JPH11322916A

JPH11322916A - ビオチン残基を片末端に有するヘテロテレケリツクポリマー

Info

Publication number: JPH11322916A
Application number: JP14204498A
Authority: JP
Inventors: Kazunori Kataoka; 一則片岡; Yukio Nagasaki; 幸夫長崎; Chikau Yamamoto; 誓山本; S Kwon Glenn; グレン・エス・クウオン
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1998-05-11
Filing date: 1998-05-11
Publication date: 1999-11-26

Abstract

(57)【要約】【課題】ビオチンを片末端に有するヘテロテレケリッ
クポリマーの提供。【解決手段】一般式（Ｉ）【化１】式中、Ａはアルキレンオキシ基であり、Ｂはビオチン残
基を含有する基であり、ｎは２〜２０，０００の整数で
あるヘテロテレケリックポリマー、並びに式（Ｉ）のα
−末端アルデヒド基を用いて式（Ｉ）のポリマーを酵素
に共有結合させた修飾酵素。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヘテロテレケリッ
クポリマー、具体的には片末端（α−末端）にアルデヒ
ド基を有し、そしてもう一方の末端（ω−末端）にビオ
チン残基を有するヘテロテレケリックポリオキシエチレ
ン、ならびにそれらと酵素のコンジュゲートである修飾
酵素に関する。

【０００２】

【発明の背景】酵素−抗体のコンジュゲートを生体内に
投与し、かかるコンジュゲートを標的とする抗原部位に
集積させ、一方、用いた酵素により活性化されるプロド
ラッグを投与し、抗原部位でプロドラッグを活性型のド
ラッグとして、標的部位で選択的に薬効を生じさせる、
薬物療法が提案されている。かような薬物療法は、所
謂、抗体指示性酵素プロドラッグ療法（antibody−dire
cted enzyme prodrug therapy）（以下、ＡＤＥＰＴ
ともいう）と称されており、毒性の高い薬物を毒性の低
いプロドラッグとして全身的に投与するが、予め標的部
位に集積せしめた酵素活性を利用して、該標的部位にお
いて、本来的な薬物の薬効を選択的に発揮させようとす
る、極めて興味深い療法である。

【０００３】しかしながら、ＡＤＥＰＴを実施する上
で、（ａ）酵素−抗体コンジュゲートの作成には、極め
て精緻な技術が必要であり、かつ相当な経費を要する、
（ｂ）酵素−抗体コンジュゲート自体が免疫原性（また
は抗原性）を示すことにより、使用薬物に由来するもの
以外の新たな副作用を惹起する可能性がある、（ｃ）酵
素を結合させた抗体が立体障害等により、標的部位に充
分集積せず、かなりの量が血流中などの標的部位以外に
存在し、結果として、使用薬物による全身的な副作用が
生じる可能性がある、などの問題点がある。

【０００４】本発明者らは、かような問題点を解決する
には、（ｉ）簡易な酵素キャリアの調製、（ｉｉ）抗原
性の低減、（ｉｉｉ）特定の標的部位、例えば腫瘍部位
への酵素の集積性を向上させる、手段の開発を目差して
きた。

【０００５】上記手段の開発を行うに際し、本発明者ら
は、酵素をポリエチレングリコール（またはポリオキシ
エチレン）で修飾すると、酵素の抗原性を低下せしめる
可能性があることに着目した（例えば、稲田、「続タン
パク質ハイブリッド」共立出版、ｐ．２−４参照）。ま
た、一般的に、腫瘍細胞の細胞膜は、通常細胞のそれに
比べて、物質の透過性が増し、ポリマーの取り込み、細
胞内滞留が長くなることも知られている（前田ら、例え
ば、Bioconju．Chem., ３、（１９９２）１２８〜１３
９参照）。

【０００６】他方、本発明者らの一部は、多機能性の生
体親和性のポリマーとして、主鎖中にポリオキシエチレ
ンセグメントを有し、分子の両末端に異種官能基を有す
るヘテロテレケリックポリマーの開発を行ってきた（例
えば、国際公開第９７／６２０２号等参照）。

【０００７】

【発明の構成】本発明者らは、かようなヘテロテレケリ
ックポリマーの片末端官能基を介して、生体内の標的部
位以外（例えば、血流中）に存在するポリマーを選択的
に除去しうるように修飾し、そしてもう一つの末端の官
能基を介して酵素を共有結合せしめた酵素−合成ポリマ
ーコンジュゲートは、生体内に投与後、標的部位へ集積
し、また、血流中に存在する該コンジュゲートは、選択
的に除去しうるように修飾した官能基を利用して生体外
へ排泄除去しうるものと推察した。

【０００８】以上の推察に基づき、ポリエチレングリコ
ール（以下、ＰＥＧともいう）セグメントの片末端（α
−末端）に酵素（タンパク質）と容易に共有結合を形成
しうるアルデヒド基を有し、もう一方の末端にビオチン
残基を有するポリマーは、上記酵素−抗体コンジュゲー
トに随伴する問題点を有意に解消しうる、酵素−ＰＥＧ
コンジュゲートを容易に提供できることを見い出した。
酵素−ＰＥＧ−ビオチン残基からなるコンジュゲートが
血流中に存在する場合、別にアビジンを投与すると血流
中で前記コンジュゲートのビオチンとアビジンとの複合
体を形成し、容易に生体外へ排泄させるであろう。ま
た、アルデヒド基−ＰＥＧ−ビオチン残基からなるヘテ
ロテレケリックポリマーは、生体成分の診断用ツール等
としても、有用であろう。

【０００９】したがって、本発明によれば、一般式
（Ｉ）

【００１０】

【化５】

【００１１】（式中、Ａは、アルキレンオキシ基であ
り、Ｂは連結基を介することができるビオチン残基であ
り、そしてｎは２〜２０，０００、好ましくは５０〜２
０,０００の整数である）で示されるヘテロテレケリッ
クポリマーが提供される。

【００１２】また、かかるポリマーと酵素とのコンジュ
ゲートであって、具体的には、一般式（ＩＩ）

【００１３】

【化６】

【００１４】（式中、Ｅｎｚは、酵素の残基を表わし、
Ｙは酵素中のリジン残基のε位のアミノ基を介して形成
される少なくとも１個の共有結合であり、ｑは少なくと
も１以上であり、かつ最大、酵素残基中に含まれるリジ
ン残基の数であり、そしてＡ、Ｂ及びｎは一般式（Ｉ）
について定義したとおりである）で表わされる修飾酵素
も提供される。

【００１５】これらの一般式（Ｉ）及び一般式（ＩＩ）
で示されるヘテロテレケリックポリマーは、上述のとお
り、医療分野で有用である。

【００１６】

【発明の具体的な態様】本明細書にいう、ヘテロテレケ
リック（hetero−telechelic）の語は、ポリマーの両分
子末端に異種の官能基が存在していることを意味する。
したがって、本発明に従う、一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）
に示されるいずれのポリマーまたは修飾酵素も、ヘテロ
テレケリックポリマーの範疇に入る。

【００１７】一般式（Ｉ）のポリマーにおける、式

【００１８】

【化７】

【００１９】で表される部位は、例えば、本発明者らの
提供した国際公開第９７／６２０２号に記載のブロック
ポリマーを製造するための、前駆体たるリビングＰＥＧ
の製造方法に準じて製造することができるポリマーであ
る（該国際公開の記載事項は、ここに引用することによ
り、本明細書の内容となる）。具体的には、Ａ、式

【００２０】

【化８】

【００２１】（ここで、ｍは２〜６の正数である）で表
わされる、したがって、Ａの具体的な基としては、

【００２２】

【化９】

【００２３】である。また、一般式（Ｉ）におけるＢの
定義である、連結基を介することのできるビオチン残基
とは、ビオチン−アビジンの複合体を形成しうる限り、
如何なる連結基を有していてもよいが、好ましくは、式

【００２４】

【化１０】

【００２５】で表わされ、上式中のｐは０（Ｂ基は、連
結基を有さないビオチン残基に相当する）、或いは１
（連結基を有する場合に相当する）であって、ｐが１の
場合のＬは、Ｃ₂〜₆アルキレンアミノ基、Ｃ₂〜₆アルキ
レンオキシ基または

【００２６】

【化１１】

【００２７】（先導するカルボニル基と一体となって、
Ｂ基がビオチンに由来する残基に相当する）の基であ
る。ｐが１であり、ＬがＣ₂〜₆アルキレンアミノ及びＣ
₂〜₆アルキレンオキシを表わす、Ｂ基は、ビオチンと対
応するラクタム及びラクトンの反応により誘導できる化
合物に由来する。

【００２８】かような一般式（Ｉ）で示されるヘテロテ
レケリックポリマーは、通常、まず最初に、式

【００２９】

【化１２】

【００３０】のアルデヒド基を、例えばアセタール化等
により保護した化合物を、リビング重合触媒とともに重
合開始剤として用い、エチレオキシドをアニオン重合さ
せるそれ自体既知の重合法により、リビングポリマーを
製造する。次いで、この反応液中に、例えば式

【００３１】

【化１３】

【００３２】（式中、Ｌは上記定義のとおりである）で
示されるビオチン誘導体、また、必要によりそれらの活
性エステル、活性イミド、を加えて、上記重合反応を停
止させることにより、α−末端のアルデヒド基が保護さ
れた一般式（Ｉ）のポリマーを製造する。なお、この停
止反応は、典型的には、室温下で、５０時間まで反応液
を撹拌することにより行うことができる。こうして得ら
れたα−末端のアルデヒド基が保護されたポリマーの保
護基（通常、アセタール基）は、加水分解反応に供する
ことにより、一般式（Ｉ）のポリマーへ転化することが
できる。

【００３３】本発明では、上記式（Ｉ）のポリマーのα
−末端アルデヒド基を用いて、酵素（具体的には酵素中
のリジン残基のε位のアミノ基とのシッフ塩基の形成を
通して）に結合させ、さらにシッフ塩基をアミノ基に還
元することにより、一般式（ＩＩ）で示される修飾酵素
を提供しうる。

【００３４】したがって、一般式（ＩＩ）におけるＥｎ
ｚ−は、酵素中の１個以上のリジン残基のε位アミノ基
に由来する結合手を有する酵素残基であり、Ｙは前記ε
位のアミノ基と一般式（Ｉ）のα−末端アルデヒド基と
により形成される共有結合を表わす。また、ｑは、少な
くとも１の整数を表わし、また酵素活性に悪影響を及ぼ
さない限り、最大、使用される酵素分子中に存在するリ
ジン残基の数まででありうるが、通常、１〜１０個程度
であることが好ましい。酵素は、本発明の目的に沿う限
り、複数のサブユニットからなるものであってもよい。
酵素としては、通常、薬物のエステル化、アミド化、イ
ミド化、リン酸化等によって、薬物本来の活性（毒性も
包含する）が低下したプロドラッグを、本来の薬物に変
換しうる作用を有するものが意図されているが、それら
に限定されない。なお、上記のような変換活性を有する
酵素はエステラーゼ、アミダーゼ、ホスファターゼと称
されている既知の如何なる酵素であってもよい。またこ
れらの酵素の起源も、動物、植物または微生物のいずれ
に属するものであってもよい。

【００３５】こうして、提供される一般式（ＩＩ）で示
される修飾酵素は、実質的に未修飾酵素の有する酵素活
性をほとんど低減することな保持している。したがっ
て、これらの修飾酵素は、ビオチン残基の存在が悪影響
を及ぼさない限り、未修飾酵素の使用可能な条件を、場
合によって拡張する利点もある。

【００３６】

【実施例】以下、具体例を挙げて、本発明をさらに詳細
に説明するが、これらの例は、あくまで例示にすぎない
ことを、理解されたい。

【００３７】実施例１：アセタール−ＰＥＯ−ビオチン
の製造

【００３８】

【化１４】

【００３９】アルゴン下、受器中、室温において、開始
剤３，３−ジエトキシ−１−プロパノール０．５ｍｍｏ
ｌ（０．０８ｍｌ）を溶媒ＴＨＦ７．６ｍｌにマイク
ロシリンジで加え、Ｋ−ナフタレン０．５ｍｍｏｌ
（０．２８６ｍｏｌ／ｌ−ＴＨＦ溶液、１．７５ｍｌ）
を加えてメタル化を施した後、エチレンオキシド２．
０ｍｌを加えて水冷下で２日間撹拌し、アニオン開環重
合を行った。この後、停止剤としてＮ−スクシンイミジ
ル−Ｄ−ビオチンのＤＭＳＯ溶液（０．０６５ｍｏｌ／
ｌ）を２倍モル量（１５．４ｍｌ）加えて２日間停止反
応を行った。この後クロロホルム抽出、エーテル再沈、
吸引濾過、減圧乾燥、ベンゼン凍結乾燥により精製を行
った。この生成物の収率は８８．０％であった。

【００４０】ＴＯＦ−ＭＳ（飛行時間型質量分析計）に
よる測定により、このポリマーは一峰性であり、その分
子量は約２６００であった。

【００４１】また、これらのピークの測定値と計算値を
比較した結果、このポリマーはポリエチレンオキシドを
主鎖に有し、α−末端にアセタール基、ω−末端にビオ
チンを有するヘテロテレケリックポリマーであることが
確認された。

【００４２】さらに、得られたポリマーのＤＭＳＯ中で
のプロトン核磁気共鳴スペクトルより、このポリマーは
ポリエチレンオキシドを主鎖に有し、α−末端にアセタ
ール基、ω−末端にビオチンを有するヘテロテレケリッ
クポリマーであることが確認された（図１参照）。

【００４３】実施例２：ＯＣＨ−ＰＥＯ−ビオチンの製
造（脱アセタール化）受器中において、アセタール−ＰＥＯ−ビオチンポリマ
ー０．２ｇを酢酸４ｍｌ＋氷０．４ｍｌの溶液に溶か
し、恒温槽（２０℃）中において５時間、アセタール基
の脱離反応（脱保護）を施した。この後クロロホルム抽
出、エーテル再沈、吸引濾過、減圧乾燥、ベンゼン凍結
乾燥により精製を行った。この生成物の収率は７９．６
％であった。

【００４４】ＴＯＦ−ＭＳ（飛行時間型質量分析計）に
よる測定により、このポリマーは一峰性であり、その分
子量は２５００であった。またピークの測定値と計算値
を比較した結果、このポリマーはポリエチレンオキシド
を主鎖に有し、α−末端にアルデヒド基、ω−末端にビ
オチンを有するヘテロテレケリックポリマーであること
が確認された。

【００４５】得られたポリマーのＤＭＳＯ中でのプロト
ン核磁気共鳴スペクトルより、このポリマーはポリエチ
レンオキシドを主鎖に有し、α−末端にアルデヒド基、
ω−末端にビオチンを有するヘテロテレケリックポリマ
ーであることが確認された。実施例３：酵素−ＰＥＯ−ビオチンの製造反応容器中において、ｐＨ７．２に調製したＨＥＰＥＳ
緩衝溶液２ｍｌ（０．１Ｍ）にウシのカルボキシペプチ
ダーゼＡのトルエン溶液０．５２７ｍｌ（含タンパク質
１０ｍｇ）およびＣＨＯ−ＰＥＯ−ビオチンポリマー２
６．１ｍｇを加えて恒温槽中（２０℃）で３時間撹拌し
た。その後この混合溶液に還元剤ＮａＣＮＢＨ３２．
１ｍｇを加え、２日間還元を行った。純水に対する透析
（分画分子量１２，０００〜１４，０００、２、４、
８、２４時間後に水交換）を２日間行うことで精製を行
った。

【００４６】この反応溶液に対してＴＯＦ−ＭＳ（飛行
時間型質量分析計）による測定を行ったところ、ポリマ
ー修飾前のカルボキシペプチダーゼＡに由来するピーク
に対して、より高質量において、カルボキシペプチダー
ゼＡとＣＨＯ−ＰＥＯ−ビオチンが結合したものと思わ
れるピークを確認した（図２、図３）。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は実施例１で得られた、アセタール−ＥＰ
Ｏ−アビジンのプロトン核磁気共鳴スペクトラムであ
る。

【図２】図２はカルボキシペプチダーゼＡのＴＯＦ−Ｍ
Ｓによる測定結果である。

【図３】図３は実施例３で得られた酵素−ＰＥＯ−ビオ
チンのＴＯＦ−ＭＳによる測定結果である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者グレン・エス・クウオンアメリカ合衆国ウイスコンシン州53719マデイソン・テインバーレイクトレイルナンバー310 7409

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】一般式（Ｉ）【化１】（式中、Ａは、アルキレンオキシ基であり、Ｂは連結基
を介することができるビオチン残基であり、そしてｎは
２〜２０，０００の整数である）で示されるヘテロテレ
ケリックポリマー。
【請求項２】Ａが、式【化２】（ここで、ｍは２〜６で示されるアルキレンオキシ基で
あり、そしてＢが、式【化３】（式中、ｐは０または１であり、そしてＬはＣ₂〜₆アル
キレンアミノ基、Ｃ₂〜₆アルキレンオキシ基、または−
ＣＨ(ＮＨ₂)(ＣＨ₂)₄ＮＨ−基である）で表わされる基
である、請求項１記載のヘテロテレケリックポリマー。
【請求項３】一般式（ＩＩ）【化４】（式中、Ｅｎｚは、酵素の残基を表わし、Ｙは酵素中の
リジン残基のε位のアミノ基を介して形成される少なく
とも１個の共有結合であり、ｑは少なくとも１以上であ
り、かつ最大、酵素残基中に含まれるリジン残基の数で
あり、そしてＡ、Ｂ及びｎは一般式（Ｉ）について定義
したとおりである）で表わされる修飾酵素。