JPH11299482A - 酸化酵素及びその用途 - Google Patents

酸化酵素及びその用途

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JPH11299482A
JPH11299482A JP32877795A JP32877795A JPH11299482A JP H11299482 A JPH11299482 A JP H11299482A JP 32877795 A JP32877795 A JP 32877795A JP 32877795 A JP32877795 A JP 32877795A JP H11299482 A JPH11299482 A JP H11299482A
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JP
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polyphenol oxidase
polyphenol
myrothecium
oxidase according
oxidase
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JP32877795A
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Takashi Echigo
貴 愛知後
Shiro Fukuyama
志朗 福山
Ritsuko Ono
律子 大野
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Novo Nordisk AS
Original Assignee
Novo Nordisk AS
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ｐＨ８以上のアルカリ側に至適反応ｐＨを有
するポリフェノールオキシダーゼ、その生産微生物及び
用途の開発、提供。 【解決手段】 ミロセシウム属細菌が生産するポリフェ
ノールオキシダーゼ、該酵素を含有する洗剤組成物、ミ
ロセシウム・ヴェルカリア ＳＤ３００１（受託番号Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１４９５５）。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、微生物が生産するｐＨ
８以上のアルカリ側に至適反応ｐＨを有するポリフェノ
ールオキシダーゼとその生産微生物に関する。更に詳し
くは、新規な特性を有する酵素により、着色物質の酸化
処理やポリフェノール含有物の酸化処理、洗浄に関して
新たな酵素利用方法を提供するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来、ポリフェノール酸化作用を持つ微
生物由来の酵素として、担子菌類、不完全菌類等の糸状
菌が生産するポリフェノールオキシダーゼやラッカーゼ
が知られている。しかしながら、従来のポリフェノ−ル
酸化酵素はｐＨ８以上のアルカリ側で活性が著しく低い
ため、実際の用途が限られていた。例えば、ポリフェノ
ール酸化酵素の漂白への利用については、ＷＯ９１−０
５８３９、ＥＰ９１６１００３２、ＤＥ４００８８９
４、特開昭６４−６０６９３などに記載されている。し
かしながら洗濯などの洗浄操作は通常アルカリｐＨで行
われ、特に過酸化水素存在下での酸化漂白を同時に行う
場合には過酸化水素の漂白作用を促進するためにもアル
カリｐＨでの洗浄操作が望ましい。従って、こうした用
途にポリフェノールオキシダーゼを用いる場合、酸性ｐ
Ｈに至適反応ｐＨを有する従来の酵素では実質的な利用
は困難であった。
【０００３】ポリフェノールを構造部分に有する天然物
として、フラボノイド系、キサントン系、メラニン系な
どの植物色素やリグニンが知られており、ポリフェノー
ルオキシダーゼはこれらの天然物に対する酸化作用を有
する。また、毒性が問題になっているジクロロフェノー
ル、トリクロロフェノールをもポリフェノールオキシダ
ーゼは反応基質にできる。それ故に、これらの天然物や
非天然物を含有する排水処理においてもポリフェノール
オキシダーゼは有用である。しかしながら従来の酵素で
は酸性ｐＨから中性ｐＨに至適反応ｐＨを有するためア
ルカリｐＨでの利用は実質的に困難であり、このことが
ポリフェノールオキシダーゼの産業上の利用範囲を狭く
する要因となっていた。
【０００４】一方、動植物由来のポリフェノールオキシ
ダーゼの中には、ｐＨ８以上の高ｐＨに至適ｐＨを有す
るものが知られている。（Comp. Biochem. Physiol.,19
92,102B(4)891-896 : Zhongguo Nongye Huaxue Huizhi,
1991,29(2),177-185 : Agric. Biol. Chem.,1991,55
(1),13-17）しかしながら、これらのポリフェノールオ
キシダーゼを動植物の組織から安定かつ安価に生産する
ことは困難であり、産業上の利用に供するためには微生
物由来のポリフェノールオキシダーゼが望まれていた。
【０００５】
【本発明が解決しようとする課題】本発明が解決しよう
とする課題は、微生物が生産するｐＨ８以上のアルカリ
側に至適反応ｐＨを有するポリフェノールオキシダーゼ
とその生産微生物を提供し、これを用いることでアルカ
リｐＨでのポリフェノールの酵素的酸化を達成し、ポリ
フェノールオキシダーゼの利用分野の拡大に寄与するこ
とである。
【０００６】
【課題を解決するための手段・作用】ポリフェノール酸
化作用を持つ微生物由来の酵素として、担子菌類、不完
全菌類等の糸状菌が生産するポリフェノールオキシダー
ゼやラッカーゼが知られている。しかしながら、従来の
ポリフェノールオキシダーゼはｐＨ８以上のアルカリ側
で活性が著しく低いため、実際の用途が限られていた。
【０００７】そこで、本発明者らはポリフェノ−ル物質
の酸化をアルカリｐＨにおいて触媒する菌体外生産物を
広範な微生物において鋭意探索を行った。その探索は極
めて困難であったがついに、不完全菌類であるミロセシ
ウム（Myrothecium ）属に属する菌株がｐＨ８以上のア
ルカリ側に至適反応ｐＨを有する目的の酵素を菌体外に
生産することを見い出し、本発明を完成させるに至っ
た。
【０００８】すなわち本発明は以下のものを提供するも
のである。 １） 微生物由来のｐＨ８以上のアルカリ側に至適反応
ｐＨを有するポリフェノールオキシダーゼ。 ２） 下記の性質を有する前記１）記載のポリフェノー
ルオキシダーゼ。 （１）作用 ポリフェノールを酸化する。 （２）至適反応ｐＨ ｐＨ８．５〜９付近に至適反応ｐＨを有する。 （３）至適反応温度 約６０℃に至適反応温度を有する。 （４）分子量 ＧＦＣ分析により測定した分子量が約６２，０００。
【０００９】３） ミロセシウム（Myrothecium ）属細
菌由来の前記１）または２）記載のポリフェノールオキ
シダーゼ。 ４） ミロセシウム（Myrothecium ）属細菌がミロセシ
ウム・ヴェルカリア（Myrothecium verrucaria）である
前記３）記載のポリフェノールオキシダーゼ。 ５） ミロセシウム・ヴェルカリア（Myrothecium verr
ucaria）ＳＤ３００１（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４９
５５）から得ることの出来る前記１）または２）記載の
ポリフェノールオキシダーゼ。
【００１０】６） 前記１）〜５）のいずれか一項に記
載のポリフェノールオキシダーゼを作用させることを特
徴とする、フェノール化合物、アルコキシル基含有芳香
族、ハロゲン化フェノール化合物、または芳香族アミン
化合物の処理方法。 ７） 前記１）〜５）のいずれか一項に記載のポリフェ
ノールオキシダーゼを作用させることを特徴とする着色
物質の処理方法。 ８） 前記１）〜５）のいずれか一項に記載のポリフェ
ノールオキシダーゼを作用させることを特徴とする、微
生物またはウィルスの処理方法。 ９） 前記１）〜５）のいずれか一項に記載のポリフェ
ノールオキシダーゼを作用させることを特徴とする紙、
パルプ、または繊維の処理方法。
【００１１】１０） 洗浄剤、洗剤、または界面活性剤
と共に用いることを特徴とする前記１）〜５）のいずれ
か一項に記載のポリフェノールオキシダーゼの使用方
法。 １１） ペルオキシダーゼ作用を有する物質と共に用い
ることを特徴とする前記１）〜５）のいずれか一項に記
載のポリフェノールオキシダーゼの使用方法。 １２） 酸化剤として空気、酸素、オゾン、過酸化水
素、過酸化水素前駆体、過酸前駆体または過酸を、単独
で、または複数組み合わせて用いることを特徴とする前
記１）〜５）のいずれか一項に記載のポリフェノールオ
キシダーゼの使用方法。 １３） オキシダーゼ及びその基質と共に用いることを
特徴とする前記１）〜５）のいずれか一項に記載のポリ
フェノールオキシダーゼの使用方法。
【００１２】１４） ミロセシウム（Myrothecium ）属
細菌を培養することを特徴とする前記１）〜５）のいず
れか一項に記載のポリフェノールオキシダーゼの製造方
法。 １５） ミロセシウム（Myrothecium ）属細菌がミロセ
シウム・ヴェルカリア（Myrothecium verrucaria）であ
る前記１４）記載のポリフェノールオキシダーゼの製造
方法。 １６） ミロセシウム（Myrothecium ）属細菌がミロセ
シウム・ヴェルカリア（Myrothecium verrucaria）ＳＤ
３００１（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４９５５）または
その変異株である前記１４）記載のポリフェノールオキ
シダーゼの製造方法。 １７） ミロセシウム・ヴェルカリア（Myrothecium ve
rrucaria）ＳＤ３００１（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４
９５５）。 １８） 前記１〜５のいずれかに記載のポリフェノール
オキシダーゼを含むことを特徴とする洗剤組成物。
【００１３】（生産菌）本発明のポリフェノールオキシ
ダーゼを得るために用いるミロセシウム属に属する菌株
にはミロセシウム・ロリダム（Myrothecium roridum
）、ミロセシウム・ヴェルカリア（Myrothecium verru
caria）、ミロセシウム・プレストニ（Myrothecium pre
stonii ）、ミロセシウム・ロイコトリカム（Myrotheci
um leucotrichum）が挙げられるが、好ましくはミロセ
シウム・ヴェルカリア（Myrotheciumverrucaria）、特
に好ましくはミロセシウム・ヴェルカリア ＳＤ３００
１（Myrothecium verrucaria SD3001 ）( 工業技術院生
命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１４９５５とし
て寄託）を用いる。本発明での代表的な菌株について、
マルトエキス寒天培地上での集落の色調、形状及び分生
子、分生子形成構造等の形態観察の結果を下記に示す。
【００１４】 ────────────────────────────── 項目 性状 ────────────────────────────── 集落表面の色 白色〜黄白色，黒色の分生子座を認める 集落裏面の色 白色〜黄白色 集落表面の組織 やや羊毛状 菌糸 無色，滑面，幅 1.5〜 3μm フィアライド 円柱形， 3〜 6本輪生 大きさ10〜15× 1.5〜 2μm 分生子 紡錘形〜レモン形 大きさ 6〜8 × 2〜 3.5μm 一部は先端に扇形の付属糸を形成 ────────────────────────────── さらには、分生子の一部が先端に扇形の付属糸を形成す
ることから本菌株はミロセシウム・ヴェルカリア ＳＤ
３００１（Myrothecium verrucaria SD3001 ）と命名さ
れた。
【００１５】（酵素の調製）本発明のポリフェノールオ
キシダーゼは、前記のミロセシウム属に属する菌株及び
その変異株を培養して得られる他、遺伝子操作菌を利用
して調製することも可能である。すなわち、該ポリフェ
ノールオキシダーゼをコードするＤＮＡ配列と宿主生物
での酵素発現機能を有する適当なプロモーター、及びオ
ペレーター、ターミネーターＤＮＡ配列と共に、宿主生
物中でベクターを複製するための複製開始点を有するＤ
ＮＡベクターに挿入された発現ベクターを用いて形質転
換された宿主細胞、もしくは該ポリフェノールオキシダ
ーゼをコードするＤＮＡ配列と宿主生物での酵素発現機
能を有する適当なプロモーター、及びオペレーター、タ
ーミネーターＤＮＡ配列と共に、宿主細胞ＤＮＡにイン
テグレーションせしめることで形質転換された宿主細胞
を、ポリフェノールオキシダーゼの発現できる条件のも
とに培養し、さらにポリフェノールオキシダーゼを培地
から回収する方法によっても生産される。
【００１６】また、本発明のポリフェノールオキシダー
ゼは、該ポリフェノールオキシダーゼをコードするＤＮ
Ａ配列等をもとに得られる該ポリフェノールオキシダー
ゼのアミノ酸配列に関する知見をもとに、従来の酸性側
に至適反応ｐＨを有するポリフェノールオキシダーゼの
ＤＮＡを改変するプロテイン・エンジニアリングの手法
によって生産されるものであってもよい。
【００１７】本発明のポリフェノールオキシダーゼをコ
ードするＤＮＡ断片の取得のためには、例えば本発明の
菌株からのｃＤＮＡまたはゲノムライブラリィを分離源
とし、本発明のポリフェノールオキシダーゼのアミノ酸
配列もしくは既知のポリフェノールオキシダーゼのアミ
ノ酸配列に基づいて合成されたオリゴヌクレオチドをプ
ローブとして目的のＤＮＡ断片を特定するか、または酵
素活性を発現するクローンを選択するか、または該ポリ
フェノールオキシダーゼに対する抗体と反応する蛋白質
を生産するクローンを選択するといった常法によって行
うことができる。
【００１８】本発明のポリフェノールオキシダーゼを得
るための培養は、通常用いられる合成培地や有機炭素源
及び有機窒素源を含む栄養培地が使用可能である。ま
た、Ｃｕ2+イオンを金属塩として０．００１ｍＭから１
０ｍＭ、好ましくは０．０１ｍＭから１ｍＭの濃度で添
加することが望ましい。培養温度は１０〜３５℃、好ま
しくは２０〜３０℃である。また、適当な培養時間は２
０時間から１５０時間、好ましくは４０時間から１００
時間である。分泌されたポリフェノールオキシダーゼは
培地中から周知の方法で回収出来る。この回収手順に
は、遠心分離もしくはろ過、膜分離により培地から細胞
を分離し、例えばイオン交換クロマトグラフィー等によ
るクロマトグラフィーを行うという一連の手順によるこ
とができる。また、限外ろ過膜を用いる膜濃縮も有効で
ある。
【００１９】（酵素の性質）本発明のポリフェノールオ
キシダーゼの代表例であるミロセシウム・ヴェルカリア
ＳＤ３００１由来の酵素は５〜１１の広いｐＨ範囲で
酸化反応を行えるが、好ましくはｐＨ７〜１０、より好
ましくはｐＨ８〜９．５であり、ｐＨ８．５〜９付近に
至適ｐＨがあり、アルカリ側での酸化反応を触媒すると
いう特長を有する（図１）。また、至適温度は約６０℃
であり（図２）、さらには、様々な一定温度で３０分間
の加熱処理を施した後の活性は、例えば６０℃において
はほぼ１００％の残存活性を示した（図３）。さらに
は、様々なｐＨのバッファー中で３０℃、３０分間の処
理を施した後の残存活性は、広範囲のｐＨにおける安定
性を示した（図４）。これらの結果は、中性からアルカ
リ性の広範囲のｐＨ域で、中低温の様々な溶液中での酸
化反応を保証する。
【００２０】また、本発明のポリフェノールオキシダー
ゼは、従来の酸性側に至適反応ｐＨを有する酵素と共に
組み合わせて用いることも可能である。つまり、従来知
られている酸性側に至適反応ｐＨを有するポリフェノー
ルオキシダーゼと本発明のポリフェノールオキシダーゼ
を組み合わせて用いることで、酸性からアルカリ性の広
範囲のｐＨ域においてポリフェノールオキシダーゼ反応
を行うことが可能となる。このような目的で酵素を混合
して用いるとき、酸性側に至適反応ｐＨを有するポリフ
ェノールオキシダーゼの活性量と本発明のポリフェノー
ルオキシダーゼの活性量の混合比率は、好ましくは１：
１０〜１０：１、より好ましくは１：３〜３：１であ
る。このようにして広範囲のｐＨ域においてポリフェノ
ールオキシダーゼ反応を達成するためにも、本発明のポ
リフェノールオキシダーゼは有用である。
【００２１】（活性測定方法）本発明において、ポリフ
ェノール酸化活性の活性測定は２０℃において２０ｐｐ
ｍのシリンガルダジン（syringaldazine）と１００ｍＭ
のＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー溶液（pH8.7 ）を含む水
溶液中で反応を行い、５２５ｎｍの吸光度を測定するこ
とで行った。そして、１分間に１μｍｏｌのシリンガル
ダジンを酸化する活性量を１ｕｎｉｔ（以下Ｕと略す）
と定義した。また、本発明のポリフェノールオキシダー
ゼを用いてポリフェノール含有物の処理を行うときは、
０．１〜５ｕ／ｍｌの活性濃度で使用した。
【００２２】（用途）アルカリｐＨに至適反応域を有す
る新規なポリフェノールオキシダーゼの用途としては、
例えば、漂白への適用が可能である。ポリフェノール酸
化酵素の漂白への利用については、ＷＯ９１−０５８３
９、ＤＥ４００８８９４、特開昭６４−６０６９３など
に記載されている。しかしながら洗濯などの洗浄操作は
通常アルカリｐＨで行われ、特に過酸化水素存在下での
酸化漂白を同時に行う場合には過酸化水素の漂白作用を
促進するためにもアルカリｐＨでの洗浄操作が望まし
い。従って、こうした用途にポリフェノールオキシダー
ゼを用いる場合、酸性ｐＨに至適反応ｐＨを有する従来
の酵素では実質的に利用は困難であった。本発明のポリ
フェノールオキシダーゼはこうした、アルカリ洗浄、ア
ルカリ漂白分野に酵素の用途を開くものとして有用であ
る。
【００２３】過酸化水素による酸化漂白は洗浄、洗濯に
おいて現在広く用いられている。しかしながら、過酸化
水素は６０℃以下の低温でその漂白力が十分ではない。
これを改善するために、過酸前駆体が過酸化水素と共に
用いられているが、４０℃以下の低温での漂白力は十分
ではなく、より効果の高い漂白系が求められている。そ
のため、様々な酵素的漂白促進方法が従来より提案され
ている。ここに開示するポリフェノールオキシダーゼ
を、ペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、マ
ンガンペルオキシダーゼ等のペルオキシダーゼ作用を有
する物質の内の１つもしくは複数と共存させることで、
アルカリｐＨでの酸化漂白を促進することができ、本発
明の有用性は明かである。
【００２４】酸化漂白のために広く用いられている過酸
化水素は高価な酸化剤であり、そして、洗浄剤にしばし
ば用いられている過酸化水素前駆体や過酸前駆体、過酸
はさらに高価な酸化剤である。また、オキシダーゼとそ
の基質を用いることで過酸化水素を酵素的に生成するこ
とも可能だが、こうした過酸化水素発生系もまた高価な
酸化剤と考えることができる。ここに開示するポリフェ
ノールオキシダーゼを、従来から酸化漂白のために用い
られている酸化剤である空気、酸素、オゾン、過酸化水
素、過酸化水素前駆体、過酸前駆体、または過酸を、単
独で、または複数組み合わせて用いることで、酸化漂白
を促進することができる。従って、酸化剤を有効に用い
て酸化漂白を達成できる本発明の有用性は明かである。
【００２５】酸化剤の内、過酸化水素前駆体は水に溶解
してパーヒドロキシルイオンを生成するものである。こ
のような物質には、１水和物もしくは４水和物のパーボ
レート（過硼酸塩）、パーカーボネート（過炭酸塩）、
過ホウ砂、過ピロリン酸ナトリウム、過安息香酸、尿素
−Ｈ2 Ｏ2 反応物、メラミン−Ｈ2 Ｏ2 反応物、クエン
酸過水和物などがあり、特に好ましくはパーボレート、
パーカーボネートである。またさらには、過酸化水素前
駆体としてオキシダーゼ及びその基質による過酸化水素
発生系を用いることもできる。このようなオキシダーゼ
の例は、グルコースオキシダーゼ、アルコールオキシダ
ーゼ、グリセロールオキシダーゼ、アミンオキシダー
ゼ、アミノ酸オキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダー
ゼ、アリールアルコールオキシダーゼ、アルデヒドオキ
シダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、ソルボースオキ
シダーゼ、ウレートオキシダーゼ、キサンチンオキシダ
ーゼ、コレステロールオキシダーゼなどがあり、特に好
ましくはグルコースオキシダーゼ、アルコールオキシダ
ーゼである。
【００２６】また過酸前駆体は、反応性アシル基を有す
る有機化合物もしくはカルボン酸エステル、カルボン酸
無水物、酢酸塩であり、このような物質にはＴＡＥＤ
（tetraacetylethylenediamine）、ＴＡＭＤ（tetraace
tylmethylenediamine ）、ＴＡＧＵ（tetraacetylglyco
luril ）、ＤＡＤＨＴ（diacetyldioxohexahydrotriazi
ne）、ＳＮＯＢＳ（sodium nonanoyloxybenzene sulfon
ate ）、ＩＳＯＮＯＢＳ（sodium isononanoyloxybenze
ne sulfonate）、コハク酸無水物、安息香酸無水物、フ
タル酸無水物、ＰＡＧ（glucose pentaacetate）、キシ
ローステトラアセテートがあり、特に好ましくは、ＴＡ
ＥＤ、ＳＮＯＢＳである。さらに過酸は、例えばＤＰＤ
ＤＡ（diperoxydodecanedioic acid）、diperoxyisopht
halic acid、magnesium monoperoxyphthalate hexahydr
ate 、ＮＡＰＡＡ（nonylamidoperoxyadipic acid ）で
ある。
【００２７】本発明のポリフェノールオキシダーゼは、
様々な洗浄剤、洗剤、または界面活性剤と共に用いるこ
とができる。これにより、本発明のポリフェノールオキ
シダーゼを配合した洗浄剤または洗剤組成物が提供され
る。このような洗浄剤または洗剤組成物の代表例は、洗
浄剤または洗剤組成物重量当たり１０〜５０重量％の界
面活性剤、０〜５０重量％のビルダー、１〜５０重量％
のアルカリ剤あるいは無機電解質、０．１〜１０重量％
の再汚染防止剤、酵素、漂白剤、蛍光染料、ケーキング
防止剤及び酸化防止剤からなる群より選ばれる少なくと
も１種以上の配合成分からなる洗浄剤または洗剤組成物
が挙げられる。
【００２８】界面活性剤としては石鹸、例えば直鎖また
は分岐アルキルあるいはアルケニル硫酸塩、アミド硫酸
塩、直鎖または分岐鎖のアルキル基またはアルケニル基
を有し、エチレンオキサイド、プロピレンオキサイド及
びブチレンオキサイドのうちの単独あるいは複数成分が
付加したアルキルまたはアルケニルエーテル硫酸塩のよ
うな脂肪族硫酸化物、アルキルスルホン酸塩、アミドス
ルホン酸塩、ジアルキルスルホコハク酸塩、α−オレフ
ィン、ビニリデン型オレフィン及び内部オレフィンの各
スルホン酸塩のような脂肪族スルホン酸塩、直鎖または
分岐鎖のアルキルベンゼンスルホン酸塩のような芳香族
スルホン酸塩、直鎖または分岐鎖のアルキル基またはア
ルケニル基を有し、エチレンオキサイド、プロピレンオ
キサイド及びブチレンオキサイドのうちの単独あるいは
複数成分が付加したアルキルまたはアルケニルエーテル
カルボン酸塩またはアミド、α−スルホ脂肪酸塩または
エステル、アミノ酸型界面活性剤、アルキルまたはアル
ケニル酸性リン酸エステル、アルキルまたはアルケニル
リン酸塩のごときリン酸エステル系界面活性剤、スルホ
ン酸型両性界面活性剤、ベタイン型両性界面活性剤、直
鎖または分岐鎖のアルキル基またはアルケニル基を有
し、エチレンオキサイド、プロピレンオキサイド及びブ
チレンオキサイドのうちの単独あるいは複数成分が付加
したアルキルまたはアルケニルエーテルあるいはアルコ
ール、直鎖または分岐鎖のアルキル基またはアルケニル
基を有し、エチレンオキサイド、プロピレンオキサイド
及びブチレンオキサイドのうちの単独あるいは複数成分
が付加したポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテ
ル、高級脂肪酸アルカノールアミドまたはそのアルキレ
ンオキサイド付加物、ショ糖脂肪酸エステル、脂肪酸グ
リセリンモノエステル、アルキルまたはアルケニルアミ
ンオキサイド、テトラアルキルアンモニウム塩型カチオ
ン界面活性剤など洗剤組成物として通常配合される界面
活性剤であればいずれも使用可能であり、陰イオン性界
面活性剤の場合の対イオンとしてはナトリウムイオンま
たはカリウムイオンであることが好ましい。これらの界
面活性剤は、単独または２種以上の混合物として使用さ
れる。
【００２９】ビルダー及びアルカリ剤あるいは無機電解
質としてはオルソリン酸塩、ピロリン酸塩、トリポリ酸
塩、メタリン酸塩、ヘキサメタリン酸塩、フィチン酸塩
などのリン酸塩、エタン−1,1 −ジホスホン酸及びその
誘導体、エタンヒドロキシ−1,1,2 −トリホスホン酸、
エタン−1,2 −ジカルボキシ−1,2 −ジホスホン酸、メ
タンヒドロキシホスホン酸などのホスホン酸塩、2 −ホ
スホノブタン−1,2 −ジカルボン酸、1 −ホスホノブタ
ン−2,3,4 −トリカルボン酸、α−メチルホスホノコハ
ク酸などのホスホノカルボン酸塩、アスパラギン酸、グ
ルタミン酸などのアミノ酸塩、ニトリロ三酢酸塩、エチ
レンジアミン四酢酸塩、ジエチレントリアミン五酢酸塩
などのアミノポリ酢酸塩、ポリアクリル酸、ポリイタコ
ン酸、ポリマレイン酸、無水マレイン酸共重合体、カル
ボキシメチルセルロース塩などの高分子電解質、ポリエ
チレングリコール、ポリビニルアルコールなどの非解離
高分子、ジグリコール酸、オキシジコハク酸、カルボキ
シメチルオキシコハク酸、グルコン酸、クエン酸、乳
酸、酒石酸、ショ糖、ラクトースなどのカルボキシメチ
ル化物、ペンタエリスリトールのカルボキシメチル化
物、グルコン酸のカルボキシメチル化物、ベンゼンポリ
カルボン酸、シュウ酸、リンゴ酸、オキシジコハク酸、
グルコン酸などの有機酸塩、ゼオライトなどのアルミノ
ケイ酸塩、炭酸塩、セスキ炭酸塩、硫酸塩、メタケイ酸
塩などの無機塩をアルカリ金属塩として用いることがで
き、またデンプン、尿素などの有機物質及び塩化ナトリ
ウム、ベントナイトなどの無機化合物を用いることがで
き、更には有機アルカリ剤としてトリエタノールアミ
ン、ジエタノールアミン、モノエタノールアミン、トリ
イソプロパノールアミンなどを用いることができる。
【００３０】本発明の洗剤組成物は、前述のごとく、界
面活性剤、本発明のポリフェノールオキシダーゼ等を構
成成分として含むが、その必要に応じて両性界面活性
剤、例えばパーボレート、パーカルボネートなどの漂白
剤、色素、ビルダー、例えばポリエチレングリコール、
ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボ
キシメチルセルロースなどの再汚染防止剤、ケーキング
防止剤、酸化防止剤、例えば他のオキシダーゼやペルオ
キシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セ
ルラーゼなどのその他の酵素を必要に応じて含ませるこ
とができる。
【００３１】本発明の洗剤組成物にポリフェノールオキ
シダーゼ等の酵素を配合するには如何なる方法をもって
行ってもよいが、微粉末状で配合することは、洗剤取扱
い時の発塵による洗剤使用者や洗剤工業における作業者
の安全衛生上好ましいことではなく、溶液状態あるいは
あらかじめ発塵性をおさえた形状に賦形しておくことが
好ましい。この賦形は通常よく用いられるマルメ造粒、
押し出し造粒、流動造粒、遠心流動造粒やその他の方法
のいずれによるものであってもよく、本発明の洗剤組成
物に配合する酵素の形状は特にこれらの方法によって賦
形されたものに限定されるものではない。
【００３２】脱リグニン、漂白を目的として、パルプ工
程の一部において本発明の菌株を接種して本発明のポリ
フェノールオキシダーゼを生産せしめるか、もしくは直
接本発明の酵素標品を添加して、チップや粗砕パルプ等
に作用させるバイオパルピング、バイオ漂白が有用な用
途分野に挙げられる。この場合も、従来の酸性側に至適
反応ｐＨを有するポリフェノールオキシダーゼと比べ、
アルカリ側に至適反応ｐＨを有する本発明のポリフェノ
ールオキシダーゼの方がｐＨ調整のために使用する薬液
の量を削減することができコスト・ダウンが可能であ
る。
【００３３】ポリフェノールを構造部分に有する天然物
として、フラボノイド系、キサントン系、メラニン系な
どの植物色素やリグニンが知られており、ポリフェノー
ルオキシダーゼはこれらの天然物に対する酸化作用を有
する。また、毒性が問題になっているジクロロフェノー
ル、トリクロロフェノール等のＡＯＸをもポリフェノー
ルオキシダーゼは反応基質にできる。それ故に、例えば
これらの天然物や非天然物を含有する排水処理において
も本発明のポリフェノールオキシダーゼは有用である。
【００３４】また、本発明のポリフェノールオキシダー
ゼを用いるバイオセンサーは、本酵素の特性を反映し
て、中性からアルカリ性域のｐＨを有する様々な水溶
液、有機溶媒中の芳香族化合物をモニターするために用
いることができ有用である。また、本発明のポリフェノ
ールオキシダーゼにより発生するフェノキシラジカルの
反応性を利用して、中性〜アルカリ性のｐＨ域において
効率よく微生物やウィルスの殺菌や不活性化を行うこと
も可能である。つまり、ポリフェノールオキシダーゼの
基質自体の殺菌性に加えて、酵素的に発生するフェノキ
シラジカルによってより強力な殺菌性を与えることが可
能である。しかも、殺菌処理物がそののち人体に接触も
しくは摂取される場合、もしくは環境中に放出される場
合には、ポリフェノールオキシダーゼの基質は酸化によ
って毒性の軽減された物質に変わっているため、必要な
時点での殺菌性とその後の安全性の双方を達成でき、有
用性が高い。
【００３５】また、ポリフェノールオキシダーゼにより
発生するフェノキシラジカルやキノン類を利用してポリ
マー合成を行う場合も、適用する反応の拡大が期待で
き、本発明のポリフェノールオキシダーゼは有用であ
る。さらには、カテコール類等の易酸化性のポリフェノ
ールを含む物質群を酸化する場合、アルカリｐＨでの自
動酸化反応と酵素触媒的なポリフェノールの酸化反応を
同時に進行させることができるアルカリｐＨでのポリフ
ェノールオキシダーゼの使用は、効率の良い酸化のため
に極めて有効である。
【００３６】
【実施例】以下に本発明について代表的な例を示し、さ
らに具体的に説明する。ただし、これらは単なる例示で
あり、本発明はこれらのみに限られるものではない。
【００３７】実施例１：培養及び濃縮 ２リッター容のフラスコを培養装置に用い、０．５％グ
ルコース及び０．１％（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、１．３４％
Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・１２Ｈ2 Ｏ、０．３％ＫＨ2ＰＯ4 、
０．１％ＮａＣｌ、０．１％ペプトン、０．０１％酵母
エキス、０．１ｍＭ ＣｕＳＯ4 を含む４００ｍｌの培
地に２Ｎ−ＮａＯＨを加えてｐＨを８としたものに、ミ
ロセシウム・ヴェルカリア ＳＤ３００１（受託番号Ｆ
ＥＲＭＰ−１４９５５）を接種し、２７℃、３日間の振
とう培養を行った。培養後、４℃での遠心分離により除
菌された培養ブロスを得た。これをさらに精製、濃縮す
るためには限外ろ過膜が有効で、分子量１０，０００〜
１００，０００の分画範囲に精製、濃縮された粗精製濃
縮水溶液（20 U/ml ）を得た。
【００３８】実施例２：粗精製 １．３４％Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・１２Ｈ2 Ｏ、０．３％ＫＨ
2 ＰＯ4 、０．１％ＮａＣｌによって平衡化したＤＥＡ
Ｅ−Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ Ａ−８００ｍ（生化学工
業（株））カラム（φ20mm, 50cc）の上部に、実施例１
記載の除菌後の培養ブロスをカラム上部の空隙にアプラ
イし、通液開始と同時に１フラクション１５ｍｌで溶出
液の回収を開始した。３４５ｍｌの培養ブロスをアプラ
イした後、平衡化に使用したものと同組成の緩衝液によ
るカラム洗浄と、ＮａＣｌ濃度を０．１５Ｍに上昇させ
るステップワイズにより溶出を行った。各フラクション
の２８０ｎｍの吸光度とポリフェノールオキシダーゼ活
性値のパターンを図５に示した。フラクションの内、Ｎ
ｏ．１〜５５は０．１％ ＮａＣｌで溶出を行ったもの
で、Ｎｏ．５６〜７５は０．１５Ｍ ＮａＣｌで溶出を
行ったものである。酵素活性はフラクションＮｏ．５９
と６０において強く検出された。フラクションＮｏ．５
９と６０の詳細を以下に示した。
【００３９】
【表１】 なお、フラクションＮｏ．５９の吸光度を３８０ｎｍか
ら７００ｎｍの範囲で測定した結果、６００ｎｍ近辺で
の吸収極大が認められた（図６）。
【００４０】実施例３：基質特異性 実施例２記載のフラクションＮｏ．５９の粗精製ポリフ
ェノールオキシダーゼを用いてポリフェノール化合物酸
化反応の基質特異性を調べた。室温（２０℃）におい
て、０．０５ｍＭの基質と１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌバッファー溶液（pH8.7 ）における酵素添加、無添加
での酸素消費速度の差を測定することで行った。結果を
表２に示した。
【００４１】
【表２】
【００４２】実施例４：分子量 分子量測定は、ＧＦＣ（ゲルろ過クロマトグラフィー）
を用いて行った。１．３４％Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・１２Ｈ2
Ｏ、０．３％ＫＨ2 ＰＯ4 、１％ＮａＣｌによって流速
１．０ｍｌ／ｍｉｎで平衡化したＧＦＣカラム（Shodex
PROTEINKW-802.5,２連）とＵＶ検出器（２８０ｎｍ）
を用いるＨＰＬＣにより、実施例２記載のフラクション
Ｎｏ．５９の粗精製ポリフェノールオキシダーゼの分析
及び分取と活性測定を行ったところ、ポリフェノールオ
キシダーゼ活性ピークは分子量62,000であった。分子量
マーカー蛋白質は、オリエンタル工業（株）のＭＷ−Ｍ
ａｒｋｅｒ（ＨＰＬＣ）を用いた。なお、上記ＧＦＣ分
析（ＨＰＬＣ）におけるフラクションＮｏ．５９の溶出
パターンを図７に示した。
【００４３】実施例５：紅茶汚染布の漂白処理 ０．１％Ｔｗｅｅｎ８０、０．０２％の活性化ゼオライ
ト粉末を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウムバッファ−（ｐＨ
９．０）１０ｍｌに５×５ｃｍの紅茶汚染布を浸漬し、
さらにここに、あらかじめ実施例２記載のフラクション
Ｎｏ．５９の粗精製ポリフェノールオキシダーゼを他の
漂白剤と組み合わせて調製した配合物を添加し、これを
３０℃で４０分間振とうすることで洗浄、漂白処理を行
った。その後、水洗、風乾し、色彩色差計（CR-200, MI
NOLTA 製）によって Y,y,x値を測定し、さらに式［Ｚ＝
（１−ｘ−ｙ）Ｙ／ｙ］によってＺ値を算出した。そし
て、処理前後のＺ値の差（ΔＺ値）によって、白色度の
上昇を評価した。結果を表３に示す。なお紅茶汚染布
は、市販の紅茶１６０ｇ（ホテルレストラン ブレンド
セイロン，日本紅茶（株））を５リットルの沸騰水に
入れ、５分間煮沸後、ろ過により紅茶を取り除き、ろ液
を５分間沸騰させたあと木綿白布を入れ再び５分間煮沸
し、布を取り出し乾燥後、イオン交換水により十分に水
洗し、再乾燥したものを用いた。
【００４４】
【表３】
【００４５】実施例６：５リッター培養槽での培養及び
濃縮、粗精製 ０．５％グルコース及び０．１％ＮａＮＯ3 、１．３４
％Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・１２Ｈ2 Ｏ、０．３％ＫＨ2 ＰＯ
4 、０．１％ＮａＣｌ、０．２％ペプトン、２０ｐｐｍ
酵母エキス、０．０１％ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．１
ｍＭ ＣｕＳＯ4からなる３リッターの培地に１０％Ｎ
ａＯＨを加えてｐＨを８としたものを含む５リッター培
養槽にミロセシウム・ヴェルカリア ＳＤ３００１（受
託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４９５５）を接種し、２８℃、
３日間の振とう培養を行った。培養後、４℃での遠心分
離により除菌された培養ブロス２．５リッターを得た。
次に、この培養ブロスの一部を、ミニタン・フィルター
パケット（CAT.NO.: PTGC0MP04, ミリポア社製）を用い
るミニタン限外ろ過システム（ミリポア社製）によっ
て、分子量１０，０００以上の画分として濃縮した。こ
れをさらに、ＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ Ａ−
８００ｍカラムクロマトグラフィーに供し、溶出した活
性画分を再び、上記のミニタン限外ろ過システムによっ
て、分子量１０，０００以上の画分として再濃縮した。
さらにこの再濃縮液を２００ｐｐｍＮＨ4 ＨＣＯ3 に対
して透析後、凍結乾燥に供し、粗精製物を凍結乾燥品と
して得た。凍結乾燥品のポリフェノールオキシダーゼ活
性は１０Ｕ／ｍｇであった。
【００４６】実施例７：酵素含有洗剤による汚染布の処
理 ２５重量％のＬＡＳ及び５重量％のポリオキシエチレン
ラウリルエーテル、１５重量％のトリポリリン酸ナトリ
ウム、６重量％のケイ酸ナトリウム、１重量％のカルボ
キシメチルセルロースナトリウム、４８重量％のＮａ2
ＳＯ4 からなる指標洗剤１０グラムに、実施例６記載の
凍結乾燥品を０．１グラム添加したものを酵素配合洗剤
とし、凍結乾燥品を添加していないものを酵素非配合洗
剤とした。また、木綿白布（５ｃｍx ５ｃｍ）の中央に
１００ｐｐｍエバンスブルー（和光純薬工業（株））
０．２ｍｌを加えることで汚染布を調製した。次に、５
００ｍｌ容ビーカーに汚染布１枚と水１０ｍｌを加えた
後、さらに酵素配合洗剤または酵素非配合洗剤を１０ｍ
ｇ添加し、１２分間振とうすることで洗浄処理を行っ
た。処理後の汚染布は、水洗、風乾し、実施例５と同様
に色彩色差計（CR-200, MINOLTA 製）によってＺ値を算
出したところ、酵素配合洗剤は、酵素非配合洗剤に比
べ、６ポイントの白色度向上を示した。
【００４７】実施例８：粗精製パルプの漂白処理 ５００ｍｌ容のビーカーを培養装置に用い、０．３％グ
ルコース及び０．０５％（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、１．３４
％Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・１２Ｈ2 Ｏ、０．３％ＫＨ2 ＰＯ
4 、０．１％ＮａＣｌ、０．０２％ペプトン、５０ｐｐ
ｍ酵母エキス、０．０２ｍＭ ＣｕＳＯ4 、８％広葉樹
未漂白クラフトパルプ（LUKP）（カッパー価１８）を含
む５０ｍｌの培地に２Ｎ- ＮａＯＨを加えてｐＨを８．
５としたものにミロセシウム・ヴェルカリア ＳＤ３０
０１（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４９５５）を接種し、
２７℃、４日間の静置培養を行った後にカッパー価を測
定したところ５ポイントのカッパー価の向上を認めた。
【００４８】実施例９：従来のポリフェノールオキシダ
ーゼとの混合 試薬として市販されているポリフェノールオキシダーゼ
（Rigidoporus zonalis 由来、TaKaRa（株））０．１Ｕ
／ｍｌ溶液と、本発明のポリフェノールオキシダーゼの
０．２Ｕ／ｍｌ溶液を等容量混合したものを用いて様々
なｐＨで活性測定を行ったところ、図８に示したように
ｐＨ５〜１１の広範囲のｐＨにおいて酸化反応が進行し
た。
【００４９】
【発明の効果】以上詳細に説明した通り、本発明により
ｐＨ８以上のアルカリ側に至適反応ｐＨを有するポリフ
ェノールオキシダーゼが提供され、これを用いることに
よりアルカリｐＨでの酵素的酸化を達成し、ポリフェノ
ール物質や着色物質の酸化処理や、洗浄、漂白といった
ポリフェノールオキシダーゼの利用分野の拡大に寄与す
ることが示された。
【００５０】また、本発明のポリフェノールオキシダー
ゼの製造方法により、本発明のポリフェノールオキシダ
ーゼを効率良く製造できる。また、本発明のミロセシウ
ム・ヴェルカリア ＳＤ３００１は本発明のポリフェノ
ールオキシダーゼの製造に有効であり、更にパルプの漂
白処理に直接使用しても高い効果が得られる。また、本
発明のポリフェノールオキシダーゼを用いることによ
り、有効な着色物質の処理、紙、パルプもしくは繊維の
処理、漂白処理、洗浄処理、または、微生物もしくはウ
ィルスの処理等の方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＳＤ３００１由来のポリフェノールオキシダー
ゼのｐＨプロファイル。
【図２】ＳＤ３００１由来のポリフェノールオキシダー
ゼの温度プロファイル。
【図３】ＳＤ３００１由来のポリフェノールオキシダー
ゼの温度安定性を示すグラフ。
【図４】ＳＤ３００１由来のポリフェノールオキシダー
ゼのｐＨ安定性を示すグラフ。
【図５】各フラクションの２８０ｎｍの吸光度及び活性
値のパターン。
【図６】フラクション No.５９の吸光度を示すグラフ。
【図７】ＧＦＣ分析（ＨＰＬＣ）におけるフラクション
No.５９の溶出パターン。
【図８】ポリフェノールオキシダーゼ混合物のｐＨプロ
ファイル。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/14 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 福山 志朗 千葉県千葉市緑区大野台１丁目１番１号 昭和電工株式会社 総合研究所内 (72)発明者 大野 律子 千葉県千葉市緑区大野台１丁目１番１号 昭和電工株式会社 総合研究所内

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 微生物由来のｐＨ８以上のアルカリ側に
    至適反応ｐＨを有するポリフェノールオキシダーゼ。
  2. 【請求項２】 下記の性質を有する請求項１記載のポリ
    フェノールオキシダーゼ。 （１）作用 ポリフェノールを酸化する。 （２）至適反応ｐＨ ｐＨ８．５〜９付近に至適反応ｐＨを有する。 （３）至適反応温度 約６０℃に至適反応温度を有する。 （４）分子量 ＧＦＣ分析により測定した分子量が約６２，０００。
  3. 【請求項３】 ミロセシウム（Myrothecium ）属細菌由
    来の請求項１または２記載のポリフェノールオキシダー
    ゼ。
  4. 【請求項４】 ミロセシウム（Myrothecium ）属細菌が
    ミロセシウム・ヴェルカリア（Myrothecium verrucari
    a）である請求項３記載のポリフェノールオキシダー
    ゼ。
  5. 【請求項５】 ミロセシウム・ヴェルカリア（Myrothec
    ium verrucaria）ＳＤ３００１（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ
    −１４９５５）から得ることの出来る請求項１または２
    記載のポリフェノールオキシダーゼ。
  6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか一項に記載のポ
    リフェノールオキシダーゼを作用させることを特徴とす
    る、フェノール化合物、アルコキシル基含有芳香族、ハ
    ロゲン化フェノール化合物、または芳香族アミン化合物
    の処理方法。
  7. 【請求項７】 請求項１〜５のいずれか一項に記載のポ
    リフェノールオキシダーゼを作用させることを特徴とす
    る着色物質の処理方法。
  8. 【請求項８】 請求項１〜５のいずれか一項に記載のポ
    リフェノールオキシダーゼを作用させることを特徴とす
    る、微生物またはウィルスの処理方法。
  9. 【請求項９】 請求項１〜５のいずれか一項に記載のポ
    リフェノールオキシダーゼを作用させることを特徴とす
    る紙、パルプ、または繊維の処理方法。
  10. 【請求項１０】 洗浄剤、洗剤、または界面活性剤と共
    に用いることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項
    に記載のポリフェノールオキシダーゼの使用方法。
  11. 【請求項１１】 ペルオキシダーゼ作用を有する物質と
    共に用いることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一
    項に記載のポリフェノールオキシダーゼの使用方法。
  12. 【請求項１２】 酸化剤として空気、酸素、オゾン、過
    酸化水素、過酸化水素前駆体、過酸前駆体または過酸
    を、単独で、または複数組み合わせて用いることを特徴
    とする請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリフェノ
    ールオキシダーゼの使用方法。
  13. 【請求項１３】 オキシダーゼ及びその基質と共に用い
    ることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載
    のポリフェノールオキシダーゼの使用方法。
  14. 【請求項１４】 ミロセシウム（Myrothecium ）属細菌
    を培養することを特徴とする請求項１〜５のいずれか一
    項に記載のポリフェノールオキシダーゼの製造方法。
  15. 【請求項１５】 ミロセシウム（Myrothecium ）属細菌
    がミロセシウム・ヴェルカリア（Myrothecium verrucar
    ia）である請求項１４記載のポリフェノールオキシダー
    ゼの製造方法。
  16. 【請求項１６】 ミロセシウム（Myrothecium ）属細菌
    がミロセシウム・ヴェルカリア（Myrothecium verrucar
    ia）ＳＤ３００１（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４９５
    ５）またはその変異株である請求項１４記載のポリフェ
    ノールオキシダーゼの製造方法。
  17. 【請求項１７】 ミロセシウム・ヴェルカリア（Myroth
    ecium verrucaria）ＳＤ３００１（受託番号ＦＥＲＭ
    Ｐ−１４９５５）。
  18. 【請求項１８】 請求項１〜５のいずれかに記載のポリ
    フェノールオキシダーゼを含むことを特徴とする洗剤組
    成物。
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