JPH11346779A - 肝特異的有機アニオントランスポーターとその遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 本発明は、肝臓における有機アニオン性物質
の取り込み排出の制御をする蛋白質として有用な肝特異
的有機アニオントランスポーターＯＡＴ２、それをコー
ドする塩基配列を有する核酸、及び、それに対する抗体
を提供する。 【解決手段】 本発明は、肝特異的有機アニオントラン
スポーターＯＡＴ２、それをコードする塩基配列、及
び、それに対する抗体に関する。本発明の肝特異的有機
アニオントランスポーターＯＡＴ２のアミノ酸配列及び
塩基配列は、明細書中の配列表に示されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は有機陰イオン（有機
アニオン）輸送に関与する遺伝子と、その遺伝子がコー
ドするポリペプチドに関する。

【０００２】

【従来の技術】肝臓は、生体異物や薬物の代謝および体
外排出に関して重要な役割を果たしている。肝細胞は極
性を有する上皮細胞であり、血液とは側底膜、また胆汁
とは胆管側膜を介して接している。陰イオン（アニオ
ン）性の薬物は、輸送担体（トランスポーター）により
側底膜を介して肝臓中に取り込まれ、また肝細胞内で代
謝により産生された有機アニオンもトランスポーターに
より肝細胞より排出される。

【０００３】肝細胞の側底膜を介した有機アニオンの取
り込み（即ち血液と肝細胞間での有機アニオンの輸送）
については、これまで摘出臓器潅流法や単離細胞膜小胞
系などを用いた実験系により研究されてきた。これらの
研究により主に、生理的有機アニオンの一つである胆汁
酸の輸送について多くの知見が得られてきた。

【０００４】しかし従来の手法では、肝細胞の特に側底
膜を介した物質輸送について詳細に解析することは困難
であり、トランスポーターそのものを単離して詳細に解
析することが望まれてきた。

【０００５】これまでの分子生物学的な研究から、肝臓
の側底膜に発現している有機アニオントランスポーター
としては２種類のものがクローニングされている（Ｊａ
ｃｑｕｅｍｉｎ，Ｅ．ら、 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１巻、１３３−７頁、１９９
４年、Ｈａｇｅｎｂｕｃｈ，Ｂ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８巻、１０６２９−
３３頁、１９９１年）。

【０００６】しかしながら、これらのトランスポーター
のみでは肝臓の側底膜における多様な有機アニオン輸送
を説明することが出来ず、新規有機アニオントランスポ
ーターの存在が予想されていた。

【０００７】腎臓は肝臓とならび、有機アニオン輸送を
最も活発におこなっている臓器である。腎臓における
（特に側底膜を介した）有機アニオン輸送の研究は１０
０年近い歴史を持ち、その輸送特性については膨大な検
討がなされてきた。我々は最近、この腎臓での有機アニ
オン輸送において最も重要な役割を果たしている有機ア
ニオントランスポーターＯＡＴ１の単離に成功し（Ｓｅ
ｋｉｎｅ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２
巻、１８５２６−９頁、１９９７）、既に特許出願済み
である。ＯＡＴ１は基質選択性の極めて広い、即ち化学
構造の異なる多くの有機アニオンを輸送することの出来
るトランスポーターである。また多くの薬物が有機アニ
オンに属することからＯＡＴ１は薬物トランスポーター
としても認識されている。ＯＡＴ１の発現は腎臓に限ら
れており、肝臓には全くその発現が認められない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、肝臓
における有機アニオン輸送に関与する新規な有機アニオ
ンントランスポーター遺伝子およびその遺伝子がコード
するポリペプチドである有機アニオントランスポーター
を同定し、提供することにある。その他の目的について
は以下の記載より明白である。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、腎臓の有
機アニオントランスポーターＯＡＴ１との構造上の類似
性から、肝細胞に発現している肝特異的有機アニオント
ランスポーター（ＯＡＴ２）を同定した。

【００１０】本発明の有機アニオントランスポーターＯ
ＡＴ２は、ジカルボン酸、プロスタグランジン、非ステ
ロイド系抗炎症薬や抗腫瘍薬等の異なる化学構造を持っ
た薬物や内因性物質に対してこれらを輸送する（取り込
む能力を有する）、非常に広い範囲の基質選択性を有す
るものである。

【００１１】本発明のタンパク質としては、配列番号１
で示されたアミノ酸配列を有するもののほか、例えば、
配列番号１で示されたアミノ酸配列において１もしくは
数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ
酸配列を有するものが挙げられる。アミノ酸の欠失、置
換もしくは付加は、有機アニオン輸送活性が失われない
程度であればよく、通常１〜約１１０個、好ましくは１
〜約５５個である。このようなタンパク質は、配列番号
１で示されたアミノ酸配列と通常、１〜８０％、好まし
くは１〜９０％のアミノ酸配列のホモロジーを有する。

【００１２】本発明において、ストリンジェントな条件
下でのハイブリダイゼーションは、通常、ハイブリダイ
ゼーションを、５×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度のハ
イブリダイゼーション溶液中、３７〜４２℃の温度条件
下、約１２時間行い、５×ＳＳＣまたはこれと同等の塩
濃度の溶液等で予備洗浄を行った後に、１×ＳＳＣ又は
これと同等の塩濃度で洗浄を行うことにより実施でき
る。また、より高いストリンジェンシーを得るために
は、洗浄を０．１×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶
液中で洗浄を行うことにより実施できる。

【００１３】本発明の有機アニオントランスポーター遺
伝子は、適当な哺乳動物の肝臓の組織や細胞を遺伝子源
として用いてスクリーニングを行うことにより単離取得
できる。哺乳動物としては、イヌ、ウシ、ウマ、ヤギ、
ヒツジ、サル、ブタ、ウサギ、ラット、マウスなどの非
ヒト動物のほか、ヒトが挙げられる。

【００１４】遺伝子のスクリーニングおよび単離は、ホ
モロジースクリーニングおよびＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒ
ａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）スクリーニン
グなどにより好適に実施できる。

【００１５】得られたｃＤＮＡについては、常法により
塩基配列を決定し、翻訳領域を解析して、これにコード
されるタンパク質、即ちＯＡＴ２のアミノ酸配列を決定
することができる。

【００１６】得られたｃＤＮＡが、有機アニオントラン
スポーター遺伝子のｃＤＮＡであること、即ちはｃＤＮ
Ａにコードされた遺伝子産物が有機アニオントランスポ
ーターであることは、例えば次のようにして検証するこ
とができる。即ち、得られたＯＡＴ２遺伝子から調製し
たｃＲＮＡを卵母細胞に導入して発現させ、有機アニオ
ンを細胞内に輸送する（取り込む）能力を、適当な有機
アニオンを基質とする通常の取り込み実験（Ｓｅｋｉｎ
ｅ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２巻、１
８５２６−９頁、１９９７）により、細胞内への基質取
り込みを測定することにより確認できる。

【００１７】また、ＯＡＴ２発現細胞について、同様の
取り込み実験を応用して、ＯＡＴ２の輸送特性や基質特
異性などを調べることができる。

【００１８】得られたＯＡＴ１遺伝子のｃＤＮＡを用い
て、異なる遺伝子源で作製された適当なｃＤＮＡライブ
ラリー又はゲノミックＤＮＡライブラリーをスクリーニ
ングすることにより、異なる組織、異なる生物由来の相
同遺伝子や染色体遺伝子等を単離することができる。

【００１９】また、開示された本発明の遺伝子の塩基配
列（配列番号２）に示された塩基配列、もしくはその一
部の情報に基づいて設計された合成プライマーを用い、
通常のＰＣＲ法によりｃＤＮＡライブラリーから遺伝子
を単離することが出来る。

【００２０】ｃＤＮＡライブラリー及びゲノミックＤＮ
Ａライブラリー等のＤＮＡライブラリーは例えば、「Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔ
ｉｓ，Ｔ．著、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓより、１９８９年
に発刊」に記載の方法により調製することができる。あ
るいは、市販のライブラリーがある場合にはこれを用い
てもよい。

【００２１】本発明の有機アニオントランスポーター
（ＯＡＴ２）は、例えば、有機アニオントランスポータ
ーをコードするｃＤＮＡを用い、遺伝子組み換え技術に
より生産することができる。例えば、有機アニオントラ
ンスポーターをコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡ等）を適当
な発現ベクターに組み込み、得られた組み換えＤＮＡを
適当な宿主細胞に導入することができる。ポリペプチド
を生産するための発現系としては、例えば、細菌、酵
母、昆虫細胞および哺乳動物細胞の発現系等が挙げられ
る。このうち、機能タンパクを得るためには、昆虫細胞
および哺乳動物細胞を用いることが望ましい。

【００２２】例えば、ポリペプチドを哺乳動物で発現さ
せる場合には、有機アニオントランスポーターをコード
するＤＮＡを、適当な発現ベクター（例えば、レトロウ
イルス系ベクター、パピローマウイルスベクター、ワク
シニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等）中の
適当なプロモーター（例えばＳＶ４０プロモーター、Ｌ
ＴＲプロモーター、エロンゲーション１αプロモーター
等）の下流に挿入して発現ベクターを構築する。次に、
得られた発現ベクターで適当な動物細胞を形質転換し
て、形質転換体を適当な培地で培養することによって、
目的とするポリペプチドが生産される。宿主とする哺乳
動物細胞としては、サルＣＯＳ−７細胞、チャイニーズ
ハムスターＣＨＯ細胞、ヒトＨｅｌａ細胞または、腎臓
組織由来の初代培養細胞やブタ腎由来ＬＬＣ−ＰＫ１細
胞、フクロネズミ腎由来ＯＫ細胞等の細胞株が挙げられ
る。

【００２３】有機アニオントランスポーターＯＡＴ２を
コードするｃＤＮＡとしては、例えば、配列番号２に示
される塩基配列を有するｃＤＮＡを用いることが出来る
ほか、前記のｃＤＮＡに限定されることなく、アミノ酸
配列に対応するＤＮＡを設計し、ポリペプチドをコード
するＤＮＡをもちいることもできる。この場合、一つの
アミノ酸をコードするコドンは各々１〜６種類知られて
おり、用いるコドンの選択は任意でよいが、例えば発現
に利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現
の高い配列を設計することができる。設計した塩基配列
をもつＤＮＡはＤＮＡの化学合成、前記ｃＤＮＡの断片
化と結合、塩基配列の一部改変等によって取得できる。
人為的な塩基配列の一部改変、変異導入は、所望の改変
をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマ
ーを利用して部位変異導入法（ｓｉｔｅ ｓｐｅｃｉｆ
ｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）「Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．
ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ
第１８巻、５６６２−５６６６頁、１９８４年」等によ
り実施できる。

【００２４】本発明の有機アニオントランスポーター遺
伝子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする
ヌクレオチド（オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレ
オチド）は、有機アニオントランスポーター遺伝子を検
出するためのプローブとして使用できるほか、有機アニ
オントランスポーターの発現を変調させるために、例え
ばアンチセンスオリゴヌクレオチドやリボザイム、デコ
イとして使用することもできる。このようなヌクレオチ
ドとしては、例えば、配列番号２で示される塩基配列の
中の通常、連続する１４塩基以上の部分配列もしくはそ
の相補的な配列を含むヌクレオチドを用いることがで
き、ハイブリダイズをより特異的とするためには、部分
配列としてより長い配列、例えば２０塩基以上あるいは
３０塩基以上の配列を用いても良い。

【００２５】また、本発明の有機アニオントランスポー
ターまたは、これと免疫学的同等性を有するポリペプチ
ドを用いて、その抗体を取得することが出来、抗体は、
有機アニオントランスポーター検出や精製などに利用で
きる。抗体は、本発明の有機アニオントランスポータ
ー、その断片、またはその部分配列を有する合成ペプチ
ド等を抗原として用いて製造できる。ポリクロナール抗
体は、宿主動物（たとえば、ラットやウサギ）に抗原を
接種し、免疫血清を回収する通常の方法により製造する
ことができ、モノクロナール抗体は、通常ハイブリドー
マ法などの技術により製造できる。

【００２６】以下、実施例をもって本説明をさらに詳し
く説明するが、これらの実施例は本発明を制限するもの
ではない。

【００２７】なお下記実施例において、各操作は特に断
りがない限り、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．
およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ ＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓより、１９８９年に発
刊」に記載の方法により行うか、または、市販のキット
を用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。

【００２８】

【実施例】実施例１ ラット肝特異的有機アニオントラ
ンスポーター（ＮＬＴ：ｎｏｖｅｌｌｉｂｅｒ ｔｒａ
ｎｓｐｏｒｔｅｒ）ｃＤＮＡの単離とその解析 （１）腎特異的有機アニオントランスポーターＯＡＴ１
の塩基配列情報を基にした、関連遺伝子の検索

【００２９】既に我々が単離したＯＡＴ１（Ｓｅｋｉｎ
ｅ，Ｔ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２巻、１８
５２６−９頁、１９９７年）の塩基配列情報をもとにＤ
ＮＡデータベースを検索したところ、機能未知として報
告されていた膜タンパクＮＬＴ（Ｓｉｍｏｎｓｏｎ，
Ｇ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．、１０７巻、１０
６５−１０７２頁、１９９４）がＯＡＴ１と弱い相同性
（アミノ酸レベルで４２％）を有することが判明した。
またＮＬＴは肝細胞の側底膜に限局して発現していると
考えられた。我々は、ＮＬＴが肝細胞側底膜に存在する
多選択性有機アニオントランスポーターであると仮定し
てその単離と機能解析を行った。

【００３０】ｃＤＮＡライブラリーは、ラット肝ポリ
（Ａ）⁺ＲＮＡから、ｃＤＮＡ合成キット（商品名：Ｓ
ｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｃｈｏｉｃｅ Ｓｙｓｔｅｍ，
ギブコ社製）を使用して作製し、ファージベクターλＺ
ｉｐＬｏｘ（ギブコ社製）の制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部
位に組み込んだ。ＰＣＲ法にて、既に報告されているＮ
ＬＴの １３１−６７３塩基に相当する部位を単離し、
³²Ｐ−ｄＣＴＰでラベルし、これをプローブとして用い
てラットのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし
た。ハイブリダイゼーションは、３７℃のハイブリダイ
ゼーション用溶液中で一昼夜行い、その後フィルター膜
は、３７℃で０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄し
た。ハイブリダイゼーション溶液としては、５０％ ホ
ルムアミド、５×ｓｔａｎｄａｒｄ ｓａｌｉｎｅ ｃ
ｉｔｒａｔｅ（ＳＳＣ）、３×デンハード液、０．２％
ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン、０．２ｍｇ／ｍｌ
変性サーモン精子ＤＮＡ、２．５ｍＭピロリン酸ナトリ
ウム、２５ｍＭ ＭＥＳ、０．０１％ Ａｎｔｉｆｏａ
ｍ Ｂ（シグマ社製）を含むｐＨ６．５の緩衝液を用い
た。λＺｉｐＬｏｘ中に単離されたクローンは、ｉｎ
ｖｉｔｒｏ ｅｘｃｉｓｉｏｎ法によりプラスミドベク
ターｐＺＬにサブクローン化した。

【００３１】上記により得られたクローン（Ｌ５）の塩
基配列の決定は、ＮＬＴに対する特異的オリゴヌクレオ
チドプライマーを合成し、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ｖｅ
ｒ．２．０（アマシャム社製）を用いておこなった。

【００３２】これにより、ＮＬＴと相同なクローン（Ｌ
５）遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列が得られた。 （２）ＮＬＴの機能の特定

【００３３】上記により得られたクローン（Ｌ５）を含
むプラスミドから、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用い
て、ｃＲＮＡ（ｃＤＮＡに相補的なＲＮＡ）を調製し
た。

【００３４】得られたｃＲＮＡを、既に報告されている
方法に従い（Ｓｅｋｉｎｅ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂ
ｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２巻、１８５２６−９頁、１９
９７年）、アフリカツメガエルの卵母細胞に注入し、こ
の卵母細胞についてグルタール酸およびサリチル酸を基
質として用いた取り込み実験をおこなった。実験には、
放射能ラベルした基質（¹⁴Ｃ−グルタル酸および¹⁴Ｃ−
サリチル酸）を用いた。その結果、Ｌ５を発現させた卵
母細胞は¹⁴Ｃ−グルタル酸および¹⁴Ｃ−サリチル酸の取
り込みを示すことが判明した。

【００３５】Ｌ５の輸送活性における細胞外Ｎａイオン
の影響を検討する実験を行った。サリチル酸の取り込み
実験は前記に記載の方法に準じて実施した。但し、ｉｎ
ｃｕｂａｔｉｏｎ溶液はＮＤ９６溶液および、塩化コリ
ン溶液（ＮＤ９６溶液の９６ｍＭの塩化ナトリウムを９
６ｍＭの塩化コリンで置換し、ｐＨを７．４に調製し
た）を用いておこなった。その結果、細胞外のナトリウ
ムをコリンと置換しても、サリチル酸取り込みに何ら影
響を与えなかった（図１Ａ）。このことから、ＮＬＴは
Ｎａイオン非依存的に働くトランスポーターであること
が示された。

【００３６】ＮＬＴ ｃＲＮＡを注入した卵母細胞によ
るサリチル酸の取り込み実験においてグルタル酸とのプ
レインキュベーションの影響を調べた。サリチル酸の取
り込み実験は、ＮＬＴ ｃＲＮＡもしくはＮＬＴ ｃＲ
ＮＡとラットＮａＤＣ−１（Ｎａ−ジカルボン酸トラン
スポーター）ｃＲＮＡを注入した卵母細胞を１ｍＭグル
タル酸添加もしくは無添加のＮＤ９６溶液で２時間培養
した後、¹⁴Ｃ−サリチル酸を添加して室温で１時間培養
し放射能ラベルされた基質の取り込みを調べた。その結
果１ｍＭグルタル酸添加した溶液で前処置しても¹⁴Ｃ−
サリチル酸の取り込みは変わらなかった（図１Ｂ）。こ
の結果はＮＬＴが交換輸送体ではなく、促進拡散型輸送
体であることを示唆するものである。

【００３７】ＮＬＴの有機アニオン輸送のミカエリスー
メンテンの動力学試験をおこなった。基質サリチル酸お
よびα−ケトグルタル酸の濃度の違いによるそれぞれの
取り込み率の変化を調べることにより、ＮＬＴのミカエ
リスーメンテンの動力学試験をおこなった。サリチル酸
およびα−ケトグルタル酸の取り込み実験は、ＮＬＴｃ
ＲＮＡを注入した卵母細胞を用い、前記記載方法に準じ
て実施した。この結果（図２）、サリチル酸およびα−
ケトグルタル酸のＫｍ値はそれぞれ ８８．８± ２
３．４ μＭおよび１７．８ ± ２．９μＭであっ
た。

【００３８】ＮＬＴの基質選択性を検討するために、各
種アニオン性物質を基質とする取り込み試験を行った。
取り込み実験は、ＮＬＴ ｃＲＮＡを注入した卵母細胞
を用い、ＮＤ９６溶液中で前記記載方法に準じて実施し
た。但し、基質としては、放射能でラベルした各種化合
物を用いた。その結果、α−ケトグルタレート（¹⁴Ｃ標
識）、メトトレキセート（³Ｈ標識）、プロスタグラン
ジンＥ₂（³Ｈ標識）、アセチルサリチル酸（¹⁴Ｃ標
識）、パラアミノ馬尿酸（¹⁴Ｃ標識）を基質とした場合
に、卵母細胞への取り込みが認められた（図３）。一
方、テトラエチルアンモニウム（¹⁴Ｃ標識）、タウロコ
ール酸（¹⁴Ｃ標識）およびコール酸（¹⁴Ｃ標識）では取
り込みを示さなかった。

【００３９】ＮＬＴの基質選択性をさらに検討するため
に、ＮＬＴ ｃＲＮＡを注入した卵母細胞によるサリチ
ル酸の取り込み実験において、系へ各種アニオン性物質
を添加し、その影響を調べた（阻害実験）。サリチル酸
の取り込み実験は、ＮＬＴｃＲＮＡを注入した卵母細胞
を用い、前記に記載の方法に準じて実施した。但し、Ｎ
Ｄ９６溶液を用い、１ｍＭの各種化合物（非標識）の存
在下および非存在下で、サリチル酸の取り込みを測定し
た。その結果、構造的に無関係のアニオン性物質の添加
で、ｃｉｓ−阻害効害効果が観察された（図４）。

【００４０】種々の組織におけるＮＬＴ遺伝子の発現
（ノーザンブロッティング）の解析を行った。ＮＬＴ
ｃＤＮＡの全長を³²Ｐ−ｄＣＴＰでラベルし、これをプ
ローブとして用いてラットの種々の組織から抽出したＲ
ＮＡに対してノーザンブロッティングを以下のように行
った。３μｇのポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡを１％アガロース
／ホルムアルデヒドゲルで電気泳動した後にニトロセル
ロースフィルターにトランスファーした。このフィルタ
ーを４２℃で、³²Ｐ−ｄＣＴＰでラベルしたＮＬＴ ｃ
ＤＮＡ全長を含んだハイブリダイゼーション液で一晩ハ
イブリダイセーションを行った。フィルターを６５℃に
て、０．１％ＳＤＳを含む０．１ｘＳＳＣで洗浄した。
ノーザンブロットの結果（図５）、肝臓において、２．
０Ｋｂ付近に強いバンドが検出され、また腎臓に弱い発
現が観察された。

【００４１】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：５３５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ） 配列 Met Gly Phe Glu Asp Leu Leu Asp Lys Val Gly Gly Phe Gly Pro 15 Phe Gln Leu Arg Asn Leu Val Leu Met Ala Leu Pro Arg Met Leu 30 Leu Pro Met His Phe Leu Leu Pro Val Phe Met Ala Ala Val Pro 45 Ala His His Cys Ala Leu Pro Gly Ala Pro Ala Asn Leu Ser His 60 Gln Asp Leu Trp Leu Glu Ala His Leu Pro Arg Glu Thr Asp Gly 75 Ser Phe Ser Ser Cys Leu Arg Phe Ala Tyr Pro Gln Thr Val Pro 90 Asn Val Thr Leu Gly Thr Glu Val Ser Asn Ser Gly Glu Pro Glu 105 Gly Glu Pro Leu Thr Val Pro Cys Ser Gln Gly Trp Glu Tyr Asp 120 Arg Ser Glu Phe Ser Ser Thr Ile Ala Thr Glu Trp Asp Leu Val 135 Cys Gln Gln Arg Gly Leu Asn Lys Ile Thr Ser Thr Cys Phe Phe 150 Ile Gly Val Leu Val Gly Ala Val Val Tyr Gly Tyr Leu Ser Asp 165 Arg Phe Gly Arg Arg Arg Leu Leu Leu Val Ala Tyr Val Ser Ser 180 Leu Val Leu Gly Leu Met Ser Ala Ala Ser Ile Asn Tyr Ile Met 195 Phe Val Val Thr Arg Thr Leu Thr Gly Ser Ala Leu Ala Gly Phe 210 Thr Ile Ile Val Leu Pro Leu Glu Leu Glu Trp Leu Asp Val Glu 225 His Arg Thr Val Ala Gly Val Ile Ser Thr Val Phe Trp Ser Gly 240 Gly Val Leu Leu Leu Ala Leu Val Gly Tyr Leu Ile Arg Ser Trp 255 Arg Trp Leu Leu Leu Ala Ala Thr Leu Pro Cys Val Pro Gly Ile 270 Ile Ser Ile Trp Trp Val Pro Glu Ser Ala Arg Trp Leu Leu Thr 285 Gln Gly Arg Val Glu Glu Ala Lys Lys Tyr Leu Leu Ser Cys Ala 300 Lys Leu Asn Gly Arg Pro Val Gly Glu Gly Ser Leu Ser Gln Glu 315 Ala Leu Asn Asn Val Val Thr Met Glu Arg Ala Leu Gln Arg Pro 330 Ser Tyr Leu Asp Leu Phe Arg Thr Ser Gln Leu Arg His Ile Ser 345 Leu Cys Cys Met Met Val Trp Phe Gly Val Asn Phe Ser Tyr Tyr 360 Gly Leu Thr Leu Asp Val Ser Gly Leu Gly Leu Asn Val Tyr Gln 375 Thr Gln Leu Leu Phe Gly Ala Val Glu Leu Pro Ser Lys Ile Met 390 Val Tyr Phe Leu Val Arg Arg Leu Gly Arg Arg Leu Thr Glu Ala 405 Gly Met Leu Leu Gly Ala Ala Leu Thr Phe Gly Thr Ser Leu Leu 420 Val Ser Leu Glu Thr Lys Ser Trp Ile Thr Ala Leu Val Val Val 435 Gly Lys Ala Phe Ser Glu Ala Ala Phe Thr Thr Ala Tyr Leu Phe 450 Thr Ser Glu Leu Tyr Pro Thr Val Leu Arg Gln Thr Gly Leu Gly 465 Leu Thr Ala Leu Met Gly Arg Leu Gly Ala Ser Leu Ala Pro Leu 480 Ala Ala Leu Leu Asp Gly Val Trp Leu Leu Leu Pro Lys Val Ala 495 Tyr Gly Gly Ile Ala Leu Val Ala Ala Cys Thr Ala Leu Leu Leu 510 Pro Glu Thr Lys Lys Ala Gln Leu Pro Glu Thr Ile Gln Asp Val 525 Glu Arg Lys Ser Thr Gln Glu Glu Asp Val *** 535 配列番号：２ 配列の長さ：１９０１ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態（both） トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列 10 20 30 40 50 60 AGACTGAACC GTCCTAGATA CCAAAGAGGG ACACCTTGTG GGTGGGTAGC ATGGGCTTCG 70 80 90 100 110 120 AAGACCTGCT GGACAAGGTG GGCGGCTTTG GGCCCTTCCA ACTTCGGAAT CTGGTTCTGA 130 140 150 160 170 180 TGGCCCTGCC CCGAATGCTG CTCCCCATGC ACTTTCTCCT GCCCGTCTTC ATGGCCGCTG 190 200 210 220 230 240 TGCCTGCCCA CCATTGTGCC CTGCCCGGTG CCCCTGCCAA CCTCAGTCAC CAGGACTTAT 250 260 270 280 290 300 GGCTGGAAGC CCATCTACCC CGGGAGACTG ACGGCAGCTT TAGCTCCTGC CTCCGATTTG 310 320 330 340 350 360 CCTATCCCCA GACTGTCCCC AATGTCACTT TGGGGACAGA GGTGTCCAAC TCTGGGGAGC 370 380 390 400 410 420 CTGAGGGTGA GCCCCTCACG GTGCCCTGCT CTCAGGGCTG GGAGTACGAC CGCTCAGAAT 430 440 450 460 470 480 TCTCCTCCAC CATTGCAACT GAGTGGGATC TTGTGTGTCA GCAGAGAGGA CTGAACAAAA 490 500 510 520 530 540 TTACGTCCAC CTGCTTCTTC ATTGGTGTGC TGGTGGGAGC CGTGGTGTAT GGATACTTGT 550 560 570 580 590 600 CTGACAGGTT TGGCAGGCGC CGGCTTCTGC TGGTGGCCTA CGTGAGCTCC CTGGTGCTGG 610 620 630 640 650 660 GTCTGATGTC TGCAGCCTCC ATCAACTACA TCATGTTCGT AGTCACCCGT ACACTCACCG 670 680 690 700 710 720 GCTCAGCCCT GGCTGGCTTC ACCATCATTG TGCTCCCACT GGAGTTGGAG TGGCTGGATG 730 740 750 760 770 780 TGGAGCACCG CACTGTGGCC GGGGTCATCA GCACCGTCTT CTGGTCGGGA GGCGTGCTGC 790 800 810 820 830 840 TGCTGGCACT GGTGGGCTAC CTGATCCGGA GCTGGCGCTG GCTTCTGCTG GCTGCCACCC 850 860 870 880 890 900 TGCCGTGTGT CCCAGGCATC ATCAGCATCT GGTGGGTTCC TGAGTCTGCA CGGTGGCTTC 910 920 930 940 950 960 TAACCCAGGG TCGTGTGGAG GAGGCAAAAA AATACTTGCT GAGCTGTGCC AAGCTCAATG 970 980 990 1000 1010 1020 GGCGGCCCGT GGGTGAGGGC AGCCTGAGCC AGGAGGCCCT GAACAACGTG GTCACCATGG 1030 1040 1050 1060 1070 1080 AAAGGGCGTT GCAAAGACCC TCATACTTAG ACCTGTTCCG AACATCTCAG CTCCGACATA 1090 1100 1110 1120 1130 1140 TCTCACTGTG CTGCATGATG GTGTGGTTTG GAGTGAACTT TTCCTACTAC GGCCTGACTC 1150 1160 1170 1180 1190 1200 TGGACGTGTC TGGGCTGGGG CTGAACGTGT ACCAGACACA GCTGCTGTTT GGGGCTGTGG 1210 1220 1230 1240 1250 1260 AGCTCCCCTC CAAAATTATG GTCTACTTCC TTGTGCGCCG TCTGGGACGC CGTCTCACGG 1270 1280 1290 1300 1310 1320 AGGCTGGGAT GCTGCTGGGC GCTGCTCTGA CCTTTGGCAC CAGCCTGCTG GTATCCTTGG 1330 1340 1350 1360 1370 1380 AGACTAAGTC ATGGATCACT GCTCTGGTGG TGGTGGGGAA AGCTTTTTCT GAAGCTGCTT 1390 1400 1410 1420 1430 1440 TTACTACGGC CTACCTGTTC ACGTCCGAGT TGTACCCTAC TGTGCTCAGA CAGACAGGAT 1450 1460 1470 1480 1490 1500 TGGGACTTAC TGCACTCATG GGCAGGCTAG GGGCCTCTCT GGCCCCACTG GCGGCCTTGC 1510 1520 1530 1540 1550 1560 TGGATGGAGT GTGGCTGTTG CTGCCCAAAG TTGCTTACGG GGGGATTGCC CTGGTGGCTG 1570 1580 1590 1600 1610 1620 CCTGCACTGC ACTCCTGCTG CCTGAGACGA AGAAGGCACA GCTGCCAGAG ACCATCCAGG 1630 1640 1650 1660 1670 1680 ATGTGGAGAG GAAGAGTACC CAGGAGGAAG ATGTGTAGGT CCGGGACTGA GTTGGACTAG 1690 1700 1710 1720 1730 1740 CGACAGTTCT CCACAGGAGC TGGGCACAGA AGGCAGCCTC TTGTGACTGG GACATCAGAC 1750 1760 1770 1780 1790 1800 TCCTCCACCT AAGGATGGAG CTGCTCCTGA TGCCCTCTGC CTGTGCTCTC CAGCAGCAGA 1810 1820 1830 1840 1850 1860 ACAACTTCCC GCAGCACTGG GCCGCTGGGA TTCTGGACTC CCCTCTCATG GCCGGGGGCT 1870 1880 1890 1900 1910 1920 TCTATAAATA AAGACGGTTG CTCATGGGAA AAAAAAAAAA A......... .......... 配列番号：３ 配列の長さ：１９０１ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態（both） トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列 10 20 30 40 50 AGACTGAACC GTCCTAGATA CCAAAGAGGG ACACCTTGTG GGTGGGTAGC 59 68 77 86 95 ATG GGC TTC GAA GAC CTG CTG GAC AAG GTG GGC GGC TTT GGG CCC Met Gly Phe Glu Asp Leu Leu Asp Lys Val Gly Gly Phe Gly Pro 104 113 122 131 140 TTC CAA CTT CGG AAT CTG GTT CTG ATG GCC CTG CCC CGA ATG CTG Phe Gln Leu Arg Asn Leu Val Leu Met Ala Leu Pro Arg Met Leu 149 158 167 176 185 CTC CCC ATG CAC TTT CTC CTG CCC GTC TTC ATG GCC GCT GTG CCT Leu Pro Met His Phe Leu Leu Pro Val Phe Met Ala Ala Val Pro 194 203 212 221 230 GCC CAC CAT TGT GCC CTG CCC GGT GCC CCT GCC AAC CTC AGT CAC Ala His His Cys Ala Leu Pro Gly Ala Pro Ala Asn Leu Ser His 239 248 257 266 275 CAG GAC TTA TGG CTG GAA GCC CAT CTA CCC CGG GAG ACT GAC GGC Gln Asp Leu Trp Leu Glu Ala His Leu Pro Arg Glu Thr Asp Gly 284 293 302 311 320 AGC TTT AGC TCC TGC CTC CGA TTT GCC TAT CCC CAG ACT GTC CCC Ser Phe Ser Ser Cys Leu Arg Phe Ala Tyr Pro Gln Thr Val Pro 329 338 347 356 365 AAT GTC ACT TTG GGG ACA GAG GTG TCC AAC TCT GGG GAG CCT GAG Asn Val Thr Leu Gly Thr Glu Val Ser Asn Ser Gly Glu Pro Glu 374 383 392 401 410 GGT GAG CCC CTC ACG GTG CCC TGC TCT CAG GGC TGG GAG TAC GAC Gly Glu Pro Leu Thr Val Pro Cys Ser Gln Gly Trp Glu Tyr Asp 419 428 437 446 455 CGC TCA GAA TTC TCC TCC ACC ATT GCA ACT GAG TGG GAT CTT GTG Arg Ser Glu Phe Ser Ser Thr Ile Ala Thr Glu Trp Asp Leu Val 464 473 482 491 500 TGT CAG CAG AGA GGA CTG AAC AAA ATT ACG TCC ACC TGC TTC TTC Cys Gln Gln Arg Gly Leu Asn Lys Ile Thr Ser Thr Cys Phe Phe 509 518 527 536 545 ATT GGT GTG CTG GTG GGA GCC GTG GTG TAT GGA TAC TTG TCT GAC Ile Gly Val Leu Val Gly Ala Val Val Tyr Gly Tyr Leu Ser Asp 554 563 572 581 590 AGG TTT GGC AGG CGC CGG CTT CTG CTG GTG GCC TAC GTG AGC TCC Arg Phe Gly Arg Arg Arg Leu Leu Leu Val Ala Tyr Val Ser Ser 599 608 617 626 635 CTG GTG CTG GGT CTG ATG TCT GCA GCC TCC ATC AAC TAC ATC ATG Leu Val Leu Gly Leu Met Ser Ala Ala Ser Ile Asn Tyr Ile Met 644 653 662 671 680 TTC GTA GTC ACC CGT ACA CTC ACC GGC TCA GCC CTG GCT GGC TTC Phe Val Val Thr Arg Thr Leu Thr Gly Ser Ala Leu Ala Gly Phe 689 698 707 716 725 ACC ATC ATT GTG CTC CCA CTG GAG TTG GAG TGG CTG GAT GTG GAG Thr Ile Ile Val Leu Pro Leu Glu Leu Glu Trp Leu Asp Val Glu 734 743 752 761 770 CAC CGC ACT GTG GCC GGG GTC ATC AGC ACC GTC TTC TGG TCG GGA His Arg Thr Val Ala Gly Val Ile Ser Thr Val Phe Trp Ser Gly 779 788 797 806 815 GGC GTG CTG CTG CTG GCA CTG GTG GGC TAC CTG ATC CGG AGC TGG Gly Val Leu Leu Leu Ala Leu Val Gly Tyr Leu Ile Arg Ser Trp 824 833 842 851 860 CGC TGG CTT CTG CTG GCT GCC ACC CTG CCG TGT GTC CCA GGC ATC Arg Trp Leu Leu Leu Ala Ala Thr Leu Pro Cys Val Pro Gly Ile 869 878 887 896 905 ATC AGC ATC TGG TGG GTT CCT GAG TCT GCA CGG TGG CTT CTA ACC Ile Ser Ile Trp Trp Val Pro Glu Ser Ala Arg Trp Leu Leu Thr 914 923 932 941 950 CAG GGT CGT GTG GAG GAG GCA AAA AAA TAC TTG CTG AGC TGT GCC Gln Gly Arg Val Glu Glu Ala Lys Lys Tyr Leu Leu Ser Cys Ala 959 968 977 986 995 AAG CTC AAT GGG CGG CCC GTG GGT GAG GGC AGC CTG AGC CAG GAG Lys Leu Asn Gly Arg Pro Val Gly Glu Gly Ser Leu Ser Gln Glu 1004 1013 1022 1031 1040 GCC CTG AAC AAC GTG GTC ACC ATG GAA AGG GCG TTG CAA AGA CCC Ala Leu Asn Asn Val Val Thr Met Glu Arg Ala Leu Gln Arg Pro 1049 1058 1067 1076 1085 TCA TAC TTA GAC CTG TTC CGA ACA TCT CAG CTC CGA CAT ATC TCA Ser Tyr Leu Asp Leu Phe Arg Thr Ser Gln Leu Arg His Ile Ser 1094 1103 1112 1121 1130 CTG TGC TGC ATG ATG GTG TGG TTT GGA GTG AAC TTT TCC TAC TAC Leu Cys Cys Met Met Val Trp Phe Gly Val Asn Phe Ser Tyr Tyr 1139 1148 1157 1166 1175 GGC CTG ACT CTG GAC GTG TCT GGG CTG GGG CTG AAC GTG TAC CAG Gly Leu Thr Leu Asp Val Ser Gly Leu Gly Leu Asn Val Tyr Gln 1184 1193 1202 1211 1220 ACA CAG CTG CTG TTT GGG GCT GTG GAG CTC CCC TCC AAA ATT ATG Thr Gln Leu Leu Phe Gly Ala Val Glu Leu Pro Ser Lys Ile Met 1229 1238 1247 1256 1265 GTC TAC TTC CTT GTG CGC CGT CTG GGA CGC CGT CTC ACG GAG GCT Val Tyr Phe Leu Val Arg Arg Leu Gly Arg Arg Leu Thr Glu Ala 1274 1283 1292 1301 1310 GGG ATG CTG CTG GGC GCT GCT CTG ACC TTT GGC ACC AGC CTG CTG Gly Met Leu Leu Gly Ala Ala Leu Thr Phe Gly Thr Ser Leu Leu 1319 1328 1337 1346 1355 GTA TCC TTG GAG ACT AAG TCA TGG ATC ACT GCT CTG GTG GTG GTG Val Ser Leu Glu Thr Lys Ser Trp Ile Thr Ala Leu Val Val Val 1364 1373 1382 1391 1400 GGG AAA GCT TTT TCT GAA GCT GCT TTT ACT ACG GCC TAC CTG TTC Gly Lys Ala Phe Ser Glu Ala Ala Phe Thr Thr Ala Tyr Leu Phe 1409 1418 1427 1436 1445 ACG TCC GAG TTG TAC CCT ACT GTG CTC AGA CAG ACA GGA TTG GGA Thr Ser Glu Leu Tyr Pro Thr Val Leu Arg Gln Thr Gly Leu Gly 1454 1463 1472 1481 1490 CTT ACT GCA CTC ATG GGC AGG CTA GGG GCC TCT CTG GCC CCA CTG Leu Thr Ala Leu Met Gly Arg Leu Gly Ala Ser Leu Ala Pro Leu 1499 1508 1517 1526 1535 GCG GCC TTG CTG GAT GGA GTG TGG CTG TTG CTG CCC AAA GTT GCT Ala Ala Leu Leu Asp Gly Val Trp Leu Leu Leu Pro Lys Val Ala 1544 1553 1562 1571 1580 TAC GGG GGG ATT GCC CTG GTG GCT GCC TGC ACT GCA CTC CTG CTG Tyr Gly Gly Ile Ala Leu Val Ala Ala Cys Thr Ala Leu Leu Leu 1589 1598 1607 1616 1625 CCT GAG ACG AAG AAG GCA CAG CTG CCA GAG ACC ATC CAG GAT GTG Pro Glu Thr Lys Lys Ala Gln Leu Pro Glu Thr Ile Gln Asp Val 1634 1643 1652 1661 1670 GAG AGG AAG AGT ACC CAG GAG GAA GAT GTG TAG GTC CGG GAC TGA Glu Arg Lys Ser Thr Gln Glu Glu Asp Val *** 1680 1690 1700 1710 1720 1730 GTTGGACTAG CGACAGTTCT CCACAGGAGC TGGGCACAGA AGGCAGCCTC TTGTGACTGG 1740 1750 1760 1770 1780 1790 GACATCAGAC TCCTCCACCT AAGGATGGAG CTGCTCCTGA TGCCCTCTGC CTGTGCTCTC 1800 1810 1820 1830 1840 1850 CAGCAGCAGA ACAACTTCCC GCAGCACTGG GCCGCTGGGA TTCTGGACTC CCCTCTCATG 1860 1870 1880 1890 1900 1910 GCCGGGGGCT TCTATAAATA AAGACGGTTG CTCATGGGAA AAAAAAAAAA A......... 1920 ..........

【発明の効果】 【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、卵母細胞におけるサリチル酸の取り込
みを示したものである。図１のＢはグルタル酸とのプレ
インキュベーションの影響（図１Ｂの「＋」）をみたも
のである。図１中の「Ｌ５」はＬ５を発現させせた卵母
細胞を用いた系である。

【図２】図２は、本発明の有機アニオントランスポータ
ーにおける基質α−ケトグルタル酸（図２Ａ）とサリチ
ル酸（図２Ｂ）の動力学試験の結果を示すものである。

【図３】図３は、本発明の有機アニオントランスポータ
ーの各種薬剤および内因性有機アニオンの取り込みを示
すものである。図３中の「³Ｈ−ＰＧＥ₂」は³Ｈ標識化
プロスタグランジンＥ₂を示し、「¹⁴Ｃ−ＰＡＨ」は¹⁴
Ｃ標識化パラアミノ馬尿酸を示す。

【図４】図４は、各種のアニオン物質の存在下におけ
る、本発明の有機アニオントランスポーターのサリチル
酸の取り込みの影響を調べたものである。

【図５】図５は、本発明の遺伝子のノーザンブロッティ
ング解析の結果を示すものである。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ // Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 肝特異的有機アニオントランスポーター
   ＯＡＴ２。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号１に示されるアミノ酸
   配列、又は、その一部のアミノ酸配列が欠失し、他のア
   ミノ酸で置換若しくは付加されていてもよいアミノ酸配
   列を有する請求項１に記載の肝特異的有機アニオントラ
   ンスポータＯＡＴ２。
3. 【請求項３】 配列表の配列番号１に示されるアミノ酸
   配列、又は、その一部のアミノ酸配列が欠失し、他のア
   ミノ酸で置換若しくは付加されていてもよいアミノ酸配
   列をコードする核酸。
4. 【請求項４】 配列表の配列番号２で示される塩基配列
   を有するＤＮＡである請求項３に記載の核酸。
5. 【請求項５】 配列表の配列番号２で示される塩基配列
   を有するＤＮＡの連続する少なくとも１４塩基又はその
   相補鎖からなる核酸。
6. 【請求項６】 塩基の数が２０以上である請求項５に記
   載の核酸。
7. 【請求項７】 請求項１又は２に記載の肝特異的有機ア
   ニオントランスポーターを認識し得る抗体。