JPH11318461A

JPH11318461A - ヒトニューロプシン、そのｄｎａ配列、その遺伝子、及びそのプライマー

Info

Publication number: JPH11318461A
Application number: JP10133615A
Authority: JP
Inventors: Sadao Shiosaka; 貞夫塩坂; Shigetaka Yoshida; 成孝吉田
Original assignee: Medical and Biological Laboratories Co Ltd
Current assignee: Medical and Biological Laboratories Co Ltd
Priority date: 1998-05-15
Filing date: 1998-05-15
Publication date: 1999-11-24

Abstract

(57)【要約】【課題】脳の海馬に特異的に発現されている新規なヒ
トニューロプシン、そのＤＮＡ配列、その遺伝子及びそ
のプライマを提供する。【解決手段】脳の海馬に特異的に発現する新規なヒト
ニューロプシン（下記表のアミノ酸配列で表される蛋白
質）は、神経系の細胞の増殖、情報伝達、さらには脳の
機能などに関する研究に貢献すると考えられる物質であ
る。【表１】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、脳の海馬に特異的
に発現されている新規なヒトニューロプシン、そのＤＮ
Ａ配列、その遺伝子及びそのプライマーに関する。

【０００２】

【従来の技術】最近の研究により、脳におけるセリンプ
ロテアーゼの重要な役割が明らかになってきた。例えば
神経の可塑性におけるプラスミノーゲンアクチベータや
エグジットトキシン（ｅｘｉｔｏｔｏｘｉｎ）による神
経損傷などである。ニューロプシンは当初マウスの海馬
から単離されたセリンプロテアーゼであるが、生化学的
な分析により、ニューロプシンが実際にはトリプシン様
の基質特異性を持つ蛋白分解活性を持つことが明らかに
なった。さらに、ニューロプシンに特異的な抗体は、興
奮によって引き起こされるてんかん発作の進行を引き延
ばした。ニューロプシンのｍＲＮＡの量は化学的に誘導
された虚血性障害の後の記憶の保持能力に関係してい
る。この蛋白は又、長期増強の誘導をも修正する。この
ことから、ニューロプシンは神経の可塑性において重要
な役割を担っている。さらに、ニューロプシンのｍＲＮ
Ａは脳や皮膚、発達途中の妊婦の子宮といった多様な臓
器において発現されているところで、特開平８−３１１０９９号公報には、マウス
のニューロプシンが開示されている。すなわち、この公
報によれば、神経成長因子であるＮＧＦ−γのセリンプ
ロテアーゼドメインに特異的に保存されている２カ所の
領域すなわちヒスチジン及びセリン残基領域のｃＤＮＡ
に基づいて２つのＰＣＲ−プライマーを合成し、マウス
の海馬から調製したｍＲＮＡより、ＲＴ−ＰＣＲを行
い、新規な塩基配列を有するＤＮＡ断片を得、このＤＮ
Ａ断片をプローブにして、上記ｍＲＮＡより作製したｃ
ＤＮＡライブラリーをスクリーニングして新規な塩基配
列を含有するｃＤＮＡを得ている。また、このｃＤＮＡ
を含有する組換え発現ベクターによって形質転換された
形質転換体を得、この形質転換体を培養して得られる上
清からセリンプロテアーゼ活性を有するニューロプシン
を得ている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、特開平
８−３１１０９９号公報のマウスのニューロプシンは、
脳の機能（すなわち記憶や学習機構等）の解明や脳疾患
治療薬の開発が期待されるものの、マウス由来であるた
め、よりヒトに適したニューロプシンを開発することが
望まれていた。

【０００４】本発明は上記課題に鑑みなされたものであ
り、ヒトの脳の機能の解明や脳疾患治療薬の開発するに
当たりマウスニューロプシンよりも適したヒトニューロ
プシンを提供することを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段及び発明の効果】本発明者
らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ヒ
トのニューロプシンのｃＤＮＡをクローニングし、ＰＣ
Ｒ（ポリメライゼーション・チェーン・リアクション）
を用いた戦略により、その遺伝子を分析することによ
り、ヒトニューロプシンのアミノ酸配列、塩基配列、遺
伝子構造を明らかにすると共に、ヒトニューロプシンに
適したプライマーを設計し合成した。

【０００６】即ち、本発明の第１は、配列表の配列番号
１のアミノ酸配列で示されるヒトニューロプシンであ
る。本発明の第２は、ヒトニューロプシンをコードする
ヒトニューロプシンのＤＮＡ配列であり、配列表の配列
番号１の塩基配列で示されるＤＮＡ配列である。本発明
の第３は、ヒトニューロプシンの遺伝子であり、６つの
エクソンと５つのイントロンからなり、前記６つのエク
ソンはそれぞれ配列表の配列番号１の塩基配列の１〜２
６番、２７〜１０４番、１０５〜２６４番、２６５〜５
２７番、５２８〜６６１番、６６２〜８６８番の遺伝子
であり、また、プロモータ領域が配列表の配列番号２の
塩基配列で示される遺伝子である。本発明の第４は、配
列表の配列番号３〜１０のいずれかの塩基配列で示され
るヒトニューロプシンのプライマーである。

【０００７】本発明の新規なヒトニューロプシンは、神
経系の細胞の増殖、情報伝達、さらには脳の機能（記憶
や学習機構等）などに関する研究に貢献すると考えられ
る新規なタンパク質であり、ヒトへの適合性に優れてい
るため、脳疾患治療薬やこのヒトニューロプシンのポリ
ペプチドに対する抗体を用いる臨床診断試薬などとして
利用可能であるという効果が得られる。また、末梢組織
（脾臓、胸腺など）に存在するヒトニューロプシンは免
疫などの機能に関係すると考えられ、免疫疾患治療薬と
して利用可能であるという効果が得られる。また、ヒト
ニューロプシンのアミノ酸配列をコードするそのＤＮＡ
配列を含有するベクターで形質転換された形質転換体を
培養し、この培養物からヒトニューロプシンを採取する
ことにより、有用なニューロプシンの大量供給が可能に
なるという効果が得られる。一方、本発明の第４は、例
えばＰＣＲプライマーとして使用することによりヒトニ
ューロプシンを簡単に増幅できる。

【０００８】

【発明の実施の形態及び実施例】以下、本発明の好適な
実施例について詳述する。なお、ｃＤＮＡ及びＤＮＡの
増幅に用いたすべてのオリゴヌクレオチドを表１に示
し、また、市販のＡＰ１及びＡＰ２を除くオリゴヌクレ
オチドを配列表の配列番号３〜１０に示した。また、配
列分析とアラインメントはパッケージソフト「ジーンワ
ークス（ＧｅｎｅＷｏｒｋｓ）」（インテリジェネティ
クス社（ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ））を用いて
行った。

【０００９】

【表１】

【００１０】（１）ニューロプシンｃＤＮＡのＲＡＣＥ
（ラピッド・アンプリフィケーション・オブ・ＤＮＡ・
エンズ（ｒａｐｉｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏ
ｆＤＮＡｅｎｄｓ）、ＤＮＡ末端の高速増幅法）ＥＳＴクローンの１つであるジーンバンクアクセスＮ
ｏ．ＡＡ１０２３３３（５３９ｂｐ）は、ＢＬＡＳＴプ
ログラム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３
ー４１０（１９９０））を用いたデータベース検索によ
ってマウスニューロプシンのｃＤＮＡの配列と有意な相
同性を持っている。このＥＳＴクローンのデータベース
配列情報に基づき、５’ＲＡＣＥの２つのプライマー、
７３６ＡＳ及び６３７ＡＳを設計し合成した。なお、Ｅ
ＳＴとはエクスプレスド・シーケンス・タグ（ｅｘｐｒ
ｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇ）、ｂｐは塩基
対（ｂａｓｅｐａｉｒ）、ＢＬＡＳＴとはベーシック
・ローカル・アラインメント・サーチ・ツール（Ｂａｓ
ｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈ
Ｔｏｏｌ）である。

【００１１】５’ＲＡＣＥ反応は２回行ったが、５μｌ
のヒト海馬のマラソンレディｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔ
ｈｏｎＲｅａｄｙ^TM ｃＤＮＡ（クローンテック社
（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））をテンプレートとして用いた。
反応混液及びＰＣＲの条件は取扱説明書に従った。プラ
イマーはＡＰ１（クローンテック社）及び７３６ＡＳ
（各０．２ｍＭ）を使用した。増幅産物はアガロースゲ
ルで分離し、ナイロンメンブレンに移してアルカリに
し、［γ−³²Ｐ］ＡＴＰをラベルしたインターナルオリ
ゴＤＮＡ、４３１Ｓと融合した。陽性シグナルのサイズ
（約６５０ｂｐ）付近のバンドはアガロースゲルで精製
し、小分けして２回目のＰＣＲ反応に用いた。２回目の
ＰＣＲ反応は同じ反応混液及び条件で行ったが、プライ
マーはＡＰ２（クローンテック社）及び６３７ＡＳを用
いた。６５０ｂｐの増幅された分画はｐＧＥＭ−Ｔイ
ージーベクター（ｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙＶｅｃｔｏ
ｒ（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））にサブクローニン
グし、配列を決定した。その配列は、配列表の配列番号
１の塩基配列の１−６３７番を含んでいた。

【００１２】５’ＲＡＣＥ産物の配列情報及びＥＳＴク
ローンの配列情報に基づき、３’ＲＡＣＥ用の２つのプ
ライマー、４３１Ｓ及び５８７Ｓを設計し合成した。
３’ＲＡＣＥ反応は２回行った。３’ＲＡＣＥの反応混
液は１回目の５’ＲＡＣＥのＰＣＲと同じだが、プライ
マーはＡＰ１及び４３１Ｓを用いた。反応は９４℃で３
０秒、６０℃で３０秒及び７２℃で１分１５秒のサイク
ルを３０回行った。２回目のＰＣＲにおいてはテンプレ
ートとして最初のＰＣＲ産物全体の１／５００を用い、
５８７Ｓ及びＡＰ２をプライマーとして用いた。反応の
サイクルは最初のＰＣＲと同じ条件で行った。３’ＲＡ
ＣＥで増幅された４５０ｂｐの分画はｐＧＥＭ−Ｔイ
ージーベクター（前出）にサブクローニングして配列を
決定した。その配列は、配列表の配列番号１の塩基配列
の５８７−８６８番を含み、その後にポリＡ配列（約１
００ベース）が付いていた。このように、長いポリＡ配
列があることが見いだされたことから、３’末端が確認
された。

【００１３】これらの配列情報からすべてのＯＲＦ（オ
ープン・リーディング・フレーム（ｏｐｅｎｒｅａｄ
ｉｎｇｆｒａｍｅ））をカバーするｃＤＮＡの増幅の
ための特異的なプライマー、１Ｓ及び８４２Ｓを設計し
合成した。（２）ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）すべてのＲＮＡは一段ＲＮＡ抽出法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．１６２，１５６−１５９（１９８７））によ
りヒトのケラチノサイト１次培養液から調製した。トー
タル５μｇのＲＮＡを１μｇオリゴｄＴ及び１０Ｕ
ＡＭＶリバーストランスクリプターゼ（プロメガ
社）を含む２５μｌの溶液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．３），５０ｍＭＫＣｌ，１０ｍＭＭｇ
Ｃｌ₂，０．５ｍＭスペルミジン，１０ｍＭジチオ
スレイトール）中で逆転写した。反応は４２℃、１時間
で行った。続くＰＣＲ反応は１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．３），５０ｍＭＫＣｌ，１．５ｍＭＭ
ｇＣｌ₂，０．００１％ゲラチン及び５Ｕアンプリタ
ック（ＡｍｐｌｉＴａｑ、パーキンエルマー社（Ｐｅｒ
ｋｉｎＥｌｍｅｒ））の溶液中で２０ｐｍｏｌのプラ
イマーペアを用いて行った。上流のプライマーは１Ｓを
用い、下流のプライマーは８４２ＡＳを用いた。反応は
９４℃で１５秒、５７℃で１５秒及び７２℃で９０秒の
サイクルを３０サイクル行った。増幅した分画をｐＧＥ
Ｍ−Ｔイージーベクター（前出）に連結し、配列を決
定した。

【００１４】（３）ヒトニューロプシンの配列分析ケラチノサイト培養液からのＲＴ−ＰＣＲ産物の配列
は、海馬ｃＤＮＡから得たＲＡＣＥ産物と完全に一致し
た。その配列を配列表の配列番号１に示す。この配列の
結果から、ｃＤＮＡは８６８ｂｐの長さであり、コザッ
クモチーフ（Ｊ.ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１１５，８８７
−９０３（１９９１））を満足する推定上の翻訳開始コ
ドン（配列番号１の３５〜３７番のＡＴＧ）をコードし
ていることが明らかとなった。この翻訳開始部位と共
に、このｃＤＮＡは２６０アミノ酸からなるタンパク質
を作るための単一の７８０ｂｐのＯＲＦ（配列番号１の
３４〜８１３番の塩基配列）を有している。

【００１５】配列番号１の３３８〜８６８番の塩基配列
に対応するＥＳＴクローン（ＡＡ１０２３３３，５３９
ｂｐ）との配列比較によって、ｃＤＮＡとＥＳＴクロー
ンとの間に３つのミスマッチがあることが明らかとなっ
た。データベース検索によってこのｃＤＮＡがマウスの
ニューロプシンと７２％の相同性があり、ジーンバンク
中の他のすべての配列は４５％未満の相同性しか持たな
いことが明らかとなった。このことから、このｃＤＮＡ
がニューロプシンのヒトホモローグつまりヒトニューロ
プシンであると判定した。

【００１６】ヒトニューロプシンのｃＤＮＡはマウスの
ニューロプシン（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５，５０
８８−５０９７（１９９５））よりも４５４ｂｐ短い。
この違いは主として５’側の非翻訳領域が短いことによ
る。ヒトニューロプシンのｃＤＮＡはヒトカリクレイン
ｍＲＮＡと４５％、ヒトトリプシノーゲンのｍＲＮＡと
３２％の相同性を持つ。

【００１７】（４）ヒトニューロプシンの推定アミノ酸
配列図１は、ヒトニューロプシン及び他のセリンプロテアー
ゼの配列のアラインメントを示す説明図である。アミノ
酸レベルでは、ヒトのニューロプシンはマウスのニュー
ロプシンと７２％の相同性を持ち、ヒトのプレプロカリ
クレインと４０％、ヒトのプレトリプシノーゲンと３８
％の相同性を持つ。推定されたアミノ酸配列のＮ末端に
は多分シグナル配列と思われる疎水領域があった（図２
参照）。

【００１８】ヒトニューロプシンのシグナルペプチダー
ゼによる推定上のプロセシング部位はアミノ酸配列の２
８番目のＡｌａまでのＣ末端であり、活性化のために、
ほとんどのトリプシンタイプのセリンプロテアーゼで見
られるように、さらに同３２番目のリジンのプロセシン
グが起こる。これら推定上のプロセッシング部位の残基
はヒトとマウスの間で保存されている。従ってヒトニュ
ーロプシンは多分マウスニューロプシンで見られるのと
同様なメカニズムによってプロセスされる。

【００１９】プロテアーゼ活性のために必要な必須の３
つの残基（ヒトニューロプシンのアミノ酸配列の７３番
目のＨｉｓ，同１２０番目のＡｓｐ，同２１２番目の
Ｓｅｒであり、図１においてアスタリスクで表示した）
が各アミノ酸配列の間で保存されている。ヒトニューロ
プシンは活性化セリン残基までアミノ末端から６残基の
位置にＡｓｐ残基を持っている。このことはヒトニュー
ロプシンがマウスニューロプシンで見られたのと同様
に、Ｐ１部位の塩基性アミノ酸に基質特異性をもってい
ることを示唆している。ヒトニューロプシンは、Ｎ末端
にリンクしたグリコシレーション部位（配列番号１のア
ミノ酸配列の１１０〜１１２番）を持っており、これも
又ヒトとマウスの間で保存されている。すべてのＣｙｓ
残基（推定される成熟蛋白中に１３残基）はヒトとマウ
スの間で完全に保存されている。これらのＣｙｓ残基の
うち、１２のＣｙｓ残基が分子内ジスルフィド結合に含
まれているらしい。しかし、１０８番目のＣｙｓはマウ
ス及びヒトニューロプシン及びトリプシンのアラインメ
ントに由来しないように思われる。興味深いことに、細
胞溶解性Ｔ細胞において発現するセリンプロテアーゼで
あるグランザイムＡにおいてよく知られているＰＸＰＣ
Ｙ配列（図３の囲み参照）−これは対応するＣｙｓにお
いてホモダイマーを形成する−が、このフリーのＣｙｓ
（１０８番目のＣｙｓ）に接している。このようにＣｙ
ｓ残基はグランザイムＡで起こるようにホモダイマーを
形成するように潜在的にジスルフィド結合が可能であ
る。マウスニューロプシンにおいては対応する領域はＱ
ＨＰＣＹ（図１参照）であり、これもまたこのモチーフ
に類似している。

【００２０】ここで、配列番号１に示したヒトニューロ
プシンのｃＤＮＡ配列とその予想されるアミノ酸配列に
つきまとめると、ＤＮＡは８６８ｂｐの長さであり、２
６０ａａのアミノ酸残基のＯＲＦを含む。塩基配列の３
１〜３８番のＣＡＣＣＡＴＧＧ、アミノ酸配列の１１０
〜１１２番のＡｓｎＳｅｒＳｅｒ、塩基配列の８４
５〜８５０番のＡＡＴＡＡＡはコザック配列であり、そ
れぞれ推定上のグリコシレーション部位及びポリアデニ
レーションシグナル配列である。アミノ酸配列の７３番
目のＨｉｓ、１２０番目のＡｓｐ、２１２番目のＳｅｒ
はトリプシンタイプのセリンプロテアーゼのキー配列を
示す。２０６番目のＡｓｐはトリプシン様プロテアーゼ
の基質特異性を示す。

【００２１】（５）ＰＣＲによるヒトニューロプシン遺
伝子のイントロンの増幅ヒトニューロプシン遺伝子中のイントロンを増幅するた
め一連のＰＣＲを行った。標準的なプロトコール（“Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｎｄｅｄ．”Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰ
ｒｅｓｓ（１９８９））に従って健康なボランティアの
白血球から調製された１６０ｎｇのヒトゲノミックＤＮ
Ａをテンプレートとして用いた。ＰＣＲ反応は２０ｐｍ
ｏｌのプライマーのペアを含む溶液（１０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），５０ｍＭＫＣｌ，１．５
ｍＭＭｇＣｌ₂，０．００１％ゼラチン及び５Ｕア
ンプリタック（前出）中で行った。プライマーのペアは
１Ｓと４８１ＡＳ、４３１Ｓと６３７ＡＳ、及び５８７
Ｓと８４２ＡＳのペアを用いた。反応は９４℃で１５
秒、５７℃で１５秒及び７２℃で３分のサイクルを３０
サイクル繰り返した。

【００２２】この結果、１Ｓと４８１Ｓ、４３１Ｓと６
３７ＡＳ及び５８７Ｓと８４２ＡＳを用いたＰＣＲによ
り、それぞれ、１．５ｋｂｐ、２．２ｋｂｐ及び１．８
ｋｂｐの産物がそれぞれ産生された。増幅された分画を
ｐＧＥＭ−Ｔイージーベクター（前出）に連結し、配
列を決定した。

【００２３】配列分析によりこの遺伝子が６つのエクソ
ンと５つのイントロンからなることが明らかになった。
図４は、ヒトニューロプシン遺伝子の塩基配列を表す説
明図である。イントロン−４及び５の配列は完全には明
らかになっていないが、およそのサイズを（）内に示
す。最初のイントロンつまりイントロン−１は５’非翻
訳領域を分けており、残り４つのイントロン（イントロ
ン−２〜５）はコード配列を分断している。エクソン−
２〜６の長さはそれぞれ７８ｂｐ，１６０ｂｐ，２６３
ｂｐ，１３４ｂｐ及び２０７ｂｐであった。イントロン
−１，２，３，４及び５の長さはそれぞれ０．３，０．
５，０．２，２．０及び１．５ｋｂであり、すべてのイ
ントロン／エクソン結合はｇｔ−ａｇルールにしたがっ
ていた。従って、遺伝子はトータルで５．４ｋｂにわた
っていた。

【００２４】ヒトニューロプシン及びトリプシンタイプ
のプロテアーゼのゲノム構成は非常に良く似ており、コ
ーディング領域の中ではヒトニューロプシンの遺伝子構
成はトリプシンファミリーの遺伝子のそれと同一であ
る。図５はヒトニューロプシン遺伝子及びいくつかの他
のセリンプロテアーゼのゲノム構成を示す説明図であ
る。図５においてエクソンは四角で囲み、コード領域は
黒で示した。活性基のアミノ酸残基Ｈｉｓ、Ａｓｐ及び
Ｓｅｒの位置を、それぞれＨ、Ｄ、Ｓで示した。ローマ
数字はコドンの一番目（Ｉ）、二番目（II）あるいは三
番目（０）のヌクレオチドに続くかどうかによってリー
ディングフレームに関するイントロンの相を示す。上記
（４）で述べたように、アミノ酸レベルではヒトニュー
ロプシンはプレトリプシノーゲンとプレプロカリクレイ
ンに最も良く似ており、これらはどちらもトリプシンフ
ァミリーに属している。このことから、ヒトニューロプ
シン遺伝子及びトリプシンファミリーの遺伝子は共通の
祖先に由来すると思われる。

【００２５】ヒトニューロプシンの遺伝子の一つのユニ
ークな特徴は、最初のイントロンの位置である。という
のは、これまでのトリプシンタイプのセリンプロテアー
ゼの遺伝子には、この位置にはイントロンが報告されて
いなかったからである。（６）ヒトニューロプシン遺伝子のプロモータ領域ヒトニューロプシン遺伝子のプロモータ領域を解析する
ために、５’フランキング領域（ｆｌａｎｋｉｎｇｒ
ｅｇｉｏｎ）の高速増幅を行った。まず、５μｌのヒト
ゲノミックＤＮＡをＥｃｏＲＶで消化した。消化したＤ
ＮＡへのアダプタの付加は１０μｌの２０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１０ｍＭＭｇＣｌ₂，１ｍ
Ｍジチオスレイトール，１ｍＭＡＴＰ，５％ポリ
エチレングリコールｌ及び２ＵＴ４ＤＮＡリガーゼ
溶液中で２μｌの１０μＭマラソンｃＤＮＡアダ
プタ（マラソン^TMｃＤＮＡシンセシスキット、クローン
テック社）を用いて２０℃で３時間行った。続くＰＣＲ
反応は１００番目のリゲーション混合物をテンプレート
として用いて行った。反応混液は５０μｌのＡＰ１及び
７３６ＡＳの０．２ｍＭプライマーペア、１×ＬＡＰ
ＣＲバッファII（タカラ社）、１．５ｍＭＭｇＣｌ
₂，０．２ｍＭｄＮＴＰ及び５ＵＬＡＴａｑ（タカ
ラ社）を用いた。ＰＣＲのパラメータは９４℃で１分の
後９４℃で１５秒、７２℃で１０分を５サイクル行った
後、９４℃で１５秒、７０℃で１０分を５サイクル、９
４℃で１５秒、６８℃で１０分を２５サイクル行った。
反応液の１／５００希釈を２回目のＰＣＲのテンプレー
トとして用いた。２回目のＰＣＲ反応は同じ反応混液で
行ったが、プライマーペアはＡＰ２及び６３７ＡＳを用
いた。ＰＣＲのサイクルは１回目のＰＣＲサイクルと同
じであった。反応混液はアガロースゲル上で電気泳動
し、ｐＧＥＭ−Ｔイージーベクター（前出）にサブク
ローニングして、ｃＤＮＡ５’末端の上流トータル１
０９９ｂｐの配列を決定した。その配列を配列表の配列
番号２に示す。

【００２６】この配列につき、−９８２ｂｐまで典型的
なＴＡＴＡｂｏｘあるいはＣＣＡＡＴ配列も見つからな
かったが、弱いＴＡＴＡｂｏｘ様の配列ＴＴＡＡＡＡ
が−７１から−７６の位置に見つかり、−９９３から−
９９７にＣＣＡＡＴモチーフが観察された。プロモータ
領域には二つの繰り返し配列が存在した。ＣＴＣＣＴＣ
ＣＣＴＣＡの配列は５回（−１９８から−２０８、−３
４７から−３５７、−４５６から−４６６、−４９７か
ら−５０７及び−５３４から−５４４まで）、ＴＣＣＡ
ＧＧＣＣＣＣＣＡＧＣが２回（−３２３から−３３６及
び−３６０から−３７３まで）現れた。この二つの繰り
返し配列はどちらもよく知られたコンセンサス翻訳因子
結合配列である。潜在的な翻訳因子結合配列をＭａｔＩ
ｎｓｐｅｃｔｏｒ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅ
ｓｅａｒｃｈ２３，４８７８−４８８４（１９９
５））でサーチした。推定上の調節因子の中に、ＳＴＡ
Ｔｘ結合モチーフであるＴＴＣＣＣＡ／ＧＧ／ＴＡＡが
−１３６から−１４４の位置に、ＡＰ−２，ＣＣＣＣＮ
ＧＧＣが−１２５から−１３２の位置に見いだされた
（ＧｅｎｅｓＤｅｖ．５，６７０−６８２（１９９
１）；ＧｅｎｅｓＤｅｖ．９，９８４−９９４（１９
９５））。

【００２７】（７）ノーザンブロットハイブリダイゼー
ショントータルＲＮＡを変性アガロースゲル中で電気泳動し、
ナイロンメンブレンに転写した。［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰ
でラベルしたプローブは５’ＲＡＣＥで増幅した６５０
ｂｐＤＮＡ分画からランダムプライミングによって作
製した。ハイブリダイゼーションは文献（Ｊ．Ｎｅｕ
ｒｏｓｃｉ．１５，５０８８−５０９７（１９９５））
に従って行った。

【００２８】図６は、ヒトケラチノサイトの培養液のノ
ーザンブロット分析結果を表す説明図である。この図６
において、トータル２０μｇのＲＮＡを用いた。ＲＮＡ
は１％フォルムアルデヒド−アガロースゲルで分離して
ナイロンメンブレンに転写し、³²Ｐでラベルした６５０
ｂｐのＲＡＣＥ産物で釣り上げた。２８Ｓ及び１８Ｓリ
ボソームＲＮＡのバンドの位置を示した。

【００２９】このノーザンブロットによる分析によって
ニューロプシンのｍＲＮＡが培養ケラチノサイトに発現
していることが証明された。０．９ｋｂの位置に単一の
陽性バンドが観察された。このことは、マウスのニュー
ロプシンがケラチノサイトに覆われた皮膚の上皮組織や
上部消化管において強く発現しており、その発現は成
長過程においてケラチノサイトがもっとも活発な時期に
強かったことから、ケラチノサイト培養中の成長細胞が
大量のヒトニューロプシンを発現していることと一致し
ている。

【００３０】（８）サザーンブロットハイブリダイゼー
ションヒトのゲノミックＤＮＡをＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＩ，
ＰｓｔＩ及びＸｂａＩで消化し、０．７％アガロース
ゲルで分離した。さらにアルカリ溶液中で変性させ、ナ
イロンメンブレンに転写した。ハイブリダイゼーション
のプローブはノーザンブロットハイブリダイゼーション
で用いたＤＮＡ分画と同じものを用いた。図７は、ヒト
ゲノムＤＮＡのサザーンブロットハイブリダイゼーショ
ン分析結果を表す説明図である。図７において、各レー
ンはＢａｍＨＩ（レーン１）、ＥｃｏＲＩ（レーン
２）、ＰｓｔＩ（レーン３）及びＸｂａＩ（レーン
４）で消化した１０μｇのＤＮＡを含む。

【００３１】サザーンブロットはコード領域のほとんど
を覆っているｃＤＮＡを用いて行った。ハイブリダイゼ
ーションの結果単一若しくは少数のバンドが各レーンに
認められ、このことはヒトニューロプシン遺伝子が単一
コピーの遺伝子であることを示唆している。

【００３２】

【配列表】配列番号：１配列の長さ：８６８配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列 GTGACCCCGC CCCTGGATTC TGGAAGACCT CAC 33 CAT GGG ACG CCC CCG ACC TCG TGC GGC CAA GAC GTG GAT GTT CCT GCT 81 Met Gly Arg Pro Arg Pro Arg Ala Ala Lys Thr Trp Met Phe Leu Leu 5 10 15 CTT GCT GGG GGG AGC CTG GGC AGG ACA CTC CAG GGC ACA GGA GGA CAA 129 Leu Leu Gly Gly Ala Trp Ala Gly His Ser Arg Ala Gln Glu Asp Lys 20 25 30 GGT GCT GGG GGG TCA TGA GTG CCA ACC CCA TTC GCA GCC TTG GCA GGC 177 Val Leu Gly Gly His Glu Cys Gln Pro His Ser Gln Pro Trp Gln Ala 35 40 45 GGC CTT GTT CCA GGG CCA GCA ACT ACT CTG TGG CGG TGT CCT TGT AGG 225 Ala Leu Phe Gln Gly Gln Gln Leu Leu Cys Gly Gly Val Leu Val Gly 50 55 60 TGG CAA CTG GGT CCT TAC AGC TGC CCA CTG TAA AAA ACC GAA ATA CAC 273 Gly Asn Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Lys Lys Pro Lys Tyr Thr 65 70 75 80 AGT ACG CCT GGG AGA CCA CAG CCT ACA GAA TAA AGA TGG CCC AGA GCA 321 Val Arg Leu Gly Asp His Ser Leu Gln Asn Lys Asp Gly Pro Glu Gln 85 90 95 AGA AAT ACC TGT GGT TCA GTC CAT CCC ACA CCC CTG CTA CAA CAG CAG 369 Glu Ile Pro Val Val Gln Ser Ile Pro His Pro Cys Tyr Asn Ser Ser 100 105 110 CGA TGT GGA GGA CCA CAA CCA TGA TCT GAT GCT TCT TCA ACT GCG TGA 417 Asp Val Glu Asp His Asn His Asp Leu Met Leu Leu Gln Leu Arg Asp 115 120 125 CCA GGC ATC CCT GGG GTC CAA AGT GAA GCC CAT CAG CCT GGC AGA TCA 465 Gln Ala Ser Leu Gly Ser Lys Val Lys Pro Ile Ser Leu Ala Asp His 130 135 140 TTG CAC CCA GCC TGG CCA GAA GTG CAC CGT CTC AGG CTG GGG CAC TGT 513 Cys Thr Gln Pro Gly Gln Lys Cys Thr Val Ser Gly Trp Gly Thr Val 145 150 155 160 CAC CAG TCC CCG AGA GAA TTT TCC TGA CAC TCT CAA CTG TGC AGA AGT 561 Thr Ser Pro Arg Glu Asn Phe Pro Asp Thr Leu Asn Cys Ala Glu Val 165 170 175 AAA AAT CTT TCC CCA GAA GAA GTG TGA GGA TGC TTA CCC GGG GCA GAT 609 Lys Ile Phe Pro Gln Lys Lys Cys Glu Asp Ala Tyr Pro Gly Gln Ile 180 185 190 CAC AGA TGG CAT GGT CTG TGC AGG CAG CAG CAA AGG GGC TGA CAC GTG 657 Thr Asp Gly Met Val Cys Ala Gly Ser Ser Lys Gly Ala Asp Thr Cys 195 200 205 CCA GGG CGA TTC TGG AGG CCC CCT GGT GTG TGA TGG TGC ACT CCA GGG 705 Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asp Gly Ala Leu Gln Gly 210 215 220 CAT CAC ATC CTG GGG CTC AGA CCC CTG TGG GAG GTC CGA CAA ACC TGG 753 Ile Thr Ser Trp Gly Ser Asp Pro Cys Gly Arg Ser Asp Lys Pro Gly 225 230 235 240 CGT CTA TAC CAA CAT CTG CCG CTA CCT GGA CTG GAT CAA GAA GAT CAT 801 Val Tyr Thr Asn Ile Cys Arg Tyr Leu Asp Trp Ile Lys Lys Ile Ile 245 250 255 AGG CAG CAA GGG 813 Gly Ser Lys Gly 260 CTGATTCTAG GATAAGCACT AGATCTCCCT TAATAAACTC ACAACTCTCT GGTTC 868 配列番号：２配列の長さ：１０９９配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列 GTAGAGCTCA GCCCCTTGTG GCCCCGTCCT GGGCGTGTGC TGGGTTTGAA TCCTGACGGA -1040 GACCTGGGGG GAAATTGAGG GAGGGTCTGG ATACCTTTAG AGCCAATGCA ACGGATGATT -980 TTTCAGTAAA CGCGGGAAAC CTCACCTTCT TTCTGCCTGA GCTGTGAGAT GAGTGGAGAG -920 CAAACGGTTG GGCGGTGAAG GGCAGATGAG GGAACCGGTA CCGCCTTGCA ACTCCCCCTT -860 AAACCCCTAG TAAGTTTTGC CTAAAGTCTC TGTCCATCAG CCCTATTGCA GCAAGACTCC -800 TGGGTTCTGC TTGGGTTGGT CTTGCCGCCT CCAGGGGAAG GGGAAACCAG GTCACAGTGC -740 CTCCCAAACC TGCCCTCCCA GATCCCGGAC CTCTCAGGGG ACAGCGGGCG GGGCCTGATC -680 CACCCTCTGG TTTCTGACCC TAGAAAACCT GCCTTTCTTC GGTTCCCGGT TACTGGCAGC -620 AGCCCCCTCC TCCCACAAAA GATCAGGTTC CAAGCTTCTC CTTTTAAAAG TACTTAGAAT -560 TTAGCCCCCA GCTCTCTCCT CCCTCACACC CAGGAATCCA GGCCCCTAGC CCCTCCTCCC -500 TCAGACCCAG GAGTCCTGGC CCCTAGCAGC CCCCTCCTCC CTCAGACCCA GGAGTCTGGG -440 CCCCCAGCCC CTCCTCGGTC AGACCTAAAT CCCAGGTCCC AGTCCCTCCT CCCTTAGATT -380 TAGGAGTCCA GGCCCCCAGC CTCTCCTCCC TCAGACCCAG GAATCCAGGC CCCCAGCTTC -320 CTCCCCTCTC AGAACTAAAA TCTTGGCCCC CAGCCCTTTA TGTTTCAGAT CCTAGAGTCT -260 CAGCACCGAG TCCCTCCTCT CCCTAGCCTC AGGAGTCTGA GATTCCAGCC CCTCCTCCCT -200 CAAGATTTCA CGTTCAATCC CCTCCGCCCC TTCTCACTCA CACCCAGTGT TCCAGTTCCC -140 AGAAGCTCCC CAGGCTCTAG TGCAGGAGGA GAAGGAGGAG GAGCAGGAGG TGGAGATTCC -80 CAGTTAAAAG GCTCCAGAAT CGTGTACCAG GCAGAGAACT GAAGTACTGG GGCCTCCTCC -20 ACTGGGTCCG AATCAGTAG -1 配列番号：３配列の長さ：１９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（プライマー１ｓ）アンチセンス：ＮＯフラグメント型：Ｎ末端他の情報：ヒトニューロプシンのｃＤＮＡの１−１９番
に相当する。配列 GTGACCCCGC CCCTGGATT 配列番号：４配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（プライマー５９ＡＳ）アンチセンス：ＹＥＳフラグメント型：中間他の情報：ヒトニューロプシンのｃＤＮＡの５９−３５
番に相当する。配列 CCGCACGAGG TCGGGGGCGT CCCAT 配列番号：５配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（プライマー４３１Ｓ）アンチセンス：ＮＯフラグメント型：中間他の情報：ヒトニューロプシンのｃＤＮＡの４３１−４
５０番に相当する。配列 GGGTCCAAAG TGAAGCCCAT 配列番号：６配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（プライマー４８１ＡＳ）アンチセンス：ＹＥＳフラグメント型：中間他の情報：ヒトニューロプシンのｃＤＮＡの４８１−４
６２番に相当する。配列 GCCAGGCTGG GTGCAATGAT 配列番号：７配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（プライマー５８７Ｓ）アンチセンス：ＮＯフラグメント型：中間他の情報：ヒトニューロプシンのｃＤＮＡの５８７−６
０９番に相当する。配列 GAGGATGCTT ACCCGGGGCA GAT 配列番号：８配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（プライマー６３７ＡＳ）アンチセンス：ＹＥＳフラグメント型：中間他の情報：ヒトニューロプシンのｃＤＮＡの６３７−６
１３番に相当する。配列 GCTGCCTGCA CAGACCATGC CATCT 配列番号：９配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（プライマー７３６ＡＳ）アンチセンス：ＹＥＳフラグメント型：中間他の情報：ヒトニューロプシンのｃＤＮＡの７３６−７
１２番に相当する。配列 CCCACAGGGG TCTGAGCCCC AGGAT 配列番号：１０配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（プライマー８４２ＡＳ）アンチセンス：ＹＥＳフラグメント型：Ｃ末端他の情報：ヒトニューロプシンのｃＤＮＡの８４２−８
２１番に相当する。配列 GGGAGATCTA GTGCTTATCC TA

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトニューロプシン及び他のセリンプロテア
ーゼの配列のアラインメントを示す説明図である。

【図２】ヒトニューロプシンの疎水プロットを示すグ
ラフである。

【図３】ヒトニューロプシン及びヒトグランザイムＡ
のアラインメントを示す説明図である。

【図４】ヒトニューロプシン遺伝子の塩基配列を表す
説明図である。

【図５】ヒトニューロプシン遺伝子及びいくつかの他
のセリンプロテアーゼのゲノム構成を示す説明図であ
る。

【図６】ヒトケラチノサイトの培養液のノーザンブロ
ットハイブリダイゼーション分析結果を表す説明図であ
る。

【図７】ヒトゲノムＤＮＡのサザーンブロットハイブ
リダイゼーション分析結果を表す説明図である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列表の配列番号１のアミノ酸配列で示
されるヒトニューロプシン。
【請求項２】配列表の配列番号１のアミノ酸配列をコ
ードするヒトニューロプシンのＤＮＡ配列。
【請求項３】配列表の配列番号１の塩基配列で示され
るヒトニューロプシンのＤＮＡ配列。
【請求項４】６つのエクソンと５つのイントロンから
なり、前記６つのエクソンはそれぞれ配列表の配列番号
１の塩基配列の１〜２６番、２７〜１０４番、１０５〜
２６４番、２６５〜５２７番、５２８〜６６１番、６６
２〜８６８番であるヒトニューロプシンの遺伝子。
【請求項５】プロモータ領域が配列表の配列番号２の
塩基配列で示される請求項５記載のヒトニューロプシン
の遺伝子。
【請求項６】配列表の配列番号３〜１０のいずれかの
塩基配列で示されるヒトニューロプシンのプライマー。