JPH11346799A - エンテロウイルスの系統解析による血清型の迅速同定法 - Google Patents
エンテロウイルスの系統解析による血清型の迅速同定法Info
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- JPH11346799A JPH11346799A JP15638798A JP15638798A JPH11346799A JP H11346799 A JPH11346799 A JP H11346799A JP 15638798 A JP15638798 A JP 15638798A JP 15638798 A JP15638798 A JP 15638798A JP H11346799 A JPH11346799 A JP H11346799A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 エンテロウイルスの迅速かつ簡易な血清型同
定法を提供する。 【解決手段】 エンテロウイルスのＶＰ４領域の塩基配
列に基づいて分子系統解析を行い、エンテロウイルスの
血清型を同定する。特に、試料からＲＮＡを調製し、調
製されたＲＮＡからｃＤＮＡを得、得られたｃＤＮＡか
らＰＣＲによってＶＰ４領域の塩基配列を含む塩基配列
を増幅し、増幅された産物を用いて塩基配列解析を行う
ことにより、前記ＶＰ４領域の塩基配列を得ることによ
って、試料中のエンテロウイルスの血清型を迅速かつ簡
易に同定することができる。
定法を提供する。 【解決手段】 エンテロウイルスのＶＰ４領域の塩基配
列に基づいて分子系統解析を行い、エンテロウイルスの
血清型を同定する。特に、試料からＲＮＡを調製し、調
製されたＲＮＡからｃＤＮＡを得、得られたｃＤＮＡか
らＰＣＲによってＶＰ４領域の塩基配列を含む塩基配列
を増幅し、増幅された産物を用いて塩基配列解析を行う
ことにより、前記ＶＰ４領域の塩基配列を得ることによ
って、試料中のエンテロウイルスの血清型を迅速かつ簡
易に同定することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、エンテロウイルス
の血清型同定法に関する。
の血清型同定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】エンテロウイルスは、"intestine"を意
味するギリシャ語である"enteron"にその命名が由来す
るように、主として腸管系細胞に感染し、小児麻痺、無
菌性髄膜炎、ヘルパンギーナ、上気道炎、手足口病、下
痢症、発疹症、心筋炎、肺炎や気管支炎など多彩な臨床
症状を引き起こす原因ウイルスである。エンテロウイル
スは酸に耐性であるため容易に胃を通過してその増殖の
場である腸管部(lower intestinal tract)に到達するこ
とができる。また、肝炎の病因であったり(CAV4, CAV
9)、EV70やCAV24変異株のように急性出血性結膜炎の世
界的大流行を引き起こしたりすることもある。一つのウ
イルス属がこれほどの多くの異なった臨床症状を引き起
こす例は他にない。従って、このウイルスは、ウイルス
検査機関で分離されることが最も多いウイルスの一つ
で、国内での分離報告は毎年およそ4000〜6000件にのぼ
る。
味するギリシャ語である"enteron"にその命名が由来す
るように、主として腸管系細胞に感染し、小児麻痺、無
菌性髄膜炎、ヘルパンギーナ、上気道炎、手足口病、下
痢症、発疹症、心筋炎、肺炎や気管支炎など多彩な臨床
症状を引き起こす原因ウイルスである。エンテロウイル
スは酸に耐性であるため容易に胃を通過してその増殖の
場である腸管部(lower intestinal tract)に到達するこ
とができる。また、肝炎の病因であったり(CAV4, CAV
9)、EV70やCAV24変異株のように急性出血性結膜炎の世
界的大流行を引き起こしたりすることもある。一つのウ
イルス属がこれほどの多くの異なった臨床症状を引き起
こす例は他にない。従って、このウイルスは、ウイルス
検査機関で分離されることが最も多いウイルスの一つ
で、国内での分離報告は毎年およそ4000〜6000件にのぼ
る。
【０００３】エンテロウイルスは、ピコルナウイルス科
(family Picornaviridae)エンテロウイルス属(genus En
terovirus)に含まれるプラス一本鎖ＲＮＡをゲノムに持
つ小形球形ウイルスである。ヒトでは、ポリオウイルス
１〜３型、コクサッキーウイルスA1〜A22およびA24、コ
クサッキーウイルスB1〜B6、エコーウイルス1〜9、11〜
27および29〜34、エンテロウイルス68〜71の６８種の血
清型に分類されている。コクサッキーウイルスA23はエ
コーウイルス9、エコーウイルス10はレオウイルスタイ
プ１、エコーウイルス28はヒトライノウイルス1Aである
ことが後に判明し、これらは現在欠番になっている。臨
床症状からこれらのウイルスの血清型を推定することは
困難で、分離ウイルスの同定は型特異的免疫血清を用い
た中和試験によって行われている。
(family Picornaviridae)エンテロウイルス属(genus En
terovirus)に含まれるプラス一本鎖ＲＮＡをゲノムに持
つ小形球形ウイルスである。ヒトでは、ポリオウイルス
１〜３型、コクサッキーウイルスA1〜A22およびA24、コ
クサッキーウイルスB1〜B6、エコーウイルス1〜9、11〜
27および29〜34、エンテロウイルス68〜71の６８種の血
清型に分類されている。コクサッキーウイルスA23はエ
コーウイルス9、エコーウイルス10はレオウイルスタイ
プ１、エコーウイルス28はヒトライノウイルス1Aである
ことが後に判明し、これらは現在欠番になっている。臨
床症状からこれらのウイルスの血清型を推定することは
困難で、分離ウイルスの同定は型特異的免疫血清を用い
た中和試験によって行われている。
【０００４】エンテロウイルスは他の多くのＲＮＡウイ
ルス同様、ウイルスの遺伝子自体がコードするＲＮＡ依
存性ＲＮＡポリメラーゼによって複製される。しかしな
がら、この酵素は校正(proofreading)機能を持たないた
めＲＮＡ合成の過程で生じた塩基変異は子孫ウイルスの
遺伝子内に蓄積される。従って、アミノ酸変異を伴った
塩基変異がウイルス構造蛋白質領域に生じた場合、いわ
ゆる難中和性ウイルスが生じる可能性がある。これは、
表現型(phenotype)を指標にした中和試験に常に付きま
とう固有の問題点である。
ルス同様、ウイルスの遺伝子自体がコードするＲＮＡ依
存性ＲＮＡポリメラーゼによって複製される。しかしな
がら、この酵素は校正(proofreading)機能を持たないた
めＲＮＡ合成の過程で生じた塩基変異は子孫ウイルスの
遺伝子内に蓄積される。従って、アミノ酸変異を伴った
塩基変異がウイルス構造蛋白質領域に生じた場合、いわ
ゆる難中和性ウイルスが生じる可能性がある。これは、
表現型(phenotype)を指標にした中和試験に常に付きま
とう固有の問題点である。
【０００５】一方、エンテロウイルスの分子生物学的見
地からの分類が試みられているが（P. Muir et al., 19
98, Clin. Microbiol. Rev., 11: 202-227; R.R. Rueck
ert,1996, Fields Virolgy, 3rd. ed., Lippincott-Rav
en Publishers, 609-654; T. Poyry et al., 1996, J.
Gen. Virol., 77: 1699-1717; T. Pulli et al., 1995,
Virology, 212: 30-38）、血清型を同定するには十分
なものとは言えず、特に、P. Muirらによれば、エンテ
ロウイルスの遺伝型の系統樹による分類は血清型を反映
しないとされている。
地からの分類が試みられているが（P. Muir et al., 19
98, Clin. Microbiol. Rev., 11: 202-227; R.R. Rueck
ert,1996, Fields Virolgy, 3rd. ed., Lippincott-Rav
en Publishers, 609-654; T. Poyry et al., 1996, J.
Gen. Virol., 77: 1699-1717; T. Pulli et al., 1995,
Virology, 212: 30-38）、血清型を同定するには十分
なものとは言えず、特に、P. Muirらによれば、エンテ
ロウイルスの遺伝型の系統樹による分類は血清型を反映
しないとされている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記の様な
問題点のないエンテロウイルスの迅速かつ簡易な血清型
同定法を提供することを目的とする。
問題点のないエンテロウイルスの迅速かつ簡易な血清型
同定法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、日本の流
行で分離が報告されているエンテロウイルスのＶＰ４全
領域の塩基配列を解析したところ、この塩基配列の分子
系統解析により血清型が同定できるという知見を得、こ
の知見に基づき、本発明を完成するに至った。
行で分離が報告されているエンテロウイルスのＶＰ４全
領域の塩基配列を解析したところ、この塩基配列の分子
系統解析により血清型が同定できるという知見を得、こ
の知見に基づき、本発明を完成するに至った。
【０００８】かくして、本発明は、エンテロウイルスの
ＶＰ４領域の塩基配列に基づいて分子系統解析を行い、
エンテロウイルスの血清型を同定することを特徴とする
エンテロウイルスの血清型同定法（以下、本発明同定法
ともいう）を提供する。
ＶＰ４領域の塩基配列に基づいて分子系統解析を行い、
エンテロウイルスの血清型を同定することを特徴とする
エンテロウイルスの血清型同定法（以下、本発明同定法
ともいう）を提供する。
【０００９】本発明同定法において、ＶＰ４領域の塩基
配列は、試料からＲＮＡを調製し、調製されたＲＮＡか
らｃＤＮＡを得、得られたｃＤＮＡからＰＣＲによって
ＶＰ４領域の塩基配列を含む塩基配列を増幅し、増幅さ
れた産物を用いて塩基配列解析を行うことにより得るこ
とができる。
配列は、試料からＲＮＡを調製し、調製されたＲＮＡか
らｃＤＮＡを得、得られたｃＤＮＡからＰＣＲによって
ＶＰ４領域の塩基配列を含む塩基配列を増幅し、増幅さ
れた産物を用いて塩基配列解析を行うことにより得るこ
とができる。
【００１０】ＰＣＲに使用されるプライマーとしては、
配列番号１に示す塩基配列を有するプライマーおよび配
列番号２に示す塩基配列を有するプライマーが挙げられ
る。
配列番号１に示す塩基配列を有するプライマーおよび配
列番号２に示す塩基配列を有するプライマーが挙げられ
る。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明同定法は、エンテロウイル
スの血清型を同定するために、エンテロウイルスのＶＰ
４領域の塩基配列に基づいて分子系統解析を行うことを
特徴とする。
スの血清型を同定するために、エンテロウイルスのＶＰ
４領域の塩基配列に基づいて分子系統解析を行うことを
特徴とする。
【００１２】本明細書において、ＶＰ４領域とは、エン
テロウイルスのキャプシドを形成するタンパク質の一つ
であるＶＰ４タンパク質（６９アミノ酸）をコードする
領域（２０７ｂｐ）を意味する。また、ＶＰ４領域の塩
基配列とは、ＶＰ４領域の全領域の塩基配列または血清
型を反映するのに十分な長さ（通常、２０ｂｐ以上）を
有するその一部を意味する。
テロウイルスのキャプシドを形成するタンパク質の一つ
であるＶＰ４タンパク質（６９アミノ酸）をコードする
領域（２０７ｂｐ）を意味する。また、ＶＰ４領域の塩
基配列とは、ＶＰ４領域の全領域の塩基配列または血清
型を反映するのに十分な長さ（通常、２０ｂｐ以上）を
有するその一部を意味する。
【００１３】ＶＰ４領域の塩基配列を得る方法は特に限
定されないが、血清型の未同定のエンテロウイルスを含
む試料からＶＰ４領域の塩基配列を得る場合には、以下
の方法によることが好ましい。すなわち、試料からＲＮ
Ａを調製し、調製されたＲＮＡからｃＤＮＡを得、得ら
れたｃＤＮＡからＰＣＲによってＶＰ４領域の塩基配列
を含む塩基配列を増幅し、増幅された産物を用いて塩基
配列解析を行う方法である。
定されないが、血清型の未同定のエンテロウイルスを含
む試料からＶＰ４領域の塩基配列を得る場合には、以下
の方法によることが好ましい。すなわち、試料からＲＮ
Ａを調製し、調製されたＲＮＡからｃＤＮＡを得、得ら
れたｃＤＮＡからＰＣＲによってＶＰ４領域の塩基配列
を含む塩基配列を増幅し、増幅された産物を用いて塩基
配列解析を行う方法である。
【００１４】試料は、エンテロウイルスを含むかまたは
含む可能性があるものであれば特に限定されないが、例
としては、咽頭拭い液、髄液、水泡内容物などの臨床材
料、または、これらの臨床材料より分離されたウイルス
培養液などを挙げることができる。これらの試料からの
ＲＮＡの調製は公知の方法により行うことができる。ま
た、ＲＮＡからのｃＤＮＡの調製方法も公知である。Ｐ
ＣＲは、このｃＤＮＡを鋳型とし、ＶＰ４領域の塩基配
列を含む塩基配列を増幅できるように選択されたオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして、公知のＰＣＲの方法
に従って行うことができる。また、ＲＮＡから逆転写(R
T)-PCRにより同一反応系でｃＤＮＡの取得及びＤＮＡの
増幅を行うこともできる。
含む可能性があるものであれば特に限定されないが、例
としては、咽頭拭い液、髄液、水泡内容物などの臨床材
料、または、これらの臨床材料より分離されたウイルス
培養液などを挙げることができる。これらの試料からの
ＲＮＡの調製は公知の方法により行うことができる。ま
た、ＲＮＡからのｃＤＮＡの調製方法も公知である。Ｐ
ＣＲは、このｃＤＮＡを鋳型とし、ＶＰ４領域の塩基配
列を含む塩基配列を増幅できるように選択されたオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして、公知のＰＣＲの方法
に従って行うことができる。また、ＲＮＡから逆転写(R
T)-PCRにより同一反応系でｃＤＮＡの取得及びＤＮＡの
増幅を行うこともできる。
【００１５】増幅産物の取得は、アガロースゲル電気泳
動で分離し、ゲルから切り出して抽出精製するなどの公
知の方法で行うことができる。通常には、エンテロウイ
ルスの既知の塩基配列と、用いたプライマーの塩基配列
とから予測できる長さの増幅産物を取得する。
動で分離し、ゲルから切り出して抽出精製するなどの公
知の方法で行うことができる。通常には、エンテロウイ
ルスの既知の塩基配列と、用いたプライマーの塩基配列
とから予測できる長さの増幅産物を取得する。
【００１６】ＶＰ４領域の全領域を含む塩基配列を増幅
できるように選択されたオリゴヌクレオチドの例として
は、配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオ
チド及び配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌク
レオチドが挙げられる。
できるように選択されたオリゴヌクレオチドの例として
は、配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオ
チド及び配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌク
レオチドが挙げられる。
【００１７】ＰＣＲによる増幅は２段階で行ってもよ
く、例えば、配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴ
ヌクレオチド及び配列番号２に示す塩基配列からなるオ
リゴヌクレオチドをプライマーとして用いて第１回目の
ＰＣＲを行った後、配列番号１に示す塩基配列からなる
オリゴヌクレオチド及び配列番号３に示す塩基配列から
なるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて第２
回目のＰＣＲを行ってもよい。２段階の増幅を行うこと
によって、一層特異的に目的の塩基配列を増幅すること
が可能になる。
く、例えば、配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴ
ヌクレオチド及び配列番号２に示す塩基配列からなるオ
リゴヌクレオチドをプライマーとして用いて第１回目の
ＰＣＲを行った後、配列番号１に示す塩基配列からなる
オリゴヌクレオチド及び配列番号３に示す塩基配列から
なるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて第２
回目のＰＣＲを行ってもよい。２段階の増幅を行うこと
によって、一層特異的に目的の塩基配列を増幅すること
が可能になる。
【００１８】増幅産物の塩基配列の決定は公知の方法に
よって行うことができる。決定された塩基配列の内、Ｖ
Ｐ４領域の塩基配列を系統解析に用いる。本発明同定法
において、ＶＰ４領域の塩基配列に基づく系統解析は、
公知の系統解析法によって行うことができる。このよう
な方法としては、Higgins法、ならびに、２−パラメー
ター法を用いたUPGMA法およびN-J法などが挙げられ、ま
た、これらの方法により系統解析を行うためのソフトウ
ェアが市販されている（DNASIS(日立ソフトウェアエン
ジニアリング)、SINCA(富士通)など）。
よって行うことができる。決定された塩基配列の内、Ｖ
Ｐ４領域の塩基配列を系統解析に用いる。本発明同定法
において、ＶＰ４領域の塩基配列に基づく系統解析は、
公知の系統解析法によって行うことができる。このよう
な方法としては、Higgins法、ならびに、２−パラメー
ター法を用いたUPGMA法およびN-J法などが挙げられ、ま
た、これらの方法により系統解析を行うためのソフトウ
ェアが市販されている（DNASIS(日立ソフトウェアエン
ジニアリング)、SINCA(富士通)など）。
【００１９】血清型は、系統解析においてそれぞれの血
清型の標準株と一定値以上のホモロジーを示す、また
は、一定値以上の確率で他の血清型のクラスターと区別
されるか否かによって決定できる。一定値とは、系統解
析により得られた系統樹において各血清型に属する株が
それぞれ単一のクラスターを形成するような値であれば
よい。
清型の標準株と一定値以上のホモロジーを示す、また
は、一定値以上の確率で他の血清型のクラスターと区別
されるか否かによって決定できる。一定値とは、系統解
析により得られた系統樹において各血清型に属する株が
それぞれ単一のクラスターを形成するような値であれば
よい。
【００２０】より具体的には、ホモロジーで８０％以
上、ブーツストラップ法で他のクラスターから区別され
る確率が９０％以上という値があげられる。例えば、エ
ンテロウイルス標準株４４血清型（６０株）の系統解析
によると、血清型は８４％のホモロジーで区別され、分
離株を加えたブーツストラップでは、１００％の確率で
他の血清型と区別された。
上、ブーツストラップ法で他のクラスターから区別され
る確率が９０％以上という値があげられる。例えば、エ
ンテロウイルス標準株４４血清型（６０株）の系統解析
によると、血清型は８４％のホモロジーで区別され、分
離株を加えたブーツストラップでは、１００％の確率で
他の血清型と区別された。
【００２１】
【実施例】次に、実施例を挙げて本発明を詳細に説明す
るが、下記実施例は本発明について具体的な認識を得る
一助としてのみ挙げたものであり、これによって本発明
の範囲が何ら限定されるものではない。
るが、下記実施例は本発明について具体的な認識を得る
一助としてのみ挙げたものであり、これによって本発明
の範囲が何ら限定されるものではない。
【００２２】
【実施例１】 エンテロウイルスＶＰ４全領域の塩基配
列解析 日本の流行で分離が報告されているエンテロウイルスの
ＶＰ４全領域の塩基配列解析をするために、ウイルスと
して、以下の標準株、すなわち、コクサッキーA群ウイ
ルス(CAV)として、CAV2、CAV3、CAV4、CAV5、CAV6、CAV
7、CAV8およびCAV10の８株、コクサッキーB群ウイルス
(CBV)として、CBV2およびCBV6の２株、ならびに、エコ
ーウイルス(ECV)として、ECV1、ECV2、ECV3、ECV4、ECV
5、ECV7、ECV13、ECV14、ECV17、ECV18、ECV19、ECV2
0、ECV24、ECV25およびECV30の１６株、総計２６の血清
型株を用いた。
列解析 日本の流行で分離が報告されているエンテロウイルスの
ＶＰ４全領域の塩基配列解析をするために、ウイルスと
して、以下の標準株、すなわち、コクサッキーA群ウイ
ルス(CAV)として、CAV2、CAV3、CAV4、CAV5、CAV6、CAV
7、CAV8およびCAV10の８株、コクサッキーB群ウイルス
(CBV)として、CBV2およびCBV6の２株、ならびに、エコ
ーウイルス(ECV)として、ECV1、ECV2、ECV3、ECV4、ECV
5、ECV7、ECV13、ECV14、ECV17、ECV18、ECV19、ECV2
0、ECV24、ECV25およびECV30の１６株、総計２６の血清
型株を用いた。
【００２３】臨床検体として、咽頭拭い液、髄液、水泡
内容物、および、これらの臨床材料より分離されたウイ
ルス培養液を用いた。咽頭拭い液および水泡内容物はそ
れぞれ１．５ｍｌのＴＥ溶液(10 mM Tris-HCl, 1 mM ED
TA (pH 8.0))に懸濁し、−８０℃で保存して用いた。
内容物、および、これらの臨床材料より分離されたウイ
ルス培養液を用いた。咽頭拭い液および水泡内容物はそ
れぞれ１．５ｍｌのＴＥ溶液(10 mM Tris-HCl, 1 mM ED
TA (pH 8.0))に懸濁し、−８０℃で保存して用いた。
【００２４】それぞれの検体１００μｌからスマイテス
トＲキット（住友金属工業）を用いて、ＲＮＡを抽出
し、乾固後のＲＮＡに、８μｌのRNaseフリーの蒸留水
と、１μｌのリボヌクレアーゼインヒビター（40 U/μ
l）(Promega)と、１μｌの５０μＭ下流プライマー（OL
68-1、5'GGTAA(C/T)TTCCACCACCA(A/G/C/T)CC3'、20mer
(配列番号１)）とを加え溶解させた。１００℃で１分間
加熱後、氷中にて急冷した。これに、１０×Taq緩衝液
（100 M Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2,
0.01%(w/v) gelatin）２μｌ、10 mM dNTPs２μｌ、Ｍ
−ＭＬＶ由来の逆転写酵素(200 U/μl)(BRL)１μｌ、お
よび、RNaseフリーの蒸留水４μｌを加え、３７℃、６
０分間の反応条件でｃＤＮＡを合成した。
トＲキット（住友金属工業）を用いて、ＲＮＡを抽出
し、乾固後のＲＮＡに、８μｌのRNaseフリーの蒸留水
と、１μｌのリボヌクレアーゼインヒビター（40 U/μ
l）(Promega)と、１μｌの５０μＭ下流プライマー（OL
68-1、5'GGTAA(C/T)TTCCACCACCA(A/G/C/T)CC3'、20mer
(配列番号１)）とを加え溶解させた。１００℃で１分間
加熱後、氷中にて急冷した。これに、１０×Taq緩衝液
（100 M Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2,
0.01%(w/v) gelatin）２μｌ、10 mM dNTPs２μｌ、Ｍ
−ＭＬＶ由来の逆転写酵素(200 U/μl)(BRL)１μｌ、お
よび、RNaseフリーの蒸留水４μｌを加え、３７℃、６
０分間の反応条件でｃＤＮＡを合成した。
【００２５】ウイルスのＶＰ４全領域の塩基配列を増幅
するため、エンテロウイルスに共通な配列のある5'非翻
訳領域およびVP2領域に設定したプライマーを用いてＰ
ＣＲを行った。第１回(1st)ＰＣＲは、上記で得られた
反応液５μｌに、１０×Taq緩衝液４．５μｌ、４０μ
Ｍ上流プライマー（EVP2、5'CCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAA
T3'、25mer(配列番号２)）０．５μｌ、蒸留水３９．７
５μｌおよびAmpli TaqDNAポリメラーゼ(5U/μl)(Roche
Diagnostic Systems)０．２５μｌを加え、ミネラルオ
イルを重層し、GeneAmp PCR System 9600(PERKIN ELME
R)を用いて、９５℃３０秒で変性、５５℃３０秒でアニ
ーリングおよび７２℃１分間で伸長のサイクルを４０サ
イクルの条件で行った。第２回(2nd)ＰＣＲは、1st Ｐ
ＣＲで得られた反応液５μｌに１０×Taq緩衝液４．５
μｌ、１０ｍＭｄＮＴＰｓ１μｌ、５０μＭ上流プライ
マー(EVP4、5'CTACTTTGGGTGTCCGTGTT3'、20mer(配列番
号３))０．５μｌ、５０μＭ下流プライマー(OL68-1)
０．５μｌ、蒸留水３８．２５μｌおよびAmpli Taq DN
Aポリメラーゼ(5U/μl)０．２５μｌを加え、1st ＰＣ
Ｒと同じ条件で行った。ＰＣＲ産物は、３％アガロース
ゲル電気泳動で分離し、エチジウムブロマイド染色後、
紫外線で検出した。
するため、エンテロウイルスに共通な配列のある5'非翻
訳領域およびVP2領域に設定したプライマーを用いてＰ
ＣＲを行った。第１回(1st)ＰＣＲは、上記で得られた
反応液５μｌに、１０×Taq緩衝液４．５μｌ、４０μ
Ｍ上流プライマー（EVP2、5'CCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAA
T3'、25mer(配列番号２)）０．５μｌ、蒸留水３９．７
５μｌおよびAmpli TaqDNAポリメラーゼ(5U/μl)(Roche
Diagnostic Systems)０．２５μｌを加え、ミネラルオ
イルを重層し、GeneAmp PCR System 9600(PERKIN ELME
R)を用いて、９５℃３０秒で変性、５５℃３０秒でアニ
ーリングおよび７２℃１分間で伸長のサイクルを４０サ
イクルの条件で行った。第２回(2nd)ＰＣＲは、1st Ｐ
ＣＲで得られた反応液５μｌに１０×Taq緩衝液４．５
μｌ、１０ｍＭｄＮＴＰｓ１μｌ、５０μＭ上流プライ
マー(EVP4、5'CTACTTTGGGTGTCCGTGTT3'、20mer(配列番
号３))０．５μｌ、５０μＭ下流プライマー(OL68-1)
０．５μｌ、蒸留水３８．２５μｌおよびAmpli Taq DN
Aポリメラーゼ(5U/μl)０．２５μｌを加え、1st ＰＣ
Ｒと同じ条件で行った。ＰＣＲ産物は、３％アガロース
ゲル電気泳動で分離し、エチジウムブロマイド染色後、
紫外線で検出した。
【００２６】この条件でのＰＣＲでは、1st ＰＣＲで約
７５０ｂｐ、2nd ＰＣＲで約６５０ｂｐ（5'非翻訳領域
の一部、ＶＰ４全領域およびＶＰ２領域のＮ末端側約１
／３を含む）が増幅される。今回用いた全ての標準株お
よび分離ウイルス株において増幅が確認できた。
７５０ｂｐ、2nd ＰＣＲで約６５０ｂｐ（5'非翻訳領域
の一部、ＶＰ４全領域およびＶＰ２領域のＮ末端側約１
／３を含む）が増幅される。今回用いた全ての標準株お
よび分離ウイルス株において増幅が確認できた。
【００２７】また、咽頭拭い液の臨床検体からは、上記
の増幅の他に、2nd ＰＣＲで約６２０ｂｐの増幅も認め
られた。これは、エンテロウイルスと同じピコルナウイ
ルス科に属するライノウイルスと考えられ、今回用いた
プライマー配列を有するが、5'非翻訳領域に一部塩基配
列の欠失を持つため、その増幅産物の長さからエンテロ
ウイルスとは容易に区別ができた。
の増幅の他に、2nd ＰＣＲで約６２０ｂｐの増幅も認め
られた。これは、エンテロウイルスと同じピコルナウイ
ルス科に属するライノウイルスと考えられ、今回用いた
プライマー配列を有するが、5'非翻訳領域に一部塩基配
列の欠失を持つため、その増幅産物の長さからエンテロ
ウイルスとは容易に区別ができた。
【００２８】このようにして得られた、ＶＰ４全領域を
含むＰＣＲ産物の塩基配列を解析した。ＰＣＲ産物は、
QIAquick PCR purificationキット(QIAGEN)を用いて、
未反応のプライマーとｄＮＴＰｓを除去し、ＤＮＡ濃度
が５ｎｇ／μｌ以上になるように蒸留水に溶解した。塩
基配列解析用に、ＶＰ４領域上流のエンテロウイルスに
共通の塩基配列に基づいて、プライマー(SEVP1、5'TGGC
TGCTTATGGTGACAAT3'、20mer(配列番号４))を設計した。
塩基配列の解析は、ダイデオキシターミネーターサイク
ルシークエンスキット(PERKIN ELMER)を用いて、９５℃
１０秒、５０℃５秒および６０℃４分のサイクルで２５
サイクル反応を行い、373A DNAオートシーケンサー(PER
KIN ELMER)で塩基配列を決定した。
含むＰＣＲ産物の塩基配列を解析した。ＰＣＲ産物は、
QIAquick PCR purificationキット(QIAGEN)を用いて、
未反応のプライマーとｄＮＴＰｓを除去し、ＤＮＡ濃度
が５ｎｇ／μｌ以上になるように蒸留水に溶解した。塩
基配列解析用に、ＶＰ４領域上流のエンテロウイルスに
共通の塩基配列に基づいて、プライマー(SEVP1、5'TGGC
TGCTTATGGTGACAAT3'、20mer(配列番号４))を設計した。
塩基配列の解析は、ダイデオキシターミネーターサイク
ルシークエンスキット(PERKIN ELMER)を用いて、９５℃
１０秒、５０℃５秒および６０℃４分のサイクルで２５
サイクル反応を行い、373A DNAオートシーケンサー(PER
KIN ELMER)で塩基配列を決定した。
【００２９】塩基配列を決定した結果、エンテロウイル
スの標準株、分離ウイルス株、臨床検体のいずれの株に
ついても、塩基配列に挿入や欠失は認められず、ＶＰ４
領域は２０７ｂｐの長さで一様であった。
スの標準株、分離ウイルス株、臨床検体のいずれの株に
ついても、塩基配列に挿入や欠失は認められず、ＶＰ４
領域は２０７ｂｐの長さで一様であった。
【００３０】CAV2-8、CAV10、CBV2、CBV6、ECV1-5、ECV
7、ECV13、ECV14、ECV17-21、ECV24、ECV25およびECV30
（２６血清型）が、今回初めてＶＰ４全領域の塩基配列
を解析したウイルス標準株であり、CAV9、CAV16、CAV2
1、CAV24、CBV1、CBV3-5、ECV6、ECV9、ECV11、ECV12、
ECV16、EV70、ECV71、PV1-3（１８血清型３５株）がGen
Bankに登録されている標準株である。これら４４血清型
のエンテロウイルス標準株のＶＰ４領域は、６６〜８４
％のホモロジーを有し、８０％のホモロジーで血清型が
区別できた。
7、ECV13、ECV14、ECV17-21、ECV24、ECV25およびECV30
（２６血清型）が、今回初めてＶＰ４全領域の塩基配列
を解析したウイルス標準株であり、CAV9、CAV16、CAV2
1、CAV24、CBV1、CBV3-5、ECV6、ECV9、ECV11、ECV12、
ECV16、EV70、ECV71、PV1-3（１８血清型３５株）がGen
Bankに登録されている標準株である。これら４４血清型
のエンテロウイルス標準株のＶＰ４領域は、６６〜８４
％のホモロジーを有し、８０％のホモロジーで血清型が
区別できた。
【００３１】上記の条件のRT-PCRによれば、0.1TCID50
の検出感度で、咽頭拭い液、髄液などの臨床材料からウ
イルスゲノムを直接増幅することが可能である。従っ
て、分離培養することなく、エンテロウイルスの血清型
の迅速同定が可能になる。
の検出感度で、咽頭拭い液、髄液などの臨床材料からウ
イルスゲノムを直接増幅することが可能である。従っ
て、分離培養することなく、エンテロウイルスの血清型
の迅速同定が可能になる。
【００３２】
【実施例２】 系統解析による臨床分離株の血清型同定
実施例１で新たに塩基配列を解析した標準株２６株、な
らびに、GenBankに登録されているCAV9、CAV16、CAV2
1、CAV24、CBV1、CBV3、CBV4、CBV5、ECV6、ECV9、ECV1
1、ECV12、ECV16、EV70、EV71およびPV1-3（１８血清型
３５株）のＶＰ４領域の塩基配列を選出した。系統樹
は、Higgins法(DNASIS、日立ソフトウェアエンジニアリ
ング)、ならびに、２−パラメーター法を用いたUPGMA法
およびN-J法(SINCA、富士通)の両ソフトウェアにより作
成し、作成された系統樹の確かさは、ブーツストラップ
法(SINCA)を用いて統計的評価を行った。
実施例１で新たに塩基配列を解析した標準株２６株、な
らびに、GenBankに登録されているCAV9、CAV16、CAV2
1、CAV24、CBV1、CBV3、CBV4、CBV5、ECV6、ECV9、ECV1
1、ECV12、ECV16、EV70、EV71およびPV1-3（１８血清型
３５株）のＶＰ４領域の塩基配列を選出した。系統樹
は、Higgins法(DNASIS、日立ソフトウェアエンジニアリ
ング)、ならびに、２−パラメーター法を用いたUPGMA法
およびN-J法(SINCA、富士通)の両ソフトウェアにより作
成し、作成された系統樹の確かさは、ブーツストラップ
法(SINCA)を用いて統計的評価を行った。
【００３３】臨床分離株の塩基配列を標準株と共に系統
解析を行って得られた系統樹の枝分かれとブーツストラ
ップ解析とより血清型同定を行った。先ず、標準株のＶ
Ｐ４領域の全領域の塩基配列による系統樹を作成した結
果、エンテロウイルスの遺伝子型は約６０％のホモロジ
ーで５群に分かれた。すなわち、CAV2-8、CAV10の第１
群、CAV16、EV71の第２群、CBV1-6、CAV9、エコーウイ
ルス(ECV)の第３群、ポリオウイルス(PV)、CAV21、CAV2
4の第４群およびEV70の第５群の各群である。これは、U
PGMA法およびN-J法のいずれも同様な結果となり、ピコ
ルナウイルス科内のゲノムにおける系統樹と矛盾を生じ
ず、さらにPeterMuirらが示したVP4-VP2のアミノ酸配列
の系統樹によるグループ分けとよく似ていた。
解析を行って得られた系統樹の枝分かれとブーツストラ
ップ解析とより血清型同定を行った。先ず、標準株のＶ
Ｐ４領域の全領域の塩基配列による系統樹を作成した結
果、エンテロウイルスの遺伝子型は約６０％のホモロジ
ーで５群に分かれた。すなわち、CAV2-8、CAV10の第１
群、CAV16、EV71の第２群、CBV1-6、CAV9、エコーウイ
ルス(ECV)の第３群、ポリオウイルス(PV)、CAV21、CAV2
4の第４群およびEV70の第５群の各群である。これは、U
PGMA法およびN-J法のいずれも同様な結果となり、ピコ
ルナウイルス科内のゲノムにおける系統樹と矛盾を生じ
ず、さらにPeterMuirらが示したVP4-VP2のアミノ酸配列
の系統樹によるグループ分けとよく似ていた。
【００３４】次に、同様に手足口病の臨床分離株３６株
の系統解析を行ったところ、血清型の同定されたCAV16
およびEV71は、それぞれの血清型の標準株と８０％以上
のホモロジーを示し、ブーツストラップ法において１０
０％の確率で、交差することなくそれぞれCAV16およびE
V71の単一の血清型のクラスターを形成した。さらに、
血清型が未同定な株についても単一のクラスターを形成
していた。
の系統解析を行ったところ、血清型の同定されたCAV16
およびEV71は、それぞれの血清型の標準株と８０％以上
のホモロジーを示し、ブーツストラップ法において１０
０％の確率で、交差することなくそれぞれCAV16およびE
V71の単一の血清型のクラスターを形成した。さらに、
血清型が未同定な株についても単一のクラスターを形成
していた。
【００３５】また、同様にECV30の分離株１４株につい
て系統解析を行うと、ECV30の標準株と８０％以上のホ
モロジーを示し、ブーツストラップ法で１００％の確率
で交差することなく単一のクラスターを形成していた。
て系統解析を行うと、ECV30の標準株と８０％以上のホ
モロジーを示し、ブーツストラップ法で１００％の確率
で交差することなく単一のクラスターを形成していた。
【００３６】さらに、コクサッキーウイルスＡ２４変異
株(CAV24v)の各分離株についても、同様に系統解析を行
うと、標準株と単一のクラスター（８５％以上のホモロ
ジー）を形成したうえに、ブーツストラップ法で１００
％の確率で交差することなく単一のクラスターを形成
し、他の血清型のエンテロウイルスと容易に鑑別され
た。急性出血性結膜炎(AHC)の原因ウイルスとして、CAV
24vとEV70の二つのウイルスが知られており、従って、A
HCの原因ウイルスを分離培養することなく、迅速に同定
できることが確認された。
株(CAV24v)の各分離株についても、同様に系統解析を行
うと、標準株と単一のクラスター（８５％以上のホモロ
ジー）を形成したうえに、ブーツストラップ法で１００
％の確率で交差することなく単一のクラスターを形成
し、他の血清型のエンテロウイルスと容易に鑑別され
た。急性出血性結膜炎(AHC)の原因ウイルスとして、CAV
24vとEV70の二つのウイルスが知られており、従って、A
HCの原因ウイルスを分離培養することなく、迅速に同定
できることが確認された。
【００３７】
【発明の効果】本発明によって、エンテロウイルスの血
清型を、エンテロウイルスの分離培養を要することな
く、塩基配列の分子系統解析により決定することが可能
になる。
清型を、エンテロウイルスの分離培養を要することな
く、塩基配列の分子系統解析により決定することが可能
になる。
【００３８】
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列の特徴 存在位置：18 他の情報：N=A, T, GまたはC 配列 GGTAAYTTCC ACCACCANCC 20
【００３９】 配列番号：２ 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列 CCTCCGGCCC CTGAATGCGG CTAAT 25
【００４０】 配列番号：３ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列 CTACTTTGGG TGTCCGTGTT 20
【００４１】 配列番号：４ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列 TGGCTGCTTA TGGTGACAAT 20
Claims (3)
- 【請求項１】 エンテロウイルスのＶＰ４領域の塩基配
列に基づいて分子系統解析を行い、エンテロウイルスの
血清型を同定することを特徴とするエンテロウイルスの
血清型同定法。 - 【請求項２】 試料からＲＮＡを調製し、調製されたＲ
ＮＡからｃＤＮＡを得、得られたｃＤＮＡからＰＣＲに
よってＶＰ４領域の塩基配列を含む塩基配列を増幅し、
増幅された産物を用いて塩基配列解析を行うことによ
り、前記ＶＰ４領域の塩基配列を得ることを特徴とする
請求項１に記載の血清型同定法。 - 【請求項３】 前記ＰＣＲが、配列番号１に示す塩基配
列を有するプライマーと配列番号２に示す塩基配列を有
するプライマーとを用いるものであることを特徴とする
請求項２に記載の血清型同定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15638798A JP4891468B2 (ja) | 1998-06-04 | 1998-06-04 | エンテロウイルスの系統解析による血清型の迅速同定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15638798A JP4891468B2 (ja) | 1998-06-04 | 1998-06-04 | エンテロウイルスの系統解析による血清型の迅速同定法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2008215672A Division JP5156543B2 (ja) | 2008-08-25 | 2008-08-25 | エンテロウイルスの血清型同定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11346799A true JPH11346799A (ja) | 1999-12-21 |
| JP4891468B2 JP4891468B2 (ja) | 2012-03-07 |
Family
ID=15626641
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15638798A Expired - Lifetime JP4891468B2 (ja) | 1998-06-04 | 1998-06-04 | エンテロウイルスの系統解析による血清型の迅速同定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4891468B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003093057A (ja) * | 2001-09-26 | 2003-04-02 | Mitsubishi Kagaku Bio-Clinical Laboratories Inc | ヒトライノウイルスの系統解析による血清型または遺伝子型の同定法 |
| JP2010104379A (ja) * | 2010-02-01 | 2010-05-13 | Mitsubishi Chemical Medience Corp | マイコプラズマ属およびウレアプラズマ属の菌種の同定方法 |
-
1998
- 1998-06-04 JP JP15638798A patent/JP4891468B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003093057A (ja) * | 2001-09-26 | 2003-04-02 | Mitsubishi Kagaku Bio-Clinical Laboratories Inc | ヒトライノウイルスの系統解析による血清型または遺伝子型の同定法 |
| JP2010104379A (ja) * | 2010-02-01 | 2010-05-13 | Mitsubishi Chemical Medience Corp | マイコプラズマ属およびウレアプラズマ属の菌種の同定方法 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4891468B2 (ja) | 2012-03-07 |
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