JPH11318478A - ２重タグ付タンパク質及びそれらの使用 - Google Patents

２重タグ付タンパク質及びそれらの使用

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JPH11318478A
JPH11318478A JP11077771A JP7777199A JPH11318478A JP H11318478 A JPH11318478 A JP H11318478A JP 11077771 A JP11077771 A JP 11077771A JP 7777199 A JP7777199 A JP 7777199A JP H11318478 A JPH11318478 A JP H11318478A
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tag sequence
sequence
capture
fusion protein
interest
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JP11077771A
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Bernaccio John
バーナッチオ ジョン
Pappkoff Jacky
パップコフ ジャッキー
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Pfizer Inc
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Megabios Corp
Pfizer Inc
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 組換えタンパク質の検出のための核酸及び改
良方法の提供。 【解決手段】 本発明の融合タンパク質は、捕獲タグ配
列、検出タグ配列、及び着目のポリペプチド配列を含
む。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、２重タグ付組換え
融合タンパク質に関する。本発明の融合タンパク質は、
特に遺伝子修飾された動物からの組織中で、便利には単
離され、そして定量される。
【０００２】
【従来の技術】着目の組換えタンパク質を単離し、そし
て／又は検出するための方法は、多くの適用において有
用である。例えば、遺伝子操作された動物内でのトラン
スジーン産物の高感度の検出は、トランスジーン発現が
生じている組織の決定において重要である。上記タンパ
ク質は、所望のタンパク質を特異的に認識する結合性リ
ガンド（例えば、抗体）を使用して検出されることがで
きる。ほとんどの場合、この手順は、所望のタンパク質
と特異的免疫反応性である抗体の作製を必要とする。こ
の要求を回避するために、着目のタンパク質に融合され
ることができるさまざまなタグが開発されてきた。例え
ば、これらのタグは、それについて抗体が容易に入手さ
れることができるところのユニークなエピトープを含む
ことができる。他の方法は、金属キレート形成性アミノ
酸を取り込むタグの使用を含む。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、単一の
エピトープ・タグその他の関連タグは、動物組織中のト
ランス・ジーン産物の検出を許容するために十分な感度
を、必ずしも提供しない。従って、本分野において必要
なことは、速く、安く、かつ、容易に実施されるであろ
うインビボ及びインビトロにおいて組換えタンパク質を
検出するためのより高感度の方法である。本発明は、上
記その他の利点を提供する。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、融合タンパク
質及びそれをコードする核酸を提供する。本発明の融合
タンパク質は、着目のポリペプチド配列、捕獲タグ配
列、と検出タグ配列を含む。この捕獲タグ配列と検出タ
グ配列は、それぞれ、着目のポリペプチド配列に対し
て、異種である。いくつかの態様においては、捕獲タグ
配列又は検出タグ配列のいずれも、エピトープ・タグで
あることができる。例証的な捕獲タグ配列はＤＹＫＤＤ
ＤＤＫである。例証的な検出タグ配列は、ＹＰＹＤＶＰ
ＤＹＡである。
【０００５】上記２つのタグは、互いに関して、かつ、
着目のポリペプチド配列に関して、多くの方法で配置さ
れることができる。例えば、捕獲タグ配列と検出タグ配
列は、着目のポリペプチド配列のＣ末端に配置されるこ
とができる。さらに、本発明の融合タンパク質は、様々
な成分の間にリンカーを含むことができる。例えば、捕
獲タグ配列と検出タグ配列は、オリゴペプチド・リンカ
ーを通じて互いに連結されることができる。リンカー
は、約１５未満のアミノ酸残基、通常、約４〜約１０の
間のアミノ酸から成ることができる。上記リンカーは、
アラニン残基を含んで成ることができる。いくつかの態
様においては、捕獲タグ配列、検出タグ配列、又はその
組合せは、オリゴペプチド・リンカーを通じて着目のポ
リペプチドに連結されることができる。
【０００６】本発明において検出される特定のタンパク
質は、決定的なものではない。いくつかの態様において
は、着目のポリペプチドは、アンジオスタチンであるこ
とができる。本発明の融合タンパク質は、その融合タン
パク質をコードする核酸を含む動物において検出される
ことができる。典型的には、本発明のアッセイは、捕獲
タグ配列に特異的に結合する化合物を用いて動物からの
サンプル中の融合タンパク質を捕獲し；そして次に、検
出タグ配列に特異的に結合する第２化合物を用いて上記
サンプル中の上記融合タンパク質を検出する、ことを含
む。この捕獲工程は、捕獲タグ配列に特異的に結合する
抗体と上記サンプルとを接触させることにより行われる
ことができる。検出工程は、検出タグ配列に特異的に結
合する抗体と上記サンプルとを接触させることにより行
われることができる。サンプルは、組織サンプル、例え
ば、肺組織であることができる。動物は、トランスジェ
ニック又は遺伝子操作されたマウスであることができ
る。
【０００７】本明細書中に使用するとき、“捕獲タグ配
列”は、複雑な混合物から本発明の融合タンパク質を単
離し又は除去するために使用されることができるアミノ
酸残基の配列である。典型的には、リガンド（例えば、
抗体）に特異的に結合し、そしてこうして、融合タンパ
ク質が混合物から単離されることを許容するアミノ酸配
列であろう。さまざまな捕獲タグの例を、以下、詳細に
述べる。
【０００８】本明細書中に使用するとき、“検出タグ配
列”は、一旦、タンパク質が捕獲タグ配列を使用して単
離されれば、本発明の融合タンパク質の存在を検出する
ために使用されることができるアミノ酸残基の配列であ
る。多くの手段の中のいずれも、この検出タグを検出す
るために使用されることができる。この検出タグ配列
は、直接的に検出され（例えば、蛍光により）、又は検
出タグに特異的に結合する検出可能なリガンドを使用し
て、間接的に検出されることができる。さまざまな検出
タグの例を、以下、詳細に述べる。
【０００９】本発明の“融合タンパク質”は、２つの異
なる異種配列（例えば、捕獲タグ配列と検出タグ配列）
を含むポリペプチドである。さまざまな成分が、リンカ
ー配列を通じて連結されることができる。ポリヌクレオ
チド又はポリペプチド配列は、それが全て合成である場
合、外来種から生じ、又は同一種由来である場合、その
元の形態から修飾されている場合、第２ポリヌクレオチ
ド又はポリペプチド配列に対し“異種”である。句“特
異的に結合する”とは、捕獲又は検出リガンドとアミノ
酸配列の間の結合反応をいい、この結合は、タンパク質
その他の生物工学製品の異種集団の存在下、アミノ酸配
列の存在の決定因である。従って、指定（ｄｉｓｉｇｎ
ａｔｅｄ）条件下、捕獲又は検出リガンドは、特定の配
列に優先的に結合し、そしてサンプル中に存在する他の
アミノ酸配列に有意な量で結合しない。この相互作用
は、（例えば、エピトープ・タグの場合）エピトープと
抗体との間の反応に言及するとき、“特異的に免疫反応
性である(specifically immunoreactive）”ともいう。
【００１０】句“核酸”又は“ポリヌクレオチド”は、
デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の
１本鎖又は２本鎖ポリマーをいう。それは、ｃＤＮＡ、
自己複製性プラスミド、ＤＮＡ又はＲＮＡの感染性ポリ
マー並びに非機能的ＤＮＡ又はＲＮＡを含む。２つの核
酸配列又はポリペプチドは、それぞれ、ヌクレオチド又
はアミノ酸残基の配列が、その２つの配列において、以
下に記載するように最大一致のために整列されたとき、
同じである場合、“同一である（ｉｄｅｎｔｉｃａ
ｌ）”といわれる。２（又はそれ以上）のポリヌクレオ
チド又はポリペプチドの間の配列の比較は、配列類似性
の局所的領域を同定し、そして比較するために、“比較
窓(comparison window）”上で上記２つの配列の配列を
比較することにより、典型的には行われる。本明細書中
に使用するとき、“比較窓”は、２つの配列が最適に整
列された後に、隣接部分の同一数の参照配列とある配列
が比較されることができるところの、少なくとも約２０
の隣接部分、通常約５０〜約２００の、より普通には約
１００〜約１５０のセグメントをいう。
【００１１】比較のための配列の最適な整列は、Smith
and Waterman Adv. Appl. Math. 2:482 (1981) の局所
ホモロジー・アルゴリズムにより、Needleman and Wuns
ch J. Mol. Biol. 48: 443 (1970) のホモロジー整列ア
ルゴリズムにより、Pearsonand Lipman Proc. Natl. Ac
ad. Sci. (U.S.A) 85: 2444 (1988) の類似性のサーチ
方法により、Wisconsin Genetics Software Package, G
enetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Mad
ison, WI) における上記アルゴリズムのコンピューター
支援実行(GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA,及びTFASTA）に
より、又はインスペクションにより、行われることがで
きる。
【００１２】“配列同一性のパーセンテージ”は、比較
窓上で２つの最適に整列された配列を比較することによ
り測定され、ここで、その比較窓内のポリヌクレオチド
配列の部分は、上記２つの配列の最適な整列について
（付加又は欠失を含まない）参照配列に比較されると
き、付加又は欠失（すなわち、ギャップ（ｇａｐｓ））
を含むことができる。このパーセンテージは、両配列内
で同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が生じるところの位
置の数を測定してマッチした位置の数を求め、そのマッ
チした位置の数を比較の窓内の位置の合計数で除し、そ
してその結果に１００を乗して、配列同一性のパーセン
テージを求めることにより、計算される。
【００１３】ポリヌクレオチド配列の“実質的に同一
性”なる用語は、ポリヌクレオチド配列が、標準的なパ
ラメーターを使用して上記のプログラム（好ましくはＢ
ＬＡＳＴ）を使用して参照配列と比較されたとき、少な
くとも６０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８０
％の、より好ましくは少なくとも９０％の、そして最も
好ましくは少なくとも９５％の配列同一性をもつ配列を
意味する。当業者は、コドン縮重、アミノ酸類似性、リ
ーディング・フレームの位置決めその他を考慮すること
により２つのヌクレオチド配列によりコードされたタン
パク質の対応の同一性を測決するために、上記の値が適
当に調整されることができるということを認めるであろ
う。上記目的のためのアミノ酸配列の実質的同一性は、
通常、少なくとも４０％の、好ましくは少なくとも６０
％の、より好ましくは少なくとも９０％の、そして最も
好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を意味する。
“実質的に同様な”ポリペプチドは上述のように配列を
共有する。但し、同一でない残基の位置は、保存的アミ
ノ酸の変更により相違することができる。保存的アミノ
酸置換は、同様の側鎖をもつ残基の互換性をいう。例え
ば、脂肪族側鎖をもつアミノ酸の一群は、グリシン、ア
ラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり；
脂肪族−ヒドロキシル側鎖をもつアミノ酸の一群は、セ
リン及びスレオニンであり；アミン含有側鎖をもつアミ
ノ酸の一群は、アスパラギン及びグルタミンであり；芳
香族側鎖をもつアミノ酸の一群は、フェニルアラニン、
チロシン、及びトリプトファンであり；塩基性側鎖をも
つアミノ酸の一群は、リジン、アルギニン、及びヒスチ
ジンであり；そして硫黄含有側鎖をもつアミノ酸の一群
は、システイン及びメチオニンである。好ましい保守的
アミノ酸置換基は：バリン−ロイシン−イソロイシン、
フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、ア
ラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンであ
る。
【００１４】ヌクレオチド配列が実質的に同一であると
いう他の指標は、２つの分子が、ストリンジェント条件
下、互いに、又は第３の核酸とハイブリダイズするかど
うかということである。ストリンジェント条件は、配列
依存性であり、そして異なる状況において異なるであろ
う。一般に、ストリンジェント条件は、所定のイオン強
度及びpHにおいて特定の配列についての熱融点（Ｔm ）
より約５℃近く選ばれる。このＴm は、その標的配列の
５０％が完全にマッチしたプローブにハイブリダイズす
るところの（所定のイオン強度及びpH下の）温度であ
る。典型的には、ストリンジェント条件は、その塩濃度
がpH７において約０．０２モル濃度であり、そして温度
は少なくとも約６０℃であるところのものであろう。標
準的なサザン・ハイブリダイゼーションのためのストリ
ンジェント条件は、２０分間の、少なくとも約５０℃
の、通常約５５℃の温度における０．２×ＳＳＣ中の少
なくとも１回の洗浄（通常、２）、又は等価な条件を含
むであろう。
【００１５】本発明は、さまざまな文脈において、組換
えにより製造された２重タグ付融合タンパク質を単離、
及び／又は検出における使用のための組成物及び方法に
向けられる。本発明のタンパク質は、遺伝子操作された
動物からのサンプル（例えば、組織サンプル）中のタン
パク質の高感度検出のために特に有用である。
【００１６】捕獲及び検出タグは、着目のポリペプチド
配列に関して多くの方法において位置決めされることが
できる。例えば、各タグは、ポリペプチド配列のＮ−末
端又はＣ−末端のいずれかにおいて配置されることがで
きる。これらの態様においては、タグは、着目のポリペ
プチドの同一端又は異なる端において置かれることがで
きる。あるいは、どちらかの又は両方のタグが、着目の
ポリペプチド配列内に置かれることができる。例えば、
適当なスプライジング配列と共に、いずれかの又は両方
のタグをコードするＤＮＡが、着目のポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列内に含まれるイントロン内に配置さ
れることができる（例えば、米国特許第５，６５２，１
２８号を参照のこと）。これは、上記タグ配列をコード
する新たなエクソンを含む新たな構築物を作り出す。
【００１７】いくつかの態様においては、２つのタグ
は、それらの間のスペーサー又はリンカー配列と共に、
上記ポリペプチド配列のＣ−末端に置かれる。リンカー
配列は、各タグに特異的な結合性リガンドが標的に結合
することを許容するために十分ないずれかの長さである
ことができる。このリンカーは、通常、長さ約３０未満
のアミノ酸残基であるが、約２０未満の、又はより普通
には、約１５未満、さらにより一般的には、１０以下、
例えば、９，８，７，６，５又は４残基の長さであるこ
とができる。リンカー内で使用されるアミノ酸残基は本
発明にとって臨界的ではないが、典型的には、捕獲又は
検出配列と交差反応性ではなく、かつ、比較的小さな側
鎖をもつように選ばれる。好適な残基は、例えば、アラ
ニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、そ
の他を含む。
【００１８】さらに、いくつかの態様においては、リン
カー配列は、着目のポリペプチドとタグの間に含まれる
ことができる。これらの態様においては、そのＣ−又は
Ｎ−末端が折り畳まれたタンパク質内に埋め込まれてい
る場合、スペーサーは、いずれかの又は両方のタグが露
出することを保証するようにデザインされる。これらの
態様におけるリンカー配列は、タグ間で使用されるもの
と同一物であることができる。
【００１９】捕獲タグ配列 上述のように、本発明の融合タンパク質内の捕獲タグ配
列は、複雑な混合物からタンパク質を単離するために使
用されることができるいずれかのアミノ酸配列である。
使用される特定の捕獲タグは、本発明にとって臨界的で
はない。典型的には、それが検出前に融合タンパク質を
濃縮するように使用されることができるような捕獲タグ
が選ばれる。
【００２０】本発明の捕獲タグは、通常、融合タンパク
質が複雑な混合物から単離されることを許容する捕獲リ
ガンドにより特異的に結合される配列である。いくつか
の態様においては、捕獲タグは、エピトープ・タグであ
り、そしてこのエピトープ・タグと特異的免疫応答性で
ある抗体が、上記タンパク質を単離するために使用され
る。多くのエピトープ・タグが本分野において知られて
おり、例は、myc (Roth et al, J. Cell Biol. 115: 58
7-596 (1991)）、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク
質由来のHA (Wilson, et al., Cell, 37: 767 (1984)),
FLAG (International Biotechnologies Inc. (IBI), K
odak, New Haven, CT,米国特許第 4,793,004号及び第
4,851,341号を参照のこと）、ＩＲＳ（ＲＹＩＲＳ又は
ＩＲＳ，ＢＡＢＣＯから入手可能な抗体）、Ｈｉｓ
（４，５, 又は６ヒスチジン残基、又はＲＧＳＨＨＨ
Ｈ，Ｑｕｉａｇｅｎ又はＢＡＢＣＯから入手可能な抗
体）、ＡＵ１（ＤＴＹＲＹＩ，ＢＡＢＣＯから入手可能
な抗体）、ＡＵ５（ＴＤＦＬＹＫ，ＢＡＢＣＯから入手
可能な抗体）、ｇｌｕ−ｇｌｕ（ポリオーマ・ウィルス
培地Ｔ抗原からの９アミノ酸エピトープ、ＥＥＥＥＹＭ
ＰＭＥ，ＢＡＢＣＯから入手可能な抗体）、ＫＴ３（Ｓ
Ｖ４０ラージＴ抗原からの１１アミノ酸エピトープ、Ｋ
ＰＰＴＰＰＰＥＰＥＴ，ＢＡＢＣＯから入手可能な抗
体）、Ｔ７（Ｔ７主要カプシド・タンパク質からの１１
アミノ酸リーダー・ペプチド、Ｎｏｖａｇｅｎから入手
可能な抗体）、Ｓ−ＴＡＧ（Ｎｏｖａｇｅｎ），ＨＳＶ
（単純ヘルペス・ウィルス・グリコプロテインＤからの
１１アミノ酸ペプチド、Ｎｏｖａｇｅｎから入手可能な
抗体）、ＶＳＶ−Ｇ（水疱性口内炎ウィルス・グリコプ
ロテインのカルボキシ末端からの１１アミノ酸エピトー
プ、ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ，Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手可能な抗体）、Ａｎｔｉ−Ｘ
ｐｒｅｓｓ（８アミノ酸エピトープ、ＤＬＹＤＤＤＫ，
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能な抗体）、及びＶ５
（パラモキシウィルスＳＶ５からの１４アミノ酸エピト
ープ、ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ，Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎから入手可能な抗体）を含む。
【００２１】ほとんどの場合において、融合タンパク質
を捕獲するために使用される抗体は、容易に入手可能で
ある。抗体は、全抗体又は抗体断片であることができ
る。それは、ポリクローナル又はモノクローナルである
ことができ、そしてそれは、所望のエピトープ・タグ配
列で生物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、等）をチ
ャレンジすることにより製造されることができる。必要
な場合、当業者は、周知の技術を使用して適当な抗体を
作出することができる（例えば、Methods in Cell Biol
ogy Volume 37: Antibodies in Cell Biology, Asai, e
d. Academic Press, Inc. New York (1993);及びBasic
and Clinical Immunology 7th Edition, Stites & Ter
r, eds. (1991) を参照のこと）。あるいは、抗体は、
組換えＤＮＡ方法を使用して新規に製造されることがで
きる。抗体は、上記タンパク質に対してスクリーンされ
たファージ・ディスプレイ・ライブラリーから選択され
ることもできる（例えば、Vaughau et al. (1996) Natu
re Biotechnology, 14: 309-314 及びその中の文献を参
照のこと）。
【００２２】他の態様においては、ロイシン・ジッパー
・モチーフ（leucine zipper motifs)は、タンパク質内
に取り込まれることができる。これらの態様は、ＤＮＡ
に結合することができ、そしてこれ故、転写を調節する
ことができる特定のタンパク質対のペプチド・セグメン
トの強い相互作用に基づく。ロイシン・ジッパー対含有
タンパク質の例は、ｆｏｓ遺伝子産物とｊｕｎ遺伝子産
物を含む。この目的のための特別の配列の例は、ｃ−Ｊ
ｕｎタンパク質のアミノ酸２８５〜３２４位、及びｖ−
Ｆｏｓタンパク質の１６２〜２０１位を含む（例えば、
米国特許第５，６４３，７３１号を参照のこと）。これ
らの態様においては、上記配列の中の１が、本発明の融
合タンパク質内に取り込まれ、そして他が、固体表面に
付着された捕獲リガンドとして使用される。
【００２３】本発明の捕獲タグは、金属キレート形成性
のアミノ酸を含むこともできる（例えば、Porath, et a
l., Nature 258: 598-599 (1975) Lonnerdal and Keen,
J.Appl. Biochem. 4: 203-208 (1982), Sulkowski, Tr
ends in Biotechnology 3:1-7 (1985)及び米国特許第
5,047,513号を参照のこと）。本明細書中に使用すると
き、金属キレート形成性のアミノ酸は、金属結合に参加
することができるもの、すなわち、金属イオンとキレー
ト又は錯体を形成することができるアミノ酸である。こ
のようなアミノ酸は：グリシン、チロシン、システイ
ン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、アスパラギン及
びメチオニンを含む。通常、ヒスチジンが使用される。
典型的には、２〜約１０の金属キレート形成性アミノ酸
が融合タンパク質中に取り込まれる。より好ましくは、
約６の金属キレート形成性アミノ酸が上記タンパク質中
に取り込まれる。
【００２４】一般に、金属キレートの分離方法は、金属
イオン（例えば、Ｃｕ2+，Ｚｎ2+，Ｎｉ2+、等）と、タ
ンパク質の表面上に配置された電子供与基、特にヒスチ
ジンのイミダゾール側鎖の間の可逆的相互作用を利用す
る。キレーティング・リガンドの使用を通して固体支持
体又はマトリックス上に金属イオンを固定化することに
より（すなわち、キレート樹脂の形成により）、接近可
能な電子供与基をもつタンパク質が、このような基を欠
くプロトンから分離されることができる。このタンパク
質は、そのpHが、その電子供与基が少なくとも部分的に
脱プロトン化されるようなものであるとき、上記の固定
化された金属イオンに結合する。結合されたタンパク質
は、多くの異なる技術を使用して、例えば、競合的溶出
により、pHを低下させることにより、又は強いキレート
形成剤を使用することにより、その後、溶離されること
ができる。
【００２５】本発明の精製方法に従う使用のために好適
な金属イオンは、非限定的に第１列の遷移金属を含む。
第１列遷移金属は、例えば、Ｃｕ2+，Ｚｎ2+，Ｎｉ2+，
Ｃｏ 2+及びＦｅ3+を含む。目下好ましい態様において
は、Ｎｉ2+，Ｃｕ2+及びＺｎ2+が、使用される金属イオ
ンである。これらの金属は、金属キレート形成性アミノ
酸と容易に錯体又はキレートを形成することが分ってお
り、そしてこれ故、それらは、金属キレート形成性アミ
ノ酸をもつタンパク質をそれをもたないタンパク質から
分離するために使用されることができる。
【００２６】発現された融合タンパク質を特異的に結合
させるための他の手段を使用することもできる。例え
ば、特異的なレクチン・ドメインが捕獲タグ配列内に取
り込まれることができる。次に同起源の炭水化物が融合
タンパク質を捕獲するために使用されることができる
（例えば、Drickamer et al., Biology of animal lect
ins, Annu Rev Cell Biol 9: 237-64 (1993)を参照のこ
と）。
【００２７】本発明の捕獲タグ配列は、使用される特定
の捕獲タグに依存して、周知技術に従って融合タンパク
質を単離するために使用される。典型的には、結合性リ
ガンド（例えば、抗体、ロイシン・ジッパー配列、金
属、その他）が固体表面に共有結合され、そして融合タ
ンパク質を含むサンプルが固体表面と接触される。さま
ざまな固体表面に生体分子を固定化するための多くの方
法が本分野において知られている。例えば、固体表面
は、膜（例えば、ニトロセルロース）、マイクロタイタ
ー皿（例えば、ＰＶＣ又はポリスチレン）又は磁気ビー
ズであることができる。所望の成分は、非特異的結合を
通じて共有結合され又は非共有結合的に付着されること
ができる。
【００２８】多種多様な有機及び無機ポリマー、天然及
び合成が、固体表面のための材料として使用されること
ができる。例証的ポリマーは、ポリエチレン、ポリプロ
ピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポ
リメタクリレート、ポリ（エチレン・テレフタレー
ト）、レーヨン、ナイロン、ポリ（ビニル・ブチレー
ト）、ポリビニリデン・ジフルオリド（ＰＶＤＦ）、シ
リコーン、ポリホルムアルデヒド、セルロース、セルロ
ース・アセテート、ニトロセルロース、その他を含む。
使用されることができる他の材料は、紙、ガラス、セラ
ミック、金属、メタロイド、半導体材料、セメントその
他を含む。ゲルを形成する物質も含まれ、例えば、タン
パク質（例えば、ゼラチン）、リポポリサッカライド、
シリケート、アガロース及びポリアクリルアミドが使用
されることができる。いくつかの水性相を形成するポリ
マー、例えば、デキストラン、ポリアルキレン・グリコ
ール又は界面活性剤、例えば、リン脂質、長鎖（１２〜
２４炭素原子）アルキル・アンモニウム塩その他も好適
である。固体表面が多孔性である場合、その系の性質に
依存して、さまざまな多孔サイズが使用されることがで
きる。
【００２９】上記表面の調製においては、さまざまな特
性を獲得するために、特にラミネートとして、複数の異
なる材料が使用されることができる。例えば、タンパク
質コーティング、例えばゼラチンは、非特異的結合を回
避し、共有結合を単純化し、シグナル検出を強化、等す
るために使用されることができる。化合物と上記表面の
間の共有結合が望ましい場合、その表面は、通常、多官
能価であろうし、又は多官能化されることができるであ
ろう。表面上に存在し、かつ、結合のために使用される
ことができる官能基は、カルボン酸、アルデヒド、アミ
ノ基、シアノ基、エチレン性基、ヒドロキシル基、メル
カプト基、その他を含むことができる。さまざまな表面
に多種多様な化合物を結合させるやり方は、周知であ
り、そして文献中にたくさん説明されている。例えば、
Immobilized Enzymes, Ichiro Chibata, Halsted Pres
s, New York, 1978及びCuatrecasas, J.Biol. Chem. 24
5 3059 (1970) を参照のこと。
【００３０】共有結合に加えて、リガンドを非共有結合
的に結合させるためのさまざまな方法が使用されること
ができる。非共有結合的な結合は、典型的には、表面へ
の化合物の非特異的吸収である。典型的には、その表面
は、サンプル中のさまざまな成分の非特異的結合を防ぐ
ために、第２の化合物でブロックされる。成分の非共有
結合的付着における使用のためのさまざまな固体表面
が、米国特許第４，４４７，５７６号及び第４，２５
４，０８２号中にレビューされている。
【００３１】好ましい態様においては、アフィニティー
及びゲル・クロマトグラフィーにおいて一般に使用され
る材料が便利に使用される。このような材料の例は、例
えば、デキストラン、アガロース、セルロース、ポリス
チレン、ポリアクリルアミド、及びそれらの誘導体を含
む。あるいは、結合性リガンドは常磁性ビーズに結合さ
れることができ、これは次に知られた技術に従って融合
タンパク質を分離するために使用されることができる。
このようなビーズは、例えば、Dynal, Inc. Lake Succe
ss, NY. Brun et al. Blood 1990; 76 (11): 2397-2403
から入手可能である。例えば、いくつかの態様において
は、ビオチン−ストレプトアビジン結合が、上記ビーズ
に捕獲抗体を付着させるために使用される。常磁性ビー
ズの使用方法は、例えば、米国特許第 4,910,148号、Me
tzger et al. Ann. N.Y. Acad. Sci 651: 75-77 (199
2), Rasmussen et al. Journal of Immunological Meth
ods146: 195-202 (1992) 、及びFunderud et al. Europ
ean Journal of Immunology20: 201-206 (1990) 中に記
載されている。
【００３２】検出タグ配列 融合タンパク質が捕獲タグを使用して濃縮された後、そ
れは、検出タグを使用して検出されることができる。所
望のタンパク質分子を検出するための手段がいくらで
も、この目的のために使用されることができる。検出タ
グは、直接的に又は間接的に検出されることができる。
直接的に検出されることができる検出タグの例は、蛍光
及び化学発光性ポリペプチド配列を含む（例えば、緑色
蛍光タンパク質、例えば、Kain et al. BioTechniques
19: 650-655 (1995), Chalfie et al., Science 263: 8
02-805 (1994) を参照のこと、及びルシフェラーゼ、例
えば、米国特許第５，２８３，１７９号を参照のこ
と）。間接的に検出される場合、その検出タグ配列は、
検出可能な成分を取り込んだリガンド（例えば、上記の
ようなロイシン・ジッパー対配列、エピトープ・タグ／
抗体又は金属結合性ドメイン）により結合される。
【００３３】検出可能なリガンドは、いくつかの方法の
中のいずれか１つにより標識付けされることができる。
標識の例は、非限定的に、以下の：ラジオアイソトープ
（例えば、 3Ｈ，14Ｃ，35Ｓ， 125Ｉ， 131Ｉ）、蛍光
又はリン光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ラン
タニド・リン光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビ・
ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラ
ーゼ、アルカリ・ホスファターゼ）、ビオチニル基、第
２抗体により認識されるポリペプチド配列、その他を含
む。いくつかの態様においては、標識は、例えば、潜在
的な立体妨害を減少させるために、さまざまな長さのス
ペーサー・アームにより付着される。
【００３４】リガンドを検出する好ましい方法は、電気
化学発光（electrochemiluminescence）を通じてのもの
である（IGEN International, Inc., Gaithersburg, MD
20877) 。電気化学発光は、低電圧が電極に加えられた
とき、光の生成が起こり、検出されるべき化合物に結合
されたルテニウム金属イオンの循環的な酸化及び還元反
応の引き金を引くところのプロセスである。ルテニウム
・イオンは、トリス−（ピピリジン）のキレート内に結
合されている。過剰の大モル量においてアッセイ中に存
在する、第２反応成分、トリプロピルアミン（ＴＰＡ）
が上記酸化プロセスにおいて消費され、そしてルテニウ
ム・キレートがリサイクルされる。このアッセイにおい
ては、標識された成分は固体表面上に捕獲され、第２酸
化反応成分、ＴＰＡは、フロー・セル内に導入され、そ
して一定電圧が加えられる。ＴＰＡは、ルテニウムを減
少させ、これは、励起状態において電子を受容し、そし
て次に基底状態に減衰して、上記プロセスにおいて光子
を放出する。
【００３５】いくつかのアッセイ形式は、標識された成
分の使用を要求しない。例えば、凝集（ａｇｇｌｕｔｉ
ｎａｔｉｏｎ）アッセイが、融合タンパク質の存在を検
出するために使用されることができる。この場合、リガ
ンド−コートされた粒子が、標的融合タンパク質を含む
サンプルにより凝集される。この形式においては、その
成分のいずれも、標識付けされる必要がなく、そして融
合タンパク質の存在は、単なる視覚的検査によって検出
される。
【００３６】エピトープ・タグの場合には、特別の検出
タグ配列の存在は、いくつかのよく認識されたイムノア
ッセイ・プロトコールを使用して検出されることができ
る。イムノアッセイにおいて有用な一般手順のレビュー
については、Basic and Clinical Immunology 7th Edit
ion (D. Stites and A. Terr ed.) 1991を参照のこと。
例えば、典型的なＥＬＩＳＡ−ベースの検出アッセイに
おいては、融合タンパク質は、捕獲タグを使用して固体
表面に結合され、そして検出タグと特異的に免疫反応す
る標識された抗体が、融合タンパク質を検出し、そして
定量するために使用される。他の形式、例えば、ウェス
タン・ブロット、又はリポソーム・イムノアッセイ（Ｌ
ＩＡ）であって、特別の分子（例えば、抗体）に結合
し、そして包んでいた試薬又はマーカーを放出するもの
も、使用されることができるであろう。次に、放出され
た化学物質が、標準的な技術に従って検出される（Monr
oe et al., Amer. Clim. Prod. Rev. 5: 34-41 (1986)
を参照のこと）。
【００３７】着目のポリペプチド配列 検出されるべき特定のポリペプチド配列は、本発明にと
って臨界的ではない。これらのポリペプチドは、典型的
には、遺伝子治療において使用される治療用ポリペプチ
ドのような重要なものであろう。これらのポリペプチド
は、さまざまな疾患、例えば先天性遺伝性疾患、後天性
遺伝性疾患（例えば、癌）、ウィルス疾患（例えば、Ａ
ＩＤＳ、単核球症、ヘルペス・ウィルス感染、サイトメ
ガロウィルス感染、パピローマウィルス感染）を治療
し、又はいずれかの治療的利益のために患者の選ばれた
細胞タイプのゲノムを修飾するために、使用されたもの
であることができる。以下の実施例においては、本発明
の方法は、マウス組織中の組換えアンジオスタチンの存
在を検出するために使用される。
【００３８】融合タンパク質の発現 本発明の融合タンパク質は、遺伝子操作された動物又は
植物を含む多くの系内で、又は、細胞、例えば、バクテ
リア、酵母、昆虫、植物及び哺乳類細胞培養において、
発現されることができる。当業者は、組換えポリペプチ
ドをコードするＤＮＡの発現のために利用されることが
できる多くの発現系をよく知っていると予想される。原
核生物又は真核生物内でのタンパク質の発現について知
られたさまざまな方法を詳細に説明することはしない。
これらの手順のために必要な命名法及び一般実験手順の
多くは、Sambrook, et al., Molecular Cloning : A La
boratory Manual (2nd Ed.), Vol.1-3, Cold Spring Ha
rbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 198
9 中に見られる。
【００３９】簡単に言えば、検出のためのポリペプチド
をコードする天然又は合成核酸の発現は、典型的には
（構成的であるか又は誘導性である）プロモーターに、
融合タンパク質をコードする核酸を作用可能な状態で連
結させ、その後、発現ベクター内に取り込むことにより
達成されるであろう。これらのベクターは、原核細胞又
は真核細胞のいずれか又は両者における複製及び組み込
みのために好適であることができる。典型的な発現ベク
ターは、転写及び翻訳ターミネーター、ポリＡ付加部
位、スプライス部位をもつイントロン、開始配列、及び
融合タンパク質をコードするＤＮＡの発現の調節のため
に有用なプロモーターを含む。クローン化された遺伝子
の高レベル発現を得るために、少なくとも、転写を指令
するプロモーター、ポリＡ配列、及び翻訳開始のための
結合部位を含む発現プラスミドを構築することが望まし
い。
【００４０】融合タンパク質を発現させるための発現系
は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス種（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｓｐ．）(Palva, I. et al., 1983, Gene 22:
229-235; Mosbach, K. et al., Nature, 302: 543-545)
及びサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）を使用して利
用可能である。酵母内での異種タンパク質の合成も、周
知であり、そして記載されている。Methods in Yeast G
enetics, Sherman, F., et al., Cold Spring Harbor L
aboratory, (1982) は、酵母内で異種ポリペプチドを製
造するために利用可能なさまざまな方法を記載している
よく認められた研究である。融合タンパク質をコードす
るポリヌクレオチドは、哺乳類又は昆虫細胞培養物の形
質転換における使用のためにさまざまな発現ベクターに
ライゲートされることもできる。哺乳類細胞系の実例
は、ＶＥＲＯ，ＣＯＳ、及びＨｅＬａ細胞、チャイニー
ズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、及びAmerican T
ypeCulture Collection Catalogue of Cell Lines and
Hybridomas (7th edition,1992) 中に記載されているよ
うなさまざまな細胞系を含む。好適な昆虫細胞系は、蚊
の幼虫、カイコ、アワヨトラの幼虫（ａｒｍｙｗｏｒ
ｍ）、蛾（ｍｏｔｈ）及びキイロショウジョウバエ（Ｄ
ｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞系を含む。
【００４１】最も好ましい態様においては、本発明の融
合タンパク質をコードする構築物は、遺伝子操作された
動物又は植物を製造するために使用される。遺伝子操作
された動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウ
サギ、その他）の作出のために、上記構築物がインビト
ロ又はインビボにおいて細胞内に導入されることができ
る。これらの核酸は、標的細胞及び生物のトランスフェ
クションのための多くの周知のベクターのいずれかに挿
入されることができる。
【００４２】動物細胞への所望の核酸のデリバリーのた
めに好適な多くの方法が知られている。このような方法
は、例えば、リポソーム・ベースの遺伝子デリバリー
（Debsand Zhu (1993) WO93/24640; Mannino and Gould
-Fogerite (1988) BioTechniques 6 (7): 682-691; Ros
e米国特許第 5,279,833号; Brigham (1991) WO91/0630
9;及びFelgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 84: 7413-7414）。上記方法において有用なカチオ
ン脂質は、例えば、イミダゾリニウム誘導体（ＷＯ９５
／１４３８０）、グアニジン誘導体（ＷＯ９５／１４３
８１）、ホスファチジル・コリン誘導体（ＷＯ９５／３
５３０１）、及びピペラジン誘導体（ＷＯ９５／１４６
５１）を含む。使用されることができるカチオン脂質の
例は、DOTIM (BODAIともいわれる）(Solodin et al.,
(1995) Biochem. 34: 13537-13544),DDAB (Rose et a
l., (1991) BioTechniques 10 (4): 520-525), DOTMA(
米国特許第 5,550,289号）、DOTAP (Eibl and Wooley
(1979) Biophys. Chem. 10: 261-271), DMRIE (Felgner
et al. (1994) J. Biol. Chem. 269 (4): 2550-2561),
EDMPC (Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabamaから
商業的に入手可能なもの）、DC-Chol (Gau and Huang
(1991) Biochem. Biophys, Res. Comm. 179: 280-285),
DOGS (Behr et al. (1989) Proc. Nat'l. Acad. Sci.
USA, 86: 6982-6986), MBOP (MeBop ともいわれる）(WO
95/14651)、及びWO97/00241中に記載されたものを含
む。
【００４３】中性脂質は、例えば、ジオレオイル・ホス
ファチジルエタノールアミン（dioleoyl phosphatidyle
thanolamine) (DOPE) (Hui et al. (1996) Biophys. J.
(71): 590-599) 及びコレステロール(Liu et al. (199
7) Nat. Biotech. (15): 167-173) を含む。使用される
特定のカチオン及び中性脂質は、標的細胞のタイプと投
与の方法に依存するであろう。例えば、肺血管内皮細胞
への静脈内デリバリーのために、トランスフェクション
複合体は、１：１のモル比のＤＯＴＩＭとコレステロー
ルをもつリポソームであって、１：６の比（μｇ ＤＮ
Ａ：ｎモルカチオン脂質）においてプラスミドＤＮＡと
複合体形成されたリポソームから調製される。ＷＯ９６
／４０９６２を参照のこと。
【００４４】脂質混合物は、典型的には、クロロホルム
中で調製され、乾燥され、そして例えば水又は生理学的
バッファー中５％デキストロース中で再水和されて、リ
ポソームを形成される。低イオン強度溶液が好ましい。
リポソームは、ＬＵＶｓ，ＭＬＶｓ、又はＳＵＶｓであ
ることができる。通常、再水和の間に形成されるリポソ
ームは、主にＭＬＶｓであり、そしてＳＵＶｓは、それ
らのサイズを減少させるために、音波処理により又は５
０〜６００nmの範囲にある多孔サイズをもつ膜を通して
押し出すことにより、それらから形成される。最も好ま
しくは、リポソームは、減少した多孔サイズ、例えば４
００nm、２００nm及び５０nmをもつ一連の膜を通して押
し出される。得られたリポソームは、着目の標的細胞を
トランスフェクトすることができる複合体を形成するた
めに、プラスミドＤＮＡと混合される。
【００４５】レトロウィルス・ゲノムの一部として所望
のポリヌクレオチド配列を宿す複製欠陥レトロウィルス
・ベクターも、本発明の融合タンパク質をコードする核
酸をデリバリーするために使用されることができる（例
えば、Miller et al. (1990)Mol. Cell. Biol. 10: 423
9 (1990); Kolberg (1992) J. NIH Res. 4: 43,及びCor
netta et al. Hum-Gene Ther. 2: 215 (1991)を参照の
こと）。広く使用されるレトロウィルス・ベクターは、
Ｍｏｌｏｎｅｙネズミ白血病ウィルス（ＭＭｕＬＶ）、
テナガザル（ｇｉｂｂｏｎ ａｐｅ）白血病ウィルス
（ＧａＬＶ）、シミアン免疫不全ウィルス（ＳＩＶ）、
ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、それらの組合せに基
づくものを含む。例えば、Buchscher et al. (1992) J.
Virol. 66(5) 2731-2739; Johann et al. (1992) J. V
irol. 66 (5): 1635-1640 (1992);Sammer felt et al.,
(1990) Virol. 176: 58-59; Wilson et al. (1989) J.
Virol. 63: 2374-2378; Miller et al., J. Virol. 6
5: 2220-2224 (1991); Wong-Staal et al., PCT/US 94/
05700、及びRosenburg and Fauci (1993) in Fundament
al Immunology, Thind Edition Paul (ed) Raven Pres
s, Ltd., New York 及びその中の文献、並びにYu et a
l., Gene Therapy (1994)前掲を参照のこと。
【００４６】アデノウィルス・ベクターも、哺乳類への
核酸の導入のために一般に使用される。例えば、レビュ
ーについては、Berns et al. (1995) Ann. NY Acad. Sc
i. 772: 95-104; Al: et al. (1994) Gene ther. 1: 36
7-384;及びHaddada et al. (1995) Curr. Top. Microbi
ol. Immunol. 199 (Pt3): 297-306 を参照のこと。アデ
ノ関連ウィルス（ＡＡＶ）−ベースのベクターも、標的
核酸により細胞を形質導入するために使用される。ＡＡ
Ｖベクターの概説については、West et al. (1987) Vir
ology 160: 38-47; Carter et al. (1989)米国特許第
4,797,368号; Carter et al. WO93/24641 (1993); Koti
n (1994) Human Gene Therapy 5: 793-801; Muzyczka
(1994) J. Clin. Invest. 94: 1351及びSanulski (前
掲）を参照のこと。組換えＡＡＶベクターの構築は、Le
bkowski,米国特許第 5,173,414号; Tratschin et al.
(1985) Mol. Cell. Biol. 5 (11): 3251-3260; Tratsch
in, etal. (1984) Mol. Cell. Biol., 4: 2072-2081; H
ermonat and Muzyczka (1984)Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 81: 6466-6470; McLaughlin et al. (1988) 及びS
amulski et al. (1989) J. Virol., 63: 03822-3828を
含む、多くの刊行物中に記載されている。ｒＡＡＶによ
り形質転換されることができる細胞系は、Lebkowski et
al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8: 3988-3996 中に記載
されたものを含む。
【００４７】上記核酸は、単独で又は他の好適な成分と
共に、吸入により投与されるべきエアロゾル配合物（す
なわち、それらは“噴霧される”ことができる。）中に
導入されることができる（米国特許第５，６４１，６６
２号を参照のこと）。エアロゾル配合品は、加圧された
許容駆出剤、例えばジクロロジフルオロメタン、プロパ
ン、窒素、その他内に入れられることができる。
【００４８】遺伝子操作された動物内での発現の後に、
上記融合タンパク質は、動物からのサンプル中に検出さ
れる。サンプルは、生物学的液体、例えば全血、血漿、
血清、鼻分泌物、喀痰（ｓｐｕｔｕｍ）、唾液、尿、
汗、経皮滲出物、脳脊髄液、その他であることができ
る。あるいは、このサンプルは、動物からの全臓器、組
織又は細胞であることができる。このようなサンプルの
源の例は、筋力、眼、皮膚、性腺、リンパ節、心臓、
脳、肺、肝臓、腎臓、脾臓、固形腫瘍、マクロファー
ジ、体腔上皮（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｕｍ）、その他を含
む。
【００４９】
【実施例】実施例 以下の実施例を、本発明を限定するためではなく、説明
するために提供する。 実施例１ＦＬＡＧ−ＨＡ ＥＬＩＳＡ 本実施例は、捕獲タグ配列としてオクタペプチド、ＦＬ
ＡＧ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を、そして検出タグ配列とし
てノナペプチドＨＡ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）を含む本発
明の融合タンパク質の使用を説明する。これらの実験に
おいて使用される着目のポリペプチドは、アンジオスタ
チンであった。アンジオスタチンは、プラスミノーゲン
の天然の解裂性製品であり、これは抗−血管形成（ａｎ
ｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）活性をもつことが知られ
ている（Folkman (1990) J. Nat'l. Cancer Inst. 82:
4-6 及びSim et al. (1997) Cancer Res. 57: 1329-133
4を参照のこと）。
【００５０】ＦＬＡＧとＨＡ配列は、いくつかのバリエ
ーションにおいてアンジオスタチンのカルボキシ末端に
融合された。２つの構築物は、２つの方向：ＨＡ−スペ
ーサー−ＦＬＡＧ（ｐＭＢ２８１）及びＦＬＡＧ−スペ
ーサー−ＨＡ（ｐＭＢ２８１．１）において４アミノ酸
のスペーサー（ＡＡＡＡ）を使用する。第２の２つの構
築物は、両方向においてより長いスペーサー（１０アラ
ニン）を使用した（図１参照）。サンドイッチＥＬＩＳ
Ａは、上記タンパク質を検出するために使用した。簡単
に言えば、このサンドイッチＥＬＩＳＡは、捕獲試薬と
して抗−ＦＬＡＧ Ｍ２モノクローナル抗体（ＩＢＩ／
Ｋｏｄａｋ）を使用し、そして検出は、ウサギ抗−ＨＡ
ペプチド・ポリクローナル（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈ．）及びヤギ抗−ウサギ−ＨＲＰ（Ａｃｃ
ｕｒａｔｅ）で達成される。このアッセイは、過渡的に
トランスフェクトされた２９３細胞により発現されたＦ
ＬＡＧ−ＨＡタグ付アンジオスタチンについて特異的で
あることが示されている。
【００５１】インビボにおけるトランスフェクション実
験 我々は、その最新形態におけるＦＬＡＧ−ＨＡ ＥＬＩ
ＳＡが、脂質配合品ＭＢ１１２（ＤＯＴＩＭ：コレステ
ロール１：１モル比；１：６、１：６、μｇＤＮＡ：ｎ
モルカチオン脂質）によるＣ５７／８１６マウス・トラ
ンスフェクテドＩＶから調製された肺ホモジネート中に
存在するアンジオスタチン−ＦＬＡＧ−ＨＡタンパク質
を検出することができるかどうかを決定したいと欲し
た。図２中、各肺サンプルについて得られたＯＤを、ア
ッセイされた全タンパク質の関数としてプロットした。
図示されるように、１０肺サンプルの中の１０がＤ５Ｗ
（水中５％デキストロース（Ｗ／Ｖ））対照肺サンプル
よりも高いＯＤ値に戻った。この結果は、ＦＬＡＧ−Ｈ
Ａ ＥＬＩＳＡが、上記のインビボにおいてトランスフ
ェクトされた肺ホモジネート中に存在するＦＬＡＧ−Ｈ
Ａタグ付アンジオスタチンを検出することができたとい
うことを立証した。
【００５２】実施例２ＦＬＡＧ−ＨＡ ＥＣＬアッセイ（ＤＲＩＧＥＮ（商
標）） 本実施例は、実施例１に記載したＦＬＡＧ−ＨＡ ＥＬ
ＩＳＡを真似る電気化学発光（ＥＣＬ）−ベースのアッ
セイを説明する。本アッセイは、捕獲試薬としてビオチ
ニル化抗−ＦＬＡＧ Ｍ２モノクローナル抗体（ＩＢＩ
／Ｋｏｄａｋ）を使用し、一方、検出は、ルテニウム標
識されたウサギ抗−ＨＡペプチド・ポリクローナル抗体
（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて達
成された。逐次希釈実験を、捕獲及び検出試薬の相対的
濃度を最適化するために行った。ｐＭＢ２８１．１（ア
ンジオスタチン−ＦＬＡＧ−ＨＡ）により過渡的にトラ
ンスフェクトされた２９３細胞からの溶解物を、アッセ
イ最適化のための２重タグ付タンパク質の源として使用
した。ＥＣＬシグナル対アッセイされた全タンパク質量
としてプロットされた、代表的な希釈曲線を、図３中に
示す。図示されるように、陽性シグナル（バックグラン
ドを＞２倍上廻る）が、ｐＭＢ２８１．１トランスフェ
クチド細胞から調製された全タンパク質の０．４５μｇ
未満がアッセイされたときに、得られた。しかしなが
ら、ｐＭＢ２４９（アンジオスタチン−ＨＡシングル・
タグ）又はｐＭＢ７５．６（ベクター・バックボーン対
照）によりトランスフェクトされた細胞から調製された
溶解物は、認識されなかった。この結果は、上記アッセ
イがアンジオスタチンの２重タグ付形態について特異的
であったということを示唆した。上記アッセイの特異性
をさらに証明するために、上記分析を、ＨＡペプチドの
増加した濃度の存在下で繰り返した。図４は、アンジオ
スタチン−ＦＬＡＧ−ＨＡトランスフェクテド溶解物を
用いて得られたＥＣＬシグナルが、ＨＡペプチドの増加
した濃度により阻害されたということを示している。こ
の発見は、上記アッセイがエピトープ・タグ付アンジオ
スタチンについて特異的であるという結論を支持する。
【００５３】標準的な曲線は、２重タグ付アンジオスタ
チンの源として粗トランスフェクテド２９３細胞溶解物
を使用して作成されることができる。ＦＬＡＧ−ＨＡ
ＥＣＬアッセイのための定量標準を確立するために、２
９３トランスフェクテド細胞溶解物中のタグ付アンジオ
スタチンの濃度を定量した。これを、上記サンプル中の
ＨＡエピトープのモル濃度を計測するイムノ−ベースの
競合アッセイを使用して行った。この分析の例を表１中
に示す。ＥＣＬ競合アッセイのために使用されたＨＡペ
プチド標準阻害曲線に基づいて、ｐＭＢ２８１．１トラ
ンスフェクテド２９３細胞溶解物は、１１．１８μｇ／
mlのアンジオスタチン−ＦＬＡＧ−ＨＡを含有すると計
算された。特定のタンパク質濃度の上記推定を使用すれ
ば、この溶解物は、ＦＬＡＧ−ＨＡ ＥＣＬアッセイの
ための相対的定量標準として使用されることができる。
【００５４】
【表１】
【００５５】インビボにおけるトランスフェクション実
験 ＦＬＡＧ−ＨＡ ＥＣＬアッセイを、脂質配合品ＭＢ１
１２によるＣ５７／Ｂ１６マウス・トランスフェクテド
ＩＶから調製された肺ホモジネート中のアンジオスタチ
ン−ＦＬＡＧ−ＨＡタンパク質を計測するために使用し
た。この肺サンプルの全ては、Ｄ５Ｗ対照肺サンプルよ
りも高いＥＣＬ値に戻った（図５）。それ故、このＦＬ
ＡＧ−ＨＡ ＥＣＬアッセイは、トランスフェクトされ
た肺ホモジネート中に存在するＦＬＡＧ−ＨＡタグ付ア
ンジオスタチンを検出することができる。これらの肺ホ
モジネートを用いて得られたシグナルが上記タグ付アン
ジオスタチン分子に特異的であるということを証明する
ために、最高のＥＣＬシグナルを与えたサンプル＃１０
を、ＨＡペプチドの増加する濃度の存在下で再テストし
た。この実験の結果を図６に提供する。上記陽性肺ホモ
ジネート（サンプル＃１０）を用いて得られたＥＣＬシ
グナルは、ＨＡペプチドの濃度が増加するにつれて、減
少する。対照肺ホモジネート（サンプル＃３）を用いて
得られたシグナルは、バックグラウンドを下廻る。これ
らの結果は、上記アッセイが、トランスフェクトされた
マウス肺ホモジネート中のＦＬＡＧ−ＨＡタグ付アンジ
オスタチンを特異的に認識するという結論を支持する。
【００５６】本明細書中に記載する実施例及び態様は、
説明だけを目的としたものであること、そして本発明の
観点からさまざまな修正又は変更が当業者に示唆される
であろうし、そして本願の本質及び範囲内並びに添付の
請求の範囲内に包含されるべきであるということが、理
解される。本明細書中に引用する刊行物、特許、及び特
許明細書の全てを、目的を限定せずに、ここに引用によ
り取り込む。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のＣ−末端２重タグ付タンパク質の各種
態様を図示する。
【図２】マウスからの肺ホモジネート中のアンジオスタ
チン−ＦＬＡＧ−ＨＡタンパク質を検出するために使用
されたＦＬＡＧ−ＨＡ ＥＬＩＳＡからの結果を示す。
各肺サンプルについて得られたＯＤ値が、アッセイされ
た全タンパク質の関数としてプロットされる。
【図３】ＥＣＬシグナル対アッセイされた全タンパク質
の量としてプロットされた、ＦＬＡＧ−ＨＡ ＥＣＬア
ッセイについての代表的な希釈曲線である。
【図４】アンジオスタチン−ＦＬＡＧ−ＨＡトランスフ
ェクテド溶解物を用いて得られたＥＣＬシグナルが、Ｈ
Ａペプチドの増加する濃度により阻害されたことを示
す。
【図５】マウスからの肺ホモジネート中のアンジオスタ
チン−ＦＬＡＧ−ＨＡタンパク質を計測するために使用
されたＦＬＡＧ−ＨＡ ＥＣＬアッセイの結果を示す。
【図６】陽性肺ホモジネートを用いて得られたＥＣＬシ
グナルが、ＨＡペプチドの増加する濃度により阻害され
たことを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ジョン バーナッチオ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94402, サン マテオ，ティコンデローガ ドライ ブ 2373 (72)発明者 ジャッキー パップコフ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94303, パロ アルト，シカモア ドライブ 812

Claims (37)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 着目のポリペプチド配列、捕獲タグ配
    列、及び検出タグ配列を含んで成る融合タンパク質をコ
    ードする核酸であって、その捕獲タグ配列と検出タグ配
    列が、それぞれ、上記着目のポリペプチド配列に対して
    異種である、前記核酸。
  2. 【請求項２】 前記捕獲タグ配列又は前記検出タグ配列
    がエピトープ・タグである、請求項１に記載の核酸。
  3. 【請求項３】 前記捕獲タグ配列が、ＤＹＫＤＤＤＤＫ
    である、請求項２に記載の核酸。
  4. 【請求項４】 前記検出タグ配列が、ＹＰＹＤＶＰＤＹ
    Ａである、請求項２に記載の核酸。
  5. 【請求項５】 前記捕獲タグ配列と前記検出タグ配列
    が、前記着目のポリペプチド配列のＣ末端に位置する、
    請求項１に記載の核酸。
  6. 【請求項６】 前記捕獲タグ配列と前記検出タグ配列
    が、オリゴペプチド・リンカーを通じて互いに連結され
    ている、請求項１に記載の核酸。
  7. 【請求項７】 前記リンカーが、１５未満のアミノ酸残
    基から成る、請求項６に記載の核酸。
  8. 【請求項８】 前記リンカーが、４〜１０の間のアミノ
    酸から成る、請求項７に記載の核酸。
  9. 【請求項９】 前記リンカーが、アラニン残基から成
    る、請求項６に記載の核酸。
  10. 【請求項１０】 前記捕獲タグ配列、前記検出タグ配
    列、又はそれらの組合せ、がオリゴペプチド・リンカー
    を通じて、前記着目のポリペプチドに連結されている、
    請求項１に記載の核酸。
  11. 【請求項１１】 前記着目のポリペプチド配列がアンジ
    オスタチンである、請求項１に記載の核酸。
  12. 【請求項１２】 着目のポリペプチド配列、捕獲タグ配
    列、及び検出タグ配列を含む融合タンパク質であって、
    その捕獲タグ配列と検出タグ配列が、それぞれ、その着
    目のポリペプチド配列に対して異種である、前記融合タ
    ンパク質。
  13. 【請求項１３】 前記捕獲タグ配列又は前記検出タグ配
    列が、エピトープ・タグである、請求項１２に記載の融
    合タンパク質。
  14. 【請求項１４】 前記捕獲タグ配列が、ＤＹＫＤＤＤＤ
    Ｋである、請求項１３に記載の融合タンパク質。
  15. 【請求項１５】 前記検出タグ配列が、ＹＰＹＤＶＰＤ
    ＹＡである、請求項１３に記載の融合タンパク質。
  16. 【請求項１６】 前記捕獲タグ配列と前記検出タグ配列
    が、前記着目のポリペプチドのＣ末端に位置する、請求
    項１２に記載の融合タンパク質。
  17. 【請求項１７】 前記捕獲タグ配列と前記検出タグ配列
    が、オリゴペプチドリンカーを通じて互いに連結されて
    いる、請求項１２に記載の融合タンパク質。
  18. 【請求項１８】 前記リンカーが、１５未満のアミノ酸
    残基から成る、請求項１７に記載の融合タンパク質。
  19. 【請求項１９】 前記リンカーが４〜１０の間のアミノ
    酸から成る、請求項１８に記載の融合タンパク質。
  20. 【請求項２０】 前記リンカーがアラニン残基を含む、
    請求項１７に記載の融合タンパク質。
  21. 【請求項２１】 前記捕獲タグ配列、前記検出タグ配
    列、又はそれらの組合せが、オリゴペプチド・リンカー
    を通じて、前記着目のポリペプチド配列に連結されてい
    る、請求項１２に記載の融合タンパク質。
  22. 【請求項２２】 前記着目のポリペプチド配列がアンジ
    オスタチンである、請求項１２に記載の融合タンパク
    質。
  23. 【請求項２３】 動物中のタンパク質の存在を検出する
    方法であって、 着目のポリペプチド配列、捕獲タグ配列、及び検出タグ
    配列をもつタンパク質をコードする核酸分子を含む動物
    を用意し、ここで、上記捕獲タグ配列と上記検出タグ配
    列は、それぞれ、着目のポリペプチド配列に対して異種
    であり；上記捕獲配列に特異的に結合する化合物を用い
    て上記トランスジェニック動物からのサンプル中の上記
    融合タンパク質を捕獲し；そして上記検出タグ配列に特
    異的に結合する第２化合物を用いて上記サンプル中の融
    合タンパク質を検出する、工程を含む、前記検出方法。
  24. 【請求項２４】 前記捕獲工程が、前記捕獲タグ配列に
    特異的に結合する抗体と、前記サンプルとを接触させる
    ことにより行われる、請求項２３に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記捕獲タグ配列がＤＹＫＤＤＤＤＫ
    である、請求項２４に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記検出工程が、前記検出タグ配列に
    特異的に結合する抗体と、前記サンプルとを接触させる
    ことにより行われる、請求項２３に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 前記検出タグ配列がＹＰＹＤＶＰＤＹ
    Ａである、請求項２６に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 前記捕獲タグ配列及び前記検出タグ配
    列が、前記着目のポリペプチド配列のＣ末端に位置す
    る、請求項２３に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 前記捕獲タグ配列及び前記検出タグ配
    列が、オリゴペプチド・リンカーを通じて互いに連結さ
    れている、請求項２３に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 前記リンカーが、１５未満のアミノ酸
    残基から成る、請求項２９に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 前記リンカーが、４〜１０の間のアミ
    ノ酸から成る、請求項３０に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 前記リンカーが、アラニン残基から成
    る、請求項２９に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 前記捕獲タグ配列、前記検出タグ配
    列、又はそれらの組合せが、オリゴペプチド・リンカー
    を通じて前記着目のポリペプチド配列に連結されてい
    る、請求項２３に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 前記着目のポリペプチド配列がアンジ
    オスタチンである、請求項２３に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 前記サンプルが組織サンプルである、
    請求項２３に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 前記組織サンプルが肺組織である、請
    求項３５に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 前記トランスジェニック動物がマウス
    である、請求項２３に記載の方法。
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