JPH11318436A - ナノエマルジョンを用いて細胞培養試験における親油性物質の生体適合性を測定する方法およびこの方法に用いる分散体 - Google Patents

ナノエマルジョンを用いて細胞培養試験における親油性物質の生体適合性を測定する方法およびこの方法に用いる分散体

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JPH11318436A JP8126699A JP8126699A JPH11318436A JP H11318436 A JPH11318436 A JP H11318436A JP 8126699 A JP8126699 A JP 8126699A JP 8126699 A JP8126699 A JP 8126699A JP H11318436 A JPH11318436 A JP H11318436A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 親油性物質を細胞培養物の細胞中に送出する
のに用いるナノエマルジョンを提供する。 【解決手段】 ナノエマルジョンの油状粒子の直径は、
１００ｎｍより小さく、該粒子の表面は、両性乳化剤を
単分子層として有している。この油状粒子は、試験され
るべきであるかまたは細胞培養物中に送出されるべきで
ある親油性物質を含む。前述の油状粒子、前述の親油性
物質および水性相は、無菌である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、細胞培養試験にお
ける親油性物質の生体適合性を測定する方法、および前
述の方法において適切なナノエマルジョンに関するもの
である。
【０００２】
【従来の技術】ナノエマルジョン（またナノ粒子とも呼
ぶ）は、油状粒子から構成され、この表面は、水性分散
体中で両性乳化剤により占められる。このナノエマルジ
ョンは、水性相中でトリグリセリドまたは脂肪酸エステ
ルを高圧ホモジナイザーを用いて混合することにより、
製造することができる（欧州特許第ＥＰ−Ｂ１−０ ４
０６ １６２号明細書、H. G. Weder ）。
【０００３】現在までは、このナノエマルジョンは、医
薬調製物および／または化粧品調製物を製造するため、
およびナノエマルジョンが細胞培養においてエネルギー
供給源として作用する栄養液を調製するために、用いら
れていた（欧州特許第ＥＰ−Ｂ１−０ ４０６ １６２
号明細書、H. G. Weder ）。
【０００４】細胞培養手法は、極めて広範囲の用途を有
する生物学的システムである。これらの細胞の制御され
た培養は主として、免疫学において、バイオテクノロジ
ーにおいて、毒物学において、遺伝子技術においておよ
び細胞生物学において、用いられる。すべての前述の用
途において、物質の細胞との相互作用は、第一に重要で
ある。生化学的物質と細胞との交換は、多種の異なる物
質から成る培地において生じる。細胞のための理想的な
条件を得るために、ほとんどの場合において、血清を培
地に加える。しかし、多くの用途において、前述の培地
に血清を補足すると、重大な欠点が生じる。その理由
は、血清が不確定の組成を有し、高価であり、不所望な
成分、例えばウイルス、プリオンおよび病原菌を含有し
うるからである。従って、多くの用途のために、いわゆ
る無血清培地を得ることが、第一に重要である。
【０００５】細胞培養物に関する作業にあたり、一般的
な困難は、水に不溶である試験物質を用いることであ
る。可能であれば、親油性物質を、アルコールまたはジ
メチルスルホキシドに溶解し、次に培地に加える。しか
し、この結果、低い生物学的利用能を有する前述の物質
の不確定の分散体が生じる。溶解補助剤、例えばトウィ
ーン(Tween) ２０（商標）を用いる結果、不安定であ
り、かつ極めて有毒なエマルジョンが生成する。
【０００６】従って、現在までは、以下の問題を解決す
るための、信頼性があり、かつ簡単な方法は、得られな
かった： −親油性物質の細胞培養アッセイにおける生体適合性の
試験； −親油性物質の細胞培養アッセイにおける毒性および／
または遺伝子毒性の試験； −親油性物質の細胞培養物における生体内変化； −初代細胞培養物における細胞分化の促進； −導入されなかった脂質からの細胞の分離； −細胞の完全培地からの無血清培地への適合； −細胞培地への、細胞成長を促進する親油性物質の補
足； −細胞培地への、細胞内に望ましい物質の生合成を促進
する親油性物質の補足； −親油性物質の、細胞培養物の細胞中への明確であり、
かつ再現性のある輸送。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の第一の目的
は、前述の問題を解決するために、親油性物質を細胞培
養物に送出する方法であって、該親油性物質が、ビヒク
ルとしてナノエマルジョンを用いることにより前述の細
胞培養物中で試験されるべきものである方法を提供する
ことにある。前述のおよび他の目的、利点および特徴
は、以下の記載から明らかである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】これらの目的および他の
目的を達成するために、本発明は、次の方法および本発
明の方法において用いるのに適する次の分散体を提供す
る。親油性物質を細胞培養物の細胞中に、明確であり、
かつ再現性のある方式で送出する方法であって、前述の
方法が、（ａ）前述の親油性物質を含むナノエマルジョ
ンから成る分散体を、水性相で調製し、（ｂ）前述の分
散体を前述の細胞培養物に加え、さらに随意に（ｃ）前
述の細胞を、導入されなかった脂質から、遠心分離およ
び洗浄により分離する工程を含むことを特徴とする、親
油性物質を細胞培養物の細胞中に送出する方法。
【０００９】親油性物質の生体適合性を、細胞培養アッ
セイにおいて試験する方法であって、前述の方法が、
（ａ）試験するべき前述の親油性物質を含むナノエマル
ジョンから成る分散体を、水性相で調製し、（ｂ）前述
の分散体を前述の細胞培養物に加え、前述の試験を好ま
しくは化粧品の製造において用いる脂質に関して実施す
る工程を含むことを特徴とする、親油性分離の生体適合
性の試験方法。
【００１０】親油性物質の毒性および／または遺伝子毒
性を細胞培養アッセイにおいて試験する方法であって、
前述の方法が、（ａ）試験するべき前述の親油性物質を
含むナノエマルジョンから成る分散体を、水性相で調製
し、（ｂ）前述の分散体を前述の細胞培養物に加える工
程を含むことを特徴とする、親油性物質の毒性および／
または遺伝子毒性の試験方法。
【００１１】親油性物質を細胞培養物により生体内変化
させる方法であって、前述の方法が、（ａ）生体内変化
させるべき物質を含むナノエマルジョンから成る分散体
を、水性相で調製し、（ｂ）前述の分散体を前述の細胞
培養物に加え、（ｃ）生体内変化した物質を前述の細胞
培養物から採集する工程を含むことを特徴とする、親油
性物質を細胞培養物により生体内変化させる方法。
【００１２】初代細胞培養物における細胞分化を促進す
る方法であって、前述の方法が、（ａ）細胞分化を促進
することができる物質を含むナノエマルジョンから成る
分散体を、水性相で調製し、（ｂ）前述の分散体を前述
の細胞培養物に加える工程を含むことを特徴とする、初
代細胞培養物中で細胞分化を促進する方法。
【００１３】細胞培養物の培地に、重量を基準とする細
胞の成長を促進する親油性物質を補足する方法であっ
て、前述の方法が、（ａ）細胞の成長を促進する物質を
含むナノエマルジョンから成る分散体を、水性相で調製
し、（ｂ）前述の分散体を前述の細胞培養物に加える工
程を含むことを特徴とする、細胞培養物の培地に親油性
物質を補足する方法。
【００１４】細胞培養物の培地に、細胞内での望ましい
物質の生合成を促進する親油性物質を補足する方法であ
って、前述の方法が、（ａ）前述の生合成を促進する物
質を含むナノエマルジョンから成る分散体を、水性相で
調製し、（ｂ）前述の分散体を前述の細胞培養物に加え
る工程を含むことを特徴とする、細胞培養物の培地に細
胞内での望ましい物質の生合成を促進する親油性物質を
補足する方法。
【００１５】親油性物質を細胞培養物の細胞中に送出す
るのに有用な無菌の分散体であって、前述の分散体が、
水性相でのナノエマルジョンから成り、前述の分散体の
油状粒子が、送出されるべき前述の親油性物質を含み、
前述の油状粒子の表面が、無毒性両性乳化剤により占め
られ、ここで、前述の親油性物質を溶解する前述の油状
成分の前述の細胞培養物に対する毒性が、好ましくは、
この細胞培養物の成長の低減が油状成分を含まない基準
培養物と比較して２０％より小さい程度に低いことを特
徴とする、親油性物質を細胞培養物の細胞中に送出する
のに有用な無菌の分散体。
【００１６】親油性物質を細胞培養により試験するのに
有用な無菌の分散体であって、前述の分散体が、水性相
でのナノエマルジョンから成り、前述の分散体の油状粒
子が、試験されるべき前述の親油性物質を含み、前述の
油状粒子の表面が、無毒性両性乳化剤により占められ、
ここで、前述の親油性物質を溶解する前述の油状成分の
前述の細胞培養物に対する毒性が、好ましくは、この細
胞培養物の成長の低減が油状成分を含まない基準培養物
と比較して２０％より小さい程度に低いことを特徴とす
る、親油性物質を細胞培養により試験するのに有用な無
菌の分散体。
【００１７】好ましくは、前述の分散体は、油状成分と
して脂肪酸Ｃ１８：１（オレイン酸）および／またはＣ
１８：２（リノール酸）のトリグリセリドを含み、前述
の油状成分１重量部につき前述の両性乳化剤０．６５〜
０．７５重量部を含むナノエマルジョンを含む。
【００１８】
【発明の実施の形態】本発明において有用なナノエマル
ジョンを、成分を一緒に混合し、この混合物を高圧ホモ
ジナイザーを通過させることにより、容易に製造するこ
とができる。
【００１９】好ましくは、ナノエマルジョンの油状粒子
の直径は、１００ｎｍより小さく、特に４０ｎｍより小
さく、好ましくは該粒子の表面は、両性乳化剤を単分子
層として有している。
【００２０】好ましくは、ナノエマルジョンは、負のゼ
ータ電位、特に−１０ｍＶ〜−５０ｍＶ、とりわけ−３
０ｍＶ〜−４０ｍＶのゼータ電位を有する。しかし、特
定の用途において、正のゼータ電位を有するナノエマル
ジョンが有利であることがある。このような陽イオン系
ナノエマルジョンを、例えば、Ｃ8 〜Ｃ22アルキルアミ
ンを加えることにより、得ることができる。
【００２１】好ましくは、ナノエマルジョンは、１重量
部の油につき、０．４重量部より多量の、特に０．４５
〜０．７５重量部の両性乳化剤を含む。一般的な法則と
して、油状粒子の直径は、両性乳化剤の比率が低下する
に伴って増大する。
【００２２】好ましくは、両性乳化剤自体が、細胞培養
物に対して低い毒性を有し、好ましくはレシチンをこの
目的のために用いる。
【００２３】好ましくは、油状相も同様に、細胞培養物
に対して低い毒性、特に細胞培養物の成長の低減が油状
成分を含まない基準培養物と比較して２０％より小さい
程度に低い毒性を有する。
【００２４】本目的に特に有用なのは、天然トリグリセ
リドであり、とりわけ、脂肪酸Ｃ１８：１（オレイン
酸）および／または脂肪酸Ｃ１８：２（リノール酸）の
天然トリグリセリドである。前述の脂肪酸は、毒性が極
めて低く、親油性試験物質用の溶媒として特に有用であ
る。
【００２５】前述のように、ナノエマルジョンを、成分
の予備混合物を高圧でホモジナイズすることにより、調
製することができる。好ましくは、レシチン対油の比率
は、０．４１よりも高い。最適な混合物は、例えば０．
６のレシチン対油の比率を有する。さらに、ナノエマル
ジョンが小さい粒径を有する場合には、大いに有利であ
る。７０ｎｍより小さい油状小滴を含む水中油型エマル
ジョンは、透明である。このような透明なナノエマルジ
ョンにより、細胞培養の視覚的制御が容易になる。さら
に、小さい平均粒度（例えば１００ｎｍ）の分散体を、
濾過により容易に滅菌することができる。
【００２６】ナノエマルジョンは、極めて安定であり、
細胞培養物に加える前に冷蔵庫中で数カ月にわたり貯蔵
することができる。
【００２７】
【実施例】本発明の好ましい実施態様を、次の実施例お
よび添付した図面につき記載し、説明する。 実施例１ 低い毒性を有するナノエマルジョンを用いたＴＫ−６リ
ンパ芽球様細胞の処理ＴＫ−６細胞を、２ミリモルのグ
ルタミン、５％のゲンタマイシンおよび１０％のウマ血
清を補足したＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。細
胞懸濁液を、２〜３日おきに、新たな細胞培養フラスコ
中に接種した。細胞の数を、ノイバウアー チャンバー
(Neubauer chamber)により測定した。細胞の成長に対す
るナノエマルジョン１および中空のレシチン粒子（リポ
ソーム）の影響を、種々の濃度について２日後に測定し
た。
【００２８】図１は、未処理細胞と比較した相対的細胞
の数を示す（「対照」を１００％とする）。ナノエマル
ジョン１（「ナノ１」）は、６％の濃度まで、細胞成長
に対して影響を与えなかった。乳化剤（「乳化」）は、
８％までの濃度においてさえも、相対的細胞数に対して
影響を与えなかった。
【００２９】図２は、他の油状成分を含むナノエマルジ
ョンは、同一の濃度および同一の乳化剤を用いた際にナ
ノエマルジョン１中の油状成分よりも本質的に毒性が高
いことを示す。図２において、油状成分は、ヒマワリ油
（「ナノ２」）、水素化落花生油（「ナノ３」）および
飽和Ｃ８／１０トリグリセリド（「ナノ４」）であっ
た。
【００３０】ナノエマルジョン１の組成 レシチン ０．６％ トリグリセリド １．０％ 内訳 ９０％のＣ１８：１および １０％のＣ１８：２ 粒径 ４１ｎｍ ナノエマルジョン２の組成 レシチン ０．６％ ヒマワリ油 １．０％ 粒径 ４５ｎｍ ナノエマルジョン３の組成 レシチン ０．６％ 水素化落花生油 １．０％ 粒径 ５０ｎｍ ナノエマルジョン４の組成 レシチン ０．６％ カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド １．０％ 粒径 ４５ｎｍ
【００３１】実施例２ ナノエマルジョンによるＴＫ−６リンパ芽球様細胞中へ
の紫外線フィルターの制御された送出 ＴＫ−６細胞を、２ミリモルのグルタミン、５％のゲン
タマイシンおよび１０％のウマ血清を補足したＲＰＭＩ
−１６４０培地中で培養した。それぞれ１％、５％およ
び１０％のナノエマルジョン５を、細胞懸濁液（７×１
０5 個の細胞／ｍｌ）に加えた。１０分間のインキュベ
ーション時間の後、各々の培養物１０ｍｌを遠心分離
し、細胞を、１０ｍｌの緩衝液で２回洗浄した。細胞中
の紫外線フィルター物質(UV filter) の量を、クロロホ
ルムで抽出した後に、吸収を測定することにより測定し
た（表１）。ナノエマルジョン５を用いて、所定の量の
紫外線フィルター物質を、細胞中に送出することができ
た。
【００３２】
【表１】
【００３３】細胞中へのナノ粒子の取り込みは、時間依
存性であった。図３は、細胞中への紫外線フィルター物
質の取り込みの時間依存性の経過を示す。１ｍｌあたり
２×１０5 個の細胞を、２％のナノエマルジョン５と共
にインキュベートした。それぞれ５、１５、３０、６０
および３００分後に、各々の細胞培養物１０ｍｌを遠心
分離した。細胞を、１０ｍｌの緩衝液で２回洗浄し、次
にクロロホルムで抽出した。種々の抽出物における紫外
線フィルター物質の相対的濃度を、図３に示す。
【００３４】これとは対照的に、紫外線フィルター物質
の０．５％アルコール溶液を２％含む培地からＴＫ−６
細胞中への、紫外線フィルター物質であるイソアミルメ
トキシジンナメートの取り込みは、完全に不確定的であ
った。その理由は、細胞を、紫外線フィルター物質分散
体から適切に分離することができなかったからである
（表２）。
【００３５】
【表２】
【００３６】 ナノエマルジョン５の組成 レシチン ０．６％ トリグリセリド ０．５％ 内訳 ９０％のＣ１８：１および １０％のＣ１８：２ イソアミルメトキシジンナメート ０．５％ （４−（４−メトキシフェニル）−２−プロピオン酸−３−メチルブチルエス テル） 粒径 ４９ｎｍ
【００３７】実施例３ ナノエマルジョンによる繊維芽細胞およびＴＫ−６リン
パ芽球様細胞中への紫外線フィルター物質の制御された
送出 ＴＫ−６細胞を、実施例１に記載したようにして培養し
た。繊維芽細胞（正常なヒト皮膚繊維芽細胞）を、無血
清培地（プロモセル(PromoCell) （商標））中で培養し
た。２％のナノエマルジョン６を培養物に加え、１時間
後に、取り込まれた紫外線フィルター物質の量を、実施
例２に記載したようにして、測定した（表３）。
【００３８】 ナノエマルジョン６の組成 レシチン ０．６％ トリグリセリド ０．９％ 内訳 ９０％のＣ１８：１および １０％のＣ１８：２ ブチルメトキシジベンゾイルメタン ０．１％ （１−（４−メトキシフェニル）−３−（４−ｔ−ブチルフェニル）−３−ヒ ドロキシ−２−プロペン−１−オン） 粒径 ５０ｎｍ
【００３９】
【表３】
【００４０】実施例４ ＴＫ−６リンパ芽球様細胞に対する紫外線フィルター物
質の毒性の測定 ＴＫ−６細胞を、実施例１に記載したようにして、ＲＰ
ＭＩ−１６４０培地中で培養した。細胞の数を、ノイバ
ウアー チャンバーにより測定した。カプセル封入した
紫外線フィルター物質を含むナノエマルジョン５、６、
７および８の影響および紫外線フィルター物質を含まな
いナノエマルジョン１の影響を、２日後に種々の濃度に
おいて測定した。図４に、未処理の細胞と比較した相対
的細胞数を示す（対照を１００％とする）。異なる紫外
線フィルター物質の毒性は種々であり、用いた濃度に依
存する。
【００４１】 ナノエマルジョン７の組成 レシチン ０．６％ トリグリセリド ０．９％ 内訳 ９０％のＣ１８：１および １０％のＣ１８：２ イソアミルメトキシジンナメート ０．１％ （４−（４−メトキシフェニル）−２−プロピオン酸−３−メチルブチルエス テル） 粒径 ６０ｎｍ ナノエマルジョン８の組成 レシチン ０．６％ トリグリセリド ０．９％ 内訳 ９０％のＣ１８：１および １０％のＣ１８：２ ベンゾフェノン ０．１％ （２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン） 粒径 ６０ｎｍ
【００４２】実施例５ 紫外線照射に露光した紫外線フィルター物質の毒性の測
定 ＴＫ−６細胞を、実施例１に記載したようにして、ＲＰ
ＭＩ−１６４０培地中で培養した。細胞の数を、ノイバ
ウアー チャンバーにより測定した。カプセル封入した
紫外線フィルター物質を含むナノエマルジョン５および
６の影響並びに紫外線フィルター物質を含まないナノエ
マルジョン１の影響を、前述のナノエマルジョンの紫外
線照射前並びにＵＶ−Ａ照射およびＵＶ−Ｂ照射後に測
定した（図５）。
【００４３】実施例６ 紫外線照射に露光した化粧品脂質フィルター物質の毒性
の測定 ＴＫ−６細胞を、実施例１に記載したようにして、ＲＰ
ＭＩ−１６４０培地中で培養した。細胞の数を、ノイバ
ウアー チャンバーにより測定した。カプセル封入した
多価不飽和脂肪酸（リノレン酸）を含むナノエマルジョ
ン９の細胞に対する影響およびナノエマルジョン１の細
胞に対する影響を、前述のナノエマルジョンの紫外線照
射前並びにＵＶ−Ａ照射およびＵＶ−Ｂ照射後に測定し
た（図６）。
【００４４】ナノエマルジョン９の組成 レシチン ０．６％ トリグリセリド ０．８％ ルリヂサ油 ０．２％ 粒径 ６０ｎｍ
【００４５】実施例７ 使用済み揚げ油の遺伝子毒性の測定 遺伝子毒性物質の突然変異誘発の割合を、例えば適切な
選択的なプリンまたはピリミジン栄養要求性を有するＣ
ＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）において
測定することができる。使用済み揚げ油の遺伝子毒性
を、これを適切なナノエマルジョン（例えばナノエマル
ジョン１０）中にカプセル封入することにより、測定す
ることができる。
【００４６】ナノエマルジョン１０の組成 レシチン ０．７％ 揚げ油 １．０％ 粒径 ８５ｎｍ
【００４７】実施例８ 殺虫剤および除草剤の神経毒性の測定 リンデン（γ−１，２，３，４，５，６−ヘキサクロロ
シクロヘキサン）の固有の神経毒性を、溶解性の問題に
遭遇せずに、カプセル封入したリンデンを含む適切なナ
ノエマルジョン（例えばナノエマルジョン１１）と共
に、ＣＨＥＮ細胞（ヒナドリ胚神経細胞）をインキュベ
ートすることにより、試験管内で測定することができ
る。
【００４８】ナノエマルジョン１１の組成 レシチン ０．３８％ カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド ０．８１％ リンデン ０．０９％
（γ−１，２，３，４，５，６−ヘキサクロロシクロヘ
キサン） 粒径 ７５ｎｍ
【００４９】実施例９ 薬物の神経毒性の測定 ヴァリウム(Valium)（商標）（ジアゼパム）の固有の神
経毒性を、カプセル封入したヴァリウム（商標）を含む
適切なナノエマルジョン（例えばナノエマルジョン１
２）と共に、ＣＨＥＮ細胞（ヒナドリ胚神経細胞）をイ
ンキュベートすることにより、濃度依存様式で試験管内
で容易に測定することができる。
【００５０】ナノエマルジョン１２の組成 レシチン ３．３２％ カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド ７．２０％ ヴァリウム（商標） ０．３６％
（７−クロロ−１−メチル−５−フェニル−１，４−ベ
ンゾジアゼピン−２−オン） 粒径 ８０ｎｍ
【００５１】実施例１０ 細胞培養物中のホルモン前駆物質の生体内変化 バイオテクノロジーにおいて、合成物の化学分子、例え
ばホルモンを、細胞培養により容易に調製することがで
きる。従って、前述の分子の前駆物質を、培地に加える
ことができる。細胞において、前駆物質は、特異的な酵
素に変化し、次に再び培地中に放出される。ナノエマル
ジョンにより、親油性の分離された物質を、これらの細
胞中に効率的に送出することができる。次に、カプセル
封入された分離された物質を、培地に放出された生成物
から、簡単な分離方法、例えば透析または「クロスフロ
ー(Cross-Flow)」限外濾過により、容易に分離すること
ができる。例えば１７−ヒドロキシプロゲステロンを、
精巣組織培養物の間質細胞中に、制御された方法により
送出することができる。前述の物質は、前述の細胞にお
いて、５−α−アンドロスタン−１７−β−オール−３
−オンに変化し、これは次に、培地に再び放出される。
【００５２】実施例１１ ナノエマルジョンによる一次皮膚ケラチン細胞の細胞分
化の促進 胚のブタの皮膚ケラチン細胞を、１０％の血清および
０．４μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾンを含むＭ１９９培
地中で培養した。１％のナノエマルジョン１３を培地に
加えることにより、ケラチン細胞の分化が改善された。
【００５３】ナノエマルジョン１３の組成 レシチン ０．６％ カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド ０．６％ ビタミンＥ酢酸 ０．３％ ビタミンＡパルミチン酸 ０．１％ 粒径 ４５ｎｍ
【００５４】実施例１２ 無血清細胞培地を補足するためのビタミンＡおよびビタ
ミンＥを含むナノエマルジョンを用いた細胞成長の促進 特定の抗体を生成するハイブリドーマ細胞を、無血清培
地（セル カルチャーテクノロジーズ(Cell Culture Te
chnologies) ）中で培養した。細胞成長を、ナノエマル
ジョン１３を加えることにより、改善することができた
（図７）。
【００５５】実施例１３ ナノエマルジョンによる繊維芽細胞の無血清細胞培養物
の補足によるバイオマス生成の増大 ＢＡＬＢ／３Ｔ３繊維芽細胞を、種々の濃度のナノエマ
ルジョン１３において、無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２−
（１：１）培地（バイオコンセプト(BioConcept)）中で
培養した。９日後に５０ｍｌの培養物を収穫し、バイオ
マスを測定した（図８）。
【００５６】実施例１４ ビタミンＡおよびビタミンＥを含むナノエマルジョンを
用いることによる繊維芽細胞の無血清培地への適合 ３Ｔ３繊維芽細胞を、１０％の血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ
１２−（１：１）培地(BioConcept)中で培養した。集密
的培養物をトリプシン処理し、種々の濃度のナノエマル
ジョン１３を含む無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２−（１：１）
培地中に接種した。細胞成長を、集密度を評価すること
により、種々の時間の後に測定した（図９）。
【００５７】実施例１５ 不飽和脂肪酸、ビタミンおよびβ−カロテンを含むナノ
エマルジョンを用いることによる無血清培地中のハイブ
リドーマ細胞における特異的抗体の生合成の促進無血清
培地は、タンパク質の生成に特に適する。その理由は、
無血清培地が、生成物の分離に影響しうる外来タンパク
質を何も含んでいないからである。しかし、無血清細胞
培養において、通常血清中に存在する必須の親油性物
質、例えば不飽和脂肪酸およびビタミンは、しばしば欠
乏している。これらの物質は、無血清培地に躊躇せずに
加えることはできない。その理由は、これらの物質は、
水不溶性であり、制御された方式で分散させることが困
難であり、低い生物学的利用能を示すのみであるからで
ある。必須の脂質を含むナノエマルジョン（例えばナノ
エマルジョン１４）をこれらの培地に補足することによ
り、例えばハイブリドーマ細胞における特異的な抗体の
生成を、顕著に改善することができる。
【００５８】ナノエマルジョン１４の組成 レシチン ０．３０％ トリグリセリド ０．５０％ α−トコフェロール ０．０１００％ ビタミンＡ酢酸 ０．００５０％ リノール酸 ０．０１００％ リノレン酸 ０．０１００％ β−カロテン ０．０００１％ 粒径 ６５ｎｍ
【００５９】実施例１６ ナノエマルョンを用いることによる組換えタンパク質の
生合成の促進 ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）は、し
ばしば、組換えタンパク質、例えば成長因子、血液凝固
因子およびサイトカインを生成するために用いられる。
これにより、これらの生成物の無血清培地中での生合成
を、必須の親油性物質を含むナノエマルジョン（例えば
ナノエマルジョン１３）を加えることにより、改善する
ことができる。
【００６０】実施例１７ ナノエマルジョンの灌流系においての使用 また、ナノエマルジョン１３を、灌流系において培養し
た繊維芽細胞のインターフェロン−β分泌を増大させる
ために、用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 トリグリセリドを含むナノエマルジョンの毒
性を示すグラフである。
【図２】 他の油状成分を含むナノエマルジョンの毒性
を示すグラフである。
【図３】 細胞中への紫外線フィルター物質の取り込み
の時間依存性の経過を示すグラフである。
【図４】 ＴＫ−６リンパ芽球様細胞に対する紫外線フ
ィルター物質の毒性を示すグラフである。
【図５】 紫外線照射に露光した紫外線フィルター物質
の毒性を示すグラフである。
【図６】 紫外線照射に露光した化粧品脂質フィルター
物質の毒性を示すグラフである。
【図７】 ハイブリドーマ細胞成長を、ビタミンＡおよ
びビタミンＥを含むナノエマルジョンを加えることによ
り改善することができることを示すグラフである。
【図８】 ナノエマルジョンによる繊維芽細胞の無血清
細胞培養物の補足によるバイオマス生成の増大を示すグ
ラフである。
【図９】 ビタミンＡおよびビタミンＥを含むナノエマ
ルジョンを含む無血清培地中での繊維芽細胞の成長を示
すグラフである。

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 親油性物質を細胞培養物の細胞中に、明
    確であり、かつ再現性のある方式で送出する方法であっ
    て、前記方法が、（ａ）前記親油性物質を含むナノエマ
    ルジョンから成る分散体を、水性相で調製し、（ｂ）前
    記分散体を前記細胞培養物に加える工程を含むことを特
    徴とする、親油性物質を細胞培養物の細胞中に送出する
    方法。
  2. 【請求項２】 さらに、（ｃ）前記細胞を、導入されな
    かった脂質から、遠心分離および洗浄により分離する工
    程を含むことを特徴とする、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記親油性物質の前記細胞中への取り込
    みが、前記親油性物質の培地中での分散性によっても、
    該親油性物質の細胞膜における浸透性によっても影響さ
    れないことを特徴とする、請求項１または２記載の方
    法。
  4. 【請求項４】 親油性物質の生体適合性を、細胞培養ア
    ッセイにおいて試験する方法であって、前記方法が、
    （ａ）試験するべき前記親油性物質を含むナノエマルジ
    ョンから成る分散体を、水性相で調製し、（ｂ）前記分
    散体を前記細胞培養物に加える工程を含むことを特徴と
    する、親油性物質の生体適合性の試験方法。
  5. 【請求項５】 前記試験を化粧品の製造において用いる
    脂質に関して実施することを特徴とする、請求項４記載
    の方法。
  6. 【請求項６】 親油性物質の毒性または遺伝子毒性を細
    胞培養アッセイにおいて試験する方法であって、前記方
    法が、（ａ）試験するべき前記親油性物質を含むナノエ
    マルジョンから成る分散体を、水性相で調製し、（ｂ）
    前記分散体を前記細胞培養物に加える工程を含むことを
    特徴とする、親油性物質の毒性または遺伝子毒性の試験
    方法。
  7. 【請求項７】 親油性物質を細胞培養物により生体内変
    化させる方法であって、前記方法が、（ａ）生体内変化
    させるべき物質を含むナノエマルジョンから成る分散体
    を、水性相で調製し、（ｂ）前記分散体を前記細胞培養
    物に加え、（ｃ）生体内変化した物質を前記細胞培養物
    から採集する工程を含むことを特徴とする、親油性物質
    を細胞培養物により生体内変化させる方法。
  8. 【請求項８】 初代細胞培養物における細胞分化を促進
    する方法であって、前記方法が、（ａ）細胞分化を促進
    することができる親油性物質を含むナノエマルジョンか
    ら成る分散体を、水性相で調製し、（ｂ）前記分散体を
    前記細胞培養物に加える工程を含むことを特徴とする、
    初代細胞培養物中で細胞分化を促進する方法。
  9. 【請求項９】 細胞培養物の培地に、重量を基準とする
    細胞の成長を促進する親油性物質を補足する方法であっ
    て、前記方法が、（ａ）細胞の成長を促進する物質を含
    むナノエマルジョンから成る分散体を、水性相で調製
    し、（ｂ）前記分散体を前記細胞培養物に加える工程を
    含むことを特徴とする、細胞培養物の培地に親油性物質
    を補足する方法。
  10. 【請求項１０】 細胞培養物の培地に、細胞内での望ま
    しい物質の生合成を促進する親油性物質を補足する方法
    であって、前記方法が、（ａ）前記生合成を促進する物
    質を含むナノエマルジョンから成る分散体を、水性相で
    調製し、（ｂ）前記分散体を前記細胞培養物に加える工
    程を含むことを特徴とする、細胞培養物の培地に細胞内
    での望ましい物質の生合成を促進する親油性物質を補足
    する方法。
  11. 【請求項１１】 親油性物質を細胞培養物の細胞中に送
    出するのに有用な無菌の分散体であって、前記分散体
    が、水性相でのナノエマルジョンから成り、前記分散体
    の油状粒子が、送出されるべき前記親油性物質を含み、
    前記油状粒子の表面が、無毒性両性乳化剤により占めら
    れていることを特徴とする、無菌の分散体。
  12. 【請求項１２】 親油性物質を細胞培養により試験する
    のに有用な無菌の分散体であって、前記分散体が、水性
    相でのナノエマルジョンから成り、前記分散体の油状粒
    子が、試験されるべき前記親油性物質を含み、前記油状
    粒子の表面が、無毒性両性乳化剤により占められている
    ことを特徴とする、無菌の分散体。
  13. 【請求項１３】 前記親油性物質を溶解する前記油状成
    分の前記細胞培養物に対する毒性が、この細胞培養物の
    成長の低減が油状成分を含まない基準培養物と比較して
    ２０％より小さい程度に低いことを特徴とする、請求項
    １１または１２記載の分散体。
  14. 【請求項１４】 前記油状成分が、脂肪酸Ｃ１８：１
    （オレイン酸）およびＣ１８：２（リノール酸）から成
    る群から選択されたトリグリセリドから選択されている
    ことを特徴とする、請求項１３記載の分散体。
  15. 【請求項１５】 前記ナノエマルジョンが、前記油状成
    分１重量部につき前記両性乳化剤を０．６５〜０．７５
    重量部含むことを特徴とする、請求項１１または１２記
    載の分散体。
JP8126699A 1998-03-30 1999-03-25 ナノエマルジョンを用いて細胞培養試験における親油性物質の生体適合性を測定する方法およびこの方法に用いる分散体 Pending JPH11318436A (ja)

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