JPH11337543A - 有色物質の担体上での簡易測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】試料中の色を有する分析対象物の測定を、種々
の試薬を必要とせず、高価な測定装置を使用することな
く、簡便な操作で、短時間のうちに正確に行うことがで
きる測定手段を提供する。 【解決手段】色を有する分析対象物を含む試料と疎水性
担体に親和性を持つ色素を含有する溶液を混合し、この
混合液を疎水性担体に滴下し、担体上の混合液の液滴を
観察し、そして、液滴中に輪が見えた場合は試料中に分
析対象物が存在しないか又は一定濃度未満であると判定
し、液滴中に輪が見えない場合は試料中に分析対象物が
存在するか又は一定濃度以上であると判定する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、試料中に微量に含
まれる色を有する分析対象物を、簡便に定性、定量する
ことができる測定方法に関する。本発明は、分析化学分
野、生命科学分野、医療分野、特に臨床検査分野におい
て有用である。

【０００２】

【従来の技術】従来、試料中に微量に含まれる色を有す
る分析対象物の測定は、測定に際して種々の試薬、測定
装置、又は煩雑な測定操作を必要とするものであった。

【０００３】例えば、貧血の診断に必須な血液中のヘモ
グロビンの測定は、従来、シアンメトヘモグロビン法が
標準法とされ、広く使用されてきた。しかし、この方法
は、高価な分光光度計を用いて、反応液の吸光度を測定
する操作を行わなければならないものであった。また、
猛毒のシアン化合物を用いるため、測定方法としては好
ましいものではなかった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、試料中の色
を有する分析対象物の測定を、種々の試薬を必要とせ
ず、高価な測定装置を使用することなく、簡便な操作
で、短時間のうちに正確に行うことができる測定手段の
提供を目的とするものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、色を有する分
析対象物を含む試料と疎水性担体に親和性を持つ色素を
含有する溶液を混合する工程；この混合液を疎水性担体
に滴下する工程；担体上の混合液の液滴を観察する工
程；及び液滴中に輪が見えた場合は試料中に分析対象物
が存在しないか又は一定濃度未満であると判定し、液滴
中に輪が見えない場合は試料中に分析対象物が存在する
か又は一定濃度以上であると判定する工程を含む、試料
中の色を有する分析対象物の測定方法である。（第１の
測定方法）

【０００６】また、本発明は、色を有する分析対象物を
含む試料と疎水性担体に親和性を持つ色素を含有する溶
液のうちいずれか一方を疎水性担体に滴下する工程；前
記試料と前記色素を含有する溶液のうちの他の一方を疎
水性担体に滴下し、担体上の液滴中で前記試料と前記色
素を含有する溶液を混合する工程；担体上の混合液の液
滴を観察する工程；及び液滴中に輪が見えた場合は試料
中に分析対象物が存在しないか又は一定濃度未満である
と判定し、液滴中に輪が見えない場合は試料中に分析対
象物が存在するか又は一定濃度以上であると判定する工
程を含む、試料中の色を有する分析対象物の測定方法で
ある。（第２の測定方法）

【０００７】

【発明の実施の態様】本発明において、色を有する分析
対象物（以下、分析対象物という）とは、色を有する物
質であって、試料中における存在の有無の確認（定性測
定）又は定量測定を行おうとするものである。

【０００８】例えば、赤色であるヘモグロビン、ヘモグ
ロビンＡ1 、ヘモグロビンＡ1C、若しくはヘモグロビン
Ｆ、黄色であるビリルビン、間接ビリルビン、直接ビリ
ルビン、胞合型ビリルビン、非胞合型ビリルビン、若し
くはδ−ビリルビン、又は黄緑色であるビリベルジン等
を挙げることができる。

【０００９】本発明における試料とは、色を有する分析
対象物が存在する可能性がある液状のものである。

【００１０】例としては、ヒト又は動物の血液、血清、
血漿、尿、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水、若しくは
羊水などの体液；ヒト若しくは動物の脳、肝臓等の臓
器、毛髪、皮膚、爪、筋肉、又は神経組織などの抽出
液、ヒト又は動物の糞便の抽出液又は懸濁液；細胞或い
は菌体の抽出液；植物の抽出液；穀物、野菜、果物、魚
介類、又は加工食品などの食品、水、茶、牛乳、又は果
汁などの飲料、そして、飲料水、河川水、湖沼水、海
水、又は土壌の懸濁液などの環境分析用試料等が挙げら
れる。

【００１１】本発明における疎水性担体は、少なくと
も、色を有する分析対象物を含む試料（以下、試料とい
う）及び疎水性担体に親和性を持つ色素を含有する溶液
（色素含有溶液）を滴下する部分、つまり試料及び色素
含有溶液との接触部分が、疎水性であるような担体であ
る。

【００１２】疎水性担体の試料及び色素含有溶液との接
触部分が疎水性であるので、疎水性担体に親和性を持つ
色素は、疎水性担体の疎水性部分へ疎水結合的に吸着す
る。

【００１３】また、接触部分が疎水性であるので、試料
と色素含有溶液の混合液（以下、混合液という）と疎水
性担体の接触部分との接触面積は、表面張力によりごく
小さいものとなり、この混合液は疎水性担体の表面上で
液滴となる。

【００１４】なお、疎水性担体の混合液との接触部分が
疎水性かつ撥水性であると、疎水性担体表面上の液滴が
球形となり、液滴中の輪の判別が容易となるので好まし
い。

【００１５】このような疎水性担体としては、例えば、
疎水性である、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレ
ート、ろ紙又はフィルター等を挙げることができる。

【００１６】疎水性担体の混合液との接触部分が疎水性
である材質としては、逆相系又は順相逆相系の分配クロ
マトグラフィーや吸着クロマトグラフィーの固定相（充
填剤）に用いられる材質を挙げることができる。

【００１７】例えば、逆相系のものとしては、オクタデ
シルシリル（ＯＤＳ）化シリカ、オクチルシリル化シリ
カ、エチルシリル化シリカ、メチルシリル化シリカ、フ
ェニル化シリカ、フルオロカーボン化シリカやグラファ
イトカーボン化シリカなどの化学修飾型シリカ、ポリス
チレンゲル又はハイドロキシアパタイト等が挙げられ
る。

【００１８】また、順相逆相系のものとして、アミノプ
ロピル、シアノプロピル、ジオール又はキラル等を挙げ
ることができる。

【００１９】疎水性担体の混合液との接触部分以外の材
質は、前記の接触部分と同じ材質でよいが、異なっても
よい。例えば、種々の有機材質又は無機材質を用いるこ
とができる。

【００２０】本発明における、疎水性担体に親和性を持
つ色素とは、可視部に吸収を持つか又は蛍光を示すもの
であって、ベンゼン環等の疎水的な構造を有する物質で
ある。そして、疎水性担体の疎水性部分へ疎水結合的に
吸着し、特に液滴の外周部に輪状に強く吸着するもので
ある。

【００２１】なお、この色素は、その色又は蛍光の色
が、分析対象物の色と同じか近い色であることが好まし
い。また、分析対象物の色の補色かこの補色に近い色で
あることも好ましい。

【００２２】このような色素として、ローダミンＢ（色
及び蛍光色が赤色）、ローダミン６Ｇ（色及び蛍光色が
赤色）、エチルバイオレット（色が紫色）、又はメチレ
ンブルー（色が青色）等を例示することができる。

【００２３】本発明の色素を含有する溶液（以下、色素
含有溶液という）は、前記の色素を水又は水を主成分と
する溶媒に溶解させたものである。この色素含有溶液に
は、更に、緩衝剤、塩、無機化合物、有機化合物、有機
溶媒、タンパク質、糖類、又は界面活性剤等を含ませて
もよい。

【００２４】色素を含有させる濃度は、その色素の吸光
係数、蛍光強度、担体との親和性、試料と色素含有溶液
を混合させる時の量の比、又は検出が可能となる分析対
象物濃度の設定値等により最適濃度が異なるので、その
時の条件に応じて、担体に吸着した色素の輪の観察が行
えるような濃度を適宜選択すればよい。

【００２５】本発明の第１の測定方法においては、ま
ず、試料と色素含有溶液を混合する。混合する試料と色
素含有溶液の量の比について特に制限はなく、適宜設定
すればよい。

【００２６】次に、この混合液を担体に滴下する。この
担体に滴下する量は、後の液滴中の輪の観察時に観察が
容易であるような容量以上であることが好ましく、また
表面張力により液滴が形成される範囲内の量であること
が好ましい。通常この量は、３μｌ〜１ｍｌの範囲であ
り、２０μｌ〜１００μｌの範囲の量とすることが好ま
しい。

【００２７】担体に滴下した混合液は、担体の接触部分
が疎水性であるので、担体の表面上では球形又は楕円形
等の液滴となる。

【００２８】その後、この担体上の混合液の液滴を観察
する。観察は、この液滴中に輪が見えるか、又は見えな
いかを観察する。

【００２９】ここで観察を行う液滴中の輪は、液滴と担
体の接触部分の外周部に形成された色素の輪である。観
察は液滴の上方から行うと、液滴中の輪の有無が明確に
判定できるので好ましい。

【００３０】また、この観察は、目視により行っても、
又はデンシトメータ、パターン認識装置等の機器を用い
て行ってもよい。

【００３１】なお、液滴中の輪の蛍光を観察する場合
は、紫外線ランプ等により液滴に紫外線を照射して観察
を行う。

【００３２】液滴中の輪の観察を目視により行う様子を
図１に示した。

【００３３】最後に判定を行う。

【００３４】観察の結果、液滴中に輪が見えた場合は、
試料中に分析対象物が存在しないか又は一定濃度以下で
あると判定する。

【００３５】また、液滴中に輪が見えない場合は、試料
中に分析対象物が存在するか又は一定濃度以上であると
判定する。

【００３６】以下に、上記のように判定することができ
る原理について記載する。疎水性担体に親和性を有する
色素は、担体と接触することにより、担体と混合液の接
触部分に吸着する。

【００３７】そして、その吸着の強さは混合液と担体と
空気が接触する部分である液滴と担体の接触部分の外周
部において著しい。この結果、混合液の液滴と担体の接
触部分の外周部に、担体に吸着した色素の輪が形成され
る。

【００３８】よって、担体上の混合液の液滴を観察した
場合、試料中に分析対象物が存在しないか又は一定濃度
未満である時には、液滴中にこの輪を見ることができ
る。

【００３９】しかし、試料中に分析対象物が存在するか
又は一定濃度以上である場合は、混合液中に色素の輪と
同じ色又は近い色の分析対象物が存在するので、液滴を
観察しても輪以外の部分も輪と同じ色又は近い色になっ
ていて、輪と輪の内側の部分の色に差がないか又は差が
小さいため、輪を輪として認めることができなくなる。

【００４０】なお、この輪を認めることができなくなる
時の分析対象物の濃度（上記の一定濃度）は、任意に設
定することができる。

【００４１】これは、色素含有溶液に含有させる色素の
濃度、又は試料と色素含有溶液を混合させる時の量の比
等を調整することにより、液滴中の輪と輪の内側の部分
の色に差がないか又は差を小さくすることができる時の
分析対象物の濃度、つまり液滴中の輪が見えなくなる時
の分析対象物の濃度を変えることができる。

【００４２】そして、この液滴中の輪が見えなくなる時
の分析対象物の濃度を段階的に変えていった複数の測定
系を用いて１つの試料を測定することにより、その試料
中の分析対象物の濃度の定量測定を行うことができる。
以上のようにして、試料中の分析対象物の測定を行うこ
とができる。

【００４３】また、本発明の第２の測定方法において
は、まず、試料と色素含有溶液のうちいずれか一方を担
体に滴下して液滴を形成させる。

【００４４】次に、試料と色素含有溶液のうち、まだ担
体に滴下していない他の一方を担体上の液滴の上にゆっ
くりと滴下する。

【００４５】順次滴下した試料及び色素含有溶液は担体
上の液滴の中で混合し、混合液となる。

【００４６】なお、滴下する試料、色素含有溶液の滴下
量自体については特に制限はないものの、担体上の混合
液の量については第１の測定方法と同じであり、液滴中
の輪の観察時に観察が容易であるような容量以上である
ことが好ましく、また表面張力により液滴が形成される
範囲内の量であることが好ましい。通常この量は、３μ
ｌ〜１ｍｌの範囲であり、２０μｌ〜１００μｌの範囲
の量とすることが好ましい。よって、試料、色素含有溶
液の滴下量は、その混合液の量が上記の範囲内に収まる
ようにすることが好ましい。

【００４７】この後の担体上の混合液の液滴を観察する
工程以降の工程については、先の第１の測定方法と同様
である。

【００４８】

【実施例】〔実施例〕 （試料中のヘモグロビンの測定） （１）色素含有溶液の調製 ローダミンＢ（分子量：４７９．０２）の１．１９８ｍ
ｇ／ｌ、１．９１６ｍｇ／ｌ、及び２．３９５ｍｇ／ｌ
をそれぞれ蒸留水に溶解して全量１ｌとし、２．５μ
Ｍ、４μＭ、及び５μＭの濃度の色素含有溶液（ローダ
ミンＢ水溶液）を調製した。

【００４９】（２）試料の調製 人より採血したヒト血液を生理食塩水（０．９％塩化ナ
トリウム水溶液）で洗浄した後、赤血球だけを集め、こ
れに蒸留水を加えて溶血させた。この溶血液を蒸留水で
希釈して、６０ｇ／ｌ、８０ｇ／ｌ、１００ｇ／ｌ、及
び１２０ｇ／ｌのヘモグロビン濃度の試料を調製した。

【００５０】（３）測定 以下の操作は暗室にて行った。前記３種類の色素含有溶
液２０μｌのそれぞれと、前記４種類の試料４０μｌの
それぞれを混合して、合計１２種類の混合液を調製し
た。

【００５１】次に、これら１２種類の混合液５０μｌの
それぞれを、オクタデシルシリル（ＯＤＳ）化シリカ−
薄層クロマトグラフィープレート（製品番号：Ａｒｔ．
５９１４；メルク社製）上に、ピペットを用いてゆっく
りと滴下し、液滴を形成させた。

【００５２】紫外線ランプ（製品番号：Ｑ−１２ＮＦ／
Ｊ；スペクトロニクス社製）により、プレート上の液滴
に紫外線を照射した。

【００５３】照射して５分後に、部屋の照明を消してプ
レート上の液滴を上方から観察して、液滴中に輪が見え
るか見えないかを判定した。

【００５４】観察を行ったプレート上の液滴の像を図２
に示した。

【００５５】また、この判定の結果を表１に示した。

【００５６】

【表１】

【００５７】この表で、「◎」は液滴中に輪が見えたこ
とを、「●」は液滴中に輪が見えなかったことを表す。

【００５８】この結果より、試料中のヘモグロビン濃度
が低い場合は液滴中に輪が見えるが、試料中のヘモグロ
ビン濃度が高い場合は液滴中に輪が見えないことが分か
る。

【００５９】また、液滴中の輪が見えなくなる時の試料
中のヘモグロビン濃度は、色素含有溶液中のローダミン
Ｂ濃度が２．５μＭの時は８０ｇ／ｌ、４μＭの時は１
００ｇ／ｌ、５μＭの時は１２０ｇ／ｌであった。

【００６０】よって、色素含有溶液中の色素の濃度を変
えることによって、液滴中の輪が見えなくなる時の分析
対象物の濃度を変えられることが確かめられた。

【００６１】そして、試料中のヘモグロビンの濃度６０
ｇ／ｌの時は色素含有溶液中のローダミンＢ濃度がいず
れの場合も液滴中に輪が見え、ヘモグロビンの濃度８０
ｇ／ｌの時はローダミンＢ濃度２．５μＭの場合に液滴
中の輪が見えなくなり、ヘモグロビンの濃度１００ｇ／
ｌの時はローダミンＢ濃度４μＭの場合に液滴中の輪が
見えなくなり、ヘモグロビンの濃度１２０ｇ／ｌの時は
ローダミンＢ濃度がいずれの場合も液滴中の輪は見えな
かった。

【００６２】従って、このように液滴中の輪が見えなく
なる時の分析対象物の濃度を段階的に変えていった測定
系を用いて試料を測定することにより、試料中の分析対
象物の定量測定を行えることが確かめられた。

【００６３】

【発明の効果】本発明の測定方法は、試料中の色を有す
る分析対象物を、種々の試薬を必要とせず、高価な測定
装置を使用することなく、簡便な操作で、かつ短時間の
うちに正確に測定することができるものである。

【００６４】

【図面の簡単な説明】

【図１】液滴中の輪の観察を行う様子を示した図であ
る。

【図２】プレート上の液滴の像を表した図である。

【符号の説明】

１ 疎水性担体 ２ 混合液の液滴 ３ 輪

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 色を有する分析対象物を含む試料と疎水
   性担体に親和性を持つ色素を含有する溶液を混合する工
   程；この混合液を疎水性担体に滴下する工程；担体上の
   混合液の液滴を観察する工程；及び液滴中に輪が見えた
   場合は試料中に分析対象物が存在しないか又は一定濃度
   未満であると判定し、液滴中に輪が見えない場合は試料
   中に分析対象物が存在するか又は一定濃度以上であると
   判定する工程を含む、試料中の色を有する分析対象物の
   測定方法。
2. 【請求項２】 色を有する分析対象物を含む試料と疎水
   性担体に親和性を持つ色素を含有する溶液のうちいずれ
   か一方を疎水性担体に滴下する工程；前記試料と前記色
   素を含有する溶液のうちの他の一方を疎水性担体に滴下
   し、担体上の液滴中で前記試料と前記色素を含有する溶
   液を混合する工程；担体上の混合液の液滴を観察する工
   程；及び液滴中に輪が見えた場合は試料中に分析対象物
   が存在しないか又は一定濃度未満であると判定し、液滴
   中に輪が見えない場合は試料中に分析対象物が存在する
   か又は一定濃度以上であると判定する工程を含む、試料
   中の色を有する分析対象物の測定方法。