JPH1138008A

JPH1138008A - 自己抗体の検出方法および検出試薬

Info

Publication number: JPH1138008A
Application number: JP19096097A
Authority: JP
Inventors: Toshihiko Kishimoto; 利彦岸本; Takaaki Tamura; 隆明田村; Yasutaka Makino; 泰孝牧野; Isanori Sasaki; 功典佐々木
Original assignee: Sumitomo Electric Industries Ltd
Current assignee: Sumitomo Electric Industries Ltd
Priority date: 1997-07-16
Filing date: 1997-07-16
Publication date: 1999-02-12

Abstract

(57)【要約】【課題】ヒトの体液または組織抽出液から抗ヒトＧＡ
ＤＩＩ自己抗体を検出する検出方法および検出試薬を提
供すること。また、ヒトＧＡＤＩＩに対する自己抗体を
検出し、その発生量を健常人での発生量と比較すること
により特定の疾患、例えば、肝臓癌や自己免疫疾患を診
断することが可能であることを示すこと。【解決手段】ヒトＧＡＤＩＩ蛋白質または該蛋白質の
一部であって抗ヒトＧＡＤＩＩ自己抗体と抗原抗体反応
することが可能な蛋白質を用いて、ヒトの体液または組
織抽出液から抗ヒトＧＡＤＩＩ自己抗体を検出する検出
方法および検出試薬を提供する。また、前記自己抗体の
発生量を健常人での発生量と比較することにより特定の
疾患、例えば肝臓癌や自己免疫疾患の診断を行うことが
可能であることを示す。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、自己抗体を検出す
る検出方法および検出試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】癌の発症は遺伝子の何らかの異常によっ
て起こることが知られており、特に、遺伝子の転写レベ
ルでの変動異常が癌の発症の主たる原因と考えられてい
る。本発明者は、肝臓癌で特異的に発現する遺伝子とし
てＧＡＤＩＩ遺伝子を単離し、その塩基配列および該遺
伝子がコードするアミノ酸配列を決定した。本発明者
は、そのアミノ酸配列からなる組み換え体ＧＡＤＩＩ蛋
白質を作製し、国際出願公開番号ＷＯ９７／１０３３３
号公報に開示した。また、本発明者らにより、ラットで
はＣＳＡＤ（ＧＡＤＩＩと同じ）蛋白質に対する自己抗
体が発現していることが開示されている（Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ５６巻、５２３０−５２３７ペー
ジ（１９９６年））。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明者は、或る特定
の疾患、例えば、肝臓癌や自己免疫疾患を発病している
ヒトにおいてヒトＧＡＤＩＩ蛋白質と反応する抗体が体
内に存在する、すなわち抗ヒトＧＡＤＩＩ自己抗体が体
内に存在するのではないかと考えた。本発明は、ヒトの
体液や組織抽出液から抗ヒトＧＡＤＩＩ自己抗体を検出
することを課題とする。そして、抗ヒトＧＡＤＩＩ自己
抗体を検出し、その発生量を健常人での発生量と比較す
ることにより、前記特定の疾患、例えば、肝臓癌や自己
免疫疾患を診断することが可能であることを示すことを
課題とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、ヒトの体内に
存在する抗ヒトＧＡＤＩＩ自己抗体を、ヒトＧＡＤＩＩ
蛋白質と反応させることにより検出することを開示する
ものである。

【０００５】本発明は、配列表の配列番号１に記載した
アミノ酸から成るヒトＧＡＤＩＩ蛋白質（以降、ヒトＧ
ＡＤＩＩということがある）とヒトの体液または組織抽
出液とを反応させ、ヒトＧＡＤＩＩ蛋白質と反応する抗
ヒトＧＡＤＩＩ抗体を、該体液または該組織抽出液から
分離して検出する検出方法に関するものである。ここ
で、抗ヒトＧＡＤＩＩ抗体はヒトＧＡＤＩＩ蛋白質に対
して天然にヒト体内、特に体液内または組織内に存在す
る抗体であり、自己抗体である。

【０００６】また、本発明は、ヒトの体液または組織抽
出液に存在することが前記の検出方法によって確認され
た抗ヒトＧＡＤＩＩ自己抗体と抗原抗体反応することが
可能な蛋白質であって、かつ該蛋白質が配列表の配列番
号１に記載のアミノ酸配列における連続する８アミノ酸
残基以上のアミノ酸配列からなる蛋白質に関するもので
ある。この蛋白質は、抗ヒトＧＡＤＩＩ自己抗体の検出
に使用することができる。

【０００７】また、本発明は、ヒトＧＡＤＩＩ蛋白質と
反応する自己抗体を検出する検出試薬であって、前記に
記載の蛋白質を含むことを特徴とする検出試薬に関する
ものである。さらに、本発明は、前記検出試薬を用い
て、抗ヒトＧＡＤＩＩ自己抗体を検出する検出方法に関
するものである。

【０００８】また、本発明は前記の検出試薬を含むこと
を特徴とする検出キットに関するものである。さらに、
本発明は前記検出キットを用いて抗ヒトＧＡＤＩＩ自己
抗体を検出する検出方法に関するものである。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明者は、ヒトＧＡＤＩＩ蛋白
質を利用して、ヒトの体液または組織抽出液から抗ヒト
ＧＡＤＩＩ自己抗体の検出ができないか検討した。ま
ず、ヒトＧＡＤＩＩ蛋白質とヒトの血清を反応させるこ
とを試みた。具体的にはＥＬＩＳＡ法を試行した結果、
血清中に抗ヒトＧＡＤＩＩ自己抗体が天然に存在するこ
とを確認した。

【００１０】本発明において、ヒト体液中または組織抽
出液中からヒトＧＡＤＩＩ蛋白質と反応する抗体を検出
する方法は、一般に抗原−抗体反応を利用する方法が使
用可能である。体液または組織抽出液中の抗ヒトＧＡＤ
ＩＩ自己抗体を検出するには、抗原を標識しておくこと
あるいは自己抗体と結合もしくは反応する物質、例えば
標識化された二次抗体、抗原アナログまたはプロテイン
ＧもしくはプロテインＡを用いることが可能である。抗
原アナログは、ペプチド、修飾ペプチド、高分子有機化
合物等がある。標識の手段としては蛍光物質（ＦＩＴＣ
やローダミン等）等を用いることが可能であり、これ以
外にも、放射性同位元素（ＲＩ）、酵素（アルカリフォ
スファターゼ（ＡＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ
（ＨＲＰ）等）またはアビジンもしくはビオチンが利用
される。また、二次抗体としては、抗ヒトＩｇ抗体等の
抗原特異性の広いものが好ましい。

【００１１】酵素反応を利用する方法としては、例え
ば、ＥＬＩＳＡ法、免疫凝集法、ウェスタンブロット
法、フローサイトメトリーを用いた免疫反応分子の同定
方法又はそれらに類似する方法が挙げられる。前記以外
に、抗体を検出する方法としては、ウェスタンブロッテ
ィング法が使用可能であり、その結果現れるバンドの画
像情報ををイメージスキャナでコンピュータにデータと
して取り込み、コンピュータ上でバンドの密度を定量化
することも可能である。

【００１２】また、抗体を検出する方法として免疫沈降
法も使用可能である。本発明の場合、検体に、抗原とな
るヒトＧＡＤＩＩをビーズ等に結合させて見かけ上大き
な分子としたものを加えて、抗原抗体反応によりヒトＧ
ＡＤＩＩに結合または会合した抗体を遠心分離等により
分離することが可能である。

【００１３】一般に、抗原において、ある抗体により認
識される部位はアミノ酸数でいうと４アミノ酸程度と言
われている。分子量の小さなポリペプチドの場合、好ま
しくは８アミノ酸残基以上からなるポリペプチドであれ
ば、該ポリペプチドを免疫することにより該ポリペプチ
ドに対する抗体が得られることが知られている。したが
って、本発明において、抗ヒトＧＡＤＩＩ自己抗体を検
出するには、必ずしも配列表の配列番号１に記載したア
ミノ酸配列の全長からなるヒトＧＡＤＩＩでなくとも、
その一部分であって、８アミノ酸残基以上からなる蛋白
質には、抗ヒトＧＡＤＩＩ自己抗体を検出することがで
きる蛋白質が存在することが予想される。実際に、この
蛋白質を得るためには、まず全長のヒトＧＡＤＩＩで抗
ヒトＧＡＤＩＩ自己抗体を検出し、その自己抗体によ
り、ヒトＧＡＤＩＩの一部分である蛋白質であって該自
己抗体と反応するものをスクリーニングして得ることが
出来る。スクリーニング時の検出方法は、一般に、前記
の抗原−抗体反応を利用する方法が使用可能である。

【００１４】前記の配列表の配列番号１に記載したアミ
ノ酸配列からなるヒトＧＡＤＩＩの一部分であって、８
アミノ酸残基以上からなる蛋白質の作製には、公知の方
法が使用可能である。例えば、アミノ酸数が少ないとき
は、ペプチドシンセサイザーにより化学合成することが
可能である。

【００１５】また、比較的大きな蛋白質（３０アミノ酸
程度より多くのアミノ酸からなる蛋白質）の場合は、配
列表の配列番号２に記載の塩基配列からなる遺伝子（ヒ
トＧＡＤＩＩ遺伝子）を鋳型にしてＰＣＲ法により好み
の部位または全長を増幅し、該増幅して得られた遺伝子
を適当な制限酵素部位等で切断して短くし、該短くした
遺伝子を導入した形質転換体を作製し、該形質転換体に
蛋白質を作製させ、該形質転換体から蛋白質を回収して
精製することにより、目的とする蛋白質を得ることがで
きる。

【００１６】本発明の抗ヒトＧＡＤＩＩ自己抗体を検出
する検出試薬は、前記の蛋白質を含むことを特徴とし、
該蛋白質以外に該試薬に含まれるのが好ましい物質は、
牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、スカシ貝ヘモシアニン
（ＫＬＨ）、スキムミルク等、一般に使用されているも
のが使用可能である。

【００１７】また、本発明の検出キットに含まれる要素
は前記の検出試薬の他、反応条件に適した緩衝液、ブロ
ッキング溶液、界面活性剤、発色試薬（酵素基質）、酵
素液等が挙げられる。発色剤として蛍光試薬を使用する
場合は、蛍光増強試薬、蛍光退色防止剤を使用すること
が好ましい。

【００１８】

【実施例】以下に実施例を示し、本発明をさらに詳述す
るが、本発明はこの例に限定されるものではない。な
お、酵素に関しては、特に記載がない限り、宝酒造社製
のものを、当該酵素の使用説明書にしたがって用いた。

【００１９】Ｉ．ヒトＧＡＤＩＩ蛋白質の作製１．ヒトＧＡＤＩＩ遺伝子導入形質転換体の調製１）工業技術院生命科学研究所に受託番号ＦＥＲＭＢ
Ｐ−５６５３で寄託されているヒトＧＡＤＩＩ遺伝子
（配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなる遺伝
子）を導入した形質転換大腸菌ＪＭ１０９から、アルカ
リ法（『ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＳｅｃ
ｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ』１．３３−１．４３ページ）
によりプラスミド（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクタ
ー）を回収した。

【００２０】２）ヒトＧＡＤＩＩ遺伝子を、図１に示さ
れるヒスチジンタグを導入したｐＥＴ３ａベクターに組
み込んだ。以下にその詳細を記す。（１）まず、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクターを、
ＰＣＲ法（『Ｃｕｒｒｅｎｔｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉ
ｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ』ｃｈａｐｔ
ｅｒ１５に記載）により、次の式（１）及び式（２）の
塩基配列のプライマーを用いて、ヒトＧＡＤＩＩ遺伝子
の第一メチオニン部分をコードする塩基配列の前にＥｃ
ｏＲＩサイトを導入して増幅した。式（１）の塩基配列
を配列表の配列番号３に、式（２）の塩基配列を配列表
の配列番号４に示す。５’ＧＡＡＴＴＣＣＣＣＡＴＧＧＣＴＧＡＣＴＣＡＡＡＡＣＣＡＣＴＣＡＧＡＡ３’ ・・・式（１）５’ＧＣＡＣＴＧＡＣＣＡＧＡＡＡＴＧＧＣＡＣ３’ ・・・式（２）

【００２１】（２）増幅された遺伝子をＥｃｏＲＩおよ
びＳａｃＩで切断して切り出した。（３）別に、ヒトＧＡＤＩＩ遺伝子を挿入したｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔＩＩのヒトＧＡＤＩＩ遺伝子のＣ末端側
に存在する残りの部分をＢｇｌＩＩで切断した。その
後、クレノーフラグメントで平滑化した後、ＳａｃＩで
切断して遺伝子を切り出した。（４）（２）で切り出した遺伝子と（３）で切り出した
遺伝子とをＬｉｇａｔｉｏｎＰａｃｋ（登録商標、日
本ジーン社製）を用いてその取扱説明書に従い連結し、
ヒトＧＡＤＩＩ遺伝子を作製した。（５）図１に示すヒスチジンタグを導入したｐＥＴ３ａ
ベクターをＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩで切断した後、脱リン
酸化処理を行った。

【００２２】（６）（４）で作製したヒトＧＡＤＩＩ遺
伝子と（５）で作製されたベクターとを、Ｌｉｇａｔｉ
ｏｎＰａｃｋ（登録商標、日本ジーン社製）を用いて
その取扱説明書に従い連結した。なお、前記過程でのベ
クターに挿入された遺伝子の確認は、挿入断片の塩基配
列を読み取って行った。（７）ヒトＧＡＤＩＩ遺伝子を組み込んだプラスミド
（ｐＥＴ３ａベクター）を『ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌ
ｏｎｉｎｇＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ』ｃｈａｐ
ｔｅｒ１に記載の方法で大量調製した。

【００２３】２．ヒトＧＡＤＩＩ蛋白質の調製１）大量調製したプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ
３）ｐＬｙｓＳに導入した。２）該大腸菌をアンピシリン１００μｇ／ｍｌ、クロラ
ムフェニコール２５μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地で培養
し、分光光度計（ベックマン社製）で濁度が６００ｎｍ
の波長で０．５になった時点でＩＰＴＧを０．５ｍＭに
なるように加え、ヒトＧＡＤＩＩ蛋白質の発現誘導を行
った。この培養は計４ｌ行った（８００ｍｌ×５本）。

【００２４】３）２時間後、遠心分離により大腸菌を回
収し、ＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ（１０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌｐＨ７．９、１０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、
０．５ＭＮａＣｌ、０．１％ＮＰ４０、５ｍ
Ｍ２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、１ｍＭ
ＰＭＳＦ）に懸濁した後４℃でソニケーションにより大
腸菌を破砕し、ＢｅｃｋｍａｎＯｐｔｉｍａＸＬ−
８０を使用し、５０．２Ｔｉローターで１８００ｒｐ
ｍ、４℃で１５分間遠心分離した。その後、上清を取
り、１Ｍイミダゾール（ｐＨ７．５）を終濃度１０ｍＭ
になるように加え、Ｎｉ−アガロース（登録商標、キア
ゲン社製）を用いて、非変性条件で取扱い説明書の通り
に精製した。また、沈殿物を６Ｍ塩酸グアジニンに溶解
し、Ｎｉ−アガロース（キアゲン製）を用いて、変性条
件で取扱い説明書の通りに精製した。以降の操作では沈
殿物から変性条件で精製したヒトＧＡＤＩＩ蛋白質を用
いた。

【００２５】４）精製された標品の一部を、２×ＳＤＳ
サンプルバッファーと等量ずつ混合し、３分間沸騰水中
でボイルした後、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にか
け、クマシーブリリアントブルーで染色したところ、５
２ｋＤ付近にバンドが現れ、得られた蛋白質がヒトＧＡ
ＤＩＩ蛋白質であることが確認された。５）次に残った精製ヒトＧＡＤＩＩ蛋白質を４）と同様
に２×ＳＤＳサンプルバッファーで処理し、５ｍｍゲル
厚の１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけ、泳動終了
後ゲルを４℃にて０．２５ＭのＫＣｌで３０分間染色を
行った。５２ｋＤ付近の白く染色された目的のバンドを
カッターナイフで切り出し、そのバンドをカッターナイ
フでさらに細かく刻んだ。バイオラッド社製のモデル４
２２エレクトロエリューターを用い、取扱説明書に従い
２０ｍＡで８時間蛋白質の溶出を行った後、溶出された
蛋白質を回収した。前記によりヒトＧＡＤＩＩ蛋白質
（配列表の配列番号１のアミノ酸配列からなる蛋白質）
を得た。

【００２６】ＩＩ．抗ＧＡＤＩＩ抗体の検出１肝臓癌が疑われる人４８名について血清を得て、ＥＬＩ
ＳＡ法により血清中から抗ヒトＧＡＤＩＩ自己抗体の検
出を行った。コントロールとして健常人７人の血清を用
いた。以下にその方法を示す。

【００２７】１．抗原のコーティング抗原としてＧＡＤＩＩ蛋白質を用意し、抗原濃度が１０
μｇ／ｍｌとなるように抗原液を調製した。この抗原液
を９６ウェルプレートの各ウェルに１００μｌずつ入
れ、４℃で一晩置き、コーティングした。

【００２８】２．ブロッキング前記のプレートの抗原液
を捨て、プレートが乾かないうちにブロッキング液（ブ
ロックエース（登録商標、雪印乳業社製）を純粋で４倍
希釈したもの）を各ウェルに２００μｌずつ加え室温で
２時間置き、ブロッキングした。

【００２９】３．抗原抗体反応ブロッキング液を捨てた後、プレートが乾かないうち
に、ヒト血清（１００倍希釈したもの）を各ウェルに５
０μｌずつ加え２時間置き、抗原抗体反応させた。ヒト
血清を捨て、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０ＰＢＳ（−）
で４回洗浄した。

【００３０】４．二次抗体反応ＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧ抗体液をＰＢＳ（−）で５００
倍希釈し、各ウェルに５０μｌずつ加え、室温で１時間
置き、ヒト血清中のＩｇＧと反応させた。ＨＲＰ結合抗
ヒトＩｇＧ抗体液を捨て、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
ＰＢＳ（−）で７回洗浄した。

【００３１】５．発色反応ＯＰＤ（オルトフェニルジアミン、和光純薬社製）を１
錠を０．１ＭＰＣＢ３０ｍｌおよびＨ₂Ｏ₂１２μｌに
溶解した液を各ウェルに１００μｌずつ加え、室温で発
色するまで反応させた。２ＮＨ₂ＳＯ₄を各ウェルに５
０μｌずつ加え発色反応を停止させた。

【００３２】６．吸光度測定４９０ｎｍにおける吸光度をプレートリーダー（クラボ
ウ社製）で測定した。吸光度測定の結果、健常人７名の
血清のＥＬＩＳＡの結果の平均値を取り、それを正常平
均値とした。また、前記健常人７名での結果の標準偏差
を取り、正常標準偏差とした。肝臓癌患者の血清のＥＬ
ＩＳＡの結果については、４９０ｎｍにおける結果が、
「（正常平均値）＋（正常標準偏差）×２」の範囲外に
なるものを陽性とし、「正常平均値」と「（正常平均
値）＋（正常標準偏差）×２」の間になるものを擬陽性
とした。

【００３３】肝臓癌が疑われる人４８名の血清について
のＥＬＩＳＡ法の結果と、他の診断方法により肝臓癌と
診断された結果とを対比して表１に示す。また、肝臓癌
特異的な蛋白質として知られているＡＦＰまたはＰＩＶ
ＫＡ−ＩＩの検出の結果も表１に示す。

【００３４】

【表１】

【００３５】肝臓癌が疑われるごく初期の段階におい
て、抗ヒトＧＡＤＩＩ自己抗体の検出方法結果が陽性ま
たは擬陽性となった人は、最終的に肝臓腫瘍有り（肝臓
癌）と診断された人においては３０人中９人であり、そ
の比率は３０％を占める。これは従来使用されているＡ
ＦＰやＰＩＶＫＡ−ＩＩよりも高い陽性率となってお
り、本発明の自己抗体の検出方法が肝臓癌の診断方法の
一つとして使用できるものであることを示している。

【００３６】また、抗ヒトＧＡＤＩＩ自己抗体の検出結
果が陽性となった人は、肝臓癌と診断された人において
は３０人中６人であり、最終的に肝臓腫瘍無し（肝臓癌
でない）と診断された人は１８人中１人であることも、
本発明の抗ヒトＧＡＤＩＩ自己抗体の検出が肝臓癌の診
断方法の一つとして使用できるものであることを示して
いる。

【００３７】ＩＩＩ．抗ＧＡＤＩＩ抗体の検出２自己免疫疾患患者１１１人について血清を得て、ＥＬＩ
ＳＡ法により血清中から抗ヒトＧＡＤＩＩ自己抗体の検
出を行った。コントロールとして正常人（自己免疫疾患
に罹患していない人）２０人の血清を用いた。以下にそ
の方法を示す。

【００３８】１．抗原のコーティング抗原としてＧＡＤＩＩ蛋白質を用意し、抗原濃度が１０
μｇ／ｍｌとなるように抗原液を調製した。この抗原液
を９６ウェルプレートの各ウェルに１００μｌずつ入
れ、４℃で一晩置き、コーティングした。

【００３９】２．ブロッキング前記のプレートの抗原液を捨て、プレートが乾かないう
ちにブロッキング液（ブロックエース（登録商標、雪印
乳業社製）を純粋で４倍希釈したもの）を各ウェルに２
００μｌずつ加え室温で２時間置き、ブロッキングし
た。

【００４０】３．抗原抗体反応ブロッキング液を捨てた後、プレートが乾かないうち
に、ヒト血清（１００倍希釈したもの）を各ウェルに５
０μｌずつ加え２時間置き、抗原抗体反応させた。ヒト
血清を捨て、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０ＰＢＳ（−）
で４回洗浄した。

【００４１】４．二次抗体反応ＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧ抗体液をＰＢＳ（−）で５００
倍希釈し、各ウェルに５０μｌずつ加え、室温で１時間
置き、ヒト血清中のＩｇＧと反応させた。ＨＲＰ結合抗
ヒトＩｇＧ抗体液を捨て、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
ＰＢＳ（−）で７回洗浄した。

【００４２】５．発色反応ＯＰＤ（オルトフェニルジアミン、和光純薬社製）を１
錠を０．１ＭＰＣＢ３０ｍｌおよびＨ₂Ｏ₂１２μｌに
溶解した液を各ウェルに１００μｌずつ加え、室温で発
色するまで反応させた。２ＮＨ₂ＳＯ₄を各ウェルに５
０μｌずつ加え発色反応を停止させた。

【００４３】６．吸光度測定４９０ｎｍにおける吸光度をプレートリーダー（クラボ
ウ社製）で測定した。吸光度測定の結果、正常人２０名
の血清のＥＬＩＳＡの結果の平均値を取り、それを正常
平均値とした。また、前記正常人２０名での結果の標準
偏差を取り、正常標準偏差とした。自己免疫疾患患者の
血清のＥＬＩＳＡの結果については、４９０ｎｍにおけ
る結果が、「（正常平均値）＋（正常標準偏差）×２」
の範囲外になるものを陽性とした。結果を表２に示す。

【００４４】

【表２】

【００４５】ＳＬＥ、強皮症または多発性筋炎もしくは
皮膚性炎の患者においては、陽性率（被検者中陽性とな
った患者の数）は０％であった。一方、慢性関節リウマ
チの患者においては陽性率は８．３％であり、自己免疫
性肝炎の患者においては陽性率は８．８％であった。ま
た、１例ながら原発胆汁性肝硬変の患者でも陽性となる
結果が得られた。以上の結果より、陽性となった血清が
採取された患者は自己免疫疾患、特に、慢性関節リウマ
チ、自己免疫性肝炎または原発胆汁性肝硬変が疑われ
る。このことは、本発明の自己抗体の検出方法が自己免
疫疾患、特に、慢性関節リウマチ、自己免疫性肝炎また
は原発胆汁性肝硬変の診断方法の一つとして使用できる
ものであることを示している。

【００４６】

【発明の効果】本発明により、抗ヒトＧＡＤＩＩ自己抗
体をヒト体液または組織抽出液から検出することが可能
となる。そして、肝臓癌が疑われる患者の体液または組
織抽出液から前記自己抗体の発生量を健常人での発生量
と比較することにより肝臓癌の診断を行うことが可能と
なる。

【００４７】また、本発明により、自己免疫疾患が疑わ
れる患者の体液または組織抽出液から前記自己抗体の発
生量を正常人での発生量と比較することにより自己免疫
性疾患、特に慢性関節リウマチ、自己免疫性肝炎または
原発性肝硬変の診断を行うことが可能となる。

【００４８】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：４９３配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質配列 Met Ala Asp Ser Glu Ala Leu Pro Ser Leu Ala Gly Asp Pro Val Ala 1 5 10 15 Val Glu Ala Leu Leu Arg Ala Val Phe Gly Val Val Val Asp Glu Ala 20 25 30 Ile Gln Lys Gly Thr Ser Val Ser Gln Lys Val Cys Glu Trp Lys Glu 35 40 45 Pro Glu Glu Leu Lys Gln Leu Leu Asp Leu Glu Leu Arg Ser Gln Gly 50 55 60 Glu Ser Gln Lys Gln Ile Leu Glu Arg Cys Arg Ala Val Ile Arg Tyr 65 70 75 80 Ser Val Lys Thr Gly His Pro Arg Phe Phe Asn Gln Leu Phe Ser Gly 85 90 95 Leu Asp Pro His Ala Leu Ala Gly Arg Ile Ile Thr Glu Ser Leu Asn 100 105 110 Thr Ser Gln Tyr Thr Tyr Glu Ile Ala Pro Val Phe Val Leu Met Glu 115 120 125 Glu Glu Val Leu Arg Lys Leu Arg Ala Leu Val Gly Trp Ser Ser Gly 130 135 140 Asp Gly Ile Phe Cys Pro Gly Gly Ser Ile Ser Asn Met Tyr Ala Val 145 150 155 160 Asn Leu Ala Arg Tyr Gln Arg Tyr Pro Asp Cys Lys Gln Arg Gly Leu 165 170 175 Arg Thr Leu Pro Pro Leu Ala Leu Phe Thr Ser Lys Glu Cys His Tyr 180 185 190 Ser Ile Gln Lys Gly Ala Ala Phe Leu Gly Leu Gly Thr Asp Ser Val 195 200 205 Arg Val Val Lys Ala Asp Glu Arg Gly Lys Met Val Pro Glu Asp Leu 210 215 220 Glu Arg Gln Ile Gly Met Ala Glu Ala Glu Gly Ala Val Pro Phe Leu 225 230 235 240 Val Ser Ala Thr Ser Gly Thr Thr Val Leu Gly Ala Phe Asp Pro Leu 245 250 255 Glu Ala Ile Ala Asp Val Cys Gln Arg His Gly Leu Trp Leu His Val 260 265 270 Asp Ala Ala Trp Gly Gly Ser Val Leu Leu Ser Gln Thr His Arg His 275 280 285 Leu Leu Asp Gly Ile Gln Arg Ala Asp Ser Val Ala Trp Asn Pro His 290 295 300 Lys Leu Leu Ala Ala Gly Leu Gln Cys Ser Ala Leu Leu Leu Gln Asp 305 310 315 320 Thr Ser Asn Leu Leu Lys Arg Cys His Gly Ser Gln Ala Ser Tyr Leu 325 330 335 Phe Gln Gln Asp Lys Phe Tyr Asp Val Ala Leu Asp Thr Gly Asp Lys 340 345 350 Val Val Gln Cys Gly Arg Arg Val Asp Cys Leu Lys Leu Trp Leu Met 355 360 365 Trp Lys Ala Gln Gly Asp Gln Gly Leu Glu Arg Arg Ile Asp Gln Ala 370 375 380 Phe Val Leu Ala Arg Tyr Leu Val Glu Glu Met Lys Lys Arg Glu Gly 385 390 395 400 Phe Glu Leu Val Met Glu Pro Glu Phe Val Asn Val Cys Phe Trp Phe 405 410 415 Val Pro Pro Ser Leu Arg Gly Lys Gln Glu Ser Pro Asp Tyr His Glu 420 425 430 Arg Leu Ser Lys Val Ala Pro Val Leu Lys Glu Arg Met Val Lys Glu 435 440 445 Gly Ser Met Met Ile Gly Tyr Gln Pro His Gly Thr Arg Gly Asn Phe 450 455 460 Phe Arg Val Val Val Ala Asn Ser Ala Leu Thr Cys Ala Asp Met Asp 465 470 475 480 Phe Leu Leu Asn Glu Leu Glu Arg Leu Gly Gln Asp Leu 485 490

【００４９】配列番号：２配列の長さ：１９２６配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列 CGGCGCGCCT GTAATCCCAG CACTCTGGGA GACCGAGATT CTTGGTTGAT GCAAATCAAA 60 TAGAGATCCT G ATG GCT GAC TCA GAA GCA CTC CCC TCC CTT GCT GGG GAC 110 CCA GTG GCT GTG GAA GCC TTG CTC CGG GCC GTG TTT GGG GTT GTT GTG 158 GAT GAG GCC ATT CAG AAA GGA ACC AGT GTC TCC CAG AAG GTC TGT GAG 206 TGG AAG GAG CCT GAG GAG CTG AAG CAG CTG CTG GAT TTG GAG CTG CGG 254 AGC CAG GGC GAG TCA CAG AAG CAG ATC CTG GAG CGG TGT CGG GCT GTG 302 ATT CGC TAC AGT GTC AAG ACT GGT CAC CCT CGG TTC TTC AAC CAG CTC 350 TTC TCT GGG TTG GAT CCC CAT GCT CTG GCC GGG CGC ATT ATC ACT GAG 398 AGC CTC AAC ACC AGC CAG TAC ACA TAT GAA ATC GCC CCC GTG TTT GTG 446 CTC ATG GAA GAG GAG GTG CTG AGG AAA CTG CGG GCC CTG GTG GGC TGG 494 AGC TCT GGG GAC GGA ATC TTC TGC CCT GGT GGC TCC ATC TCC AAC ATG 542 TAT GCT GTA AAT CTG GCC CGC TAT CAG CGC TAC CCG GAT TGC AAG CAG 590 AGG GGC CTC CGC ACA CTG CCG CCC CTG GCC CTA TTC ACA TCG AAG GAG 638 TGT CAC TAC TCC ATC CAG AAG GGA GCT GCG TTT CTG GGA CTT GGC ACC 686 GAC AGT GTC CGA GTG GTC AAG GCT GAT GAG AGA GGG AAA ATG GTC CCC 734 GAG GAT CTG GAG AGG CAG ATT GGT ATG GCC GAG GCT GAG GGT GCT GTG 782 CCG TTC CTG GTC AGT GCC ACC TCT GGC ACC ACT GTG CTA GGG GCC TTT 830 GAC CCC CTG GAG GCA ATT GCT GAT GTG TGC CAG CGT CAT GGG CTA TGG 878 CTG CAT GTG GAT GCT GCC TGG GGT GGG AGC GTC CTG CTG TCA CAG ACA 926 CAC AGG CAT CTC CTG GAT GGG ATC CAG AGG GCT GAC TCT GTG GCC TGG 974 AAT CCC CAC AAG CTC CTC GCA GCA GGC CTG CAA TGC TCT GCA CTT CTT 1022 CTC CAG GAT ACC TCG AAC CTG CTC AAG CGC TGC CAT GGG TCC CAG GCC 1070 AGC TAC CTT TTC CAG CAG GAC AAG TTC TAC GAT GTG GCT CTG GAC ACG 1118 GGA GAC AAG GTG GTG CAG TGT GGC CGC CGT GTG GAC TGT CTG AAG CTG 1166 TGG CTC ATG TGG AAG GCA CAG GGC GAT CAA GGG CTG GAG CGG CGC ATC 1214 GAC CAG GCC TTT GTC CTT GCC CGG TAC CTG GTG GAG GAA ATG AAG AAG 1262 CGG GAA GGG TTT GAG CTA GTC ATG GAG CCT GAG TTT GTC AAT GTG TGT 1310 TTC TGG TTC GTA CCC CCC AGC CTG CGA GGG AAG CAG GAG AGT CCA GAT 1358 TAC CAC GAA AGG CTG TCA AAG GTG GCC CCC GTG CTC AAG GAG CGC ATG 1406 GTG AAG GAG GGC TCC ATG ATG ATT GGC TAC CAG CCC CAC GGG ACC CGG 1454 GGC AAC TTC TTC CGT GTG GTT GTG GCC AAC TCT GCA CTG ACC TGT GCT 1502 GAT ATG GAC TTC CTC CTC AAC GAG CTG GAG CGG CTA GGC CAG GAC CTG 1550 TGA GCCTTCTCTG TCTTGCTGCC GGCCTTGATA CCACCCCTCA CCCGCAGAGT 1603 CACTGCATTC CCTCCCAGCC TTTGAGGCCG GGTGCAGTGG CTCACGCCTG TAATCCCAGC 1663 ACTTTGGGAG GCCGAGGCGG GTGGATCACT TGAGGTCAGG AGTTCGAGAC CAGCCTGGCC 1723 AATAAGGTGA AACCCTGTCT CTACTAAAAA TACAAAAATT AGCCGAGCAT GGTGGCCTGT 1783 GCCTGTAAAC CCAGCTACTC AGGAGGTTGG GGCAGAATTG CTTGAACCCA GGGGGCAGAG 1843 GTTGCAGTGA GCCGAGATTG CACCCCTGCA CTCCAGGCTG GGCAACAGTA CGAGACTCTG 1903 TTCCAAAAAA AATAAAAAAG CCG 1926

【００５０】配列番号：３配列の長さ：３４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列 GAATTCCCCA TGGCTGACTC AAAACCACTC AGAA

【００５１】配列番号：４配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸配列 GCACTGACCA GAAATGGCAC

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒスチジンタグを導入したｐＥＴ３ａベクター
を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者佐々木功典山口県字部市小串1144番地山口大学医学部第二病理学講座内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
列から成る蛋白質とヒトの体液または組織抽出液とを反
応させて、該体液または該組織抽出液中に存在し、かつ
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列から成る蛋白
質と反応する自己抗体を検出する検出方法。
【請求項２】肝臓癌患者の体液または組織抽出液中に
存在し、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列から
成る蛋白質と反応し、かつ肝臓癌で発生量が増加する自
己抗体を検出することを特徴とする請求項１に記載の検
出方法。
【請求項３】自己免疫疾患患者の体液または組織抽出
液中に存在し、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
列から成る蛋白質と反応し、かつ自己免疫疾患で発生量
が増加する自己抗体を検出することを特徴とする請求項
１に記載の検出方法。
【請求項４】配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
列における連続する８アミノ酸残基以上のアミノ酸配列
からなる蛋白質であって、請求項１ないし３のいずれか
一項に記載の検出方法により存在が確認されたヒトの体
液または組織抽出液に存在する自己抗体と抗原抗体反応
することが可能であることを特徴とする蛋白質。
【請求項５】ヒトの体液または組織抽出液中に存在
し、かつ配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列から
なる蛋白質と反応する自己抗体を検出する検出試薬であ
って、請求項４に記載の蛋白質を含むことを特徴とする
検出試薬。
【請求項６】肝臓癌患者の体液または組織抽出液中に
存在し、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列から
なる蛋白質と反応し、かつ肝臓癌で発生量が増加する自
己抗体を検出することを特徴とする請求項５に記載の検
出試薬。
【請求項７】自己免疫疾患患者の体液または組織抽出
液中に存在し、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
列からなる蛋白質と反応し、かつ自己免疫疾患で発生量
が増加する自己抗体を検出することを特徴とする請求項
５に記載の検出試薬。
【請求項８】請求項５ないし７のいずれか一項に記載
の検出試薬を含むことを特徴とする検出キット。