JPH1132767A - 組み換え型核内レセプター結合タンパク質を用いた核内レセプターの検出方法、およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 簡便かつ特異的に核内受容体とリガンドとの
複合体、特定のリガンドに結合する核内受容体、または
特定の核内受容体に結合するリガンドをスクリーニング
する方法、簡便かつ特異的に被検低分子化合物が核内受
容体のリガンドであるか否かを検査する方法、およびこ
れらスクリーニングまたは検査に有用なタンパク質を提
供することを課題とする。 【解決手段】 核内受容体と結合するコアクチベーター
分子内において、核内受容体とそのリガンドが結合した
場合にのみ、その複合体に結合しうる特定の領域を同定
し、この領域を組み込んだ組み換えタンパク質を単離し
た。さらに単離したタンパク質との結合を指標として、
簡便かつ特異的に核内受容体とリガンドとの複合体、特
定のリガンドに結合する核内受容体、または特定の核内
受容体に結合するリガンドをスクリーニングすること、
および被検低分子化合物が核内受容体のリガンドである
か否かを検査することを可能にした。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、リガンドの存在に
依存して核内受容体と結合するタンパク質、該タンパク
質を用いた核内受容体、リガンド、またはこれらの複合
体のスクリーニング方法、該方法により単離しうる核内
受容体、リガンド、またはこれらの複合体、並びに該タ
ンパク質を用いた被検低分子化合物が核内受容体のリガ
ンドであるか否かを検査する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】脂溶性ホルモンや活性型ビタミンＤ、レ
チノイン酸など生体内で生物活性を持つ低分子物質の多
くは、細胞内に存在する核内受容体と総称されるタンパ
ク質を通じて生体の機能を調節している。これらの核内
受容体タンパク質の多くは、リガンドとなる低分子物質
と複合体を形成することにより、遺伝子の転写を調節す
る転写因子としての機能を発揮する。低分子のリガンド
が直接核内受容体タンパク質の転写因子活性を制御する
ため、核内受容体のアゴニスト、アンタゴニストとなる
低分子化合物は生体に対して様々な薬理作用を有する。
例えば、L-チロキシン、L-トリヨードチロニン等に代表
される甲状腺ホルモン受容体アゴニストはクレチン病や
粘液水腫、単純性甲状腺腫などの甲状腺機能低下症の治
療薬として有効である。コルチゾール、デキサメサゾ
ン、プレドニゾロン等に代表されるグルココルチコイド
受容体アゴニストは原発性又は二次性の副腎不全症や関
節炎、リウマチ性心臓炎、急性または慢性の糸球体腎
炎、膠原病、アレルギー疾患、気管支喘息などの治療薬
として有効である。テステステロン等に代表されるアン
ドロゲン受容体アゴニストは睾丸機能低下症に、またシ
プロテロンアセテートに代表されるアンドロゲン受容体
アンタゴニストは前立腺肥大症や前立腺腫瘍の治療薬と
して有効である。安息香酸エストラジオールや吉草酸エ
ストラジオール等に代表されるエストロゲン受容体アゴ
ニストは無月経、無排卵周期症、月経周期異常、更年期
障害、閉経期後骨粗鬆症等の治療薬として、またクロミ
フェンに代表されるエストロゲン受容体アンタゴニスト
は乳癌の治療薬として有効である。ビタミンD2やビタミ
ンD3等に代表されるビタミンD受容体アゴニストはくる
病、骨軟化症、骨脆弱症、テタニーの予防及び治療薬と
して有効である。レチノール、全トランスレチノイン酸
等に代表されるレチノイン酸受容体のアゴニストはビタ
ミンA欠乏症や皮膚病の治療薬として有効である（ギル
マン・エー(Gilman A.)ら,The Pharmacological Basis
of Therapeutics Pergamon Press Inc.（ニューヨー
ク）第8版(1990年)、高木敬次郎,小澤光編 薬物学 南山
堂 縮刷版(1987年)）。従って現在まで既知の核内受容
体のアゴニスト、アンタゴニストを探索する試みに多大
の努力が払われていると同時に、未知の核内受容体を発
見しようとする試みが様々な手法を用いて行われてき
た。また一部の核内受容体の作用は細胞の癌化や分化、
脱分化に関わる他、その異常が病態に関わるものも知ら
れており、そのために特定の組織・器官における既知の
核内受容体の存在を簡便に検出する方法が診断の面から
必要とされている。

【０００３】核内受容体にはDNAに結合する分子内領
域、およびリガンドに結合する分子内領域に比較的共通
するアミノ酸配列がそれぞれ存在する。従来この領域の
アミノ酸配列の類似性を利用して、ポリメラーゼ・チェ
ーン・リアクション(polymerase Chain Reaction:以
下、PCRと略称する)法、あるいはハイブリダイゼーショ
ン法によって新規の核内受容体タンパク質をコードする
DNAの探索や、既知核内受容体の検出が行われていた（B
ecker-Andre-M;Andre-E;DeLamarter-JF,Biochem-Biophy
s-Res-Commun.(1993年) 194巻3号 1371-9頁、Petkovich
-M;Brand-NJ;Krust-A;Chambon-P,Nature.(1987年) 330
巻 444-50頁、Mangelsdorf-DJ;Ong-ES;Dyck-JA;Evans-R
M,Nature.(1990年) 345巻 224-9頁）。これらの方法で
これまでに構造の類似性から核内受容体であると予想さ
れる数多くのタンパク質をコードする遺伝子が発見され
報告されているが、その中には、その生体内リガンドが
不明なオーファン受容体が数多く含まれていた。さら
に、その一部には、これまで薬剤としての生物活性が知
られながらその標的因子が不明であった化合物が、その
アゴニスト・アンタゴニストとして作用する受容体であ
ることが判明したものがある。すなわち、最近になっ
て、これまでそのリガンドが不明であったオーファン核
内受容体のうちの一つ、ペルオキシソームプロリファレ
ーターアクチベーテットレセプターガンマー（PPARγ）
のアゴニストであることが判明したチアゾリジン系薬剤
のトログリタゾンが、インスリン抵抗性糖尿病治療薬と
して有効であることが明らかとなった（小林正 ダイア
ベーテスフロンティア(Diabetes Frontier) 7巻 (1996
年)）。このように、現在、生物活性が知られながら未
だその標的分子が判明していない薬剤・化合物の中には
未知の核内受容体のリガンドとして作用するものが相当
数存在する可能性がある。しかしこれら薬剤・化合物か
ら、直接その標的となる核内受容体を検出する方法は現
在まで存在しなかった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、簡便かつ特
異的に核内受容体とリガンドとの複合体、特定のリガン
ドに結合する核内受容体、または特定の核内受容体に結
合するリガンドをスクリーニングする方法、簡便かつ特
異的に被検低分子化合物が核内受容体のリガンドである
か否かを検査する方法、およびこれらスクリーニングま
たは検査に有用なタンパク質を提供することを課題とす
る。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究を重ねた結果、核内受容体と
結合するコアクチベーター分子内において、核内受容体
とそのリガンドが結合した場合にのみ、その複合体に結
合しうる特定の領域を同定し、この領域を組み込んだ組
み換えタンパク質を単離することに成功した。さらに本
発明者らは該タンパク質との結合を指標とする、簡便か
つ特異的に核内受容体とリガンドとの複合体、特定のリ
ガンドに結合する核内受容体、または特定の核内受容体
に結合するリガンドをスクリーニングする方法、さらに
は簡便かつ特異的に被検低分子化合物が核内受容体のリ
ガンドであるか否かを検査する方法を確立することに成
功した。

【０００６】具体的には、これまでのコアクチベーター
はいずれも核内受容体群とリガンドの存在に依存して結
合する性質が知られ、それぞれ核内受容体と結合する分
子内領域の存在が報告されていた（BW.O'Malley, Keyst
one Symposium, S2, California, 3/17-23, 1996, Cava
illes.V et al. The EMBO-J, Vol 14, pp3741-3751,199
5, Kamei. Y et al. Cell, Vol.85, pp403-414, 199
6）。しかしながらこれらの核内受容体結合領域は、追
試ができなかったり研究者間で異なる結果が報告され、
統一した見解が得られていなかった。その原因として、
コファクターの分子内には核内受容体とリガンドの存在
に依存して結合する領域とリガンドの存在に依存せずに
結合する領域がそれぞれ存在し、この両者が混同されて
いたためコファクターのリガンド依存核内受容体結合領
域が確定できなかったことが予想された。そこで本発明
者らはSRC-1、p300、RIP140の各分子中で核内受容体と
リガンドの存在に依存して結合する領域を独自に確定し
た。すなわち（図１）に示すヒトSRC-1タンパク質、ヒ
トp300タンパク質、ヒトRIP140タンパク質をコードする
cDNAの断片を、ヒト乳癌由来の培養細胞であるMCF-7細
胞より抽出したcDNAのライブラリー中からPCR法によっ
て増幅し、プラスミドベクターにサブクローニングし
た。これらのcDNA断片を真核生物細胞中および酵母細胞
中で異なる二種類のタンパク質の結合の有無を調べるこ
とが出来る市販のtwo-hybrid system（クロンテック社
製）に用いる発現プラスミドに挿入し、その発現によっ
て形成される組み換えタンパク質が、それぞれ核内受容
体と結合することを調べた結果、図１に示すアミノ酸配
列をコードするcDNAを発現させて出来る組み換えタンパ
ク質は、エストロゲンのアゴニスト活性を示す低分子化
合物の存在下でエストロジェン受容体（estrogen recep
tor; 以下ERと略称する）と結合することを見出した。
このリガンド依存核内受容体結合領域をコードするcDNA
断片を用いることにより、コファクタータンパク質の全
長領域を用る場合に発生する巨大タンパク質発現の困難
さ、および分子内のリガンド非依存的核内受容体結合領
域によるリガンド依存した核内受容体の検出に対する干
渉の回避を可能とした。すなわち該cDNA断片をアフィニ
ティーカラム等により簡便に精製が可能なポリペプチド
よりなるタグをコードするDNAの下流に上記の該タンパ
ク質部分が翻訳されるようにつなぎ目を合わせて挿入
し、これで大腸菌を形質転換して、バクテリア細胞内で
発現させたところ、該タンパク質の効率よい発現が認め
られ、これらはタグのアフィニティーにより容易に精製
が可能であった。精製した該タンパク質は、エストロゲ
ンを添加して放射線標識した乳腺由来細胞の抽出液と共
培養すると、ERが結合して共沈することが、電気泳動に
よる分離とオートラジオグラフおよび抗体標識法（ウエ
スタンブロッティング法）により認められた（図3,
4）。これにより本発明者等は、これらのタンパク質
が、リガンドと複合体を形成した核内受容体を選択的に
単離するためのプローブとして有用であることを見いだ
した。さらに、本発明者らは、このようなタンパク質の
特性を利用すれば、特定の核内受容体に結合するリガン
ドや特定のリガンドに結合する核内受容体のスクリーニ
ング、さらには被検低分子化合物が核内受容体のリガン
ドとして作用するか否かの検査を行うことが可能である
ことを見いだした。

【０００７】即ち、本発明は、リガンドの存在に依存し
て核内受容体と結合するタンパク質、該タンパク質を用
いた核内受容体、リガンド、またはこれらの複合体のス
クリーニング方法、該方法により単離しうる核内受容
体、リガンド、またはこれらの複合体、並びに該タンパ
ク質を用いた被検低分子化合物が核内受容体のリガンド
であるか否かを検査する方法に関し、より具体的には、
（１） リガンドの存在に依存して核内受容体と結合す
るタンパク質、（２） 核内受容体のコアクチベーター
に由来する、（１）に記載のタンパク質、（３） 配列
番号：１乃至３のいずれかに記載のアミノ酸配列、また
は該アミノ酸配列中のアミノ酸が置換、欠失、もしくは
付加したアミノ酸配列を含む、（１）に記載のタンパク
質、（４） 請求項１乃至３のいずれかに記載のタンパ
ク質と標識とが融合したタンパク質、（５） 標識がグ
ルタチオン S-トランスフェラーゼである、（４）に記
載のタンパク質、（６） （１）乃至（５）のいずれか
に記載のタンパク質をコードするDNA、（７） （６）
に記載のDNAを含むベクター、（８） （７）に記載の
ベクターで形質転換された細胞、（９） （８）に記載
の細胞を培養する工程を含む、（１）乃至（５）のいず
れかに記載のタンパク質の製造方法、（１０） 核内受
容体とリガンドとの複合体のスクリーニング方法であっ
て、（Ａ）（１）乃至（５）のいずれかに記載のタンパ
ク質と生物学的試料とを作用させる工程、（Ｂ）（１）
乃至（５）のいずれかに記載のタンパク質、核内受容
体、およびリガンドを含む複合体を単離する工程、を含
む方法、（１１） 特定のリガンドに結合する核内受容
体のスクリーニング方法であって、（Ａ）特定のリガン
ドの存在下で（１）乃至（５）のいずれかに記載のタン
パク質と生物学的試料とを作用させる工程、（Ｂ）
（１）乃至（５）のいずれかに記載のタンパク質、核内
受容体、および該特定リガンドを含む複合体を単離する
工程、を含む方法、（１２） 特定の核内受容体に結合
するリガンドのスクリーニング方法であって、（Ａ）特
定の核内受容体の存在下で請求項１乃至５のいずれかに
記載のタンパク質と生物学的試料とを作用させる工程、
（Ｂ）（１）乃至（５）のいずれかに記載のタンパク
質、該特定の核内受容体、およびリガンドを含む複合体
を単離する工程、を含む方法、（１３） 特定の核内受
容体に結合するリガンドのスクリーニング方法であっ
て、（Ａ）被検低分子化合物の存在下で（１）乃至
（５）のいずれかに記載のタンパク質と特定の核内受容
体とを作用させる工程、（Ｂ）（１）乃至（５）のいず
れかに記載のタンパク質と特定の核内受容体とを結合さ
せる能力を有する被検低分子化合物を選択する工程、を
含む方法、（１４） 被検低分子化合物が核内受容体の
リガンドであるか否かを検査する方法であって、（Ａ）
被検低分子化合物の存在下で（１）乃至（５）のいずれ
かに記載のタンパク質と生物学的試料とを作用させる工
程、（Ｂ）（１）乃至（５）のいずれかに記載のタンパ
ク質と被検低分子化合物の存在下で結合する生物学的試
料中のタンパク質の存在を検出する工程、を含む方法、
（１５） 被検低分子化合物が特定の核内受容体に結合
するリガンドであるか否かを検査する方法であって、
（Ａ）被検低分子化合物の存在下で（１）乃至（５）の
いずれかに記載のタンパク質と特定の核内受容体とを作
用させる工程、（Ｂ）（１）乃至（５）のいずれかに記
載のタンパク質の特定の核内受容体への結合を検出する
工程、を含む方法、（１６） （１０）に記載の方法に
より単離しうる核内受容体とリガンドとの複合体、また
は該複合体を構成する核内受容体もしくはリガンド、
（１７） （１１）に記載の方法により単離しうる核内
受容体、（１８） （１２）または（１３）に記載の方
法により単離しうるリガンド、に関する。

【０００８】なお、本発明において「核内受容体（N
R）」とは、ステロイドホルモン、甲状腺ホルモン、ビ
タミンＡ、ビタミンＤなどの脂溶性生理活性物質をリガ
ンドとする受容体群、および該受容体群と互いに構造が
類似したリガンド誘導性あるいは発現量依存性の転写調
節因子であり、標的遺伝子プロモーター内の標的配列に
直接あるいは間接的に結合して遺伝子発現の転写を制御
するタンパク質を指す。また、本発明において「リガン
ド」とは、核内受容体と結合し、結合した核内受容体の
転写因子活性を調節できる分子群を指し、天然に存在す
るものに限られず、人工的に合成されるものも含まれ
る。さらに本発明において「コアクチベーター」とは、
核内受容体と結合し、リガンドの存在に依存して結合し
た核内受容体の転写因子活性を促進するタンパク質分子
をを指す。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明は、リガンドの存在に依存
して核内受容体と結合するタンパク質に関する。ここで
「リガンドの存在に依存して核内受容体と結合する」と
は、リガンドの存在下において核内受容体と結合し、リ
ガンドの非存在下では核内受容体と結合しない（または
結合能が低い）ことを指す。

【００１０】本発明のタンパク質は、好ましくは核内受
容体のコアクチベーターに由来する。本発明のタンパク
質を調製するために用いられる核内受容体のコアクチベ
ーターとしては、例えば、SRC-1(Science270,135-1357,
1995, Endocrinology137,3594-3597,1996), TIF2 / GRI
P1(EMBO J.15,101-108,1996, Proc.Natl. Acad.Sci.USA
93,4948-4952), p/CIP(Nature 387,677-684,1997), CB
P (Cell 85,403-414,1996), p300(Proc.Natl.Acad,Sci.
USA 93,11540-11545,1996) RIP140(EMBO J.14,3741-375
1,1995) が挙げられるが、広範囲の核内受容体に対して
コアクチベーターとして機能する点で、特にSRC-1, RIP
140, p300などが好適である。

【００１１】核内受容体のコアクチベーターに由来する
本発明のタンパク質としては、例えば、SRC-1の384乃至
782番目のアミノ酸配列（配列番号：１に記載のアミノ
酸配列）からなるタンパク質、RIP140の637乃至1158番
目のアミノ酸配列（配列番号：２に記載のアミノ酸配
列）からなるタンパク質、p300の1乃至567番目のアミノ
酸配列（配列番号：３に記載のアミノ酸配列）からなる
タンパク質が挙げられる。また、SRC-1と高い相同性を
有するTIF2/GRIP1の390乃至790番目のアミノ酸配列、お
よびp300と高い相同性を有するCBPの1乃至570番目のア
ミノ酸配列からなるタンパク質も同様に用いることが可
能である。なお、本発明のタンパク質のアミノ酸配列
は、リガンドの存在に依存して核内受容体と結合する活
性を有する限り、天然型タンパク質のアミノ酸配列と同
一である必要はなく、アミノ酸が置換、欠失、もしくは
付加されていてもよい。当業者であれば、公知の方法、
例えば、部位特異的突然変異誘発法 (Gene8,81-97,197
9, Methods in Enzymol 100,457-468,1983, Proc.Natl.
Acad,Sci.USA 79,7258-7262, 1982, Nature 328,731-73
4,1987)、点突然変異誘起法（Methods in Enzymol 154,
350-382,1987, Gene 34,315-323,1985）あるいはPCR法
を用いてこのようなアミノ酸配列の改変を行うことがで
きる。変異させるアミノ酸数は、通常は、50アミノ酸以
内であり、好ましくは10アミノ酸以内であり、さらに好
ましくは5アミノ酸以内である。

【００１２】本発明のタンパク質は、後述する核内受容
体、リガンド、もしくはその複合体のスクリーニング、
被検低分子化合物がリガンドであるか否かの検査などに
用いる場合には、必要に応じて標識との融合タンパク質
として調製される。標識としては、タンパク質の精製を
容易にするものであれば特に制限はなく、例えば、グル
タチオン S-トランスフェラーゼ、ヒスチジンクラスタ
ー, Flag, マルトース結合タンパク質（MBP）、プロテ
インAなどが好適に用いられる。

【００１３】また、本発明は、上記本発明のタンパク質
をコードするDNAに関する。本発明のタンパク質をコー
ドするDNAは、cDNAでも、ゲノムDNAでもよく、また合成
DNAであってもよい。本発明のDNAは、例えば、本発明の
タンパク質を組み換えタンパク質として生産するために
利用しうる。即ち、本発明のタンパク質をコードするDN
A（例えば、配列番号：４乃至６に記載のDNA）を適当な
発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な細胞に導入
して得た形質転換体を培養し、発現させタンパク質を精
製することにより本発明のタンパク質を組み換えタンパ
ク質として調製することが可能である。

【００１４】組み換えタンパク質の製造に用いる細胞と
しては、例えば、大腸菌、出芽酵母、昆虫細胞、動物細
胞が挙げられる。これらの具体例としては、大腸菌株で
はJM109, JM105, DH1, DH5, HB101, XL1-Blue, BL21, C
600などが用いられる。出芽酵母ではAH22, AH22Rなどが
用いられる。培養昆虫細胞株ではSF9, SF21, Tn5など
が、培養動物細胞ではCOS-1, CV-1, NIH3T3, CHO, A293
などが用いられる。また細胞内で組み換えタンパク質を
発現させるためのベクターとしては、宿主が大腸菌の場
合はpET（ストラタジーン社製）pLEX（インビトロジェ
ン社製） pKK233-3(ファルマシア社製)などが、酵母の
場合はpYEUra3（クロンテック社製）が、昆虫細胞の場
合はAcNPV（インビトロジェン社製）, pBacPAK, pAcUW3
1（クロンテック社製）が、動物細胞ではpSG5(ストラタ
ジーン社製), pMSG(ファルマシア社製) pDR（クロンテ
ック社製 ）, pREP（インビトロジェン社製）などがそ
れぞれ挙げられる。本発明のタンパク質を標識との融合
タンパク質として調整する場合には、宿主が大腸菌であ
れば市販の融合タンパク質発現プラスミド、例えば、pR
SET, pTrcHis、pTrxFus（インビトロジェン社製）pMAL
（ニューイングランドバイオラボ社製）pGEX, pRIT2T
(ファルマシア社製)などを利用することができる。同じ
く昆虫細胞であればpBacPAK-His（クロンテック社製）
を、動物細胞であればpEBVHis（インビトロジェン社
製）を利用することができる。組み換えタンパク質の生
産は、細胞を宿主として用いる方法以外に、上記の大腸
菌を宿主とする場合に用いる発現プラスミドと細胞抽出
液からなる試験管内転写・翻訳システム（プロメガ社
製）を用いることにより、宿主を介さずに行うことも可
能である。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、大
腸菌へは塩化カルシウム法、塩化ルビジウム法、あるい
は電気穿孔法などを用いて行うことができる。出芽酵母
へはリチウム法、スフェロプラスト法あるいは電気穿孔
法を用いて行うことができる。培養昆虫細胞・動物細胞
にはリン酸カルシウム法、DEAE-Dextran法あるいはリポ
フェクション法を用いて行うことができる（バイオマニ
ュアルシリーズ４、遺伝子導入と発現・解析法 横田崇
新井賢一編 羊土社）。

【００１５】得られた形質転換体からの組み換えタンパ
ク質の精製は、タンパク質の性質に応じ、例えば、分子
ふるいクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフ
ィー、疎水クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィ
ー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマト
グラフィー、硫安沈殿法、有機溶媒沈殿法、トリクロロ
酢酸沈殿法、電気泳動法などの方法を必要に応じて適宜
組み合わせて行うことができる。本発明のタンパク質を
標識との融合タンパク質として発現させた場合には、該
標識に対するアフィニティービーズあるいは特異的抗体
などを用いて容易に精製を行うことが可能である。

【００１６】本発明のタンパク質は、リガンドの存在に
依存して核内受容体に結合する性質を有するため、特
に、核内受容体およびリガンドの単離に有用である。単
離される核内受容体およびリガンドは、当該の核内受容
体あるいはリガンドを含有すると推定される培養細胞・
動物臓器の破砕液などの生物学的試料から精製し、単離
することができる。精製は、通常、リガンドが結合した
核内受容体と本発明のタンパク質との高い親和性（アフ
ィニティー）を利用した方法により行われる。このよう
な方法としては、例えば、前述の生物学的試料と本発明
のタンパク質とを混合し、本発明のタンパク質を特異的
に吸着する担体を利用して本発明のタンパク質とリガン
ドが結合した核内受容体との複合体を効率的に濃縮する
方法が挙げられる。より具体的には、特異的に吸着する
担体として、GST融合タンパク質として発現させた場合
にはグルタチオンを有効成分とする高分子担体、His融
合タンパク質として発現させた場合にはNiをはじめとす
る金属イオンを有効成分とする高分子担体、MBP融合タ
ンパク質して発現させた場合にはマルトースを有効成分
とする高分子担体、チオレドキシン融合タンパク質して
発現させた場合にはフェニルアルシンを有効成分とする
高分子担体、核内受容体が結合するDNA配列が明らかな
場合にはその配列を有するDNA断片を有効成分とする高
分子担体、さらにリガンドあるいは標識配列または発現
ベクターに挿入した配列がコードするタンパク質を特異
的に認識する抗体を有効成分とする高分子担体、等が考
えられる。また抗体を用いた場合には、抗体に対するプ
ロテインＡあるいはプロテインGなどの特異的な認識を
利用して、高分子担体を用いずに複合体を濃縮する方法
も考えられる。

【００１７】上記の方法あるいはそれと類似の方法によ
って濃縮された本発明のタンパク質とリガンドが結合し
た核内受容体との複合体から、分子ふるいクロマトグラ
フィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマト
グラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグ
ラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、硫安沈
殿法、有機溶媒沈殿法、トリクロロ酢酸沈殿法、電気泳
動法等の方法を組み合わせることによって、複合体に含
まれる核内受容体およびリガンドを純化する。

【００１８】これにより調製されるリガンドおよび核内
受容体は、本発明のタンパク質の性質（例えば、由来す
るコアクチベーターの種類）に応じて変動しうる。即
ち、本発明のタンパク質の由来として、広範囲の核内受
容体との結合が知られているコアクチベーターを用いれ
ば、種々の核内受容体およびリガンドを単離することが
でき、一方、特定の核内受容体に対し特異性の高いコア
クチベーターを用いれば、該特定の核内受容体およびそ
のリガンドを単離しうる。なお、単離された核内受容体
は、エドマン分解法、あるいは質量分析法により、その
アミノ酸配列を決定できる(岩松明彦 細胞工学 16巻2
号 269-281頁 1997年)。さらにそのアミノ酸配列情報
からPCR法、およびハイブリダイゼーション法により該
核内受容体をコードする遺伝子の塩基配列を決定するこ
とができる。より具体的には、該核内受容体そのもの、
あるいはそれをタンパク質分解酵素やシアノーゲンブロ
マイドにより断片化した試料を、エドマン分解してペプ
チドシークエンサーにより解析する、あるいは質量分析
器によって解析することによりアミノ酸配列を決定でき
る。得られた部分アミノ酸配列から予想される遺伝子の
塩基配列の一部と相補なオリゴヌルレオチドを合成し、
これをプライマーとして該核内受容体を含む細胞由来の
DNA中からPCR法により該核内受容体遺伝子の部分断片を
増幅させ取得する。さらにこの遺伝子断片をプローブと
して、ハイブリダイゼーション法により遺伝子ライブラ
リー中から該核内受容体遺伝子の全長域を取得できると
同時に、自体自明の方法によりその塩基配列を決定する
ことができる(竹縄忠臣、稲垣昌樹 編 バイオマニュ
アルシリーズ7 分子生物学研究のためのタンパク実験
法1994年 羊土社)。また単離されたリガンドは、核磁
気共鳴法(NMR)、質量分析法、赤外線吸収スペクトル
法、元素分析法を用いることにより、その構造を決定す
ることができる。さらに単離されたリガンドがタンパク
質である場合には、上記の方法に加えてエックス線結晶
解析法や先述したペプチドシークエンサーによる解析に
より、その構造を決定することができる(Silverstein-R
M;Bassler-GC;Morrill-TC,(荒木峻,益子洋一郎,山本修
訳) 有機化合物のスペクトルによる同定法 第4版
東京化学同人(1983年)、後藤俊夫,芝哲夫,松浦輝男 監
修 有機化学実験のてびき2 化学同人(1989年))。

【００１９】また、上記単離を特定のリガンドを用いて
行えば、用いた特定のリガンドに結合する核内受容体を
生物学的試料から選択的に単離することが可能である。
この場合、用いる本発明のタンパク質としては、広範囲
の核内受容体との結合能を有するものが好ましい。この
単離方法において、特に薬理効果がすでに解明されてい
るリガンドを用いれば、当該薬理効果を得るためのター
ゲットを明らかにできるという点で有用である。

【００２０】一方、上記単離を特定の核内受容体を用い
て行えば、用いた特定の核内受容体に結合するリガンド
を生物学的試料から選択的に単離することが可能であ
る。この場合、用いる本発明のタンパク質としては、該
特定の核内受容体との結合能を有するものであれば特に
制限はない。この単離方法は、生体内リガンドが不明な
核内受容体（オーファン受容体）に結合する生体内リガ
ンドの検索に特に有用である。

【００２１】本発明のタンパク質を用いればこのような
生物学的試料中に存在する生体内リガンドの検索のみな
らず、被検低分子化合物、例えば、ケミカルライブラリ
ーから特定の核内受容体に結合するリガンドを検索する
ことも可能である。即ち、被検低分子化合物の存在下で
本発明のタンパク質と特定の核内受容体とを作用させ、
本発明のタンパク質と特定の核内受容体とを結合させる
能力を有する被検低分子化合物を選択することにより、
該特定の核内受容体に結合するリガンドを単離しうる。
ケミカルライブラリーは、例えば、化合物データベース
であるエム・ディー・エル インフォメーション・システ
ム(MDL Information System)社のアベイラブル・ケミカ
ルズ・ディレクトリー(Available Chemicals Directory)
を利用してアルドリッチ・ケミカル(Aldrich Chemical)
社、バイエル・エー・ジー(Bayer AG)社、カルビオケム-
ノババイオケム(Calbiochem-Novabiochem)社、デュポン
(Dupont)社、ヤンセン・ケミカ(Janssen Chimica)社、シ
グマ・ケミカル(Sigma Chemical)社、住友ケミカル(Sumi
tomo Chemical)社等から化合物を購入することにより作
成できる。また、コンビナトリアルケミストリー法を用
いて多数の化合物を合成しケミカルライブラリーを作成
することも可能である(コンビナトリアルケミストリー
研究会編,コンビナトリアルケミストリー入門から応用
まで,化学同人(1997年))。

【００２２】また、本発明のタンパク質は被検低分子化
合物が核内受容体のリガンドであるか否かを検査するた
めに用いられる。１つの態様は、特定の被検低分子化合
物、好ましくは、リガンドである可能性がある化合物の
存在下で本発明のタンパク質と生物学的試料を作用さ
せ、本発明のタンパク質に結合する生物学的試料中のタ
ンパク質の検出を行う。この結果、生物学的試料中に本
発明のタンパク質に結合するタンパク質が検出されれ
ば、該タンパク質は核内受容体であると推定され、か
つ、用いた被検低分子化合物は検出されたタンパク質
（核内受容体）のリガンドであると推定することができ
る。一方、本発明のタンパク質と結合するタンパク質が
検出されなければ、被検低分子化合物は生物学的試料中
に含まれる核内受容体に結合しないと推定することがで
きる。

【００２３】被検低分子化合物の存在下で本発明のタン
パク質に結合する生物学的試料中のタンパク質を検出す
る方法として、電気泳動法による分離とタンパク質の染
色あるいは放射線標識を組み合わせた方法が挙げられ
る。より具体的には、培養細胞や組織から調製した細胞
抽出液を、被検低分子化合物の存在下で本発明のタンパ
ク質と反応させて形成させた複合体を、本発明のタンパ
ク質中のタグのアフィニティーを利用して精製した後、
エス・ディー・エス(SDS)電気泳動によりポリアクリルア
ミドゲル上に展開して、これを銀染色法、クーマジー・
ブリリアント・ブルー染色法、カッパーステインまたは
シプロオレンジ染色法（バイオラッド社製）などの方法
を用いて染色することにより本発明のタンパク質に結合
するタンパク質を検出できる。あるいは[³⁵S]メチオニ
ン、[³⁵S]システイン等を用いて予め培養細胞や組織中
のタンパク質を放射線標識した試料から調製した細胞抽
出液を用いて、上記と同様の実験を行い得られたポリア
クリルアミドゲルをオートラジオグラフィー法により解
析することにより、本発明のタンパク質に結合するタン
パク質を検出できる。

【００２４】他の一つの態様は、被検低分子化合物の存
在下で、本発明のタンパク質と特定の核内受容体を作用
させ、本発明のタンパク質と核内受容体との被検低分子
化合物の存在に依存した結合の検出を行う。この結果、
核内受容体と本発明のタンパク質との結合が検出されれ
ば、被検低分子化合物は該特定の核内受容体のリガンド
であると推定される。

【００２５】被検低分子化合物の存在下で、核内受容体
と本発明のタンパク質との結合を検出する具体的な方法
としては、放射標識した核内受容体を利用して本発明の
タンパク質と結合した該核内受容体をオートラジオグラ
フィーあるいはシンチレーション計測法で検出する方法
が挙げられる。また核内受容体に対する抗体を用いて本
発明のタンパク質と結合した該核内受容体を検出する方
法、あるいは酵母細胞または動物細胞内に核内受容体と
本発明のタンパク質の組み換え体を共発現させて両タン
パク質の相互作用をツーハイブリッド法（クロンテック
社製）で検出する方法、BIACORE（ファルマシア社製）
を利用して両タンパク質の相互作用を検出する方法が挙
げられる。

【００２６】

【実施例】以下の参考例および実施例により本発明をよ
り具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるも
のではない。

【００２７】[参考例] 組み換え型ヒトSRC-1, ヒトp30
0, ヒトRIP140タンパク質の製造 （１） MCF7細胞の培養とｍRNAの調整 MCF-7細胞（ATCC HTB22）は10%牛胎児血清（シグマ社
製）を含む最少必須培地（ギブコ社製）中で直径150mm
の培養皿（2枚）にコンフルエントの状態に近くなるま
で培養した。 培地を除去し、さらに細胞をリン酸緩衝
液（以下PBSと略称する）で洗浄した後に培養皿１枚あ
たり2.5mlの細胞溶解液を添加して細胞を溶解した。細
胞溶解液の組成は、4Mグアニジンチオシアネート／18ｍ
Ｍクエン酸ナトリウム（pH7.0）／0.5%ザルコシル／0.1
M２―メルカプトエタノールであり、使用直前に滅菌濾
過した。細胞溶解液を氷冷し、18Gの注射針を数回通す
ことで高分子DNAを細断した。そして0.1容の2M酢酸ナト
リウム溶液（pH4.0）、1容の水飽和フェノール、0.2容
のクロロホルム／イソアミルアルコ−ル混液（49:1）を
順に加え、激しく振り混ぜてから氷上に15分間静置し
た。この溶液を4℃、10,000gで20分間遠心分離し、上層
を別の容器に移した。その溶液に等容の２-プロパノー
ルを加えて静かに振り混ぜ、-20℃に一昼夜静置した。
次にこの溶液を4℃、10,000gで20分間遠心分離した際生
じた沈殿を先程の組成の細胞溶解液0.5mlに溶かした。
その溶液に等容の２-プロパノールを加えて静かに振り
混ぜ、-20℃に一昼夜以上静置した。次にこの溶液を4
℃、10,000gで20分間遠心分離した際生じた沈殿を1mlの
10mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5）／1mMエチレンジアミン
四酢酸溶液（以下TE溶液と略称する）に溶かした。この
溶液を65℃に5分間加温した後に直ちに氷冷し、3M塩化
ナトリウムを含むTE溶液0.2mlを加えた。この溶液を、
あらかじめ0.5Mの塩化ナトリウムを含むTE溶液で平衡化
したオリゴｄＴセルロース（ファルマシア社製）と静か
に混合した。この懸濁液を室温、350gで2分間遠心して
オリゴｄＴセルロースを分離した。このオリゴｄＴセル
ロースに1mlの0.5Mの塩化ナトリウムを含むTE溶液を加
えて静かに混合し、室温、350gで2分間遠心してオリゴ
ｄＴセルロースを再分離した。この操作を2回行い、次
に1mlの0.2Mの塩化ナトリウムを含むTE溶液を用いて同
様の操作を3回行った。3回目の遠心分離に際して、オリ
ゴｄＴセルロースの懸濁液を小カラムに充填した。次に
65℃に加温したTE溶液0.25mlをオリゴｄＴセルロースの
カラムに重層し、室温、350gで2分間遠心して溶出液を
回収した。同様の操作を計4回行った。４回分の溶出液
を1本の容器にまとめて、0.05容の5M塩化ナトリウム溶
液と2.5容のエタノールを加えて静かに混合し、-20℃に
一昼夜以上静置した。この方法によってMCF-7細胞から6
7μgのmRNAを得た。 （２）単鎖DNAの合成 上記（１）で得たmRNAから逆転写酵素を用いて、自体公
知の方法で単鎖DNAを合成した。すなわち、市販の単鎖D
NA合成キット（クロンテック社製, Advantage^TMRT-for-
PCR Kit）を用いて上記（１）で得たMCF-7由来のmRNA
0.5μgに添付の20 pmolランダムヘキサマープライマー
を加え13.5 μlの水溶液として70℃で2分静置した後、2
0 μlの50 mMトリス塩酸(pH8.3), 75mM塩化カリウム, 3
mM塩化マグネシウム, 0.5mMデオキシアデノシン三燐酸,
0.5mMデオキシグアノシン三燐酸, 0.5mMデオキシシチ
ジン三燐酸, 0.5mMデオキシチミジン三燐酸を含む溶液
中に溶解し、ここに 0.5 unitリボヌクレアーゼ阻害剤
および200unitの逆転写酵素を加えて42℃で1時間、94℃
で５分間逆転写反応を行った。反応後滅菌蒸留水を加え
て全量を100 μlとした後、-80℃で凍結保存した。 （３） ヒトSRC-1, ヒトp300, ヒトRIP140 cDNA部分断
片の取得（図１） 以下に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを市販
のDNA合成機（ベックマン社製）により合成した。以下
オリゴヌクレオチド上の塩基アデニン、グアニン、シト
シン、チミンはそれぞれA, G, C, Tと略記した。SRC-1
；5'-TTCCCGGGTCCCCGAGTAAATCCCTC-3'(配列番号：
７), SRC-1；CATGGATCCATCTGTTC-3'(配列番号：８),
RIP140；5'-TTGGATCCGCACAATGTGGAATGCAGTCATCCATGTC
AG-3'(配列番号：９), RIP140, 5'-GGGGATTCTGATTGTT
TCTTTATCGTTAGCACGCTTCC-3'(配列番号：１０), p300
；5'-TTCCCGGGGATGGGCGAGAATGTGG -3'(配列番号：１
１), p300；CGAGCATATGCAACTAGG-3'(配列番号：１
２)。これらのオリゴヌクレオチドのSRC-1,、RIP14
0,、p300,をそれぞれ組み合わせてプライマー
とし、上記（２）で得られた単鎖DNAを鋳型としてPCR法
によりSRC-1, RIP140, p300遺伝子の各部分断片を増幅
した。すなわち市販のキット(LA- PCRキット；宝酒造)
を用いて上記（２）で得られた単鎖DNA溶液の5 μlとプ
ライマーの各20 pmolを混合し、70℃で5分間静置した後
添付のポリメラーゼを加えて以下上記キットの指し示す
方法に従ってPCR反応を98℃ 20秒間、48℃ 2分間、72℃
10分間を30回繰り返すことにより実行した。反応によ
り増幅したSRC-1, RIP140, p300遺伝子の各部分断片を
アガロースゲル電気泳動法により分離し自体公知の方法
で精製した。 （４） 発現型プラスミドの製造（図２） 上記（３）で得られたSRC-1遺伝子断片は制限酵素Sma
I, BamH I（東洋紡社製）による切断を行ってその両端
を粘着末端とした後、市販のグルタチオンS-トランスフ
ェラーゼ(以下GSTと略記)融合タンパク質発現プラスミ
ドpGEX4T-1(ファルマシア社製)のSma I, BamH Iサイト
に市販のライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて
自体公知の方法で組み込んだ。同様の手法により、RIP1
40遺伝子断片はpGEX2T-1(ファルマシア社製)のBamH I,
Sma Iサイトに、p300遺伝子断片はpGEX2T-1のSma I, Ec
oR Iサイトにそれぞれ組み込んみ、図２に示す３種類の
GST融合コファクタータンパク質をコードする発現プラ
スミドを作成した。 （５） 大腸菌JM109株におけるヒトSRC-1, ヒトp300,
ヒトRIP140の部分断片とGST融合タンパク質の発現 上記４で作成したSRC-1,p300,RIP140遺伝子の部分断片
を組み込んだ各発現型プラスミドを用いて大腸菌JM109
を自体公知の方法で形質転換した。すなわち各発現型プ
ラスミドの0.2μgをコンピーテント状態の大腸菌JM109
（東洋紡社製）に添加して氷上で30分間静置した後、42
℃で90秒間処理し、再び氷上に静置した。L液体培地
（トリプトン 5 g/l, 酵母抽出粉2.5 g/l, 塩化ナトリ
ウム2.5 g/l）を0.5ml加えて37℃で１時間培養した後、
抗生物質であるアンピシリンを50 μg / ml含むL-寒天
培地（Ｌ-液体培地＋寒天1.2%）に展開し、37℃で18時
間静置して上記（４）で作成した発現型プラスミドで形
質転換された大腸菌のコロニーを得た。各形質転換細菌
コロニーの一つを滅菌した楊枝の先で掻き取り、アンピ
シリン7.5 μg / ml含む2.5 mlのL-液体培地に移して37
℃で8時間振盪培養した。その全量を400 mlのアンピシ
リン7.5 μg / ml含むＬ-液体培地に加えて37℃で3時間
振盪した後、イソプロピルベータチオガラクトシドを最
終濃度2.5mMになるように加えて組み換えタンパク質の
発現を誘導し、さらに27℃で6時間振盪培養した。増殖
した形質転換細菌は毎分6000回転の遠心分離によって集
菌し、マイナス20℃で凍結した。 （６） ヒトSRC-1, ヒトp300, ヒトRIP140の組み換えタ
ンパク質の精製 グルタチオンセファロース4Bの前処理 グルタチオンセファロース4Bビーズ(ファルマシア社製)
の非特異的なタンパク質吸着を抑えるため以下の措置を
施した。すなわち、緩衝液A(20mMトリス塩酸(pH7.5)／1
50mM塩化ナトリウム／10%グリセロール(v/v)／0.5%ノニ
デットP40(v/v)／0.055%2-メルカプトエタノール／1mM
エチレンジアミン4酢酸ナトリウム(以下EDTAと略記)／
0.1mM グリコールエーテルジアミン四酢酸(以下EGTAと
略記)／0.5mM フェニルメチルスルフォニルフルオライ
ド(以下PMSFと略記)) にて3回洗浄し、4%ウシ血清アル
ブミン(シグマ社製)を含む緩衝液A中にて4℃で30分イン
キュベートした。次にこれを緩衝液Aにて3回洗浄した
後、ビーズと等量の緩衝液Aを加えて懸濁液とした。

【００２８】GST融合コファクタータンパク質の精製 上記（５）で得られた大腸菌を室温で解凍した後、ノデ
ィエットP40を含まない緩衝液Aに懸濁し超音波破砕機
(クボタ社製)を用いて150ワットで10分間破砕した。ト
ライトンX-100を最終濃度1%になるように加え4℃にて1
時間振盪した後、毎分6000回転で遠心して沈殿する不溶
性画分を除去した。この上清に上記にて調製したグル
タチオンセファロース4Bビーズを添加し4℃にて30分間
振盪してグルタチオンセファロース4Bビーズに図２で示
すGST融合コファクタ−タンパク質を結合させ、遠心分
離にてビーズ画分を回収した。回収したビーズ画分を緩
衝液Ｂ(20mMトリス塩酸(pH7.5)／100mM塩化ナトリウム
／10%グリセロール(v/v)／0.5%ノディエットP40(v/v)／
0.055%2-メルカプトエタノール／1mM EDTA／0.1mM EGTA
／0.5mM PMSF)にて4回洗浄した後、ビーズと等量の緩衝
液Bにて懸濁したものをGST融合コファクタ−・グルタチ
オンセファロース4Bビーズ複合体懸濁液とした。

【００２９】[実施例] GST融合コファクタ−タンパク
質と核内受容体リガンドを用いた真核細胞抽出液からの
核内受容体の検出（図３、４） （１）放射線標識による検出 ヒト乳癌由来細胞MCF-7を10%の牛胎児血清（シグマ社
製）を含むダルベッコ改変イーグル培地15ml中で、直径
10cmシャーレ（ファルコンφ=100）の底面に面積比で80
%を細胞が占める状態に培養した。新鮮な培地7mlに交換
した後、 L-[³⁵S]メチオニン及びL-[³⁵S]システイン(ア
マシャム社製)をそれぞれ1.855MBq/ml及び0.795MBq/ml
になるように添加してさらに4時間培養した。培地を除
き、氷冷したリン酸緩衝食塩水(以後PBSと略称する)に
て2回洗浄した後、塩化ナトリウム濃度を120mMに変えた
緩衝液Aの1mlを添加して細胞を掻き取った後、数回のピ
ペッティングにより破砕した。そこから毎分15000回転
で5分間の遠心分離により不溶性画分を除去し、上清を
細胞抽出液とした。得られた細胞抽出液300μlに上記
で調製されたGST融合コファクタ−・グルタチオンセフ
ァロース4Bビーズ複合体懸濁液を30μl添加しさらにエ
ストロジェンを最終濃度10μMになるように添加して1時
間4℃にて振盪した。遠心分離によりGST融合コファクタ
−に結合したタンパク質をビーズ画分に共沈殿させ、上
清は吸引して除いた。ビーズ画分を核内受容体のリガン
ドとして10μMのエストロゲンを含む緩衝液Bで4回洗浄
した。得られたビーズ複合体に5μlの4倍濃縮タンパク
質電気泳動用緩衝液（500mMトリス塩酸／12% ラウレル
硫酸ナトリウム(以下SDSと略記)／60％グリセロール／
0.55M２-メルカプトエタノール／0.08％ ブロムフェノ
ールブルー）を添加して懸濁し100℃で2分間静置した
後、4-20%ポリアクリルアミドグラジエントゲル（第一
化学社製）を用いて電気泳動により含まれるタンパク質
を分離した。電気泳動終了後、ゲル上のタンパク質をニ
トロセルロース膜にブロッティング装置(バイオラッド)
を用いて転写した。膜上に固定されたMCF-7細胞由来の
タンパク質の位置を、その放射活性によりオートラジオ
グラフにより特定した結果、エストロゲンを添加して共
沈殿させた試料の列にのみエストロゲン受容体(ERα)と
思われる位置（65,000ダルトン）にシグナルバンドを検
出した（図３Ａ）。このシグナルバンドがERに相当する
ことを以下（２）に記述する抗ER抗体を用いた解析から
確認するとともに、放射活性量をBAS2000(フジフィルム
社製)を用いて定量することによって共沈殿するER量が
エストロゲンの添加に依存することを明らかにした（図
３Ｂ）。 （２） 抗核内受容体抗体による検出 上記（１）に記した、MCF-7由来タンパク質を転写した
ニトロセルロース膜をPBSに0.1%TWEEN20を添加したPBST
緩衝液に5%のスキムミルクを加えた液に1時間浸した
後、 PBST緩衝液で３回洗浄した。この膜を市販の抗ヒ
トER抗体（フナコシ社製）を3%のスキムミルクを含むPB
ST緩衝液で1000倍に希釈した溶液に室温で1時間浸した
後、 PBST緩衝液で３回洗浄した。この膜をさらに市販
の西洋ワサビペルオキシダーゼ融合抗ラビットIgG抗体
（フナコシ社製）を5%のスキムミルクを含むPBST緩衝液
で3000倍に希釈した溶液に室温で1時間浸した後、 PBST
緩衝液で３回洗浄した。ペルオキシダーゼにより蛍光を
発する市販の検出キット(ECLバイオプロダクツ社製)に
より抗ヒトER抗体の結合するERタンパク質の位置を特定
した結果、エストロゲンを添加して共沈殿させた試料の
列にのみシグナルバンドを検出した（図４Ａ）。このER
のシグナルバンドは上記（１）で検出したラジオラベル
されたバンドの位置と完全に一致した。抗体で検出した
ERをデンシトメーターで定量した結果、 ERのコファク
タービーズによる共沈殿がエストロゲンの存在に依存し
て見られることが明らかになった（図４Ｂ）。

【００３０】上記（１）（２）における実施例の結果
は、本発明においてエストロゲンのような特定の核内受
容体のリガンドを用いることにより、その標的分子であ
る特定の核内受容体を簡便に検出し単離できることを示
した。同時に、本発明を用いて任意の化合物を同様に解
析することにより、その標的分子が核内受容体である場
合に該化合物がリガンドとして作用する未知・既知の核
内受容体の存在を検出・同定できることを示した。逆
に、特定の核内受容体を用いてその核内受容体に結合す
るリガンドを検出し単離することが可能であることも示
した。

【００３１】

【発明の効果】本発明により、リガンドの存在に依存し
て核内受容体と結合するタンパク質が提供された。ま
た、該タンパク質の性質を利用した核内受容体とリガン
ドとの複合体、特定のリガンドに結合する核内受容体、
または特定の核内受容体に結合するリガンドのスクリー
ニング法、および該タンパク質を利用した被検低分子化
合物が核内受容体のリガンドであるか否かを検査する方
法が提供された。

【００３２】本発明のタンパク質を用いるスクリーニン
グ方法は、本発明のタンパク質とリガンドが結合した核
内受容体との結合能（分子機能上の性質）を指標とする
ため、構造の類似性を指標とした従来の技術と異なり、
既知核内受容体とは構造が類似していない新規の核内受
容体を検出し単離することが可能である。また、本発明
の核内受容体のスクリーニング方法において、例えば、
薬理効果がすでに解明されているリガンドを用いれば、
該リガンドが作用する核内受容体を簡便に単離すること
が可能であり、しかも、これにより単離される核内受容
体は医薬品開発の標的として非常に有益である。さら
に、本発明のリガンドのスクリーニング方法を用いれ
ば、例えば、オーファン受容体に結合する生体内リガン
ドを簡便に検出し単離することも可能である。

【００３３】また、本発明の被検低分子化合物が核内受
容体のリガンドであるか否かを検査する方法は、被検低
分子化合物を添加した際の核内受容体と本発明のタンパ
ク質との結合能を指標とするため、任意の低分子化合物
が核内受容体のリガンドとして機能しうるかを簡便に検
出することが可能である。

【００３４】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：399 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Pro Arg Val Asn Pro Ser Val Asn Pro Ser Ile Ser Pro Ala His Gly 1 5 10 15 Val Ala Arg Ser Ser Thr Leu Pro Pro Ser Asn Ser Asn Met Val Ser 20 25 30 Thr Arg Ile Asn Arg Gln Gln Ser Ser Asp Leu His Ser Ser Ser His 35 40 45 Ser Asn Ser Ser Asn Ser Gln Gly Ser Phe Gly Cys Ser Pro Gly Ser 50 55 60 Gln Ile Val Ala Asn Val Ala Leu Asn Lys Gly Gln Ala Ser Ser Gln 65 70 75 80 Ser Ser Lys Pro Ser Leu Asn Leu Asn Asn Pro Pro Met Glu Gly Thr 85 90 95 Gly Ile Ser Leu Ala Gln Phe Met Ser Pro Arg Arg Gln Val Thr Ser 100 105 110 Gly Leu Ala Thr Arg Pro Arg Met Pro Asn Asn Ser Phe Pro Pro Asn 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Ser Ser Pro Val Gly Met Thr Ser Ser Ala Cys Asn 130 135 140 Asn Asn Asn Arg Ser Tyr Ser Asn Ile Pro Val Thr Ser Leu Gln Gly 145 150 155 160 Met Asn Glu Gly Pro Asn Asn Ser Val Gly Phe Ser Ala Ser Ser Pro 165 170 175 Val Leu Arg Gln Met Ser Ser Gln Asn Ser Pro Ser Arg Leu Asn Ile 180 185 190 Gln Pro Ala Lys Ala Glu Ser Lys Asp Asn Lys Glu Ile Ala Ser Thr 195 200 205 Leu Asn Glu Met Ile Gln Ser Asp Asn Ser Ser Ser Asp Gly Lys Pro 210 215 220 Leu Asp Ser Gly Leu Leu His Asn Asn Asp Arg Leu Ser Asp Gly Asp 225 230 235 240 Ser Lys Tyr Ser Gln Thr Ser His Lys Leu Val Gln Leu Leu Thr Thr 245 250 255 Thr Ala Glu Gln Gln Leu Arg His Ala Asp Ile Asp Thr Ser Cys Lys 260 265 270 Asp Val Leu Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Ser Ala Ser Ala Asn Ser 275 280 285 Ser Gly Gly Ser Cys Pro Ser Ser His Ser Ser Leu Thr Ala Arg His 290 295 300 Lys Ile Leu His Arg Leu Leu Gln Glu Gly Ser Pro Ser Asp Ile Thr 305 310 315 320 Thr Leu Ser Val Glu Pro Asp Lys Lys Asp Ser Ala Ser Thr Ser Val 325 330 335 Ser Val Thr Gly Gln Val Gln Gly Asn Ser Ser Ile Lys Leu Glu Leu 340 345 350 Asp Ala Ser Lys Lys Lys Glu Ser Lys Asp His Gln Leu Leu Arg Tyr 355 360 365 Leu Leu Asp Lys Asp Glu Lys Asp Leu Arg Ser Thr Pro Asn Leu Ser 370 375 380 Leu Asp Asp Val Lys Val Lys Val Glu Lys Lys Glu Gln Met Asp 385 390 395 配列番号：2 配列の長さ：522 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Cys Gly Met Gln Ser Ser Met Ser Val Glu Glu Gln Arg Pro Ser Lys 1 5 10 15 Gln Leu Leu Thr Gly Asn Thr Asp Lys Pro Ile Gly Met Ile Asp Arg 20 25 30 Leu Asn Ser Pro Leu Leu Ser Asn Lys Thr Asn Ala Val Glu Glu Asn 35 40 45 Lys Ala Phe Ser Ser Gln Pro Thr Gly Pro Glu Pro Gly Leu Ser Gly 50 55 60 Ser Glu Ile Glu Asn Leu Leu Glu Arg Arg Thr Val Leu Gln Leu Leu 65 70 75 80 Leu Gly Asn Pro Thr Lys Gly Arg Val Lys Lys Lys Glu Lys Thr Pro 85 90 95 Leu Arg Asp Glu Ser Thr Gln Glu His Ser Glu Arg Ala Leu Ser Glu 100 105 110 Gln Ile Leu Met Val Lys Ile Lys Ser Glu Pro Cys Asp Asp Leu Gln 115 120 125 Ile Pro Asn Thr Asn Val His Leu Ser His Asp Ala Lys Ser Ala Pro 130 135 140 Phe Leu Gly Met Ala Pro Ala Val Gln Arg Ser Ala Pro Ala Leu Pro 145 150 155 160 Val Ser Glu Asp Phe Lys Ser Glu Pro Val Ser Pro Gln Asp Phe Ser 165 170 175 Phe Ser Lys Asn Gly Leu Leu Ser Arg Leu Leu Arg Gln Asn Gln Asp 180 185 190 Ser Tyr Leu Ala Asp Asp Ser Asp Arg Ser His Arg Asn Asn Glu Met 195 200 205 Ala Leu Leu Glu Ser Lys Asn Leu Cys Met Val Pro Lys Lys Arg Lys 210 215 220 Leu Tyr Thr Glu Pro Leu Glu Asn Pro Phe Lys Lys Met Lys Asn Asn 225 230 235 240 Ile Val Asp Ala Ala Asn Asn His Ser Ala Pro Glu Val Leu Tyr Gly 245 250 255 Ser Leu Leu Asn Gln Glu Glu Leu Lys Phe Ser Arg Asn Asp Leu Glu 260 265 270 Phe Lys Tyr Pro Ala Gly His Gly Ser Ala Ser Glu Ser Glu His Arg 275 280 285 Ser Trp Ala Arg Glu Ser Lys Ser Phe Asn Val Leu Lys Gln Leu Leu 290 295 300 Leu Ser Glu Asn Cys Val Arg Asp Leu Ser Pro His Arg Ser Asn Ser 305 310 315 320 Val Ala Asp Ser Lys Lys Lys Gly His Lys Asn Asn Val Thr Asn Ser 325 330 335 Lys Pro Glu Phe Ser Ile Ser Ser Leu Asn Gly Leu Met Tyr Ser Ser 340 345 350 Thr Gln Pro Ser Ser Cys Met Asp Asn Arg Thr Phe Ser Tyr Pro Gly 355 360 365 Val Val Lys Thr Pro Val Ser Pro Thr Phe Pro Glu His Leu Gly Cys 370 375 380 Ala Gly Ser Arg Pro Glu Ser Gly Leu Leu Asn Gly Cys Ser Met Pro 385 390 395 400 Ser Glu Lys Gly Pro Ile Lys Trp Val Ile Thr Asp Ala Glu Lys Asn 405 410 415 Glu Tyr Glu Lys Asp Ser Pro Arg Leu Thr Lys Thr Asn Pro Ile Leu 420 425 430 Tyr Tyr Met Leu Gln Lys Gly Gly Asn Ser Val Ala Ser Arg Glu Thr 435 440 445 Gln Asp Lys Asp Ile Trp Arg Glu Ala Ser Ser Ala Glu Ser Val Ser 450 455 460 Gln Val Thr Ala Lys Glu Glu Leu Leu Pro Thr Ala Glu Thr Lys Ala 465 470 475 480 Ser Phe Phe Asn Leu Arg Ser Pro Tyr Asn Ser His Met Gly Asn Asn 485 490 495 Ala Ser Arg Pro His Ser Ala Asn Gly Glu Val Tyr Gly Leu Leu Gly 500 505 510 Ser Val Leu Thr Ile Lys Lys Glu Ser Glu 515 520 配列番号：3 配列の長さ：567 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Ala Glu Asn Val Val Glu Pro Gly Pro Pro Ser Ala Lys Arg Pro 1 5 10 15 Lys Leu Ser Ser Pro Ala Leu Ser Ala Ser Ala Ser Asp Gly Thr Asp 20 25 30 Phe Gly Ser Leu Phe Asp Leu Glu His Asp Leu Pro Asp Glu Leu Ile 35 40 45 Asn Ser Thr Glu Leu Gly Leu Thr Asn Gly Gly Asp Ile Asn Gln Leu 50 55 60 Gln Thr Ser Leu Gly Met Val Gln Asp Ala Ala Ser Lys His Lys Gln 65 70 75 80 Leu Ser Glu Leu Leu Arg Ser Gly Ser Ser Pro Asn Leu Asn Met Gly 85 90 95 Val Gly Gly Pro Gly Gln Val Met Ala Ser Gln Ala Gln Gln Ser Ser 100 105 110 Pro Gly Leu Gly Leu Ile Asn Ser Met Val Lys Ser Pro Met Thr Gln 115 120 125 Ala Gly Leu Thr Ser Pro Asn Met Gly Met Gly Thr Ser Gly Pro Asn 130 135 140 Gln Gly Pro Thr Gln Ser Thr Gly Met Met Asn Ser Pro Val Asn Gln 145 150 155 160 Pro Ala Met Gly Met Asn Thr Gly Thr Asn Ala Gly Met Asn Pro Gly 165 170 175 Met Leu Ala Ala Gly Asn Gly Gln Gly Ile Met Pro Asn Gln Val Met 180 185 190 Asn Gly Ser Ile Gly Ala Gly Arg Gly Arg Gln Asp Met Gln Tyr Pro 195 200 205 Asn Pro Gly Met Gly Ser Ala Gly Asn Leu Leu Thr Glu Pro Leu Gln 210 215 220 Gln Gly Ser Pro Gln Met Gly Gly Gln Thr Gly Leu Arg Gly Pro Gln 225 230 235 240 Pro Leu Lys Met Gly Met Met Asn Asn Pro Asn Pro Tyr Gly Ser Pro 245 250 255 Tyr Thr Gln Asn Pro Gly Gln Gln Ile Gly Ala Ser Gly Leu Gly Leu 260 265 270 Gln Ile Gln Thr Lys Thr Val Leu Ser Asn Asn Leu Ser Pro Phe Ala 275 280 285 Met Asp Lys Lys Ala Val Pro Gly Gly Gly Met Pro Asn Met Gly Gln 290 295 300 Gln Pro Ala Pro Gln Val Gln Gln Pro Gly Leu Val Thr Pro Val Ala 305 310 315 320 Gln Gly Met Gly Ser Gly Ala His Thr Ala Asp Pro Glu Lys Arg Lys 325 330 335 Leu Ile Gln Gln Gln Leu Val Leu Leu Leu His Ala His Lys Cys Gln 340 345 350 Arg Arg Glu Gln Ala Asn Gly Glu Val Arg Gln Cys Asn Leu Pro His 355 360 365 Cys Arg Thr Met Lys Asn Val Leu Asn His Met Thr His Cys Gln Ser 370 375 380 Gly Lys Ser Cys Gln Val Ala His Cys Ala Ser Ser Arg Gln Ile Ile 385 390 395 400 Ser His Trp Lys Asn Cys Thr Arg His Asp Cys Pro Val Cys Leu Pro 405 410 415 Leu Lys Asn Ala Gly Asp Lys Arg Asn Gln Gln Pro Ile Leu Thr Gly 420 425 430 Ala Pro Val Gly Leu Gly Asn Pro Ser Ser Leu Gly Val Gly Gln Gln 435 440 445 Ser Ala Pro Asn Leu Ser Thr Val Ser Gln Ile Asp Pro Ser Ser Ile 450 455 460 Glu Arg Ala Tyr Ala Ala Leu Gly Leu Pro Tyr Gln Val Asn Gln Met 465 470 475 480 Pro Thr Gln Pro Gln Val Gln Ala Lys Asn Gln Gln Asn Gln Gln Pro 485 490 495 Gly Gln Ser Pro Gln Gly Met Arg Pro Met Ser Asn Met Ser Ala Ser 500 505 510 Pro Met Gly Val Asn Gly Gly Val Gly Val Gln Thr Pro Ser Leu Leu 515 520 525 Ser Asp Ser Met Leu His Ser Ala Ile Asn Ser Gln Asn Pro Met Met 530 535 540 Ser Glu Asn Ala Ser Val Pro Ser Leu Gly Pro Met Pro Thr Ala Ala 545 550 555 560 Gln Pro Ser Thr Thr Gly Ile 565 配列番号 : 4 配列の長さ : 1197 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 二本鎖 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : cDNA to mRNA 配 列 CCC CGA GTA AAT CCC TCG GTC AAT CCT AGT ATC TCT CCA GCT CAT GGT 48 Pro Arg Val Asn Pro Ser Val Asn Pro Ser Ile Ser Pro Ala His Gly 1 5 10 15 GTG GCT CGT TCA TCC ACA TTG CCA CCA TCC AAC AGC AAC ATG GTA TCC 96 Val Ala Arg Ser Ser Thr Leu Pro Pro Ser Asn Ser Asn Met Val Ser 20 25 30 ACC AGA ATA AAC CGC CAG CAG AGC TCA GAC CTT CAT AGC AGC AGT CAT 144 Thr Arg Ile Asn Arg Gln Gln Ser Ser Asp Leu His Ser Ser Ser His 35 40 45 AGT AAT TCT AGC AAC AGC CAA GGA AGT TTC GGA TGC TCA CCC GGA AGT 192 Ser Asn Ser Ser Asn Ser Gln Gly Ser Phe Gly Cys Ser Pro Gly Ser 50 55 60 CAG ATT GTA GCC AAT GTT GCC TTA AAC AAA GGA CAG GCC AGT TCA CAG 240 Gln Ile Val Ala Asn Val Ala Leu Asn Lys Gly 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Ser Ser His Ser Ser Leu Thr Ala Arg His 290 295 300 AAA ATT CTA CAC CGG CTC TTA CAG GAG GGT AGC CCC TCA GAT ATC ACC 960 Lys Ile Leu His Arg Leu Leu Gln Glu Gly Ser Pro Ser Asp Ile Thr 305 310 315 320 ACT TTG TCT GTC GAG CCT GAT AAA AAG GAC AGT GCA TCT ACT TCT GTG 1008 Thr Leu Ser Val Glu Pro Asp Lys Lys Asp Ser Ala Ser Thr Ser Val 325 330 335 TCA GTG ACT GGA CAG GTA CAA GGA AAC TCC AGT ATA AAA CTA GAA CTG 1056 Ser Val Thr Gly Gln Val Gln Gly Asn Ser Ser Ile Lys Leu Glu Leu 340 345 350 GAT GCT TCA AAG AAA AAA GAA TCA AAA GAC CAT CAG CTC CTA CGC TAT 1104 Asp Ala Ser Lys Lys Lys Glu Ser Lys Asp His Gln Leu Leu Arg Tyr 355 360 365 CTT TTA GAT AAA GAT GAG AAA GAT TTA AGA TCA ACT CCA AAC CTG AGC 1152 Leu Leu Asp Lys Asp Glu Lys Asp Leu Arg Ser Thr Pro Asn Leu Ser 370 375 380 CTG GAT GAT GTA AAG GTG AAA GTG GAA AAG AAA GAA CAG ATG GAT 1197 Leu Asp Asp Val Lys Val Lys Val Glu Lys Lys Glu Gln Met Asp 385 390 395 配列番号 : 5 配列の長さ : 1566 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 二本鎖 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : cDNA to mRNA 配 列 TGT GGA ATG CAG TCA TCC ATG TCA GTG GAA GAG CAG AGA CCC AGC AAA 48 Cys Gly Met Gln Ser Ser Met Ser Val Glu Glu Gln Arg Pro Ser Lys 1 5 10 15 CAG CTG TTA ACT GGA AAC ACA GAT AAA CCG ATA GGT ATG ATT GAT AGA 96 Gln Leu Leu Thr Gly Asn Thr Asp Lys Pro Ile Gly Met Ile Asp Arg 20 25 30 TTA AAT AGC CCT TTG CTC TCA AAT AAA ACA AAT GCA GTT GAA GAA AAT 144 Leu Asn Ser Pro Leu Leu Ser Asn Lys Thr Asn Ala Val Glu Glu Asn 35 40 45 AAA GCA TTT AGT AGT CAA CCA ACA GGT CCT GAA CCA GGG CTT TCT GGT 192 Lys Ala Phe Ser Ser Gln Pro Thr Gly Pro Glu Pro Gly Leu Ser Gly 50 55 60 TCT GAA ATA GAA AAT CTG CTT GAA AGA CGT ACT GTC CTC CAG TTG CTC 240 Ser Glu Ile Glu Asn Leu Leu Glu Arg Arg Thr Val Leu Gln Leu Leu 65 70 75 80 CTG GGG AAC CCA ACA AAG GGA AGA GTG AAA AAA AAA GAG AAA ACT CCC 288 Leu Gly Asn Pro Thr Lys Gly Arg Val Lys Lys Lys Glu Lys Thr Pro 85 90 95 TTA AGA GAT GAA AGT ACT CAG GAA CAC TCA GAG AGA GCT TTA AGT GAA 336 Leu Arg Asp Glu Ser Thr Gln Glu His Ser Glu Arg Ala Leu Ser Glu 100 105 110 CAA ATA CTG ATG GTG AAA ATA AAA TCT GAG CCT TGT GAT GAC TTA CAA 384 Gln Ile Leu Met Val Lys Ile Lys Ser Glu Pro Cys Asp Asp Leu Gln 115 120 125 ATT CCT AAC ACA AAT GTG CAC TTG AGC CAT GAT GCT AAG AGT GCC CCA 432 Ile Pro Asn Thr Asn Val His Leu Ser His Asp Ala Lys Ser Ala Pro 130 135 140 TTC TTG GGT ATG GCT CCT GCT GTG CAG AGA AGC GCA CCT GCC TTA CCA 480 Phe Leu Gly Met Ala Pro Ala Val Gln Arg Ser Ala Pro Ala Leu Pro 145 150 155 160 GTG TCC GAA GAC TTT AAA TCG GAG CCT GTT TCA CCT CAG GAT TTT TCT 528 Val Ser Glu Asp Phe Lys Ser Glu Pro Val Ser Pro Gln Asp Phe Ser 165 170 175 TTC TCC AAG AAT GGT CTG CTA AGT CGA TTG CTA AGA CAA AAT CAA GAT 576 Phe Ser Lys Asn Gly Leu Leu Ser Arg Leu Leu Arg Gln Asn Gln Asp 180 185 190 AGT TAC CTG GCA GAT GAT TCA GAC AGG AGT CAC AGA AAT AAT GAA ATG 624 Ser Tyr Leu Ala Asp Asp Ser Asp Arg Ser His Arg Asn Asn Glu Met 195 200 205 GCA CTT CTA GAA TCA AAG AAT CTT TGC ATG GTC CCT AAG AAA AGG AAG 672 Ala Leu Leu Glu Ser Lys Asn Leu Cys Met Val Pro Lys Lys Arg Lys 210 215 220 CTT TAT ACT GAG CCA TTA GAA AAT CCA TTT AAA AAG ATG AAA AAC AAC 720 Leu Tyr Thr Glu Pro Leu Glu Asn Pro Phe Lys Lys Met Lys Asn Asn 225 230 235 240 ATT GTT GAT GCT GCA AAC AAT CAC AGT GCC CCA GAA GTA CTG TAT GGG 768 Ile Val Asp Ala Ala Asn Asn His Ser Ala Pro Glu Val Leu Tyr Gly 245 250 255 TCC TTG CTT AAC CAG GAA GAG CTG AAA TTT AGC AGA AAT GAT CTT GAA 816 Ser Leu Leu Asn Gln Glu Glu Leu Lys Phe Ser Arg Asn Asp Leu Glu 260 265 270 TTT AAA TAT CCT GCT GGT CAT GGC TCA GCC AGC GAA AGT GAA CAC AGG 864 Phe Lys Tyr Pro Ala Gly His Gly Ser Ala Ser Glu Ser Glu His Arg 275 280 285 AGT TGG GCC AGA GAG AGC AAA AGC TTT AAT GTT CTG AAA CAG CTG CTT 912 Ser Trp Ala Arg Glu Ser Lys Ser Phe Asn Val Leu Lys Gln Leu Leu 290 295 300 CTC TCA GAA AAC TGT GTG CGA GAT TTG TCC CCG CAC AGA AGT AAC TCT 960 Leu Ser Glu Asn Cys Val Arg Asp Leu Ser Pro His Arg Ser Asn Ser 305 310 315 320 GTG GCT GAC AGT AAA AAG AAA GGA CAC AAA AAT AAT GTG ACC AAC AGC 1008 Val Ala Asp Ser Lys Lys Lys Gly His Lys Asn Asn Val Thr Asn Ser 325 330 335 AAA CCT GAA TTT AGC ATT TCT TCT TTA AAT GGA CTG ATG TAC AGT TCC 1056 Lys Pro Glu Phe Ser Ile Ser Ser Leu Asn Gly Leu Met Tyr Ser Ser 340 345 350 ACT CAG CCC AGC AGT TGC ATG GAT AAC AGG ACA TTT TCA TAC CCA GGT 1104 Thr Gln Pro Ser Ser Cys Met Asp Asn Arg Thr Phe Ser Tyr Pro Gly 355 360 365 GTA GTA AAA ACT CCT GTG AGT CCT ACT TTC CCT GAG CAC TTG GGC TGT 1152 Val Val Lys Thr Pro Val Ser Pro Thr Phe Pro Glu His Leu Gly Cys 370 375 380 GCA GGG TCT AGA CCA GAA TCT GGG CTT TTG AAT GGG TGT TCC ATG CCC 1200 Ala Gly Ser Arg Pro Glu Ser Gly Leu Leu Asn Gly Cys Ser Met Pro 385 390 395 400 AGT GAG AAA GGA CCC ATT AAG TGG GTT ATC ACT GAT GCG GAG AAG AAT 1248 Ser Glu Lys Gly Pro Ile Lys Trp Val Ile Thr Asp Ala Glu Lys Asn 405 410 415 GAG TAT GAA AAA GAC TCT CCA AGA TTG ACC AAA ACC AAC CCA ATA CTA 1296 Glu Tyr Glu Lys Asp Ser Pro Arg Leu Thr Lys Thr Asn Pro Ile Leu 420 425 430 TAT TAC ATG CTT CAA AAA GGA GGC AAT TCT GTT GCC AGT CGA GAA ACA 1344 Tyr Tyr Met Leu Gln Lys Gly Gly Asn Ser 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Lys Leu Ser Ser Pro Ala Leu Ser Ala Ser Ala Ser Asp Gly Thr Asp 20 25 30 TTT GGC TCT CTA TTT GAC TTG GAG CAC GAC TTA CCA GAT GAA TTA ATC 144 Phe Gly Ser Leu Phe Asp Leu Glu His Asp Leu Pro Asp Glu Leu Ile 35 40 45 AAC TCT ACA GAA TTG GGA CTA ACC AAT GGT GGT GAT ATT AAT CAG CTT 192 Asn Ser Thr Glu Leu Gly Leu Thr Asn Gly Gly Asp Ile Asn Gln Leu 50 55 60 CAG ACA AGT CTT GGC ATG GTA CAA GAT GCA GCT TCT AAA CAT AAA CAG 240 Gln Thr Ser Leu Gly Met Val Gln Asp Ala Ala Ser Lys His Lys Gln 65 70 75 80 CTG TCA GAA TTG CTG CGA TCT GGT AGT TCC CCT AAC CTC AAT ATG GGA 288 Leu Ser Glu Leu Leu Arg Ser Gly Ser Ser Pro Asn Leu Asn Met Gly 85 90 95 GTT GGT GGC CCA GGT CAA GTC ATG GCC AGC CAG GCC CAA CAG AGC AGT 336 Val Gly Gly Pro Gly Gln Val Met Ala Ser Gln Ala Gln Gln Ser Ser 100 105 110 CCT GGA TTA GGT TTG ATA AAT AGC ATG GTC AAA AGC CCA ATG ACA CAG 384 Pro Gly Leu Gly Leu Ile Asn Ser Met Val Lys Ser Pro Met Thr Gln 115 120 125 GCA GGC TTG ACT TCT CCC AAC ATG GGG ATG GGC ACT AGT GGA CCA AAT 432 Ala Gly Leu Thr Ser Pro Asn Met Gly Met Gly Thr Ser Gly Pro Asn 130 135 140 CAG GGT CCT ACG CAG TCA ACA GGT ATG ATG AAC AGT CCA GTA AAT CAG 480 Gln Gly Pro Thr Gln Ser Thr Gly Met Met Asn Ser Pro Val Asn Gln 145 150 155 160 CCT GCC ATG GGA ATG AAC ACA GGG ACG AAT GCG GGC ATG AAT CCT GGA 528 Pro Ala Met Gly Met Asn Thr Gly Thr Asn Ala Gly Met Asn Pro Gly 165 170 175 ATG TTG GCT GCA GGC AAT GGA CAA GGG ATA ATG CCT AAT CAA GTC ATG 576 Met Leu Ala Ala Gly Asn Gly Gln Gly Ile Met Pro Asn Gln Val Met 180 185 190 AAC GGT TCA ATT GGA GCA GGC CGA GGG CGA CAG GAT ATG CAG TAC CCA 624 Asn Gly Ser Ile Gly Ala Gly Arg Gly Arg Gln Asp Met Gln Tyr Pro 195 200 205 AAC CCA GGC ATG GGA AGT GCT GGC AAC TTA CTG ACT GAG CCT CTT CAG 672 Asn Pro Gly Met Gly Ser Ala Gly Asn Leu Leu Thr Glu Pro Leu Gln 210 215 220 CAG GGC TCT CCC CAG ATG GGA GGA CAA ACA GGA TTG AGA GGC CCC CAG 720 Gln Gly Ser Pro Gln Met Gly Gly Gln Thr Gly Leu Arg Gly Pro Gln 225 230 235 240 CCT CTT AAG ATG GGA ATG ATG AAC AAC CCC AAT CCT TAT GGT TCA CCA 768 Pro Leu Lys Met Gly Met Met Asn Asn Pro Asn Pro Tyr Gly Ser Pro 245 250 255 TAT ACT CAG AAT CCT GGA CAG CAG ATT GGA GCC AGT GGC CTT GGT CTC 816 Tyr Thr Gln Asn Pro Gly Gln Gln Ile Gly Ala Ser Gly Leu Gly Leu 260 265 270 CAG ATT CAG ACA AAA ACT GTA CTA TCA AAT AAC TTA TCT CCA TTT GCT 864 Gln Ile Gln Thr Lys Thr Val Leu Ser Asn Asn Leu Ser Pro Phe Ala 275 280 285 ATG GAC AAA AAG GCA GTT CCT GGT GGA GGA ATG CCC AAC ATG GGT CAA 912 Met Asp Lys Lys Ala Val Pro Gly Gly Gly Met Pro Asn Met Gly Gln 290 295 300 CAG CCA GCC CCG CAG GTC CAG CAG CCA GGT CTG GTG ACT CCA GTT GCC 960 Gln Pro Ala Pro Gln Val Gln Gln Pro Gly Leu Val Thr Pro Val Ala 305 310 315 320 CAA GGG ATG GGT TCT GGA GCA CAT ACA GCT GAT CCA GAG AAG CGC AAG 1008 Gln Gly Met Gly Ser Gly Ala His Thr Ala Asp Pro Glu Lys Arg Lys 325 330 335 CTC ATC CAG CAG CAG CTT GTT CTC CTT TTG CAT GCT CAC AAG TGC CAG 1056 Leu Ile Gln Gln Gln Leu Val Leu Leu Leu His Ala His Lys Cys Gln 340 345 350 CGC CGG GAA CAG GCC AAT GGG GAA GTG AGG CAG TGC AAC CTT CCC CAC 1104 Arg Arg Glu Gln Ala Asn Gly Glu Val Arg Gln Cys Asn Leu Pro His 355 360 365 TGT CGC ACA ATG AAG AAT GTC CTA AAC CAC ATG ACA CAC TGC CAG TCA 1152 Cys Arg Thr Met Lys Asn Val Leu Asn His Met Thr His Cys Gln Ser 370 375 380 GGC AAG TCT TGC CAA GTG GCA CAC TGT GCA TCT TCT CGA CAA ATC ATT 1200 Gly Lys Ser Cys Gln Val Ala His Cys Ala Ser Ser Arg Gln Ile Ile 385 390 395 400 TCA CAC TGG AAG AAT TGT ACA AGA CAT GAT TGT CCT GTG TGT CTC CCC 1248 Ser His Trp Lys Asn Cys Thr Arg His Asp Cys Pro Val Cys Leu Pro 405 410 415 CTC AAA AAT GCT GGT GAT AAG AGA AAT CAA CAG CCA ATT TTG ACT GGA 1296 Leu Lys Asn Ala Gly Asp Lys Arg Asn Gln Gln Pro Ile Leu Thr Gly 420 425 430 GCA CCC GTT GGA CTT GGA AAT CCT AGC TCT CTA GGG GTG GGT CAA CAG 1344 Ala Pro Val Gly Leu Gly Asn Pro Ser Ser Leu Gly Val Gly Gln Gln 435 440 445 TCT GCC CCC AAC CTA AGC ACT GTT AGT CAG ATT GAT CCC AGC TCC ATA 1392 Ser Ala Pro Asn Leu Ser Thr Val Ser Gln Ile Asp Pro Ser Ser Ile 450 455 460 GAA AGA GCC TAT GCA GCT CTT GGA CTA CCC TAT CAA GTA AAT CAG ATG 1440 Glu Arg Ala Tyr Ala Ala Leu Gly Leu Pro Tyr Gln Val Asn Gln Met 465 470 475 480 CCG ACA CAA CCC CAG GTG CAA GCA AAG AAC CAG CAG AAT CAG CAG CCT 1488 Pro Thr Gln Pro Gln Val Gln Ala Lys Asn Gln Gln Asn Gln Gln Pro 485 490 495 GGG CAG TCT CCC CAA GGC ATG CGG CCC ATG AGC AAC ATG AGT GCT AGT 1536 Gly Gln Ser Pro Gln Gly Met Arg Pro Met Ser Asn Met Ser Ala Ser 500 505 510 CCT ATG GGA GTA AAT GGA GGT GTA GGA GTT CAA ACG CCG AGT CTT CTT 1584 Pro Met Gly Val Asn Gly Gly Val Gly Val Gln Thr Pro Ser Leu Leu 515 520 525 TCT GAC TCA ATG TTG CAT TCA GCC ATA AAT TCT CAA AAC CCA ATG ATG 1632 Ser Asp Ser Met Leu His Ser Ala Ile Asn Ser Gln Asn Pro Met Met 530 535 540 AGT GAA AAT GCC AGT GTG CCC TCC CTG GGT CCT ATG CCA ACA GCA GCT 1680 Ser Glu Asn Ala Ser Val Pro Ser Leu Gly Pro Met Pro Thr Ala Ala 545 550 555 560 CAA CCA TCC ACT ACT GGA ATT 1701 Gln Pro Ser Thr Thr Gly Ile 565 配列番号：7 配列の長さ：26 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 TTCCCGGGTC CCCGAGTAAA TCCCTC 26 配列番号：8 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CATGGATCCA TCTGTTC 17 配列番号：9 配列の長さ：39 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 TTGGATCCGC ACAATGTGGA ATGCAGTCAT CCATGTCAG 39 配列番号：10 配列の長さ：38 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GGGGATTCTG ATTGTTTCTT TATCGTTAGC ACGCTTCC 38 配列番号：11 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTCCCGGGGA TGGGCGAGAA TGTGG 25 配列番号：12 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CGAGCATATG CAACTAGG 18

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、コアクチベーター内のリガンドに依存
した核内受容体結合ドメインをコードするcDNA断片の取
得を示す。

【図２】図２は、コアクチベーター内のリガンドに依存
した核内受容体結合ドメインをGSTとの融合タンパク質
として発現させるためのプラスミドの構築を示す。

【図３】図３Ａは、放射標識によるエスロトゲン受容体
の検出を示す。図３Ｂは、検出されたエスロトゲン受容
体のバンドのシグナル強度を示す。

【図４】図４Ａは、抗体によるエスロトゲン受容体の検
出を示す。図４Ｂは、検出されたエスロトゲン受容体の
バンドのシグナル強度を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/535 Ｇ０１Ｎ 33/535 33/566 33/566 // Ａ６１Ｋ 45/00 ＡＤＵ Ａ６１Ｋ 45/00 ＡＤＵ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 橋本 誠一 茨城県つくば市御幸が丘21 山之内製薬株 式会社内

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 リガンドの存在に依存して核内受容体と
   結合するタンパク質。
2. 【請求項２】 核内受容体のコアクチベーターに由来す
   る、請求項１に記載のタンパク質。
3. 【請求項３】 配列番号：１乃至３のいずれかに記載の
   アミノ酸配列、または該アミノ酸配列中のアミノ酸が置
   換、欠失、もしくは付加したアミノ酸配列を含む、請求
   項１に記載のタンパク質。
4. 【請求項４】 請求項１乃至３のいずれかに記載のタン
   パク質と標識とが融合したタンパク質。
5. 【請求項５】 標識がグルタチオン S-トランスフェラ
   ーゼである、請求項４に記載のタンパク質。
6. 【請求項６】 請求項１乃至５のいずれかに記載のタン
   パク質をコードするDNA。
7. 【請求項７】 請求項６に記載のDNAを含むベクター。
8. 【請求項８】 請求項７に記載のベクターで形質転換さ
   れた細胞。
9. 【請求項９】 請求項８に記載の細胞を培養する工程を
   含む、請求項１乃至５のいずれかに記載のタンパク質の
   製造方法。
10. 【請求項１０】 核内受容体とリガンドとの複合体のス
    クリーニング方法であって、 （Ａ）請求項１乃至５のいずれかに記載のタンパク質と
    生物学的試料とを作用させる工程、 （Ｂ）請求項１乃至５のいずれかに記載のタンパク質、
    核内受容体、およびリガンドを含む複合体を単離する工
    程、を含む方法。
11. 【請求項１１】 特定のリガンドに結合する核内受容体
    のスクリーニング方法であって、 （Ａ）特定のリガンドの存在下で請求項１乃至５のいず
    れかに記載のタンパク質と生物学的試料とを作用させる
    工程、 （Ｂ）請求項１乃至５のいずれかに記載のタンパク質、
    核内受容体、および該特定リガンドを含む複合体を単離
    する工程、を含む方法。
12. 【請求項１２】 特定の核内受容体に結合するリガンド
    のスクリーニング方法であって、 （Ａ）特定の核内受容体の存在下で請求項１乃至５のい
    ずれかに記載のタンパク質と生物学的試料とを作用させ
    る工程、 （Ｂ）請求項１乃至５のいずれかに記載のタンパク質、
    該特定の核内受容体、およびリガンドを含む複合体を単
    離する工程、を含む方法。
13. 【請求項１３】 特定の核内受容体に結合するリガンド
    のスクリーニング方法であって、 （Ａ）被検低分子化合物の存在下で請求項１乃至５のい
    ずれかに記載のタンパク質と特定の核内受容体とを作用
    させる工程、 （Ｂ）請求項１乃至５のいずれかに記載のタンパク質と
    特定の核内受容体とを結合させる能力を有する被検低分
    子化合物を選択する工程、を含む方法。
14. 【請求項１４】 被検低分子化合物が核内受容体のリガ
    ンドであるか否かを検査する方法であって、 （Ａ）被検低分子化合物の存在下で請求項１乃至５のい
    ずれかに記載のタンパク質と生物学的試料とを作用させ
    る工程、 （Ｂ）請求項１乃至５のいずれかに記載のタンパク質と
    被検低分子化合物の存在下で結合する生物学的試料中の
    タンパク質の存在を検出する工程、を含む方法。
15. 【請求項１５】 被検低分子化合物が特定の核内受容体
    に結合するリガンドであるか否かを検査する方法であっ
    て、 （Ａ）被検低分子化合物の存在下で請求項１乃至５のい
    ずれかに記載のタンパク質と特定の核内受容体とを作用
    させる工程、 （Ｂ）請求項１乃至５のいずれかに記載のタンパク質の
    特定の核内受容体への結合を検出する工程、を含む方
    法。
16. 【請求項１６】 請求項１０に記載の方法により単離し
    うる核内受容体とリガンドとの複合体、または該複合体
    を構成する核内受容体もしくはリガンド。
17. 【請求項１７】 請求項１１に記載の方法により単離し
    うる核内受容体。
18. 【請求項１８】 請求項１２または１３に記載の方法に
    より単離しうるリガンド。