JPH1132795A - 病原性プリオン蛋白質の検出方法及びその濃縮方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 動物組織由来物質から、比較的低濃度でも高
感度で迅速かつ簡便に、病原性プリオン蛋白質を検出で
きる病原性プリオン蛋白質の検出方法を提供すること。 【解決手段】 動物組織由来物質の種類に応じた界面活
性剤と酵素とを用いて前記動物組織由来物質を均一化す
る第１の工程と、前記均一化物を分解酵素を用いて分解
処理する第２の工程と、前記第２の工程で分解された均
一化物から前記病原性プリオン蛋白質を含有する濃縮物
を得る第３の工程とを有する病原性プリオン蛋白質の濃
縮工程を経て、病原性プリオン蛋白質を含有する濃縮物
を溶剤に溶解して前記濃縮物の溶解物を得る第４の工程
と、この溶解物中の前記病原性プリオン蛋白質を吸着面
に吸着させる第５の工程と、吸着された前記病原性プリ
オン蛋白質を発色させる第６の工程とを有する酵素免疫
吸着測定法によって前記病原性プリオン蛋白質を検出す
る、病原性プリオン蛋白質の検出方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、動物組織由来物質
から病原性プリオン蛋白質を検出する病原性プリオン蛋
白質の検出方法、さらに、この検出方法の実施に際し、
検出されるべき前記病原性プリオン蛋白質を濃縮する、
病原性プリオン蛋白質の濃縮方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】プリオン病の１つであるスレーピーは、
羊において約２００年以上前から西ヨーロッパで深刻な
病気として知られていた。また、近年、英国でスクレー
ピー感染羊を未加熱のまま牛飼料として投与し、狂牛病
（牛海綿状脳症：ＢＳＥ；Bovine Spongiform Encephal
opathy）の大発生を起こした。

【０００３】また、狂牛病の牛クズ肉を食することと、
人プリオン病の１つであるクロイツフェルト・ヤコブ病
（ＣＪＤ； Creutfelt Jakob Disease）の新型のものと
の因果関係も指摘されている。即ち、人類にとって重要
な動物性蛋白質資源である羊肉やその乳、牛肉や牛乳に
関して、危機的な汚染が進行しているといっても過言で
はない。

【０００４】しかしながら、プリオン病は、これまでに
報告された伝染性細菌、ウイルス性疾患等とは異なり、
その病原性物質が本来生体に存在する蛋白質であるこ
と、伝播機能が新しいこと、発病までに比較的長時間を
有すること、病原性の失活が困難であることなどから、
有効な診断方法及び予防方法の開発が遅れている。

【０００５】現在行われている最も高感度な病原性プリ
オン蛋白質（異常プリオン蛋白質）の検出方法として、
羊のスクレーピーに関して、発病前の低濃度での病原性
プリオン蛋白質を検出するウエスタンブロット法（ＷＢ
法；Western Blotting）が開発されている。

【０００６】しかしこの方法は、病原物質の蓄積部位の
相違や、この方法を実施するのに時間がかかることや処
理頭数などの関係から、牛に関しての適用は困難であ
る。即ち、迅速な処理は困難である。

【０００７】上述した方法以外では、病原性プリオン蛋
白質に対する抗体を用いた免疫組織染色や病理所見によ
る感染牛の検出法が広く実施されているのが現状であ
る。

【０００８】しかしながら、これらの方法は、発病後顕
著な神経症状を呈したり、死亡した家畜に関し有効なも
のであり、潜伏期間にある家畜の安全性、言い換えれ
ば、屠蓄場まで、見かけ上、正常な牛についての安全性
が確保できなかった。

【０００９】また、近年、海外から、酵素免疫吸着測定
法（ＥＬＩＳＡ：enzyme-linked immnosorbent assay）
や、尿や血液による診断方法の報告もあるが、その感度
や特異性には疑問があった。

【００１０】即ち、目的とする病原物質に含まれる病原
性プリオン蛋白質をその測定試料調製段階で濃縮し、ま
た、ＥＬＩＳＡ法用のマイクロタイタープレートへ効率
良く吸着させれば、この方法での検出感度を向上させる
ことができるが、これまでの方法では検出感度上の限界
があった。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】ウシ海綿状脳症（ＢＳ
Ｅ：ウェールズ他、１９８７年）は、食事として与えら
れた肉や骨髄を介してスクレーピーに汚染された羊のく
ず肉が畜牛の飼料に含まれていたために発生し、その結
果新しく感染した畜牛材が再循環した（ウイルスミス
他、１９９３年）ことは明らかであった。

【００１２】その後英国では、ネコ科の動物と同様に数
種の捕獲有蹄動物（ワイアット他、１９９１年）が再
度、海綿状脳症を発病している。これら全てのケースに
おいて、ＢＳＥは汚染された飼料を介して発生したもの
と考えられる。

【００１３】ウイル他が行った（１９９６年）英国にお
けるクロイッフェルト−ヤコブ病（ＣＩＪ）の特殊な例
に関する報告では、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）又はプ
リオン病の当グループにおける人間変異体の一つが報告
されているが、それによると、ＢＳＥが人間に伝染する
可能性（ウイル他、１９９６年）が示唆されている。こ
のため全てのＴＳＥについて、種を越えて発生する（デ
ィリンガー、１９９５年）可能性が一般的に考えられ
る。

【００１４】現在の調査最優先事項は、スクレーピーや
ＢＳＥに感染している動物及び材料を検知し、感染の拡
大や食物連鎖システムへの侵入を防ぐ方法を開発するこ
とにある。

【００１５】残念ながら今までのところ、これらの防止
方法や管理対策、又スクレーピー及びＢＳＥの撲滅プロ
グラムは、診断の困難さから上手く捗っているとは言え
ない。

【００１６】現在使用されている診断方法で最も一般的
な方法は、中枢神経系の代表的な海綿変化が顕著に認め
れる場合に感染と診断する組織病理学的方法（フレイサ
ー、１９７６年）と、プロテイナーゼＫ処理法に対して
部分的に耐性を示すほか（ボルトン他、１９８２年；デ
ィリンガー他、１９８３年）、中性界面活性剤により抽
出できない（メイヤー他、１９８６年；ボルトン他、１
９８７年）と言う特性を有するがために正常なプリオン
蛋白質（ＰｒＰ^C ）と区別することができるプリオン蛋
白質のスクレーピー特殊イソフォーム（ＰｒＰ^SC）検出
方法の二つである。

【００１７】また、最近になって、羊の生検扁桃組織を
使用した免疫組織化学アッセイによる細網リンパ系臓器
内のＰｒＰ^SC検出方法が報告された（シュルーダー他、
１９９６年）。しかしながら、牛では、細網リンパ系臓
器において異常プリオンの蓄積が顕著でないために、こ
の方法は適さない。

【００１８】その反面、組織病理学は、潜伏期間中での
中枢神経系の病理学的変化が後になって発生するため、
前記ＰｒＰ^SC検出法と比較した場合、実験用のスクレー
ピー及びＢＳＥの両者（ボルトン他、１９９１年；ジェ
ンドロスカ他、１９９１年）でその使用有効性が低減し
ている。

【００１９】最近では、プリオン病の重大性が高まって
きているため、羊や畜牛を屠殺時に選別するためのより
感度の高い診断方法が求められている。

【００２０】選別方法としてはＥＬＩＳＡ法が適切な方
法と言えるが、現在、この方法はＴＳＥの基本的な研究
のみで使用されているにすぎない（カスクザック他、１
９８７年、サファー他、１９９０年；サーバン他、１９
９０年）。これらの研究では、高純度ＰｒＰ^SCのみがマ
イクロタイタプレートに吸着されているが、診断におい
ては原組織抽出液の使用も必要となる。

【００２１】上述したように、プリオン病のうち、人類
に対して最も大きな脅威となる疾病の１つに牛海綿状脳
症（ＢＳＥ）が挙げられる。

【００２２】この疾病は外来の病原性プリオン蛋白質が
引き金となり、家畜体内の中枢神経等に病原性プリオン
蛋白質を蓄積し、神経症状を呈して死亡に至る疾病であ
り、病原性物質としての病原性プリオン蛋白質の蓄積濃
度と病気の進行具合とは顕著に比例する。

【００２３】そのため、罹患後、潜伏期間中には病原性
物質の蓄積濃度が低いため、特異的で高感度の検出方法
が必要であった。また、全世界で処理される牛の頭数を
考慮すれば、測定試料の調製法（即ち、濃縮法）並びに
検出法は、簡便性、正確性、迅速性、経済性等が必要で
あることは言うまでもない。

【００２４】他方、本疾病は、罹患した牛の中枢神経系
臓器を食することによる人間への伝播性が強く示唆され
ている。これらの問題を解決するためには、広く検疫調
査を行い、本疾病に罹った羊や牛などを見出し、食物連
鎖の初期の段階での駆除が有効である。

【００２５】本発明は、上述した従来の実情に鑑みてな
されたものであり、その目的は、動物組織由来物質か
ら、比較的低濃度でも迅速かつ簡便に、そして高感度で
組織特異的に病原性プリオン蛋白質を検出できる病原性
プリオン蛋白質の検出方法、および、その検出方法の実
施に際し、検出されるべき前記病原性プリオン蛋白質を
濃縮する病原性プリオン蛋白質の濃縮方法を提供するこ
とにある。

【００２６】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上述した課
題を解決するべく鋭意検討を重ねた結果、動物組織由来
物質から病原性プリオン蛋白質を検出する病原性プリオ
ン蛋白質の検出方法において、検出対象となる動物組織
由来物質の種類に応じて、使用する調製剤（特に界面活
性剤）や調製方法、検出方法を適宜選択することによっ
て、前記病原性プリオン蛋白質を比較的低濃度でも迅速
かつ簡便に、そして高感度で検出できることを見出し
た。

【００２７】即ち、本発明は、動物組織由来物質から病
原性プリオン蛋白質を検出する病原性プリオン蛋白質の
検出方法において、前記動物組織由来物質の種類に応じ
た界面活性剤と酵素とを用いて前記動物組織由来物質を
均一化する第１の工程と、前記第１の工程で得られた均
一化物を分解酵素を用いて分解処理する第２の工程と、
前記第２の工程で分解された前記均一化物から前記病原
性プリオン蛋白質を含有する濃縮物を得る第３の工程と
を有する前記病原性プリオン蛋白質の濃縮工程を経て、
前記病原性プリオン蛋白質を含有する濃縮物を溶剤に溶
解して前記濃縮物の溶解物を得る第４の工程と、この溶
解物中の前記病原性プリオン蛋白質を吸着面に吸着させ
る第５の工程と、前記第５の工程において吸着された前
記病原性プリオン蛋白質を発色させる第６の工程とを有
する酵素免疫吸着測定法によって前記病原性プリオン蛋
白質を検出することを特徴とする、病原性プリオン蛋白
質の検出方法（以下、本発明の検出方法と称する。）に
係るものである。

【００２８】本発明の検出方法によれば、まず、病原性
プリオン蛋白質の濃縮工程において、上述した第１の工
程〜第３の工程を有しており、特に、動物組織由来物質
の種類に応じた界面活性剤を用いてこれを均一化してい
るので、前記動物組織由来物質に蓄積される病原性プリ
オン蛋白質の蓄積濃度が比較的小さくても、これを十分
に濃縮させることができる。

【００２９】さらに、第４の工程から第６の工程を有す
る酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ法；以下、同様）に
基づいてこれを検出しているので、病原性プリオン蛋白
質を特異的に、かつ強固に吸着（固定化）させることが
でき、迅速かつ簡便に、そして高感度でこれを検出する
ことができる。

【００３０】即ち、本発明の検出方法によれば、例えば
牛や羊などをプリオン病（スクレーピーやＢＳＥ）感染
初期の段階で診断、選別することが可能となり、また、
これを大量かつ迅速に行うことができる。特に、羊では
リンパ節を用いた生検が可能とされているが、本発明に
よれば、例えば牛に関してもリンパ節を用いた生検が可
能になると考えられる。

【００３１】また、本発明は、動物組織由来物質から病
原性プリオン蛋白質を検出する病原性プリオン蛋白質の
検出方法の実施に際し、検出されるべき前記病原性プリ
オン蛋白質を濃縮する方法において、前記動物組織由来
物質の種類に応じたＮ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−
３−アミノ−１−プロパンスルホネート又はｔ−オクチ
ルフェノキシポリエトキシエタノールと酵素とを用いて
前記動物組織由来物質を均一化する第１の工程と、前記
第１の工程で得られた均一化物を分解酵素を用いて分解
処理する第２の工程と、前記第２の工程で分解された前
記均一化物から前記病原性プリオン蛋白質を含有する濃
縮物を得る第３の工程とを有することを特徴とする、病
原性プリオン蛋白質の濃縮方法（以下、本発明の第１の
濃縮方法と称する。）を提供するものである。

【００３２】さらに、本発明は、動物組織由来物質から
病原性プリオン蛋白質を検出する病原性プリオン蛋白質
の検出方法の実施に際し、検出されるべき前記病原性プ
リオン蛋白質を濃縮する方法において、前記動物組織由
来物質の種類に応じた界面活性剤と酵素とを用いて前記
動物組織由来物質を均一化する第１の工程と、前記第１
の工程で得られた均一化物を分解酵素を用いて分解処理
する第２の工程と、前記第２の工程で分解された前記均
一化物から前記病原性プリオン蛋白質を含有する濃縮物
を得る第３の工程と前記第３の工程で得られた前記病原
性プリオン蛋白質を含有する濃縮物をＮ−ドデシル−
Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノ−１−プロパンスルホネ
ートからなる非イオン性界面活性剤で洗浄する洗浄工程
とを有することを特徴とする、病原性プリオン蛋白質の
濃縮方法（以下、本発明の第２の濃縮方法と称する。）
も提供するものである。

【００３３】本発明の第１の濃縮方法及び第２の濃縮方
法によれば、前記動物組織由来物質に蓄積される病原性
プリオン蛋白質の蓄積濃度が比較的小さくても、これを
十分に濃縮させることができる。

【００３４】ここで、前記動物組織由来物質とは、動物
の中枢神経系組織、細網リンパ系組織や骨、更には、こ
れらの組織に由来する物質（例えば、食品、移植用硬
膜、医療用コラーゲン）なども含むものである（以下、
同様）。また、前記病原性プリオン蛋白質とは、プリオ
ン病の原因であると考えられている異常プリオン蛋白質
を意味し、前記プリオン病としては、上述したＣＪＤや
スクレーピー、ＢＳＥなどが挙げられる。本発明の検出
方法、本発明の第１の濃縮方法及び本発明の第２の濃縮
方法は、羊のスクレーピーやＢＳＥに限定されず、様々
なプリオン病に対処することが可能である。

【００３５】

【発明の実施の形態】まず、本発明の検出方法について
説明する。

【００３６】本発明の検出方法における第１の工程とし
て、前記動物組織由来物質の種類に応じた界面活性剤と
酵素とを用いて、この動物組織由来物質を均一化する均
一化工程を有しているので、前記酵素の作用で前記動物
組織由来物質を十分に溶解し、また、その種類に応じた
前記界面活性剤の存在下で非特異的物質を可溶化し、病
原性プリオン蛋白質を含有する前記動物組織由来物質を
十分に均一化することができる。

【００３７】従って、前記動物組織由来物質における病
原性プリオン蛋白質の割合が比較的低濃度であっても、
これを良好に均一化することができ、ひいては良好な病
原性プリオン蛋白質の濃縮物を得ることができる。つま
り、病原性プリオン蛋白質を分離、抽出するために有効
な均一化物（ホモジネート）を得ることができる。

【００３８】この第１の工程において、前記動物組織由
来物質が中枢神経系組織（例えば、脳組織や脊髄組織な
ど）の場合は、前記界面活性剤をズイッタージェント
（Zwittergent) 3-12 〔商品名：カルビオケミカル社
製：Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノ−１
−プロパンスルホネート（N-dodecyl-N,N-dimethyl-3-a
mino-1-propanesulfonate)：分子量３３６．６〕又はト
リトン(Triton) X-100〔商品名：シグマ社製：ｔ−オク
チルフェノキシポリエトキシエタノール（t-octylpheno
xypolyethoxyethanol)〕からなる非イオン性界面活性剤
とすることが望ましい。なお、前記界面活性剤以外に
も、例えばカルビオケミカル社製のズイッタージェント
３−０８、３−１０、３−１４、３−１６やノニデット
Ｐ−４０（octylphenoxypolyethoxyethanol)などを使用
してもよい。

【００３９】上記の各界面活性剤を使用することによっ
て、前記脳組織における非特異的物質（正常プリオン蛋
白質やその他の蛋白質：以下、同様）を十分に可溶化す
ることができる。特に、前記中枢神経系組織として脳組
織を用いることがさらに望ましい。

【００４０】界面活性剤の選択により検出感度の組織特
異性が向上するメカニズムとしては、例えば脳組織で
は、濃度０．５％、ｐＨ７．５程度のサーコシル〔商品
名：シグマ社製（分子式Ｃ₁₅Ｈ₂₅ＮＯ₃ Ｎａ）〕でもＰ
ｒＰ^SCのロスが少なく、十分非特異的に蛋白質の抽出が
でき、これに対してリンパ、脾臓組織などでは、非特異
的な夾雑蛋白質の除去が不十分となることがあり、改め
て高濃度の前記サーコシルでＰｒＰ^SCを選択的に抽出す
ることが望ましいからであると考えられる。

【００４１】また、前記動物組織由来物質が細網リンパ
系組織（例えば、脾臓やリンパ節、骨髄など）の場合
は、前記界面活性剤をｔ−オクチルフェノキシポリエト
キシエタノールからなる非イオン性界面活性剤とするこ
とが望ましい。

【００４２】上記界面活性剤を使用することによって、
前記脾臓組織における非特異的物質を十分に可溶化する
ことができる。特に、前記細網リンパ系組織として脾臓
組織を用いることがさらに望ましい。

【００４３】次に、前記第２の工程として、前記第１の
工程で得られた均一化物を分解酵素を用いて分解処理す
る分解処理工程を有しているので、前記均一化物中の病
原性プリオン蛋白質を含む物質（特に、染色体やＤＮＡ
など）を十分に分解、消化させて、目的物である病原性
プリオン蛋白質を十分に取り出すことができる。

【００４４】一般に、病原性プリオン蛋白質は、染色体
中の遺伝子上にのっていると考えられている。従って、
特異的にこの蛋白質を取り出すためには、これを含む蛋
白質を分解することが要求される。この第２工程は、非
特異的物質を分解すると共に病原性プリオン蛋白質を含
む蛋白質を分解する操作である。

【００４５】ここで、前記分解酵素としてコラーゲン分
解酵素（コラゲナーゼ： Collagenase）及びＤＮＡ分解
酵素（ＤＮアーゼ：DNase ）を用いて前記均一化物を分
解し、さらに蛋白質分解酵素（プロテイナーゼ：Protei
nase又はプロテアーゼ：Protease）を用いて分解するこ
とが望ましい。

【００４６】また、前記分解酵素としてパパイン（Papa
in：ＳＨ酵素）やブロメリン（Bromelain ：ＳＨ酵素）
等の植物プロテアーゼ（Protease）や微生物プロテアー
ゼを用いて前記均一化物を分解することもできる。

【００４７】特に、前記ブロメリンは、パイナップル由
来の酵素で、主に蛋白質に作用するが、脂肪の分解も行
うことができる。また、作用温度も約８０℃までは酵素
活性を失わないなど安定性の高い酵素といえる。ＰｒＰ
^SC検出の目的でブロメリン等のプロテアーゼを用いるこ
とは、本発明者によって初めて見出された。

【００４８】また、前記分解酵素としてブロメリン等を
使用する場合は、濃度０．０８〜２０Unit/ml 、反応温
度４５℃程度において、ＰｒＰ^SCの分解はプロテイナー
ゼＫによる分解と同程度（耐性がある）である。

【００４９】さらに、ＰｒＰ^SC以外の蛋白質、核酸の分
解も十分に行うことができる。通常の蛋白質は、４５℃
程度で熱変性し、分解を受け易くなることも、ブロメリ
ン等が熱耐性であることを考慮すればブロメリン等を用
いる効果といえる（ＰｒＰ^SCは１００℃以上の耐熱性を
有するので熱分解も受けない）。

【００５０】次に、前記第３の工程として、前記第２の
工程で分解された前記均一化物から前記病原性プリオン
蛋白質を含有する濃縮物を得る分離工程を有しているの
で、上記の第１の工程及び第２の工程で十分に均一化及
び分解された前記病原性プリオン蛋白質を含有する物質
を効率的に分離することができる。

【００５１】この分離工程では、例えば、遠心分離（超
遠心分離）等の手段を用いて分離、濃縮することができ
る。

【００５２】以上が、前記病原性プリオン蛋白質の濃縮
工程の基本的な構成であるが、本発明の検出方法におけ
る濃縮工程では、上述した第１の工程〜第３の工程に加
えて、例えば、下記のような工程を付加することが望ま
しい。

【００５３】例えば、前記濃縮工程中に、前記第３の工
程で得られた前記病原性プリオン蛋白質を含有する濃縮
物を分解酵素を用いて分解し、次いで分離後に塩析処理
を施す工程を更に有することが望ましい。

【００５４】即ち、前記病原性プリオン蛋白質の溶解性
を一層向上させるために、例えば、サーコシル（Sarkos
yl、商品名：シグマ社製：Ｃ₁₅Ｈ₂₅ＮＯ₃ Ｎａ）等の分
解酵素を使用して溶解処理、分離処理を行い、得られた
分離抽出物を例えばＮａＣｌを用いて塩析した後、分離
処理を行うことによって、一層濃縮された病原性プリオ
ン蛋白質を含有する濃縮物を得ることができる。

【００５５】また、前記濃縮工程中に、前記第３の工程
で得られた前記病原性プリオン蛋白質を含有する濃縮物
を界面活性剤で洗浄する洗浄工程を更に有することが望
ましい。

【００５６】即ち、前記濃縮物（例えばペレット状）の
付加的な洗浄工程として、界面活性剤を用いて前記濃縮
物を洗浄することによって、前記濃縮物中の不所望の物
質（非特異性物質）をさらに多く除去することができ
る。

【００５７】ここで、使用する界面活性剤としては、Ｎ
−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノ−１−プロ
パンスルホネート（例えばズイッタージェント 3-12, 3
-08,3-10 など）からなる非イオン性界面活性剤が望ま
しい。

【００５８】次に、本発明の検出方法に基づく、酵素免
疫吸着測定法（第４の工程から第６の工程）について説
明する。

【００５９】ここで、上記酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩ
ＳＡ：enzyme-linked immnosorbentassay)は、酵素抗体
法とも呼ばれ、特定の吸着面に抗原を配し、抗原と抗体
とを吸着せしめて、その複合体を形成し、これを検出す
る方法である。

【００６０】まず、前記第４の工程として、前記病原性
プリオン蛋白質を含有する濃縮物を溶剤に溶解して前記
濃縮物の溶解物を得る工程（溶解工程）を有しているの
で、次段の吸着工程で吸着面に吸着され易い病原性プリ
オン蛋白質の濃縮物を作製することができる。

【００６１】ここで、前記溶剤としてグアニジンチオシ
アネート（ GdnSCN ）を使用することが望ましい。

【００６２】グアニジンチオシアネートは、前記濃縮物
を次段での吸着工程で吸着されやすくする作用を有する
と考えられる。これは、グアニジンチオシアネートによ
って抗プリオン蛋白質抗体の免疫反応性が増大するよう
な抗原性サイトが発現することによるものと考えられ、
グアニジンチオシアネートでの溶解処理によって、抗原
−抗体複合体の強固で特異的な反応を検出することがで
きる。

【００６３】前記グアニジンチオシアネートは、１〜５
モル濃度（Ｍ）のものを使用することが望ましい。この
濃度は３〜４モル濃度がさらに望ましい。また、上述し
たグアニジンチオシアネート中への前記濃縮物の溶解
は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ≦５）などを
バッファとして行うことが望ましい。

【００６４】次に、前記第５の工程として、前記溶解物
中の前記病原性プリオン蛋白質を吸着面に吸着させる工
程（吸着工程）を有しており、前段で溶解された溶解物
中の病原性プリオン蛋白質を、例えばマイクロタイター
プレート（microtiter pleate)などに吸着させることが
できる。従って、抗原−抗体複合体の形成のための強く
特異的な反応をこの方法にて検出することができる。

【００６５】また、前記吸着面を一次抗体で形成し、こ
の一次抗体と前記病原性プリオン蛋白質との抗原−抗体
複合体を前記吸着面に生成させることができる。一般
に、ＥＬＩＳＡ法は、測定対象である抗原とその固定化
のための抗体とにおける抗原−抗体複合体を生じせし
め、これを発色法にて検出するものである。

【００６６】次に、前記第６の工程として、上記第５の
工程において吸着された前記病原性プリオン蛋白質を発
色させる工程（発色工程）を有しているので、これを比
色計や分光光度計などにより容易に検出できる。即ち、
前記病原性プリオン蛋白質を発色させ、その発色濃度を
検出することによって病原性プリオン蛋白質の有無、さ
らにはその蓄積濃度を調べることができる。

【００６７】また、前記発色を蛍光発光とすることが望
ましい。さらに、前記蛍光発光の発光剤として化学発光
物質を用いることが望ましい。例えば、前記化学発光物
質（発色試薬）としては、２，２−アジゾ−ビス（３−
エチル−ベンズチアゾリン−６−スルホネート）等を使
用することができる。

【００６８】この発色方法としては、前記病原性プリオ
ン蛋白質に結合するアビジン（avidin）と、前記化学発
光物質に結合するビオチン（biotin）との複合体の形成
に基づく発色を観察するアビジン−ビオチン複合体法
（ＡＢＣ法）やホースラディッシュペルオキシダーゼ複
合ロバ抗兎免疫グロブリン（horseradish peroxidase-c
onjugated donky anti-rabbit IgG ）を使用する間接法
（ＨＲＰ法）などを使用できる。

【００６９】この検出方法の概要は、例えば、ウエルに
吸着されたＰｒＰ^SCがポリクローナル抗体Ｂ１０３と特
異的に結合、その抗体をさらに特異的に認識する２次抗
体（抗ウサギＩｇＧ）−ビオチン複合体で結合、そこへ
アジビンを結合、次にホースラディシュベルオキシター
ゼ（ＨＲＰ）−ビオチンを結合させ、ＨＲＰの基質であ
る２，２−アジゾ−ビスを反応させ発色させる方法であ
る。

【００７０】一般に、アビジン−ビオチン複合体法によ
り得られる結果は、間接法よりも再現性が高いが、特
に、前記動物組織由来物質として脾臓組織中の病原性プ
リオン蛋白質を検出する場合、前記アビジン−ビオチン
複合体法を用いることが望ましい。

【００７１】上述したように、本発明の酵素免疫吸着法
（ＥＬＩＳＡ法）によれば、測定対象である病原性プリ
オン蛋白質が比較的低濃度であっても、これを強く、特
異的に吸着させることができ、迅速かつ簡便に前記病原
性プリオン蛋白質を検出することができる。

【００７２】なお、ＥＬＩＳＡ法による検出は、上述し
たウエスタンブロッティング法（ＷＢ法）に比べて、少
なくとも同等の感度を示し、さらに、その測定は実用的
かつ迅速である。また、ＥＬＩＳＡ法による検出の利点
は、多くのサンプルを１回で分析することができ、潜在
的に感染されている動物を大量に診断、選別することが
でき、感染によるプリオン病（特にＢＳＥ）をコントロ
ールするという広汎は用途に利用することが可能であ
る。

【００７３】次に、上記した本発明の第１の濃縮方法を
説明する。

【００７４】本発明の第１の濃縮方法によれば、動物組
織由来物質から病原性プリオン蛋白質を検出する病原性
プリオン蛋白質の検出方法の実施に際し、検出されるべ
き前記病原性プリオン蛋白質を濃縮する方法において、
前記第１の工程として、前記動物組織由来物質の種類に
応じたＮ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノ−
１−プロパンスルホネート又はｔ−オクチルフェノキシ
ポリエトキシエタノールと酵素とを用いて前記動物組織
由来物質を均一化する均一化工程を有しているので、前
記酵素の作用で前記動物組織由来物質を十分に溶解し、
また、その種類に応じた界面活性剤として、Ｎ−ドデシ
ル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノ−１−プロパンスル
ホネート又はｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタ
ノールからなる非イオン性界面活性剤の存在下で非特異
的物質を可溶化し、病原性プリオン蛋白質を含有する前
記動物組織由来物質を十分に均一化することができる。

【００７５】従って、前記動物組織由来物質における病
原性プリオン蛋白質の割合が比較的低濃度であっても、
これを良好に均一化することができ、ひいては良好な病
原性プリオン蛋白質の濃縮物を得ることができる。つま
り、病原性プリオン蛋白質を分離、抽出するために有効
な均一化物（ホモジネート）を得ることができる。

【００７６】ここで、前記動物組織由来物質を中枢神経
系組織とすることが望ましい。また、前記中枢神経系組
織を脳組織とすることがさらに望ましい。

【００７７】また、第２の工程として、前記第１の工程
で得られた均一化物を分解酵素を用いて分解処理する分
解処理工程を有しているので、前記均一化物中の病原性
プリオン蛋白質を含む物質（特に、染色体）を十分に分
解、消化させて、目的物である病原性プリオン蛋白質を
十分に取り出すことができる。

【００７８】前記分解酵素として、コラーゲン分解酵素
及びＤＮＡ分解酵素を用いて前記均一化物を分解し、さ
らに蛋白質分解酵素を用いて分解することが望ましい。

【００７９】また、前記分解酵素として、前述したパパ
インやブロメリン等の植物プロテアーゼ及び／又は微生
物プロテアーゼを用いて前記均一化物を分解することも
できる。

【００８０】次に、第３の工程として、前記第２の工程
で分解された前記均一化物から前記病原性プリオン蛋白
質を含有する濃縮物を得る分離工程を有しているので、
上記の第１の工程及び第２の工程で十分に均一化及び分
解された前記病原性プリオン蛋白質を含有する物質を効
率的に分離することができる。

【００８１】この分離工程では、例えば、遠心分離（超
遠心分離）等の手段を用いて分離、濃縮することができ
る。

【００８２】以上が、本発明の第１の濃縮方法の基本的
な構成であるが、本発明の第１の濃縮方法では、上述し
た本発明の検出方法と同様に、前記第１の工程〜第３の
工程に加えて、例えば、下記のような工程を付加するこ
とが望ましい。

【００８３】例えば、前記濃縮工程中に、前記第３の工
程で得られた前記病原性プリオン蛋白質を含有する濃縮
物を分解酵素を用いて分解し、次いで分離後に塩析処理
を施す工程を更に有することが望ましい。

【００８４】即ち、前記病原性プリオン蛋白質の溶解性
を一層向上させるために、例えば、サーコシル等の分解
酵素を使用して溶解処理、分離処理を行い、得られた分
離抽出物を例えば、ＮａＣｌ等を用いて塩析を行った
後、分離処理を行うことによって、一層濃縮された病原
性プリオン蛋白質を含有する濃縮物（例えばペレット）
を得ることができる。

【００８５】また、前記濃縮工程中に、前記第３の工程
で得られた前記病原性プリオン蛋白質を含有する濃縮物
を界面活性剤で洗浄する洗浄工程を更に有することが望
ましい。

【００８６】即ち、前記濃縮物（例えばペレット状）の
付加的な洗浄工程として、前記界面活性剤を用いて前記
濃縮物を洗浄することによって、前記濃縮物中の不所望
の物質（非特異的物質）をさらに多く除去することがで
きる。前記界面活性剤としては、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ
−ジメチル−３−アミノ−１−プロパンスルホネート
（例えば、前記ズイッタージェント 3-12, 3-08, 3-10
など）からなる非イオン性界面活性剤を使用することが
望ましい。

【００８７】次に、上記した本発明の第２の濃縮方法を
説明する。

【００８８】本発明の第２の濃縮方法によれば、動物組
織由来物質から病原性プリオン蛋白質を検出する病原性
プリオン蛋白質の検出方法の実施に際し、検出されるべ
き前記病原性プリオン蛋白質を濃縮する方法において、
第１の工程として、前記動物組織由来物質の種類に応じ
た界面活性剤と酵素とを用いて前記動物組織由来物質を
均一化する均一化工程を有しているので、前記酵素の作
用で前記動物組織由来物質を十分に溶解し、また、その
種類に応じた前記界面活性剤の存在下で非特異的物質を
可溶化し、病原性プリオン蛋白質を含有する前記動物組
織由来物質を十分に均一化することができる。

【００８９】従って、前記動物組織由来物質における病
原性プリオン蛋白質の割合が比較的低濃度であっても、
これを良好に均一化することができ、ひいては良好な病
原性プリオン蛋白質の濃縮物を得ることができる。つま
り、病原性プリオン蛋白質を分離、抽出するために有効
な均一化物を得ることができる。

【００９０】この第１の工程において、前記動物組織由
来物質を細網リンパ系組織とすることが望ましい。特
に、前記細網リンパ系組織が脾臓組織である場合は、上
述したように、上記界面活性剤を使用することによっ
て、前記脾臓組織における非特異的物質を十分に可溶化
することができる。

【００９１】次に、第２の工程として、前記第１の工程
で得られた均一化物を分解酵素を用いて分解処理する分
解処理工程を有しているので、前記均一化物中の病原性
プリオン蛋白質を含む物質（特に、染色体）を十分に分
解、消化させて、目的物である病原性プリオン蛋白質を
十分に取り出すことができる。

【００９２】ここで、前記分解酵素としてコラーゲン分
解酵素及びＤＮＡ分解酵素を用いて前記均一化物を分解
し、さらに蛋白質分解酵素を用いて分解することが望ま
しい。

【００９３】また、前記分解酵素として、前述したパパ
インやブロメリン等の植物プロテアーゼ及び／又は微生
物プロテアーゼを用いて前記均一化物を分解することも
できる。

【００９４】次に、第３の工程として、前記第２の工程
で分解された前記均一化物から前記病原性プリオン蛋白
質を含有する濃縮物を得る分離工程を有しているので、
上記の第１の工程及び第２の工程で十分に均一化及び分
解された前記病原性プリオン蛋白質を含有する物質を効
率的に分離することができる。

【００９５】この分離工程では、例えば、遠心分離（超
遠心分離）等の手段を用いて分離、濃縮することができ
る。

【００９６】次に、洗浄工程として、前記第３の工程で
得られた前記病原性プリオン蛋白質を含有する濃縮物を
Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノ−１−プ
ロパンスルホネートからなる非イオン性界面活性剤で洗
浄する洗浄工程を更に有しているので、前記濃縮物中の
不所望の物質（非特異性物質；例えば、正常なプリオン
蛋白質や他の蛋白質など）をさらに多く除去することが
できる。

【００９７】上述した、本発明の第１の濃縮方法及び第
２の濃縮方法によれば、前記動物組織由来物質に蓄積さ
れる病原性プリオン蛋白質の蓄積濃度が比較的小さくて
も、これを十分に濃縮させることができる。なお、上記
各濃縮方法で得られた病原性プリオン蛋白質を含有する
濃縮物は、後段でＥＬＩＳＡ法に用いてもよいし、ま
た、ＷＢ法や電気泳動法などに用いてもよい。

【００９８】

【実施例】以下、本発明を具体的な実施例について説明
するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではな
い。

【００９９】本実施例は、スクレーピー感染マウスから
の粗組織抽出物のＰｒＰ^sc（病原性プリオン蛋白質：以
下、同様）のＰｒＰ^scの検出、及び検出されるべきＰｒ
Ｐ^scの濃縮を行うものである。

【０１００】１．本実施例ではSIc/ICR マウスを用い
た。このマウスは、オビヒロ種スクレーピーを脳内感染
したもの（シナガワ他、１９８５年）であり、明らかに
スクレーピーを発症したマウスから脳組織及び脾臓組織
を取り出した。

【０１０１】２．脳組織及び脾臓組織からのＰｒＰ^scの
濃縮 サンプルは図１〜図３に示す８種の異なる濃縮法で調製
した。すべての８つの方法は、ハサミで細かく切り刻ん
だ組織サンプルを、分解酵素で消化させたこと（第２の
工程）、および、非イオン性界面活性剤の存在下で、可
溶性の非特異的物質を抽出し、遠心分離（第３の工程）
する目的のために均一化を行うこと（第１の工程）にお
いて共通している。

【０１０２】以下、ＰｒＰ^scの濃縮方法に関し、方法１
〜方法８について図１〜３を参照しながら簡単に説明す
る。

【０１０３】方法１ まず、8%ズイッタージェント 3-12 （非イオン性界面活
性剤）と、サーコシル（酵素）と、100mM 塩化ナトリウ
ム（NaCl）と、5mM 塩化マグネシウム（MgCl）と、50m
M、pH=7.5のトリス−塩酸緩衝液（Tris-HCl）とを加え
て、上記脳組織を均一化し、均一化物( ホモジネート)
を作製した（第１の工程）。

【０１０４】次いで、この均一化物を、0.5mg/100mg コ
ラゲナーゼ〔３，４，２４，３〕(Collagenase）及び 4
0 μg/100mg のＤＮアーゼ〔３，１，２１，１〕(DNas
e）を用いて、温度37℃、4 〜12時間で分解（消化）処
理を行い、さらに、50μg/100mg のプロテイナーゼ
〔３，４，２１，１４〕（Proteinase K）を用い、温度
37℃、0.5 〜2 時間で分解（消化）処理を行った（第２
の工程）。この分解（消化）処理は、前記組織中の病原
性プリオン蛋白質以外の測定夾雑物質の酵素分解のため
に行ったものである。

【０１０５】次いで、反応を停止した後、回転数15,000
rpm、室温で20分間遠心分離を行った。これを、5% SDS
（硫酸ドデシルナトリウム）で10分間加熱溶解させ（第
３の工程）、ＰｒＰ^sc含有の濃縮物を得た（図１）。

【０１０６】方法２ まず、方法１と同様に、上記脳組織を均一化し均一化物
を作製した（第１の工程）。次いで、前記均一化物を、
ブロメリン〔３，４，２２，２３〕(Bromelain）を用い
て温度４５℃、０．５〜２時間で分解（消化）した（第
２の工程）。

【０１０７】次いで、反応を停止した後、回転数15,000
rpm、室温で20分間遠心分離を行った。これを、5% SDS
（硫酸ドデシルナトリウム）で10分間加熱溶解させ（第
３の工程）、ＰｒＰ^sc含有の濃縮物を得た（図１）。

【０１０８】なお、ブロメリンを用いる場合、作用温度
４５〜８０℃、作用時間１〜１０時間程度が望ましい。
ブロメリンを用いる結果、使用する酵素の種類が１種類
となり、また操作が簡便（操作時間の短縮や経費圧縮）
になる。なお、測定結果は、３種類の酵素（コラゲナー
ゼ、ＤＮアナーゼ、プロテイナーゼ）を用いた場合と感
度においても遜色のない（同程度）結果であった。

【０１０９】方法３ 組織重量の5 〜8 倍容量の 4% トリトン X-100（非イオ
ン性界面活性剤）と、0.5% サーコシルと、100mM 塩化
ナトリウム（NaCl）と、5mM 塩化マグネシウム（MgCl）
と、50mM、pH=7.5のトリス−塩酸緩衝液とを加えて、上
記脾臓組織及び脳組織を均一化し均一化物を作製した
（第１の工程）。

【０１１０】次いで、方法１と同様の分解（消化）処理
を行った（第２の工程）。さらに方法１と同様の分離処
理を行った（第３の工程）。

【０１１１】次いで、前記分離処理（第３の工程）で得
られた沈殿物を 6.25% サーコシル及び10mM、pH=9.2の
トリス−塩酸緩衝液を用いて懸濁化、分解した（分解工
程）。

【０１１２】次いで、これを超音波破砕してから、回転
数15,000rpm で遠心分離し、その後、遠心分離で得られ
た溶液の上澄みに、最終濃度 12%で HClを添加、攪拌し
た（塩析工程）。この後、回転数55,000rpm で超遠心分
離し、5% SDSを用いて加熱溶解し、ＰｒＰ^sc含有の濃縮
物を得た（図２）。

【０１１３】方法４ 方法３と、分離処理（第３の工程）までは同様にして、
上記脾臓組織及び脳組織の分離を行ったのち、得られた
沈殿物（ペレット状）を5% SDSを用いて加熱溶解し、Ｐ
ｒＰ^sc含有の濃縮物を得た（図２）。

【０１１４】方法５ 方法３と、分離処理（第３の工程）までは同様にして、
上記脾臓組織の分離を行ったのち、得られた沈殿物（ペ
レット状）を 8% ズイッタージェント 3-12 （非イオン
性界面活性剤）と、10mM、pH=7.5のトリス−塩酸緩衝液
とを加えて均一化し、均一化物を作製した（第１の工
程）。

【０１１５】次いで、回転数15,000rpm で遠心分離し、
得られた沈殿物（ペレット状）を5%SDSを用いて加熱溶
解し、ＰｒＰ^sc含有の濃縮物を得た（図２）。

【０１１６】方法６ 方法３において、その分解処理工程（第２の工程）で、
コラゲナーゼ及びＤＮアーゼ、更には、プロテイナーゼ
を用いて分解（消化）処理を行う代わりに、方法２と同
様のブロメリン(Bromelain）を用いて、組織中の病原性
プリオン蛋白質以外の測定夾雑物質を酵素分解した以外
は方法３と同様にして、ＰｒＰ^sc含有の濃縮物を得た
（図３）。

【０１１７】方法７ 方法４において、その分解処理工程（第２の工程）で、
コラゲナーゼ及びＤＮアーゼ、更には、プロテイナーゼ
を用いて分解（消化）処理を行う代わりに、方法２と同
様のブロメリンを用いて、組織中の病原性プリオン蛋白
質以外の測定夾雑物質を酵素分解した以外は方法４と同
様にして、ＰｒＰ^sc含有の濃縮物を得た（図３）。

【０１１８】方法８ 方法５において、その分解処理工程（第２の工程）で、
コラゲナーゼ及びＤＮアーゼ、更には、プロテイナーゼ
を用いて分解（消化）処理を行う代わりに、方法２と同
様のブロメリンを用いて、組織中の病原性プリオン蛋白
質以外の測定夾雑物質を酵素分解した以外は方法５と同
様にして、ＰｒＰ^sc含有の濃縮物を得た（図３）。

【０１１９】即ち、方法３、方法４及び方法５では、５
〜８倍容量の４％(wt/vol)トリトンX-100を均一化バッ
ファに添加し、方法１では、８％(wt/vol)ズイッタージ
ェント 3-12 を前記トリトン X-100の代わりに添加し
た。

【０１２０】方法５で用いたズイッタージェント 3-12
は、不所望な材料（非特異的物質）を更に多く除去する
ために、第３の工程（回転数15,000 rpm）での遠心分離
(TLA 100.3 回転子、オプティマ TLX デスクトップ型
超遠心機、ベックマン（Beckman)社製) で得られたペレ
ットの付加的な洗浄工程として用いた。

【０１２１】方法３では、ＰｒＰ^scの溶解性を上げるた
め、ＰｒＰ^scを６．２５％(wt/vol)サーコシルによりｐ
Ｈ＝９．２ (これは従来用いたｐＨよりも高い値であ
る) で抽出した。サーコシル抽出後は、ＰｒＰ^scの溶解
性を再び下げるため、１０％(vol/vol) ＨＣｌでｐＨを
中性に戻し、次いで１２％(wt/vol)ＮａＣｌによるＰｒ
Ｐ^scの塩析と、55,000 rpmでの最終遠心分離処理を行
い、一層濃縮されたＰｒＰ^scを含有するペレットを得
た。このサーコシル抽出とＮａＣｌによるＰｒＰ^scの塩
析は、方法４、方法５、方法１では省略し、サンプル調
製プロセスを簡略化した。

【０１２２】３．ウエスタンブロット分析 スクレーピーに感染させたマウスの脳、脾臓をサンプル
とした。脳は方法１で脾臓は方法３で調製した。サンプ
ルは２³ 倍から２¹¹倍希釈した。ＷＢ法に先立ち、各希
釈サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（電気泳動）を行い、こ
れをＰＶＤＦ膜に転写した。ブロッキングには、５％の
スキムミルクを用い、検出にはＢ１０３ポリクローナル
抗体を使用した。ＥＬＣ−Western blot detection sys
tem(Amersham社製）で検出した。

【０１２３】４．ＥＬＩＳＡ法 図４に示すように、マイクロタイタープレートへの適切
な吸着条件を調べるために、まず、脳組織及び脾臓組織
抽出物を、5% SDS :硫酸ドデシルナトリウム中で 10 分
間加熱沸騰させ（１）、これを 10 倍容量以上の氷冷メ
タノール中で沈殿させた（２）。この組織抽出物は、通
常、 10 〜 40mg の原組織を含有していた。但し、前記
（数値）は、図４中の（数値）と対応するものである
（以下、同様）。

【０１２４】次いで、遠心分離処理（３）後、得られた
ペレット状沈殿物を 100μl の異なる濃度(1〜5M) のグ
アニジンチオシアネート (グアニジンチオシアン酸エス
テル：GdnSCN) 、 PBS (リン酸緩衝生理食塩水: 最終 p
H ≦ 5 )中で超音波溶解させた（４）。ここまでの工程
（１）〜（４）は上述した第４の工程に相当するもので
ある。

【０１２５】また、図５に示すように、溶剤として SDS
を用いた場合の測定を行うために、GdnSCN の使用に変
えて、ペレットを 100μl の異なる濃度(0.1〜4%(vol/v
ol))の SDS 、 PBS (最終 pH ≦ 5 )中に溶解させた。

【０１２６】次いで、それぞれの溶液を、96穴丸底マキ
シソープ免疫プレート（商品名：Maxisorp immuno plat
e ：Nunc）上に分布させ、室温で一晩、振揺下で培養し
た（５）（なお、例えばコーニング社製ＥＬＩＳＡプレ
ート高結合型４３０４５２を用いてもよい）。

【０１２７】次いで、前記プレートを、PBS で３回洗浄
し（６）、PBS-5% 脱脂乳中で 1時間、37℃でブロッキ
ング（閉塞状態にすること）を行った（７）。

【０１２８】次いで、前記プレートを、0.05% トゥイー
ン(Tween)20 を含有する PBS（以下、PBSTと称する）で
３回洗浄した（８）。

【０１２９】次いで、兎の抗血清 B-103 (ホリウチ他、
１９９５年) を一次抗体として PBSの初期容量分を用
い、33% 硫酸アンモニウムでの沈殿処理後に、PBST-0.5
% 脱脂乳中で 2,000倍に希釈した後、ウエル（上記穴：
以下、同様）中に 100μl 分布させた。前記プレート
は、室温で 1時間、振揺下で培養し、抗原−抗体反応複
合体を形成した（９）。ここで、前記工程（５）〜
（９）は、第５の工程に相当する。

【０１３０】このプレートを PBST で３回洗浄した後、
アビジン（Avidin）−ビオチン（Biotin）複合体 (ABC)
法により、下記のようにして顕在化させたところ、上記
抗原−抗体複合体が目視状態となった。ただし、ＡＢＣ
法用のキットとしてベクタステイン・エリート ＡＢＣ
キット、ベクター研究所製（Vectastain Elite ABC ki
t, Vector Laboratories)を使用した。

【０１３１】ビオチン（ビタミンＨ）化した抗ウサギ免
疫グロブリン(anti-rabbit IgG）をPBST-0.5% 脱脂乳
中で 1,500倍に希釈し、ウエルを室温、振揺下で 1時
間、 100μl を培養した（１０）。

【０１３２】次いで、 PBST で 4回洗浄し、PBS で 1回
洗浄した後（１１）、キットの成分Ａ（アビジン）と成
分Ｂ（ビオチン）とをそれぞれ、200 倍の希釈率で PBS
に添加し、ウエル中に分布させた（１２）。ここで、
前記キットとは、上記ＡＢＣ法を実施するための用具や
調製剤が組になっているものである。

【０１３３】次いで、培養及び洗浄を、ビオチン化され
た抗体（即ち、吸着された抗体）に関して行った（１
３）。

【０１３４】発色は、基質溶液〔 100μl/mlの 2,2'-ア
ジゾ−ビス (3-エチル- ベンズチアゾリン-6- スルホネ
ート）: ABTS〕 100μl で培養後、0.05M クエン酸−リ
ン酸エステルからなる緩衝液中で 0.04%の過酸化水素で
室温、 1時間、暗中で行った（１４）。

【０１３５】次いで、マイクロプレートリーダー〔Mode
l 2550, バイオ−レッド研究所(Bio-Red Laboratorie
s)〕で波長 405nmの発色を確認した（１５）。

【０１３６】この ABC法に基づく発色法に代えて、ホー
スラディッシュペルオキシダーゼ複合ロバ抗兎 IgG（ho
rse radish peroxidase-conjugated donky annti-rabbi
t IgG (Amersham 社製)) 100μl で PBST-0.5%脱脂乳中
で 800倍の希釈下でウエルを培養した（１６）。この
後、 PBST で４回洗浄し、PBS で１回洗浄した（１
７）。以下、この方法を間接法と称する。

【０１３７】また、培養と洗浄とをビオチン化された抗
体に対して行った。なお、カットオフラインは、平均光
学濃度(OD)と非感染マウスの組織抽出物でコーティング
した、４〜８個の負のコントロール群の標準偏差との合
計で決定した。

【０１３８】５．測定結果 (1) 適当なコーティング条件の決定 マイクロタイタープレートへの高い吸着率を実現するた
めには、ＰｒＰ^scを十分に溶解させる必要がある。ここ
で、ＰｒＰ^scを溶解させるために GdnSCN と SDS の有
用性を評価した（図５）。

【０１３９】図５において、マイクロタイタープレート
へのＰｒＰ^sc吸着時の GdnSCN 及びSDSの効果を見るた
めに、スクレーピー感染マウスの脳組織(A) 及び脾臓組
織(B) からのサンプルを方法１及び方法５によってそれ
ぞれ調製した。各 SDS 及びGdnSCN の各濃度におい
て、脳(A) 及び脾臓(B) の1mg 相当量から抽出液を採取
し、これをマイクロタイタープレート１枚当たり３つの
ウエルにコーティングした。

【０１４０】非感染マウスからの各組織抽出物を調製
し、 3M の GdnSCN-PBS に溶解させ、負のコントロール
群（negative controls(Ctrl.); コントロール）として
用いた。ここでは、2mg の脳等価物(6ウエル分) 又は
2.5mgの脾臓等価物(4ウエル分)を各ウエルに対して用い
た。

【０１４１】また、図５に平均値及びその標準偏差(S.
D.)を示した。カットオフラインは、それぞれの平均値
に対し３つの標準偏差値（３ S.D. ：以下、同様）を加
えることによって決めた。なお、間接法及び ABC法を脳
組織及び脾臓組織についてそれぞれ適用した。なお、前
記カオトロピックイオン剤は、疎水性分子の水溶性を増
加させ、疎水結合を弱め、膜蛋白質等の抽出に用いられ
るものであり、例えばGdnSCNが挙げられる。

【０１４２】PBS へのＰｒＰ^scの溶解は、カオトロピッ
クイオン（chaotropic）剤又は界面活性剤なしで行う
と、マイクロタイタープレートへの吸着が脳組織のもの
では幾らか生じるが、脾臓組織のものでは生じなかった
（図５(A) 、(B) : OMのGdnSCN) 。また、SDS 濃度が最
低濃度(0.1%)であっても、脳組織からＰｒＰ^scの吸着は
生じていなかった（図５(A) ）。

【０１４３】これに対して、PBS 濃度を増やしながら G
dnSCN を PBSに添加すると、コーティング効率が向上
し、 GdnSCN の濃度が 4M の側で脾臓組織のものについ
てのピークが生じた（図４(B) ）。また、 3M 付近の G
dnSCN 濃度で、脳組織のものについてはピークを示した
（図４(A) ）。即ち、溶剤として１〜５Ｍ（特に３〜４
Ｍ）の GdnSCN を使用したとき、強く特異的な吸着が見
られた。

【０１４４】PBS 中での GdnSCN 濃度が高くなれば、pH
値が低下 (≦ 5) するので、0.05Mの重炭酸ナトリウム
のカーボネートバッファ (pH=9.6) を PBS に対して定
量的に置換することによって GdnSCN と SDS双方を希釈
し、これによって最終 pH を8以上に高めた。しかしな
がら、吸着率は低下する傾向があった (データは示さ
ず) 。

【０１４５】(2) 2つの異なる検出方法 : 間接法及び
ABC法の比較 間接法と ABC法とを感度及び特異性について比較した。
図６は、抗原−抗体複合体の検出に関する ABC法と間接
法との比較を示す。

【０１４６】スクレーピー感染マウスの脳組織のサンプ
ル(A) を方法１で調製し、引き続いて、 3M の GdnSCN
中へ順次２倍ずつ希釈した。脾臓組織(B) については、
方法３を適用し、 4M の GdnSCN を用いた。 2つの測定
方法は、 2つの検出方法における平均値を求めた。負の
コントロール群（コントロール）についても示した。標
準偏差(S.D.)は小さすぎて図示していない。カットオフ
ラインはそれぞれに対して 3 S.D. を加えて決めた。脾
臓組織の測定におけるカットオフラインは 40mg の脾臓
等価物（即ち、４０ｍｇの脾臓に相当する量：以下、同
様）からなる負のコントロール群のデータに基づいて決
めた。

【０１４７】この測定結果によれば、脳組織については
ABC法の方がわずかに優れている（図５(A) ）が、 ABC
法は脾臓組織について明らかに好ましいことが分かった
（図５(B) ）。脾臓組織に関して、 ABC法は、間接法に
比べて少なくとも 2倍の感度を示した。また、一般に、
ABC法により得られる結果は、間接法よりも再現性が高
いことが分かった (データは図示せず) 。従って、最終
的な測定（図８のＥＬＩＳＡ法とＷＢ法との比較）で
は、脾臓組織及び脳組織に対し、 ABC法を適用した。

【０１４８】(3) 適切なサンプル調製法（濃縮法）の確
立 ＥＬＩＳＡ法については方法３を用いた。このサンプル
調製（濃縮）法は公知のウエスタンブロット法（グレイ
スウォール他、１９９６年）用のサンプル調製法であ
る。ここで、サーコシル抽出及び NaCl によるＰｒＰ^sc
の塩析は、方法４、方法５、方法１では省略した。

【０１４９】そして、抽出によるＰｒＰ^scの分離に代え
て、8%(wt/vol)ズイッタージェント3-12 を用いてサン
プルからＰｒＰ^c (正常なプリオン蛋白質) 及び他の蛋
白質を十分に除去した。前記ズイッタージェント 3-12
は、トリトン X-100よりも有効な洗浄剤であることが分
かった。それ故、前者を方法１の均一化バッファにおい
てトリトン X-100に代えて用いた。

【０１５０】脾臓組織については、コラゲナーゼによる
消化は、4%(wt/vol)トリトン X-100と 0.5%(wt/vol) サ
ーコシルとを用いて行った（方法３、方法４及び方法
５）。そして方法５においては、より非特異的な物質を
除去する目的で、40,000 rpmの遠心力下で得られたペレ
ット（濃縮物）を 8%(wt/vol) ズイッタージェント 3-1
2 及び 0.5%(wt/vol) サーコシルで更に抽出した。

【０１５１】(3-1) 脳組織について 図７は、脳組織及び脾臓組織の適切なサンプル調製法を
示すものである。図７(A) 、(B) とも、繰り返し行った
測定結果である。

【０１５２】脳組織抽出物は、方法４、方法３、方法１
で調製（濃縮）し、 3M の GdnSCN-PBS 中で２倍ずつ溶
解、希釈化した。ここで、プレートを調べるのに間接法
を用いた。負のコントロール群（コントロール）とし
て、 8個のウエルをそれぞれ、非感染マウスの 20mg の
脳組織等価物から方法１で得られた抽出物でコーティン
グした。カットオフ値は、3 S.D. を加えた平均値とし
た。

【０１５３】脾臓組織抽出物は、方法４、方法３、方法
５で調製（濃縮）し、 4M の GdnSCN-PBS 中で４倍ずつ
溶解、希釈化した。ここで、プレートを調べるのに ABC
法を用いた。負のコントロール群（コントロール）とし
て、各方法において 5個のウエルを非感染マウスの 40m
g の脾臓組織等価物からの抽出物でコーティングした。
平均値を示したが、S.D.は小さすぎて示していない。○
と□で表した曲線に対し、コントロールはゼロに近く、
カットオフ値は y軸上の 0.1U であったが、これは脾臓
組織で繰り返し得られた値におおよそ対応している（図
６及び図８）。

【０１５４】図７(A) によれば、均一化バッファ（方法
１）におけるズイッタージェント−サーコシルの組み合
わせによって、7.8 μg の脳組織と同量においてもＰｒ
Ｐ^scの検出を可能としたことが分かる。

【０１５５】また、トリトン−サーコシルの組み合わせ
（方法４）で得られた感度を方法１のものと比べた。方
法４は方法１もやや感度が劣るが、十分に実用的なもの
である。但し、方法３では、125 μg 以上の脳等価物で
しかＰｒＰ^scが検出されなかった。このように、サーコ
シル及び NaCl によるＰｒＰ^scの付加的な抽出は、ＥＬ
ＩＳＡ法による高感度抽出には至らないことが分かる。

【０１５６】方法１は、高感度に加えて、比較サンプル
（図７(A) ）の継続して弱い非特異的反応も明らかにし
た。従って、方法１は、脳組織のサンプル調製には最も
適した方法と考えられた。

【０１５７】(3-2) 脾臓組織について 方法４で得られた負のコントロール群のウエルは、完全
に正のシグナルを示す非特異反応を呈した（図７(B)
）。従って、この方法は、脾臓組織の調製には不適当
であることが分かった。負のコントロール群に基づいて
方法３及び方法５における感度のあるカットオフライン
を確立することは、負のコントロール群の非常に弱い反
応のために可能ではなかった。

【０１５８】従って、図６(B) 及び図８(C) の結果を含
め、脾臓組織について繰り返して確立した値を考慮しな
がら、カットオフラインを y軸の 0.1U とした。これに
よって、方法３と方法１について類似したＰｒＰ^scの検
出にとって効果的な反応が実現された（図７(B) ）。但
し、方法５は、大量の組織等価物について方法３の感度
には及ばなかったし、繰り返しの測定により、方法３の
感度のほぼ 2倍の感度を示した (データは示さず) が、
これはサーコシル抽出及び NaCl によるＰｒＰ^scの塩析
について検討する必要がある。

【０１５９】図７(B) に示したすべての方法の結果を比
較すると、脾臓組織についての感度及び特異性を向上さ
せるためには、ズイッタージェント 3-12 を含む洗浄剤
の組み合わせで非特異的蛋白を十分に除去すること、或
いは、抽出物及び塩析によってＰｒＰ^scを分離すること
が、効果的で必要な工程であることが分かる。

【０１６０】(4) ウエスタンブロット法とＥＬＩＳＡ法
の感度の比較 脳組織又は脾臓組織から抽出されたＰｒＰ^scを検出する
ための診断方法として、ＥＬＩＳＡ法の有用性は、ＥＬ
ＩＳＡ法とウエスタンブロット( ＷＢ) 法の感度比較で
確かめられた。

【０１６１】感染病状の発現前段階での動物の診断法に
類似した比較であって、ＰｒＰ^scのごく少量が潜伏して
いる組織サンプルの比較を行うために、非感染マウスの
組織均一化物で希釈されたスクレーピー感染マウスから
の組織均一化物を処理した。

【０１６２】図８は、ＥＬＩＳＡ法とウエスタンブロッ
ト法との感度比較を示している。すべての結果は各測定
のデータである。脳組織についての結果は、図８(A)
（ＥＬＩＳＡ法）、図８(B) （ＷＢ法）に示し、脾臓組
織についての結果は、図８(C)（ＥＬＩＳＡ法）、図８
(D) （ＷＢ法）に示す。

【０１６３】(4-0) ＥＬＩＳＡ法及びＷＢ法のサンプル
調製：脳組織は方法１で、脾臓組織は方法３で調製し
た。スクレーピー感染マウスから得られた組織均一化物
を、非感染マウスの対応する組織の 20mg 等価物からの
ホモジネート中で順次２倍ずつ希釈した。 2³ 倍 (即
ち、2.5mg/20mg に等しい組織等価物全量に対するスク
レーピー組織等価物の割合) から 2¹¹倍(9.8μg/20mg)
への希釈工程の結果を示す。

【０１６４】ＥＬＩＳＡ法（図８(A) 、図８(C) ）；
マイクロタイタープレートへの吸着に関し、各希釈工程
のサンプルは 20mg の組織等価物からの抽出物からな
り、脳組織及び脾臓組織についてそれぞれ 3M 及び 4M
の GdnSCN-PBS に溶解した。両組織とも、マイクロタイ
タープレートの 5個のウエルを非感染マウスからの 20m
g 当量の抽出物でコーティングし、ＥＬＩＳＡ法の負の
コントロール群（コントロール）とした。これらを図示
したが、標準偏差(S.D.)は小さすぎて図示していない。
また、カットオフラインは各平均値に 3 S.D. を加えた
値に相当している。

【０１６５】ＷＢ法（図８(B) 、図８(D) ）; 各希釈工
程について、組み合わせ総量が 20mg の組織から採取し
た抽出物を使用して１レーン当たりの負荷を行った。薄
膜はフィルムに15時間露出させた。

【０１６６】(4-1) 脳組織 ＥＬＩＳＡ法は、2⁸倍の希釈工程の場合に明らかに積極
的な反応が生じることそ示し、2⁹倍の希釈工程において
もカットオフライン以上となることが分かった。このこ
とは、スクレーピー感染マウスからの脳組織が全ホモジ
ネート量の 1/512 にすぎない場合 (これは脳等価物 2
0mg の全量中の 39 μg に相当する。)でも、ＰｒＰ^sc
を検出できることを意味する（図８(A) ）。

【０１６７】一方、ＷＢ法は、薄膜を15時間露出させた
後に、2⁸倍の希釈工程（これは1/256 の比率、即ち、 2
0mg の脳組織全量中の 78 μg のスクレーピー脳に相当
する。）で非常に弱いバンドを示すに過ぎなかった（図
８(B) ）。

【０１６８】この結果、ＥＬＩＳＡ法はＷＢ法と少なく
とも同等の感度を示していることがわかる。

【０１６９】(4-2) 脾臓組織 ＥＬＩＳＡ法は、2⁶倍の希釈工程の場合に明らかに積極
的な反応が生じることを示し、スクレーピー感染マウス
の脾臓組織が全量の 1/64 にすぎない（即ち、20mg の
脾臓等価物の全量中の 312.5μg に相当する。）場合で
も、ＰｒＰ^scが抽出物中に検出されたことを示す（図８
(C) ）。

【０１７０】ＷＢ法は、15時間の露出後に、2⁵倍以下の
希釈（これは、スクレーピー感染マウスの組織の 1/32
、即ち、20mgの脾臓組織等価物全量中の 625μg に相
当する。）で、24.5 kDa、21 kDa、17 kDaのＰｒＰ^sc特
有のバンドを示した（図８(D)）。

【０１７１】従って、脾臓組織についても、ＥＬＩＳＡ
法の感度はＷＢ法の感度以上に相当するものであること
が分かる。

【０１７２】ここで、脾臓組織に関しＥＬＩＳＡ法によ
る積極的な結果を得るのに求められる組織等価物は、脳
組織に関して求められる組織等価物より 8倍多いだけで
あった。

【０１７３】６．評価 マウスのスクレーピーは感染後 1週間目にＷＢ法で診断
され (グレイスウォール他、１９９６年）、レイスとエ
ルンスト(1992b) は感染後 2週間目にＰｒＰ^scのデノボ
合成を検出した。羊のスクレーピーもＷＢ法によって感
染初期段階で診断された (イケガミ他、１９９１年 ;ム
ラマツ他、１９９９３年）。

【０１７４】これらの結果を組織病理学（Histopatholo
gy）（レイス他、1992a)、電子顕微鏡法（ルーベンシュ
タイン他、１９９１年）、又は免疫組織化学法 (シュル
ーダー他、１９９６年）による羊の扁桃腺中のＰｒＰ^sc
の予備臨床についての新しい報告の如き他の方法で得ら
れた結果と比較すると、ＷＢ法はスクレーピーの初期で
の最も高感度な方法の 1つであり、面倒なバイオアッセ
イ(bio assay) を省略できる。

【０１７５】また、腸壁（腹膜）内面の感染後 1週間目
に、マウスからの脾臓中のＰｒＰ^scの検出が十分な組織
均一化物によって実現され、ホモジネートのコラゲナー
ゼ消化によって行われた（グレイスウォール他、１９９
６年）これによって、本発明者によるＷＢ法の感度が他
の報告 (ルーベンシュタイン他、１９９１年；レイス及
びエルンスト 1992b）で述べられているマウス脾臓から
のＰｒＰ^scの検出結果と少なくとも一致していることが
分かった。

【０１７６】本発明者は、ＷＢ法と感度が少なくとも同
等であり、容易かつ短時間に検出可能なＥＬＩＳＡ法を
脳組織及び脾臓組織に適用した。

【０１７７】スクレーピー診断にＥＬＩＳＡ法を開発す
る上での大きな障害は、ＰｒＰ^scが容易に沈積状態に凝
集することであった (メイヤー他、１９８６年）。スク
レーピー感染組織のギ酸又は SDSでの予備処理（カスク
サック他、１９８７年）更に、純粋なＰｒＰ^scの GdnSC
N での変性 (これはマイクロタイタープレートへの吸着
後に行われた ;サーバン他、１９９０年）が報告されて
おり、これは、抗 PrP抗体の免疫反応性を増大させる。
また、マイクロタイタープレートへの BSA牛胎児血清 )
の吸着がグアニジンの存在下で向上することが報告され
た（ズー他、１９９３年）グアニジンはおそらく、抗原
性サイトが生じることによって次々と耐プリオン蛋白質
抗体の免疫反応性を増大させるＰｒＰ^scの展開を促進さ
せるものと考えられる。

【０１７８】これらの観察及び考察に基づいて、本発明
者は、ＰｒＰ^sc含有物質を直接溶解させるために 1M 〜
5M（特に3M及び4M）の GdnSCN を用い、この濃度での G
dnSCN の存在下でマイクロタイタープレートへのＰｒＰ
^scの吸着に成功した。

【０１７９】ＥＬＩＳＡ法で分析可能な組織等価量の限
界、即ち、感度の向上が見込めない限界値は、 40mg 付
近 (データは図示せず) にある。

【０１８０】ＥＬＩＳＡ法の利点は、多くのサンプルを
1回で分析できるため、潜在的に感染された動物を大量
に診断、選別することによって、感染による病気をコン
トロールするという広汎な用途に導けることである。

【０１８１】ＰｒＰ^scの検出を経て TSE (伝播性海綿状
脳症:Transmissible Spongiform Encephalopathies）を
実際に診断する方法に対する障害は、血液又はその成分
を未だ診断に使用しにくいことにある。ＰｒＰ^scは脳又
はリンパ線組織から抽出されるべきものであるから、サ
ンプル調製は最も時間を要するファクタである。脳組織
について適用される方法（方法１）はかなり簡単な方法
であり、高感度化に導くものである。但し、方法１は、
脾臓組織には十分ではない。これに関して、Sarksyl に
よる PrP^scの抽出及びこれに続く NaCl による塩析 (方
法3) によって、感度が向上し、非特異性シグナルが減
少する。

【０１８２】この方法は、時間がかかるが、ごく少量の
PrP^scを検査するのに有用である。一方、ＰｒＰ^scの抽
出及び塩析を省略し、サンプル調製（濃縮）を方法５で
行うと、ＥＬＩＳＡ法の感度が約 2倍低下するが、なお
も、ＷＢ法と同等であった (データは示さず) 。このこ
とと、方法５が方法３よりも短時間で行える事実とか
ら、方法５は診断にとって実用可能であると考えられ
る。

【０１８３】本実施例を行うなかで見出されたＷＢ法に
おける 0.6mgの脾臓組織のＰｒＰ^sc検出限界は、公知の
0.3mgの検出限界（グレイスウォール他、１９９６年）
とほぼ同等であった。この場合、最終的な組織抽出物は
SDS-PAGE サンプルバッファによって希釈しているが、
通常の組織ホモジネートを希釈剤として用いて、最初の
抽出工程後に順次希釈を行ているため、ＰｒＰ^sc検出条
件はあまり有利ではなかった。ＥＬＩＳＡ法について報
告されている極限の検出限界はより困難な条件を考慮し
て見出されるべきである。

【０１８４】脳組織についての結果を脾臓組織のそれと
比較すると（図６、図７及び図８）、脳組織中のＰｒＰ
^sc量は脾臓組織中のＰｒＰ^sc量の 8〜30倍であるものと
考えられる。異なるマウス適用の TSEは脾臓組織に含ま
れるＰｒＰ^scで変化することを考慮しても、ルーベンシ
ュタイン等(1993)によってスクレーピー感染マウスで発
見された 500倍よりもかなり少なく、また、感染の終わ
りの段階で CJD (Creutfelt Jakob disease)感染マウス
においてサカグチ等(1993)によって発見された50 倍以
上よりも少ない。ラズメザス等（1996a)のみが細菌、マ
ウスモデルに関する約30倍の差を報告した。

【０１８５】本発明者は、ＰｒＰ^sc回収を高効率に行う
ことが改善されたサンプル調製で実現することを考慮し
ている。そして、マウス脾臓中のＰｒＰ^sc量はこれまで
考えられていたものより多いように思われる。

【０１８６】予備臨床に関するリンパ線組織の潜在力に
着目して、ヴァン・クーレン等（1996) は免疫組織化学
法によってＰｒＰ^sc量を幾つかの上記組織について調べ
た。この研究によれば、扁桃腺、脾臓及び腸間リンパ節
はこの順に、予備臨床の最も好適な組織である。本発明
者は、実験的モデル (イケガミ他、１９９１年) 及び天
然の羊スクレーピー (ムラマツ他、１９９３年）の双方
について、スクレーピーの予備臨床段階での生検表面リ
ンパ節に含まれるＰｒＰ^scを検出したことを報告した。
しかし、ＰｒＰ^sc量と各組織の得られ易さとを考える
と、シュルーダー等(1996)において提案されているよう
に、扁桃腺の生検及び検査は、生前試験（antemortem t
est)としてより適していると思える。

【０１８７】上述した実施例から、脳及び脾臓組織から
のＰｒＰ^sc検出のために、 ABC法と共にＥＬＩＳＡ法を
使用する方法は、少なくともＷＢ法と同等の感度が得ら
れると結論づけられる。また、このＥＬＩＳＡ法を羊の
スクレーピーや牛のBSE の診断に適用すれば、現行のＷ
Ｂ法に比べて、より実用的な、速い診断ができると思わ
れる。しかしながら、調査方法として適当なものにする
ためには、ＰｒＰ^scの抽出に要する手間をより簡便にす
る必要がある。

【０１８８】原組織抽出物や GdnSCN 溶解物に含まれる
ＰｒＰ^scをマイクロタイタープレートに容易に吸着でき
ることは、より高感度にＰｒＰ^scの検出を可能にする上
で基本事項と考えられる。発色ＥＬＩＳＡ法はＷＢ法に
比べてわずかに高感度であるが、蛍光物質や化学発光物
質のような発色試薬を使用することで、さらに感度を向
上させることができる。

【０１８９】

【発明の作用効果】本発明の検出方法によれば、動物組
織由来物質から病原性プリオン蛋白質を検出する病原性
プリオン蛋白質の検出方法において、前記動物組織由来
物質の種類に応じた界面活性剤と酵素とを用いて前記動
物組織由来物質を均一化する第１の工程と、前記第１の
工程で得られた均一化物を分解酵素を用いて分解処理す
る第２の工程と、前記第２の工程で分解された前記均一
化物から前記病原性プリオン蛋白質を含有する濃縮物を
得る第３の工程とを有する前記病原性プリオン蛋白質の
濃縮工程を経て、前記病原性プリオン蛋白質を含有する
濃縮物を溶剤に溶解して前記濃縮物の溶解物を得る第４
の工程と、この溶解物中の前記病原性プリオン蛋白質を
吸着面に吸着させる第５の工程と、前記第５の工程にお
いて吸着された前記病原性プリオン蛋白質を発色させる
第６の工程とを有する酵素免疫吸着測定法によって前記
病原性プリオン蛋白質を検出することを特徴としてお
り、まず、病原性プリオン蛋白質の濃縮工程において、
上述した第１の工程〜第３の工程を有しており、特に、
動物組織由来物質の種類に応じた界面活性剤を用いてこ
れを均一化しているので、前記動物組織由来物質に蓄積
される病原性プリオン蛋白質の蓄積濃度が比較的小さく
ても、これを十分に濃縮させることができる。

【０１９０】さらに、第４の工程から第６の工程を有す
る酵素免疫吸着測定法に基づいてこれを検出しているの
で、病原性プリオン蛋白質を特異的に、かつ強固に吸着
（固定化）させることができ、迅速かつ簡便に、そして
高感度でこれを検出することができる。

【０１９１】即ち、本発明の検出方法によれば、例えば
牛や羊などをプリオン病（スクレーピーやＢＳＥ）感染
初期の段階で診断、選別することが可能となり、また、
これを大量かつ迅速に行うことができる。

【０１９２】また、本発明の第１の濃縮方法及び第２の
濃縮方法によれば、動物組織由来物質から病原性プリオ
ン蛋白質を検出する病原性プリオン蛋白質の検出方法の
実施に際し、検出されるべき前記病原性プリオン蛋白質
を濃縮する方法において、蓄積濃度が比較的小さくても
これを十分に濃縮できる有効な濃縮方法を提供できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本実施例における病原性プリオン蛋白質の濃縮
方法の概要を示すフロー図である。

【図２】同、他の濃縮方法の概要を示すフロー図であ
る。

【図３】同、他の濃縮方法の概要を示すフロー図であ
る。

【図４】同、病原性プリオン蛋白質の検出に用いる酵素
免疫吸着測定法の概要を示すフロー図である。

【図５】同、酵素免疫吸着測定法における吸着の前段階
で使用する溶剤の種類及び濃度による病原性プリオン蛋
白質の検出能の変化を示すグラフである（脳組織(A) 、
脾臓組織(B) ）。

【図６】同、発色法による検出能を示すグラフである
（脳組織(A) 、脾臓組織(B) ）。

【図７】同、病原性プリオン蛋白質の濃縮方法による検
出能を示すグラフである（脳組織(A) 、脾臓組織(B)
）。

【図８】同、酵素免疫吸着測定法における検出能を示す
グラフ（脳組織(A) 、脾臓組織(C) ）、及びＷＢ法にお
ける検出能を示す図（脳組織(B) 、脾臓組織(D) ）であ
る。

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 動物組織由来物質から病原性プリオン蛋
   白質を検出する病原性プリオン蛋白質の検出方法におい
   て、 前記動物組織由来物質の種類に応じた界面活性剤と酵素
   とを用いて前記動物組織由来物質を均一化する第１の工
   程と、 前記第１の工程で得られた均一化物を分解酵素を用いて
   分解処理する第２の工程と、 前記第２の工程で分解された前記均一化物から前記病原
   性プリオン蛋白質を含有する濃縮物を得る第３の工程と
   を有する前記病原性プリオン蛋白質の濃縮工程を経て、 前記病原性プリオン蛋白質を含有する濃縮物を溶剤に溶
   解して前記濃縮物の溶解物を得る第４の工程と、 この溶解物中の前記病原性プリオン蛋白質を吸着面に吸
   着させる第５の工程と、 前記第５の工程において吸着された前記病原性プリオン
   蛋白質を発色させる第６の工程とを有する酵素免疫吸着
   測定法によって前記病原性プリオン蛋白質を検出するこ
   とを特徴とする、病原性プリオン蛋白質の検出方法。
2. 【請求項２】 前記動物組織由来物質を中枢神経系組織
   とし、前記界面活性剤をＮ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチ
   ル−３−アミノ−１−プロパンスルホネート又はｔ−オ
   クチルフェノキシポリエトキシエタノールからなる非イ
   オン性界面活性剤とする、請求項１に記載した病原性プ
   リオン蛋白質の検出方法。
3. 【請求項３】 前記中枢神経系組織を脳組織とする、請
   求項２に記載した病原性プリオン蛋白質の検出方法。
4. 【請求項４】 前記動物組織由来物質を細網リンパ系組
   織とし、前記界面活性剤をｔ−オクチルフェノキシポリ
   エトキシエタノールからなる非イオン性界面活性剤とす
   る、請求項１に記載した病原性プリオン蛋白質の検出方
   法。
5. 【請求項５】 前記細網リンパ系組織を脾臓組織とす
   る、請求項４に記載した病原性プリオン蛋白質の検出方
   法。
6. 【請求項６】 前記第２の工程において、前記分解酵素
   としてコラーゲン分解酵素及びＤＮＡ分解酵素を用いて
   前記均一化物を分解し、さらに蛋白質分解酵素を用いて
   分解する、請求項１に記載した病原性プリオン蛋白質の
   検出方法。
7. 【請求項７】 前記第２の工程において、前記分解酵素
   として植物プロテアーゼ及び／又は微生物プロテアーゼ
   を用いて前記均一化物を分解する、請求項１に記載した
   病原性プリオン蛋白質の検出方法。
8. 【請求項８】 前記濃縮工程中に、前記第３の工程で得
   られた前記病原性プリオン蛋白質を含有する濃縮物を分
   解酵素を用いて分解し、次いで分離後に塩析処理を施す
   工程を更に有する、請求項１に記載した病原性プリオン
   蛋白質の検出方法。
9. 【請求項９】 前記濃縮工程中に、前記第３の工程で得
   られた前記病原性プリオン蛋白質を含有する濃縮物を界
   面活性剤で洗浄する洗浄工程を更に有する、請求項１に
   記載した病原性プリオン蛋白質の検出方法。
10. 【請求項１０】 前記界面活性剤をＮ−ドデシル−Ｎ，
    Ｎ−ジメチル−３−アミノ−１−プロパンスルホネート
    からなる非イオン性界面活性剤とする、請求項９に記載
    した病原性プリオン蛋白質の検出方法。
11. 【請求項１１】 前記第４の工程における前記溶剤とし
    てグアニジンチオシアネートを使用する、請求項１に記
    載した病原性プリオン蛋白質の検出方法。
12. 【請求項１２】 １〜５モル濃度の前記グアニジンチオ
    シアネートを使用する、請求項１１に記載した病原性プ
    リオン蛋白質の検出方法。
13. 【請求項１３】 前記吸着面を一次抗体で形成し、この
    一次抗体と前記病原性プリオン蛋白質との抗原−抗体複
    合体を前記吸着面に生成させる、請求項１に記載した病
    原性プリオン蛋白質の検出方法。
14. 【請求項１４】 前記第６の工程において、前記病原性
    プリオン蛋白質を発色させ、その発色濃度を検出する、
    請求項１に記載した病原性プリオン蛋白質の検出方法。
15. 【請求項１５】 前記発色を蛍光発光で行う、請求項１
    ４に記載した病原性プリオン蛋白質の検出方法。
16. 【請求項１６】 前記蛍光発光の発光剤として化学発光
    物質を用いる、請求項１５に記載した病原性プリオン蛋
    白質の検出方法。
17. 【請求項１７】 動物組織由来物質から病原性プリオン
    蛋白質を検出する病原性プリオン蛋白質の検出方法の実
    施に際し、検出されるべき前記病原性プリオン蛋白質を
    濃縮する方法において、 前記動物組織由来物質の種類に応じたＮ−ドデシル−
    Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノ−１−プロパンスルホネ
    ート又はｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノー
    ルと酵素とを用いて前記動物組織由来物質を均一化する
    第１の工程と、 前記第１の工程で得られた均一化物を分解酵素を用いて
    分解処理する第２の工程と、 前記第２の工程で分解された前記均一化物から前記病原
    性プリオン蛋白質を含有する濃縮物を得る第３の工程と
    を有することを特徴とする、病原性プリオン蛋白質の濃
    縮方法。
18. 【請求項１８】 前記動物組織由来物質を中枢神経系組
    織とする、請求項１７に記載した病原性プリオン蛋白質
    の濃縮方法。
19. 【請求項１９】 前記中枢神経系組織を脳組織とする、
    請求項１８に記載した病原性プリオン蛋白質の濃縮方
    法。
20. 【請求項２０】 前記第２の工程において、前記分解酵
    素としてコラーゲン分解酵素及びＤＮＡ分解酵素を用い
    て前記均一化物を分解し、さらに蛋白質分解酵素を用い
    て分解する、請求項１７に記載した病原性プリオン蛋白
    質の濃縮方法。
21. 【請求項２１】 前記第２の工程において、前記分解酵
    素として植物プロテアーゼ及び／又は微生物プロテアー
    ゼを用いて前記均一化物を分解する、請求項１７に記載
    した病原性プリオン蛋白質の濃縮方法。
22. 【請求項２２】 前記第３の工程で得られた前記病原性
    プリオン蛋白質を含有する濃縮物を分解酵素を用いて分
    解し、次いで分離後に塩析処理を施す工程を更に有す
    る、請求項１７に記載した病原性プリオン蛋白質の濃縮
    方法。
23. 【請求項２３】 前記第３の工程で得られた前記病原性
    プリオン蛋白質を含有する濃縮物を界面活性剤で洗浄す
    る洗浄工程を更に有する、請求項１７に記載した病原性
    プリオン蛋白質の濃縮方法。
24. 【請求項２４】 動物組織由来物質から病原性プリオン
    蛋白質を検出する病原性プリオン蛋白質の検出方法の実
    施に際し、検出されるべき前記病原性プリオン蛋白質を
    濃縮する方法において、 前記動物組織由来物質の種類に応じた界面活性剤と酵素
    とを用いて前記動物組織由来物質を均一化する第１の工
    程と、 前記第１の工程で得られた均一化物を分解酵素を用いて
    分解処理する第２の工程と、 前記第２の工程で分解された前記均一化物から前記病原
    性プリオン蛋白質を含有する濃縮物を得る第３の工程と
    前記第３の工程で得られた前記病原性プリオン蛋白質を
    含有する濃縮物をＮ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３
    −アミノ−１−プロパンスルホネートからなる非イオン
    性界面活性剤で洗浄する洗浄工程とを有することを特徴
    とする、病原性プリオン蛋白質の濃縮方法。
25. 【請求項２５】 前記動物組織由来物質を細網リンパ系
    組織とする、請求項２４に記載した病原性プリオン蛋白
    質の濃縮方法。
26. 【請求項２６】 前記細網リンパ系組織を脾臓組織とす
    る、請求項２５に記載した病原性プリオン蛋白質の濃縮
    方法。
27. 【請求項２７】 前記第２の工程において、前記分解酵
    素としてコラーゲン分解酵素及びＤＮＡ分解酵素を用い
    て前記均一化物を分解し、さらに蛋白質分解酵素を用い
    て分解する、請求項２４に記載した病原性プリオン蛋白
    質の濃縮方法。
28. 【請求項２８】 前記第２の工程において、前記分解酵
    素として植物プロテアーゼ及び／又は微生物プロテアー
    ゼを用いて前記均一化物を分解する、請求項２４に記載
    した病原性プリオン蛋白質の濃縮方法。