JPH1142091A - アンチセンス核酸化合物 - Google Patents
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N15/1136—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against growth factors, growth regulators, cytokines, lymphokines or hormones
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 血管内皮細胞増殖因子の発現を阻害するア
ンチセンス核酸化合物及びそれを有効成分とする医薬、
診断薬の提供。 【解決手段】 塩基配列が血管内皮細胞増殖因子をコ
ードする遺伝子の翻訳部分の上流に存在する塩基配列に
対して実質的に相補的であり、細胞による血管内皮細胞
増殖因子の発現を５０％以上阻害するものをアンチセン
ス核酸化合物とする。
ンチセンス核酸化合物及びそれを有効成分とする医薬、
診断薬の提供。 【解決手段】 塩基配列が血管内皮細胞増殖因子をコ
ードする遺伝子の翻訳部分の上流に存在する塩基配列に
対して実質的に相補的であり、細胞による血管内皮細胞
増殖因子の発現を５０％以上阻害するものをアンチセン
ス核酸化合物とする。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は血管内皮細胞増殖因
子をコードする遺伝子において、翻訳領域の５'上流域
の非翻訳領域の中の特定の塩基配列に相補的な塩基配列
を含み、血管内皮細胞増殖因子の発現を阻害するアンチ
センス核酸化合物及びその用途に関するものであり、遺
伝子技術ひいては製薬、診断薬技術に関するものであ
る。
子をコードする遺伝子において、翻訳領域の５'上流域
の非翻訳領域の中の特定の塩基配列に相補的な塩基配列
を含み、血管内皮細胞増殖因子の発現を阻害するアンチ
センス核酸化合物及びその用途に関するものであり、遺
伝子技術ひいては製薬、診断薬技術に関するものであ
る。
【０００２】
【従来の技術】制癌剤開発の基礎となる腫瘍や腫瘍細胞
についての研究は従来から盛んに行われている。その結
果として、固形腫瘍の恒常性維持には血管を介して供給
される酸素や栄養が重要であり、生体内に発生した固形
腫瘍は、血管の到達なしには直径約２mm以上には生育で
きないとされている[I.F.Tannock及びR.P.Hill著、谷口
直之監訳「がんのベーシックサイエンス」 メディカル・
サイエンス・インターナショナル、1993年；黒木登志夫
編、発がんとがん細胞(がんのバイオサイエンス３)、東
京大学出版会 1991年]。このため、固形腫瘍への血管の
到達については、固形腫瘍細胞が血管を引き寄せるなん
らかの因子(腫瘍血管新生因子)を産生し分泌していると
の考えが古くから提唱されている(J.Folkman、 Annals o
f Surgery 175巻 409-416、 1972年)。腫瘍血管新生因子
の作用を有する物質の一つとして、血管内皮細胞増殖因
子が注目されている(N. Ferraraら、Endocrine Reviews
3巻 1号 18-31頁、1992年)。血管内皮細胞増殖因子は
血管透過性因子とよばれるものと同一物質であり、血管
内皮細胞増殖因子／血管透過性因子と記載されることも
あり、ヒト由来のものではスプライシングの違いにより
４つの分子種の存在が知られている。この血管内皮細胞
増殖因子は、細胞レベルでの実験では、固形腫瘍細胞に
対する増殖促進効果などの直接の作用を示さないが、個
体レベルでの動物実験では、この血管内皮細胞増殖因子
が固形腫瘍の増大を促進したり、抗血管内皮細胞増殖因
子抗体の投与によって固形腫瘍の増大が阻害されたりす
ることが示され、血管内皮細胞増殖因子が腫瘍血管新生
因子の一つであることが確かめられた(K.J.Kimら、Natu
re 362巻 4月29日号 841-844頁、1993年；S.Kondoら、B
iochemical andBiophysical Research Communications
194巻 3号 1234-1241頁、1993年)。
についての研究は従来から盛んに行われている。その結
果として、固形腫瘍の恒常性維持には血管を介して供給
される酸素や栄養が重要であり、生体内に発生した固形
腫瘍は、血管の到達なしには直径約２mm以上には生育で
きないとされている[I.F.Tannock及びR.P.Hill著、谷口
直之監訳「がんのベーシックサイエンス」 メディカル・
サイエンス・インターナショナル、1993年；黒木登志夫
編、発がんとがん細胞(がんのバイオサイエンス３)、東
京大学出版会 1991年]。このため、固形腫瘍への血管の
到達については、固形腫瘍細胞が血管を引き寄せるなん
らかの因子(腫瘍血管新生因子)を産生し分泌していると
の考えが古くから提唱されている(J.Folkman、 Annals o
f Surgery 175巻 409-416、 1972年)。腫瘍血管新生因子
の作用を有する物質の一つとして、血管内皮細胞増殖因
子が注目されている(N. Ferraraら、Endocrine Reviews
3巻 1号 18-31頁、1992年)。血管内皮細胞増殖因子は
血管透過性因子とよばれるものと同一物質であり、血管
内皮細胞増殖因子／血管透過性因子と記載されることも
あり、ヒト由来のものではスプライシングの違いにより
４つの分子種の存在が知られている。この血管内皮細胞
増殖因子は、細胞レベルでの実験では、固形腫瘍細胞に
対する増殖促進効果などの直接の作用を示さないが、個
体レベルでの動物実験では、この血管内皮細胞増殖因子
が固形腫瘍の増大を促進したり、抗血管内皮細胞増殖因
子抗体の投与によって固形腫瘍の増大が阻害されたりす
ることが示され、血管内皮細胞増殖因子が腫瘍血管新生
因子の一つであることが確かめられた(K.J.Kimら、Natu
re 362巻 4月29日号 841-844頁、1993年；S.Kondoら、B
iochemical andBiophysical Research Communications
194巻 3号 1234-1241頁、1993年)。
【０００３】上述のことから、血管内皮細胞増殖因子の
作用を阻害することは固形腫瘍細胞の増殖を阻害するこ
とにつながり、かかる関係を利用して制癌剤の開発を行
うことができるはずであり、実際に抗血管内皮細胞増殖
因子抗体を用いる方法が報告されている。この方法はm
ＲＮＡの翻訳により生合成された血管内皮細胞増殖因子
の作用(固形腫瘍を増大させる作用)を抗血管内皮細胞増
殖因子抗体で阻害する方法である。しかし、かかる方法
では、阻害する対象である血管内皮細胞増殖因子の存在
を前提としており、言わば、腫瘍の増殖を抑制するのに
不要な物質まで生合成されなければならないという不合
理が生じ、生体内物質の有効利用の点で効率性に欠ける
という問題点がある。また、血管内皮細胞増殖因子自体
は特に抑制を受けることなく生合成されるので、用いた
抗血管内皮細胞増殖因子抗体の特異性や結合力が充分で
なく、抗体の阻害作用が不完全である場合にも問題が生
じる。そこで、産生された血管内皮細胞増殖因子の作用
を阻害するために用いられる該因子に対する抗体の代わ
りに、mＲＮＡから血管内皮細胞増殖因子への産生過程
(翻訳)などの血管内皮細胞増殖因子の産生自体を完全に
又はほぼ完全に阻害する核酸化合物、いわゆるアンチセ
ンス核酸化合物を用いる方法(アンチセンス核酸法とい
う)が提案されている(Uchidaら Antisense Res.&Dev. 5
巻 1号 87-88頁、1995年；Nomuraら J.Biol.Chem. 270
巻 47号 28316-28324頁、1995年；WO95/04142；WO 96/0
0286；WO 96/23065；WO 96/27006)。
作用を阻害することは固形腫瘍細胞の増殖を阻害するこ
とにつながり、かかる関係を利用して制癌剤の開発を行
うことができるはずであり、実際に抗血管内皮細胞増殖
因子抗体を用いる方法が報告されている。この方法はm
ＲＮＡの翻訳により生合成された血管内皮細胞増殖因子
の作用(固形腫瘍を増大させる作用)を抗血管内皮細胞増
殖因子抗体で阻害する方法である。しかし、かかる方法
では、阻害する対象である血管内皮細胞増殖因子の存在
を前提としており、言わば、腫瘍の増殖を抑制するのに
不要な物質まで生合成されなければならないという不合
理が生じ、生体内物質の有効利用の点で効率性に欠ける
という問題点がある。また、血管内皮細胞増殖因子自体
は特に抑制を受けることなく生合成されるので、用いた
抗血管内皮細胞増殖因子抗体の特異性や結合力が充分で
なく、抗体の阻害作用が不完全である場合にも問題が生
じる。そこで、産生された血管内皮細胞増殖因子の作用
を阻害するために用いられる該因子に対する抗体の代わ
りに、mＲＮＡから血管内皮細胞増殖因子への産生過程
(翻訳)などの血管内皮細胞増殖因子の産生自体を完全に
又はほぼ完全に阻害する核酸化合物、いわゆるアンチセ
ンス核酸化合物を用いる方法(アンチセンス核酸法とい
う)が提案されている(Uchidaら Antisense Res.&Dev. 5
巻 1号 87-88頁、1995年；Nomuraら J.Biol.Chem. 270
巻 47号 28316-28324頁、1995年；WO95/04142；WO 96/0
0286；WO 96/23065；WO 96/27006)。
【０００４】このアンチセンス酸核法が有効か否かはそ
のアンチセンス核酸の選択方法にかかっている。すなわ
ち、血管内皮細胞増殖因子の産生自体を完全に又はほぼ
完全に阻害する核酸化合物、いわゆるアンチセンス核酸
化合物としていかに有効なものを選択できるかにかかっ
ている。そこで、本発明者等は先に血管内皮細胞増殖因
子をコードする遺伝子の塩基配列に対して相補的な塩基
配列を有し、かつ、血管内皮細胞増殖因子の発現を阻害
する作用を有するアンチセンス核酸化合物を見出し提案
した（国際公開ＷＯ９６／００２８６）。
のアンチセンス核酸の選択方法にかかっている。すなわ
ち、血管内皮細胞増殖因子の産生自体を完全に又はほぼ
完全に阻害する核酸化合物、いわゆるアンチセンス核酸
化合物としていかに有効なものを選択できるかにかかっ
ている。そこで、本発明者等は先に血管内皮細胞増殖因
子をコードする遺伝子の塩基配列に対して相補的な塩基
配列を有し、かつ、血管内皮細胞増殖因子の発現を阻害
する作用を有するアンチセンス核酸化合物を見出し提案
した（国際公開ＷＯ９６／００２８６）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、先に提
案したもの以上に血管内皮細胞増殖因子の産生を効果的
に阻害するアンチセンス核酸を見つけることを課題とし
て研究を行ったのである。
案したもの以上に血管内皮細胞増殖因子の産生を効果的
に阻害するアンチセンス核酸を見つけることを課題とし
て研究を行ったのである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
に基づいて鋭意研究を行った結果、血管内皮細胞増殖因
子をコードする遺伝子の翻訳部分より上流の塩基配列に
相補的な塩基配列を有する核酸化合物が、前回提案の核
酸化合物より遙かに効率的に、血管内皮細胞増殖因子の
産生を阻害することをを見出し、その薬理効果を培養細
胞系において確かめて本発明を完成させたのである。即
ち、本発明は、塩基配列が血管内皮細胞増殖因子をコー
ドする遺伝子の翻訳部分より上流に存在する塩基配列に
対して相補的であり、細胞による血管内皮細胞増殖因子
の発現を５０％以上阻害することを特徴とするアンチセ
ンス核酸化合物に関するものであり、さらには、前記ア
ンチセンス核酸化合物を有効成分とする治療剤、診断剤
に関するものである。
に基づいて鋭意研究を行った結果、血管内皮細胞増殖因
子をコードする遺伝子の翻訳部分より上流の塩基配列に
相補的な塩基配列を有する核酸化合物が、前回提案の核
酸化合物より遙かに効率的に、血管内皮細胞増殖因子の
産生を阻害することをを見出し、その薬理効果を培養細
胞系において確かめて本発明を完成させたのである。即
ち、本発明は、塩基配列が血管内皮細胞増殖因子をコー
ドする遺伝子の翻訳部分より上流に存在する塩基配列に
対して相補的であり、細胞による血管内皮細胞増殖因子
の発現を５０％以上阻害することを特徴とするアンチセ
ンス核酸化合物に関するものであり、さらには、前記ア
ンチセンス核酸化合物を有効成分とする治療剤、診断剤
に関するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において血管内皮細胞増殖因子をコードする遺伝
子の翻訳部分より上流(以下翻訳上流部分という)に存在
する塩基配列とは、血管内皮細胞増殖因子のアミノ酸配
列を規定している構造遺伝子より上流の塩基配列(プロ
モーターやオペレーターなどをも含む部分)を意味し、
例えば配列番号１で表されるものが挙げられる。また、
血管内皮細胞増殖因子の発現を阻害するとは、血管内皮
細胞増殖因子をコードするmＲＮＡから血管内皮細胞増
殖因子への翻訳などを阻害することにより、該因子の産
生を阻止もしくは産生を抑制することを意味する。アン
チセンス核酸化合物としては、血管内皮細胞増殖因子の
発現を効率的に抑えるものほど良いものといえ、本発明
によれば、例えば配列番号１で表される血管内皮細胞増
殖因子をコードする遺伝子の翻訳上流部分の塩基配列で
あって、配列番号２〜１９等で示される塩基配列のうち
の１０個、好ましくは１３個、より好ましくは２０個の
連続した塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核
酸化合物が、無添加の場合に較べて、血管内皮細胞増殖
因子の発現を５０％以上、一般的には７０％以上、一部
のものは８０％或いは９０％以上も阻害するのであり、
それらは非常に優れたアンチセンス核酸化合物と言いえ
るものである。これらの阻害効果は、後述する培養細胞
系において確かめたものである。
本発明において血管内皮細胞増殖因子をコードする遺伝
子の翻訳部分より上流(以下翻訳上流部分という)に存在
する塩基配列とは、血管内皮細胞増殖因子のアミノ酸配
列を規定している構造遺伝子より上流の塩基配列(プロ
モーターやオペレーターなどをも含む部分)を意味し、
例えば配列番号１で表されるものが挙げられる。また、
血管内皮細胞増殖因子の発現を阻害するとは、血管内皮
細胞増殖因子をコードするmＲＮＡから血管内皮細胞増
殖因子への翻訳などを阻害することにより、該因子の産
生を阻止もしくは産生を抑制することを意味する。アン
チセンス核酸化合物としては、血管内皮細胞増殖因子の
発現を効率的に抑えるものほど良いものといえ、本発明
によれば、例えば配列番号１で表される血管内皮細胞増
殖因子をコードする遺伝子の翻訳上流部分の塩基配列で
あって、配列番号２〜１９等で示される塩基配列のうち
の１０個、好ましくは１３個、より好ましくは２０個の
連続した塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核
酸化合物が、無添加の場合に較べて、血管内皮細胞増殖
因子の発現を５０％以上、一般的には７０％以上、一部
のものは８０％或いは９０％以上も阻害するのであり、
それらは非常に優れたアンチセンス核酸化合物と言いえ
るものである。これらの阻害効果は、後述する培養細胞
系において確かめたものである。
【０００８】本発明のアンチセンス核酸化合物は、以下
に示すように、アンチセンス核酸法の考えに基づいて核
酸化合物を設計し、蛋白質である血管内皮細胞増殖因子
の産生量をもとに該蛋白質産生に及ぼす該化合物の効果
を評価して得られたものである。すなわち、まず血管内
皮細胞増殖因子(以下「ＶＥＧＦ」という)をコードする遺
伝子の翻訳上流部分の塩基配列を調査する。しかる後
に、該塩基配列に対して相補的な核酸化合物を合成化学
的手法などにより調製する。次に、該化合物のＶＥＧＦ
の産生阻害効果を培養細胞系を用いて確認する。すなわ
ち、ＶＥＧＦを産生する細胞を前記核酸化合物存在下で
培養し、該培養細胞においてＶＥＧＦの産生が抑制され
ているか否かを確かめ、ＶＥＧＦの産生を阻害する核酸
化合物をアンチセンス核酸化合物としたのである。特
に、本発明では、上記合成された核酸化合物存在下での
ＶＥＧＦ発現阻害率が、ランダムな塩基配列をもつ核酸
化合物によるＶＥＧＦ発現阻害率よりも大きい場合に、
有意に発現を阻害するアンチセンス核酸化合物とした。
なお、「ランダムな塩基配列」とは、目的とする蛋白質を
コードする遺伝子に対する相補性の程度が、統計的に期
待される相補性の程度又はそれ以下の程度である塩基配
列をいう。
に示すように、アンチセンス核酸法の考えに基づいて核
酸化合物を設計し、蛋白質である血管内皮細胞増殖因子
の産生量をもとに該蛋白質産生に及ぼす該化合物の効果
を評価して得られたものである。すなわち、まず血管内
皮細胞増殖因子(以下「ＶＥＧＦ」という)をコードする遺
伝子の翻訳上流部分の塩基配列を調査する。しかる後
に、該塩基配列に対して相補的な核酸化合物を合成化学
的手法などにより調製する。次に、該化合物のＶＥＧＦ
の産生阻害効果を培養細胞系を用いて確認する。すなわ
ち、ＶＥＧＦを産生する細胞を前記核酸化合物存在下で
培養し、該培養細胞においてＶＥＧＦの産生が抑制され
ているか否かを確かめ、ＶＥＧＦの産生を阻害する核酸
化合物をアンチセンス核酸化合物としたのである。特
に、本発明では、上記合成された核酸化合物存在下での
ＶＥＧＦ発現阻害率が、ランダムな塩基配列をもつ核酸
化合物によるＶＥＧＦ発現阻害率よりも大きい場合に、
有意に発現を阻害するアンチセンス核酸化合物とした。
なお、「ランダムな塩基配列」とは、目的とする蛋白質を
コードする遺伝子に対する相補性の程度が、統計的に期
待される相補性の程度又はそれ以下の程度である塩基配
列をいう。
【０００９】（１）核酸化合物の合成 核酸塩基の二重鎖形成エネルギーを計算し、ＶＥＧＦm
ＲＮＡの２次構造予測(杉本直巳、生物物理、33巻 2号
1−8 頁、日本生物物理学会誌、1993年)や部位予測(特
願平08-128192)などにより、アンチセンス核酸効果が予
想される領域、例えばＶＥＧＦmＲＮＡ中、二重鎖を形
成していないと予想される領域の塩基配列から、１０〜
３０塩基からなる塩基配列を選択し、該塩基配列に相補
的な核酸化合物を合成によって調製する。或いはＶＥＧ
Ｆをコードする塩基配列の全領域について、１〜１０塩
基ずつずらした１０〜３０塩基からなる塩基配列に相補
的な塩基配列を合成によって調製する。しかし、後者は
多大な時間的、金銭的、人的投資をする事が必要であ
り、効率が良くない。従って、前者の計算等を用いて効
果があると予想される領域を絞り込み、これについて実
験的にその効果を確認する方法が好ましい。核酸化合物
としては、天然型のオリゴデオキシリボヌクレオチド、
ホスホロチオエート型のオリゴデオキシリボヌクレオチ
ド、ホスホロジチオエート型のオリゴデオキシリボヌク
レオチド、メチルホスホネート型のオリゴデオキシリボ
ヌクレオチド、ホスホロアミデート型のオリゴデオキシ
リボヌクレオチド、Ｈ−ホスホネート型のオリゴデオキ
シリボヌクレオチド、トリエステル型のオリゴデオキシ
リボヌクレオチド、α−アノマー型のオリゴデオキシリ
ボヌクレオチド、上記の各オリゴデオキシリボヌクレオ
チドに対応するオリゴリボヌクレオチド、ペプチド核
酸、これらのキメラ型オリゴマー及びその他の人工核酸
や核酸修飾化合物等を挙げることができるが、天然型及
びホスホロチオエート型のオリゴデオキシリボヌクレオ
チドが、mＲＮＡと結合して二重鎖を形成したときにＲ
Ｎase Ｈの基質となる点、非特異的な発現阻害が少ない
点、合成が容易な点などから好ましい核酸化合物であ
る。
ＲＮＡの２次構造予測(杉本直巳、生物物理、33巻 2号
1−8 頁、日本生物物理学会誌、1993年)や部位予測(特
願平08-128192)などにより、アンチセンス核酸効果が予
想される領域、例えばＶＥＧＦmＲＮＡ中、二重鎖を形
成していないと予想される領域の塩基配列から、１０〜
３０塩基からなる塩基配列を選択し、該塩基配列に相補
的な核酸化合物を合成によって調製する。或いはＶＥＧ
Ｆをコードする塩基配列の全領域について、１〜１０塩
基ずつずらした１０〜３０塩基からなる塩基配列に相補
的な塩基配列を合成によって調製する。しかし、後者は
多大な時間的、金銭的、人的投資をする事が必要であ
り、効率が良くない。従って、前者の計算等を用いて効
果があると予想される領域を絞り込み、これについて実
験的にその効果を確認する方法が好ましい。核酸化合物
としては、天然型のオリゴデオキシリボヌクレオチド、
ホスホロチオエート型のオリゴデオキシリボヌクレオチ
ド、ホスホロジチオエート型のオリゴデオキシリボヌク
レオチド、メチルホスホネート型のオリゴデオキシリボ
ヌクレオチド、ホスホロアミデート型のオリゴデオキシ
リボヌクレオチド、Ｈ−ホスホネート型のオリゴデオキ
シリボヌクレオチド、トリエステル型のオリゴデオキシ
リボヌクレオチド、α−アノマー型のオリゴデオキシリ
ボヌクレオチド、上記の各オリゴデオキシリボヌクレオ
チドに対応するオリゴリボヌクレオチド、ペプチド核
酸、これらのキメラ型オリゴマー及びその他の人工核酸
や核酸修飾化合物等を挙げることができるが、天然型及
びホスホロチオエート型のオリゴデオキシリボヌクレオ
チドが、mＲＮＡと結合して二重鎖を形成したときにＲ
Ｎase Ｈの基質となる点、非特異的な発現阻害が少ない
点、合成が容易な点などから好ましい核酸化合物であ
る。
【００１０】天然型の核酸化合物の合成は、例えば、Ａ
ＢＩ(Applied Biosystems Inc.)社製の３８１Ａ ＤＮＡ
合成機又は同社製の３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を用
いて、ホスフォアミダイト法(ABI社の手順書又はF.Ecks
tein編 Oligonucleotides and Analogues : A Practica
l Approach, IRL Press, 1991年を参照)により行うこと
ができる。また、パーセプティブ(PerSeptive Biosyste
ms)社製のＥxpediteＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を用いて、あ
るいはファルマシアバイオテク(PharmaciaBiotec)社製
のＧene Ａssmblerを用いても同様な手法で合成するこ
とができる。ホスフォアミダイト法とは、修飾デオキシ
リボヌクレオシド又は修飾リボヌクレオシドの３'末端
にシアノエチル基などで保護したホスフォアミダイトを
結合した試薬を用いて、別の修飾デオキシリボヌクレオ
シド、修飾リボヌクレオシド、オリゴ修飾デオキシリボ
ヌクレオチド、オリゴ修飾リボヌクレオチド等の５'末
端に縮合させることを基本とするオリゴデオキシリボヌ
クレオチドやオリゴリボヌクレオチドなど核酸関連化合
物の合成法である。そして、合成の最終サイクルにおい
て、５'末端の糖水酸基の保護基(ジメトキシトリチル基
等)が結合した状態で合成を終了する。室温下で合成し
たオリゴマーをサポートから切断後、塩基部分及びリン
酸部分の脱保護を行う。このようにして天然型オリゴ核
酸の粗精製物を得る。ホスホロチオエート型の核酸化合
物も上述の天然型と同様、先述の合成機を用いてホスフ
ォアミダイト法で合成することができる。この場合、ホ
スフォアミダイト法の合成サイクル中、酸化工程を硫化
試薬を用いた硫化工程に変更することにより可能とな
る。合成の最終サイクル以降の処理も上述の天然型の場
合と同様である。
ＢＩ(Applied Biosystems Inc.)社製の３８１Ａ ＤＮＡ
合成機又は同社製の３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を用
いて、ホスフォアミダイト法(ABI社の手順書又はF.Ecks
tein編 Oligonucleotides and Analogues : A Practica
l Approach, IRL Press, 1991年を参照)により行うこと
ができる。また、パーセプティブ(PerSeptive Biosyste
ms)社製のＥxpediteＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を用いて、あ
るいはファルマシアバイオテク(PharmaciaBiotec)社製
のＧene Ａssmblerを用いても同様な手法で合成するこ
とができる。ホスフォアミダイト法とは、修飾デオキシ
リボヌクレオシド又は修飾リボヌクレオシドの３'末端
にシアノエチル基などで保護したホスフォアミダイトを
結合した試薬を用いて、別の修飾デオキシリボヌクレオ
シド、修飾リボヌクレオシド、オリゴ修飾デオキシリボ
ヌクレオチド、オリゴ修飾リボヌクレオチド等の５'末
端に縮合させることを基本とするオリゴデオキシリボヌ
クレオチドやオリゴリボヌクレオチドなど核酸関連化合
物の合成法である。そして、合成の最終サイクルにおい
て、５'末端の糖水酸基の保護基(ジメトキシトリチル基
等)が結合した状態で合成を終了する。室温下で合成し
たオリゴマーをサポートから切断後、塩基部分及びリン
酸部分の脱保護を行う。このようにして天然型オリゴ核
酸の粗精製物を得る。ホスホロチオエート型の核酸化合
物も上述の天然型と同様、先述の合成機を用いてホスフ
ォアミダイト法で合成することができる。この場合、ホ
スフォアミダイト法の合成サイクル中、酸化工程を硫化
試薬を用いた硫化工程に変更することにより可能とな
る。合成の最終サイクル以降の処理も上述の天然型の場
合と同様である。
【００１１】遺伝子の発現を阻害するためには、本発明
者らが先に明らかにした様に、遺伝子の塩基配列のう
ち、１０個以上の連続塩基配列、好ましくは１３個以上
の連続塩基配列、より好ましくは２０個以上の連続塩基
配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸化合物であ
ることが必要であり、ここで述べた条件にあてはまるな
らば、塩基の数は限定されないが、３０個以上の相補的
な塩基配列を有しても格別に効果に優れるということは
なく、合成・精製等が困難になるばかりであるから、３
０個以下の相補的配列を有する核酸化合物で本発明の目
的は十分に達成されるので、その範囲の鎖長の核酸化合
物を目的として合成すればよい。
者らが先に明らかにした様に、遺伝子の塩基配列のう
ち、１０個以上の連続塩基配列、好ましくは１３個以上
の連続塩基配列、より好ましくは２０個以上の連続塩基
配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸化合物であ
ることが必要であり、ここで述べた条件にあてはまるな
らば、塩基の数は限定されないが、３０個以上の相補的
な塩基配列を有しても格別に効果に優れるということは
なく、合成・精製等が困難になるばかりであるから、３
０個以下の相補的配列を有する核酸化合物で本発明の目
的は十分に達成されるので、その範囲の鎖長の核酸化合
物を目的として合成すればよい。
【００１２】得られた核酸化合物の粗精製物は、通常の
精製方法、例えば、エタノール沈殿法を用いたり、ま
た、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラ
フィー及びゲル濾過クロマトグラフィーの原理に基づく
高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)、超臨界クロマ
トグラフィーなど種々のクロマトグラフィー、さらに
は、電気泳動法を用いて精製することができる。このほ
か、逆相クロマトグラフィーの原理に基づいて製造され
たカートリッジ[例えば、tＣ18を充填剤とするセップパ
ックプラス；Waters社製]を用いることもできる。ホス
ホロチオエート型の核酸化合物(２０量体、粗精製品で
約３mg)の精製も上述の天然型の場合と同様である。な
お、天然型及びホスホロチオエート型の核酸化合物の純
度は、ＨＰＬＣ分析、キャピラリーゲル電気泳動等によ
り調べることが可能である。合成した核酸化合物は、後
述するスクリーニングに用いられる。
精製方法、例えば、エタノール沈殿法を用いたり、ま
た、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラ
フィー及びゲル濾過クロマトグラフィーの原理に基づく
高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)、超臨界クロマ
トグラフィーなど種々のクロマトグラフィー、さらに
は、電気泳動法を用いて精製することができる。このほ
か、逆相クロマトグラフィーの原理に基づいて製造され
たカートリッジ[例えば、tＣ18を充填剤とするセップパ
ックプラス；Waters社製]を用いることもできる。ホス
ホロチオエート型の核酸化合物(２０量体、粗精製品で
約３mg)の精製も上述の天然型の場合と同様である。な
お、天然型及びホスホロチオエート型の核酸化合物の純
度は、ＨＰＬＣ分析、キャピラリーゲル電気泳動等によ
り調べることが可能である。合成した核酸化合物は、後
述するスクリーニングに用いられる。
【００１３】（２）培養細胞系でのアンチセンス核酸効
果 本発明のアンチセンス核酸化合物が治療剤又は診断剤と
して有用であることを裏付ける薬理試験は、ＶＥＧＦを
発現する培養細胞に、（１）で合成された核酸化合物を
単独あるいは細胞内導入試薬と共に添加し、ＶＥＧＦの
発現阻害を調べることにより行うことができる。すなわ
ち、無菌状況下において、ヒト、マウス、ラット、モル
モット、ウシなどの哺乳動物由来の細胞に、天然型のオ
リゴデオキシリボヌクレオチド又はホスホロチオエート
型オリゴデオキシリボヌクレオチドなどのアンチセンス
核酸化合物０.０１〜１００μＭ、好ましくは０.１〜１
０μＭを、必要に応じてリポフェクチン試薬、リポフェ
クトアミン試薬、ＤＯＴＡＰ試薬、人工合成脂質ベシク
ル、リポソーム、膜融合試薬、高分子ミセル化試薬、高
分子坦体、Ｔfx試薬又はその他の細胞内導入試薬ととも
に加え、それによる標的蛋白質の発現阻害を、例えば、
ＶＥＧＦに対する抗体などを用いたＥＬＩＳＡやウエス
タンブロッティングなどで調べることにより、用いたア
ンチセンス核酸化合物の蛋白質発現阻害効果を確かめる
ことができる。
果 本発明のアンチセンス核酸化合物が治療剤又は診断剤と
して有用であることを裏付ける薬理試験は、ＶＥＧＦを
発現する培養細胞に、（１）で合成された核酸化合物を
単独あるいは細胞内導入試薬と共に添加し、ＶＥＧＦの
発現阻害を調べることにより行うことができる。すなわ
ち、無菌状況下において、ヒト、マウス、ラット、モル
モット、ウシなどの哺乳動物由来の細胞に、天然型のオ
リゴデオキシリボヌクレオチド又はホスホロチオエート
型オリゴデオキシリボヌクレオチドなどのアンチセンス
核酸化合物０.０１〜１００μＭ、好ましくは０.１〜１
０μＭを、必要に応じてリポフェクチン試薬、リポフェ
クトアミン試薬、ＤＯＴＡＰ試薬、人工合成脂質ベシク
ル、リポソーム、膜融合試薬、高分子ミセル化試薬、高
分子坦体、Ｔfx試薬又はその他の細胞内導入試薬ととも
に加え、それによる標的蛋白質の発現阻害を、例えば、
ＶＥＧＦに対する抗体などを用いたＥＬＩＳＡやウエス
タンブロッティングなどで調べることにより、用いたア
ンチセンス核酸化合物の蛋白質発現阻害効果を確かめる
ことができる。
【００１４】上述の培養細胞系でＶＥＧＦの生成を確認
する方法としては、例えば以下の２つが挙げられる。第
一の方法として、ＶＥＧＦに対するポリクローナル抗体
[ヒト由来のＶＥＧＦを大腸菌に産生させ、その産生物
を兎に投与して得た抗体(S.Kondoら、Biochemical and
Biophysical Research Communications 194 巻 3号 123
4-1241頁, 1993年を参照)]を用いたサンドイッチ方式の
酵素免疫測定法(例えばE.Harlow及びD.Lane著, Antibod
ies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labo
ratory, 1988年)が挙げられる。この方法は一般的によ
く知られており、具体的には以下の通りである。マイク
ロタイタープレートに上述のポリクローナル抗体を常法
(例えば、上掲のAntibodies: A Laboratory Manual)に
従って固定化し、ついで、上述のＶＥＧＦを発現する培
養細胞を適当な温度で適当な時間保った反応混合液をマ
イクロタイタープレートに入れ、室温で放置したあと洗
浄する。しかる後に、西洋ワサビペルオキシダーゼで標
識した上述のポリクローナル抗体を添加して室温で放置
した後に洗浄し、基質であるオルト−ジアミノベンゼン
溶液を加え、適度に発色するまで室温で放置後、吸光度
を測定し、ＶＥＧＦの含有量を評価する。第二の方法と
して、ＶＥＧＦが上述の培養細胞系で生成することをＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ(ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法)後、膜に蛋白質の泳動像を転
写し、目的の蛋白質を標識化した抗体と反応させ、これ
をオートラジオグラフィーで確認するウエスタンブロッ
ト法が挙げられる。ウエスタンブロット法は、常法(例
えば、大野茂男ら編著、蛋白実験プロトコール、秀潤
社、1997年)に従えばよく、典型的な例は、次のとおり
である。培養細胞の培養液にSDS Sample Buffer を加え
て蛋白質を変性させる。このサンプルを泳動槽に取り付
けたドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
のウェルに添加し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ(１５％又は１７.
５％のポリアクリルアミドゲル)で高次構造を変性させ
たまま電気泳動を行う。その後、ニトロセルロース膜あ
るいはナイロン膜等と泳動後のゲルを重ね合わせ、ブロ
ッティング装置などで泳動像を膜に転写(ブロット)させ
る。非特異的反応を防ぐため、この膜を５％スキムミル
ク液等であらかじめブロッキングする。この後、放射性
物質、例えば125Ｉで標識化したＶＥＧＦ抗体溶液を接
触させ、膜上に転写されたＶＥＧＦをＶＥＧＦ抗体と特
異的に結合させる。洗浄により、非特異的に吸着したＶ
ＥＧＦ抗体を除去した後、オートラジオグラフィーを行
う。すなわち暗室中でそのゲルをＸ線用フィルムと重ね
てカセットに入れ、数時間から数十時間、室温で放置し
たあと、該Ｘ線用フィルムを現像する。ＶＥＧＦをコー
ドする遺伝子が発現していれば、ＶＥＧＦの分子量に応
じた位置にバンドが出現する。アンチセンス核酸化合物
によって該遺伝子の発現が阻害されている場合には、該
バンドは発現しないか又は発現が弱くなる。
する方法としては、例えば以下の２つが挙げられる。第
一の方法として、ＶＥＧＦに対するポリクローナル抗体
[ヒト由来のＶＥＧＦを大腸菌に産生させ、その産生物
を兎に投与して得た抗体(S.Kondoら、Biochemical and
Biophysical Research Communications 194 巻 3号 123
4-1241頁, 1993年を参照)]を用いたサンドイッチ方式の
酵素免疫測定法(例えばE.Harlow及びD.Lane著, Antibod
ies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labo
ratory, 1988年)が挙げられる。この方法は一般的によ
く知られており、具体的には以下の通りである。マイク
ロタイタープレートに上述のポリクローナル抗体を常法
(例えば、上掲のAntibodies: A Laboratory Manual)に
従って固定化し、ついで、上述のＶＥＧＦを発現する培
養細胞を適当な温度で適当な時間保った反応混合液をマ
イクロタイタープレートに入れ、室温で放置したあと洗
浄する。しかる後に、西洋ワサビペルオキシダーゼで標
識した上述のポリクローナル抗体を添加して室温で放置
した後に洗浄し、基質であるオルト−ジアミノベンゼン
溶液を加え、適度に発色するまで室温で放置後、吸光度
を測定し、ＶＥＧＦの含有量を評価する。第二の方法と
して、ＶＥＧＦが上述の培養細胞系で生成することをＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ(ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法)後、膜に蛋白質の泳動像を転
写し、目的の蛋白質を標識化した抗体と反応させ、これ
をオートラジオグラフィーで確認するウエスタンブロッ
ト法が挙げられる。ウエスタンブロット法は、常法(例
えば、大野茂男ら編著、蛋白実験プロトコール、秀潤
社、1997年)に従えばよく、典型的な例は、次のとおり
である。培養細胞の培養液にSDS Sample Buffer を加え
て蛋白質を変性させる。このサンプルを泳動槽に取り付
けたドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
のウェルに添加し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ(１５％又は１７.
５％のポリアクリルアミドゲル)で高次構造を変性させ
たまま電気泳動を行う。その後、ニトロセルロース膜あ
るいはナイロン膜等と泳動後のゲルを重ね合わせ、ブロ
ッティング装置などで泳動像を膜に転写(ブロット)させ
る。非特異的反応を防ぐため、この膜を５％スキムミル
ク液等であらかじめブロッキングする。この後、放射性
物質、例えば125Ｉで標識化したＶＥＧＦ抗体溶液を接
触させ、膜上に転写されたＶＥＧＦをＶＥＧＦ抗体と特
異的に結合させる。洗浄により、非特異的に吸着したＶ
ＥＧＦ抗体を除去した後、オートラジオグラフィーを行
う。すなわち暗室中でそのゲルをＸ線用フィルムと重ね
てカセットに入れ、数時間から数十時間、室温で放置し
たあと、該Ｘ線用フィルムを現像する。ＶＥＧＦをコー
ドする遺伝子が発現していれば、ＶＥＧＦの分子量に応
じた位置にバンドが出現する。アンチセンス核酸化合物
によって該遺伝子の発現が阻害されている場合には、該
バンドは発現しないか又は発現が弱くなる。
【００１５】添加した核酸化合物、すなわち、アンチセ
ンス核酸化合物のＶＥＧＦをコードする遺伝子に対する
発現阻害効果は、それを添加しない場合と比較すること
で行うことができる。例えば、前記のＶＥＧＦが生成す
るか否かの確認方法に記載の通り、産生したＶＥＧＦを
前記サンドイッチ方式の酵素免疫測定法で定量するか、
あるいは前記ウエスタンブロット法を行い、得られたオ
ートラジオグラフィーの黒化度をデンシトメータで定量
すればよい。そして、アンチセンス核酸化合物を添加し
た場合と添加しない場合の定量値とを比較することによ
り確認することができる。この定量値は、細胞培養単位
当たりの細胞数で補正する必要がある。これは、以下の
２点の理由によるものである。１つは、秤量誤差による
ものである。例えば、一定容量の細胞懸濁液を培養プレ
ートの各穴に添加し培養を開始するとする。懸濁液を分
取した時に、秤量誤差が生ずる。この秤量誤差とは、一
定量を再現性よく繰り返し分取することが困難であるこ
とや、細胞懸濁液が不均一であること等に起因してい
る。次には、添加した試料・試薬が細胞に対して毒性を
持つ場合である。例えば、核酸化合物のある配列では特
異的な蛋白質阻害作用が知られており(例えば、Arthur
M. Kriegら、Antisense & Nucleic Acid Drug Developm
ent 7巻 115-123頁、1997年；C.A.Steinら、Science 26
1巻 1004-1012頁、1993年を参照)、これによる細胞数の
減少が起こりうる。これらにより、細胞培養単位当たり
でのＶＥＧＦ発現量では、正確な比較ができない場合が
ある。このため、正確なＶＥＧＦ発現量の比較には、細
胞培養単位当たりの生細胞数による補正が必要となる。
上述の培養細胞系で生細胞数を確認する方法としては、
例えば以下の２つが挙げられる。第一の方法としては、
セルカウント法と呼ばれる古典的な顕微鏡を用いた細胞
数の計測がある。このとき、細胞を含む溶液に１／２５
容程度の０.５％トリパン青溶液を加える。生細胞はト
リパン青に染まらず死細胞は染まることを利用して、染
まらなかった細胞のみを顕鏡下で計数することで、生細
胞のみを計測する事ができる。第二の方法としては、生
細胞の生体反応を利用するＭＴＴ法がある。ＭＴＴ(3-
(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
bromide，水溶性，黄色)は、生細胞のミトコンドリ
ア、特にその呼吸鎖に選択的に作用し、ＭＴＴが開裂さ
れ、ＭＴＴフォルマザン(水不溶性，紫色)になることが
知られている。ＭＴＴを加えた培地で細胞を培養した場
合、一定時間後に産生されるＭＴＴフォルマザン量は、
生細胞数に比例するため、生細胞数の計測に利用される
(例えば、西田正人ら、Human Cell 5巻 1号 87-98頁、1
992年；J.Carmichaelら、 Cancer Research 47巻 936-94
2頁、1987年を参照)。生細胞数での補正を含めたかかる
比較によって、遺伝子の発現阻害率を求めることができ
る。
ンス核酸化合物のＶＥＧＦをコードする遺伝子に対する
発現阻害効果は、それを添加しない場合と比較すること
で行うことができる。例えば、前記のＶＥＧＦが生成す
るか否かの確認方法に記載の通り、産生したＶＥＧＦを
前記サンドイッチ方式の酵素免疫測定法で定量するか、
あるいは前記ウエスタンブロット法を行い、得られたオ
ートラジオグラフィーの黒化度をデンシトメータで定量
すればよい。そして、アンチセンス核酸化合物を添加し
た場合と添加しない場合の定量値とを比較することによ
り確認することができる。この定量値は、細胞培養単位
当たりの細胞数で補正する必要がある。これは、以下の
２点の理由によるものである。１つは、秤量誤差による
ものである。例えば、一定容量の細胞懸濁液を培養プレ
ートの各穴に添加し培養を開始するとする。懸濁液を分
取した時に、秤量誤差が生ずる。この秤量誤差とは、一
定量を再現性よく繰り返し分取することが困難であるこ
とや、細胞懸濁液が不均一であること等に起因してい
る。次には、添加した試料・試薬が細胞に対して毒性を
持つ場合である。例えば、核酸化合物のある配列では特
異的な蛋白質阻害作用が知られており(例えば、Arthur
M. Kriegら、Antisense & Nucleic Acid Drug Developm
ent 7巻 115-123頁、1997年；C.A.Steinら、Science 26
1巻 1004-1012頁、1993年を参照)、これによる細胞数の
減少が起こりうる。これらにより、細胞培養単位当たり
でのＶＥＧＦ発現量では、正確な比較ができない場合が
ある。このため、正確なＶＥＧＦ発現量の比較には、細
胞培養単位当たりの生細胞数による補正が必要となる。
上述の培養細胞系で生細胞数を確認する方法としては、
例えば以下の２つが挙げられる。第一の方法としては、
セルカウント法と呼ばれる古典的な顕微鏡を用いた細胞
数の計測がある。このとき、細胞を含む溶液に１／２５
容程度の０.５％トリパン青溶液を加える。生細胞はト
リパン青に染まらず死細胞は染まることを利用して、染
まらなかった細胞のみを顕鏡下で計数することで、生細
胞のみを計測する事ができる。第二の方法としては、生
細胞の生体反応を利用するＭＴＴ法がある。ＭＴＴ(3-
(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
bromide，水溶性，黄色)は、生細胞のミトコンドリ
ア、特にその呼吸鎖に選択的に作用し、ＭＴＴが開裂さ
れ、ＭＴＴフォルマザン(水不溶性，紫色)になることが
知られている。ＭＴＴを加えた培地で細胞を培養した場
合、一定時間後に産生されるＭＴＴフォルマザン量は、
生細胞数に比例するため、生細胞数の計測に利用される
(例えば、西田正人ら、Human Cell 5巻 1号 87-98頁、1
992年；J.Carmichaelら、 Cancer Research 47巻 936-94
2頁、1987年を参照)。生細胞数での補正を含めたかかる
比較によって、遺伝子の発現阻害率を求めることができ
る。
【００１６】このようにして得られたアンチセンス核酸
化合物は、固形腫瘍細胞の増殖阻害、あるいはリューマ
チ性関節炎や糖尿病性網膜症などの治療を目的とする治
療剤として、また癌やその他の病気の診断剤として有用
である。本発明のアンチセンス核酸化合物を治療剤とし
て投与する場合には、投与する対象を特に限定しない。
例えば、個々の癌種の予防あるいは治療することを特異
目的として用いることができる。また、投与する方法は
経口又は非経口でもよく、経口投与には舌下投与を包含
する。非経口投与には、注射、例えば皮下、筋肉、静
脈、動脈注射、点滴、坐剤、塗布剤、貼着剤等を含む。
また、その投与量は動物か人間かによって、また、年
齢、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変える
ことができる。この場合、本発明のアンチセンス核酸化
合物の有効量と適切な希釈剤及び薬理学的に使用し得る
担体の組成物として投与される有効量は１〜１００,０
００μg/kg体重/日であり、連続的にあるいは１日１回
から数回に分けて、または数日毎に１回投与される。本
発明のアンチセンス核酸化合物を経口投与する場合、そ
れに適用される錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、カプセル
剤等は、通常それらの組成物中に製剤上一般に使用され
る結合剤、包含剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤の
ような添加物を含有する。また、経口用液体製剤として
は、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等いずれの状
態であってもよく、また、使用する際に再溶解させる乾
燥生成物であってもよい。更に、その組成物は添加剤、
保存剤のいずれを含有してもよい。また、非経口投与の
場合には、安定剤、緩衝剤、保存剤、等張化剤等の添加
剤を含有し、通常単位投与量アンプル若しくは多投与量
容器又はチューブの状態で提供される。上記の組成物は
使用する際に適当な担体、例えば発熱物質不含の滅菌し
た水で再溶解させる粉体を含んでいてもよい。本発明の
アンチセンス核酸化合物を診断剤として使用するには、
例えば、以下の場合が挙げられる。癌細胞は、一般にＶ
ＥＧＦを発現していることが知られていることを利用
し、ＶＥＧＦをコードする遺伝子あるいは該遺伝子に対
応するmＲＮＡの特定の塩基配列に相補的な塩基配列を
もつ核酸化合物をプローブとして用いて、ＶＥＧＦの発
現の程度を知ることができる。この際、mＲＮＡの特定
の塩基配列に相補的な塩基配列として、すなわちプロー
ブとして用いる核酸化合物の塩基配列として、本発明の
アンチセンス核酸化合物の塩基配列を用いることができ
る。
化合物は、固形腫瘍細胞の増殖阻害、あるいはリューマ
チ性関節炎や糖尿病性網膜症などの治療を目的とする治
療剤として、また癌やその他の病気の診断剤として有用
である。本発明のアンチセンス核酸化合物を治療剤とし
て投与する場合には、投与する対象を特に限定しない。
例えば、個々の癌種の予防あるいは治療することを特異
目的として用いることができる。また、投与する方法は
経口又は非経口でもよく、経口投与には舌下投与を包含
する。非経口投与には、注射、例えば皮下、筋肉、静
脈、動脈注射、点滴、坐剤、塗布剤、貼着剤等を含む。
また、その投与量は動物か人間かによって、また、年
齢、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変える
ことができる。この場合、本発明のアンチセンス核酸化
合物の有効量と適切な希釈剤及び薬理学的に使用し得る
担体の組成物として投与される有効量は１〜１００,０
００μg/kg体重/日であり、連続的にあるいは１日１回
から数回に分けて、または数日毎に１回投与される。本
発明のアンチセンス核酸化合物を経口投与する場合、そ
れに適用される錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、カプセル
剤等は、通常それらの組成物中に製剤上一般に使用され
る結合剤、包含剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤の
ような添加物を含有する。また、経口用液体製剤として
は、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等いずれの状
態であってもよく、また、使用する際に再溶解させる乾
燥生成物であってもよい。更に、その組成物は添加剤、
保存剤のいずれを含有してもよい。また、非経口投与の
場合には、安定剤、緩衝剤、保存剤、等張化剤等の添加
剤を含有し、通常単位投与量アンプル若しくは多投与量
容器又はチューブの状態で提供される。上記の組成物は
使用する際に適当な担体、例えば発熱物質不含の滅菌し
た水で再溶解させる粉体を含んでいてもよい。本発明の
アンチセンス核酸化合物を診断剤として使用するには、
例えば、以下の場合が挙げられる。癌細胞は、一般にＶ
ＥＧＦを発現していることが知られていることを利用
し、ＶＥＧＦをコードする遺伝子あるいは該遺伝子に対
応するmＲＮＡの特定の塩基配列に相補的な塩基配列を
もつ核酸化合物をプローブとして用いて、ＶＥＧＦの発
現の程度を知ることができる。この際、mＲＮＡの特定
の塩基配列に相補的な塩基配列として、すなわちプロー
ブとして用いる核酸化合物の塩基配列として、本発明の
アンチセンス核酸化合物の塩基配列を用いることができ
る。
【００１７】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明する。 （１）ホスホロチオエート型の核酸化合物の合成及び精
製 ホスホロチオエート型の核酸化合物(２０量体、粗精製
品で約３mg)の合成及び精製は以下のように行った。Ａ
ＢＩ(Applied Biosystems Inc.)社の３８１Ａ ＤＮＡ合
成機及び同社の３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を用い、
ホスホロアミダイト法(ABI社の手順書に従った)で配列
番号１の塩基配列に相補的な配列をもつものとランダム
な配列をもつ２０塩基のホスホロチオエート型オリゴデ
オキシリボヌクレオチドを合成した。これらは、表１の
U0370TS からU0865TS までの１８種類である。合成の最
終サイクルにおいて、５'末端の糖水酸基の保護基(ジメ
トキシトリチル基)が結合した状態で合成を終了した。
室温下において、約３０％のアンモニア水で６０分間処
理し、合成したオリゴマーをサポートから切断した。こ
れを５５℃で８時間保ち、塩基部分及びリン酸部分の脱
保護を行った。このようにして得たホスホロチオエート
型オリゴデオキシリボヌクレオチドの粗精製物を逆相Ｈ
ＰＬＣ法を用いて以下の通り精製した。逆相ＨＰＬＣカ
ラム(Waters社製μ-Bondasphere，Ｃ18，300Å，５μ，
１５０mm長)を５％アセトニトリル−９５％ＴＥＡＡ(TE
AA: 0.1M 酢酸トリエチルアンモニウムpH7.2)溶液で平
衡化した。このカラムにホスホロチオエート型オリゴデ
オキシリボヌクレオチド粗製物を負荷した。２５℃、流
速１ml/分の条件で、アセトニトリル２％/分の直線勾配
をかけて溶出した。２６０nmでモニターし、溶出開始か
ら2 5 〜３０分の間に溶出する５'末端の糖水酸基の保
護基(ジメトキシトリチル基)が結合した状態の目的２０
量体を分取した。分取した溶液を減圧乾固した後、４０
％酢酸を加え攪拌後室温にて放置し、ジメトキシトリチ
ル基を５'末端の糖水酸基から脱離させた。１時間後、
等量の滅菌水を加え攪拌し、さらに２倍量のジエチルエ
ーテルを加え激しく攪拌した。２層になるまで静置し
て、上層(脱離したジメトキシトリチル基を含むエーテ
ル層)を除去した。このエーテル抽出を４回繰り返す。
これを真空下で乾固した後、滅菌水０.５mlを加え十分
に攪拌した。これをイオン交換担体Ｄawex-50(Aldrich
社)を充填したカラムに負荷し、滅菌水を十分に通し
た。続いて、塩化ナトリウム溶液で０.１M/分でグラジ
エントをかけ、ホスホロチオエート型オリゴデオキシリ
ボヌクレオチド溶出させた。２６０nmでモニターし、目
的物を分取した。この後、十分に透析し、過剰の塩化ナ
トリウムを除いた。
明する。 （１）ホスホロチオエート型の核酸化合物の合成及び精
製 ホスホロチオエート型の核酸化合物(２０量体、粗精製
品で約３mg)の合成及び精製は以下のように行った。Ａ
ＢＩ(Applied Biosystems Inc.)社の３８１Ａ ＤＮＡ合
成機及び同社の３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を用い、
ホスホロアミダイト法(ABI社の手順書に従った)で配列
番号１の塩基配列に相補的な配列をもつものとランダム
な配列をもつ２０塩基のホスホロチオエート型オリゴデ
オキシリボヌクレオチドを合成した。これらは、表１の
U0370TS からU0865TS までの１８種類である。合成の最
終サイクルにおいて、５'末端の糖水酸基の保護基(ジメ
トキシトリチル基)が結合した状態で合成を終了した。
室温下において、約３０％のアンモニア水で６０分間処
理し、合成したオリゴマーをサポートから切断した。こ
れを５５℃で８時間保ち、塩基部分及びリン酸部分の脱
保護を行った。このようにして得たホスホロチオエート
型オリゴデオキシリボヌクレオチドの粗精製物を逆相Ｈ
ＰＬＣ法を用いて以下の通り精製した。逆相ＨＰＬＣカ
ラム(Waters社製μ-Bondasphere，Ｃ18，300Å，５μ，
１５０mm長)を５％アセトニトリル−９５％ＴＥＡＡ(TE
AA: 0.1M 酢酸トリエチルアンモニウムpH7.2)溶液で平
衡化した。このカラムにホスホロチオエート型オリゴデ
オキシリボヌクレオチド粗製物を負荷した。２５℃、流
速１ml/分の条件で、アセトニトリル２％/分の直線勾配
をかけて溶出した。２６０nmでモニターし、溶出開始か
ら2 5 〜３０分の間に溶出する５'末端の糖水酸基の保
護基(ジメトキシトリチル基)が結合した状態の目的２０
量体を分取した。分取した溶液を減圧乾固した後、４０
％酢酸を加え攪拌後室温にて放置し、ジメトキシトリチ
ル基を５'末端の糖水酸基から脱離させた。１時間後、
等量の滅菌水を加え攪拌し、さらに２倍量のジエチルエ
ーテルを加え激しく攪拌した。２層になるまで静置し
て、上層(脱離したジメトキシトリチル基を含むエーテ
ル層)を除去した。このエーテル抽出を４回繰り返す。
これを真空下で乾固した後、滅菌水０.５mlを加え十分
に攪拌した。これをイオン交換担体Ｄawex-50(Aldrich
社)を充填したカラムに負荷し、滅菌水を十分に通し
た。続いて、塩化ナトリウム溶液で０.１M/分でグラジ
エントをかけ、ホスホロチオエート型オリゴデオキシリ
ボヌクレオチド溶出させた。２６０nmでモニターし、目
的物を分取した。この後、十分に透析し、過剰の塩化ナ
トリウムを除いた。
【００１８】この様にした得たホスホロチオエート型オ
リゴデオキシリボヌクレオチド精製品の純度は、逆相Ｈ
ＰＬＣ、キャピラリーゲル電気泳動、31Ｐ−ＮＭＲ及び
紫外線吸収スペクトルにより調べた。分析条件等は、次
の通りである。 （ｉ）逆相ＨＰＬＣ分析 カラム：μ-Bondasphere(Ｃ18, 300Å, ５μ，3.9×150
mm, Waters社製） 緩衝液：アセトニトリル−100mM 酢酸-トリエチルアン
モニウム液（pH7.2) 溶出勾配：アセトニトリル5%→85% ／40分、直線勾配 温度：25℃ 検出波長：２６０nm U0853TS の測定結果を図１に示す。 （ii）キャピラリーゲル電気泳動分析 カラム：μPAGE(5%T, 5%C ホ゜リアクリルアミト゛ケ゛ル, 7M尿素、75
μm×55cm、J & W社製) 緩衝液：100mM トリス- 硼酸緩衝液（pH8.3 ）、７Ｍ尿
素 電圧：２３０Ｖ／cm 温度：室温 検出波長：２６０nm U0853TS の測定結果を図２に示す。 （iii) 31Ｐ−ＮＭＲ分析 測定溶媒：重水 共鳴周波数：１６２ＭＨz 温度：室温 外部標準：トリメトキシホスフィン（140.0ppm） U0853TS の測定結果を図３に示す。 （iv）紫外線吸収スペクトル分析 溶媒：20m Ｍリン酸ナトリウム及び100mＭ塩化ナトリウ
ムpH7.0 U0853TS の測定結果を図４に示す。図１乃至図３から、
これらの該化合物は本発明の実験に用いるのに充分な純
度を有し、また図４から、これらの該化合物の紫外線吸
収スペクトルは核酸化合物が示す紫外線吸収スペクトル
に一致することがわかる。
リゴデオキシリボヌクレオチド精製品の純度は、逆相Ｈ
ＰＬＣ、キャピラリーゲル電気泳動、31Ｐ−ＮＭＲ及び
紫外線吸収スペクトルにより調べた。分析条件等は、次
の通りである。 （ｉ）逆相ＨＰＬＣ分析 カラム：μ-Bondasphere(Ｃ18, 300Å, ５μ，3.9×150
mm, Waters社製） 緩衝液：アセトニトリル−100mM 酢酸-トリエチルアン
モニウム液（pH7.2) 溶出勾配：アセトニトリル5%→85% ／40分、直線勾配 温度：25℃ 検出波長：２６０nm U0853TS の測定結果を図１に示す。 （ii）キャピラリーゲル電気泳動分析 カラム：μPAGE(5%T, 5%C ホ゜リアクリルアミト゛ケ゛ル, 7M尿素、75
μm×55cm、J & W社製) 緩衝液：100mM トリス- 硼酸緩衝液（pH8.3 ）、７Ｍ尿
素 電圧：２３０Ｖ／cm 温度：室温 検出波長：２６０nm U0853TS の測定結果を図２に示す。 （iii) 31Ｐ−ＮＭＲ分析 測定溶媒：重水 共鳴周波数：１６２ＭＨz 温度：室温 外部標準：トリメトキシホスフィン（140.0ppm） U0853TS の測定結果を図３に示す。 （iv）紫外線吸収スペクトル分析 溶媒：20m Ｍリン酸ナトリウム及び100mＭ塩化ナトリウ
ムpH7.0 U0853TS の測定結果を図４に示す。図１乃至図３から、
これらの該化合物は本発明の実験に用いるのに充分な純
度を有し、また図４から、これらの該化合物の紫外線吸
収スペクトルは核酸化合物が示す紫外線吸収スペクトル
に一致することがわかる。
【００１９】合成したホスホロチオエート型オリゴデオ
キシリボヌクレオチドの塩基配列を表１に示す。表１の
「試料＃」において、数字の前に書かれている「Ｕ」
は、ＶＥＧＦをコードする核酸の翻訳上流部分のセンス
鎖に対する相補鎖であること、すなわち、アンチセンス
鎖に相当することを意味する。また、「Ｒ」はランダム
配列であることを意味する。例えば、「RU0406」は「U0
406 」と同一の塩基組成であるが、その順序をランダム
に入れ換えたものである。各試料＃に対応する２０量体
の配列を、表１の「塩基配列」の欄に記載してある。
「配列１での相補範囲」の欄の数字は各オリゴデオキシ
リボヌクレオチドが対応する、配列番号１で表される塩
基配列の範囲を表す。例えば、「U0370 」は、配列番号
１の配列表の308 番目から327 番目の塩基に相補的な塩
基の配列からなる２０量体のいわゆるアンチセンス核酸
化合物である。
キシリボヌクレオチドの塩基配列を表１に示す。表１の
「試料＃」において、数字の前に書かれている「Ｕ」
は、ＶＥＧＦをコードする核酸の翻訳上流部分のセンス
鎖に対する相補鎖であること、すなわち、アンチセンス
鎖に相当することを意味する。また、「Ｒ」はランダム
配列であることを意味する。例えば、「RU0406」は「U0
406 」と同一の塩基組成であるが、その順序をランダム
に入れ換えたものである。各試料＃に対応する２０量体
の配列を、表１の「塩基配列」の欄に記載してある。
「配列１での相補範囲」の欄の数字は各オリゴデオキシ
リボヌクレオチドが対応する、配列番号１で表される塩
基配列の範囲を表す。例えば、「U0370 」は、配列番号
１の配列表の308 番目から327 番目の塩基に相補的な塩
基の配列からなる２０量体のいわゆるアンチセンス核酸
化合物である。
【００２０】
【表１】
【００２１】（２）HT1080細胞系でのアンチセンス核酸
効果の確認 精製したホスホロチオエート型オリゴデオキシリボヌク
レオチドを再び真空下で乾固し、所定の濃度に希釈し
て、ＶＥＧＦ発現に及ぼす効果を培養細胞系において調
べた。オリゴデオキシリボヌクレオチドの濃度は、報告
されているモノヌクレオチド及びジヌクレオチドの分子
吸光係数(E.G.Richards, Handbook of Biochemistryand
Molecular Biology: Nucleic Acids(C.D.Fasman編) 第
３版、Ｉ巻 p197 CRC Cleveland OH)をもとにする最近
接近似法により求めたモル分子吸光係数と、２０mＭリ
ン酸ナトリウムと１００mＭ塩化ナトリウムからなる緩
衝液(pH7.0) にオリゴデオキシリボヌクレオチドを溶か
し、光路長１cmのセルを用いて、８０℃の温度下の２６
０nmにおいて測定した吸光度を用いて求めた。ヒト線維
肉腫細胞であるＨＴ１０８０細胞を用いた培養細胞系に
おけるＶＥＧＦ発現に及ぼす効果は文献に報告の方法
(M.Y. Chiangら、The Journal of Biological Chemistr
y 266巻 27号 18162-18172頁、1991年)を参考に無菌状
況下で次のように行った。ＨＴ１０８０細胞を４８穴プ
レートにまき、１０％胎児牛血清を含有するダルベッコ
改変Eagle 培地(ＤＭＥＭ)中で、５％二酸化炭素を含有
する雰囲気下、５０〜７０％コンフルエント状態になる
まで３７℃にて培養した。培地を除去したのち、Opti-M
EM培地(GIB CO-BRL社製)で洗浄した。２.３μＭのホス
ホロチオエート型オリゴデオキシリボヌクレオチドを含
むOpti-MEM培地に、最終濃度で１８μg/mlになるように
TfxTM-50試薬(Promega社製)を加え、攪拌した。１５〜
２０分間室温に放置した後、０.２mlを各穴にいれ、５
％二酸化炭素含有の雰囲気下３７℃で、４時間保った。
この溶液を除去して、１０％胎児牛血清を含有するＤＭ
ＥＭ培地で洗浄した。その後、各穴に１０％胎児牛血清
を含有するＤＭＥＭ培地１００μlを加え、５％二酸化
炭素含有の雰囲気下３７℃で２時間保った。
効果の確認 精製したホスホロチオエート型オリゴデオキシリボヌク
レオチドを再び真空下で乾固し、所定の濃度に希釈し
て、ＶＥＧＦ発現に及ぼす効果を培養細胞系において調
べた。オリゴデオキシリボヌクレオチドの濃度は、報告
されているモノヌクレオチド及びジヌクレオチドの分子
吸光係数(E.G.Richards, Handbook of Biochemistryand
Molecular Biology: Nucleic Acids(C.D.Fasman編) 第
３版、Ｉ巻 p197 CRC Cleveland OH)をもとにする最近
接近似法により求めたモル分子吸光係数と、２０mＭリ
ン酸ナトリウムと１００mＭ塩化ナトリウムからなる緩
衝液(pH7.0) にオリゴデオキシリボヌクレオチドを溶か
し、光路長１cmのセルを用いて、８０℃の温度下の２６
０nmにおいて測定した吸光度を用いて求めた。ヒト線維
肉腫細胞であるＨＴ１０８０細胞を用いた培養細胞系に
おけるＶＥＧＦ発現に及ぼす効果は文献に報告の方法
(M.Y. Chiangら、The Journal of Biological Chemistr
y 266巻 27号 18162-18172頁、1991年)を参考に無菌状
況下で次のように行った。ＨＴ１０８０細胞を４８穴プ
レートにまき、１０％胎児牛血清を含有するダルベッコ
改変Eagle 培地(ＤＭＥＭ)中で、５％二酸化炭素を含有
する雰囲気下、５０〜７０％コンフルエント状態になる
まで３７℃にて培養した。培地を除去したのち、Opti-M
EM培地(GIB CO-BRL社製)で洗浄した。２.３μＭのホス
ホロチオエート型オリゴデオキシリボヌクレオチドを含
むOpti-MEM培地に、最終濃度で１８μg/mlになるように
TfxTM-50試薬(Promega社製)を加え、攪拌した。１５〜
２０分間室温に放置した後、０.２mlを各穴にいれ、５
％二酸化炭素含有の雰囲気下３７℃で、４時間保った。
この溶液を除去して、１０％胎児牛血清を含有するＤＭ
ＥＭ培地で洗浄した。その後、各穴に１０％胎児牛血清
を含有するＤＭＥＭ培地１００μlを加え、５％二酸化
炭素含有の雰囲気下３７℃で２時間保った。
【００２２】培地中のＶＥＧＦ量を下記に記載の酵素免
疫測定法に従って、また生存細胞数は下記に記載の生細
胞数の測定法に従って測定した。 ○ 酵素免疫測定法 マイクロタイタープレート(ポリスチレン製)にポリクロ
ーナル抗体(ヒト由来のＶＥＧＦを大腸菌に産生させ、
その産生物を兎に投与して得た抗体)を常法に従って固
定化した。ついで、上記に記載の細胞培養液(３７℃で
２時間又は３時間培養した上澄み液)１００μl、および
５０〜１５００pg/mlの種々の濃度のＶＥＧＦ標準物質
を含む１０％胎児牛血清を含有するＤＭＥＭ培地１００
μlを、プレートの各穴に加え、室温(約２５℃)で２時
間静置した。この液を除き、０.１％ウシ血清アルブミ
ンを含有するリン酸緩衝液で充分に洗浄した。次に、西
洋ワサビペルオキシダーゼで標識した前記ポリクローナ
ル抗体を添加し、室温で１時間放置した。前記洗浄液で
充分に洗浄した後、オキシダーゼの基質であるオルト−
ジアミノベンゼン溶液を加え、適度に発色するまで室温
で放置した(約３０分)。その後、４９０nm及び６５０nm
における吸光度を測定し、それらの吸光度の差を算出し
(４９０nmの吸光度−６５０nmの吸光度)、ＶＥＧＦの含
有量を評価した。このとき含有量は、同一プレート上に
調製して得た標準曲線を用いて算出した。 ○ 生細胞数測定法（ＭＴＴ法） １０％胎児牛血清を含有するＤＭＥＭ培地１mlにＭＴＴ
０.５mgを溶解した液をＭＴＴ液とする。ＶＥＧＦ発現
量を酵素免疫測定法で測定するために、細胞培養液を除
去した後の４８穴フ゜レートに、ＭＴＴ液を２００μl/穴で
加える。５％二酸化炭素含有の雰囲気下３７℃で２時間
保つ。細胞培養液を除去し、これにＤＭＳＯ(ジメチル
スルホキシド)を２００μl加える。十分に攪拌し、均一
な溶液にする。その後、４９０nm及び６５０nmにおける
吸光度を測定し、それらの吸光度の差を算出し(４９０n
mの吸光度−６５０nmの吸光度)、検量線に内挿し生細胞
数を求めた。検量線は、各種細胞数での吸光度をあらか
じめ測定することで作成した。作成した検量線の一例と
して、ＨＴ１０８０の場合を図５に示した。
疫測定法に従って、また生存細胞数は下記に記載の生細
胞数の測定法に従って測定した。 ○ 酵素免疫測定法 マイクロタイタープレート(ポリスチレン製)にポリクロ
ーナル抗体(ヒト由来のＶＥＧＦを大腸菌に産生させ、
その産生物を兎に投与して得た抗体)を常法に従って固
定化した。ついで、上記に記載の細胞培養液(３７℃で
２時間又は３時間培養した上澄み液)１００μl、および
５０〜１５００pg/mlの種々の濃度のＶＥＧＦ標準物質
を含む１０％胎児牛血清を含有するＤＭＥＭ培地１００
μlを、プレートの各穴に加え、室温(約２５℃)で２時
間静置した。この液を除き、０.１％ウシ血清アルブミ
ンを含有するリン酸緩衝液で充分に洗浄した。次に、西
洋ワサビペルオキシダーゼで標識した前記ポリクローナ
ル抗体を添加し、室温で１時間放置した。前記洗浄液で
充分に洗浄した後、オキシダーゼの基質であるオルト−
ジアミノベンゼン溶液を加え、適度に発色するまで室温
で放置した(約３０分)。その後、４９０nm及び６５０nm
における吸光度を測定し、それらの吸光度の差を算出し
(４９０nmの吸光度−６５０nmの吸光度)、ＶＥＧＦの含
有量を評価した。このとき含有量は、同一プレート上に
調製して得た標準曲線を用いて算出した。 ○ 生細胞数測定法（ＭＴＴ法） １０％胎児牛血清を含有するＤＭＥＭ培地１mlにＭＴＴ
０.５mgを溶解した液をＭＴＴ液とする。ＶＥＧＦ発現
量を酵素免疫測定法で測定するために、細胞培養液を除
去した後の４８穴フ゜レートに、ＭＴＴ液を２００μl/穴で
加える。５％二酸化炭素含有の雰囲気下３７℃で２時間
保つ。細胞培養液を除去し、これにＤＭＳＯ(ジメチル
スルホキシド)を２００μl加える。十分に攪拌し、均一
な溶液にする。その後、４９０nm及び６５０nmにおける
吸光度を測定し、それらの吸光度の差を算出し(４９０n
mの吸光度−６５０nmの吸光度)、検量線に内挿し生細胞
数を求めた。検量線は、各種細胞数での吸光度をあらか
じめ測定することで作成した。作成した検量線の一例と
して、ＨＴ１０８０の場合を図５に示した。
【００２３】本実験条件下で生細胞数とＭＴＴ法の結果
が相関していることは以下の実験により確認した。ＨＴ
１０８０細胞を４８穴プレートにまき、１０％胎児牛血
清を含有するＤＭＥＭ培地中で、５％二酸化炭素を含有
する雰囲気下、５０〜８０％コンフルエント状態になる
まで３７℃にて培養した。培地を除去したのち、Opti-M
EM培地(GIBCO-BRL社製)で洗浄した。２.３μMのミック
ス配列ホスホロチオエート型オリゴデオキシリボヌクレ
オチド(２０量体の各配列全てにＡ(アテ゛ニン)，Ｇ(ク゛アニ
ン)，Ｃ(シチシ゛ン)，Ｔ(チミシ゛ン)が理論上等量存在するように
合成したもの。４20種類の２０量体の混合物である)及
び１８μg/mlのＴfxTM-50試薬を含むOpti-MEM培地中、
ＨＴ１０８０細胞を５％二酸化炭素含有の雰囲気下３７
℃で２時間又は４時間保った。試薬を含むOpti-MEM培地
を除去し、１０％胎児牛血清を含有するＤＭＥＭ培地で
洗浄した。この後、１０％胎児牛血清を含有するＤＭＥ
Ｍ培地２００μlを加え、５％二酸化炭素含有の雰囲気
下37℃で一定時間保った。一定時間後の生細胞数を、ト
リパン青溶液を用いたセルカウント法(顕微鏡による生
細胞の計数)で確認した。また同時に、ＭＴＴ法でも先
に作成した検量線を用いて生細胞数を求めた。これら二
法で求めた生細胞数を、実験開始細胞数を100%として比
較した。その結果、両者はよく相関しており、本実験条
件下においても、セルカウント法の代用としてＭＴＴ法
を用いることができることが確認できた。この結果を、
ＨＴ１０８０細胞の場合を例として図６に示した。ホス
ホロチオエート型オリゴデオキシリボヌクレオチドおよ
びＴfxTM-50を添加しない場合のＶＥＧＦの発現量及び
生細胞数を１００％として、ホスホロチオエート型オリ
ゴデオキシリボヌクレオチドを添加した場合の発現率及
び生細胞率を求めた。前者ＶＥＧＦ発現率を、後者生細
胞率で割ることで補正し、これを補正ＶＥＧＦ発現率と
した。補正ＶＥＧＦ発現率及び生存細胞率を表２に示し
た。
が相関していることは以下の実験により確認した。ＨＴ
１０８０細胞を４８穴プレートにまき、１０％胎児牛血
清を含有するＤＭＥＭ培地中で、５％二酸化炭素を含有
する雰囲気下、５０〜８０％コンフルエント状態になる
まで３７℃にて培養した。培地を除去したのち、Opti-M
EM培地(GIBCO-BRL社製)で洗浄した。２.３μMのミック
ス配列ホスホロチオエート型オリゴデオキシリボヌクレ
オチド(２０量体の各配列全てにＡ(アテ゛ニン)，Ｇ(ク゛アニ
ン)，Ｃ(シチシ゛ン)，Ｔ(チミシ゛ン)が理論上等量存在するように
合成したもの。４20種類の２０量体の混合物である)及
び１８μg/mlのＴfxTM-50試薬を含むOpti-MEM培地中、
ＨＴ１０８０細胞を５％二酸化炭素含有の雰囲気下３７
℃で２時間又は４時間保った。試薬を含むOpti-MEM培地
を除去し、１０％胎児牛血清を含有するＤＭＥＭ培地で
洗浄した。この後、１０％胎児牛血清を含有するＤＭＥ
Ｍ培地２００μlを加え、５％二酸化炭素含有の雰囲気
下37℃で一定時間保った。一定時間後の生細胞数を、ト
リパン青溶液を用いたセルカウント法(顕微鏡による生
細胞の計数)で確認した。また同時に、ＭＴＴ法でも先
に作成した検量線を用いて生細胞数を求めた。これら二
法で求めた生細胞数を、実験開始細胞数を100%として比
較した。その結果、両者はよく相関しており、本実験条
件下においても、セルカウント法の代用としてＭＴＴ法
を用いることができることが確認できた。この結果を、
ＨＴ１０８０細胞の場合を例として図６に示した。ホス
ホロチオエート型オリゴデオキシリボヌクレオチドおよ
びＴfxTM-50を添加しない場合のＶＥＧＦの発現量及び
生細胞数を１００％として、ホスホロチオエート型オリ
ゴデオキシリボヌクレオチドを添加した場合の発現率及
び生細胞率を求めた。前者ＶＥＧＦ発現率を、後者生細
胞率で割ることで補正し、これを補正ＶＥＧＦ発現率と
した。補正ＶＥＧＦ発現率及び生存細胞率を表２に示し
た。
【００２４】（３）A549細胞系でのアンチセンス核酸効
果の確認 実施例２と同様に、アンチセンス核酸効果が期待される
塩基配列をもつホスホロチオエート型オリゴデオキシリ
ボヌクレオチドをアンチセンス核酸として用いて、ＶＥ
ＧＦ発現に及ぼす効果を培養細胞系において調べた。す
なわち、ヒト肺癌由来のＡ５４９細胞を用い文献に報告
の方法(M.Y. Chiangら、The Journal ofBiological Che
mistry 266巻 27号 18162-18172頁、1991年)を参考に無
菌状況下で次のように行った。Ａ５４９細胞を４８穴プ
レートにまき、１０％胎児牛血清を含有するＤＭＥＭ培
地中で、５％二酸化炭素を含有する雰囲気下、６０〜８
０％コンフルエント状態になるまで３７℃にて培養し
た。培地を除去したのち、Opti-MEM培地(GIBCO -BRL社
製)で洗浄した。２.３μMののホスホロチオエート型オ
リゴデオキシリボヌクレオチドを含むOpti-MEM培地に、
最終濃度で１８μg/mlになるようにＴfxTM-50試薬(Prom
ega社製)を加え、攪拌した。１５〜２０分間室温に放置
した後、０.２mlを各穴にいれ、５％二酸化炭素含有の
雰囲気下３７℃で、２時間保った。この溶液を除去し
て、１０％胎児牛血清を含有するＤＭＥＭ培地で洗浄し
た。その後、各穴に１０％胎児牛血清を含有するＤＭＥ
Ｍ培地１００μlを加え、５％二酸化炭素含有の雰囲気
下２７℃で３時間保った。ＨＴ１０８０細胞での場合と
同様にして、ＶＥＧＦ発現率及び生存細胞率を表２に示
した。
果の確認 実施例２と同様に、アンチセンス核酸効果が期待される
塩基配列をもつホスホロチオエート型オリゴデオキシリ
ボヌクレオチドをアンチセンス核酸として用いて、ＶＥ
ＧＦ発現に及ぼす効果を培養細胞系において調べた。す
なわち、ヒト肺癌由来のＡ５４９細胞を用い文献に報告
の方法(M.Y. Chiangら、The Journal ofBiological Che
mistry 266巻 27号 18162-18172頁、1991年)を参考に無
菌状況下で次のように行った。Ａ５４９細胞を４８穴プ
レートにまき、１０％胎児牛血清を含有するＤＭＥＭ培
地中で、５％二酸化炭素を含有する雰囲気下、６０〜８
０％コンフルエント状態になるまで３７℃にて培養し
た。培地を除去したのち、Opti-MEM培地(GIBCO -BRL社
製)で洗浄した。２.３μMののホスホロチオエート型オ
リゴデオキシリボヌクレオチドを含むOpti-MEM培地に、
最終濃度で１８μg/mlになるようにＴfxTM-50試薬(Prom
ega社製)を加え、攪拌した。１５〜２０分間室温に放置
した後、０.２mlを各穴にいれ、５％二酸化炭素含有の
雰囲気下３７℃で、２時間保った。この溶液を除去し
て、１０％胎児牛血清を含有するＤＭＥＭ培地で洗浄し
た。その後、各穴に１０％胎児牛血清を含有するＤＭＥ
Ｍ培地１００μlを加え、５％二酸化炭素含有の雰囲気
下２７℃で３時間保った。ＨＴ１０８０細胞での場合と
同様にして、ＶＥＧＦ発現率及び生存細胞率を表２に示
した。
【００２５】
【表２】
【００２６】表２から明らかな様に、補正ＶＥＧＦ発現
率の相対誤差は通常は８％程度以内、最大でも１５％以
下であり、ばらつきは少なかった。また、細胞生存率は
いずれも約８０％以上(相対誤差は通常は６％程度以
内、最大でも９％)であり、特に強い毒性は見られず、
アンチセンス核酸であるホスホロチオエート型オリゴデ
オキシリボヌクレオチドの添加によるＶＥＧＦの発現量
は、ランダム配列ホスホロチオエート型オリゴデオキシ
リボヌクレオチドを添加した場合の発現量より明らかに
少なかった。表２には「発現率（％）」が示されてお
り、その値が小さい程、アンチセンス核酸化合物のＶＥ
ＧＦ遺伝子に対する発現阻害効果が大きいことを意味す
る。アンチセンス核酸であるホスホロチオエート型オリ
ゴデオキシリボヌクレオチドの添加によるＶＥＧＦの発
現量は、ランダム配列ホスホロチオエート型オリゴデオ
キシリボヌクレオチドを添加した場合の発現量より明ら
かに少なかった。すなわち、表２において、いずれのア
ンチセンス鎖（表１において、数字の前に「Ｕ」のつい
ている「試料＃」のもの）も、対照核酸化合物として用
いたRU0406TS及びRU0413TSの発現率よりも低い、すなわ
ち全てが３０％以下であり、殆どは２０％以下であり、
１０％以下のものも存在するという発現率を示してい
る。これらのアンチセンス鎖は、明らかにＶＥＧＦの発
現を効果的に阻害していると考えられる。ここで、翻訳
上流部分を対象としたアンチセンス核酸化合物のＶＥＧ
Ｆ遺伝子に対する発現阻害効果は、先に本発明者等がWO
96/00286で効果が高いと示した、翻訳領域に対するアン
チセンス核酸化合物のＶＥＧＦ遺伝子に対する発現阻害
効果（発現率で５４〜７０％）と比べ、優れていること
は明白である。
率の相対誤差は通常は８％程度以内、最大でも１５％以
下であり、ばらつきは少なかった。また、細胞生存率は
いずれも約８０％以上(相対誤差は通常は６％程度以
内、最大でも９％)であり、特に強い毒性は見られず、
アンチセンス核酸であるホスホロチオエート型オリゴデ
オキシリボヌクレオチドの添加によるＶＥＧＦの発現量
は、ランダム配列ホスホロチオエート型オリゴデオキシ
リボヌクレオチドを添加した場合の発現量より明らかに
少なかった。表２には「発現率（％）」が示されてお
り、その値が小さい程、アンチセンス核酸化合物のＶＥ
ＧＦ遺伝子に対する発現阻害効果が大きいことを意味す
る。アンチセンス核酸であるホスホロチオエート型オリ
ゴデオキシリボヌクレオチドの添加によるＶＥＧＦの発
現量は、ランダム配列ホスホロチオエート型オリゴデオ
キシリボヌクレオチドを添加した場合の発現量より明ら
かに少なかった。すなわち、表２において、いずれのア
ンチセンス鎖（表１において、数字の前に「Ｕ」のつい
ている「試料＃」のもの）も、対照核酸化合物として用
いたRU0406TS及びRU0413TSの発現率よりも低い、すなわ
ち全てが３０％以下であり、殆どは２０％以下であり、
１０％以下のものも存在するという発現率を示してい
る。これらのアンチセンス鎖は、明らかにＶＥＧＦの発
現を効果的に阻害していると考えられる。ここで、翻訳
上流部分を対象としたアンチセンス核酸化合物のＶＥＧ
Ｆ遺伝子に対する発現阻害効果は、先に本発明者等がWO
96/00286で効果が高いと示した、翻訳領域に対するアン
チセンス核酸化合物のＶＥＧＦ遺伝子に対する発現阻害
効果（発現率で５４〜７０％）と比べ、優れていること
は明白である。
【００２７】表２に示すように、U0393TSからU0424TSま
での、2 〜５塩基ずつずらした９種、およびU0843TSか
らU0865TSまでの３〜５塩基ずつずらした６種すべての
オリゴデオキシリボヌクレオチドについては、その阻害
効果が極めて大きい(３０％以下の発現率)ことがわかっ
た。すなわち、配列番号１で表される塩基配列の３３１
番目付近から３８１番目付近及び７８１番目付近から８
２２番目付近までは、アンチセンス核酸化合物によるＶ
ＥＧＦ産生阻害効果の極めて大きい領域(Ａ５４９ある
いはＨＴ１０８０のいずれの細胞種でも、発現率を３０
％以下にまで抑制する領域)である。配列番号１で表さ
れる塩基配列の３３１番目から３８１番目を、以下では
「領域１」と、７８１番目から８２２番目までを以下で
は「領域２」と呼称する。表２では、領域１に対して相
補な配列であり、２〜５塩基ずつずらした９種の２０量
体のアンチセンス核酸を用いた場合について、実験的に
確認したＶＥＧＦ発現量を示したのであるが、これらの
間を標的とするようなアンチセンス核酸を用いた場合に
もＶＥＧＦ産生阻害効果が極めて大きいことは、容易に
想像できることであり、領域２についても、同様のこと
が容易に類推できる。以上のことから、選んだ塩基配列
あるいは領域に相補な塩基配列を持つホスホロチオエー
ト型オリゴデオキシリボヌクレオチドを用いて、ヒト線
維肉腫細胞であるＨＴ１０８０細胞及びヒト肺癌由来の
Ａ５４９細胞のＶＥＧＦ発現を阻害できることがわかっ
た。一般に10塩基以上に対して相補的であるアンチセン
ス核酸化合物は、それが標的とする蛋白質の発現を阻害
することは本発明者等が明らかにしたことであり(WO96/
00286)、アンチセンス核酸化合物としては翻訳上流部分
の１０塩基以上、好ましくは１３塩基以上に対して連続
的に相補的なものが標的とする蛋白質の発現を阻害する
効果の大きいものである。
での、2 〜５塩基ずつずらした９種、およびU0843TSか
らU0865TSまでの３〜５塩基ずつずらした６種すべての
オリゴデオキシリボヌクレオチドについては、その阻害
効果が極めて大きい(３０％以下の発現率)ことがわかっ
た。すなわち、配列番号１で表される塩基配列の３３１
番目付近から３８１番目付近及び７８１番目付近から８
２２番目付近までは、アンチセンス核酸化合物によるＶ
ＥＧＦ産生阻害効果の極めて大きい領域(Ａ５４９ある
いはＨＴ１０８０のいずれの細胞種でも、発現率を３０
％以下にまで抑制する領域)である。配列番号１で表さ
れる塩基配列の３３１番目から３８１番目を、以下では
「領域１」と、７８１番目から８２２番目までを以下で
は「領域２」と呼称する。表２では、領域１に対して相
補な配列であり、２〜５塩基ずつずらした９種の２０量
体のアンチセンス核酸を用いた場合について、実験的に
確認したＶＥＧＦ発現量を示したのであるが、これらの
間を標的とするようなアンチセンス核酸を用いた場合に
もＶＥＧＦ産生阻害効果が極めて大きいことは、容易に
想像できることであり、領域２についても、同様のこと
が容易に類推できる。以上のことから、選んだ塩基配列
あるいは領域に相補な塩基配列を持つホスホロチオエー
ト型オリゴデオキシリボヌクレオチドを用いて、ヒト線
維肉腫細胞であるＨＴ１０８０細胞及びヒト肺癌由来の
Ａ５４９細胞のＶＥＧＦ発現を阻害できることがわかっ
た。一般に10塩基以上に対して相補的であるアンチセン
ス核酸化合物は、それが標的とする蛋白質の発現を阻害
することは本発明者等が明らかにしたことであり(WO96/
00286)、アンチセンス核酸化合物としては翻訳上流部分
の１０塩基以上、好ましくは１３塩基以上に対して連続
的に相補的なものが標的とする蛋白質の発現を阻害する
効果の大きいものである。
【００２８】これらの事実から配列番号１の塩基配列に
対し、そのアンチセンス核酸の標的とするに好ましい相
補部位を次のように設定することができる。すなわち、
配列番号１の331 番目から381 番目の塩基からなる塩基
配列（配列番号２）、配列番号１の781 番目から822 番
目の塩基からなる塩基配列（配列番号３）、配列番号１
の308 番目から327 番目の塩基からなる塩基配列（配列
番号４）、配列番号１の331 番目から350 番目の塩基か
らなる塩基配列（配列番号５）、配列番号１の335 番目
から354 番目の塩基からなる塩基配列（配列番号６）、
配列番号１の339 番目から358 番目の塩基からなる塩基
配列（配列番号７）、配列番号1 の344 番目から363 番
目の塩基からなる塩基配列（配列番号８）、配列番号１
の349 番目から368 番目の塩基からなる塩基配列（配列
番号９）、配列番号１の351 番目から370 番目の塩基か
らなる塩基配列（配列番号10）、配列番号１の354 番目
から373 番目の塩基からなる塩基配列（配列番号11）、
配列番号１の358 番目から377 番目の塩基からなる塩基
配列（配列番号12）、配列番号１の362 番目から381 番
目の塩基からなる塩基配列（配列番号13）、配列番号１
の781 番目から800 番目の塩基からなる塩基配列（配列
番号14）、配列番号１の786 番目から805 番目の塩基か
らなる塩基配列（配列番号15）、配列番号１の791番目
から810 番目の塩基からなる塩基配列（配列番号16）、
配列番号１の795 番目から814 番目の塩基からなる塩基
配列（配列番号17）、配列番号１の798 番目から817 番
目の塩基からなる塩基配列（配列番号18）、配列番号1
の803 番目から822 番目の塩基からなる塩基配列（配列
番号19）である。これらの塩基配列の連続する10塩基以
上、好ましくは13塩基以上、より好ましくは20塩基以上
に対して連続的に相補的であるアンチセンス核酸化合物
は、それが標的とする蛋白質であるＶＥＧＦの発現を阻
害する効果が大きいことが容易に類推できる。ＶＥＧＦ
の生体内における腫瘍血管新生因子としての役割(K.J.K
imら、Nature362巻 4月29日号 841-844頁、1993年；S.K
ondoら、Biochemical and Biophysical Research Comm
unications 194巻 3号 1234-1241頁、1993年)から、配
列番号２〜１９の１０塩基以上、好ましくは１３塩基以
上、より好ましくは２０塩基以上の連続する塩基配列に
対するアンチセンス核酸化合物は、固形腫瘍細胞の増殖
阻害を目的とする制癌剤などの治療剤として、また癌な
どの診断剤として有用である。
対し、そのアンチセンス核酸の標的とするに好ましい相
補部位を次のように設定することができる。すなわち、
配列番号１の331 番目から381 番目の塩基からなる塩基
配列（配列番号２）、配列番号１の781 番目から822 番
目の塩基からなる塩基配列（配列番号３）、配列番号１
の308 番目から327 番目の塩基からなる塩基配列（配列
番号４）、配列番号１の331 番目から350 番目の塩基か
らなる塩基配列（配列番号５）、配列番号１の335 番目
から354 番目の塩基からなる塩基配列（配列番号６）、
配列番号１の339 番目から358 番目の塩基からなる塩基
配列（配列番号７）、配列番号1 の344 番目から363 番
目の塩基からなる塩基配列（配列番号８）、配列番号１
の349 番目から368 番目の塩基からなる塩基配列（配列
番号９）、配列番号１の351 番目から370 番目の塩基か
らなる塩基配列（配列番号10）、配列番号１の354 番目
から373 番目の塩基からなる塩基配列（配列番号11）、
配列番号１の358 番目から377 番目の塩基からなる塩基
配列（配列番号12）、配列番号１の362 番目から381 番
目の塩基からなる塩基配列（配列番号13）、配列番号１
の781 番目から800 番目の塩基からなる塩基配列（配列
番号14）、配列番号１の786 番目から805 番目の塩基か
らなる塩基配列（配列番号15）、配列番号１の791番目
から810 番目の塩基からなる塩基配列（配列番号16）、
配列番号１の795 番目から814 番目の塩基からなる塩基
配列（配列番号17）、配列番号１の798 番目から817 番
目の塩基からなる塩基配列（配列番号18）、配列番号1
の803 番目から822 番目の塩基からなる塩基配列（配列
番号19）である。これらの塩基配列の連続する10塩基以
上、好ましくは13塩基以上、より好ましくは20塩基以上
に対して連続的に相補的であるアンチセンス核酸化合物
は、それが標的とする蛋白質であるＶＥＧＦの発現を阻
害する効果が大きいことが容易に類推できる。ＶＥＧＦ
の生体内における腫瘍血管新生因子としての役割(K.J.K
imら、Nature362巻 4月29日号 841-844頁、1993年；S.K
ondoら、Biochemical and Biophysical Research Comm
unications 194巻 3号 1234-1241頁、1993年)から、配
列番号２〜１９の１０塩基以上、好ましくは１３塩基以
上、より好ましくは２０塩基以上の連続する塩基配列に
対するアンチセンス核酸化合物は、固形腫瘍細胞の増殖
阻害を目的とする制癌剤などの治療剤として、また癌な
どの診断剤として有用である。
【００２９】
【発明の効果】本発明により、ＶＥＧＦをコードする遺
伝子の発現を阻害するアンチセンス核酸化合物が提供さ
れる。本発明のアンチセンス核酸化合物は、ＶＥＧＦの
産生を阻害するため、固形腫瘍に到達する血管の伸長を
抑制することができ、固形腫瘍の増殖を抑えることがで
きる。従って、固形腫瘍細胞の増殖阻害効果を目的とす
る制癌剤として利用可能である。また、ＶＥＧＦがリュ
ーマチ性関節炎や糖尿病性網膜症に関与していることか
ら、これらの疾病の治療剤としても利用可能である。さ
らに、本発明のアンチセンス核酸化合物を用いることに
より、腫瘍細胞の検出やリューマチ性関節炎や糖尿病性
網膜症の発見を目的とした診断剤をも開発することがで
きる。
伝子の発現を阻害するアンチセンス核酸化合物が提供さ
れる。本発明のアンチセンス核酸化合物は、ＶＥＧＦの
産生を阻害するため、固形腫瘍に到達する血管の伸長を
抑制することができ、固形腫瘍の増殖を抑えることがで
きる。従って、固形腫瘍細胞の増殖阻害効果を目的とす
る制癌剤として利用可能である。また、ＶＥＧＦがリュ
ーマチ性関節炎や糖尿病性網膜症に関与していることか
ら、これらの疾病の治療剤としても利用可能である。さ
らに、本発明のアンチセンス核酸化合物を用いることに
より、腫瘍細胞の検出やリューマチ性関節炎や糖尿病性
網膜症の発見を目的とした診断剤をも開発することがで
きる。
配列番号：１ 配列の長さ：１０３８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： cＤＮＡ to mＲＮＡ 配列： TCGCGGAGGC TTGGGGCAGC CGGGTAGCTC GGAGGTCGTG GCGCTGGGGG CTAGCACCAG 60 CGCTCTGTCG GGAGGCGCAG CGGTTAGGTG GACCGGTCAG CGGACTCACC GGCCAGGGCG 120 CTCGGTGCTG GAATTTGATA TTCATTGATC CGGGTTTTAT CCCTCTTCTT TTTTCTTAAA 180 CATTTTTTTT TAAAACTGTA TTGTTTCTCG TTTTAATTTA TTTTTGCTTG CCATTCCCCA 240 CTTGAATCGG GCCGACGGCT TGGGGAGATT GCTCTACTTC CCCAAATCAC TGTGGATTTT 300 GGAAACCAGC AGAAAGAGGA AAGAGGTAGC AAGAGCTCCA GAGAGAAGTC GAGGAAGAGA 360 GAGACGGGGT CAGAGAGAGC GCGCGGGCGT GCGAGCAGCG AAAGCGACAG GGGCAAAGTG 420 AGTGACCTGC TTTTGGGGGT GACCGCCGGA GCGCGGCGTG AGCCCTCCCC CTTGGGATCC 480 CGCAGCTGAC CAGTCGCGCT GACGGACAGA CAGACAGACA CCGCCCCCAG CCCCAGCTAC 540 CACCTCCTCC CCGGCCGGCG GCGGACAGTG GACGCGGCGG CGAGCCGCGG GCAGGGGCCG 600 GAGCCCGCGC CCGGAGGCGG GGTGGAGGGG GTCGGGGCTC GCGGCGTCGC ACTGAAACTT 660 TTCGTCCAAC TTCTGGGCTG TTCTCGCTTC GGAGGAGCCG TGGTCCGCGC GGGGGAAGCC 720 GAGCCGAGCG GAGCCGCGAG AAGTGCTAGC TCGGGCCGGG AGGAGCCGCA GCCGGAGGAG 780 GGGGAGGAGG AAGAAGAGAA GGAAGAGGAG AGGGGGCCGC AGTGGCGACT CGGCGCTCGG 840 AAGCCGGGCT CATGGACGGG TGAGGCGGCG GTGTGCGCAG ACAGTGCTCC AGCCGCGCGC 900 GCTCCCCAGG CCCTGGCCCG GGCCTCGGGC CGGGGAGGAA GAGTAGCTCG CCGAGGCGCC 960 GAGGAGAGCG GGCCGCCCCA CAGCCCGAGC CGGAGAGGGA GCGCGAGCCG CGCCGGCCCC 1020 GGTCGGGCCT CCGAAACC 1038 配列番号：２ 配列の長さ：５１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： cＤＮＡ to mＲＮＡ 配列： AAGAGCTCCAGAGAGAAGTCGAGGAAGAGAGAGACGGGGTCAGAGAGAGCG 51 配列番号：３ 配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： cＤＮＡ to mＲＮＡ 配列： GGGGAGGAGGAAGAAGAGAAGGAAGAGGAGAGGGGGCCGCAG 42 配列番号：４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： cＤＮＡ to mＲＮＡ 配列： AGCAGAAAGAGGAAAGAGGT 20 配列番号：５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： cＤＮＡ to mＲＮＡ 配列： AAGAGCTCCAGAGAGAAGTC 20 配列番号：６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： cＤＮＡ to mＲＮＡ 配列： GCTCCAGAGAGAAGTCGAGG 20 配列番号：７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： cＤＮＡ to mＲＮＡ 配列： CAGAGAGAAGTCGAGGAAGA 20 配列番号：８ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： cＤＮＡ to mＲＮＡ 配列： AGAAGTCGAGGAAGAGAGAG 20 配列番号：９ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： cＤＮＡ to mＲＮＡ 配列： TCGAGGAAGAGAGAGACGGG 20 配列番号：１０ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： cＤＮＡ to mＲＮＡ 配列： GAGGAAGAGAGAGACGGGGT 20 配列番号：１１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： cＤＮＡ to mＲＮＡ 配列： GAAGAGAGAGACGGGGTCAG 20 配列番号：１２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： cＤＮＡ to mＲＮＡ 配列： AGAGAGACGGGGTCAGAGAG 20 配列番号：１３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： cＤＮＡ to mＲＮＡ 配列： AGACGGGGTCAGAGAGAGCG 20 配列番号：１４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： cＤＮＡ to mＲＮＡ 配列： GGGGAGGAGGAAGAAGAGAA 20 配列番号：１５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： cＤＮＡ to mＲＮＡ 配列： GGAGGAAGAAGAGAAGGAAG 20 配列番号：１６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： cＤＮＡ to mＲＮＡ 配列： AAGAAGAGAAGGAAGAGGAG 20 配列番号：１７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： cＤＮＡ to mＲＮＡ 配列： AGAGAAGGAAGAGGAGAGGG 20 配列番号：１８ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： cＤＮＡ to mＲＮＡ 配列： GAAGGAAGAGGAGAGGGGGC 20 配列番号：１９ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： cＤＮＡ to mＲＮＡ 配列： AAGAGGAGAGGGGGCCGCAG 20
【図１】 精製試料の逆相ＨＰＬＣの結果の一例を示す
図である。
図である。
【図２】 精製試料のキャピラリー電気泳動の結果の一
例を示す図である。
例を示す図である。
【図３】 精製試料の31Ｐ−ＮＭＲの結果の一例を示す
図である。
図である。
【図４】 精製試料の紫外線吸収スペクトルの一例を示
す図である。
す図である。
【図５】 ＭＴＴ法での検量線を示す図である。
【図６】 セルカウント法とＭＴＴ法との相関を示す図
である。
である。
Claims (10)
- 【請求項１】 塩基配列が血管内皮細胞増殖因子をコー
ドする遺伝子の翻訳部分の上流に存在する塩基配列に対
して実質的に相補的であり、細胞による血管内皮細胞増
殖因子の発現を５０％以上阻害することを特徴とするア
ンチセンス核酸化合物。 - 【請求項２】 血管内皮細胞増殖因子の発現を７０％以
上阻害することを特徴とする請求項１記載のアンチセン
ス核酸化合物。 - 【請求項３】 血管内皮細胞増殖因子の発現を８０％以
上阻害することを特徴とする請求項１記載のアンチセン
ス核酸化合物。 - 【請求項４】 少なくとも１０個の連続塩基配列に対し
て実質的に相補的な塩基配列を有する請求項１〜３のい
ずれか１項に記載のアンチセンス核酸化合物。 - 【請求項５】 １０乃至３０量体の塩基配列からなるこ
とを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のア
ンチセンス核酸化合物。 - 【請求項６】 血管内皮細胞増殖因子をコードする遺伝
子の翻訳部分の上流に存在する塩基配列が配列番号１で
表される塩基配列である請求項１記載のアンチセンス核
酸化合物。 - 【請求項７】 血管内皮細胞増殖因子をコードする遺伝
子の翻訳部分の上流に存在する塩基配列が配列番号２又
は３で表される塩基配列である請求項１記載のアンチセ
ンス核酸化合物。 - 【請求項８】 血管内皮細胞増殖因子をコードする遺伝
子の翻訳部分の上流に存在する塩基配列が、配列番号４
〜１９で表される塩基配列のいずれかである請求項１記
載のアンチセンス核酸化合物。 - 【請求項９】 有効成分として請求項１記載のアンチセ
ンス核酸化合物を含有する治療薬。 - 【請求項１０】 有効成分として請求項１記載のアンチ
センス核酸化合物を含有する診断薬。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9213838A JPH1142091A (ja) | 1997-07-25 | 1997-07-25 | アンチセンス核酸化合物 |
| US09/120,853 US6057437A (en) | 1997-07-25 | 1998-07-21 | Antisense nucleic acid compounds inhibiting vascular endothelial growth factor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9213838A JPH1142091A (ja) | 1997-07-25 | 1997-07-25 | アンチセンス核酸化合物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1142091A true JPH1142091A (ja) | 1999-02-16 |
Family
ID=16645872
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9213838A Pending JPH1142091A (ja) | 1997-07-25 | 1997-07-25 | アンチセンス核酸化合物 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6057437A (ja) |
| JP (1) | JPH1142091A (ja) |
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| AU2003253580A1 (en) * | 2002-02-26 | 2003-11-17 | University Of Minnesota | Variants of nedd4l associated with hypertension and viral budding |
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