JPH11341999A

JPH11341999A - 尿を用いる膀胱癌の遺伝子検査法

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Publication number: JPH11341999A
Application number: JP10068219A
Authority: JP
Inventors: Kokichi Sugano; 康吉菅野; Masaki Shigyo; 雅紀執行
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1998-03-18
Filing date: 1998-03-18
Publication date: 1999-12-14
Anticipated expiration: 2018-03-18
Also published as: JP4004628B2

Abstract

(57)【要約】【課題】尿を用いて、膀胱癌を効率よくスクリーニン
グする方法を提供すること。【解決手段】尿中の細胞から抽出したＤＮＡを用い
て、９番染色体上のいくつかの遺伝子多型の存在する部
位を、ポリメラーゼチェーンリアクション法（ＰＣＲ）
で増幅後、該ＰＣＲ産物の末端を平滑化処理し、得られ
たＤＮＡ断片を一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析法（ＳＳ
ＣＰ）で分析し、該遺伝子多型部位のヘテロ接合性の消
失（ＬＯＨ）を検出することにより、尿中に存在する細
胞の中に９番染色体を欠失した細胞が含まれるかどうか
を高感度に検出し、膀胱癌を効率良くスクリーニングす
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、尿を用いる膀胱癌
のスクリーニングのための遺伝子検査法に関する。

【０００２】

【従来の技術】膀胱癌の癌化では染色体の脱落が起こ
り、染色体、４ｐ、８ｐ、９ｐ、９ｑ、１１ｐ、や１７
ｐ部位における高頻度のヘテロ接合性の消失（loss of
heterozygosity：ＬＯＨ）が報告されている（Cancer R
es. 54 p784-788 Spruck III等(1994 ）、Cancer Gene
t. Cytogenet. 77 p118-124 Matsuya等(1994)、Lancet
342p469-471 Dalbagni等(1993)、Cancer Res. 54 p531-
538 Knowles 等(1994)、Cancer Res. 50 p7081-7083 Ol
umi 等(1990)）。そのような変化の検出は、有用な膀胱
癌の検査方法になることが期待される。しかしながら、
この方法では膀胱癌から摘出した組織細胞を用いてお
り、より簡便な方法が切望されている。

【０００３】又、最近、菅野等は、蛍光ラベル化したオ
リゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行った
後、ＰＣＲ産物の３’末端側を平滑化処理し、蛍光自動
ＤＮＡシーケンサーを用い、single-stranded conforma
tion polymorphism 法（ＳＳＣＰ）でＬＯＨを検出する
方法（blunt-end SSCP analysis ：末端平滑化ＳＳＣＰ
法）を開発した（特開平９−２０１１９９、Genes. Chr
omosomes & Cancer 15 p157-164 Sugano等(1996)、Int.
J. Cancer 74 p403-406 Sugano 等(1997)）。この方法
は、それぞれのアレルを分離するための解像度の向上
と、シグナル強度の定量的な分析を可能にした。

【０００４】菅野等は、末端平滑化ＳＳＣＰ法で癌抑制
遺伝子ｐ５３のアレルの消失を分析し、Ｔ１ステージを
越える浸潤性の膀胱癌のほとんど全ての症例で、ｐ５３
のＬＯＨを検出した。また、癌組織でｐ５３遺伝子のＬ
ＯＨを示した膀胱癌患者の７５％では、尿サンプルでも
同様の遺伝子変異を示した（Int. J. Cancer 74 p403-4
06 Sugano 等(1997)）。膀胱癌のｐ５３のＬＯＨの検出
は、ハイリスクの侵襲性膀胱癌、特に膀胱全摘が適用と
なる膀胱癌のリスク評価の指標として応用できる可能性
が報告されている。一方、表在性膀胱癌の多くは、乳頭
状増殖を示す浸潤性の低い癌で、悪性度は低い。これら
は、通常、経尿道切除術（ＴＵＲ）が適用となり、浸潤
性の膀胱癌と比較し、予後は良好である。しかし、表在
性膀胱癌の約１０％では、より悪性度の高い浸潤性膀胱
癌に進展するものと思われるので、ＴＵＲ後、膀胱癌の
術後フォローアップで、再発を早期検出する必要がある
（Int. J. Urol. 4 p74-78 Tsutsumi 等(1997)）。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】膀胱癌のスクリーニン
グには、尿を用いた細胞診が行われているが、癌細胞は
尿中でしばしば変成を受けるため（特に、低異型度の癌
細胞ではこの傾向が著しい）、細胞診の見逃しが多く、
信頼性は低くかった。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記した
ような問題点を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、染色
体の欠失を高感度に検出し、正確かつ簡便に、膀胱癌を
スクリーニングする方法を見いだし、本発明に至ったも
のである。即ち、本発明は、尿を用いて、早期の膀胱癌
をも精度高くスクリーニングする方法を提供するもので
ある。

【０００７】本発明の第１の要旨は、尿中の細胞から抽
出したＤＮＡを用いて、９番染色体（相同染色体）のい
ずれか一方の少なくとも一部の欠損を検出することを特
徴とする膀胱癌の検査方法である。本発明の第２の要旨
は、尿中の細胞から抽出したＤＮＡを用いて、９番染色
体の短腕部（９ｐ）と長腕部（９ｑ）の欠失を検出し、
これらを組み合わせて検査する膀胱癌の検査方法であ
る。本発明の第３の要旨は、染色体上の遺伝子多型の存
在する部位を、ポリメラーゼチェーンリアクション法
（ＰＣＲ）で増幅後、該ＰＣＲ産物の末端を平滑化処理
し、得られたＤＮＡ断片を一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解
析法（ＳＳＣＰ）で分析し、該遺伝子多型部位のヘテロ
接合性の消失（ＬＯＨ）を検出する方法である第１又は
第２の要旨の検査方法である。本発明の第４の要旨は、
膀胱癌が、初期の膀胱癌である第１から第３の要旨の方
法である。本発明の第５の要旨は、尿中の細胞から抽出
したＤＮＡを用いて相同染色体の一方の少なくとも一部
の欠失を、ＬＯＨにより検出し膀胱癌を検査する際に、
繰り返し単位の差が１単位以上であるマイクロサテライ
ト型多型部分を利用し、該部分の遺伝子をＰＣＲで増幅
後、該ＰＣＲ産物の末端を平滑化処理し、得られたＤＮ
Ａ断片をＳＳＣＰで分析し、該遺伝子多型部位のＬＯＨ
により検出する膀胱癌の検査方法である。

【０００８】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
先ず、本発明における尿とは、集団検診、健康診断、ド
ック検診、郵送検診などの検診尿や、病院における外来
・入院患者尿で、膀胱癌のスクリーニングや再発など、
膀胱癌の早期発見を必要とするもの等が挙げられ、特に
限定されずこれらの全てが対象となる。また、採尿方法
を工夫した特殊なデバイスで、尿中に脱落してくる細胞
を効率よく集めたものも対象となる。本発明の尿中の細
胞から抽出したＤＮＡとは、尿中に脱落してきた本人の
細胞由来のＤＮＡを含むものであれば何でもよく、通
常、尿中に脱落した新陳代謝された正常細胞及び又は癌
細胞由来の遺伝子ＤＮＡを、種々の方法で効率よく抽出
したものが対象となる。この抽出は公知の方法によって
行なうことができる。

【０００９】本発明の９番染色体のいずれか一方の少な
くとも一部の欠損とは、ペアとなる９番染色体の一方が
完全に欠失したり、部分的に欠失した場合や、ペアとな
る染色体で、お互いに異なる遺伝子部位に部分的な欠失
を起こした場合を含むものである。本発明の９番染色体
の短腕部（９ｐ）と長腕部（９ｑ）の欠失を検出しこれ
らを組み合わせて検査する膀胱癌の検査方法とは、９ｐ
の欠失の検出と９ｑの欠失の検出を行ない、これらを組
み合せることにより、スクリーニングの感度を上げた
り、癌の悪性度の評価をするものである。本発明のＤＮ
Ａを用いる検査方法としては、目的の遺伝子変異を高感
度に分析できる方法であれば何れであってもよく、各種
の遺伝子診断法が用いられる。通常、ＤＮＡの高感度検
出のためには、ポリメラーゼチェーンリアクション法
（ＰＣＲ）やブランチドＤＮＡハイブリダイゼーション
法（ｂ−ＤＮＡ）等の方法が利用できる。

【００１０】本発明の遺伝子多型とは、ヒト染色体上の
遺伝的多型であり、遺伝子上の塩基配列の個体差に由来
する。一塩基置換型の多型は、平均して数百塩基に１ヶ
所程度そのような遺伝子多型が存在すると言われてい
る。例えば、９番染色体上のヒトのアルドラーゼＢ遺伝
子（ＡＬＤＯＢ）のイントロン８における１塩基置換の
遺伝子多型は、９ｑ２２上と同定され、Brooks等が報告
している（Am. J. Hum.Genet. 52 p835-840 Brooks 等
(1993)）。また、９ｑ３４上と同定されたＶＡＶ２遺伝
子上のＴ／Ｃ置換の遺伝子多型は、コスミドクローンＬ
１９６Ｃ８株の塩基配列の測定データ（Gene Bank 登録
番号ＡＣ００２１１１）に基づいており、国立がんセン
ター中央病院で見出されたものである。４塩基単位の繰
り返しのマイクロサテライト型の多型として、９番染色
体上では、Ｄ９Ｓ７７５，Ｄ９Ｓ３０４とＤ９Ｓ３０３
などが知られており、ゲノムデータベース（インターネ
ット上のアドレス：http://gdbwww.gdb.prg/）から情報
入手できる。

【００１１】これらの遺伝子多型を解析することによ
り、父方由来の染色体（アレル）と母方由来の染色体
（アレル）を区別することができる。従って、ある遺伝
子多型部位のヘテロ接合体（父方と母方のアレルが異な
る個体）で、一方のアレルの消失（ＬＯＨ）を測定すれ
ば、その遺伝子の欠失を検出することができる。しか
し、一塩基置換型の多型を利用する場合は、ヘテロ接合
体である頻度が最大でも50％であり、１つの遺伝子の欠
失を調べるためには、ヘテロ接合体の出現頻度の高い複
数の遺伝子多型を組み合わせる必要がある。また、遺伝
子多型には民族間差が存在するので、欠失を診断したい
遺伝子のなかから、その民族で出現頻度の高い遺伝子多
型部位を選択する必要がある。

【００１２】本発明の遺伝子多型部位をＰＣＲで増幅
後、このＰＣＲ産物の末端を平滑化処理し、得られたＤ
ＮＡ断片をＳＳＣＰで分析するヘテロ接合性の消失（Ｌ
ＯＨ）の検出方法としては、特開平９−２０１１９９等
に示されている方法が利用できる。即ち、末端平滑化処
理とは、２本鎖ＤＮＡ断片の末端１本鎖部分を平滑にす
ることであり、KlenowフラグメントやＴ４ＤＮＡポリメ
ラーゼのような３→５’エキソヌクレアーゼ活性を有
し、１本鎖部分を修復する酵素で処理するか、平滑に切
断する制限酵素で処理して１本鎖部分を含む末端部を取
り除けばよい。３′→５′エクソヌクレアーゼ活性有す
る耐熱性ポリメラーゼを用いてＰＣＲ法を施行する等の
方法を用いることが可能である。分析しようとする２本
鎖ＤＮＡ断片のセンス鎖とアンチセンス鎖の長さが異な
ったり不揃いの場合、熱変成して１本鎖にして分析する
と、ＤＮＡ断片に由来するピークは分裂し、多重とな
る。これに対し、２本鎖ＤＮＡ断片を平滑化して分析す
ると単一ピークに収束し、遺伝子変異を起こしたＤＮＡ
断片との識別が、極めて容易となる。ＰＣＲで増幅すべ
き遺伝子の領域は、１つの遺伝子多型を含む範囲であれ
ば特に制限はないが、ＰＣＲで増幅し易い長さと範囲を
選ぶ必要がある。長さは通常 100〜200bp で、範囲はＰ
ＣＲに適したオリゴヌクレオチドプライマーの設計から
決めればよい。ＤＮＡ断片の検出のためにＤＮＡ断片の
ラベル化をすることもできる。ＤＮＡ断片のラベル化と
しては、プライマーとして予めラベル化したプライマー
を使用する方法、又は、ＰＣＲを実施する際にラベル化
した塩基成分（例えば燐の放射性ラベル）を用いる方
法、又は、ＰＣＲを実施した後にラベル化する方法があ
る。ラベル化処理方法としては、ＳＳＣＰ後に検出し易
いものであれば特に制限はなく、放射性物質、蛍光物
質、化学発光物質、ビオチン（酵素標識アビジンで検
出）などで例えば、ＤＮＡの５’末端側を標識化すれば
よい。特に好ましくは、ＰＣＲ用のオリゴヌクレオチド
プライマーの５’末端をあらかじめＡ．Ｌ．Ｆ．ｒｅｄ
（Ｃｙ５^TM）ａｍｉｄｉｔｅ試薬（ファルマシア社）で
蛍光ラベル化したものを用いればよい。

【００１３】本発明の初期の膀胱癌とは、一部修正して
行ったＷＨＯのグレード分類ではＧ1 以下の初期癌を、
ＴＭＮ分類（tumor-nodes-metastasis pathological st
aging system：American joint Committee on Cancer(1
988)）では pＴa あるいは pＴis等の初期ステージの癌
を意味している。本発明の繰り返し単位の差が１単位以
上であるマイクロサテライト型多型部分とは、例えば、
繰り返し単位を特定の４塩基対とすると、遺伝子上のあ
る特定の領域に、この塩基対の単位を多数繰り返す領域
が存在し、その繰り返し数が、各アレル毎に異なってい
る。このため、遺伝子多型を形成する。この場合、アレ
ル間の繰り返し単位数の差が無い場合を除き、理論的に
はＬＯＨ分析は可能である。末端平滑化ＳＳＣＰ法を用
いると、ピークの分離がシャープになり分析精度が向上
し、繰り返し単位の差が１単位以上であれば分析でき
る。

【００１４】

【実施例】以下に、実験例及び実施例により本発明をよ
り具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるも
のではない。実験例１１．検体の入手膀胱癌患者のそれぞれの検体は、次のようにして入手し
て処理後、ＬＯＨを分析するまで保存した。経尿道切除
術（ＴＵＲ）やバイオプシィーで入手した新鮮な組織の
一部は、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに入れ、
−８０℃で凍結保存した。尿は、内視鏡検査前に、自然
排尿で、５０ｍＬの遠心チューブに採取した。この尿
を、１, ０００ｒｐｍで５分間遠心後、上清を捨て、沈
渣を集めた。この沈渣に、４０ｍＬの生理食塩水を加え
て再分散し、再度１, ０００ｒｐｍで５分間遠心後、上
清を捨て、残ったペレットを−８０℃で凍結保存した。
正常組織ＤＮＡには、末梢血の白血球（ＰＢＬ）を用い
た。１０ｍＬの静脈血をヘパリン入りの採血管に採取
し、３, ０００ｒｐｍで１５分間遠心後、血漿を廃棄し
た。この採血管に、０．２％の食塩水４０ｍＬを加えて
溶血し、再度３, ０００ｒｐｍで１５分間遠心後、上清
液を捨て、同様の操作を２回繰り返した。残ったペレッ
トは、−８０℃で凍結保存した。陰性対照には、良性の
尿路疾患患者２０例の尿と血液を採取し、膀胱癌患者の
検体と同様に処理して、−８０℃に凍結して保存した。

【００１５】２．尿、組織、ＰＢＬからジェノムＤＮＡ
の抽出凍結保存検体からのＤＮＡの抽出は、プロテナーゼＫで
消化後、フェノール・クロロフォルムで抽出するデイビ
スら（Basic Method in Moleular Biology, Elsevir S
cience Publishing 社出版）や菅野らの（Lab. Invest.
68 ｐ361-366 Sugano等(1993)）の方法で行った。要
約すると、６５℃で１５分間処理した検体に、プロテナ
ーゼＫ１ｍｇ／ｍＬ、ＥＤＴＡ１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）０．４％、食塩１５０ｍ
ｍｏｌ／Ｌを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液
を加えて３７℃で一夜インキュベート後、この反応液に
等量のフェノール：クロロフォルム＝１：１溶液を加え
て２回ＤＮＡを抽出した。抽出液に、０．１容の３ｍｏ
ｌ／Ｌ酢酸ナトリウム溶液と２．５容の冷無水エタノー
ルを加え、−２０℃で２時間冷却し、ＤＮＡを沈殿させ
た。尿と癌組織のサンプルには、エタノール沈殿のキャ
リアーとして２０μｇのグリコーゲンを加え、ＤＮＡの
回収率を向上させた。この溶液を遠心して沈殿物を集
め、さらに、１ｍＬの８０％エタノールを加えて洗浄
後、真空遠心濃縮機で沈殿を乾固した。このＤＮＡを含
む沈殿物は、ＴＥ緩衝液で再溶解した。

【００１６】３．蛍光標識オリゴヌクレオチドプライマ
ーの調製第９染色体上の遺伝子多型マーカー増幅用のプライマー
鎖、ＰＣＲ増幅及び末端平滑化ＳＳＣＰ法の条件と、そ
れぞれのマーカーに対するヘテロ接合性の割合を、表１
にまとめた。

【００１７】

【表１】

【００１８】Ａ．Ｌ．Ｆ．ｒｅｄ^TM（Ｃｙ５^TM）ａｍｉ
ｄｉｔｅ試薬（ファルマシア社）を用いて、前向きと後
ろ向きのＰＣＲ用プライマーの５’末端側のそれぞれ
を、indodicarbocyanine（Ｃｙ５）蛍光色素で標識し
た。第９染色体上のアレル消失のマーカーとして、５つ
の遺伝子多型を用いた。このうちの３つは、４塩基繰り
返しの、２つは１塩基置換の多型であった。３つの４塩
基の繰り返しのマイクロサテライト型マーカー、Ｄ９Ｓ
７７５，Ｄ９Ｓ３０４とＤ９Ｓ３０３は、それぞれ、９
ｐ２３−ｐ２２、９ｐ２１、９ｑ１３−ｑ２２．３と同
定され、ゲノムデータベース（インターネット上のアド
レス：http://gdbwww.gdb.prg/）から入手した。ヒトの
アルドラーゼＢ遺伝子（ＡＬＤＯＢ）のイントロン８に
おける１塩基置換の遺伝子多型は、９ｑ２２上と同定さ
れ、Brooks等から報告された（Am. J.Hum. Genet. 52 p
835-840 Brooks 等(1993)）。９ｑ３４上と同定された
ＶＡＶ２遺伝子上のＴ／Ｃ置換の遺伝子多型は、コスミ
ドクローンＬ１９６Ｃ８株の塩基配列の測定データ（Ge
ne Bank 登録番号ＡＣ００２１１１）に基づいており、
国立がんセンターで見出されたものである。

【００１９】４．ＰＣＲ組織や血球より抽出したゲノムＤＮＡ（鋳型） 0.1μg
、各プライマーを1.6ｐＭずつ、各ヌクレオチド３リン
酸（ｄＮＴＰ）を10ｎＭずつ、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ
8.3）10μＭ、ＫＣｌ 50 ｍＭ、ＭｇＣｌ₂1.5 ｍＭ、
ゼラチン 0.001％(w/v) 、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
（Perkin Elmer社）1.25 unit を加え、全液量を 25 μ
l とした。この溶液について、表１に示した条件でＰＣ
Ｒを行った。最初の変成条件のみは95℃で５分間、その
後は、それぞれ次の反応条件下で増幅反応を行った。変
成条件は95℃で30秒間、アニーリングは、Ｄ９Ｓ７７５
とＶＡＶ２に対しては55℃で30秒間、Ｄ９Ｓ３０３、Ｄ
９Ｓ３０４とＡＬＤＯＢについては57℃で30秒間、延長
反応は72℃で30秒間のサイクルを３０回繰り返し、最後
に、72℃で７分間の延長反応を行った。

【００２０】５．ＰＣＲ産物の３’末端平滑化ＰＣＲで増幅したＤＮＡフラグメントは、Klenow fragm
ent （宝酒造（株）製）で処理し、末端を平滑化した。
５μL のＰＣＲ産物に、0.5 units の Klenowfragment
を加え、37℃で30分間反応した（Genes. Chromosomes &
Cancer 15 p157-164 Sugano等(1996)）。

【００２１】６．末端平滑化ＳＳＣＰ解析分析には、Ａ．Ｌ．Ｆ．ｒｅｄ^TMＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃ
ｅｒ（ファルマシア社）を用いた。前記の末端平滑化し
たＰＣＲ反応液１μL を、10μL のローディング液（組
成は、ＥＤＴＡ 20 ｍＭ、ブロムフェノールブルー 0.0
5 ％を含む脱塩した90％ホルムアミド溶液）で希釈し
た。80℃で５分間加熱変成後、このうちの１μL を、ト
リス・グリシン緩衝液（トリス25ｍＭ、グリシン 192ｍ
Ｍ）を含む15％アクリルアミド（ビスアクリルアミド／
アクリルアミド＝１／30）ゲル（高さ 300mm×幅 350mm
×厚さ 0.52mm 、１回の泳動で最大４０検体の分析が可
能）にアプライし分析した。電気泳動は、ゲルと同一の
緩衝液系で、表１に示した条件、20Ｗ又は30Ｗで1,000
分間、恒温水槽で18℃又は28℃に保ちながら行った。測
定データの解析には、解析用のソフトはＦｒａｇｍｅｎ
ｔＭａｎａｇｅｒ^TM（ファルマシア社）を用いた（Ge
nes. Chromosomes & Cancer 15 p157-164 Sugano等(199
6)）。

【００２２】７．癌細胞割合の定量化とＬＯＨのカット
オフ値健常対象者の父方と母方アレルのシグナル（ピーク高
さ）を比較して、一方のアレルのピーク高さが著しく減
少した場合、ＬＯＨと定義された。サンプル中の癌由来
ＤＮＡの割合、即ち、癌細胞の割合は、次の式で推定で
きた（Genes. Chromosomes & Cancer 15 p157-164 Suga
no等(1996)）。検体中の癌細胞割合（％）＝（ＮA1/ ＮA2−ＴA1/ ＴA
2）×１００／ＮA1/ ＮA2 Ａ１とＡ２アレルを持つヘテロ接合性のヒトで、Ａ１ア
レルが失われたとすると、Ｔは、癌患者の組織又は尿サ
ンプルからのシグナルのピーク高さを、Ｎは、正常対象
者からのシグナルのピーク高さを示す。測定の再現性
は、健常者のＰＢＬからのＤＮＡサンプルを、同時に繰
り返し測定した場合、２つのアレルからのシグナル比の
変動係数（ＣＶ）として評価した。さらに、尿路疾患患
者２０例の尿を分析し、それぞれのマーカーの癌細胞割
合のカットオフ値を決めるための、陰性コントロールと
して用いた。

【００２３】８．組織病理学的診断膀胱癌患者の尿とバイオプシーの検体の一部は、通常の
細胞診や組織病理診断を行った。癌組織の病理診断のグ
レードは、ＷＨＯ分類を一部修正して、ステージは、Ｔ
ＭＮ分類（tumor-nodes-metastasis pathological stag
ing system：American joint Committee on Cancer(198
8)）に従って分類した。

【００２４】実験例２ＬＯＨに対する測定の再現性と
カットオフ値１人のドナーの同じＰＣＲ産物、又は、同じ遺伝子型を
持つ複数のドナーからのＰＣＲ産物の末端平滑化ＳＳＣ
Ｐ分析値からアレルのシグナル比を計算して、正常な二
倍体（一対の染色体）ＤＮＡのＣＶ値を求めた。同一ド
ナーの遺伝子上の各々の位置における同時再現性のＣＶ
値は、それぞれ、Ｄ９Ｓ７７５が０．９％（ｎ＝９）、
Ｄ９Ｓ３０４が４．９％（ｎ＝１４）、Ｄ９Ｓ３０３が
１．２％（ｎ＝１６）、ＡＬＤＯＢが３．０％（ｎ＝１
３）、ＶＡＶ２が１．４％（ｎ＝１６）であった。ま
た、複数のドナーからのＰＣＲ産物の同時測定時のＣＶ
値は、それぞれ、Ｄ９Ｓ７７５が３．７％（ｎ＝７）、
Ｄ９Ｓ３０４が３．６％（ｎ＝７）、Ｄ９Ｓ３０３が
３．９％（ｎ＝１２）、ＡＬＤＯＢが２．７％（ｎ＝
８）、ＶＡＶ２が２．５％（ｎ＝７）であった。良性尿
路疾患患者の尿サンプルを用いて同様の測定を行い、ア
レル比の異常の程度を、癌細胞割合として計算した。遺
伝子の各位置におけるＬＯＨ陽性（癌陽性）のカットオ
フ値を、この良性尿路疾患群の癌細胞割合の＋３ＳＤ
（標準偏差）とした。癌細胞割合のそれぞれのカットオ
フ値は、Ｄ９Ｓ７７５が１３％（ｎ＝１５）、Ｄ９Ｓ３
０４が１９％（ｎ＝１８）、Ｄ９Ｓ３０３が１２％（ｎ
＝１７）、ＡＬＤＯＢが１０％（ｎ＝８）、ＶＡＶ２が
１３％（ｎ＝１１）であった。このカットオフ値を用い
ると、良性尿路疾患でＬＯＨ陽性となるものは、全く無
かった（表３）。

【００２５】実施例１膀胱癌患者９番染色体のＬＯＨ
の分析膀胱癌患者３４例の尿と組織を対象として、９番染色体
上の５ヶ所の遺伝子多型部位、Ｄ９Ｓ７７５、Ｄ９Ｓ３
０４、Ｄ９Ｓ３０３、ＡＬＤＯＢ、ＶＡＶ２を、実験例
１の方法で分析した。分析例として、膀胱癌の症例Ｎｏ
３３の電気泳動パターンを図１に示した。それぞれ、Ｂ
はＰＢＬでの、Ｔは癌組織での、Ｕは尿でのパターンを
示す。また、各遺伝子多型部位でのピーク高さの比から
計算した、癌組織と尿での癌細胞割合（％）を括弧内に
示した。この例では、分析した全ての遺伝子多型部位
で、尿と組織の両方ともＬＯＨが陽性であった。

【００２６】全例の分析結果をまとめ、図２に示した。
Ｔは癌組織での、Ｕは尿での結果を示す。それぞれ、●
はＬＯＨ陽性、○は保持（ＬＯＨ陰性）、ＮＡはＰＣＲ
不能、縦線はホモ接合体で遺伝子多型の解析が不能を示
す。９番染色体上の５つの遺伝子多型マーカーを組み合
わせることで、少なくとも１つ以上の遺伝子多型部位が
有効（情報供給可能：ヘテロ接合性で、父方と母方でピ
ークの位置がずれ、ＬＯＨの分析に使える）となった。
有効な遺伝子多型部位は、３／３４（８．８％）が１ヶ
所のみ、５／３４（１４．７％）が２ヶ所、残りの２６
／３４（７６．５％）が３ヶ所以上であった。９番染色
体のＬＯＨは、癌組織では２６／３４（７６％）が陽
性、尿サンプルからでは２４／３３（７２．７％）が陽
性であった（表２〜３）。

【００２７】癌サンプルにおけるＬＯＨ陽性の頻度と、
癌のステージ、組織学的グレードとの相関をまとめ、表
２に示した。各遺伝子多型部位におけるＬＯＨ陽性の頻
度は６０．０％（Ｄ９Ｓ７７５とＶＡＶ２）から６６．
７％（Ｄ９Ｓ３０３）で、分析した９番染色体上の５つ
の多型部位のＬＯＨを組み合わせると２６／３４（７
６．５％）がＬＯＨ陽性であった。癌のステージ毎のＬ
ＯＨをみると、 pＴa が１２／１５（８０％）、 pＴ1
が１０／１４（７１．４％）、 pＴ2 以上４／５（８０
％）であった。また、グレード別では、Ｇ1 が７／１０
（７０％）、Ｇ2が８／１０（８０％）、Ｇ3 が１１／
１４（７８．６％）であった。

【００２８】

【表２】

【００２９】同じ患者からの癌組織と尿検体のアレルの
状態を比較した（図２）。尿検体では、癌患者３４例の
うち３３例が分析可能で、２４／３３（７２．７％）が
ＬＯＨ陽性であった。尿を分析した場合のＬＯＨ陽性の
頻度と、癌のステージ、組織学的グレードの間の相関
を、表３にまとめた。各遺伝子多型部位におけるＬＯＨ
陽性の頻度は４６．７％（ＶＡＶ２）から６９．２％
（Ｄ９Ｓ３０３）で、分析した９番染色体上の５つの多
型部位のＬＯＨを組み合わせると２４／３３（７２．７
％）がＬＯＨ陽性であった。癌のステージ毎のＬＯＨ
は、 pＴa が１１／１５（７３．３％）、 pＴ1 が８／
１３（６１．５％）、 pＴ2 以上５／５（１００％）で
あった。また、グレード別では、Ｇ1 が６／１０（６０
％）、Ｇ2 が６／９（６６．７％）、Ｇ3 が１２／１４
（８５．７％）であった。１７番染色体上の癌抑制遺伝
子ｐ５３中の遺伝子多型部位のＬＯＨを分析した場合、
初期の膀胱癌は検出できなかった（特開平９−２０１１
９９）が、９番染色体の欠失を検出することにより、 p
Ｔa ステージ、Ｇ1 グレードの初期の膀胱癌まで高率に
検出できるようになった。

【００３０】

【表３】

【００３１】尿と癌組織とも測定できた症例で比較する
と、２２／３３（６６．７％）が両方ともＬＯＨ陽性
で、５例（１５％）が、尿、癌組織ともＬＯＨ陰性で、
９番染色体は保持されていた。診断精度は８１．７％で
あった。癌組織では２６例が、尿では２４例がそれぞれ
ＬＯＨ陽性であった。２例（患者Ｎｏ. １とＮｏ. ３
０）では、尿のみＬＯＨ陽性であった（表４）。

【００３２】

【表４】表４．尿と癌組織のＬＯＨの比較 ─────────────────────────────────── 尿検体 ───────────────────── ＬＯＨ陽性保持（ＬＯＨ陰性） ─────────────────────────────────── ＬＯＨ陽性２２４癌組織 ────────────────────────────── 保持（ＬＯＨ陰性）２５ ─────────────────────────────────── p ＝0.0086

【００３３】実施例２尿のＬＯＨと細胞診の感度の比
較膀胱患者３３例の尿の細胞診を行い、実施例１の尿のＬ
ＯＨ分析結果と比較した（表５）。尿の９番染色体のＬ
ＯＨでは２４例が陽性であるのに対し、細胞診では１２
例が陽性で、尿ＬＯＨ分析法の僅か５０％であった。ま
た、ＬＯＨ陰性の９例のうち、２例（２２％）が細胞診
で陽性であった。癌組織で９番染色体のＬＯＨ陽性の２
６例をみると、２２例（８５％）は尿のＬＯＨが陽性
で、４例（１５％）がＬＯＨ陰性であった。この尿ＬＯ
Ｈ陽性２２例のうちで、僅か１１例（５０％）が細胞診
陽性であった。また、この尿ＬＯＨ陰性４例の全ては、
細胞診でも陰性だった。１７番染色体上の癌抑制遺伝子
ｐ５３中の遺伝子多型部位のＬＯＨを用いた場合、尿の
細胞診より膀胱癌のスクリーニング性能は劣っていた
（特開平９−２０１１９９）が、９番染色体の欠失を検
出することにより、スクリーニング性能は大幅に向上し
た。

【００３４】

【表５】表５．尿のＬＯＨと細胞診の比較 ─────────────────────────────────── 尿の細胞診 ─────────────────── 陽性陰性 ─────────────────────────────────── ＬＯＨ陽性１２１２尿検体 ───────────────────────────── 保持（ＬＯＨ陰性）２７ ─────────────────────────────────── p ＝0.2409

【００３５】

【発明の効果】本発明の尿を検体とする染色体の欠失を
検出する膀胱癌の遺伝子検査法を用いると、膀胱癌を、
初期の段階から効率よくスクリーニングできるようにな
った。

【図面の簡単な説明】

【図１】膀胱癌症例の末端平滑化ＳＳＣＰ分析の電気泳
動パターン

【図２】膀胱癌患者の癌組織と尿について、９番染色体
上のＬＯＨの分析結果

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】尿中の細胞から抽出したＤＮＡを用い
て、９番染色体（相同染色体）のいずれか一方の少なく
とも一部の欠損を検出することを特徴とする膀胱癌の検
査方法。
【請求項２】尿中の細胞から抽出したＤＮＡを用い
て、９番染色体の短腕部（９ｐ）と長腕部（９ｑ）の欠
失を検出し、これらを組み合わせて検査する膀胱癌の検
査方法。
【請求項３】染色体上の遺伝子多型の存在する部位
を、ポリメラーゼチェーンリアクション法（ＰＣＲ）で
増幅後、該ＰＣＲ産物の末端を平滑化処理し、得られた
ＤＮＡ断片を一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析法（ＳＳＣ
Ｐ）で分析し、該遺伝子多型部位のヘテロ接合性の消失
（ＬＯＨ）を検出する方法である請求項１又は２記載の
検査方法。
【請求項４】膀胱癌が、初期の膀胱癌である請求項１
から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】尿中の細胞から抽出したＤＮＡを用いて
相同染色体の一方の少なくとも一部の欠失を、ＬＯＨに
より検出し膀胱癌を検査する際に、繰り返し単位の差が
１単位以上であるマイクロサテライト型多型部分を利用
し、該部分の遺伝子をＰＣＲで増幅後、該ＰＣＲ産物の
末端を平滑化処理し、得られたＤＮＡ断片をＳＳＣＰで
分析し、該遺伝子多型部位のＬＯＨにより検出する膀胱
癌の検査方法。