で培養し、その培養物から分離する方法が例示さ
れる。
【００２１】本発明物質を製造するのに使用される培地
は、液体培地による振盪培養または通気攪拌培養が最も
適しているが、これに限定されない。培地はＡＭ６１０
５生産菌が生育して培地中に該化合物を蓄積するもので
あれば特に限定されず、例えば、炭素源としてはグルコ
−ス、シュ−クロ−ス、デキストリン、澱粉、グリセリ
ン、糖蜜、有機酸などが使用できる。また窒素源として
は、例えばイ−ストエキス、ペプトン、肉エキス、大豆
粉、綿実粉、グルテンミ−ル、小麦胚芽、コ−ンスティ
−プリカ−、アミノ酸類、アンモニウム塩、硝酸塩、そ
の他各種有機あるいは無機窒素化合物が用いられる。無
機塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸カ
ルシウム、各リン酸塩、マグネシウム塩、銅塩、コバル
ト塩等を添加してもよい。また菌の生育及びＡＭ６１０
５生産を促進するようなビタミン類、補酵素類等を添加
してもよい。特に、培地が強く発泡するのであれば、必
要あるときに液体パラフィン、動物油、植物油、鉱物
油、シリコン等を添加してもよい。
【００２２】ＡＭ６１０５生産菌の培養における培養温
度、培養時間、攪拌速度、通気量、培養液のｐＨなどの
条件は、ＡＭ６１０５の蓄積量が最大となるように適当
に選択、調節される。例えば、通常の通気攪拌培養の場
合、培養温度２７〜３０℃、２〜５日間の培養が好まし
く、また培養液のｐＨはｐＨ５．０〜８．０に調節する
のが好ましい。
【００２３】培養の経過に伴って培養液中に蓄積される
ＡＭ６１０５の量の経時的変化は後述の産生阻害活性あ
るいは逆相ＨＰＬＣにより測定することができる。通常
は、４８時間から９６時間の培養でその生産量は最大に
達する。培養終了後、主としてその液体部分に蓄積する
ＡＭ６１０５は、菌体その他の固形部分を濾過操作また
は遠心分離によって除去し、その濾液または上清液から
分離するのが好ましいが、必要に応じて菌体を除去する
ことなく培養液から該化合物を分離することも可能であ
る。培養液からのＡＭ６１０５の分離、精製には、その
物理化学的特性に基づく種々の方法を用いることができ
る。例えば、濾液または上清液中に存在するＡＭ６１０
５は、中性ｐＨ条件下で水と混和しない有機溶媒、例え
ば酢酸エチル、酢酸ブチル、ブタノ−ル、クロロホル
ム、ジクロルメタン、塩化メチレン、塩化エチレンなど
の単独またはそれらの組み合わせにより抽出精製するこ
とができる。あるいは吸着剤として例えばダイヤイオン
ＨＰ−２０（三菱化成社製）等が使用される。ＡＭ６１
０５を含む画分を上記の吸着剤の層を通過させて不純物
を吸着させて取り除くか、または、ＡＭ６１０５を吸着
させた後、メタノ−ル水、アセトン水などを用いて溶出
させることにより該化合物を得ることができる。更にシ
リカゲル、アルミナ、フロリジルのような担体を用いた
吸着カラムクロマトグラフィ−、セファデックスＬＨ−
２０（ファルマシア社製）、トヨパ−ルＨＷ−４０（東
ソ−社製）などを用いた分配カラムクロマトグラフィ
−、および順相、逆相カラムを用いた高速液体クロマト
グラフィ−などでＡＭ６１０５を精製することができ
る。
【００２４】また、本発明は、ＡＭ６１０５化合物を有
効成分とする医薬である。本発明の医薬は、通常、ＡＭ
６１０５化合物の他に、薬学的に許容される担体とから
なることができる。担体としては、公知のものが使用で
き、その性質によっては賦型剤、結合剤、崩壊剤、潤沢
剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コ−ティング剤
等と分類されることもあるが、例えば、ラクト−ス、コ
−ンスタ−チ、ステアリン酸マグネシウム等が挙げられ
る。
【００２５】本発明の医薬は、例えば免疫抑制剤であ
り、さらに詳しくは、ＩｇＥ産生抑制剤、あるいは、Ｉ
ｇＥの異常産生に基づく免疫疾患の予防治療剤であり、
例えば、抗アトピ−性気管支喘息剤、抗アトピ−性皮膚
炎剤、抗アレルギ−性鼻炎剤、抗花粉症剤、抗アナフィ
ラキシ−剤または抗食物アレルギ−剤が例示される。本
発明の医薬は、種々の形態で投与され得るが、例えば錠
剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ剤等による経口投与
または注射剤（静脈内、筋肉内、皮下）、点眼剤、坐
薬、軟膏、スプレ−、ロ−ション等による非経口投与を
挙げることができる。
【００２６】これらの医薬は、症状、年齢、体重、投与
方法および剤形等によって異なるが通常は成人に対して
１日２０ｍｇ乃至１０００ｍｇを投与することができ
る。
【００２７】
【実施例】次に実施例をあげて本発明を更に具体的に説
明するが、本発明はこの実施例によって限定されるもの
ではない。
【００２８】
【実施例１】 （１）ＡＭ６１０５化合物の醗酵生産 グルコ−ス２％、可溶性澱粉２％、大豆粉２％、イ−ス
トエキス０．５％、ＮａＣｌ０．２５％およびＣａＣＯ
3 ０．３５％を含有する水性培地（ｐＨ６．５）１００
ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに分注し、１２０℃で
２０分間滅菌した。これにＭ６１０５株（ＦＥＲＭ Ｐ
−１６３０８）のスラントを一白金耳接種し、２８℃で
３日間ロ−タリ−シェ−カ−（毎分２００ｒｐｍ）で培
養を行い１次種培養液とした。得られた１次種培養液
を、３０ｌ容ジャ−ファ−メンタ−中の上記と同じ滅菌
培地２０ｌ中へ接種した。ファ−メンタ−を２０ｌ／分
の通気および２００ｒｐｍ、２８℃で４８時間通気攪拌
培養し、２次種培養液とした。
【００２９】こうして得た２次種培養液２０ｌをさら
に、グルコ−ス２％、ペプトン１％、Ｃ．Ｓ．Ｌ．１
％、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．２％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ０．
１％およびアンチフォ−ムＦＳ−０２８（Ｄｏｗ Ｃｏ
ｒｎｉｎｇ Ｋ．Ｋ社製）０．０３％を含有する３００
０ｌ容ステンレス製ファ−メンタ−中の滅菌培地２５０
０ｌに接種した。２０００ｌ／分の通気および１５０ｒ
ｐｍの攪拌のもとに、２８℃で７２時間培養を行った。
【００３０】（２）ＡＭ６１０５化合物の精製 上記の培養方法で得られたブロス２５００ｌに珪藻土
（５０ｋｇ）を添加後濾過し、濾液（１６００ｌ）を得
た。得られた濾液を塩酸でｐＨ７．０に調製した後、酢
酸ブチル（９００ｌ）を添加し、抽出操作を行った。こ
の酢酸ブチル層を減圧下に濃縮し、約５００ｍｌのシロ
ップ状物質を得た。このシロップ状物質にベンゼン約５
００ｍｌを添加し、さらにヘキサン約１ｌを添加し、不
溶物を濾過により除き、濾液を減圧濃縮した。濃縮物を
予めヘキサンで作製したシリカゲルカラム（３．５ｌ）
に付し、同溶媒で２ｌ溶出を行った後、ヘキサン−アセ
トン（１０：３）混合溶媒で溶出を行い、５００ｍｌず
つ分画した。精製過程に於ける活性物質の検出には、シ
リカゲル薄層クロマトグラフィ−［ＴＬＣ：東京化成社
製、シリカゲルｆ Ｓ２０１；展開系：ベンゼン−酢酸
エチル＝２：１でＲｆ値０．３１の物質］を用いた。
【００３１】フラクションＮｏ．７−Ｎｏ．１１に主と
してＲｆ値０．３１を示すＡＭ６１０５成分が溶出され
た。ＡＭ６１０５成分を含むのフラクションを集め、減
圧下濃縮した。ＡＭ６１０５成分を含む濃縮物はさらに
予めベンゼンで作製したシリカゲルカラム（１．５ｌ）
に付し、同溶媒で８．２ｌ溶出を行った後、酢酸エチル
４ｌで溶出した。酢酸エチル溶出画分にＡＭ６１０５成
分が溶出され、酢酸エチル画分を減圧下濃縮した。ＡＭ
６１０５成分を含む濃縮物はさらにシリカゲルカラム
（１ｌ）に付し、クロロホルム−ヘキサン（１０：３）
混合溶媒で溶出を行い、１ｌ溶出後１８ｍｌずつ分画し
た。フラクションＮｏ．１０〜Ｎｏ．８０にＡＭ６１０
５成分が溶出された。ＡＭ６１０５成分を含むフラクシ
ョンを集め減圧下濃縮し、濃縮物をさらに分取液体クロ
マトグラフィーにて精製を行った。即ち、カラム：ＹＭ
Ｃ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ、移動相：２５％アセトニト
リル、流速：５０ｍｌ／分でクロマトグラフィーを実施
し、５００ｍｌずつ分画した。フラクションＮｏ．１〜
Ｎｏ．６にＡＭ６１０５成分が溶出された。ＡＭ６１０
５成分を含むフラクションを集め減圧下濃縮し、濃縮物
をさらに分取液体クロマトグラフィーにて精製を行っ
た。即ち、カラム：Ｓｈｏｄｅｘ Ｃ１８−５Ｆ、移動
相：２０％アセトニトリル、流速：５ｍｌ／分でクロマ
トグラフィーを実施し、１０ｍｌずつ分画した。フラク
ションＮｏ．１３０〜Ｎｏ．２３０にＡＭ６１０５成分
が溶出された。ＡＭ６１０５成分を含むフラクションを
集め減圧下濃縮し、濃縮物をさらに分取液体クロマトグ
ラフィーにて精製を行った。即ち、カラム：ＹＭＣ−Ｐ
ａｃｋ ＯＤＳ−Ａ、移動相：２０％アセトニトリル、
流速：５０ｍｌ／分でクロマトグラフィーを実施し、５
ｌ溶出後、５０ｍｌずつ分画した。フラクションＮｏ．
２１〜Ｎｏ．２９にＡＭ６１０５成分が溶出された。Ａ
Ｍ６１０５成分を含むフラクションを集め減圧下濃縮
し、約２ｍｌのクロロホルムに溶解後、ヘキサン約２０
ｍｌを加え室温に放置するとＡＭ６１０５が柱状結晶と
して得られた。この結晶を濾過によりグラスフィルタ−
上に集め、乾燥することで精製された無色柱状結晶のＡ
Ｍ６１０５（２．２ｇ）を得た。
【００３２】
【実施例２】 （１）ＡＭ６１０５のＩｇＥ抗体産生抑制活性 実施例１で得られたＡＭ６１０５について、ＩｇＥ抗体
産生抑制活性の測定を次のようにして行い、該活性を確
認した。６週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃ系マウスの脾臓を無
菌的に摘出し、ステンレスメッシュを通過させ大きな細
胞塊を除いた後、１０％牛胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ
社）、２ｍＭグルタミン、５ｘ１０-5Ｍ２−メルカプト
エタノ−ル、０．２％ＮａＨＣＯ3 、ペニシリンＧ（５
０ＩＵ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（５０μｇ／ｍ
ｌ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲ
Ｌ社）に細胞を懸濁して脾臓細胞浮遊液を得た。この液
を１２００ｒｐｍで１０分間遠心後、１４０ｍＭＮＨ4
Ｃｌ−１５ｍＭトリス溶液で赤血球を破壊し、ＰＢＳ
（−）（２．７ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＫＨ2 ＰＯ4 、
０．１４ＭＮａＣｌ，８．１ｍＭＮａ2ＨＰＯ4 ・７Ｈ
2 Ｏを含有する）溶液にて２回洗浄後、更に抗Ｔｈｙ−
１抗体及びウサギ補体を用いてＴ細胞を死滅させＢ細胞
源とした。このＢ細胞源をＰＢＳ（−）溶液にて２回洗
浄し、上記ＲＰＭＩ−１６４０培地にて５ｘ１０6 細胞
／ｍｌに調製し、Ｂ細胞浮遊液を得た。このＢ細胞浮遊
液に、Ｂ細胞刺激剤としてＬＰＳ（Ｄｉｆｃｏ社；Ｅ．
ｃｏｌｉ由来）を５０μｇ／ｍｌとなるように添加し、
２４時間、３７℃、５％ＣＯ2 下で前培養した。その
後、細胞を回収し、ＰＢＳ（−）溶液で２回洗浄した。
再度細胞を上記ＲＰＭＩ−１６４０培地にて５ｘ１０6
細胞／ｍｌに調製し、この細胞浮遊液１００μｌを９６
穴プレ−トの各ウェル（５ｘ１０5 細胞／ウェル）に入
れ、これに上記のＬＰＳを５μｇと市販マウスＩＬ−４
（Ｇｅｎｚｙｍｅ社）１００Ｕを添加した。次いで各種
濃度のＡＭ６１０５化合物５０μｌを加え、２００μｌ
／ウェルとし、５％ＣＯ2 インキュベ−タ−を用いて３
７℃で７日間培養した後、培地中のＩｇＥ量を測定し
た。尚、ＡＭ６１０５化合物は水に不溶性なので、ＤＭ
ＳＯに溶解した後、上記培地で希釈した。コントロ−ル
として、ＡＭ６１０５化合物を添加しなかった他は上記
の操作を繰り返した。
【００３３】培養上清中のＩｇＥ量は以下の方法により
測定した。１次抗体として市販のラット抗マウスＩｇＥ
モノクロナ−ル抗体（ヤマサ醤油（株））を２μｇ／ｍ
ｌとなるようにＰＢＳ（−）溶液に溶解し、９６穴ＥＬ
ＩＳＡプレ−ト（Ｄｙｎａｔｅｃｈ社）に５０μｌ／ウ
ェルの割合で分注し、室温で１．５時間保持した。その
後ＰＢＳ（−）溶液を捨て、３００μｌ／ウェルの割合
で０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（−）溶液を加
えることにより各ウェルを洗浄した。この洗浄操作を４
回繰り返し行った。洗浄後、２００μｌ／ウェルの割合
でブロッキング溶液［１％ＢＳＡ（Ｍｉｌｅｓ社；ｆｒ
ａｃｔｉｏｎＶ）含有ＰＢＳ（−）溶液］を加え、４℃
で一昼夜保持し、ブロッキングを行った。次いで、ブロ
ッキング溶液を捨て、先に述べた０．０５％Ｔｗｅｅｎ
２０含有ＰＢＳ（−）溶液による洗浄操作を４回繰り返
した。次に予め用意しておいた活性測定用の一連のサン
プル希釈液を５０μｌ／ウェルの割合で加え、室温で１
時間保持した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ
（−）溶液による洗浄操作を４回繰り返した。次に２次
抗体として市販のビオチン標識ラット抗マウスＩｇＥモ
ノクロナ−ル抗体（ヤマサ醤油（株））を２μｇ／ｍｌ
となるようにＰＢＳ（−）溶液で溶解し、５０μｌ／ウ
ェル加え、室温で１時間保持した。０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０含有ＰＢＳ（−）溶液による洗浄操作を４回繰り
返した後、ＰＢＳ（−）溶液を用いて２０００倍に希釈
したＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ
Ａｖｉｄｉｎ Ｄ（Ｖｅｃｔｏｒ社、Ａ２００４）を５
０μｌ／ウェル加えて室温で１時間保持した。０．０５
％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（−）溶液による洗浄操作
を４回繰り返した後、ＡＢＴＳ溶液［０．１２９ｇクエ
ン酸；０．２７６ｇＮａ2 ＨＰＯ4 ・１２Ｈ2 Ｏ；３０
％Ｈ2 Ｏ2 １μｌ；３ｍｇ２，２−Ａｚｉｎｏ−ｂｉｓ
（３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６
−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）ｄｉａｍｍｏｎｉｕｍ
ｓａｌｔ（和光純薬（株））；１０ｍｌ蒸留水］を５
０μｌ／ウェル加えて室温で１０分間保持し、５％（ｗ
／ｖ）のシュウ酸を５０μｌ／ウェル加えて反応を停止
した。その後、４１５ｎｍの吸光度を測定することによ
りＩｇＥ量の測定を行った。
【００３４】ＩｇＥ抗体産生抑制活性は、ＩｇＥ抗体産
生量がコントロ−ルの５０％に減少した濃度をＩＣ
50（μｇ／ｍｌ）として求め、ＡＭ６１０５の活性を算
出した。 （２）ＡＭ６１０５化合物の細胞毒性 この研究では、マウスリンパ腫Ｐ３８８Ｄ１細胞（ＡＴ
ＣＣ ＣＣＬ−４６）を用いた。細胞生存率は、Ｍｉｃ
ｈａｅｌ Ｃ，Ａｌｌｅｙらの方法［Cancer Res.,48,5
89-601(1988)］に準じ、ＭＴＴ［３−（４，５−ｄｉｍ
ｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉ
ｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄ］試
薬（ＳＩＧＡＭＡ社）を用いたＭＴＴ法で測定した。即
ち、１０％牛胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）、２ｍＭグ
ルタミン、５μＭ２−メルカプトエタン−ル、０．２％
炭酸水素ナトリウム、ペニシリンＧ（５０ＩＵ／ｍｌ）
及びストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有する
ＲＰＭＩ １６４０培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）にて
マウスリンパ腫Ｐ３８８Ｄ１細胞を１ｘ１０5 細胞／ｍ
ｌに調製した。この細胞浮遊液１００μｌを９６穴プレ
−トの各ウェル（１ｘ１０4 細胞／ウェル）に入れた。
これに上記培地を用いて作製した各種濃度のＡＭ６１０
５化合物溶液１００μｌ／ウェルを加え、５％ＣＯ2 イ
ンキュベ−タ−を用いて３７℃で３日間培養した。その
後、上記ＭＴＴ試薬をＰＢＳ（−）溶液にて１ｍｇ／ｍ
ｌになるように溶解し、５０μｌを各ウェルに添加し、
５％ＣＯ2 インキュベ−タ−を用いて３７℃で４時間培
養した。培養終了後、生細胞によって生じた青色素を５
７０ｎｍで測定した。尚、ＡＭ６１０５化合物は水に不
溶性なので、ＤＭＳＯに溶解した後、上記培地で希釈し
た。コントロ−ルとして、ＡＭ６１０５化合物を添加し
なかった他は上記の操作を繰り返した。細胞数がコント
ロ−ルの５０％に減少した濃度をＩＣ50（μｇ／ｍｌ）
としてＡＭ６１０５のＩＣ50値を測定した。以上の結果
を表１に示した。
【００３５】
【表１】
【００３６】以上の結果から明らかなように、ＡＭ６１
０５化合物は、細胞毒性の低い化合物であり、低濃度で
ＩｇＥ抗体産生抑制作用を有する事が確認された。従っ
て、本発明の化合物が、免疫抑制剤であること、更に、
ＩｇＥの異常産生に基づく免疫疾患の予防治療剤であ
り、例えば、抗アトピ−性気管支喘息剤、抗アトピ−性
皮膚炎剤、抗アレルギ−性鼻炎剤、抗花粉症剤、抗アナ
フィラキシ−剤または抗食物アレルギ−剤に使用できる
可能性が確認された。
【００３７】（３）ＡＭ６１０５化合物の急性毒性 ＡＭ６１０５化合物をＤＭＳＯに溶解した後、生理的食
塩水溶液で希釈し、３０ｍｇ／ｋｇを１日１回５日間Ｉ
ＣＲ系マウス５匹（雌性、５週齢）に腹腔内投与した。
結果としてマウスの異常な症状は何ら観察されず、本化
合物は安全性も高いことが確認された。 実施例３ 経口用カプセル剤 実施例１で製造したＡＭ６１０５の３０ｍｇを、ラクト
−ス１７０ｍｇ、コ−ンスタ−チ１４０ｍｇ、ステアリ
ン酸マグネシウム２ｍｇと良く混合し、この粉末３５０
ｍｇをゼラチンカプセルに入れ、カプセル剤とした。
【００３８】
【発明の効果】本発明は、新規な化合物を提供するもの
であり、これらの化合物は、一般的免疫抑制作用を示さ
ず、優れたＩｇＥ抗体産生抑制作用を示す。したがっ
て、特に、ＩｇＥの産生異常で惹起される病気、例えば
アトピ−性気管支喘息、アトピ−性皮膚炎、アレルギ−
性鼻炎、花粉症、アナフィラキシ−、食物アレルギ−等
の治療薬または予防薬あるいはそれらへの変換素材とし
て非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はＡＭ６１０５の臭化カリウム錠剤中での
赤外部吸収スペクトルを示す。
【図２】図２はＡＭ６１０５の重クロロホルム溶液中で
の４００ＭＨｚ 1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 17/16 Ｃ１２Ｐ 17/16 //(Ｃ１２Ｐ 17/16 Ｃ１２Ｒ 1:645）

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 式（Ｉ） 【化１】 で表される化合物。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載の化合物を産生する能力
    を有するシュードアレッシェリア属に属する微生物を培
    養し、その培養物より該化合物を採取することを特徴と
    する該化合物の製造方法。
  3. 【請求項３】 請求項１に記載の化合物を有効成分とす
    る医薬。
  4. 【請求項４】 医薬が、ＩｇＥ産生抑制剤、またはＩｇ
    Ｅの異常産生に基づく免疫疾患の予防・治療剤である請
    求項３に記載の医薬。
  5. 【請求項５】 シュードアレッシェリア・エスピー Ｍ
    ６１０５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１６３０８）。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006107184A1 (en) * 2005-04-07 2006-10-12 Mycoplus Co., Ltd. A pharmaceutical composition for the treatment of atopic dermatitis containing 4-hydroxy-5-methoxy-4-[2-methyl-3-(3-methyl-2-butenyl)-2-oxiranyl]-1-oxaspiro [2,5]octan-6-one
US7211567B1 (en) * 1999-03-26 2007-05-01 Sunstar, Inc. Composition for preventing and treating type I allergy

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