JPH11346776A - ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのシトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼ遺伝子 - Google Patents
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのシトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼ遺伝子Info
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- JPH11346776A JPH11346776A JP10164019A JP16401998A JPH11346776A JP H11346776 A JPH11346776 A JP H11346776A JP 10164019 A JP10164019 A JP 10164019A JP 16401998 A JP16401998 A JP 16401998A JP H11346776 A JPH11346776 A JP H11346776A
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- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
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- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)
- C12N9/0038—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6) with a heme protein as acceptor (1.6.2)
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 コリネ型細菌のシトクロムｂｄ型キノールオ
キシダーゼの遺伝子を取得し、その構造を明らかにす
る。 【解決手段】 ブレビバクテリウム・フラバムのシトク
ロムｂｄ型キノールオキシダーゼのサブユニットＩのＮ
末端とサブユニットIIのＮ末端のアミノ酸配列に基づい
てオリゴヌクレオチドを合成し、これをプライマーとし
て、ブレビバクテリウム・フラバムの染色体ＤＮＡを鋳
型としてＰＣＲを行い、得られる増幅断片をプローブと
してブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの染色
体ＤＮＡライブラリーから、ブレビバクテリウム・ラク
トファーメンタムのシトクロムｂｄ型キノールオキシダ
ーゼをコードする遺伝子を取得する。
キシダーゼの遺伝子を取得し、その構造を明らかにす
る。 【解決手段】 ブレビバクテリウム・フラバムのシトク
ロムｂｄ型キノールオキシダーゼのサブユニットＩのＮ
末端とサブユニットIIのＮ末端のアミノ酸配列に基づい
てオリゴヌクレオチドを合成し、これをプライマーとし
て、ブレビバクテリウム・フラバムの染色体ＤＮＡを鋳
型としてＰＣＲを行い、得られる増幅断片をプローブと
してブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの染色
体ＤＮＡライブラリーから、ブレビバクテリウム・ラク
トファーメンタムのシトクロムｂｄ型キノールオキシダ
ーゼをコードする遺伝子を取得する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタムのシトクロムｂｄ型キノール
オキシダーゼ及びそれをコードするＤＮＡを提供する。
ム・ラクトファーメンタムのシトクロムｂｄ型キノール
オキシダーゼ及びそれをコードするＤＮＡを提供する。
【０００２】
【従来の技術】多くの生物は、呼吸によって生命活動に
必要なエネルギーを獲得する。高等生物では、炭水化
物、タンパク質、脂肪酸は細胞質で解糖系やβ酸化によ
りアセチルＣｏＡとなり、ミトコンドリアのクエン酸回
路に入って分解され、そのエネルギーはＮＡＤＨやＦＡ
ＤＨ2によって還元力の形で蓄えられ、それに連なるミ
トコンドリアの内膜上にある電子伝達系でＮＡＤＨは最
終的に水にまで完全酸化され、これに共役して形成され
るプロトン濃度勾配がＡＴＰ合成の駆動力となる。
必要なエネルギーを獲得する。高等生物では、炭水化
物、タンパク質、脂肪酸は細胞質で解糖系やβ酸化によ
りアセチルＣｏＡとなり、ミトコンドリアのクエン酸回
路に入って分解され、そのエネルギーはＮＡＤＨやＦＡ
ＤＨ2によって還元力の形で蓄えられ、それに連なるミ
トコンドリアの内膜上にある電子伝達系でＮＡＤＨは最
終的に水にまで完全酸化され、これに共役して形成され
るプロトン濃度勾配がＡＴＰ合成の駆動力となる。
【０００３】細菌の呼吸鎖は一般に、種に応じて、ま
た、生育環境に応じて多様な酵素複合体が働いており、
エネルギー効率も様々である。例えば、エシェリヒア・
コリ（Escherichia coli）にはｂｏ型とｂｄ型の二種の
キノールオキシダーゼがその呼吸鎖末端で働いている
が、両者を持つ野生株、ｂｏ型のみを持つ変異株、及び
ｂｄ型のみを持つ変異株の好気的培養における生育収量
を比較すると、生育収量はｂｄ型のみを持つ変異株が最
も低く、末端酸化酵素の種類とそのエネルギー獲得効率
に依存する（平成７年度日本生物工学会講演要旨集演題
番号３５７）。
た、生育環境に応じて多様な酵素複合体が働いており、
エネルギー効率も様々である。例えば、エシェリヒア・
コリ（Escherichia coli）にはｂｏ型とｂｄ型の二種の
キノールオキシダーゼがその呼吸鎖末端で働いている
が、両者を持つ野生株、ｂｏ型のみを持つ変異株、及び
ｂｄ型のみを持つ変異株の好気的培養における生育収量
を比較すると、生育収量はｂｄ型のみを持つ変異株が最
も低く、末端酸化酵素の種類とそのエネルギー獲得効率
に依存する（平成７年度日本生物工学会講演要旨集演題
番号３５７）。
【０００４】グラム陽性菌であるブレビバクテリウム・
ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentu
m）やブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium
flavum）等のコリネ型細菌は、アミノ酸発酵菌として工
業的に利用される好気性菌である。呼吸鎖の末端酸化酵
素の研究は、コリネ型細菌と系統分類上で大きく離れた
プロテオバクテリア（Proteobacteria）やコリネ型細菌
と同じグラム陽性菌に属するがやや系統が離れている枯
草菌や好熱性バチルス（Bacillus）では進んでいるが、
コリネ型細菌の呼吸鎖の電子伝達系は詳しく調べられて
いない。コリネ型細菌でエネルギー代謝の要である呼吸
鎖の電子伝達系を解明することは、有用物質の生産性の
改善等のための基礎データとしても重要であると考えら
れる。また、コリネ型細菌の呼吸鎖電子伝達系に関与す
る酵素、及びその遺伝子を同定すれば、よりエネルギー
効率のよい菌を作りだすことなどの応用が可能かもしれ
ない。
ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentu
m）やブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium
flavum）等のコリネ型細菌は、アミノ酸発酵菌として工
業的に利用される好気性菌である。呼吸鎖の末端酸化酵
素の研究は、コリネ型細菌と系統分類上で大きく離れた
プロテオバクテリア（Proteobacteria）やコリネ型細菌
と同じグラム陽性菌に属するがやや系統が離れている枯
草菌や好熱性バチルス（Bacillus）では進んでいるが、
コリネ型細菌の呼吸鎖の電子伝達系は詳しく調べられて
いない。コリネ型細菌でエネルギー代謝の要である呼吸
鎖の電子伝達系を解明することは、有用物質の生産性の
改善等のための基礎データとしても重要であると考えら
れる。また、コリネ型細菌の呼吸鎖電子伝達系に関与す
る酵素、及びその遺伝子を同定すれば、よりエネルギー
効率のよい菌を作りだすことなどの応用が可能かもしれ
ない。
【０００５】現在、ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムの呼吸がプロトン輸送と共役していることとシ
トクロムａ、ｂ、ｃを持つということが報告されている
（Kawahara, Y., et al.(1988) Agric. Biol. Chem., 5
2(8), 1979-1983）。また、ブレビバクテリウム・フラ
バムのシトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼが精製さ
れ、性質決定がなされている（楠本、曽根、坂本（199
7）「アミノ酸発酵菌Brevibacterium flavumの呼吸鎖と
そのシトクロムｂｄ型メナキノール酸化酵素の性質」、
生体エネルギー研究会第２３回討論会要旨集）。しか
し、コリネ型細菌のシトクロムｂｄ型キノールオキシダ
ーゼをコードする遺伝子に関する報告はない。
メンタムの呼吸がプロトン輸送と共役していることとシ
トクロムａ、ｂ、ｃを持つということが報告されている
（Kawahara, Y., et al.(1988) Agric. Biol. Chem., 5
2(8), 1979-1983）。また、ブレビバクテリウム・フラ
バムのシトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼが精製さ
れ、性質決定がなされている（楠本、曽根、坂本（199
7）「アミノ酸発酵菌Brevibacterium flavumの呼吸鎖と
そのシトクロムｂｄ型メナキノール酸化酵素の性質」、
生体エネルギー研究会第２３回討論会要旨集）。しか
し、コリネ型細菌のシトクロムｂｄ型キノールオキシダ
ーゼをコードする遺伝子に関する報告はない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記観点か
らなされたものであり、コリネ型細菌のシトクロムｂｄ
型キノールオキシダーゼの遺伝子を取得し、その構造を
明らかにすることを課題とする。
らなされたものであり、コリネ型細菌のシトクロムｂｄ
型キノールオキシダーゼの遺伝子を取得し、その構造を
明らかにすることを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために、ブレビバクテリウム・フラバムのシト
クロムｂｄ型キノールオキシダーゼのサブユニットＩの
Ｎ末端とサブユニットIIのＮ末端のアミノ酸配列に基づ
いてオリゴヌクレオチドを合成し、これをプライマーと
して用い、ブレビバクテリウム・フラバムの染色体ＤＮ
Ａを鋳型としてＰＣＲを行い、増幅断片を得た。そし
て、この増幅断片をプローブとしてブレビバクテリウム
・ラクトファーメンタム野生株の染色体ＤＮＡライブラ
リーをスクリーニングすることによって、ブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムのシトクロムｂｄ型キノ
ールオキシダーゼをコードする遺伝子を取得することに
成功し、本発明を完成するに至った。
解決するために、ブレビバクテリウム・フラバムのシト
クロムｂｄ型キノールオキシダーゼのサブユニットＩの
Ｎ末端とサブユニットIIのＮ末端のアミノ酸配列に基づ
いてオリゴヌクレオチドを合成し、これをプライマーと
して用い、ブレビバクテリウム・フラバムの染色体ＤＮ
Ａを鋳型としてＰＣＲを行い、増幅断片を得た。そし
て、この増幅断片をプローブとしてブレビバクテリウム
・ラクトファーメンタム野生株の染色体ＤＮＡライブラ
リーをスクリーニングすることによって、ブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムのシトクロムｂｄ型キノ
ールオキシダーゼをコードする遺伝子を取得することに
成功し、本発明を完成するに至った。
【０００８】すなわち本発明は、 （１）下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ断片、 （Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有す
るポリペプチド。 （Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿
入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、か
つ、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するシトクロ
ムｂｄ型キノールオキシダーゼのサブユニットIIととも
にシトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼ活性を有する
タンパク質を構成し得るポリペプチド、
ドするＤＮＡ断片、 （Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有す
るポリペプチド。 （Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿
入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、か
つ、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するシトクロ
ムｂｄ型キノールオキシダーゼのサブユニットIIととも
にシトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼ活性を有する
タンパク質を構成し得るポリペプチド、
【０００９】（２）下記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すポリペ
プチドをコードするＤＮＡ断片、 （Ｃ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有す
るポリペプチド。 （Ｄ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿
入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、か
つ、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するシトクロ
ムｂｄ型キノールオキシダーゼのサブユニットＩととも
にシトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼ活性を有する
タンパク質を構成し得るポリペプチド、
プチドをコードするＤＮＡ断片、 （Ｃ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有す
るポリペプチド。 （Ｄ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿
入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、か
つ、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するシトクロ
ムｂｄ型キノールオキシダーゼのサブユニットＩととも
にシトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼ活性を有する
タンパク質を構成し得るポリペプチド、
【００１０】（３）下記（ａ）又は（ｂ）に示すポリペ
プチドと、（ｃ）又は（ｄ）に示すポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ断片、 （ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有す
るポリペプチド。 （ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿
入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、か
つ、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するシトクロ
ムｂｄ型キノールオキシダーゼのサブユニットIIととも
にシトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼ活性を有する
タンパク質を構成し得るポリペプチド。 （ｃ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有す
るポリペプチド。 （ｄ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿
入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、か
つ、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するシトクロ
ムｂｄ型キノールオキシダーゼのサブユニットＩととも
にシトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼ活性を有する
タンパク質を構成し得るポリペプチド。
プチドと、（ｃ）又は（ｄ）に示すポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ断片、 （ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有す
るポリペプチド。 （ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿
入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、か
つ、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するシトクロ
ムｂｄ型キノールオキシダーゼのサブユニットIIととも
にシトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼ活性を有する
タンパク質を構成し得るポリペプチド。 （ｃ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有す
るポリペプチド。 （ｄ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿
入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、か
つ、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するシトクロ
ムｂｄ型キノールオキシダーゼのサブユニットＩととも
にシトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼ活性を有する
タンパク質を構成し得るポリペプチド。
【００１１】（４）配列番号１記載の塩基配列において
塩基番号９３３〜２４８３からなる塩基配列を有する
（１）のＤＮＡ断片、 （５）配列番号１記載の塩基配列において塩基番号２４
７６〜３４９８からなる塩基配列を有する（２）のＤＮ
Ａ断片。ドをコードするＤＮＡ断片、および （６）配列番号１記載の塩基配列において塩基番号９３
３〜３４９８からなる塩基配列を有する（３）のＤＮＡ
断片、である。
塩基番号９３３〜２４８３からなる塩基配列を有する
（１）のＤＮＡ断片、 （５）配列番号１記載の塩基配列において塩基番号２４
７６〜３４９８からなる塩基配列を有する（２）のＤＮ
Ａ断片。ドをコードするＤＮＡ断片、および （６）配列番号１記載の塩基配列において塩基番号９３
３〜３４９８からなる塩基配列を有する（３）のＤＮＡ
断片、である。
【００１２】本明細書において、シトクロムｂｄ型キノ
ールオキシダーゼ活性とは、シトクロムｂとシトクロム
ｄの酸化還元差吸収スペクトルを持ち、かつ、酸素を消
費しながら還元型キノン化合物（キノール類）を酸化す
る活性をいう。また、シトクロムｂｄ型キノールオキシ
ダーゼまたはそのサブユニットをコードするＤＮＡ断片
を、「本発明のＤＮＡ」ということがある。
ールオキシダーゼ活性とは、シトクロムｂとシトクロム
ｄの酸化還元差吸収スペクトルを持ち、かつ、酸素を消
費しながら還元型キノン化合物（キノール類）を酸化す
る活性をいう。また、シトクロムｂｄ型キノールオキシ
ダーゼまたはそのサブユニットをコードするＤＮＡ断片
を、「本発明のＤＮＡ」ということがある。
【００１３】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のＤＮＡは、ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタム染色体ＤＮＡから、公知のブレビバクテリウム
・フラバムのシトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼの
部分アミノ酸配列に基づいて取得することができる。具
体的には、該アミノ酸配列に基づいて作製したオリゴヌ
クレオチドをプライマーとし、ブレビバクテリウム・フ
ラバムの染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことに
よりブレビバクテリウム・フラバムのシトクロムｂｄ型
キノールオキシダーゼ遺伝子の部分配列を取得する。次
に、得られた部分配列をプローブとして、ブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムの染色体ＤＮＡライブラ
リーをスクリーニングすることにより、ブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタムのシトクロムｂｄ型キノー
ルオキシダーゼをコードする遺伝子が得られる。
本発明のＤＮＡは、ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタム染色体ＤＮＡから、公知のブレビバクテリウム
・フラバムのシトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼの
部分アミノ酸配列に基づいて取得することができる。具
体的には、該アミノ酸配列に基づいて作製したオリゴヌ
クレオチドをプライマーとし、ブレビバクテリウム・フ
ラバムの染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことに
よりブレビバクテリウム・フラバムのシトクロムｂｄ型
キノールオキシダーゼ遺伝子の部分配列を取得する。次
に、得られた部分配列をプローブとして、ブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムの染色体ＤＮＡライブラ
リーをスクリーニングすることにより、ブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタムのシトクロムｂｄ型キノー
ルオキシダーゼをコードする遺伝子が得られる。
【００１４】ブレビバクテリウム・フラバム及びブレビ
バクテリウム・ラクトファーメンタムの染色体ＤＮＡ
は、例えば斎藤、三浦の方法（Biochem.Biophys.Acta.,
72,619,(1963)）、K. S. Kirbyの方法（Biochem.J.,64,
405,(1956)）等の方法により調製することができる。染
色体ＤＮＡライブラリーは、染色体ＤＮＡを適当な制限
酵素で部分分解し、得られるＤＮＡ断片をエシェリヒア
・コリ細胞内で自律複製可能なベクターＤＮＡに連結
し、組換えＤＮＡを作製し、エシェリヒア・コリに導入
することによって得られる。ベクターは、通常遺伝子の
クローニングに用いられるベクターであれば特に制限さ
れず、pUC19、pUC18、pUC118、puC119等のプラスミドベ
クター、λファージＤＮＡなどのファージベクターが使
用できる。
バクテリウム・ラクトファーメンタムの染色体ＤＮＡ
は、例えば斎藤、三浦の方法（Biochem.Biophys.Acta.,
72,619,(1963)）、K. S. Kirbyの方法（Biochem.J.,64,
405,(1956)）等の方法により調製することができる。染
色体ＤＮＡライブラリーは、染色体ＤＮＡを適当な制限
酵素で部分分解し、得られるＤＮＡ断片をエシェリヒア
・コリ細胞内で自律複製可能なベクターＤＮＡに連結
し、組換えＤＮＡを作製し、エシェリヒア・コリに導入
することによって得られる。ベクターは、通常遺伝子の
クローニングに用いられるベクターであれば特に制限さ
れず、pUC19、pUC18、pUC118、puC119等のプラスミドベ
クター、λファージＤＮＡなどのファージベクターが使
用できる。
【００１５】前記ＰＣＲに用いるプライマーとしては、
例えば、配列番号７及び配列番号８に示す塩基配列を有
するオリゴヌクレオチドが挙げられる。得られるＰＣＲ
産物が目的の配列を有することは、塩基配列を決定し、
プライマーに相当する配列を含むこと、または該塩基配
列から予想されるアミノ酸配列がブレビバクテリウム・
フラバムのシトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼの公
知の部分アミノ酸配列を含むことを確認することによ
り、調べることができる。
例えば、配列番号７及び配列番号８に示す塩基配列を有
するオリゴヌクレオチドが挙げられる。得られるＰＣＲ
産物が目的の配列を有することは、塩基配列を決定し、
プライマーに相当する配列を含むこと、または該塩基配
列から予想されるアミノ酸配列がブレビバクテリウム・
フラバムのシトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼの公
知の部分アミノ酸配列を含むことを確認することによ
り、調べることができる。
【００１６】ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片をプローブと
するブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの染色
体ＤＮＡライブラリーのスクリーニングは、ライブラリ
ーの調製にプラスミドベクターを用いた場合はコロニー
ハイブリダイゼーションによって、ファージベクターを
用いた場合はプラークハイブリダイゼーションによって
行うことができる。ハイブリダイゼーション陽性のクロ
ーンからＤＮＡを調製し、塩基配列を決定することによ
り、目的とするシトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼ
遺伝子を含むことを確認することができる。また、ハイ
ブリダイゼーション陽性のクローンについて、予め前記
プローブを用いてサザン解析を行ってもよい。
するブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの染色
体ＤＮＡライブラリーのスクリーニングは、ライブラリ
ーの調製にプラスミドベクターを用いた場合はコロニー
ハイブリダイゼーションによって、ファージベクターを
用いた場合はプラークハイブリダイゼーションによって
行うことができる。ハイブリダイゼーション陽性のクロ
ーンからＤＮＡを調製し、塩基配列を決定することによ
り、目的とするシトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼ
遺伝子を含むことを確認することができる。また、ハイ
ブリダイゼーション陽性のクローンについて、予め前記
プローブを用いてサザン解析を行ってもよい。
【００１７】上記のようにして、実施例で得られたブレ
ビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８
６９株のシトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼ遺伝子
の塩基配列を配列番号１に示す。また、予想されるコー
ド領域及びそれによってコードされるタンパク質のアミ
ノ酸配列を、配列番号１〜４に示す。コード領域及びオ
ペロン構造の予想、及びバチルス・ステアロサーモフィ
ルス（Bacillus stearothermophilus）K1041、及びエシ
ェリヒア・コリのシトクロムｂｄ型キノールオキシダー
ゼとの相同性等は、ＧＥＮＥＴＹＸ‐Ｈｏｍｏｌｏｇｙ
Ｖｅｒｓｉｏｎ２．２．２（ソフトウェア開発株式会
社製）を用いて解析した。
ビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８
６９株のシトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼ遺伝子
の塩基配列を配列番号１に示す。また、予想されるコー
ド領域及びそれによってコードされるタンパク質のアミ
ノ酸配列を、配列番号１〜４に示す。コード領域及びオ
ペロン構造の予想、及びバチルス・ステアロサーモフィ
ルス（Bacillus stearothermophilus）K1041、及びエシ
ェリヒア・コリのシトクロムｂｄ型キノールオキシダー
ゼとの相同性等は、ＧＥＮＥＴＹＸ‐Ｈｏｍｏｌｏｇｙ
Ｖｅｒｓｉｏｎ２．２．２（ソフトウェア開発株式会
社製）を用いて解析した。
【００１８】シトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼ遺
伝子には、２つのオープンリーディングフレーム（５’
末端側から順にｃｙｄＡ、ｃｙｄＢ）があり、各々シト
クロムｂｄ型キノールオキシダーゼのサブユニットＩ
（以下、単に「サブユニットＩ」ともいう）及びサブユ
ニットII（以下、単に「サブユニットII」ともいう）を
コードしている。ｃｙｄＡ、ｃｙｄＢは、それぞれ１５
５１ｂｐ、１０２３ｂｐであり、サブユニットＩは５１
７アミノ酸残基、サブユニットIIは３４１アミノ酸残基
から成っていると推定された。また、ｃｙｄＡの上流に
はプロモーター様配列が存在し、ｃｙｄＡ、ｃｙｄＢの
それぞれの上流にはそれぞれＳＤ様配列が存在し、ｃｙ
ｄＢの下流にはターミネーター様配列が存在することか
ら、ｃｙｄＡ及びｃｙｄＢはｃｙｄオペロンを形成して
いると考えられる。
伝子には、２つのオープンリーディングフレーム（５’
末端側から順にｃｙｄＡ、ｃｙｄＢ）があり、各々シト
クロムｂｄ型キノールオキシダーゼのサブユニットＩ
（以下、単に「サブユニットＩ」ともいう）及びサブユ
ニットII（以下、単に「サブユニットII」ともいう）を
コードしている。ｃｙｄＡ、ｃｙｄＢは、それぞれ１５
５１ｂｐ、１０２３ｂｐであり、サブユニットＩは５１
７アミノ酸残基、サブユニットIIは３４１アミノ酸残基
から成っていると推定された。また、ｃｙｄＡの上流に
はプロモーター様配列が存在し、ｃｙｄＡ、ｃｙｄＢの
それぞれの上流にはそれぞれＳＤ様配列が存在し、ｃｙ
ｄＢの下流にはターミネーター様配列が存在することか
ら、ｃｙｄＡ及びｃｙｄＢはｃｙｄオペロンを形成して
いると考えられる。
【００１９】尚、サブユニットＩのＮ末端のアミノ酸残
基のコドンはＧＴＧであり、対応するアミノ酸が配列表
ではＶａｌとなっているが、実際はＭｅｔであり、これ
はＧＴＧを開始メチオニンとして認識しているためであ
ると考えられる。このような例は他にも報告されてい
る。
基のコドンはＧＴＧであり、対応するアミノ酸が配列表
ではＶａｌとなっているが、実際はＭｅｔであり、これ
はＧＴＧを開始メチオニンとして認識しているためであ
ると考えられる。このような例は他にも報告されてい
る。
【００２０】図１及び２に、本発明のシトクロムｂｄ型
キノールオキシダーゼと、バチルス・ステアロサーモフ
ィルス及びエシェリヒア・コリのサブユニットＩの構造
を比べるためのハイドロパシー分析を行った結果、及び
アミノ酸配列のアラインメントを示す。ＩからVIIは各
膜貫通ヘリックス領域であり、これらにより、少なくと
も膜貫通ヘリックスは７本はあることが確認され、グラ
フのパターンからも類似していることが分かる。また、
エシェリヒア・コリのサブユニットＩのＶとVIの間の部
分にＱループと呼ばれるキノール結合部位を含む領域が
存在するが、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ムではバチルス・ステアロサーモフィルスｃｙｄＡと同
様にＱループ後半部分と相同性を示す領域が無くなって
おり、Ｑループ領域が短かくなっていた。この点を考え
るとブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのシト
クロムｂｄ型キノールオキシダーゼはエシェリヒア・コ
リよりもバチルス・ステアロサーモフィルスのシトクロ
ムｂｄ型キノールオキシダーゼに似通った構造を持つと
考えられる。また、サブユニットＩのアミノ酸配列の比
較により、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
はバチルス・ステアロサーモフィルスと約２４．７％、
エシェリヒア・コリと約３８．６％のホモロジーを示
し、サブユニットＩ全体で見るとブレビバクテリウム・
ラクトファーメンタムのシトクロムｂｄ型キノールオキ
シダーゼはバチルス・ステアロサーモフィルスよりもエ
シェリヒア・コリのシトクロムｂｄ型キノールオキジダ
ーゼに似通った構造を持つと考えられる。
キノールオキシダーゼと、バチルス・ステアロサーモフ
ィルス及びエシェリヒア・コリのサブユニットＩの構造
を比べるためのハイドロパシー分析を行った結果、及び
アミノ酸配列のアラインメントを示す。ＩからVIIは各
膜貫通ヘリックス領域であり、これらにより、少なくと
も膜貫通ヘリックスは７本はあることが確認され、グラ
フのパターンからも類似していることが分かる。また、
エシェリヒア・コリのサブユニットＩのＶとVIの間の部
分にＱループと呼ばれるキノール結合部位を含む領域が
存在するが、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ムではバチルス・ステアロサーモフィルスｃｙｄＡと同
様にＱループ後半部分と相同性を示す領域が無くなって
おり、Ｑループ領域が短かくなっていた。この点を考え
るとブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのシト
クロムｂｄ型キノールオキシダーゼはエシェリヒア・コ
リよりもバチルス・ステアロサーモフィルスのシトクロ
ムｂｄ型キノールオキシダーゼに似通った構造を持つと
考えられる。また、サブユニットＩのアミノ酸配列の比
較により、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
はバチルス・ステアロサーモフィルスと約２４．７％、
エシェリヒア・コリと約３８．６％のホモロジーを示
し、サブユニットＩ全体で見るとブレビバクテリウム・
ラクトファーメンタムのシトクロムｂｄ型キノールオキ
シダーゼはバチルス・ステアロサーモフィルスよりもエ
シェリヒア・コリのシトクロムｂｄ型キノールオキジダ
ーゼに似通った構造を持つと考えられる。
【００２１】また、ヘムｂ５５８のリガンドとしてエシ
ェリヒア・コリｃｙｄＡではＨ１９、Ｈ１８６、Ｍ３９
３、バチルス・ステアロサーモフィルスｃｙｄＡではＨ
２１、Ｈ１８４、Ｍ３２６がそれぞれ機能的に重要な残
基として報告されているが、これらのアミノ酸もブレビ
バクテリウム・ラクトファーメンタムのｃｙｄＡではＨ
１８、Ｈ１８５、Ｍ３５０に保存されている。
ェリヒア・コリｃｙｄＡではＨ１９、Ｈ１８６、Ｍ３９
３、バチルス・ステアロサーモフィルスｃｙｄＡではＨ
２１、Ｈ１８４、Ｍ３２６がそれぞれ機能的に重要な残
基として報告されているが、これらのアミノ酸もブレビ
バクテリウム・ラクトファーメンタムのｃｙｄＡではＨ
１８、Ｈ１８５、Ｍ３５０に保存されている。
【００２２】図３に、３つの細菌のサブユニットIIのア
ミノ酸配列のアラインメントを示す。サブユニットII
は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムはバチ
ルス・ステアロサーモフィルスと約２５．９％、エシェ
リヒア・コリと約３４．８％のホモロジーを示した。
ミノ酸配列のアラインメントを示す。サブユニットII
は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムはバチ
ルス・ステアロサーモフィルスと約２５．９％、エシェ
リヒア・コリと約３４．８％のホモロジーを示した。
【００２３】本発明のＤＮＡは、配列番号２に示す塩基
配列を有するサブユニットＩ、配列番号４に示す塩基配
列を有するサブユニットII、又はこれらのサブユニット
Ｉ及びサブユニットIIを含むシトクロムｂｄ型キノール
オキシダーゼタンパク質のいずれかをコードするＤＮＡ
である。これらのＤＮＡのいずれかを適当な宿主細胞に
導入し、得られる形質転換体を培養し、該ＤＮＡを発現
させることによって、サブユニットＩ、サブユニットII
又はシトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼタンパク質
を製造することができる。サブユニットＩをコードする
ＤＮＡとしては配列番号１記載の塩基配列において塩基
番号９３３〜２４８３からなる塩基配列を有するＤＮＡ
が、サブユニットIIをコードするＤＮＡとしては塩基番
号２４７６〜３４９８からなる塩基配列を有するＤＮＡ
が、これらの両方をコードするＤＮＡとしては塩基番号
９３３〜３４９８からなる塩基配列を有するＤＮＡが挙
げられる。
配列を有するサブユニットＩ、配列番号４に示す塩基配
列を有するサブユニットII、又はこれらのサブユニット
Ｉ及びサブユニットIIを含むシトクロムｂｄ型キノール
オキシダーゼタンパク質のいずれかをコードするＤＮＡ
である。これらのＤＮＡのいずれかを適当な宿主細胞に
導入し、得られる形質転換体を培養し、該ＤＮＡを発現
させることによって、サブユニットＩ、サブユニットII
又はシトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼタンパク質
を製造することができる。サブユニットＩをコードする
ＤＮＡとしては配列番号１記載の塩基配列において塩基
番号９３３〜２４８３からなる塩基配列を有するＤＮＡ
が、サブユニットIIをコードするＤＮＡとしては塩基番
号２４７６〜３４９８からなる塩基配列を有するＤＮＡ
が、これらの両方をコードするＤＮＡとしては塩基番号
９３３〜３４９８からなる塩基配列を有するＤＮＡが挙
げられる。
【００２４】製造されたシトクロムｂｄ型キノールオキ
シダーゼタンパク質又はそのサブユニットは、塩析、溶
媒沈殿、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロ
マトグラフィー等の通常タンパク質の精製に用いられる
方法で、培養物から採取、精製することができる。
シダーゼタンパク質又はそのサブユニットは、塩析、溶
媒沈殿、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロ
マトグラフィー等の通常タンパク質の精製に用いられる
方法で、培養物から採取、精製することができる。
【００２５】また、本発明のサブユニットＩをコードす
るＤＮＡは、配列番号２に示すアミノ酸配列において、
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加、又は逆位等の変異を含むアミノ酸配列からなるもの
であっても、サブユニットIIとともにシトクロムｂｄ型
キノールオキシダーゼ活性を有するタンパク質を構成し
得るポリペプチドをコードするものであってもよい。
るＤＮＡは、配列番号２に示すアミノ酸配列において、
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加、又は逆位等の変異を含むアミノ酸配列からなるもの
であっても、サブユニットIIとともにシトクロムｂｄ型
キノールオキシダーゼ活性を有するタンパク質を構成し
得るポリペプチドをコードするものであってもよい。
【００２６】また、本発明のサブユニットIIをコードす
るＤＮＡは、配列番号４に示すアミノ酸配列において、
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加、又は逆位等の変異を含むアミノ酸配列からなるもの
であっても、サブユニットＩとともにシトクロムｂｄ型
キノールオキシダーゼ活性を有するタンパク質を構成し
得るポリペプチドをコードするものであってもよい。
るＤＮＡは、配列番号４に示すアミノ酸配列において、
１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付
加、又は逆位等の変異を含むアミノ酸配列からなるもの
であっても、サブユニットＩとともにシトクロムｂｄ型
キノールオキシダーゼ活性を有するタンパク質を構成し
得るポリペプチドをコードするものであってもよい。
【００２７】さらに、サブユニットＩもしくはサブユニ
ットII又はこれらの両方に変異を含むシトクロムｂｄ型
キノールオキシダーゼをコードするＤＮＡも、本発明の
ＤＮＡに含まれる。ここで「数個」とは、好ましくは１
〜４０個、より好ましくは１〜１０個である。
ットII又はこれらの両方に変異を含むシトクロムｂｄ型
キノールオキシダーゼをコードするＤＮＡも、本発明の
ＤＮＡに含まれる。ここで「数個」とは、好ましくは１
〜４０個、より好ましくは１〜１０個である。
【００２８】本発明のＤＮＡを発現させるための宿主と
しては、エシェリヒア・コリ、ブレビバクテリウム・ラ
クトファーメンタム、ブレビバクテリウム・フラバム等
のコリネ型細菌をはじめとする種々の細菌、サッカロマ
イセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等の
真核細胞が挙げられる。これらの宿主に本発明のＤＮＡ
を導入するには、発現させようとする宿主の種類に応じ
たベクターに本発明のＤＮＡを挿入して得られる組換え
ベクターで、宿主細胞を形質転換すればよい。これらの
操作は、遺伝子組換え技術において当業者によく知られ
た方法で実施することができる。
しては、エシェリヒア・コリ、ブレビバクテリウム・ラ
クトファーメンタム、ブレビバクテリウム・フラバム等
のコリネ型細菌をはじめとする種々の細菌、サッカロマ
イセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等の
真核細胞が挙げられる。これらの宿主に本発明のＤＮＡ
を導入するには、発現させようとする宿主の種類に応じ
たベクターに本発明のＤＮＡを挿入して得られる組換え
ベクターで、宿主細胞を形質転換すればよい。これらの
操作は、遺伝子組換え技術において当業者によく知られ
た方法で実施することができる。
【００２９】本発明のＤＮＡ及びそれによってコードさ
れるシトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼ又はそのサ
ブユニットは、コリネ型細菌の電子伝達系の解明に有用
であると考えられる。また、本発明のＤＮＡは、エネル
ギー効率よく有用物質を生産するコリネ型細菌の育種に
利用できることが期待される。
れるシトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼ又はそのサ
ブユニットは、コリネ型細菌の電子伝達系の解明に有用
であると考えられる。また、本発明のＤＮＡは、エネル
ギー効率よく有用物質を生産するコリネ型細菌の育種に
利用できることが期待される。
【００３０】
【実施例】以下、実施例により本発明をより具体的に説
明する。
明する。
【００３１】＜１＞ブレビバクテリウム・フラバムのシ
トクロムｂｄ型キノールオキシダーゼの精製 定常期を過ぎるまで培養したブレビバクテリウム・フラ
バムＡＴＣＣ１４０６７株の菌体（湿重量約１２０ｇ）
を、緩衝液（０．５％ ＮａＣｌ、１０ｍＭ リン酸ナト
リウム、ｐＨ７．４）２００ｍｌに懸濁した直後、０．
５ｍＭのガラス粒子存在下でバイオスペック（Biospe
c）社のビードビーターで高速攪拌して菌体を破砕し
た。この菌体破砕液を５，０００ｒｐｍで１０分遠心し
て破砕されていない菌体を除いた後、１５，０００ｒｐ
ｍで１０分遠心して得られる沈殿と、上清をさらに１
５，０００ｒｐｍで３０分遠心して得られる沈殿とを合
わせ、前記緩衝液に懸濁して膜標品とした。
トクロムｂｄ型キノールオキシダーゼの精製 定常期を過ぎるまで培養したブレビバクテリウム・フラ
バムＡＴＣＣ１４０６７株の菌体（湿重量約１２０ｇ）
を、緩衝液（０．５％ ＮａＣｌ、１０ｍＭ リン酸ナト
リウム、ｐＨ７．４）２００ｍｌに懸濁した直後、０．
５ｍＭのガラス粒子存在下でバイオスペック（Biospe
c）社のビードビーターで高速攪拌して菌体を破砕し
た。この菌体破砕液を５，０００ｒｐｍで１０分遠心し
て破砕されていない菌体を除いた後、１５，０００ｒｐ
ｍで１０分遠心して得られる沈殿と、上清をさらに１
５，０００ｒｐｍで３０分遠心して得られる沈殿とを合
わせ、前記緩衝液に懸濁して膜標品とした。
【００３２】上記膜標品懸濁液（５ｍｇ／ｍｌ、０．５
％ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．
４）をテフロンホモジナイザーで均一化し、４０，００
０ｒｐｍで２０分遠心し、沈殿を回収した。これに１．
５％コール酸ナトリウム、０．５％デオキシコール酸ナ
トリウム、０．１％ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリ
ウム、ｐＨ７．４）を加えてホモジナイズし、４０，０
００ｒｐｍで２０分遠心して沈殿を回収した。この沈殿
に１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）を加えてホ
モジナイズし、４０，０００ｒｐｍで２０分遠心して沈
殿を回収した。
％ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．
４）をテフロンホモジナイザーで均一化し、４０，００
０ｒｐｍで２０分遠心し、沈殿を回収した。これに１．
５％コール酸ナトリウム、０．５％デオキシコール酸ナ
トリウム、０．１％ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリ
ウム、ｐＨ７．４）を加えてホモジナイズし、４０，０
００ｒｐｍで２０分遠心して沈殿を回収した。この沈殿
に１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）を加えてホ
モジナイズし、４０，０００ｒｐｍで２０分遠心して沈
殿を回収した。
【００３３】上記のようにしてコール酸で洗浄した膜標
品を、界面活性剤ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミ
ド（ＭＥＧＡ−９）及びデカノイル−Ｎ−メチルグルカ
ミド（ＭＥＧＡ−１０）を１％づつ含む緩衝液に懸濁さ
せた。これを氷中でホモジナイズした後、超音波処理
し、４０，０００ｒｐｍで２０分遠心し、上清を得た。
品を、界面活性剤ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミ
ド（ＭＥＧＡ−９）及びデカノイル−Ｎ−メチルグルカ
ミド（ＭＥＧＡ−１０）を１％づつ含む緩衝液に懸濁さ
せた。これを氷中でホモジナイズした後、超音波処理
し、４０，０００ｒｐｍで２０分遠心し、上清を得た。
【００３４】上記の遠心上清を、１％ ＭＥＧＡ−９、
１％ ＭＥＧＡ−１０、１０％グリセロール、１０ｍＭ
リン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）で平衡化したハイドロ
キシアパタイトカラムに吸着させ、リン酸ナトリウム濃
度をステップワイズ（０、５０、１５０、２５０、４０
０ｍＭ）に上昇させて溶出し、分画した。各画分のシト
クロムを酸化還元差スペクトルにより検出した結果、リ
ン酸ナトリウム濃度５０ｍＭの溶出画分にシトクロム
ｃ、ｂが、１５０ｍＭの溶出画分にシトクロムｃ、ｂ及
びａが、２５０ｍＭの溶出画分にシトクロムｂ、ｄが検
出された。
１％ ＭＥＧＡ−１０、１０％グリセロール、１０ｍＭ
リン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）で平衡化したハイドロ
キシアパタイトカラムに吸着させ、リン酸ナトリウム濃
度をステップワイズ（０、５０、１５０、２５０、４０
０ｍＭ）に上昇させて溶出し、分画した。各画分のシト
クロムを酸化還元差スペクトルにより検出した結果、リ
ン酸ナトリウム濃度５０ｍＭの溶出画分にシトクロム
ｃ、ｂが、１５０ｍＭの溶出画分にシトクロムｃ、ｂ及
びａが、２５０ｍＭの溶出画分にシトクロムｂ、ｄが検
出された。
【００３５】リン酸ナトリウム濃度２５０ｍＭの溶出画
分を、１０％グリセロール、１０ｍＭリン酸ナトリウム
（ｐＨ７．４）に対して透析した後、同緩衝液で平衡化
したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（東ソー）カラムに
吸着させ、ＮａＣｌ濃度をステップワイズ（０、８０、
１００、１２０、１４０、３００ｍＭ）に上昇させて溶
出し、分画した。各画分のシトクロムを酸化還元差スペ
クトルにより検出した結果、ＮａＣｌ濃度１２０ｍＭの
溶出画分にシトクロムｂ、ｄが検出された。この画分を
シトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼ酵素標品とし
た。
分を、１０％グリセロール、１０ｍＭリン酸ナトリウム
（ｐＨ７．４）に対して透析した後、同緩衝液で平衡化
したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（東ソー）カラムに
吸着させ、ＮａＣｌ濃度をステップワイズ（０、８０、
１００、１２０、１４０、３００ｍＭ）に上昇させて溶
出し、分画した。各画分のシトクロムを酸化還元差スペ
クトルにより検出した結果、ＮａＣｌ濃度１２０ｍＭの
溶出画分にシトクロムｂ、ｄが検出された。この画分を
シトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼ酵素標品とし
た。
【００３６】上記酵素標品を１３．５％ゲルを用いてＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、ＰＶＤ
Ｆ膜にブロットし、サブユニットＩ及びサブユニットII
に相当する位置の膜をアミノ酸配列分析にかけ、Ｎ末端
アミノ酸配列を決定した。それぞれのアミノ酸配列を配
列番号５（サブユニットＩ）及び配列番号６（サブユニ
ットII）に示す。
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、ＰＶＤ
Ｆ膜にブロットし、サブユニットＩ及びサブユニットII
に相当する位置の膜をアミノ酸配列分析にかけ、Ｎ末端
アミノ酸配列を決定した。それぞれのアミノ酸配列を配
列番号５（サブユニットＩ）及び配列番号６（サブユニ
ットII）に示す。
【００３７】＜２＞ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムのシトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼ遺伝
子の単離 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの染色体Ｄ
ＮＡライブラリーから、シトクロムｂｄ型キノールオキ
シダーゼ遺伝子を含むクローンをコロニーハイブリダイ
ゼーションによってスクリーニングした。
メンタムのシトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼ遺伝
子の単離 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの染色体Ｄ
ＮＡライブラリーから、シトクロムｂｄ型キノールオキ
シダーゼ遺伝子を含むクローンをコロニーハイブリダイ
ゼーションによってスクリーニングした。
【００３８】前記のブレビバクテリウム・フラバムのシ
トクロムｂｄ型キノールオキシダーゼの部分アミノ酸配
列に基づいて２種のオリゴヌクレオチドを合成した。一
方は、シトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼのサブユ
ニットＩのＮ末アミノ酸配列に基づいて作製し（ｂｂｄ
１：配列番号７）、他方はサブユニットIIのＮ末端アミ
ノ酸配列に基づいて作製した（ｂｂｄ２：配列番号
８）。
トクロムｂｄ型キノールオキシダーゼの部分アミノ酸配
列に基づいて２種のオリゴヌクレオチドを合成した。一
方は、シトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼのサブユ
ニットＩのＮ末アミノ酸配列に基づいて作製し（ｂｂｄ
１：配列番号７）、他方はサブユニットIIのＮ末端アミ
ノ酸配列に基づいて作製した（ｂｂｄ２：配列番号
８）。
【００３９】上記プライマーｂｂｄ１及びｂｂｄ２を用
いて、ブレビバクテリウム・フラバムＡＴＣＣ１４０６
７株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法を行った。反
応は、９４℃で１分間変性させた後、変性：９５℃、４
５秒間、アニーリング：５０℃、６０秒間、鎖長反応：
６２℃、９０秒間からなるサイクルを３５サイクル繰り
返すことによって行った。その結果、約１５００ｂｐ、
８００ｂｐ、１００ｂｐの各断片が得られた。このう
ち、精製タンパクから推定されるサブユニットＩの分子
量５６．４ｋＤ、及び他の細菌のシトクロムｂｄ型キノ
ールオキシダーゼのサブユニットＩの報告されている分
子量から、約１５００ｂｐの断片を目的のＰＣＲ産物と
考えた。そこで、ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで電
気泳動し、約１．５ｋｂｐの断片をゲルから切り出し、
ＤＮＡを抽出した。
いて、ブレビバクテリウム・フラバムＡＴＣＣ１４０６
７株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法を行った。反
応は、９４℃で１分間変性させた後、変性：９５℃、４
５秒間、アニーリング：５０℃、６０秒間、鎖長反応：
６２℃、９０秒間からなるサイクルを３５サイクル繰り
返すことによって行った。その結果、約１５００ｂｐ、
８００ｂｐ、１００ｂｐの各断片が得られた。このう
ち、精製タンパクから推定されるサブユニットＩの分子
量５６．４ｋＤ、及び他の細菌のシトクロムｂｄ型キノ
ールオキシダーゼのサブユニットＩの報告されている分
子量から、約１５００ｂｐの断片を目的のＰＣＲ産物と
考えた。そこで、ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで電
気泳動し、約１．５ｋｂｐの断片をゲルから切り出し、
ＤＮＡを抽出した。
【００４０】このＤＮＡ断片をＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎ
ｇ Ｋｉｔ（宝酒造（株））を用いて平滑末端化し、Ｓ
ｍａＩ消化後アルカリホスファターゼ処理したｐＵＣ１
１８ベクターと、ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ
Ｖｅｒ．２（宝酒造（株））を使用して連結した。得ら
れた組換えプライマーでエシェリヒア・コリＸＬ−１Ｂ
ｌｕｅ株を形質転換した。
ｇ Ｋｉｔ（宝酒造（株））を用いて平滑末端化し、Ｓ
ｍａＩ消化後アルカリホスファターゼ処理したｐＵＣ１
１８ベクターと、ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ
Ｖｅｒ．２（宝酒造（株））を使用して連結した。得ら
れた組換えプライマーでエシェリヒア・コリＸＬ−１Ｂ
ｌｕｅ株を形質転換した。
【００４１】得られた形質転換体からプラスミドを調製
し、挿入断片の塩基配列を決定した。塩基配列の決定
は、フォワードプライマ―としてFluorescein Labeled
PrimerM4（宝酒造（株）、配列番号９）、リバースプラ
イマーとしてFluorescein Labeled Primer RV-MＦ（宝
酒造（株）、配列番号１０）を使用し、Thermo Sequenc
e fluorescent labelled primer cycle sequencing kit
（アマシャムライフサイエンス社）のプロトコルに従
って行った。その結果、プライマーとの相同性からシト
クロムｂｄ型キノールオキシダーゼ遺伝子を含んでいる
ことを確認した。この部分クローンをＢＤ１とした。
し、挿入断片の塩基配列を決定した。塩基配列の決定
は、フォワードプライマ―としてFluorescein Labeled
PrimerM4（宝酒造（株）、配列番号９）、リバースプラ
イマーとしてFluorescein Labeled Primer RV-MＦ（宝
酒造（株）、配列番号１０）を使用し、Thermo Sequenc
e fluorescent labelled primer cycle sequencing kit
（アマシャムライフサイエンス社）のプロトコルに従
って行った。その結果、プライマーとの相同性からシト
クロムｂｄ型キノールオキシダーゼ遺伝子を含んでいる
ことを確認した。この部分クローンをＢＤ１とした。
【００４２】このＢＤ１を、前記プライマーＭ４及びＲ
Ｖ−Ｍを使用して、ＰＣＲ法で増幅し、DIG DNA Labeli
ng Kit（ベーリンガーマンハイム社）を用いてＤＩＧ
（ジゴキシゲニン(Digoxigenin)）ラベルされたプロー
ブを作製した。
Ｖ−Ｍを使用して、ＰＣＲ法で増幅し、DIG DNA Labeli
ng Kit（ベーリンガーマンハイム社）を用いてＤＩＧ
（ジゴキシゲニン(Digoxigenin)）ラベルされたプロー
ブを作製した。
【００４３】上記プローブを用いて、ブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタム染色体ＤＮＡライブラリーの
スクリーニングを行った。ライブラリーは、ブレビバク
テリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９株
の染色体ＤＮＡをＳａｕ３Ａ１で部分分解し、ｐＵＣ１
８のＢａｍＨＩ部位に挿入し、得られた組換えプラスミ
ドでエシェリヒア・コリＸＬ−１Ｂｌｕｅを形質転換し
たものを使用した。形質転換体のコロニーに対し、上記
のＤＩＧラベルしたプローブを用いて、コロニーハイブ
リダイゼーションを行った。プローブの検出は、アルカ
リフォスファターゼ標識した抗ＤＩＧ抗体を用いたDIG
Dtection Kit（ベーリンガーマンハイム社）を使用して
行った。
ム・ラクトファーメンタム染色体ＤＮＡライブラリーの
スクリーニングを行った。ライブラリーは、ブレビバク
テリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９株
の染色体ＤＮＡをＳａｕ３Ａ１で部分分解し、ｐＵＣ１
８のＢａｍＨＩ部位に挿入し、得られた組換えプラスミ
ドでエシェリヒア・コリＸＬ−１Ｂｌｕｅを形質転換し
たものを使用した。形質転換体のコロニーに対し、上記
のＤＩＧラベルしたプローブを用いて、コロニーハイブ
リダイゼーションを行った。プローブの検出は、アルカ
リフォスファターゼ標識した抗ＤＩＧ抗体を用いたDIG
Dtection Kit（ベーリンガーマンハイム社）を使用して
行った。
【００４４】ハイブリダイゼーション陽性のコロニーか
らプラスミドを調製し、ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで消化
し、ＢＤ１をプローブとしてサザンブロッティングを行
った。その結果、２個のクローンが陽性であった。これ
らの陽性クローンの挿入断片をそれぞれＢＤ２１、ＢＤ
３１とした。ＢＤ２１は約３．８ｋｂｐ、ＢＤ３１は約
９．０ｋｂｐであった。これらのクローンをサブクロー
ニングし、塩基配列を決定した。その結果を配列番号１
に示す。また、予想されるコード領域及びそれによって
コードされるタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号１
〜４に示す。
らプラスミドを調製し、ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで消化
し、ＢＤ１をプローブとしてサザンブロッティングを行
った。その結果、２個のクローンが陽性であった。これ
らの陽性クローンの挿入断片をそれぞれＢＤ２１、ＢＤ
３１とした。ＢＤ２１は約３．８ｋｂｐ、ＢＤ３１は約
９．０ｋｂｐであった。これらのクローンをサブクロー
ニングし、塩基配列を決定した。その結果を配列番号１
に示す。また、予想されるコード領域及びそれによって
コードされるタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号１
〜４に示す。
【００４５】
【発明の効果】本発明によりブレビバクテリウム・ラク
トファーメンタムのシトクロムｂｄ型キノールオキシダ
ーゼ又はそのサブユニットをコードするＤＮＡが提供さ
れる。
トファーメンタムのシトクロムｂｄ型キノールオキシダ
ーゼ又はそのサブユニットをコードするＤＮＡが提供さ
れる。
【００４６】
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：2047 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源 生物名：ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム 株名：ＡＴＣＣ１３８６９ 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：933..2486 特徴を決定した方法： 配列 GGATCCTCTC TGTTCAAAAC AGCACCTACT CTTTTACTCC CGAGTTCCGA CGTGCCCTCG 60 ACGAAAGCCT AGAAGTGACG GACCGAGATG AGGCTGCTCA GAATTTTAAG TTTCACGTCC 120 AAGACATCAT CGAAACTGGG TTGTTTATCG CCAGAAATAA TGGATTCTGG CAAGGAAACC 180 TCGTCGTTGG CGAAAGATAT TCCCGACGAG ATGTCTGCCG AATTCTCAAT TGGGAACGAA 240 ACAATGAGAG CACGATTTAT GGTTACAAAG TGGACAGCTA CACATCGACG TGCCCAATCT 300 TTGTGACCTA TCACAAGGCT GATGATGTAT CCGAAGTACT CGTTACCAGG ATGAACTCGT 360 CGATCCGAAT ACCCTTCATT GGTATTCCCG CGGCAACCGA AAGATCACGT CTAATGAGAT 420 CAAGCCCATC GCTGCGAATG TGTGGATCTT CATGTTTTTG TGAAGAAGGA CGATGCCGAA 480 GGCCTTGATT TCTTCTACCT TGGTCAAGCG CATTCAGAAA ACAGCAAACA GTCATCGATG 540 CCCGGAAACA AAGGAGTTGT GCAACCGGTG GTCACAATGG ATCTACAGTT CGACACACCC 600 GTCGAACAAA GCCTGTTTGA GTACCTGAGC ACAAATCTCG CCGTAACGGA GTAACCACCG 660 CAACCAAGCG TCGAAAAGCA AAATCTTTTC GAGTTTTTGG TGACTTGTCA ACAAGGGGGG 720 AGCAAAATCA GTCATTGACA GGGAAAGGTT GACCACAATC GGGGTTAGCC TTTCTAAAGT 780 TAAGCTGTGA GCGGGAACTT AGGAATAAAC TTCAACGACA ACCTTTAAGA AGCTCTTATT 840 GGTTCTTCGT TTTGTATCGA TAAATACAAT CGGTTTCCTG GCTCAATAAG GCTGTTCCTG 900 TCAATCTGTA AAGAAGAGGA AGGGGACCTA GC GTG GAT GTC GTT GAC ATC GCG 953 Val Asp Val Val Asp Ile Ala 1 5 CGG TGG CAA TTC GGA ATT ACC ACC GTC TAT CAC TTC ATT TTT GTC CCA 1001 Arg Trp Gln Phe Gly Ile Thr Thr Val Tyr His Phe Ile Phe Val Pro 10 15 20 CTG ACC ATT GGC TTA GCA CCG CTG GTC GCG ATC ATG CAA ACG TTT TGG 1049 Leu Thr Ile Gly Leu Ala Pro Leu Val Ala Ile Met Gln Thr Phe Trp 25 30 35 CAA GTT ACC GGC AAA GAG CAC TGG TAT CGG GCT ACG AGA TTT TTT GGC 1097 Gln Val Thr Gly Lys Glu His Trp Tyr Arg Ala Thr Arg Phe Phe Gly 40 45 50 55 ACT GTG CTG CTC ATC AAC TTC GCG GTT GGT GTA GCA ACG GGC ATT GTG 1145 Thr Val Leu Leu Ile Asn Phe Ala Val Gly Val Ala Thr Gly Ile Val 60 65 70 CAG GAG TTC CAG TTC GGT ATG AAC TGG TCG GAA TAT TCG CGT TTC GTC 1193 Gln Glu Phe Gln Phe Gly Met Asn Trp Ser Glu Tyr Ser Arg Phe Val 75 80 85 GGT GAT GTT TTC GGC GGA CCG CTG GCT TTG GAG GGG CTC ATC GCG TTC 1241 Gly Asp Val Phe Gly Gly Pro Leu Ala Leu Glu Gly Leu Ile Ala Phe 90 95 100 TTC CTT GAG TCT GTG TTC TTA GGT CTG TGG ATT TTC GGA TGG GGG AAG 1289 Phe Leu Glu Ser Val Phe Leu Gly Leu Trp Ile Phe Gly Trp Gly Lys 105 110 115 ATT CCT GGA TGG CTG CAT ACT GCG TCC ATT TGG ATC GTT GCT ATT GCG 1337 Ile Pro Gly Trp Leu His Thr Ala Ser Ile Trp Ile Val Ala Ile Ala 120 125 130 135 ACG AAT ATT TCT GCC TAT TTC ATC ATC GTG GCC AAC TCG TTT ATG CAG 1385 Thr Asn Ile Ser Ala Tyr Phe Ile Ile Val Ala Asn Ser Phe Met Gln 140 145 150 CAT CCG GTG GGT GCT GAG TAT AAC CCT GAG ACT GGT CGG GCG GAG CTT 1433 His Pro Val Gly Ala Glu Tyr Asn Pro Glu Thr Gly Arg Ala Glu Leu 155 160 165 ACT GAT TTC TGG GCT CTT CTC ACA AAC TCC ACC GCG CTG GCT GCG TTC 1481 Thr Asp Phe Trp Ala Leu Leu Thr Asn Ser Thr Ala Leu Ala Ala Phe 170 175 180 CCG CAT GCT GTT GCC GGT GGT TTT TTA ACA GCT GGA ACT TTC GTC CTC 1529 Pro His Ala Val Ala Gly Gly Phe Leu Thr Ala Gly Thr Phe Val Leu 185 190 195 GGA ATT TCG GGT TGG TGG ATT ATT CGT GCG CAC CGC CAG GCG AAG AAG 1577 Gly Ile Ser Gly Trp Trp Ile Ile Arg Ala His Arg Gln Ala Lys Lys 200 205 210 215 GCT GAG GCG GAA ATC GAG TCG AAG CAT TCA ATG CAC AGG CCG GCG TTG 1625 Ala Glu Ala Glu Ile Glu Ser Lys His Ser Met His Arg Pro Ala Leu 220 225 230 TGG GTT GGT TGG TGG ACC ACA GTT GTC TCT TCC GTG GCA CTG TTC ATC 1673 Trp Val Gly Trp Trp Thr Thr Val Val Ser Ser Val Ala Leu Phe Ile 235 240 245 ACT GGC GAT ACA CAG GCG AAG CTC ATG TTC GTG CAG CAG CCG ATG AAG 1721 Thr Gly Asp Thr Gln Ala Lys Leu Met Phe Val Gln Gln Pro Met Lys 250 255 260 ATG GCG TCG GCG GAA TCC TTG TGT GAA ACC GCC ACA GAT CCA AAC TTC 1769 Met Ala Ser Ala Glu Ser Leu Cys Glu Thr Ala Thr Asp Pro Asn Phe 265 270 275 TCC ATT CTG ACA ATT GGT ACG CAC AAC AAC TGC GAT ACG GTA ACC CAC 1817 Ser Ile Leu Thr Ile Gly Thr His Asn Asn Cys Asp Thr Val Thr His 280 285 290 295 CTG ATC GAT GTT CCG TTT GTG CTT CCA TTC TTG GCT GAA GGA AAA TTC 1865 Leu Ile Asp Val Pro Phe Val Leu Pro Phe Leu Ala Glu Gly Lys Phe 300 305 310 ACC GGT GTG ACT TTG CAG GGT GTA AAC CAG CTC CAA GCT GCA GCG GAG 1913 Thr Gly Val Thr Leu Gln Gly Val Asn Gln Leu Gln Ala Ala Ala Glu 315 320 325 CAA GCA TAC GGT CCT GGC AAC TAC TCC CCT AAC TTG TTT GTC ACC TAC 1961 Gln Ala Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Ser Pro Asn Leu Phe Val Thr Tyr 330 335 340 TGG TCA TTC CGC GCA ATG ATC GGC CTA ATG CTT GGT TCT TTG GCT ATC 2009 Trp Ser Phe Arg Ala Met Ile Gly Leu Met Leu Gly Ser Leu Ala Ile 345 350 355 GCT GCG ATT GCG TGG CTG TTG CTG CGT AAG AAG CGC ACA CCA ACT GGA 2057 Ala Ala Ile Ala Trp Leu Leu Leu Arg Lys Lys Arg Thr Pro Thr Gly 360 365 370 375 AAG ATT GCT CGT CTC TTC CAA ATC GGC AGC CTC ATT GCC ATT CCA TTC 2105 Lys Ile Ala Arg Leu Phe Gln Ile Gly Ser Leu Ile Ala Ile Pro Phe 380 385 390 CCA TTC TTG GCT AAC TCT GCT GGT TGG ATC TTC ACC GAG ATG GGC CGC 2153 Pro Phe Leu Ala Asn Ser Ala Gly Trp Ile Phe Thr Glu Met Gly Arg 395 400 405 CAG CCT TGG GTG GTA CAC CCG AAT CCT GAA TCT GCC GGC GAT GCC CGA 2201 Gln Pro Trp Val Val His Pro Asn Pro Glu Ser Ala Gly Asp Ala Arg 410 415 420 ACA GAG ATG ATC CGG ATG ACT GTT GAT ATG GGT GTG TCT GAT CAT GCG 2249 Thr Glu Met Ile Arg Met Thr Val Asp Met Gly Val Ser Asp His Ala 425 430 435 CCG TGG CAA GTC TGG CTG ACT CTA ATT GGC TTC ACG ATT CTC TAT CTC 2297 Pro Trp Gln Val Trp Leu Thr Leu Ile Gly Phe Thr Ile Leu Tyr Leu 440 445 450 455 ATC TTG TTC GTG GTG TGG GTG TGG CTG ATT CGC CGC GCA GTT CTG ATC 2345 Ile Leu Phe Val Val Trp Val Trp Leu Ile Arg Arg Ala Val Leu Ile 460 465 470 GGA CCA CCA GAG GAA GGC GCT CCA TCC GTG GAG GCA AAG ACT GGA CCG 2393 Gly Pro Pro Glu Glu Gly Ala Pro Ser Val Glu Ala Lys Thr Gly Pro 475 480 485 GCA ACC CCG ATT GGT TCA GAT ATG CCC ATG ACA CCG CTG CAA TTT ACC 2441 Ala Thr Pro Ile Gly Ser Asp Met Pro Met Thr Pro Leu Gln Phe Thr 490 495 500 GTG CCG CCC CAA CCA CAC GTG AAA AGG AAT AAC CAT GGA TCT 2483 Val Pro Pro Gln Pro His Val Lys Arg Asn Asn His Gly Ser 505 510 515 TAATACCTTT TGGTTTATTC TCATCGCATT TTTGTTTGCG GGATACTTTC TCCTCGAAGG 2543 ATTCGACTTC GGTGTCGGAA TTTTAGCGCC GATCATCGGT AAAGATTCCG CCGCTAAAAA 2603 CACGATCATC CGCACCATCG GCCCTGTCTG GGACGGAAAT GAAGTGTGGC TGATCGTGGC 2663 AGGTGGCGCT TTGTTTGCTG CATTCCCTGA GTGGTACGCA ACGATGTTCT CCGGAATGTA 2723 TCTGCCGCTG TTCCTCGTGC TTGTGTCGTT GATCATGCGC GTGGTGGGCC TTGAATGGCG 2783 CAAGAAAGTC GATGATCCTC GTTGGCAAAA GTGGTCTGAC CGGGCCATCT TTATTGGTTC 2843 TTGGACTCCA CCGCTGATGT GGGGATTCAT CTTCGCCAAT ATTTTCAAGC TTGCATGCCC 2903 ATCAAGGCGG ATCACACCAT CGATGCTGCA GTGGCTCTGC TGTGCAATGT TCAACGTCTT 2963 CGCCATCCTG GGTGCACTTG CATTCACTGC GCTGTTCGCT CTTCATGGCC TTGCATTCAT 3023 CCGCCTGAAA ACTGCTGGTC GGGTGCGCAC CGATGCGGCG AAGGCAGCTC CAGTAGTCGC 3083 ACTTCTTGCT GCGGTGACTG GTGGACCTTT CGTGTTGTGG GCTGCCATCG CATACGGCCG 3143 TTCCTGGTCC TGGATCCTCG CAGTGCTGAT CATCGCAGCG GTTCTCGGTG GAGCTTTCGC 3203 ACTGATCAAA GACCGCGATG GATTAAGCTT CCTGTCCACT TCCGTCGCTG TCATCGGTGT 3263 AGTTGCACTG CTGTTTAGTT CCCTATTCCC CAACGTCATG CCAACAACGC TTGCCGATGG 3323 CGTGACTGGA TATTTGGAAC GCCTCCGCAA GCCACTACGC ATTGACCATC CTGACTTGGA 3383 CCGCCACTGT GATCGCACCG CTGGTTGTCC TCTACCAAGG CTGGACCTAC TGGGTGTTCC 3443 GCAAACGACT TCACGCCGAG CCAGTGTCTG CCTAAAAGTT GGAAAAATTG AGTACTAAAT 3503 CTGACGCTCC GGCTAGTCGC CGCACAGGCC CCGTCGATCC GCGGCTTTTG CGCCTATCCC 3563 CTGCTACCCG CCGTTGGGTG ATAATCGCAG GTGTTCTCAC CGCGTTGAAA ACTCTCGCGA 3623 CAGTCGCAAT GGGCTTGCTC ATCGGCCAGA TGGCAGCGGG CATCATTGAG GTTTCGGGAA 3683 GTTCTTTGCC CCGAATGGAA CTCATCGCGC TCGCCATCAC GGTGGTTGTG CGCGGACTTC 3743 TTGCGTGGGC ACAGGATCGG TTCGGAGCGC GCATCGTCCC AGGTGACTGT GGATCTTCGG 3803 GAGAAAACCC TGCGGCACCT GGCACAAAGC GATCCCCGCA CCATCGATCA AGCCTTGTGG 3863 CGCACCCGTT TGACCTCTGG CCTTGATGGT TTGGGGCCTT ACCTCACCGG ATTTTTGCCG 3923 CACTGGCCGC CAC 3936
【００４７】 配列番号：２ 配列の長さ：517 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Val Asp Val Val Asp Ile Ala Arg Trp Gln Phe Gly Ile Thr Thr Val 1 5 10 15 Tyr His Phe Ile Phe Val Pro Leu Thr Ile Gly Leu Ala Pro Leu Val 20 25 30 Ala Ile Met Gln Thr Phe Trp Gln Val Thr Gly Lys Glu His Trp Tyr 35 40 45 Arg Ala Thr Arg Phe Phe Gly Thr Val Leu Leu Ile Asn Phe Ala Val 50 55 60 Gly Val Ala Thr Gly Ile Val Gln Glu Phe Gln Phe Gly Met Asn Trp 65 70 75 80 Ser Glu Tyr Ser Arg Phe Val Gly Asp Val Phe Gly Gly Pro Leu Ala 85 90 95 Leu Glu Gly Leu Ile Ala Phe Phe Leu Glu Ser Val Phe Leu Gly Leu 100 105 110 Trp Ile Phe Gly Trp Gly Lys Ile Pro Gly Trp Leu His Thr Ala Ser 115 120 125 Ile Trp Ile Val Ala Ile Ala Thr Asn Ile Ser Ala Tyr Phe Ile Ile 130 135 140 Val Ala Asn Ser Phe Met Gln His Pro Val Gly Ala Glu Tyr Asn Pro 145 150 155 160 Glu Thr Gly Arg Ala Glu Leu Thr Asp Phe Trp Ala Leu Leu Thr Asn 165 170 175 Ser Thr Ala Leu Ala Ala Phe Pro His Ala Val Ala Gly Gly Phe Leu 180 185 190 Thr Ala Gly Thr Phe Val Leu Gly Ile Ser Gly Trp Trp Ile Ile Arg 195 200 205 Ala His Arg Gln Ala Lys Lys Ala Glu Ala Glu Ile Glu Ser Lys His 210 215 220 Ser Met His Arg Pro Ala Leu Trp Val Gly Trp Trp Thr Thr Val Val 225 230 235 240 Ser Ser Val Ala Leu Phe Ile Thr Gly Asp Thr Gln Ala Lys Leu Met 245 250 255 Phe Val Gln Gln Pro Met Lys Met Ala Ser Ala Glu Ser Leu Cys Glu 260 265 270 Thr Ala Thr Asp Pro Asn Phe Ser Ile Leu Thr Ile Gly Thr His Asn 275 280 285 Asn Cys Asp Thr Val Thr His Leu Ile Asp Val Pro Phe Val Leu Pro 290 295 300 Phe Leu Ala Glu Gly Lys Phe Thr Gly Val Thr Leu Gln Gly Val Asn 305 310 315 320 Gln Leu Gln Ala Ala Ala Glu Gln Ala Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Ser 325 330 335 Pro Asn Leu Phe Val Thr Tyr Trp Ser Phe Arg Ala Met Ile Gly Leu 340 345 350 Met Leu Gly Ser Leu Ala Ile Ala Ala Ile Ala Trp Leu Leu Leu Arg 355 360 365 Lys Lys Arg Thr Pro Thr Gly Lys Ile Ala Arg Leu Phe Gln Ile Gly 370 375 380 Ser Leu Ile Ala Ile Pro Phe Pro Phe Leu Ala Asn Ser Ala Gly Trp 385 390 395 400 Ile Phe Thr Glu Met Gly Arg Gln Pro Trp Val Val His Pro Asn Pro 405 410 415 Glu Ser Ala Gly Asp Ala Arg Thr Glu Met Ile Arg Met Thr Val Asp 420 425 430 Met Gly Val Ser Asp His Ala Pro Trp Gln Val Trp Leu Thr Leu Ile 435 440 445 Gly Phe Thr Ile Leu Tyr Leu Ile Leu Phe Val Val Trp Val Trp Leu 450 455 460 Ile Arg Arg Ala Val Leu Ile Gly Pro Pro Glu Glu Gly Ala Pro Ser 465 470 475 480 Val Glu Ala Lys Thr Gly Pro Ala Thr Pro Ile Gly Ser Asp Met Pro 485 490 495 Met Thr Pro Leu Gln Phe Thr Val Pro Pro Gln Pro His Val Lys Arg 500 505 510 Asn Asn His Gly Ser 515
【００４８】 配列番号：３ 配列の長さ：2047 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源 生物名：ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム 株名：ＡＴＣＣ１３８６９ 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：2476..3501 特徴を決定した方法： 配列 GGATCCTCTC TGTTCAAAAC AGCACCTACT CTTTTACTCC CGAGTTCCGA CGTGCCCTCG 60 ACGAAAGCCT AGAAGTGACG GACCGAGATG AGGCTGCTCA GAATTTTAAG TTTCACGTCC 120 AAGACATCAT CGAAACTGGG TTGTTTATCG CCAGAAATAA TGGATTCTGG CAAGGAAACC 180 TCGTCGTTGG CGAAAGATAT TCCCGACGAG ATGTCTGCCG AATTCTCAAT TGGGAACGAA 240 ACAATGAGAG CACGATTTAT GGTTACAAAG TGGACAGCTA CACATCGACG TGCCCAATCT 300 TTGTGACCTA TCACAAGGCT GATGATGTAT CCGAAGTACT CGTTACCAGG ATGAACTCGT 360 CGATCCGAAT ACCCTTCATT GGTATTCCCG CGGCAACCGA AAGATCACGT CTAATGAGAT 420 CAAGCCCATC GCTGCGAATG TGTGGATCTT CATGTTTTTG TGAAGAAGGA CGATGCCGAA 480 GGCCTTGATT TCTTCTACCT TGGTCAAGCG CATTCAGAAA ACAGCAAACA GTCATCGATG 540 CCCGGAAACA AAGGAGTTGT GCAACCGGTG GTCACAATGG ATCTACAGTT CGACACACCC 600 GTCGAACAAA GCCTGTTTGA GTACCTGAGC ACAAATCTCG CCGTAACGGA GTAACCACCG 660 CAACCAAGCG TCGAAAAGCA AAATCTTTTC GAGTTTTTGG TGACTTGTCA ACAAGGGGGG 720 AGCAAAATCA GTCATTGACA GGGAAAGGTT GACCACAATC GGGGTTAGCC TTTCTAAAGT 780 TAAGCTGTGA GCGGGAACTT AGGAATAAAC TTCAACGACA ACCTTTAAGA AGCTCTTATT 840 GGTTCTTCGT TTTGTATCGA TAAATACAAT CGGTTTCCTG GCTCAATAAG GCTGTTCCTG 900 TCAATCTGTA AAGAAGAGGA AGGGGACCTA GCGTGGATGT CGTTGACATC GCGCGGTGGC 960 AATTCGGAAT TACCACCGTC TATCACTTCA TTTTTGTCCC ACTGACCATT GGCTTAGCAC 1020 CGCTGGTCGC GATCATGCAA ACGTTTTGGC AAGTTACCGG CAAAGAGCAC TGGTATCGGG 1080 CTACGAGATT TTTTGGCACT GTGCTGCTCA TCAACTTCGC GGTTGGTGTA GCAACGGGCA 1140 TTGTGCAGGA GTTCCAGTTC GGTATGAACT GGTCGGAATA TTCGCGTTTC GTCGGTGATG 1200 TTTTCGGCGG ACCGCTGGCT TTGGAGGGGC TCATCGCGTT CTTCCTTGAG TCTGTGTTCT 1260 TAGGTCTGTG GATTTTCGGA TGGGGGAAGA TTCCTGGATG GCTGCATACT GCGTCCATTT 1320 GGATCGTTGC TATTGCGACG AATATTTCTG CCTATTTCAT CATCGTGGCC AACTCGTTTA 1380 TGCAGCATCC GGTGGGTGCT GAGTATAACC CTGAGACTGG TCGGGCGGAG CTTACTGATT 1440 TCTGGGCTCT TCTCACAAAC TCCACCGCGC TGGCTGCGTT CCCGCATGCT GTTGCCGGTG 1500 GTTTTTTAAC AGCTGGAACT TTCGTCCTCG GAATTTCGGG TTGGTGGATT ATTCGTGCGC 1560 ACCGCCAGGC GAAGAAGGCT GAGGCGGAAA TCGAGTCGAA GCATTCAATG CACAGGCCGG 1620 CGTTGTGGGT TGGTTGGTGG ACCACAGTTG TCTCTTCCGT GGCACTGTTC ATCACTGGCG 1680 ATACACAGGC GAAGCTCATG TTCGTGCAGC AGCCGATGAA GATGGCGTCG GCGGAATCCT 1740 TGTGTGAAAC CGCCACAGAT CCAAACTTCT CCATTCTGAC AATTGGTACG CACAACAACT 1800 GCGATACGGT AACCCACCTG ATCGATGTTC CGTTTGTGCT TCCATTCTTG GCTGAAGGAA 1860 AATTCACCGG TGTGACTTTG CAGGGTGTAA ACCAGCTCCA AGCTGCAGCG GAGCAAGCAT 1920 ACGGTCCTGG CAACTACTCC CCTAACTTGT TTGTCACCTA CTGGTCATTC CGCGCAATGA 1980 TCGGCCTAAT GCTTGGTTCT TTGGCTATCG CTGCGATTGC GTGGCTGTTG CTGCGTAAGA 2040 AGCGCACACC AACTGGAAAG ATTGCTCGTC TCTTCCAAAT CGGCAGCCTC ATTGCCATTC 2100 CATTCCCATT CTTGGCTAAC TCTGCTGGTT GGATCTTCAC CGAGATGGGC CGCCAGCCTT 2160 GGGTGGTACA CCCGAATCCT GAATCTGCCG GCGATGCCCG AACAGAGATG ATCCGGATGA 2220 CTGTTGATAT GGGTGTGTCT GATCATGCGC CGTGGCAAGT CTGGCTGACT CTAATTGGCT 2280 TCACGATTCT CTATCTCATC TTGTTCGTGG TGTGGGTGTG GCTGATTCGC CGCGCAGTTC 2340 TGATCGGACC ACCAGAGGAA GGCGCTCCAT CCGTGGAGGC AAAGACTGGA CCGGCAACCC 2400 CGATTGGTTC AGATATGCCC ATGACACCGC TGCAATTTAC CGTGCCGCCC CAACCACACG 2460 TGAAAAGGAA TAACC ATG GAT CTT AAT ACC TTT TGG TTT ATT CTC ATC GCA 2511 Met Asp Leu Asn Thr Phe Trp Phe Ile Leu Ile Ala 1 5 10 TTT TTG TTT GCG GGA TAC TTT CTC CTC GAA GGA TTC GAC TTC GGT GTC 2559 Phe Leu Phe Ala Gly Tyr Phe Leu Leu Glu Gly Phe Asp Phe Gly Val 15 20 25 GGA ATT TTA GCG CCG ATC ATC GGT AAA GAT TCC GCC GCT AAA AAC ACG 2607 Gly Ile Leu Ala Pro Ile Ile Gly Lys Asp Ser Ala Ala Lys Asn Thr 30 35 40 ATC ATC CGC ACC ATC GGC CCT GTC TGG GAC GGA AAT GAA GTG TGG CTG 2655 Ile Ile Arg Thr Ile Gly Pro Val Trp Asp Gly Asn Glu Val Trp Leu 45 50 55 60 ATC GTG GCA GGT GGC GCT TTG TTT GCT GCA TTC CCT GAG TGG TAC GCA 2703 Ile Val Ala Gly Gly Ala Leu Phe Ala Ala Phe Pro Glu Trp Tyr Ala 65 70 75 ACG ATG TTC TCC GGA ATG TAT CTG CCG CTG TTC CTC GTG CTT GTG TCG 2751 Thr Met Phe Ser Gly Met Tyr Leu Pro Leu Phe Leu Val Leu Val Ser 80 85 90 TTG ATC ATG CGC GTG GTG GGC CTT GAA TGG CGC AAG AAA GTC GAT GAT 2799 Leu Ile Met Arg Val Val Gly Leu Glu Trp Arg Lys Lys Val Asp Asp 95 100 105 CCT CGT TGG CAA AAG TGG TCT GAC CGG GCC ATC TTT ATT GGT TCT TGG 2847 Pro Arg Trp Gln Lys Trp Ser Asp Arg Ala Ile Phe Ile Gly Ser Trp 110 115 120 ACT CCA CCG CTG ATG TGG GGA TTC ATC TTC GCC AAT ATT TTC AAG CTT 2895 Thr Pro Pro Leu Met Trp Gly Phe Ile Phe Ala Asn Ile Phe Lys Leu 125 130 135 140 GCA TGC CCA TCA AGG CGG ATC ACA CCA TCG ATG CTG CAG TGG CTC TGC 2943 Ala Cys Pro Ser Arg Arg Ile Thr Pro Ser Met Leu Gln Trp Leu Cys 145 150 155 TGT GCA ATG TTC AAC GTC TTC GCC ATC CTG GGT GCA CTT GCA TTC ACT 2991 Cys Ala Met Phe Asn Val Phe Ala Ile Leu Gly Ala Leu Ala Phe Thr 160 165 170 GCG CTG TTC GCT CTT CAT GGC CTT GCA TTC ATC CGC CTG AAA ACT GCT 3039 Ala Leu Phe Ala Leu His Gly Leu Ala Phe Ile Arg Leu Lys Thr Ala 175 180 185 GGT CGG GTG CGC ACC GAT GCG GCG AAG GCA GCT CCA GTA GTC GCA CTT 3087 Gly Arg Val Arg Thr Asp Ala Ala Lys Ala Ala Pro Val Val Ala Leu 190 195 200 CTT GCT GCG GTG ACT GGT GGA CCT TTC GTG TTG TGG GCT GCC ATC GCA 3135 Leu Ala Ala Val Thr Gly Gly Pro Phe Val Leu Trp Ala Ala Ile Ala 205 210 215 220 TAC GGC CGT TCC TGG TCC TGG ATC CTC GCA GTG CTG ATC ATC GCA GCG 3183 Tyr Gly Arg Ser Trp Ser Trp Ile Leu Ala Val Leu Ile Ile Ala Ala 225 230 235 GTT CTC GGT GGA GCT TTC GCA CTG ATC AAA GAC CGC GAT GGA TTA AGC 3231 Val Leu Gly Gly Ala Phe Ala Leu Ile Lys Asp Arg Asp Gly Leu Ser 240 245 250 TTC CTG TCC ACT TCC GTC GCT GTC ATC GGT GTA GTT GCA CTG CTG TTT 3279 Phe Leu Ser Thr Ser Val Ala Val Ile Gly Val Val Ala Leu Leu Phe 255 260 265 AGT TCC CTA TTC CCC AAC GTC ATG CCA ACA ACG CTT GCC GAT GGC GTG 3327 Ser Ser Leu Phe Pro Asn Val Met Pro Thr Thr Leu Ala Asp Gly Val 270 275 280 ACT GGA TAT TTG GAA CGC CTC CGC AAG CCA CTA CGC ATT GAC CAT CCT 3375 Thr Gly Tyr Leu Glu Arg Leu Arg Lys Pro Leu Arg Ile Asp His Pro 285 290 295 300 GAC TTG GAC CGC CAC TGT GAT CGC ACC GCT GGT TGT CCT CTA CCA AGG 3423 Asp Leu Asp Arg His Cys Asp Arg Thr Ala Gly Cys Pro Leu Pro Arg 305 310 315 CTG GAC CTA CTG GGT GTT CCG CAA ACG ACT TCA CGC CGA GCC AGT GTC 3471 Leu Asp Leu Leu Gly Val Pro Gln Thr Thr Ser Arg Arg Ala Ser Val 320 325 330 TGC CTA AAA GTT GGA AAA ATT GAG TAC TAAATCTGAC GCTCCGGCTA 3518 Cys Leu Lys Val Gly Lys Ile Glu Tyr 335 340 GTCGCCGCAC AGGCCCCGTC GATCCGCGGC TTTTGCGCCT ATCCCCTGCT ACCCGCCGTT 3578 GGGTGATAAT CGCAGGTGTT CTCACCGCGT TGAAAACTCT CGCGACAGTC GCAATGGGCT 3638 TGCTCATCGG CCAGATGGCA GCGGGCATCA TTGAGGTTTC GGGAAGTTCT TTGCCCCGAA 3698 TGGAACTCAT CGCGCTCGCC ATCACGGTGG TTGTGCGCGG ACTTCTTGCG TGGGCACAGG 3758 ATCGGTTCGG AGCGCGCATC GTCCCAGGTG ACTGTGGATC TTCGGGAGAA AACCCTGCGG 3818 CACCTGGCAC AAAGCGATCC CCGCACCATC GATCAAGCCT TGTGGCGCAC CCGTTTGACC 3878 TCTGGCCTTG ATGGTTTGGG GCCTTACCTC ACCGGATTTT TGCCGCACTG GCCGCCAC 3936
【００４９】 配列番号：４ 配列の長さ：341 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Asp Leu Asn Thr Phe Trp Phe Ile Leu Ile Ala Phe Leu Phe Ala 1 5 10 15 Gly Tyr Phe Leu Leu Glu Gly Phe Asp Phe Gly Val Gly Ile Leu Ala 20 25 30 Pro Ile Ile Gly Lys Asp Ser Ala Ala Lys Asn Thr Ile Ile Arg Thr 35 40 45 Ile Gly Pro Val Trp Asp Gly Asn Glu Val Trp Leu Ile Val Ala Gly 50 55 60 Gly Ala Leu Phe Ala Ala Phe Pro Glu Trp Tyr Ala Thr Met Phe Ser 65 70 75 80 Gly Met Tyr Leu Pro Leu Phe Leu Val Leu Val Ser Leu Ile Met Arg 85 90 95 Val Val Gly Leu Glu Trp Arg Lys Lys Val Asp Asp Pro Arg Trp Gln 100 105 110 Lys Trp Ser Asp Arg Ala Ile Phe Ile Gly Ser Trp Thr Pro Pro Leu 115 120 125 Met Trp Gly Phe Ile Phe Ala Asn Ile Phe Lys Leu Ala Cys Pro Ser 130 135 140 Arg Arg Ile Thr Pro Ser Met Leu Gln Trp Leu Cys Cys Ala Met Phe 145 150 155 160 Asn Val Phe Ala Ile Leu Gly Ala Leu Ala Phe Thr Ala Leu Phe Ala 165 170 175 Leu His Gly Leu Ala Phe Ile Arg Leu Lys Thr Ala Gly Arg Val Arg 180 185 190 Thr Asp Ala Ala Lys Ala Ala Pro Val Val Ala Leu Leu Ala Ala Val 195 200 205 Thr Gly Gly Pro Phe Val Leu Trp Ala Ala Ile Ala Tyr Gly Arg Ser 210 215 220 Trp Ser Trp Ile Leu Ala Val Leu Ile Ile Ala Ala Val Leu Gly Gly 225 230 235 240 Ala Phe Ala Leu Ile Lys Asp Arg Asp Gly Leu Ser Phe Leu Ser Thr 245 250 255 Ser Val Ala Val Ile Gly Val Val Ala Leu Leu Phe Ser Ser Leu Phe 260 265 270 Pro Asn Val Met Pro Thr Thr Leu Ala Asp Gly Val Thr Gly Tyr Leu 275 280 285 Glu Arg Leu Arg Lys Pro Leu Arg Ile Asp His Pro Asp Leu Asp Arg 290 295 300 His Cys Asp Arg Thr Ala Gly Cys Pro Leu Pro Arg Leu Asp Leu Leu 305 310 315 320 Gly Val Pro Gln Thr Thr Ser Arg Arg Ala Ser Val Cys Leu Lys Val 325 330 335 Gly Lys Ile Glu Tyr 340
【００５０】 配列番号：５ 配列の長さ： 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 存在位置：18 他の情報：Xaa=不明 配列 Met Asp Val Val Asp Ile Ala Arg Trp Gln Phe Gly Ile Thr Ala Val 1 5 10 15 Tyr Xaa Phe
【００５１】 配列番号：６ 配列の長さ： 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 存在位置：16,17 他の情報：Xaa=不明 配列 Met Asp Leu Asn Thr Phe Trp Phe Ile Leu Ile Ala Phe Leu Phe Xaa 1 5 10 15 Xaa Tyr Phe Leu 20
【００５２】 配列番号：７ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：6,15,18 他の情報：Y=T又はC 存在位置：9,12 他の情報：N=A又はC又はG又はT 配列 ATGGAYGTNG TNGAYATYGC 20
【００５３】 配列番号：８ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：3,6,9,14,15 他の情報：R=A又はG 存在位置：25 他の情報：V=A又はC又はG 配列 CARAARGTRT TVARRTCCAT 20
【００５４】 配列番号：９ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGCCAGGGTT TTCCCAGTCA CGAC 24
【００５５】 配列番号：１０ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GAGCGGATAA CAATTTCACA CAGG 24
【図１】 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ム、バチルス・ステアロサーモフィルス及びエシェリヒ
ア・コリのシトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼのサ
ブユニットＩのハイドロパシー分析を示す図。「＊」印
は三者で共通のアミノ酸残基を示す。
ム、バチルス・ステアロサーモフィルス及びエシェリヒ
ア・コリのシトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼのサ
ブユニットＩのハイドロパシー分析を示す図。「＊」印
は三者で共通のアミノ酸残基を示す。
【図２】 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ム、バチルス・ステアロサーモフィルス及びエシェリヒ
ア・コリのシトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼのサ
ブユニットＩのアミノ酸配列のアラインメイトを示す
図。
ム、バチルス・ステアロサーモフィルス及びエシェリヒ
ア・コリのシトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼのサ
ブユニットＩのアミノ酸配列のアラインメイトを示す
図。
【図３】 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ム、バチルス・ステアロサーモフィルス及びエシェリヒ
ア・コリのシトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼのサ
ブユニットIIのハイドロパシー分析を示す図。「＊」印
は三者で共通のアミノ酸残基を示す。
ム、バチルス・ステアロサーモフィルス及びエシェリヒ
ア・コリのシトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼのサ
ブユニットIIのハイドロパシー分析を示す図。「＊」印
は三者で共通のアミノ酸残基を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (6)
- 【請求項１】 下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ断片。 （Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有す
るポリペプチド。 （Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿
入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、か
つ、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するシトクロ
ムｂｄ型キノールオキシダーゼのサブユニットIIととも
にシトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼ活性を有する
タンパク質を構成し得るポリペプチド。 - 【請求項２】 下記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ断片。 （Ｃ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有す
るポリペプチド。 （Ｄ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿
入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、か
つ、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するシトクロ
ムｂｄ型キノールオキシダーゼのサブユニットＩととも
にシトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼ活性を有する
タンパク質を構成し得るポリペプチド。 - 【請求項３】 下記（ａ）又は（ｂ）に示すポリペプチ
ド、及び（ｃ）又は（ｄ）に示すポリペプチドをコード
するＤＮＡ断片。 （ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有す
るポリペプチド。 （ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿
入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、か
つ、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するシトクロ
ムｂｄ型キノールオキシダーゼのサブユニットIIととも
にシトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼ活性を有する
タンパク質を構成し得るポリペプチド。 （ｃ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有す
るポリペプチド。 （ｄ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿
入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、か
つ、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するシトクロ
ムｂｄ型キノールオキシダーゼのサブユニットＩととも
にシトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼ活性を有する
タンパク質を構成し得るポリペプチド。 - 【請求項４】 配列番号１記載の塩基配列において塩基
番号９３３〜２４８３からなる塩基配列を有する請求項
１記載のＤＮＡ断片。 - 【請求項５】 配列番号１記載の塩基配列において塩基
番号２４７６〜３４９８からなる塩基配列を有する請求
項２記載のＤＮＡ断片。ドをコードするＤＮＡ断片。 - 【請求項６】 配列番号１記載の塩基配列において塩基
番号９３３〜３４９８からなる塩基配列を有する請求項
３記載のＤＮＡ断片。
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