JPH11335395A - 精製ヒトアクチビン及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】粗ヒトアクチビン、特に粗ヒトアクチビンＡか
ら医薬用途に適した高純度のヒトアクチビンＡを簡便に
単離、精製でき、かつ工業生産規模でヒトアクチビンＡ
を製造できる方法を開発すると共に、高純度に精製され
たヒトアクチビンを提供する。 【解決手段】粗ヒトアクチビンを、特に、カオトロピッ
クイオンの濃度勾配溶出法による陽イオン交換クロマト
グラフィーを含有する精製工程に付することにより、医
薬用途に使用できる高純度に精製されたヒトアクチビン
の製造を可能とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規精製ヒトアク
チビン、詳しくは純度が改善したヒトアクチビン及びそ
の製造方法に関し、特に、粗ヒトアクチビンＡからヒト
アクチビンＡを単離、精製する方法及び高純度に精製さ
れたヒトアクチビンＡに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ヒトアクチビンは、医薬品としての開発
が期待されており、特にヒトアクチビンＡは、骨粗鬆症
改善治療薬等医薬品その他の用途が期待できる有用物質
である。

【０００３】ヒトアクチビンＡはヒト白血病細胞株THP-
1（IFO 50147）の培養上清より単離、精製されたアミノ
酸１１６個のポリペプチド鎖２本から成るホモダイマー
タンパク質である。分子量は、約２５０００ダルトンで
あり、ポリペプチド鎖毎に９個のシステイン残基（Cy
s）が存在（ダイマーで合計１８個）、合計９個の分子
内、分子間ジスルフィド結合を形成している（Biochemi
cal and Biophysical Research Communications, 142,
1095-1103, 1987参照。）。

【０００４】本発明者等は、特に、ヒトアクチビンＡの
生産、精製手段として以下に示した４種類の方法を発展
させてきた。即ち （１）ヒト骨髄性白血病細胞THP-1（IFO 50147）をホル
ボールエステルを用いて刺激後に得た培養上清から、硫
安分画と４段階のカラムクロマトグラフィーにより得る
方法（細胞工学、別冊４、P48-58、1987年参照。）；

【０００５】（２）ヒトアクチビンＡのｃＤＮＡを組み
込んだ発現ベクターを導入して得たヒトアクチビンＡ高
生産遺伝子組み換えＣＨＯ細胞由来培養上清から、酸有
機溶媒沈殿／冷却層分離と逆相HPLCを組み合わせること
により得る方法（Biochemicaland Biophysical Researc
h Communications, 151, 230-235, 1988；及び特開平１
−３００８９８号公報参照。）；

【０００６】（３）上記と同じ方法で得られた培養上清
から、ヒトアクチビンＡ結合タンパク質であるフォリス
タチンをリガンドに用いたアフィニティークロマトグラ
フィーにより取得する方法（特開平２−２５５０９８号
公報参照。）；及び

【０００７】（４）ヒトアクチビンＡのｃＤＮＡを組み
込んだ発現ベクターを導入したヒトアクチビンＡ高生産
遺伝子組み換え微生物の、菌体中に蓄積される不溶性顆
粒より可溶化、リフォールディング処理して得た粗ヒト
アクチビンＡ溶液から逆相HPLCにより得る方法（国際出
願公開第ＷＯ９７／２３６３８号公報参照。）の４種類
の方法である。

【０００８】上記４種類の方法で得たヒトアクチビンＡ
は動物実験用サンプルとしては十分に高純度であった。
しかし、ヒトアクチビンＡを医薬品として開発するに
は、ヒトに投与するに足る極めて高純度の医薬品原体
を、適切な製造コストで工業生産し得る実用的な精製工
程を作り上げる必要があるが、上記方法ではヒトアクチ
ビンＡをヒトに投与し得るに十分な純度まで精製するこ
とが困難であった。即ち、上記４種類の生産方法で使用
されたクロマトグラフィー類をいくら組み合わせても、
宿主又は培地由来の抗原性物質や発熱性物質等、ヒトア
クチビンＡ遺伝子の翻訳ミスや翻訳後修飾不適切に基づ
く類縁体、及び精製工程で生じるヒトアクチビンＡ分解
物、修飾物等を高度に除去することは不可能であった。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、粗ヒ
トアクチビン、特に粗ヒトアクチビンＡから医薬用途に
適した高純度のヒトアクチビンＡを簡便に単離、精製で
き、かつ工業生産規模でヒトアクチビンを製造できる方
法の開発並びに高純度ヒトアクチビンの製造、及び提供
にある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者等は上記課題解
決に向けて鋭意検討を行った結果、粗ヒトアクチビンと
して粗ヒトアクチビンＡについて検討を行った。

【００１１】ヒトアクチビンＡの高生産遺伝子組み換え
微生物培養中の不溶性顆粒体よりリフォールディング処
理した粗ヒトアクチビンＡ溶液から、ヒトアクチビンＡ
とその類縁物質との電気的性質の差異を利用して分離す
るイオン交換クロマトグラフィーを確立することが最も
適当と考えた。その理由として、イオン交換クロマトグ
ラフィーは、逆相クロマトグラフィーに比較してスケー
ルアップが容易であり、タンパク質の工業的な大規模製
造に最も適する方法であると考えた。

【００１２】ところで、江藤等は粗ヒトアクチビンＡ
を、DEAE-トヨパール（東ソー製）、及びMono-Q（アマシャムファ
ルマシアハ゛イオテク製）の２種類の担体を使用する陰イオン交換
クロマトグラフィーで精製している（Biochemical and
Biophysical Research Communications, 151, 230-235,
1988参照。）。しかし、大量精製用カラム充填剤であ
るDEAE−トヨパールを使用して精製した場合、得られた
ヒトアクチビンＡのタンパク質純度は約２％と低く、高
性能な高速液体クロマトグラフィー（HPLC）カラムであ
るMono-Qを使用した場合でも約５５％のタンパク質純度
にとどまっている。何れも医薬品に適した純度のタンパ
ク質純度を達成するためには全く不充分な精製能力であ
った。加えて、何れのカラムを用いた場合でもヒトアク
チビンＡの回収率は低く（前者の回収率約５６％、後者
の回収率約６３％）、又希薄な溶液で回収されるため
に、そのまま工業的な生産に使用するのは不可能と結論
した。以上のように、従来知られた一般的な精製技術を
使用して、ヒトアクチビンＡのイオン交換クロマトグラ
フィーを工業的生産規模で実施することが極めて困難な
ことは全く明らかだった。

【００１３】本発明者等は、上記課題を解決するため
に、更に研究を進めた結果、粗ヒトアクチビンＡ溶液か
ら、必要により低分子不純物を除去後、陽イオン交換ク
ロマトグラフィーを含む精製工程を使用することによ
り、ヒトアクチビンＡを高度に精製する方法を見出し、
この知見に基づき本発明を完成するに到った。

【００１４】より詳しくは、本発明によれば、粗ヒトア
クチビン、特に粗ヒトアクチビンＡ溶液に、残留する場
合必要によりリフォールディング試薬を一般的な方法に
より除去した後、好ましくは高濃度有機溶媒を含有させ
て、カオトロピックイオン、及び極めて低いpH緩衝液で
平衡化された陽イオン交換カラムに負荷し、カオトロピ
ックイオンの濃度勾配溶出法によって、電気的性質の異
なる類縁体を高度に分離除去し、高純度のヒトアクチビ
ンＡを得ることができる。

【００１５】即ち、ヒトアクチビンＡ遺伝子を導入した
微生物を培養し、産生されたヒトアクチビンＡ不溶性顆
粒の可溶化、リフォールディングより得られた活性な粗
ヒトアクチビンＡ溶液を精製する場合、好ましくは低分
子不純物を除去した後、好ましくは、これを高濃度の有
機溶媒、極めて低いｐＨ、及びカオトロピックイオンの
性質をもつ塩を組み合わせた条件の陽イオン交換クロマ
トグラフィーに負荷し、カオトロピックイオン濃度勾配
溶出により、特に好ましくは宿主由来タンパク質、リフ
ォールディングしなかった会合凝集体、及び電気的性質
の異なる類縁体の何れも効果的に除去することができ、
しかも濃縮ヒトアクチビンＡを高回収率で取得可能であ
る。

【００１６】即ち、本発明は粗ヒトアクチビンを、陽イ
オン交換クロマトグラフィー、特に濃度勾配溶出法によ
る陽イオン交換クロマトグラフィーを含有する精製工程
に付して精製することにより純度が改善されたヒトアク
チビンを製造する方法である。当該濃度勾配溶出法はカ
オトロピックイオンの濃度勾配溶出法が好ましい。

【００１７】更に、本発明には下記の内容も含まれる： [1] 上記製造方法において、水溶性有機溶媒の存在下
及び／又は酸性下に陽イオン交換カラムクロマトグラフ
ィーを行う上記製造方法。

【００１８】[2] 上記[1]の精製方法において有機溶媒
が低級アルコール、アセトニトリル、ジメチルスルホキ
シド及びジメチルホルムアミドの少なくとも１種を含
み、その濃度が低くとも２０容量％、より好ましくは２
０〜６０容量％である上記製造方法。

【００１９】[3] 上記製造方法において、粗ヒトアク
チビンが、電気的に異なるその類縁体、宿主由来タンパ
ク質、宿主及び／又は培地由来の抗原性物質、発熱物質
等、リフォールディングに際してリフォールディングし
なかった会合凝集体、遺伝子翻訳ミスや翻訳後修飾不適
切に基づく類縁体、及び精製工程で生じるヒトアクチビ
ン分解物、修飾物等の少なくとも１種を含む上記製造方
法。

【００２０】[4] 上記製造方法において、粗ヒトアク
チビンが、ヒトアクチビン遺伝子を導入した微生物を培
養し、産生されたヒトアクチビン不溶性顆粒の可溶化、
リフォールディングより得られた活性な粗ヒトアクチビ
ン由来の不純物の少なくとも１種を含有する粗ヒトアク
チビンである上記製造方法。

【００２１】[5] 上記製造方法において、精製工程と
して低分子不純物を除去する精製工程を組合せた上記製
造方法。

【００２２】[6] 精製工程として、更にアルカリ性下
に陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製工程を含
有する上記製造方法。

【００２３】[7] 上記[6]の製造方法において、クロマ
トグラフィーが天然多糖をベースマトリックスとした陰
イオン交換クロマトグラフィーを含む上記製造方法。

【００２４】[8] ヒトアクチビン遺伝子を導入した微
生物を培養し、産生されたヒトアクチビン不溶性顆粒の
可溶化、リフォールディングより得られた活性な粗ヒト
アクチビン溶液から低分子不純物を除去した後、これを
高濃度の有機溶媒とカオトロピックイオンを含む極めて
低いｐＨで平衡化された陽イオン交換クロマトグラフィ
ーに負荷し、カオトロピックイオン濃度勾配溶出を行う
ことにより、宿主由来タンパク質、リフォールディング
しなかった会合凝集体、及び電気的性質の異なる類縁体
を効果的かつ高度に除去した濃縮ヒトアクチビンを高回
収率で製造する方法。

【００２５】[9] 上記[8]の製造方法において、低分子
物質の不純物を除去した後、下記２工程を組み合わせる
ことにより、更に効率良く精製を行い粗ヒトアクチビン
溶液から高純度のヒトアクチビンを製造する方法。

【００２６】（ｉ）当該一部精製物を極めて高いｐＨ条
件で平衡化された天然多糖をベースマトリックスとした
陰イオン交換クロマトグラフィーに負荷し、塩濃度上
昇、ｐＨ低下、及び有機溶媒を添加した緩衝液へ置換す
ることにより、宿主由来タンパク質、リフォールディン
グしなかった会合凝集体、電気的性質の異なる類縁体の
何れも概ね除去した濃縮ヒトアクチビンＡを定量的に回
収する工程；、 （ｉｉ）上記（ｉ）で得られた回収画分の緩衝液を置換
した後、有機溶媒を含む極めて高いｐＨで平衡化された
陰イオン交換クロマトグラフィーに負荷し、塩濃度勾
配、及びｐＨ勾配（ｐＨ低下）を施すことにより、宿主
由来タンパク質、及び電気的性質の異なる類縁体の何れ
も概ね除去した濃縮ヒトアクチビンを高回収率で得る工
程；及び上記（ｉｉ）で得られた回収画分の緩衝液を置
換した後、前記陽イオン交換クロマトグラフィーの精製
工程を行う製造方法。

【００２７】[10] 上記本発明及び[1]乃至[9]の製造方
法において得られた純度が改善したヒトアクチビン及び
純度が低くとも９９％の高純度ヒトアクチビン。

【００２８】[11] その純度が低くとも９９％で、不純
物として電気的性質を異にするヒトアクチビン類縁体を
実質的に含まないヒトアクチビン。

【００２９】[12] 上記本発明及び[1]乃至[9]の製造方
法並びに上記[10]及び[11]においてヒトアクチビンがヒ
トアクチビンＡである発明。

【００３０】[13] 上記本発明及び本発明により得られ
る純度が改善したヒトアクチビン、特にヒトアクチビン
Ａを含有する骨粗鬆症改善治療薬その他の医薬製剤。

【００３１】

【発明の実施の形態】本発明の実施の形態について、以
下に詳細に説明する。本発明に使用する出発物質である
粗ヒトアクチビンには、粗ヒトアクチビンＡ等各種アク
チビンの粗生成物が含まれる。従って、各種不純物で通
常の精製手段では分離困難な不純物を少なくとも１種含
む粗ヒトアクチビンであればよい。不純物の種類として
は特に制限されないが、電気的に異なるその類縁体、宿
主由来タンパク質、宿主及び／又は培地由来の抗原性物
質、発熱物質等、リフォールディングに際してリフォー
ルディングしなかった会合凝集体、遺伝子翻訳ミスや翻
訳後修飾不適切に基づく類縁体、及び精製工程で生じる
ヒトアクチビン分解物、修飾物等何れも効果的に分離で
きる点で優れており、特に電気的性質を異にする類縁体
の高度分離に適している。

【００３２】上記ヒトアクチビンＡ精製原料に含有され
る類縁物質について具体的には、上記した通り、大きく
分けて、培養が終了した段階で既に含まれている類縁物
質（大腸菌が誤ったアミノ酸を取り込んだしまったり、
タンパク質が合成された後に大腸菌の持つ酵素によって
異常な修飾を受けることに原因）、精製途中に生じる類
縁物質（リフォールディングやクロマトグラフィーにお
いて修飾を受けることに原因）の２通りがある。本発明
で使用する精製技術は、リフォールディングの最中に生
じてしまう修飾物（特に高ｐＨ値下で生じる脱アミド反
応物、例えば分子内のアスパラギンがアスパラギン酸に
変化したもの）をヒトアクチビンＡから分離除去するの
に、特に効果を発揮する。従って、本発明の精製につい
て、特にヒトアクチビンＡを微生物に変性状態で生産さ
せ、人為的にリフォールディングさせた場合に特に有効
である。

【００３３】被精製物としてヒトアクチビンＡの場合を
例として、以下に説明する。ヒトアクチビンＡの遺伝子
を組み込んだ微生物から得られる不溶性顆粒体を還元変
性抽出処理後、国際出願公開第ＷＯ９７／２３６３８号
公報に記載の方法に基づいてリフォールディング処理し
た粗ヒトアクチビンＡ溶液を使用することができる。こ
の場合、まず、粗ヒトアクチビンＡ溶液から低分子の不
純物を分離する方が好ましく、その場合の低分子不純物
の除去方法については低分子不純物の除去方法として知
られている方法を採用することができ、簡便には例えば
限外濾過法、ゲル濾過クロマトグラフィー法、透析法
等、一般的に緩衝液置換する方法を使用すればよい。そ
の際、事前に粗ヒトアクチビンＡ溶液を希釈し、分子分
画量１００００程度の膜を使用した濃縮操作により、出
発原料中の不純物の種類や含量に関係なくスケールアッ
プが可能となる。

【００３４】本発明は、粗ヒトアクチビンを、濃度勾配
溶出法による陽イオン交換クロマトグラフィー、特にカ
オトロピックイオンの濃度勾配溶出法により、精製し
て、純度を改善したヒトアクチビンを製造する方法であ
る。

【００３５】カオトロピックイオンとはタンパク質の高
次構造を壊す効果をもつ塩類のことである。ＮａＳＣＮ
やＮａＣｌＯ_４のように、低分子非電解質、蛋白等の水
に対する溶解度を高める、蛋白や核酸の高次構造を破壊
して変性させる等の性質を持つイオン（蛋白質・酵素の
基礎実験法、pp63（改訂第2版；堀尾武一編、南光堂、1
994年参照。）であり、このような性質は、塩が解離し
て生じたイオンによって水の構造が破壊され、疎水性物
質と水が接触したときに生じる、水のエントロピーの減
少が抑制されるためであると考えられている。

【００３６】このように低分子除去した画分を酸性下、
望ましくはｐＨ２〜４程度（より望ましくはｐＨ２．５
〜３．５程度）に調整した後、水溶性有機溶媒、好まし
くは高濃度水溶性有機溶媒（例えば、２０〜６０％の有
機溶媒、好ましくはエタノール、イソプロパノール等炭
素数１〜４の低級アルコール、アセトニトリル、ジメチ
ルスルホキシド及びジメチルホルムアミド等）と０．２
Ｍ以下のカオトロピックイオンの性質をもつ塩（例え
ば、ＮａＣｌＯ_４、ＫＣｌＯ_４等の過塩素酸塩、ＮａＳ
ＣＮ、ＫＳＣＮ等のチオシアン酸塩等）を含む酸性下、
望ましくはｐＨ２〜４程度（より望ましくはｐＨ２．５
〜３．５程度）で平衡化された陽イオン交換カラム（例
えば、リソース−Ｓ；アマシャムファルマシアハ゛イオテク製）に負荷
し、塩濃度勾配によって溶出する。塩濃度勾配は１０カ
ラム容量以上かけて０．２〜０．４Ｍ程度まで塩濃度を
上げることで、電気的性質の異なる類縁体等が効果的に
除去された高濃度のヒトアクチビンＡを高回収、製造可
能となる。

【００３７】尚、上記の陽イオン交換クロマトグラフィ
ーでの精製負担を軽減する為、陽イオン交換クロマトグ
ラフィー適用前に、好ましくは以下のように２段階の陰
イオン交換クロマトグラフィーを用いて原料由来の不純
物やリフォールディング処理までに生成した不純物を概
ね除去しておくことが精製効率を上げるために極めて有
利である。

【００３８】低分子不純物を除去した後（望ましくは、
ゲル濾過クロマトグラフィー法により、ｐＨ９．５〜１
０．５程度の緩衝液に置換）、５０ｍＭ以下の塩（例え
ば、ＮａＣｌ使用。）を含むｐＨ９．５〜１０．５程度
の緩衝液（例えば、２０ｍＭ１,３-ジアミノプロパン／
ＨＣｌ使用。）で平衡化された天然多糖をベースマトリ
ックスとした陰イオン交換カラム（例えば、Ｑ−セファ
ロースＦＦ；アマシャムファルマシアハ゛イオテク製）に６ｍｇ／ｍｌゲ
ル程度負荷し、５カラム容量程度の平衡化緩衝液で洗浄
した後、水溶性有機溶媒（例えば、５〜２５％の濃度
で、エタノール、イソプロパノール等炭素数１〜４の低
級アルコール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド
及びジメチルホルムアミド等の使用。）と０．１Ｍ以上
の塩（例えば、ＮａＣｌ使用。）を含むｐＨ８．５〜
９．５程度の緩衝液（例えば、２０ｍＭ １,３-ジアミ
ノプロパン／ＨＣｌ）に置換することにより、モノマー
や会合凝集体を概ね除去し、かつ１ｍｇ／ｍｌ以上に濃
縮されたヒトアクチビンＡ画分を得ることができる。こ
の画分をｐＨ９．５〜１０．５程度の緩衝液（例えば、
２０ｍＭ １,３-ジアミノプロパン／ＨＣｌ）に置換し
た後、有機溶媒（例えば、５〜２５％の有機溶媒、好ま
しくはメタノール、イソプロパノール等低級アルコー
ル、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド及びジメチ
ルホルムアミド等）と５０ｍＭ以下の塩（例えば、Ｎａ
Ｃｌ使用。）を含むｐＨ９．５〜１０．５程度の緩衝液
（例えば、２０ｍＭ １,３-ジアミノプロパン／ＨＣ
ｌ）で平衡化された陰イオン交換カラム（例えば、リソ
ース−Ｑ；アマシャムファルマシアハ゛イオテク製）に５ｍｇ／ｍｌゲル
程度負荷する。１０カラム容量以上かけて塩濃度を０．
１Ｍ以上に上げるのと同時にｐＨを８．５〜９．５程度
まで下げることにより、陽イオン交換クロマトグラフィ
ーで分離除去困難な類縁体を除去することができる。

【００３９】最終精製工程として、この画分を例えば実
施例１に従った陽イオン交換クロマトグラフィー精製す
ることにより、電気的性質が単一なヒトアクチビンＡを
高濃度状態で高回収、製造できる。かつ、これらクロマ
トグラフィーに用いる充填剤の粒径は大きく、直線的に
カラム容量を向上させることでスケールアップが可能で
ある。

【００４０】尚、最終的に得られた画分の純度につい
て、逆相HPLC（例えば、NucleosilＣ８；GLサイエンス製使
用。）、陰イオン交換HPLC（例えば、DEAE-NPR；東ソー製
使用。）、陽イオン交換HPLC（例えば、SP-NPR；東ソー製
使用。）、及びSDS-PAGE等で確認できる。

【００４１】

【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。

【００４２】（実施例１）ヒトアクチビンＡ遺伝子を導
入した組み換え大腸菌から得られる変性ヒトアクチビン
Ａを国際出願公開第ＷＯ９７／２３６３８号公報記載内
容に従ってリフォールディング処理した。このリフォー
ルディング溶液２５０ｍｌ（タンパク質１２ｍｇ）にＨ
₂Ｏを等量添加した後、分子分画量１００００の膜（フ
ィルトロン製「オメガ」）を使用して初期容量の約１３
分の１になるまで濃縮した。この膜濃縮操作において、
タンパク質を１１．５ｍｇ回収し（回収率９６％）、逆
相HPLCで求めた画分のタンパク質純度は６８％であっ
た。

【００４３】これを１．８ｍＭ ＨＣｌで平衡化された
セファデックスＧ−２５Ｍ（2.6φx 20 cm；アマシャムファルマシ
アハ゛イオテク製）に負荷し、A280で検出されたタンパク質を
１１．３ｍｇ回収した（回収率９８％）。この画分５ｍ
ｇを４０％アセトニトリル、０．１８Ｍ ＮａＣｌ
Ｏ_４、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０緩衝液
に平衡化されたリソース−Ｓ（0.5φ x 5 cm；アマシャムファル
マシアハ゛イオテク製）に負荷し、６ｍｌの平衡化緩衝液で洗浄
した後、流速１．５ｍｌ／ｍｉｎで１１分後に０．２４
ＭになるようなＮａＣｌＯ_４濃度勾配に供した。A280に
て検出されたタンパク質を３．７ｍｇ回収した（回収率
７４％；図１ｂのクロマトグラフィー参照。）。

【００４４】尚、溶出塩として、ＮａＣｌＯ_４の代わり
にＮａＣｌを用いた陽イオン交換クロマトグラフィーを
実施したところ（塩の種類と濃度以外は全て同じ）、Ｎ
ａＣｌＯ_４を用いた場合に比べて前方に分離されていた
不純物の分離能が低下し（図１ａのクロマトグラフィー
参照。）、それだけ回収率も低下した（回収率５１
％）。

【００４５】（実施例２）実施例１と同じ条件を使用し
て、リフォールディング溶液から膜濃縮画分３７．０ｍ
ｇを得た。これを３０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ
１,３-ジアミノプロパン／ＨＣｌで平衡化されたセファ
デックスＧ−２５Ｍ（1.6φ x 10 cm；アマシャムファルマシアハ゛イオ
テク製）に負荷し、A280で検出されたタンパク質を３６．
３ｍｇ回収した（回収率９８％）。この画分３６．０ｍ
ｇを３０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ １,３-ジアミ
ノプロパン／ＨＣｌ（ｐＨ１０）で平衡化されたＱ−セ
ファロースＦＦ（1.6 φ x 3 cm；アマシャムファルマシアハ゛イオテク
製）に負荷し、置換した。約３０ｍｌの平衡化緩衝液で
洗浄した後、０．３Ｍ ＮａＣｌ、１２％アセトニトリ
ル、２０ｍＭ １,３-ジアミノプロパン／ＨＣｌ（ｐＨ
９．０）緩衝液へ置換することにより、A280で検出され
たタンパク質を３４．９ｍｇ回収した（回収率９７％；
図２参照。）。

【００４６】この回収画分について、逆相HPLC（Nucleo
silＣ８；GLサイエンス製）、陰イオン交換HPLC（DEAE-NPR；
東ソー製）、及び陽イオン交換HPLC（SP-NPR；東ソー製）よ
り得られるタンパク質純度は各々９７％、６５％、７５
％であった。この画分３４ｍｇを２０ｍＭ １,３-ジア
ミノプロパン／ＨＣｌ（ｐＨ１０）で平衡化されたセフ
ァデックスＧ−２５Ｍ（1.6φ x 17 cm；アマシャムファルマシアハ゛
イオテク製）に負荷し、A280で検出されたタンパク質３３．
３ｍｇを回収した（回収率９８％）。この画分５ｍｇを
１０％アセトニトリル、３０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ
１,３-ジアミノプロパン／ＨＣｌ、ｐＨ９．８で平衡
化されたリソース−Ｑ（0.5φ x 5cm；アマシャムファルマシアハ゛イオ
テク製）に負荷した。

【００４７】約６ｍｌの平衡化緩衝液で洗浄した後、流
速１．５ｍｌ／ｍｉｎで１１分後に１０％アセトニトリ
ル、０．３Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ １,３-ジアミノプ
ロパン／ＨＣｌ、ｐＨ９．０緩衝液組成になるようなＮ
ａＣｌ濃度勾配、及びｐＨ勾配に供した。この操作を２
回繰り返し、A280で検出されたタンパク質を合計で５．
５ｍｇ回収した（回収率５５％；図３参照。）。

【００４８】この画分について、陰イオン交換HPLC（DE
AE-NPR；東ソー製）、及び陽イオン交換HPLC（SP-NPR；東
ソー製）で求めたタンパク質純度は各々９９％、８８％で
あった。これを１．８ｍＭ ＨＣｌで平衡化されたセフ
ァデックスＧ−２５Ｍ（1.6φ x 5 cm；アマシャムファルマシアハ゛イ
オテク製）カラムに負荷することにより、A280で検出され
たタンパク質を５．４ｍｇ得た（回収率９８％）。この
画分５ｍｇを実施例１に従ってリソース−Ｓ（0.5φ x
5 cm；アマシャムファルマシアハ゛イオテク製）に負荷し、A280で検出さ
れたタンパク質を３．９ｍｇ回収した（回収率７８％；
図４参照。）。

【００４９】これを１．８ｍＭ ＨＣｌで平衡化された
セファデックスＧ−２５Ｍ（1.6φX5 cm；アマシャムファルマシアハ
゛イオテク製）に負荷し、A280で検出されたタンパク質を
３．９ｍｇ回収した（回収率９９％）。この画分につい
て、逆相HPLC（NucleosilＣ８；GLサイエンス製）、陰イオン
交換HPLC（DEAE-NPR；東ソー製）、陽イオン交換HPLC（SP
-NPR；東ソー製）、及びSDS-PAGEを実施した結果を図５〜
８に示した。逆相HPLC（図５参照。）、陽イオン交換HP
LC（図６参照。）、及び陰イオン交換HPLC（図７参
照。）において、ヒトアクチビンＡのピーク以外にピー
クは認められず、これ等分析手法において、不純物が検
出されなかったことを確認した。又、SDS-PAGE（図８参
照。）においても、ヒトアクチビンＡを２．１μｇ負荷
したレーンにおいて（レーン２）、ヒトアクチビンＡ以
外のバンドは検出されなかった。ヒトアクチビンＡを２
１ｎｇ負荷したレーン３でヒトアクチビンＡのバンドが
検出されたことと併せて、レーン２に含まれる不純物は
１成分として、０．１％以下であることを確認した。

【００５０】尚、表１には実施例１に記載した膜濃縮操
作を含めた本実施例の結果概要、表２には図５〜８の各
種HPLC、及びSDS-PAGE分析条件をそれぞれ示した。従来
の精製方法（特開平２−２５５０９８号公報参照。）に
より得られた精製ヒトアクチビンＡと本実施例２で得ら
れた精製ヒトアクチビンＡのタンパク質純度を、陽イオ
ン交換HPLCを使用して比較した（図９参照。）。従来法
（図９ｂ）では、精製ヒトアクチビンＡの他に約２％の
不純物が残留したが、本実施例２（図９ａ）による精製
ヒトアクチビンＡには不純物は検出されず、純度は低く
とも９９％と考えられ、本精製方法の有用性が示され
た。

【００５１】

【表１】

【００５２】

【表２】

【００５３】上記図８、表１及び２の結果から明らかな
ように、本発明の精製方法を利用すれば高純度に精製さ
れたヒトアクチビンを製造、取得できることが分かる。
その純度についても、図８の電気泳動分析の結果から
は、１，０００分の１のオーダーで不純物を含まないと
考えられるので、その純度は低くとも９９．９％、即ち
９９．９％以上の高純度と考えられる。

【００５４】

【発明の効果】粗ヒトアクチビンを、濃度勾配溶出法に
よる陽イオン交換クロマトグラフィーを含有する精製工
程に付する本発明の精製方法により、従来法では得られ
なかったような高純度のヒトアクチビンを工業的に製造
することができるので、医薬用途への使用が期待でき
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施例１で実施の陽イオン交換クロマ
トグラフィーの結果を示す図である。横軸は保持時間
（分）を表す。１．８ｍＭ ＨＣｌに溶解したヒトアク
チビンＡ６ｍｇを陽イオン交換クロマトグラフィー（リ
ソース−Ｓ；アマシャムファルマシアハ゛イオテク製）に負荷し、塩濃度
勾配溶出に供した。図中、「−」部分を回収した。図
中、ａはＮａＣｌ濃度勾配溶出法、ｂはＮａＣｌＯ₄濃
度勾配溶出法による。

【図２】実施例２において実施の陰イオン交換クロマト
グラフィーの結果を示す図である。横軸は保持時間
（分）を表す。２０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ
１，３−ジアミノプロパン／ＨＣｌに溶解したヒトアク
チビンＡ３６ｍｇを陰イオン交換クロマトグラフィー
（Ｑ−セファロースＦＦ；アマシャムファルマシアハ゛イオテク製）に負
荷し、１２％アセトニトリル、０．１Ｍ ＮａＣｌ、２
０ｍＭ １，３−ジアミノプロパン／ＨＣｌに置換し
た。図中、「−」部分を回収した。

【図３】実施例２において２回目の実施の陰イオン交換
クロマトグラフィーの結果を示す図である。横軸は保持
時間（分）を表す。２０ｍＭ １，３−ジアミノプロパ
ン／ＨＣｌに溶解したヒトアクチビンＡ６ｍｇを陰イオ
ン交換クロマトグラフィー（リソースＱ；アマシャムファルマシアハ
゛イオテク製）に負荷し、塩濃度とｐＨの勾配溶出に供し
た。図中、「−」部分を回収した。

【図４】実施例２において実施の陽イオン交換クロマト
グラフィーの結果を示す図である。横軸は保持時間
（分）を表す。１．８ｍＭ ＨＣｌに溶解したヒトアク
チビンＡ６ｍｇを陽イオン交換クロマトグラフィー（リ
ソース−Ｓ；アマシャムファルマシアハ゛イオテク製）に負荷し、塩濃度
勾配溶出に供した。図中、「−」部分を回収した。

【図５】実施例２で実施の精製されたヒトアクチビンＡ
画分の逆相HPLCの結果を示す図である。横軸は保持時間
（分）を表す。精製されたヒトアクチビンＡ７μｇを逆
相HPLC（NucleosilＣ８; GLサイエンス製）に負荷し、
アセトニトリル濃度勾配に供した。保持時間約１７．５
分に検出されたピークはヒトアクチビンＡによる。

【図６】実施例２で実施の精製されたヒトアクチビンＡ
画分の陽イオン交換HPLCの結果を示す図である。横軸は
保持時間（分）を表す。精製されたヒトアクチビンＡ１
２μｇを陽イオン交換HPLC（SP-NPR；東ソー製）に負荷
し、塩濃度勾配溶出に供した。保持時間約１０分に検出
されたピ−クはヒトアクチビンＡによる。

【図７】実施例２で実施の精製されたヒトアクチビンＡ
画分の陰イオン交換HPLCの結果を示す図である。横軸は
保持時間（分）を表す。精製されたヒトアクチビンＡ１
２μｇを陰イオン交換HPLC（DEAE-NPR；東ソー製）に負
荷し、塩濃度勾配溶出に供した。保持時間約７分に検出
されたピークはヒトアクチビンＡによる。

【図８】実施例２で実施の精製されたヒトアクチビンＡ
のSDS-PAGEの結果を示す図である。精製されたヒトアク
チビンＡ２１μｇ、及び２１ｎｇを定法に従ったSDC-PA
GE（Phast System ; アマシャムファルマシアハ゛イオテク製）に供した。
分子量約２６０００の易動度に検出されたバンドはヒト
アクチビンＡによる。レーン１；６種分子量の標準タン
パク質（９４０００，６７０００，４３０００，３００
００，２００００，及び１４４００）混合溶液（分子量
キャリブレーションキットＬＭＷ；アマシャムファルマシアハ゛イオテク
製）、レーン２；精製されたヒトアクチビンＡ ２１μ
ｇ、及びレーン３；精製されたヒトアクチビンＡ２１ｎ
ｇ。

【図９】実施例２及び従来法（特開平２−２５５０９８
号公報参照。）で得られたタンパク質純度比較の結果を
示す図である。実施例２及び従来法（特開平２−２５５
０９８号公報参照。）で得られたヒトアクチビンＡ１２
μｇをSP-NPRカラムを使用する陽イオン交換HPLCに供
し、タンパク質純度を比較した。図中、ａは実施例２，
ｂは従来法による。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 江藤 譲 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社中央研究所内

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】粗ヒトアクチビンを、濃度勾配溶出法によ
   る陽イオン交換クロマトグラフィーを含有する精製工程
   に付することを特徴とする純度が改善したヒトアクチビ
   ンの製造方法。
2. 【請求項２】当該濃度勾配溶出法がカオトロピックイオ
   ンの濃度勾配溶出法である請求項１記載の製造方法。
3. 【請求項３】当該クロマトグラフィーが水溶性有機溶媒
   の存在下及び／又は酸性下に実施される陽イオン交換ク
   ロマトグラフィーである請求項１記載の製造方法。
4. 【請求項４】有機溶媒が低級アルコール、アセトニトリ
   ル、ジメチルスルホキシド及びジメチルホルムアミドの
   少なくとも１種を含み、その濃度が低くとも２０容量％
   である請求項３記載の製造方法。
5. 【請求項５】粗ヒトアクチビンが、電気的に異なるその
   類縁体、宿主由来タンパク質、宿主及び／又は培地由来
   の抗原性物質、発熱物質等、リフォールディングに際し
   てリフォールディングしなかった会合凝集体、遺伝子翻
   訳ミスや翻訳後修飾不適切に基づく類縁体、及び精製工
   程で生じるヒトアクチビン分解物、修飾物等の少なくと
   も１種を含む請求項１記載の製造方法。
6. 【請求項６】請求項１乃至５記載の製造方法により得ら
   れた純度が改善したヒトアクチビン。
7. 【請求項７】その純度が低くとも９９％である請求項６
   記載のヒトアクチビン。