JPH11326327A

JPH11326327A - 粒子を使用する被検物質の測定方法及び測定器具

Info

Publication number: JPH11326327A
Application number: JP10838099A
Authority: JP
Inventors: Takeshi Amada; 武志天田; Masahiro Naito; 正宏内藤
Original assignee: Shino Test Corp
Current assignee: Shino Test Corp
Priority date: 1998-03-11
Filing date: 1999-03-11
Publication date: 1999-11-26

Abstract

(57)【要約】【目的】抗原抗体反応等の特異的結合反応を利用して試
料中の被検物質を目視又は機器を用いて測定する際に、
試料中の被検物質の濃度の大小にかかわらず短時間に被
検物質の存在の有無の判定を行うことが可能であり、し
かもその判定の信頼性が高い被検物質の測定方法及び測
定器具を提供する。【構成】試料中の被検物質の測定方法であって、１）試
料中の被検物質に対する特異的結合物質が固定されて該
特異的結合物質により被覆された判定部、及び被検物質
に対する特異的結合物質であって該判定部に固定された
特異的結合物質と同一又は異なる特異的結合物質が固定
された粒子を保持した粒子保持部、を有する担体の該粒
子保持部に試料を接触させる工程、２）前記粒子を前
記判定部に沿って移動させる工程、を含んでなり、前記
判定部における粒子の分布状態から被検物質の有無を判
定することを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、被検物質に対する
特異的結合物質を固定した粒子を用いて試料中の被検物
質を測定する方法及び測定器具に関し、特に試料中に含
まれる微量の被検物質までも妨害物質の影響を受けずに
短時間且つ簡便に測定を行うことが可能な被検物質の測
定方法及び測定器具に関する。本発明は、臨床検査分野
等の生命科学分野において有用である。

【０００２】

【従来の技術】抗原と抗体、糖とレクチン、ヌクレオチ
ド鎖とそれに相補的なヌクレオチド鎖、リガンドとレセ
プター等の特異的な親和性を有する物質間の反応を利用
した試料中に含まれる微量の被検物質の測定方法又は測
定器具は種々のものが知られている。

【０００３】中でも、抗原と抗体の間の抗原抗体反応
（免疫反応）を利用した免疫学的測定方法は広く実施さ
れている。この免疫学的測定方法のうち間接凝集反応測
定法は簡易かつ安価な方法であることから汎用されてい
る。

【０００４】この間接凝集反応測定法は、被検物質に対
する抗体（被検物質が抗体の場合は抗原を使用すること
も可能）を結合した粒子（ラテックス粒子若しくはゼラ
チン粒子などの高分子粒子又は赤血球等）と被検物質を
含むと推定される試料を、マイクロタイタープレート等
の底面がＵ字状又はＶ字状になった測定容器内で混合
し、反応させて、生じた被検物質を介した粒子間の凝集
像を観察することにより、試料中の被検物質の存在の有
無を判定するものである。

【０００５】図１０は、この間接凝集反応測定法により
試料中の被検物質の測定を行なった場合の凝集像を示し
たものである。試料中に被検物質が存在しない（陰性）
場合、抗体（又は抗原）を結合した粒子は凝集を起こさ
ないので重力によりそのまま沈降し、Ｕ字状又はＶ字状
等の測定容器の内壁面に沿って転がり落ちて（滑り落ち
て）測定容器の底面中央部に集まる。従って、陰性の場
合、測定容器の上方から見ると、測定容器の底面中央部
に粒子が収束した像が観察される（図１０のＡ）。一
方、試料中に被検物質が存在する（陽性）場合、抗体
（又は抗原）が結合した粒子は被検物質を介して三次元
的な凝集を起こして凝集塊を生成する。この凝集塊は、
凝集を起こしていない粒子に比べると測定容器の内壁面
上を転がり難く（滑り落ち難く）、転がり速度（滑り落
ち速度）が小さいので、測定容器の内壁面に広がった状
態で止まる。従って、陽性の場合、測定容器の上方から
見ると、粒子が測定容器底面に広がった状態、即ち「ボ
タン」状の凝集像が観察でき（図１０のＢ）、試料中に
被検物質が存在することが確認できる。

【０００６】しかしながら、この問接凝集反応測定法
は、試料中の被検物質の存在の有無、つまり陽性又は陰
性かを測定容器底面の粒子による円形の像の大小によっ
て判定するものである。したがって、被検物質の濃度が
低い試料の場合、測定容器底面中央部には被検物質を介
して凝集した粒子と、被検物質とは結合していない粒子
の両方が混在していて、且つ凝集像の円が小さいので、
陰性の場合との判別が困難であった。そして、この被検
物質の濃度が低い試料の場合の判定の困難さゆえ、低濃
度の被検物質を測定することができず、また時間をかけ
て凝集像を十分形成させてから判定しようとするため測
定に要する時間が長くなり、通常測定時間は１時間以上
であった。

【０００７】また、間接凝集反応測定法では、被検物質
以外の試料中の成分を介して、抗体（又は抗原）を結合
した粒子が凝集したり、或いは抗体（又は抗原）を結合
した粒子が測定容器の内壁面に結合して、試料中に被検
物質が存在しない（陰性）にもかかわらずあたかも被検
物質が存在する（陽性）ような凝集像を示す場合があっ
た（非特異的凝集反応）。このように陰性の試料を陽性
と誤って判定する可能性があるということは、臨床検査
による疾病の診断においては重大な問題となっていた。

【０００８】これに対し、特開昭６４−６９９５４号公
報には、検体試料中の被検物質である抗原又は抗体に対
応する抗体又は抗原を内壁に固定させた測定容器に検体
試料を加え、同時に又は次いでこの検体試料を洗浄する
ことなく測定容器に固定させたものと同一の抗体又は抗
原或いは特異的結合の類縁体を固定させた不溶性担体粒
子を測定容器に加え、発現する凝集反応の有無により検
体試料中の被検物質である抗原又は抗体の有無を判定す
る免疫学的測定方法が開示されている。この測定方法に
おいて検体試料中に被検物質である抗原（又は抗体）が
存在しない（陰性）場合の測定容器内の状態を上方から
見ると、図１０のＡに示した凝集像と同様の像が観察さ
れる。また、検体試料中に被検物質である抗原（又は抗
体）が存在する（陽性）場合に測定容器内の状態を上方
から見ると、図１０のＢに示した凝集像と同様の像が観
察される。

【０００９】上記特開昭６４−６９９５４号公報に記載
の測定方法は、低濃度の被検物質を測定することがで
き、地帯現象を抑制でき、かつ短時間で明瞭な凝集像が
得られる方法であるが、試料中の被検物質の存在の有無
を測定容器底面の粒子による円形の像の大小によって判
定するものであるので、被検物質の濃度が著しく低い試
料の場合には陰性の場合との判別が困難であるとの問題
は避け得ないものであった。

【００１０】また、特開平２−１２４４６４号公報に
は、被測定物質（被検物質）に特異的に結合するか又は
これと競合する物質（抗体又は抗原等）を磁性粒子に固
定化した磁性マーカー粒子とサンプル溶液（試料）とを
混合し、この反応溶液に対し測定容器の所定の壁面領域
の外側に配置した磁石を作用させ、これにより所定の壁
面領域に集められた磁性マーカー粒子の分布状態に基づ
いてサンプル中の被測定物質を測定する免疫学的測定方
法が開示されている。この測定方法においてサンプル中
に被測定物質が存在しない（陰性）場合に測定容器内の
状態を上方から見ると、図１０のＡに示した凝集像と同
様の像が観察され、サンプル中に被測定物質が存在する
（陽性）場合に測定容器内の状態を上方から見ると図１
０のＢに示した凝集像と同様の像が観察される。

【００１１】この特開平２−１２４４６４号公報に記載
の測定方法によれば、磁性粒子を磁石により測定容器底
面に引き寄せて磁性粒子の沈降速度を増大させることに
より、測定容器底面の凝集像の形成を短時間で行わせ、
判定に要する時間を短縮することができる。しかし、や
はり試料中の被検物質の存在の有無を測定容器底面の粒
子による円形の像の大小によって判定するものであるの
で、被検物質の濃度が低い試料の場合には陰性の場合と
の判別が困難であるとの点では変わりのないものであっ
た。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、抗原抗体反応等の特異的結合反応を利用して試料中
の被検物質を目視又は機器を用いて測定する際に、試料
中の被検物質の濃度の大小にかかわらず短時間に被検物
質の存在の有無の判定を行うことが可能であり、しかも
その判定の信頼性が高い測定方法並びに該方法に使用す
る測定器具を提供することである。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明は、試料中の被検
物質の測定方法であって、１）試料中の被検物質に対す
る特異的結合物質が固定されて該特異的結合物質により
被覆された判定部、及び被検物質に対する特異的結合物
質であって該判定部に固定された特異的結合物質と同一
又は異なる特異的結合物質が固定された粒子を保持した
粒子保持部を有する担体の該粒子保持部に試料を接触さ
せる工程、２）前記粒子を前記判定部に沿って移動させ
る工程を含んでなり、前記判定部における粒子の分布状
態から被検物質の有無を判定することを特徴とする測定
方法である。また、本発明は、試料中の被検物質に対す
る特異的結合物質が固定されて該特異的結合物質により
被覆された判定部と、被検物質に対する特異的結合物質
であって前記判定部に固定された特異的結合物質と同一
又は異なる特異的結合物質が固定された粒子を保持した
粒子保持部とを有する、試料中の被検物質の測定器具で
ある。

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明において測定を行う被検物
質としては、タンパク質、糖質、脂質、核酸のような有
機物質、無機物質等の生体関連物質であればいずれのも
のでもよい。具体的には、ＨＢｓ抗原、抗ＨＢｓ抗体、
ＨＢｅ抗原、抗ＨＢｅ抗体、抗ＨＢｃ抗体、抗ＨＣＶ抗
体、抗ＨＩＶ抗体、抗ＡＴＬＶ抗体などのウイルス関連
の抗原又は抗体；大腸菌Ｏ１５７抗原、抗トレポネーマ
・パリダム（ＴＰ）抗体、抗マイコプラズマ抗体、抗ス
トレプトリジンＯ抗体（ＡＳＯ）などの細菌関連の抗原
又は抗体；免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、免疫グロブリ
ンＡ（ＩｇＡ）、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）、若しく
は免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）などの免疫グロブリン；
Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、α１−酸性糖タンパク
質、ハプトグロビン、補体Ｃ３、補体Ｃ４、リウマトイ
ド因子などの炎症マーカー；α−フェトプロテイン、Ｃ
ＥＡ、ＣＡ１９−９などの腫瘍マーカー；ヒト胎盤絨毛
性ゴナドトロピンなどのホルモン；アレルゲン、アレル
ゲン特異ＩｇＥ抗体などのアレルギー関連の抗原又は抗
体；抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）などの血液凝固
系関連物質；フィブリン体分解物（ＦＤＰ）、Ｄダイマ
ーなどの線溶系関連物質；ＡＢＯ式血液型抗体、不規則
抗体などの血液型関連の抗原又は抗体；ウイルスのＤＮ
Ａ又はＲＮＡ；細菌のＤＮＡ又はＲＮＡ；ヒトなどの動
物若しくは植物のＤＮＡ又はＲＮＡ；リポタンパク質
（ａ）、フェリチンなどの他の疾病に関連した物質又は
薬物等を例示することができる。

【００１５】本発明において、試料とは、前記の被検物
質が存在する可能性があり、且つその被検物質の存在の
有無の確認又は場合によっては定量を行おうとする液状
のものをいう。例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血
漿、尿、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水、羊水などの
体液；ヒト若しくは動物の脳などの臓器、毛髪、皮膚、
爪、筋肉、又は神経組織などの抽出液；ヒト又は動物の
糞便の抽出液又は懸濁液；細胞或いは菌体の抽出液；植
物の抽出液等が挙げられる。

【００１６】本発明において、被検物質に対する特異的
結合物質（以下、単に特異的結合物質という。）とは被
検物質に対し親和性を有する物質をいい、被検物質との
特異的な相互作用により該被検物質に非共有結合的に安
定に結合する物質をいう。例えば、特異的結合物質は、
被検物質が抗原の場合にはその抗体であり、被検物質が
抗体の場合にはその抗原又はその抗体に対する抗体であ
り、被検物質がヌクレオチド鎖の場合にはそれと相補的
なヌクレオチド鎖である。ここで、抗体とは、抗体から
作られる断片、例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）_２等も
含まれる。また、被検物質がリガンドの場合にはそのレ
セプターである。粒子に固定する特異的結合物質と、担
体に固定する特異的結合物質は、被検物質を介しての結
合が可能であれば、それぞれ同一でも異なってもよい。

【００１７】本発明において用いられる粒子としては、
一般に間接凝集反応に用いられる粒子でよい。例えば、
リポソーム、ラテックス粒子、ゼラチン粒子、ポリアク
リルアミド粒子、マイクロカプセル、エマルジョンなど
の有機高分子粒子、ガラスビーズ、シリカビーズ、ベン
トナイトなどの無機高分子粒子、他の人工粒子、および
赤血球等を挙げることができる。また、粒子として磁性
粒子を用いることもできる。この場合、磁性粒子とは、
少なくとも外部から磁石を作用させている間は磁化する
粒子であればよい。この磁性粒子としては、例えば、
鉄、コバルト、ニッケルなどの強磁性金属、これらの強
磁性金属を含む合金、非磁性体中に強磁性金属又は強磁
性金属を含む合金を含有するもの、強磁性金属中又は強
磁性金属を含む合金中に非磁性体を含有するものなどの
強磁性体を単独で粒子状に成形した粒子、強磁性体を核
としてその表面をポリスチレン、シリカゲル、ゼラチ
ン、ポリアクリルアミドなどの高分子物質で被覆した粒
子、ポリスチレン、シリカゲル、ゼラチン、アクリルア
ミドなどの高分子物質の粒子を核として強磁性体を被覆
した粒子、赤血球、リポソーム又はマイクロカプセルな
どの閉じた袋状の物質に強磁性体を封入した粒子等を挙
げることができる。なお、この磁性粒子は、外部から磁
石を作用させている間は磁化し、外部からの磁石の遮断
により速やかに減磁する性質を持つものであることが特
に好ましく、そのような磁性粒子としては、例えば、強
磁性体である酸化鉄（ＩＩＩ）（Ｆｅ２０３）を粒子内
に分散させた磁性粒子である、ＤｙｎａｂｅａｄｓＭ
−４５０ｕｎｃｏａｔｅｄ（商品名、ダイナル社製）が
挙げられる。

【００１８】更に、粒子としては、色素を被覆するか又
は色素を粒子中に分散若しくは封入させることにより着
色したものを使用してもよい。

【００１９】粒子の粒子径は、好ましくは０．０１〜１
００μｍであり、特に好ましくは０．５〜１０μｍであ
る。また、粒子の比重は、分散媒中で沈降する比重であ
れば良く、例えば比重が１〜１０のものが好ましい。

【００２０】本発明においては、特異的結合物質を固定
した粒子を用いるが、特異的結合物質を粒子に固定する
には、特異的結合物質を前記の粒子の表面に疎水結合、
親水吸着などの物理的吸着法、共有結合などの化学的結
合法又はこれらの方法の併用等により行うことができ
る。

【００２１】特異的結合物質の粒子への固定を物理的吸
着法により行う場合は、公知の方法に従って、該特異的
結合物質と粒子とを緩衝液等の溶液中で混合し接触させ
ることにより行うことができる。例えば、特異的結合物
質と粒子を緩衝液等の溶液中で混合し攪拌することによ
り接触させ、約２℃〜約４０℃で約１０分〜約１日間吸
着反応を行わせた後、得られた粒子を緩衝液等で洗浄す
ればよい。

【００２２】また、特異的結合物質の粒子への固定を架
橋試薬による化学的結合法によって行う場合は、日本臨
床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号臨床検
査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理
刊行会，１９８３年、日本生化学会編「新生化学実験講
座１タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年等
に記載の公知の方法に従い、特異的結合物質と粒子をグ
ルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル、
マレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、特
異的結合物質と粒子のそれぞれのアミノ基、カルボキシ
ル基、チオール基、アルデヒド基、水酸基等の官能基を
架橋試薬と反応させることにより固定することができ
る。例えば、粒子を含む緩衝液等にグルタルアルデヒ
ド、カルボジイミド、イミドエステル、マレイミド等の
二価性の架橋試薬を加え、攪拌し反応させる。次にこれ
に特異的結合物質を加え、攪拌して反応させる。場合に
よっては、その後これに透析、ゲルろ過などの処理によ
り架橋試薬を除くか若しくは架橋反応の反応停止剤を添
加すること等により反応を停止させる。そして、得られ
た粒子を緩衝液等で洗浄すればよい。

【００２３】また、特異的結合物質の粒子への固定量を
変更することにより、試料中の被検物質の濃度の高低に
応じて容易に感度を変更することができる。例えば、粒
子に特異的結合物質を固定する際に、高濃度の特異的結
合物質を用いれば固定量が多くなって感度を高めること
ができる。

【００２４】必要があれば非特異的反応を抑制するた
め、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、カゼイ
ン又はその塩などの各種タンパク質、脱脂粉乳等を特異
的結合物質を固定した粒子に接触させること等の公知の
方法により、該粒子をマスキングしてもよい。例えば、
マスキングは特異的結合物質を固定した粒子をウシ血清
アルブミン、ヒト血清アルブミン、カゼイン又はその塩
などの各種タンパク質などを含む緩衝液等に加え静置
し、該粒子の表面を各種タンパク質等でコーティングす
ることにより行うことができる。

【００２５】また、本発明の測定方法及び測定器具にお
いては、特異的結合物質を固定した粒子のかわりに、被
検物質又はその類縁体を固定させた粒子を用いてもよ
い。ここで、被検物質の類縁体とは、被検物質の一部
分、被検物質に別の物質が結合したもの、被検物質の構
造の一部分が置換されたもの等であって、被検物質の特
異的結合物質と結合する部分の構造を有し、特異的結合
物質に結合することができる物質のことである。例え
ば、被検物質が抗原の場合、この抗原の抗原決定基を含
む物質をこの被検物質の類縁体として挙げることができ
る。

【００２６】本発明において担体としては、特異的結合
物質を固定することにより該特異的結合物質により被覆
された判定部、及び前記判定部に固定された特異的結合
物質と同一又は異なる特異的結合物質が固定された粒子
を保持した粒子保持部とを有するものを使用する。な
お、前記判定部に固定された該特異的結合物質は、担体
の表面上に固定されている。

【００２７】また、担体の材質は、特異的結合物質を物
理的又は化学的に固定できるものであれば何ら制限され
ず、例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、
ポリアクリレート、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエ
チレン、ポリカーボネート、ポリメタクリレート等の非
吸水性の材質が挙げられる。

【００２８】また、担体は、試料等の溶液を接触させる
ことができる限りいずれの形状、構造でもよく、例え
ば、容器や、板状体などが挙げられる。

【００２９】担体として容器を用いる場合、容器の凹部
の形状は半球状、円筒形状、直方体形状等いずれの形状
でもよく、その凹部の内壁面を特異的結合物質により被
覆すればよい。凹部の形状が円筒形状、直方体形状等の
平底面を有する形状である場合には、その平底面を特異
的結合物質により被覆するのが好ましい。容器は凹部が
複数存在していてもよい。容器としては、平底面を有す
る凹部を少なくとも一つ備えた容器であって、その平底
面が特異的結合物質により被覆されているのが好まし
い。平底面を有する凹部を少なくとも一つ備えた容器と
しては、例えば、平底マイクロプレート、トレイ等が挙
げられる。

【００３０】担体として板状体を使用する場合、板状体
の表面形状は円形、長方形、正方形等いずれの形状であ
ってもよく、その表面を特異的結合物質により被覆すれ
ばよい。また、板状体の表面に溝を作って該溝に試料等
の溶液を導入することにより溶液が表面から流れ落ちる
のを防ぐこともできる。

【００３１】本発明においては、担体の判定部に特異的
結合物質を固定する場合、該判定部が部分的に該特異的
結合物質により被覆されるように固定するのが好まし
い。これは、試料中に特異的結合物質が存在する場合、
即ち陽性の場合に特異的結合物質で被覆した部分と被覆
していない部分の像の比較によって陽性であることの判
断がより明確となり、陽性と陰性の判別、つまり試料中
の被検物質の有無の判別が容易になるからである。ここ
で、「部分的」とは、特異的結合物質が偏在しており、
判定部全体にわたって特異的結合物質により被覆されて
いないことをいう。特異的結合物質により被覆された部
分（判定部）の形状及び面積は、試料中の被検物質の存
在の有無を判定することができる限り特に制限はない。
部分的被覆の例としては、担体の判定部の片側半分を被
覆したり、担体の判定部に帯状に被覆したりする場合が
挙げられる。

【００３２】また、担体の判定部を特異的結合物質によ
り部分的に被覆する場合、その被覆部分は複数存在して
いてもよく、例えば、試料中の複数種類の被検物質を測
定するために、担体の判定部にそれぞれの被検物質に対
する特異的結合物質による被覆部分を設けることができ
る。

【００３３】特異的結合物質の担体の判定部への固定化
は、物理的吸着法又は架橋試薬による化学的結合法によ
って行うことができる。物理的吸着法による場合は、公
知の方法に従い、緩衝液等に溶解した特異的結合物質と
担体の面とを接触させることにより行うことができる。
例えば、担体が容器の場合、緩衝液等に溶解した特異的
結合物質を該容器の凹部に入れて静置することにより接
触させ、約２℃〜約４０℃で約１０分〜約１日間吸着反
応を行わせた後、凹部の液を吸引除去し、緩衝液等で洗
浄すればよい。

【００３４】また、架橋試薬による化学的結合法により
行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特
集第５３号臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と
応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年、日本生化学会
編「新生化学実験講座１タンパク質ＩＶ」，東京化学
同人，１９９１年等に記載の公知の方法に従い、被検物
質に対する特異的結合物質と担体をグルタルアルデヒ
ド、カルボジイミド、イミドエステル、マレイミド等の
二価性の架橋試薬と混合、接触させ、特異的結合物質と
担体のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール
基、アルデヒド基、水酸基等と反応させることにより固
定することができる。例えば、担体が容器の場合、該容
器の凹部にグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミ
ドエステル、マレイミド等の二価性の架橋試薬を加え、
静置して反応させる。次いでこれに特異的結合物質を加
えて静置することにより反応させる。場合によっては、
その後これに架橋反応の反応停止剤を添加すること等に
より反応を停止させる。そして、緩衝液等で洗浄を行
う。

【００３５】また、本発明において、担体の判定部を部
分的に被覆する方法としては、例えば、判定部の特異的
結合物質により被覆したい部分にのみ特異的結合物質及
び／又は架橋試薬を滴下して上記方法により固定化を行
なう方法、判定部の特異的結合物質により被覆したい部
分の周囲をプラスチック板等で囲ってこの囲まれた部分
に特異的結合物質及び／又は架橋試薬を滴下して上記固
定化を行なう方法、或いはスポンジ等の吸収体に特異的
結合物質及び／又は架橋試薬を吸収させ、判定部の特異
的結合物質により被覆したい部分に置いて接触させたり
又は塗布して上記固定化を行なう方法等が挙げられる。

【００３６】また、特異的結合物質の担体の判定部への
固定量を変更することにより、試料中の被検物質の濃度
の高低に応じて容易に感度を変更することができる。例
えば、担体の判定部に特異的結合物質を固定する際に、
高濃度の特異的結合物質を用いれば固定量が多くなって
感度を高めることができる。

【００３７】更に、必要があれば非特異的反応を抑制す
るため、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、カ
ゼイン若しくはその塩などの各種タンパク質、脱脂粉乳
等を特異的結合物質を固定した担体に接触させること等
の公知の方法により、特異的結合物質を固定した担体の
判定部をマスキングしてもよい。例えば、担体の判定部
を有する部分が容器である場合には、特異的結合物質を
固定した該容器の凹部にウシ血清アルブミン、ヒト血清
アルブミン、カゼイン又はその塩などの各種タンパク質
などを含む緩衝液等を加えて静置し、特異的結合物質を
固定した容器の凹部の表面を各種タンパク質等でコーテ
ィングした後、凹部の液を吸引除去することにより行う
ことができる。

【００３８】本発明における、特異的結合物質を固定し
た粒子を保持した前記担体の粒子保持部は、試料と接触
するまで粒子を保持させるようにしたものであって、試
料及び粒子が該粒子保持部と判定部の間を行き来するこ
とが可能であれば、形状、大きさ等、特に制限はない。
また、該粒子保持部は、例えば、粒子を適当な分散媒に
分散させた粒子分散液を多孔性吸水体に含浸させた後に
乾燥させ作製することができる。また、前記粒子分散液
を多孔性吸水体に含浸させずに、凍結乾燥等の方法で錠
剤状に成型してもよい。また、前記粒子分散液を担体に
直接塗布等して載せ、これを凍結乾燥等の方法で乾燥さ
せてもよい。

【００３９】粒子の分散媒としては、例えば、トリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、リン酸緩衝
液、リン酸緩衝生理食塩水等の各種緩衝液又は生理食塩
水等を用いることができる。尚、この緩衝液のｐＨにつ
いては、ｐＨ４〜１２の範囲内にあることが好ましい。

【００４０】また、多孔性吸水体としては、例えば、ろ
紙、ペーパータオル若しくはティッシュペーパーなどの
紙類、グラスファイバーフィルタ、スポンジなどの多孔
質体、レーヨン若しくはポリエステルなどの化学繊維、
布、不織布又は綿等の液体を吸収する性質を持つ材料よ
りなるものであればどのようなものを用いてもよい。な
お、この多孔性吸水体の形状、大きさについては特に制
限はない。

【００４１】前記多孔性吸水体に、前記粒子分散液を含
浸させる方法としては、例えば、浸漬、スプレー等の方
法で行うことができる。また、該粒子分散液が含浸した
多孔性吸水体は凍結乾燥、又は静置あるいは乾燥機など
を用いて風乾させてもよい。

【００４２】本発明の担体において、前記判定部と前記
粒子保持部との設置方法としては、粒子保持部に試料を
接触させた場合に、該試料及び粒子が判定部に移動でき
るような位置であれば、どこに設置してもよい。例え
ば、担体として容器を用いる場合には、判定部の上部又
はその周辺部に粒子保持部を設置し、粒子保持部に試料
を接触させた場合に該試料及び粒子が担体の判定部に移
動できるようにしてもよい。また、担体として板状体を
用いる場合には、例えば、試料を移動させたい方向の上
流に粒子保持部を設置し、粒子保持部に試料を接触させ
た場合に該試料及び粒子が担体の判定部に移動できるよ
うにしてもよい。

【００４３】図１は、本発明において担体として用いる
平底マイクロプレートであって、粒子を保持した粒子保
持部（イ）を各ウェルの底面に穴をあけたマイクロプレ
ートに載せたもの（ロ）を、各ウェルの平底面の片側半
分が特異的結合物質により被覆された判定部を有するマ
イクロプレート（ハ）の上部に設置したものを示したも
のである。図１のＡは平底マイクロプレートの斜視図で
あり（斜線部は前記特異的結合物質により被覆された部
分である。）、図１のＢは判定部を有する平底マイクロ
プレートの平面図である（斜線部は前記特異的結合物質
により被覆された部分である。）。

【００４４】図２は、底面が長方形の直方体型透明容器
であって、特異的結合物質により帯状に被覆されている
部分（以下、帯状被覆部分という。）を有する底面を有
するものであり、粒子を保持した粒子保持部（イ）を、
該底面の特異的結合物質が被覆されていない部分に配置
したものを示したものである。図２のＡは該容器の斜視
図であり（斜線部は前記特異的結合物質により被覆され
た部分である。）、図２のＢは該容器の平面図である
（斜線部は前記特異的結合物質により被覆された部分で
ある。）。

【００４５】図３は、表面形状が長方形の板状体であっ
て、該表面に異なる２種類の特異的結合物質による帯状
被覆部分を有するものであり、該帯状被覆部分を有する
面の一端に粒子保持部（イ）を設置したものを示したも
のである。図３のＡは、該板状体の斜視図（斜線部は、
それぞれ異なる特異的結合物質により被覆された部分で
ある。）であり、図３のＢは該板状体の平面図である
（斜線部は、それぞれ異なる特異的結合物質により被覆
された部分である。）。

【００４６】図４は、表面形状が長方形の板状体であっ
て、該表面に断面形状が矩形の溝が設けられており、該
溝の底面に異なる２種類の特異的結合物質による帯状被
覆部分を形成したものであり、該帯状被覆部分を形成し
た表面の一端に粒子保持部（イ）を設置したものを示し
たものである。図４のＡは、そのような板状体の斜視図
（斜線部は、それぞれ異なる特異的結合物質により被覆
された部分である。）であり、図４のＢはそのような板
状体の平面図である（斜線部は、それぞれ異なる特異的
結合物質により被覆された部分である。）。また、溝の
帯状被覆部分側に板を載せること等によりカバーすると
（図４のＡ参照）、カバーされていない側の溝に滴下さ
れた試料が帯状被覆部分の方向に移動するので好まし
い。

【００４７】本発明による測定方法においては、まず、
上記のように試料中の被検物質に対する特異的結合物質
が固定された粒子を保持した粒子保持部に、被検物質の
存在が疑われる試料を接触させる。試料を粒子保持部に
接触させる場合には、該粒子保持部に試料を直接接触さ
せてもよいし、又は、試料の移動方向に照らして粒子保
持部の手前に試料を接触させた後、該試料を粒子保持部
に沿って移動させることにより接触させてもよい。尚、
試料中の複数種類の被検物質を測定する場合には、粒子
に複数種類の被検物質に対する特異的結合物質を同時に
固定させたものを担体の粒子保持部に予め保持させてお
けばよい。若しくは、複数種類の被検物質に対する特異
的結合物質をそれぞれ別々の粒子に固定させたものを混
合して担体の粒子保持部に予め保持させてもよい。

【００４８】試料は、例えば希釈液により希釈して担体
に接触させることができる。希釈液としては、トリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、リン酸緩衝
液、リン酸緩衝生理食塩水等の各種緩衝液又は生理食塩
水等を用いることができる。尚、この緩衝液のｐＨにつ
いては、ｐＨ４〜１２の範囲内にあることが好ましい。

【００４９】また、試料の希釈液には、ウシ血清アルブ
ミン、ヒト血清アルブミン、カゼイン、又はその塩など
の各種タンパク質、塩化ナトリウムなどの各種塩類、各
種糖類、脱脂粉乳、正常ウサギ血清などの各種動物血
清、アジ化ナトリウムなどの各種防腐剤、非イオン性界
面活性剤、両イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性
剤などの各種界面活性剤等の添加剤を適宜加えて用いる
ことができる。そして、これらの添加剤を加える際の濃
度は特に限定されるものではないが、０．００１〜１０
％（ｗ／ｖ）が好ましく、特に０．０１〜５％（ｗ／
ｖ）が好ましい。また、界面活性剤としては、ソルビタ
ン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグ
リセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタ
ン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪
酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、
ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチ
レンフィトステロール、ポリオキシエチレンフィトスタ
ノール、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテ
ル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油、ポリ
オキシエチレンラノリン等の非イオン性界面活性剤、酢
酸ベタインなどの両性界面活性剤又はポリオキシエチレ
ンアルキルエーテル硫酸塩若しくはポリオキシエチレン
アルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤等
を挙げることができる。

【００５０】上記のように、担体の粒子保持部に被検物
質の存在が疑われる試料を接触させると、該粒子保持部
に保持された粒子は、該試料により該粒子保持部から脱
離して、該試料とともに担体の表面上を判定部の方向へ
移動していく。この後、粒子を判定部に沿って移動させ
る。なお、前記の判定部に沿っての粒子の移動は、担体
の表面上での移動となる。この判定部に沿って粒子を移
動させることは、磁石を作用させることにより行った
り、担体を傾けること等により行うことができる。

【００５１】磁石を作用させることにより粒子を移動さ
せる場合、粒子は前記の磁性粒子を使用する。そして、
この磁性粒子が特異的結合物質により被覆された判定部
に沿って移動するように磁石を作用させる。

【００５２】尚、担体の判定部上の粒子の分布状態によ
り陽性又は陰性の判定を行なうことができる限り、担体
の粒子保持部に試料を接触させた後に磁石を作用させて
も良く、又は担体に磁石を作用させながら試料を接触さ
せてもよい。

【００５３】担体の判定部全体が特異的結合物質により
被覆されている場合には、磁性粒子をその面に沿って移
動させることができる位置であれば、どこに磁石を配置
してもよく、例えば、判定部が平面である場合には、そ
の同一平面上に磁石を配置すればよい。

【００５４】また、担体の判定部が部分的に特異的結合
物質により被覆されている場合には、磁性粒子を移動さ
せたい方向に移動させることができる位置であればどこ
に磁石を配置してもよく、例えば、移動させたい方向や
その周辺に配置すればよい。より具体的には、例えば、
判定部の片側半分を特異的結合物質により被覆した担体
を用いた場合、判定部の特異的結合物質により被覆され
ていない部分から被覆されている部分の方向（図１の矢
印方向）に磁性粒子が移動するように磁石を配置するの
が好ましい。

【００５５】また、判定部が特異的結合物質により帯状
に被覆されている担体を用いた場合は、判定部の特異的
結合物質により被覆されていない部分からその帯状被覆
部分を通って特異的結合物質により被覆されていない部
分の方向（図２〜４の矢印方向）に磁性粒子が移動する
ように磁石を配置するのが好ましい。

【００５６】磁石としては、磁場を発生して磁性粒子を
磁化するものであればいずれのものでもよく、永久磁
石、電磁石等を用いればよい。また、磁束密度は、用い
る磁性粒子と担体の面との相互作用に依存するが、通
常、５〜１００ガウスである。

【００５７】試料に被検物質が存在する場合、該被検物
質は磁性粒子に固定された特異的結合物質に結合する。
この場合にその被検物質が結合した磁性粒子に磁石を作
用させると、該磁性粒子は磁石に吸引されて担体の表面
上を判定部に沿って該磁石の方向に移動するが、その過
程で判定部に固定された特異的結合物質に出会うと、該
磁性粒子は被検物質を介してその判定部に固定された特
異的結合物質に結合して移動を停止するか又は移動が著
しく遅くなる。

【００５８】判定部の特異的結合物質が固定されていな
い領域では、磁性粒子の移動は該粒子と判定部表面との
相互作用及び磁場の強さに依存して磁石の方向にすみや
かに移動する。一方、判定部の特異的結合物質が固定さ
れている領域では、該磁性粒子に被検物質が結合してい
る場合と結合していない場合とではその磁性粒子の移動
速度に大きな差を生じる。

【００５９】即ち、試料中に被検物質が存在しない場
合、磁性粒子は被検物質を結合しないので、判定部に固
定された特異的結合物質とは親和性を示さず、特異的結
合物質が固定されていない領域と同様にすみやかに磁石
の方向に移動する。従って、試料中に被検物質が存在し
ない場合、磁性粒子は磁石に近い位置、即ち担体の判定
部の端部に集まる。一方、試料中に被検物質が存在する
場合、磁性粒子は被検物質を結合するので、該磁性粒子
は判定部に固定された特異的結合物質と被検物質を介し
て結合して移動が停止又は著しく遅くなる。従って、試
料中に被検物質が存在する場合、磁性粒子はその判定部
の特異的結合物質で被覆された部分に集まる。

【００６０】また、担体として容器を使用した場合、試
料と混合された磁性粒子はその比重により容器の凹部の
下方に沈降する。この際、容器の上部から底面方向に磁
石を作用させることにより磁性粒子の沈降を促進しても
よい。

【００６１】担体の特異的結合物質により被覆された判
定部に沿って移動するように磁性粒子に磁石を作用させ
る場合、被検物質が結合していない磁性粒子と該判定部
との相互作用は弱く、その移動速度はほぼ磁石に依存す
る。従って、大きな移動速度を必要とする場合、すなわ
ち短時間で測定結果を求めるときには強い磁場を発生す
る磁石を使用すればよい。また、電磁石を用いて磁場の
強さを調節しながら測定を行うことも可能である。

【００６２】担体を傾けることにより移動させる場合、
粒子が担体の特異的結合物質により被覆された判定部に
沿って移動するように担体を傾ける。なお、担体を傾け
る角度は、粒子が重力によって担体の特異的結合物質に
より被覆された判定部に沿って移動するような角度であ
ればよく、９０°以下の角度を適宜選択すればよいが、
２５°から９０°の間の角度が好ましく、特に４５°か
ら６５°の間の角度が好ましい。

【００６３】また、担体の判定部上の粒子の分布状態に
より陽性又は陰性の判定を行なうことができる限り、担
体の粒子保持部に試料を接触させた後に担体を傾けても
良く、又は担体を傾けながら試料を接触させてもよい。

【００６４】担体の判定部全体が特異的結合物質により
被覆されている場合には、担体を傾ける方向はいずれの
方向でもよい。

【００６５】また、担体の判定部が部分的に特異的結合
物質により被覆されている場合には、粒子が担体の特異
的結合物質により被覆されている部分の上を移動するよ
うな方向に担体を傾けて、重力により粒子を移動させれ
ばよい。例えば、移動させたい方向を下にして担体を配
置すればよい。より具体的には、例えば、判定部の片側
半分を特異的結合物質により被覆した担体を用いた場
合、判定部の特異的結合物質により被覆されていない部
分から被覆されている部分の方向（図１の矢印方向）に
粒子が移動するよう担体を傾ける（この場合図１の矢印
方向に傾ければよい）。

【００６６】また、判定部が特異的結合物質により帯状
に被覆されている担体を用いた場合は、判定部の特異的
結合物質により被覆されていない部分からその帯状被覆
部分を通って特異的結合物質により被覆されていない部
分の方向（図２〜４の矢印方向）に粒子が移動するよう
に担体を傾ける（この場合図２〜４の矢印方向に傾けれ
ばよい）。

【００６７】試料に被検物質が存在する場合、該被検物
質は粒子に固定された特異的結合物質に結合する。この
場合にその被検物質が結合した粒子が担体の特異的結合
物質により被覆された判定部に沿って移動するように担
体を傾けると、被検物質と結合した粒子は重力により担
体の判定部に沿って傾きの下方向に移動するが、その過
程で判定部に固定された特異的結合物質に出会うと、該
粒子は被検物質を介して担体に結合して移動を停止する
か又は移動が著しく遅くなる。

【００６８】判定部の特異的結合物質が固定されていな
い領域では、粒子の移動は該粒子と判定部表面との相互
作用及び担体を傾ける角度に依存し、該粒子は傾きの下
方向にすみやかに移動する。一方、判定部の特異的結合
物質が固定されている領域では、該粒子に被検物質が結
合している場合と結合していない場合とではその粒子の
移動速度に大きな差を生じる。

【００６９】即ち、試料中に被検物質が存在しない場
合、粒子は被検物質を結合しないので、判定部に固定さ
れた特異的結合物質とは親和性を示さず、特異的結合物
質が固定されていない領域と同様にすみやかに傾きの下
方向に移動する。従って、試料中に被検物質が存在しな
い場合、粒子は担体の下方向の端部に集まる。一方、試
料中に被検物質が存在する場合、粒子は被検物質を結合
するので、該粒子は判定部に固定された特異的結合物質
と被検物質を介して結合して移動が停止又は著しく遅く
なる。従って、試料中に被検物質が存在する場合、粒子
はその判定部の特異的結合物質で被覆された部分に集ま
る。

【００７０】担体を傾けて粒子を担体の特異的結合物質
により被覆された判定部に沿って移動させる場合、被検
物質が結合していない粒子と該判定部との相互作用は弱
く、その移動速度は担体を傾ける角度にほぼ依存する。
従って、大きな移動速度を必要とする場合、すなわち短
時間で測定結果を求めるときには担体を傾ける角度を大
きくすればよい。また、担体を傾ける角度を経時的に変
化させてもよい。更に、板状体の担体を用いる場合、そ
の板状体を湾曲させ板状体の角度を変化させることによ
り、粒子が移動する速度を変化させてもよい。

【００７１】上記のように、粒子を担体の特異的結合物
質により被覆された判定部に沿って移動させた後、この
判定部における粒子の分布状態から被検物質の有無を判
定する。この担体の判定部上の粒子の分布状態、即ち像
は、容易に肉眼により、あるいは吸光度測定やパターン
認識によるマイクロプレートリーダー等の光学的読み取
り装置により確認することができる。

【００７２】図１のＣは、平底マイクロプレートを用い
て被検物質が存在する試料（陽性の試料）について測定
を行なった場合のウェルを上方からみた図であり、図１
のＤは、平底マイクロプレートを用いて被検物質が存在
しない試料（陰性の試料）について測定を行なった場合
のウェルを上方からみた図である。陽性の場合、ウェル
の上部に設置された粒子保持部から移動してきた粒子は
特異的結合物質被覆部分（判定部）にトラップされる。

【００７３】図２のＣは、底面が長方形の直方体型の透
明容器を用いて被検物質が存在する試料（陽性の試料）
について測定を行なった場合の該容器を上方からみた図
であり、図２のＤは、底面が長方形の直方体型の透明容
器を用いて被検物質が存在しない試料（陰性の試料）に
ついて測定を行なった場合の該容器を上方からみた図で
ある。陽性の場合、底面に設置された粒子保持部から移
動してきた粒子は帯状被覆部分（判定部）にトラップさ
れる。

【００７４】図３のＣは、長方形の板状体を用いて２種
類の被検物質が存在する試料（それぞれの被検物質が陽
性の試料）について測定を行なった場合の該板状体を上
方からみた図であり、図３のＤは、長方形の板状体を用
いて被検物質が存在しない試料（陰性の試料）について
測定を行なった場合の該板状体を上方からみた図であ
る。陽性の場合、該板状体の表面に設置された粒子保持
部から移動してきた粒子はそれぞれの被検物質に対応す
る帯状被覆部分（判定部）にトラップされる。

【００７５】図４のＣは、表面に溝が設けられた長方形
の板状体を用いて２種類の被検物質が存在する試料（陽
性の試料）について測定を行なった場合の該板状体を上
方からみた図であり、図４のＤは、かかる板状体を用い
て被検物質が存在しない試料（陰性の試料）について測
定を行なった場合の該板状体を上方からみた図である。
陽性の場合、粒子保持部から移動してきた粒子はそれぞ
れの被検物質に対応する帯状被覆部分（判定部）にトラ
ップされる。

【００７６】また、特異的結合物質のかわりに、被検物
質又はその類縁体を固定した粒子を用いる場合、上記の
測定方法により得られる陽性又は陰性の粒子の分布状態
と逆の結果が得られる。

【００７７】また、試料が血液（全血試料）である場
合、その血液試料中の被検物質の測定を行なうと、その
試料中に含まれる赤血球により遮られて粒子の分布状態
が確認できず、陽性、陰性の判定が困難になる。これに
対し、担体の判定部における特異的結合物質による被覆
部分上の試料及び粒子を含む液の高さを小さくすると、
その被覆部分上の赤血球の数が減るため赤血球に遮られ
ずに粒子の分布状態を確認することができる。

【００７８】試料として血液を用いる場合、担体の判定
部における特異的結合物質による被覆部分上の試料及び
粒子を含む液の高さは、１ｍｍ以下であるのが好まし
い。担体の判定部における特異的結合物質による被覆部
分上の試料及び粒子を含む液の高さを小さくするには、
例えば、図１又は図２に示したような容器を担体として
用いた場合にはその深さを小さくすればよく、図４又は
図５に示したような表面に溝が設けられた板状体を担体
として用いた場合にはその溝の深さを小さくすればよ
い。

【００７９】また、試料中の被検物質の濃度が低い場
合、試料を多量に用いる必要がある。それは、被検物質
が一定数以上存在しないと測定において像が形成されな
いからである。従って、血液試料中の被検物質の濃度が
低い場合には、担体として、特異的結合物質による被覆
部分上の高さは十分小さいが収容できる液の容量は大き
い担体を用いるのが好ましい。特異的結合物質による被
覆部分上の高さは十分小さいが収容できる液の容量は大
きい担体とするには、例えば、特異的結合物質により被
覆されていない部分を被覆されている部分よりも高さを
高くしたり、また、高さとは別に幅、奥行きを大きくし
たりしてもよい。具体的には、これらに限定されるもの
でないが、図６〜９に例示したような担体が被検物質の
濃度が低い血液試料中の該被検物質の測定を行なう場合
に適している。図６及び図７は、それぞれ特異的結合物
質による被覆部分上の高さが小さく、且つ特異的結合物
質により被覆されていない部分の高さは前記被覆部分上
の高さよりも大きい容器の斜視図である。また、図８
は、特異的結合物質による被覆部分上の高さが小さく、
且つ特異的結合物質により被覆されていない部分の高さ
は小さいがその幅及び奥行きが大きい容器の斜視図であ
る。更に、図９は、特異的結合物質による被覆部分上の
高さが小さく、且つ特異的結合物質により被覆されてい
ない部分の高さは小さいがその幅及び奥行きが大きい溝
が表面に設けられた板状体の斜視図である。

【００８０】尚、このように、担体として、特異的結合
物質による被覆部分上の高さは十分小さいが収容できる
液の容量は大きい担体を用いる場合、該被覆部分上の被
検物質の数も赤血球と同様に減るが、磁石を作用させる
ことにより粒子を移動させる場合には、粒子に結合した
被検物質は、磁石の作用により他の部分から上記被覆部
分に移動してくるので測定に支障はない。また、担体を
傾けることにより粒子を移動させる場合にも、粒子に結
合した被検物質は担体の傾きにより他の部分から上記被
覆部分に移動してくるので測定に支障はない。

【００８１】更に、担体が例えば上記したような板状体
の場合には、該板状体の判定部に試料を接触させた後、
試料を粒子保持部に沿って移動させ、ここで粒子と接触
させ、更にこの試料と粒子の混合物を判定部に沿って移
動させた後に、判定部における粒子の分布状態から被検
物質の有無を判定することができる。

【００８２】また、担体に、液体を吸収する性質を持つ
材料よりなる吸収部を予め配置することにより、判定部
に接触させた試料と粒子の混合物を吸収することもでき
る。担体の判定部に接触させた試料と粒子の混合物を吸
収する吸収部としては、例えば、ろ紙、ペーパータオル
若しくはティッシュペーパーなどの紙類、グラスファイ
バーフィルタ、高分子吸収体、スポンジなどの多孔質
体、レーヨン若しくはポリエステルなどの化学繊維、
布、不織布又は綿等の液体を吸収する性質を持つ材料よ
りなるものであればどのようなものを用いてもよい。な
お、この試料と粒子の混合物を吸収する吸収部の形状、
大きさについては特に制限はない。また、試料と粒子を
吸収する吸収部が担体に配置される位置としては、判定
部に被検物質を含む試料と粒子を接触させた後に、前記
担体の該判定部から前記試料と粒子が吸収される位置で
あればどこに配置してもよい。例えば、担体として平底
面を有する容器を使用する場合、試料と粒子を吸収する
吸収部を短冊状に成型し、平底面の特異的結合物質が固
定されていない部分に容器の側面に沿って立てかけるよ
うに配置してもよい。また、担体として板状体を使用す
る場合、例えば、該担体の特異的結合物質により被覆さ
れた判定部の端部、又は該判定部に隣接した位置等に試
料と粒子を吸収する吸収部を配置すればよい。例えば、
試料と粒子が特異的結合物質により被覆された判定部の
上をスムーズに移動できるように、試料と粒子が移動し
ていく方向、即ち特異的結合物質が被覆された該判定部
の水平方向から試料と粒子を吸収させることができるよ
うな位置に試料と粒子を吸収する吸収部を配置するのが
好ましい。なお、試料と粒子を吸収する吸収部は、試料
と粒子を接触させた後に、取り外せるように配置しても
よい。更に、吸収部を脱着可能な形態、又はカートリッ
ジ等の形態にして、吸収部を何度も交換できるようにし
てもよい。

【００８３】なお、特公平７−１８８７８号公報や特表
平９−５０６４３４号公報に記載されている、いわゆる
イムノクロマトグラフィー法では、担体に吸水性の材質
が用いられており、液体試料が担体中の微細な孔を毛細
管現象によって流れる間に抗原抗体反応を行わせ、試料
中の被検物質の存在の有無を判定するものである。これ
に対して、本発明は、試料中の被検物質を、粒子が担体
の表面上にある特異的結合物質で被覆された部分に集ま
るか否かにより測定するものである。従って、担体には
非吸水性の材質を用い、かつ磁性粒子に磁石を作用させ
ること、または粒子に重力を作用させることにより、該
磁性粒子または該粒子を担体の表面上を判定部に沿って
移動させて測定を行うものであるので、本質的にイムノ
クロマトグラフィーの原理とは異なるものである。

【００８４】

〔実施例１〕

（ＨＢｓ抗原の測定）（１）抗ＨＢｓ抗体固定板状体の作製アクリル樹脂押出板（幅２５ｍｍ、奥行き４０ｍｍ、厚
さ１ｍｍ）〔アクリサンデー社製〕の上に２枚の塩化ビ
ニル板（幅１０ｍｍ、奥行き４０ｍｍ、厚さ０．５ｍ
ｍ）を５ｍｍの間隔をおいて溶剤で貼り合わせて、図５
に示された表面に溝（幅５ｍｍ、奥行き４０ｍｍ、高さ
０．５ｍｍ）が設けられた板状体を作製した。この板状
体の溝の底面の左端から５ｍｍより１０ｍｍの部分に抗
ＨＢｓ抗体溶液（シノテスト社製、５μｇ／ｍｌの濃度
でｐＨ７の１０ｍＭリン酸緩衝液に溶解したもの）２０
μｌをピペットを用いて載せて、接触させ、３７℃で３
時間静置した。次いで、これらの溶液を吸引除去後、
０．５％（Ｗ／Ｖ）カゼインを含むトリス緩衝液（ｐＨ
７．５，５０ｍＭ）（以下、これを希釈液Ａという）を
０．３ｍｌ加えて、４℃で一晩放置し、これを吸引除去
した。そして、この板状体の左端の上にアクリル樹脂押
出板（幅２５ｍｍ、奥行き２５ｍｍ、厚さ１ｍｍ）〔ア
クリルサンデー社製〕を溶剤で貼り合わせることによ
り、図５に示したように板状体にカバーをした。このよ
うにして、溝の底面に特異的結合物質（抗ＨＢｓ抗体）
による帯状被覆部分（判定部）が形成された板状体を作
製した。

【００８５】（２）抗ＨＢｓ抗体固定磁性粒子の作製磁性粒子（ＤｙｎａｂｅａｄｓＭ−４５０ｕｎｃｏａ
ｔｅｄ、ダイナル社製、粒径：４．５μｍ、３％（ｗ／
ｖ））１ｍｌと抗ＨＢｓ抗体溶液（シノテスト社製、ｐ
Ｈ７の１０ｍＭリン酸緩衝液に濃度０．１ｍｇ／ｍｌで
溶解したもの）１ｍｌを混合し、３７℃で３０分間反応
させた。ここに希釈液Ａを約２０倍量加えて加えてマス
キングを行なった。次いで、得られた磁性粒子を希釈液
Ａにて洗浄し、磁性粒子を濃度が約０．１％（ｗ／ｖ）
となるように希釈液Ａに再分散させた。このようにし
て、抗ＨＢｓ抗体固定磁性粒子分散液を調製した。

【００８６】（３）粒子保持部の作製上記（２）で作製した抗ＨＢｓ抗体固定磁性粒子分散液
を、ベルクリンＥ２（鐘紡社製；縦５ｍｍ、横５ｍｍに
切断したもの）に５０μｌ含浸させ凍結乾燥した。この
ようにして、抗ＨＢｓ抗体固定磁性粒子を保持した粒子
保持部を作製した。

【００８７】（４）ＨＢｓ抗原の測定上記（１）で作製した抗ＨＢｓ抗体固定板状体の溝のカ
バーされた部分とカバーされていない部分の境目に、上
記（３）で作製した抗ＨＢｓ抗体固定磁性粒子を保持し
た粒子保持部を、セロハンテープで固定し設置した（図
５のイ）。試料であるＨＢｓ抗原溶液（明治乳業社製、
希釈液Ａで１ｎｇ／ｍｌの濃度に調製したもの）１５０
μｌを、上記粒子保持部に滴下し、抗ＨＢｓ抗体固定磁
性粒子と試料を混合させた。この混合物は、抗ＨＢｓ抗
体固定板状体の抗ＨＢｓ抗体による帯状被覆部分（判定
部）に移動し接触した。これを静置し、粒子を判定部の
方向へ移動させるために、板状体の帯状被覆部分が形成
された側面方向に磁石を設置し、板状体の溝の底面の抗
ＨＢｓ抗体が固定されていない部分から溝の底面の抗Ｈ
Ｂｓ抗体が固定されている部分方向（図５の矢印方向）
に磁束密度４０〜６０ガウスの磁場を発生させた。磁場
を発生させてから３分間以内に図５のＣに示すような磁
性粒子の像が判定部に認められた。陰性血液を試料とし
て用いて測定した場合には粒子の像は認められなかっ
た。

【００８８】〔実施例２〕（ＨＢｓ抗原の測定）（１）抗ＨＢｓ抗体固定マイクロプレートの作製図１に示すように、平底マイクロプレート（ヌンク社
製、ウェルの直径：７ｍｍ、ウェルの深さ：８ｍｍ）の
ウェルの平底面の片側半分に、抗ＨＢｓ抗体溶液（シノ
テスト社製、５μｇ／ｍｌの濃度でｐＨ７の１０ｍＭリ
ン酸緩衝液に溶解したもの）２５μｌをピペットを用い
て載せて接触させ、３７℃で３時間静置した。次いで、
ウェル内の溶液を吸引除去後、希釈液Ａを０．３ｍｌ加
えて、４℃で一晩放置し、これを吸引除去した。このよ
うにして、抗ＨＢｓ抗体をウェルの底面の左半分に固定
したマイクロプレート（図１のハ）を作製した。

【００８９】（２）ＨＢｓ抗原の測定平底マイクロプレートのウエルの底面にドリルで直径約
４ｍｍの穴をあけ、実施例１の（３）で作製した、抗Ｈ
Ｂｓ抗体固定磁性粒子を保持した粒子保持部をこのウェ
ルの底面に設置した。この粒子保持部を設置した平底マ
イクロプレート（図１のロ）を、上記（１）で作製した
抗ＨＢｓ抗体固定マイクロプレートの上に重ねた。試料
であるＨＢｓ抗原溶液（明治乳業社製、希釈液Ａで１ｎ
ｇ／ｍｌの濃度に調製したもの）１００μｌを、上記粒
子保持部に滴下し、抗ＨＢｓ抗体固定磁性粒子と試料の
混合物を、抗ＨＢｓ抗体固定マイクロプレートに落下さ
せ、抗ＨＢｓ抗体による帯状被覆部分に接触させた。粒
子保持部を設置した平底マイクロプレートを抗ＨＢｓ抗
体固定マイクロプレートから外し、粒子を判定部の方向
へ移動させるために、抗ＨＢｓ抗体固定マイクロプレー
トの側面方向に磁石を設置し、ウェルの平底面の抗ＨＢ
ｓ抗体が固定されていない部分から平底面の抗ＨＢｓ抗
体が固定されている部分方向（図１の矢印方向）に磁束
密度４０〜６０ガウスの磁場を発生させた。磁場を発生
させてから３分間以内に図１のＣに示すような磁性粒子
の像が判定部に認められた。陰性血液を試料として用い
て測定した場合には粒子の像は認められなかった。

【００９０】〔実施例３〕（抗ＨＢｓ抗体の測定）（１）抗ＨＢｓ抗原固定板状体の作製アクリル樹脂押出板（幅２５ｍｍ、奥行き４０ｍｍ、厚
さ１ｍｍ）〔アクリサンデー社製〕の上に２枚の塩化ビ
ニル板（幅１０ｍｍ、Ｎ奥行き４０ｍｍ、厚さ０．５ｍ
ｍ）を５ｍｍの間隔をおいて溶剤で貼り合わせて、図５
に示された表面に溝（幅５ｍｍ、奥行き４０ｍｍ、高さ
０．５ｍｍ）が設けられた板状体を作製した。この板状
体の溝の底面の左端から５ｍｍより１０ｍｍの部分に、
ＨＢｓ抗原溶液（明治乳業社製、５μｇ／ｍｌの濃度で
ｐＨ７の１０ｍＭリン酸緩衝液に溶解したもの）２５μ
ｌをピペットを用いて載せて接触させ、３７℃で３時間
静置した。次いで、これらの溶液を吸引除去後、前記の
希釈液Ａ０．３ｍｌをここに加えて、４℃で一晩放置
し、これを吸引除去した。そして、この板状体の左端の
上にアクリル樹脂押出板（幅２５ｍｍ、奥行き２５ｍ
ｍ、厚さ１ｍｍ）〔アクリサンデー社製〕を溶剤で貼り
合わせることにより、図５に示したように板状体にカバ
ーをした。このようにして、溝の底面に特異的結合物質
（ＨＢｓ抗原）による帯状被覆部分（判定部）が形成さ
れた板状体を作製した。

【００９１】（２）ＨＢｓ抗原固定粒子の作製粒子（ＤｙｎａｂｅａｄｓＭ−４５０ｕｎｃｏａｔｅ
ｄ、ダイナル社製、粒径：４．５μｍ、３％（ｗ／
ｖ））１ｍｌとＨＢｓ抗原溶液（明治乳業社製、ｐＨ
７．２の１０ｍＭリン酸緩衝液に４０μｇ／ｍｌの濃度
で溶解したもの）１ｍｌを混合し、３７℃で３０分間反
応させた。ここに希釈液Ａを加えてマスキングを行なっ
た。次いで、得られた磁性粒子を希釈液Ａにて洗浄し、
粒子を濃度が約０．１％（ｗ／ｖ）となるように希釈液
Ａに再分散させた。このようにして、ＨＢｓ抗原固定粒
子分散液を調製した。

【００９２】（３）粒子保持部の作製上記（２）で作製したＨＢｓ抗原固定粒子分散液を、ベ
ルクリンＥ２（鐘紡社製；縦５ｍｍ、横５ｍｍに切断し
たもの）に５０μｌ含浸させ凍結乾燥した。このように
して、ＨＢｓ抗体固定粒子を保持した粒子保持部を作製
した。

【００９３】（４）抗ＨＢｓ抗体の測定上記（１）で作製した抗ＨＢｓ抗体固定板状体の溝のカ
バーされた部分とカバーされていない部分の境目に上記
（３）で作製したＨＢｓ抗原固定粒子を保持した粒子保
持部を、セロハンテープで固定し設置した（図５の
イ）。試料であるＨＢｓ抗体を含む血清１５０μｌを、
ＨＢｓ抗原固定粒子を保持した粒子保持部に滴下し、粒
子と試料を混合させた。この混合物は、ＨＢｓ抗原固定
板状体の帯状被覆部分（判定部）に移動し、接触した。
これを静置し、粒子を判定部の方向へ移動させるため
に、板状体の帯状被覆部分が形成された側面方向を下に
して、板状体の溝の底面のＨＢｓ抗原が固定されていな
い部分から溝の底面のＨＢｓ抗原が固定されている部分
方向（図５の矢印方向）にＨＢｓ抗原固定粒子が移動す
るように、約６０°の角度でＨＢｓ抗原固定板状体を傾
けた。斜めに傾けてから３分間以内に図５のＣに示すよ
うな粒子の像が判定部に認められた。陰性血液を試料と
して用いて測定した場合には粒子の像は認められなかっ
た。

【００９４】〔実施例４〕（大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の測定）（１）抗大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７抗体固定板状体の作製アクリル樹脂押出板（幅２５ｍｍ、奥行き４０ｍｍ、厚
さ１ｍｍ）〔アクリサンデー社製〕の上に２枚の塩化ビ
ニル板（幅１０ｍｍ、奥行き４０ｍｍ、厚さ０．５ｍ
ｍ）を５ｍｍの間隔をおいて溶剤で貼り合わせて、図５
に示された表面に溝（幅５ｍｍ、奥行き４０ｍｍ、高さ
０．５ｍｍ）が設けられた板状体を作製した。この板状
体の溝の底面の左端から５ｍｍより１０ｍｍの部分に抗
大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７抗体溶液〔Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ
＆ＰｅｒｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、５
μｇ／ｍｌの濃度でｐＨ７の１０ｍＭリン酸緩衝液に溶
解したもの〕２０μｌをピペットを用いて載せて接触さ
せ、３７℃で３時間静置した。次いで、この溶液をピペ
ットで吸引除去後、前記の希釈液Ａ０．３ｍｌをここに
加えて、４℃で一晩放置し、これをピペットで吸引除去
した。そして、この板状体の左端の上にアクリル樹脂押
出板（幅２５ｍｍ、奥行き２５ｍｍ、厚さ１ｍｍ）〔ア
クリサンデー社製〕を溶剤で貼り合わせることにより、
図５に示したように板状体にカバーをした。このように
して、溝の底面に特異的結合物質（抗大腸菌Ｏ１５７：
Ｈ７抗体）による帯状被覆部分（判定部）が形成された
板状体を作製した。

【００９５】（２）抗大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７抗体固定磁
性粒子の作製粒子（ＤｙｎａｂｅａｄｓＭ−４５０ｕｎｃｏａｔ
ｅｄ）ダイナル社製、粒径：４．５μｍ、粒径のＣ．
Ｖ．５％以下、比重１．５、濃度３％（ｗ／ｖ））１ｍ
ｌと抗大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７抗体溶液〔Ｋｉｒｋｅｇａ
ａｒｄ＆ＰｅｒｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社
製、ｐＨ７．０の１０ｍＭリン酸緩衝液に濃度０．１ｍ
ｇ／ｍｌで溶解したもの〕１ｍｌを混合し、３７℃で３
０分間反応させた。ここに希釈液Ａを約２０倍量加えて
マスキングを行なった。次いで、得られた粒子を希釈液
Ａにて洗浄し、粒子を濃度が約０．１％（ｗ／ｖ）とな
るように希釈液Ａに再分散させた。このようにして、抗
大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７抗体固定磁性粒子分散液を調製し
た。

【００９６】（３）粒子保持部の作製上記（２）で作製した抗大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７抗体固定
磁性粒子分散液を、ベルクリンＥ２（鐘紡社製；縦５ｍ
ｍ、横５ｍｍに切断したもの）に５０μｌ含浸させ凍結
乾燥した。このようにして、抗大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７抗
体固定磁性粒子を保持した粒子保持部を作製した。

【００９７】（４）大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の測定上記（１）で作製した抗大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７抗体固定
板状体の溝のカバーされた部分とカバーされていない部
分の境目に上記（３）で作製した粒子保持部を、セロハ
ンテープで固定し設置した（図５のイ）。試料である大
腸菌Ｏ１５７：Ｈ７〔Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅ
ｒｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製〕を１０^３個／ｍ
ｌになるように健常人の糞便懸濁液に添加し調製した試
料１５０μｌを、上記（２）で作製した抗大腸菌Ｏ１５
７：Ｈ７抗体固定粒子を保持した粒子保持部に滴下し、
粒子と試料を混合させた。この混合物は、抗大腸菌Ｏ１
５７：Ｈ７抗体固定板状体の帯状被覆部分（判定部）に
移動し、接触した。その後、この板状体の帯状被覆部分
が形成された側面方向に磁石を設置することにより、抗
大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７抗体固定粒子が移動するように板
状体の溝の底面の抗大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７抗体が固定さ
れていない部分から溝の底面の抗大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７
抗体が固定されている部分方向（図５の矢印方向）に磁
束密度４０〜６０ガウスの磁場を発生させた。磁場を発
生させてから３分間以内に図５のＣに示すような粒子の
像が判定部に認められた。大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７を添加
していない糞便懸濁液を試料として用いて測定した場合
には粒子の像は認められなかった。

【００９８】

【発明の効果】本発明の測定方法及び測定器具によれ
ば、特異的結合反応を利用して試料中の被検物質を目視
又は機器を用いて測定する際に、簡単、迅速、かつ、手
軽な操作で測定を行うことができるので、手技のない人
でも間違うことなく正しい測定結果を得ることができ
る。また、本発明の測定方法及び測定器具によれば、試
料中の被検物質の有無を、従来のように容器底面に集ま
った粒子の円形の像の大小ではなく、磁性粒子が磁石に
近い位置、即ち面の端部に集まるか或いは担体の面の特
異的結合物質で被覆された部分に集まるかにより判定す
ることから判定が容易であり、被検物質濃度が低い場合
であってもその判定が容易である。したがって高感度で
試料中の被検物質の測定をすることができる。しかも非
特異的凝集反応が生じた場合においても誤った判定を与
えることはない。また、本発明の測定方法及び測定器具
によれば、磁性粒子及び／又は担体の面への特異的結合
物質の固定量を変更することにより感度を容易に変更す
ることができるので効率がよい。従って、被検物質の濃
度が低い場合においても被検物質の有無を容易に判定す
ることができる。更に、本発明の測定方法によれば、短
時間で、具体的には被検物質の種類にもよるが、通常、
２０秒〜１０分程度で試料中の被検物質の有無の判定を
行なうことができ、例えば、ＨＢｓ抗原の場合、１ｎｇ
／ｍｌ程度の濃度であっても３分間以内で測定が可能で
ある。また、大腸菌Ｏ１５７の場合には、１０^３個／ｍ
ｌ程度の濃度であっても３分間以内で測定が可能であ
る。更に、本発明の測定方法及び測定器具によれば、試
料中の複数の被検物質の測定を同時に行なうことができ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】粒子保持部（イ）を各ウエルの底面に穴をあけ
たマイクロプレートに載せたもの（ロ）を、各ウェルの
平底面の片側半分が特異的結合物質により被覆されたマ
イクロプレート（ハ）の上部に設置したものを示す図で
ある。

【図２】底面が特異的結合物質により帯状に被覆されて
いる直方体型の透明容器を示す図である。

【図３】表面が特異的結合物質により帯状に被覆されて
いる板状体を示す図である。

【図４】表面に溝が設けられ、該溝の底面が特異的結合
物質により帯状に被覆されている板状体を示す図であ
る。

【図５】表面に溝が設けられ、該溝の底面が特異的結合
物質により帯状に被覆されている板状体を示す図であ
る。

【図６】特異的結合物質による被覆部分上の高さが小さ
く、且つ特異的結合物質により被覆されていない部分の
高さは前記被覆部分上の高さよりも大きい容器の斜視図
である。

【図７】特異的結合物質による被覆部分上の高さが小さ
く、且つ特異的結合物質により被覆されていない部分の
高さは前記被覆部分上の高さよりも大きい容器の斜視図
である。

【図８】特異的結合物質による被覆部分上は高さが小さ
く、且つ特異的結合物質により被覆されていない部分の
高さは小さいがその幅及び奥行きが大きい容器の斜視図
である。

【図９】特異的結合物質による被覆部分上の高さが小さ
く、且つ特異的結合物質により被覆されていない部分の
高さは小さいがその幅及び奥行きが大きい溝が表面に設
けられた板状体の斜視図である。

【図１０】間接凝集反応測定法により試料中の被検物質
の測定を行った場合の凝集像を示す図である。

【符号の説明】イ粒子保持部ロウェルの底面に穴をあけた平底マイクロプレートハ判定部を有する平底マイクロプレート

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】試料中の被検物質の測定方法であって、１）試料中の被検物質に対する特異的結合物質が固定さ
れて該特異的結合物質により被覆された判定部、及び被
検物質に対する特異的結合物質であって該判定部に固定
された特異的結合物質と同一又は異なる特異的結合物質
が固定された粒子を保持した粒子保持部、を有する担体
の該粒子保持部に試料を接触させる工程、２）前記粒子を前記判定部に沿って移動させる工程、を
含んでなり、前記判定部における粒子の分布状態から被
検物質の有無を判定することを特徴とする測定方法。
【請求項２】判定部が特異的結合物質により部分的に
被覆されている、請求項１に記載の試料中の被検物質の
測定方法。
【請求項３】担体が平底面を有する凹部を少なくとも
一つ備えた容器であって、該平底面に特異的結合物質に
より被覆された判定部と、前記判定部の周辺部又は上部
に粒子を保持した粒子保持部とを有している請求項１又
は２に記載の試料中の被検物質の測定方法。
【請求項４】担体が板状体であって、その表面に特異
的結合物質により被覆された判定部、及び粒子を保持し
た粒子保持部を有している、請求項１又は２に記載の試
料中の被検物質の測定方法。
【請求項５】前記被検物質が抗原であり、前記特異的
結合物質が抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に
記載の試料中の被検物質の測定方法。
【請求項６】前記被検物質が抗体であり、前記特異的
結合物質が抗原である、請求項１〜４のいずれか１項に
記載の試料中の被検物質の測定方法。
【請求項７】判定部に沿っての移動が、担体の表面上
での移動である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の
試料中の被検物質の測定方法。
【請求項８】判定部に固定された特異的結合物質が、
担体の表面上のみに固定されたものである、請求項１〜
７のいずれか１項に記載の試料中の被検物質の測定方
法。
【請求項９】担体が非吸水性の材質よりなるものであ
る、請求項１〜８のいずれか１項に記載の試料中の被検
物質の測定方法。
【請求項１０】試料中の被検物質に対する特異的結合
物質が固定されて該特異的結合物質により被覆された判
定部と、被検物質に対する特異的結合物質であって前記
判定部に固定された特異的結合物質と同一又は異なる特
異的結合物質が固定された粒子を保持した粒子保持部と
を有する、試料中の被検物質の測定器具。
【請求項１１】判定部が特異的結合物質により部分的
に被覆されている、請求項１０に記載の試料中の被検物
質の測定器具。
【請求項１２】担体が平底面を有する凹部を少なくと
も１つ備えた容器であって、該平底面に特異的結合物質
により被覆された判定部と、前記判定部の周辺部に粒子
を保持した粒子保持部とを有している、請求項１０又は
１１に記載の試料中の被検物質の測定器具。
【請求項１３】担体が板状体であって、その表面に特
異的結合物質により被覆された判定部と、粒子を保持し
た粒子保持部とを有している、請求項１０又は１１に記
載の試料中の被検物質の測定器具。
【請求項１４】前記被検物質が抗原であり、前記特異
的結合物質が抗体である、請求項１０〜１３のいずれか
１項に記載の試料中の被検物質の測定器具。
【請求項１５】前記被検物質が抗体であり、前記特異
的結合物質が抗原である、請求項１０〜１３のいずれか
１項に記載の試料中の被検物質の測定器具。
【請求項１６】判定部に固定された特異的結合物質
が、担体の表面上のみに固定されたものである、請求項
１０〜１５のいずれか１項に記載の試料中の被検物質の
測定器具。
【請求項１７】担体が非吸水性の材質よりなるもので
ある、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の試料中
の被検物質の測定器具。