JPH114683A

JPH114683A - 組換えビルナウイルスワクチン

Info

Publication number: JPH114683A
Application number: JP10144462A
Authority: JP
Inventors: Heinrich Dieter Lutticken; ヘインリツヒ・デイエター・ルテイツケン; Egbert Mundt; エグバート・ムント; Loon Adriaan Anthonius Wilhelms M Van; アドリアーン・アントニウス・ウイルヘルムス・マリア・フアン・ローン
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Akzo Nobel NV
Priority date: 1997-05-26
Filing date: 1998-05-26
Publication date: 1999-01-12
Anticipated expiration: 2018-05-26
Also published as: US7022327B1; CA2238659A1; AU725129B2; BR9801685A; CA2238659C; BR9801685B1; DE69818913T2; ATE252153T1; AU6900298A; PT887412E; ES2209052T3; DE69818913D1; JP4316025B2

Abstract

(57)【要約】【課題】撲滅制御プログラムにおけるワクチン候補と
して適するビルナウイルス変異体を提供する。【解決手段】本発明のビルナウイルス変異体は、天然
のＶＰ５タンパク質を産生することができない。この特
徴は、ＶＰ５変異体でワクチン接種した動物または天然
のビルナウイルスに感染した動物間を区別するためのマ
ーカーとして使用することができる。また本発明のビル
ナウイルス変異体は、動物のビルナウイルス感染に対す
るワクチンとして使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ビルナウイルス
（birnavirus）変異体、この変異体を含むワクチン、動
物のビルナウイルス感染を測定する方法およびこの方法
を行うためのテストキットに関する。

【０００２】

【従来の技術】伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（In
fectious Bursal Disease Virus，ＩＢＤＶ）および伝
染性膵臓壊死ウイルス（Infectious Pancreatic Necros
is Virus，ＩＰＮＶ）は、ビルナウイルスファミリーの
メンバーである。このファミリーのウイルスは、非常に
類似したゲノム構成および同様の複製サイクルを有す
る。これらのウイルスのゲノムは、２セグメント（Ａお
よびＢ）の二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡから成る。大きい方の
セグメントＡは、自己タンパク質分解によって開裂して
成熟ウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４を
生成するポリタンパク質をコードする(Hudson, P.J.
ら、Nucleic Acids Res., 14, 5001-50012, 1986; Dobo
s P., Annual review of fish diseases 5, 25-54, 199
5)。ＶＰ２およびＶＰ３は、ビリオンの主な構造タンパ
ク質である。ＶＰ２は、ビルナウイルスの主な宿主保護
免疫原であり、中和抗体の誘導に寄与する抗原領域を含
む。ＶＰ４タンパク質は、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４
タンパク質の前駆体ポリタンパク質の処理に関与する、
ウイルスによってコードされるプロテアーゼであると考
えられる。大きい方のセグメントＡはまた、そのポリタ
ンパク質遺伝子の前、および部分的に重複して、第二の
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）も有する。こ
の第二のオープンリーディングフレームは、ＩＢＤＶ感
染細胞に存在する、機能が未知のタンパク質ＶＰ５をコ
ードする(Mundt, E.ら、J. Gen. Virol., 76, 437-443,
1995)。

【０００３】小さい方のセグメントＢは、ポリメラーゼ
およびキャップ形成酵素活性を有する90 kDaの多機能タ
ンパク質であるＶＰ１をコードする(Spies, U.ら、Viru
s Res., 8, 127-140, 1987および Spies, U.ら、J. Ge
n. Virol., 71, 977-981, 1990; Duncan R. ら、Virolo
gy 181, 541-552, 1991)。

【０００４】ＩＢＤＶの場合、２個の血清型（血清型１
および２）が存在する。２個の血清型は、ウイルス中和
（ＶＮ）検定によって区別することができる。さらに、
血清型１のサブタイプが単離されている。血清型１のこ
れらのいわゆる「バリアント」ウイルスは、交差中和検
定(Diseases of Poultry, 第９版、1991, Wolfe Publis
hing Ltd, ISBN 0 7234 1706 7, Chapter 28, P.D. Luk
ert および Y.M. Saif, 648-663)、モノクローナル抗体
のパネル(Snyder, D.B. ら、Arch. Virol., 127, 89-10
1, 1992)またはＲＴ−ＰＣＲ(Jackwood, D.J., Proceed
ings of the International symposium on infectious
bursal disease and infectious anaemia, Rauischholz
hausen, ドイツ、155-161, 1994)によって同定できる。
ＩＢＤＶの血清型１のこれらのサブタイプのいくつかは
文献に記載されており、例えば、古典的、変異−Ｅ、Ｇ
ＬＳ、RS593 および DS326株(Van Loon,ら、Proceeding
sof the Intenational symposium on infectious bursa
l disease and chicken infectiouos anaemia, Rauisch
holzhausen,ドイツ、179-187, 1994)が挙げられる。

【０００５】伝染性ファブリキウス嚢病（ＩＢＤ）は、
ガンボロ（Gumboro）病とも言われ、ニワトリの急性高
伝染性ウイルス感染であり、リンパ系組織をその主要標
的とし、ファブリキウス嚢の細胞に対して選択的向性を
有する。感染しやすい群れの罹患率は高く、体重が急激
に減少し、死亡率は中程度である。ニワトリの防御機構
に必須であるファブリキウス嚢が破壊するため、その病
気から回復したニワトリは、免疫欠乏を有する可能性が
ある。ＩＢＤウイルスは、３週齢より若いニワトリに重
い免疫抑制を引き起し、３月齢までのニワトリにファブ
リキウス嚢の損傷を誘起する。

【０００６】長年、その病気は、弱毒化したＩＢＤＶ生
ワクチンで前処置しておいたニワトリに不活化ワクチン
を適用することにより、繁殖のために飼育している群れ
に高レベルの抗体を誘導することによって予防すること
ができた。こうして、ＩＢＤによって引き起こされる経
済的損失を最小限に保っている。ワクチン接種した繁殖
群のニワトリの母から受け継いだ抗体は、ＩＢＤＶによ
る早期感染を予防し、免疫抑制に係る問題を少なくす
る。さらに、弱毒化生ワクチンは、母からの抗体が減少
した後の商業用のニワトリ群においても十分使用されて
いる。

【０００７】最近、ＩＢＤＶの非常に病原性の強い株
が、ヨーロッパで死亡率の高い病気の大発生を引き起こ
した。現在のワクチン接種プログラムでは、ニワトリを
十分保護することができなかった。ワクチン予防の失敗
は、主に、現場の病原性の強いウイルスによる誘発（免
疫誘発、challenge）の前に、鳥類を生ワクチンによっ
て感染させることができなかったことによる。

【０００８】ワクチン接種以外の予防手段による病気の
撲滅は、ウイルスが広く蔓延しているし、現在投与され
ている弱毒化もしくは不活化ＩＢＤＶ生ワクチンでは、
特定の動物が現場のＩＢＤＶウイルスに感染しているか
どうか、またはその動物がＩＢＤＶワクチンの接種を受
けたかどうかを調べることができないため、実行の可能
性はない。ＩＢＤＶに対する撲滅制御プログラムの開始
を可能にするためには、ＩＢＤＶワクチン接種した動物
と現場のウイルスに感染した動物とを区別して、現場の
ビルレントウイルスの蔓延を減少させるための適切な手
段（例えば感染群の除外）を行うことができるような可
能性が存在することが強く望まれている。例えば、血清
学的に同定可能なマーカーの導入は、ＩＢＤＶの必須で
ない（糖）タンパク質をコードする遺伝子に変異を導入
し、感染した宿主動物での抗体の産生は依然として生じ
るようにすることにより達成できる。アウエスキー（Au
jeszky）病に対するマーカーワクチンおよびそれに伴う
診断テストは、この病気の制御において実際に有効であ
ることが証明されている。動物の他のウイルス感染病に
対するそのような制御プログラムは開発中であるが、本
発明以前には、ＩＢＤＶ制御プログラムに適するであろ
うＩＢＤＶワクチン株をベースとするワクチンは記載さ
れていない。この主な理由は、そのようなＩＢＤＶマー
カーワクチンの開発に対する必要条件が満たされなかっ
たということである。ゲノムＩＢＤＶ配列の許容位置ま
たは領域、すなわち感染および複製に必要な機能などの
ＩＢＤＶの必須機能を壊すことなく変異の挿入に使用で
きる位置または領域はまだ確認されていない。さらに、
ＩＢＤＶゲノムのそのような必須でない領域は、野生型
ＩＢＤＶに感染した動物の主な血清学的応答を誘起する
（糖）タンパク質をコードすべきであり、そのような領
域は以前には確認されていない。

【０００９】本発明は、予期しなかったことに、変異を
行うことができるビルナウイルスのセグメントＡ内の必
須でない遺伝子を見いだした。得られるビルナウイルス
変異体は、その遺伝子の天然の（本来の、native）発現
産物を産生しない。さらに、このビルナウイルス変異体
は、野生型ビルナウイルスに感染した動物とこのビルナ
ウイルス変異体をベースとしたワクチンで免疫感作した
動物との間の血清学的区別を行うことができるマーカー
ワクチンウイルスとして使用できる。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ビルナウイ
ルスゲノムのＶＰ５遺伝子における変異の結果として天
然のＶＰ５タンパク質を産生することができないビルナ
ウイルス変異体を提供する。

【００１１】好ましくは、ビルナウイルス変異体がＩＢ
ＤＶ変異体またはＩＰＮＶ変異体であり、ＩＢＤＶ変異
体が最も好ましく、特に血清型１のＩＢＤウイルス由来
のＩＢＤＶ変異体が本発明によって提供される。

【００１２】本発明は、天然のＶＰ５タンパク質を産生
することができないＩＢＤＶ変異体が、依然として細胞
を感染させ、これらの細胞でin vitro複製することがで
きることを見いだした。本発明に係るＩＢＤＶ変異体は
細胞培養において複製可能であることを例証する（実施
例２）。ＶＰ５^-ＩＢＤＶは、ＶＰ５⁺親ウイルスと比較
して、ニワトリの胚細胞における複製の遅延を示すが、
ウイルスの最終的な収量は同じである。すなわち、約10
^7.5TCID₅₀/mlである（実施例１）。さらに、ＩＢＤＶ変
異体は、家禽を感染させ、感染した宿主動物で in vivo
複製することができることを例証する。すなわち、ＶＰ
５タンパク質をコードする遺伝子が必須でない遺伝子で
あるという証拠を示す。実施例３は、ＶＰ５^-ＩＢＤＶ
がＩＢＤＶ変異体に感染した動物の臓器から再単離で
き、ＩＢＤＶ変異体が感染動物での保護免疫応答を誘導
することを示す。

【００１３】さらに、家禽での正常な抗−ＩＢＤＶ免疫
応答の一部がＶＰ５領域に向けられていることを本明細
書で証明した。これは、ＶＰ５タンパク質が非構造ウイ
ルスタンパク質である(Mundtら、J. Gen. Virol. 76, 4
37-443, 1995) と考えられていて、動物におけるウイル
ス性病原体に対する免疫応答は、通常は、ウイルスの構
造（糖）タンパク質に対して惹起されるので、かなり驚
くべきことである。これらの発見が、本発明に係るＩＢ
ＤＶ変異体および他のビルナウイルス変異体をマーカー
ワクチンに適するワクチン候補にしている。そのような
マーカーワクチンは、動物が野生型ビルナウイルス、例
えばＩＢＤＶ、またはワクチンウイルスに感染している
かどうかを決定するための可能性を提供する。

【００１４】さらに、ＶＰ５タンパク質は、ビルナウイ
ルス、特にＩＢＤＶの病原性の発現に関与し、また、ウ
イルス変異体の天然ＶＰ５タンパク質産生不能によりウ
イルスが弱毒化されることが見いだされた。

【００１５】

【課題を解決するための手段】「天然のＶＰ５タンパク
質を産生することができない」とは、ビルナウイルス変
異体が、血清学的テストによって天然のＶＰ５タンパク
質と区別することができるポリペプチドを産生し、また
はＶＰ５タンパク質を全く産生しないことを意味する。
例えば、前者の場合、ビルナウイルス変異体は、１以上
の免疫原エピトープに欠ける天然のビルナウイルスＶＰ
５タンパク質断片のみを産生する。

【００１６】好ましくは、本発明に係るビルナウイルス
変異体は、宿主細胞の感染時にＶＰ５タンパク質を産生
しない。

【００１７】上記したように、ビルナウイルスのゲノム
構成は十分確立されている。ＩＢＤＶおよびＩＰＮＶゲ
ノムは、大きいセグメントＡおよび小さいセグメントＢ
を含む。ＩＢＤＶのセグメントＡは、約110 kDa のポリ
タンパク質（ＶＰ２−ＶＰ４−ＶＰ３）をコードする大
きいオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。
ＶＰ５タンパク質をコードする遺伝子は、そのポリタン
パク質をコードするＯＲＦの前にあり、部分的に重複す
るビルナウイルスゲノムのセグメントＡ上の小さいＯＲ
Ｆとして、公知文献で同定され、本明細書に規定する(B
aylissら、J. Gen. Virol. 71, 1303-1312, 1990; Spie
s ら、J. Gen. Virol. 71, 977-981, 1990; Havarstein
L.S. ら、J. Gen. Virology 71, 299-308, 1990; Dobo
s ら、1995、前出; 本明細書の図１〜３および配列番号
１〜７）。ＶＰ５遺伝子に導入される変異は、ポリタン
パク質の発現を妨げないような変異である。

【００１８】配列番号１は、ＩＢＤＶＰ２株のセグメン
トＢの全長ｃＤＮＡヌクレオチド配列およびセグメント
ＢによってコードされるＶＰ１タンパク質のアミノ酸配
列を含む（配列番号２も参照）。配列番号３および５
は、各々、ＩＢＤＶＤ７８株のセグメントＡの全長ｃＤ
ＮＡ配列ならびにＶＰ５タンパク質およびポリタンパク
質のコード領域を示す。配列番号３および４は、Ｄ７８
ＶＰ５タンパク質のアミノ酸配列も示す。配列番号５お
よび６は、Ｄ７８のポリタンパク質ＶＰ２−ＶＰ４−Ｖ
Ｐ３のアミノ酸配列を示す。配列番号７は、ＶＰ５コー
ド領域に導入された変異を含む、Ｄ７８株のセグメント
Ａの５’−端を示す。配列番号８は、Ｄ７８株のセグメ
ントＢのヌクレオチド配列およびＤ７８ＶＰ１タンパク
質のアミノ酸配列を示す。両セグメントのゲノム構成
は、図１にも示す。

【００１９】ＶＰ５をコードするＯＲＦは、今まで発表
されたセグメントＡの配列全てにおいて保存されてい
る。ＩＢＤＶＯＲＦは145 個のアミノ酸をコードし、
分子量の計算値は16.5 kDaとなる。本明細書で使用する
ＩＢＤＶＤ７８株のＶＰ５タンパク質をコードするＯＲ
Ｆのヌクレオチド配列は、配列番号３および４に示す。
個々のＩＢＤＶ単離物の間には天然の変異が存在する可
能性がある。これらの天然の変異は、これらのウイルス
のゲノムの小さい相違から生じる。多くのＩＢＤＶ単離
物についてのＶＰ５遺伝子のヌクレオチド配列を含むセ
グメントＡのヌクレオチド配列は、公知文献に記載され
ている(Vakharia ら、Avian Diseases 36,736-742, 199
2; Bayliss ら、J. Gen. Virol. 71, 1303-1314, 1990;
Hudsonら、Nuc. Acid Res. 14, 5001-5012, 1986; Sch
nitzlerら、J. Gen. Virol. 47, 1563-1571, 1993; Kib
enge ら、J. Gen. Virol. 71, 569-577, 1990および Vi
rology 184, 437-440, 1991; Mundt ら、Virology 209,
10-18, 1995; Lana ら、Virus Genes 6, 247-259, 199
2; Vakhariaら、Virus Res. 31, 265-273, 1994; Brown
ら、Virus Res. 40, 1-15, 1996)。血清型ＩのＩＢＤ
Ｖ株由来のＶＰ５タンパク質のアミノ酸配列は、配列番
号３および４に示すＶＰ５アミノ酸配列と少なくとも95
％の相同性を示すが、血清型IIのＶＰ５配列と配列番号
３および４に示すアミノ酸配列との間の相同性は、少な
くとも75％である。従って、本発明に係る好ましいＩＢ
ＤＶ変異体は、変異が、本明細書に示すＶＰ５アミノ酸
配列とのアミノ酸配列レベルに関する相同性が少なくと
も75％、特に少なくとも95 %であるようにＶＰ５遺伝子
に導入されたＩＢＤＶ変異体である。

【００２０】好ましくは、本発明に係るＩＢＤＶ変異体
が、その分野で現在使用されているような、古典的また
は変異（例えば、変異ＥまたはＧＬＳ）ＩＢＤＶワクチ
ン株から誘導される。そのような適切なＩＢＤＶ株とし
ては、市販のワクチンに存在するＩＢＤＶワクチン株：
Ｄ７８、ＰＢＧ９８、ＬＺ２２８Ｅ、８９−０３（Inte
rvet International B.V.), Bursine 2 (Fort Dodge An
imal Health)およびＳ７０６（Rhone Merieux ）が挙げ
られる。

【００２１】本発明に係る特に好ましいＩＢＤＶ変異体
は、配列番号３および４に示すアミノ酸配列を有するタ
ンパク質をコードするＶＰ５遺伝子を含むＤ７８株から
誘導される。

【００２２】あるいは、本発明に係るウイルス変異体の
親ビルナウイルス株が、現場のビルレントビルナウイル
ス株である。本明細書では、ＶＰ５タンパク質が、伝染
力に関連する因子であり、ビルナウイルスにおける天然
のＶＰ５タンパク質の不在により、ウイルスの弱毒形が
生じることを示す。

【００２３】好ましくは、本発明は、ＶＰ５遺伝子のポ
リタンパク質をコードする大きいＯＲＦと重複しない部
分における変異の結果として、天然のＶＰ５タンパク質
を産生することができないビルナウイルス変異体を提供
する。

【００２４】特に、本発明に係るビルナウイルス変異体
は、ヌクレオチド１〜３０、好ましくは１〜２０、より
好ましくは１〜１０にわたるＶＰ５遺伝子の５’−端に
変異を含む。最も好ましくは、ＶＰ５遺伝子のヌクレオ
チド１〜３に変異を有するビルナウイルス変異体であ
る。

【００２５】変異は、天然のＶＰ５タンパク質を産生す
る天然のビルナウイルスのゲノムのこの領域に存在する
遺伝情報に関するＶＰ５遺伝子における遺伝情報の変化
であると理解される。変異は、例えば、核酸の置換、欠
失、挿入もしくは逆位またはそれらの組み合わせであ
る。

【００２６】本発明の好ましい実施態様では、変異が１
以上のヌクレオチドの置換であるビルナウイルス変異体
を提供する。特に、核酸の置換を開始コドンに導入し、
その結果、新しいコドンがメチオニンとは異なるアミノ
酸をコードするか、終結コドンを表し、好ましくは、核
酸の置換が、開始コドンのヌクレオチドの少なくとも２
個を含む。

【００２７】本発明に係るさらに別のビルナウイルス変
異体は、開始コドンとは異なるコドンに、望ましくは上
記した開始コドンにおける置換の他に、１以上のヌクレ
オチドの置換を含み、その結果、１以上の終結コドン、
好ましくは、上記で定義したＶＰ５遺伝子の５’−端を
生じる。好ましくは、ビルナウイルス変異体が、３個の
リーディングフレームの各々におけるＶＰ５遺伝子のこ
の領域に終結コドンを含む。

【００２８】そのような好ましいビルナウイルス変異体
は、ＶＰ５遺伝子の開始コドン、第四および第六コドン
に変異を有し、その結果、好ましくは配列番号７および
図３に示す変異コドンを生じるＩＢＤＶ変異体であって
もよい。

【００２９】あるいは、変異が欠失であるビルナウイル
ス変異体が提供される。特に、欠失は、20未満、10未満
または５未満のヌクレオチドを含む。好ましくは、欠失
が、３で割り切れないヌクレオチド総数を含み、その結
果、リーディングフレームのシフトが生じる。

【００３０】好ましくは、欠失がＶＰ５遺伝子の開始コ
ドンの１以上のヌクレオチドを含む。

【００３１】本発明の別の実施態様では、変異がビルナ
ウイルスゲノムにおける異種核酸配列の挿入を含むビル
ナウイルス変異体が提供される。異種核酸配列は、特定
のウイルス種の特定の挿入部位に通常は存在しない核酸
配列である。

【００３２】ビルナウイルスゲノムに挿入できる異種核
酸配列は、ポリペプチドをコードするか、非コード配列
である核酸断片である。核酸断片は、例えばウイルス、
真核生物、原核生物または合成源などあらゆる源から誘
導することができ、ＶＰ５遺伝子の発現の妨害に適する
オリゴヌクレオチドが挙げられる。

【００３３】ＶＰ５発現の妨害に適するオリゴヌクレオ
チドは、第二の異種核酸配列の挿入に有用な１以上の適
切な制限酵素開裂部位の他に、可能なリーディングフレ
ームの各々の両方向に３個の翻訳終結コドンを含むこと
ができる。そのような非コード異種核酸配列の長さおよ
びヌクレオチド配列は決定的ではないが、好ましくは、
８〜５０個のヌクレオチドである。

【００３４】本発明のさらに別の実施態様では、特定の
ビルナウイルスによる感染に対するワクチンの調製だけ
でなく、他の家禽または魚の感染病に対するワクチンの
調製にも使用できるビルナウイルス変異体が提供され
る。例えば、そのようなＩＢＤＶ変異体をベースとする
ベクターワクチンは、免疫感作した宿主の感染細胞内で
のこれらの鳥類病原体の抗原の発現により、他のトリ病
原体に対する免疫感作の可能性を提供する。本発明に係
るそのようなＩＢＤＶベクターは、本明細書で定義する
ように、ＶＰ５遺伝子にＩＢＤＶに対して異種のポリペ
プチドをコードする異種核酸配列を挿入することによっ
て得ることができる。

【００３５】異種核酸配列は、ニューカッスル（Newcas
tle）病ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、マレク（M
arek）病ウイルス、鳥類脳脊髄炎ウイルス、鳥類レオウ
イルス、鳥類インフルエンザウイルス、ニワトリ貧血ウ
イルス、サルネネラ種(Salmonella spp.) 、大腸菌(E.
coli) およびアイメリア種(Eimeria spp.)などの鳥類病
原体の抗原をコードすることができる。

【００３６】さらに、本発明に係るＩＢＤＶ変異体は、
ＶＰ５遺伝子における変異の他に、ＶＰ２遺伝子におけ
る変異を含み、この遺伝子は、２以上の抗原型のＩＢＤ
Ｖ（例えば、古典的、バリアント−Ｅおよび／またはＧ
ＬＳ）の中和エピトープを含むキメラタンパク質を発現
する。好ましくは、そのような変異体は、変異ＧＬＳ株
および古典的株の関係する保護ＶＰ２エピトープを含
む。特に、変異したＶＰ２遺伝子は、Ｂ６９エピトープ
をコードする核酸配列断片を含むＧＬＳＶＰ２遺伝子
である。そのような変異したＶＰ２遺伝子の構築は、Sn
yderら、Avian Diseases 38, 701-707, 1994に記載され
ている。

【００３７】さらに、薬剤または診断用途用ポリペプチ
ド、特にリンホカイン、インターフェロンまたはサイト
カインなどの免疫調節剤をコードする核酸配列をＶＰ５
遺伝子に挿入することができる。異種核酸配列は、大腸
菌β−ガラクトシダーゼまたは大腸菌β−グルクロニダ
ーゼなどのスクリーニング可能なマーカーをコードする
こともできる。

【００３８】ビルナウイルス変異体、特に本発明に係る
ＩＢＤＶ変異体の構築は、ＩＢＤＶに対して最近確立さ
れた感染性ｃＲＮＡ系によって達成できる(Mundtおよび
Vakharia, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11131-11
136, 1996)。この逆遺伝子系は、ＩＢＤウイルスのＲＮ
Ａゲノム、特にＶＰ５遺伝子への変異導入の可能性の道
を開いている。この逆遺伝子系における最も重要な工程
は、ＩＢＤウイルスのセグメントＡおよびＢの全長ｃＤ
ＮＡクローンを提供することである。セグメントＡまた
はＢを含むｃＤＮＡ構築体は、これらの両セグメントの
５’−および３’−端のヌクレオチドを含めて、Mundt
および Vakharia (1996 、前出) に記載の方法に従って
作製できる。さらに、これらの構築体は、セグメントの
どちらかに機能を発揮するように連結したＲＮＡポリメ
ラーゼプロモーターを含む。プロモターは、Ｔ７、ＳＰ
６またはＴ３ポリメラーゼに対するプロモーターであ
り、Ｔ７プロモーターが好ましい。変異は、この目的に
対して当技術分野で一般に公知の方法によってＶＰ５遺
伝子に導入することができる。特に、変異は、部位特異
的変異誘発によって導入される。

【００３９】例えば、第一工程では、少なくともＶＰ５
遺伝子の実質的な部分を含むｃＤＮＡ断片が提供され
る。次の工程では、適切なプライマー対を設計し、ＶＰ
５配列を含む断片とハイブリダイズさせる。５’−プラ
イマーは、ＶＰ５配列に相補的な配列の他に、所望の変
異、例えばＡＴＧ開始コドンをＡＧＧ（アルギニン）コ
ドンに変える変異を有するヌクレオチドを含む。さら
に、５’−プライマーには、完全な５’−端非コード配
列の修復を可能にする適切な制限酵素開裂部位を表す上
流ヌクレオチド配列を付与する。続いて、変異した新し
い断片をＰＣＲによって増幅し、その新しい断片を、適
切な制限酵素を使用して天然の核酸配列と置き換えるこ
とにより、出発配列に導入する。次の工程で、セグメン
トＡおよびＢのプラスセンス転写産物が、（Ｔ７）ＲＮ
Ａポリメラーゼにより in vitro で生成し、その後、合
成転写産物を、通常のＲＮＡ精製法を使用して精製す
る。本発明に係る組換えＩＢＤＶ変異体が、所望ならば
トランスフェクションを高める組成物（リポフェクチン
など）の存在下で、ＩＢＤＶゲノムの両セグメントの合
成ＲＮＡ転写産物により適切な細胞（例えば、ＶＥＲＯ
細胞、ＱＭ−７細胞またはＣＥＣ細胞）をトランスフェ
クションした後に得られる。最後に、組換えＩＢＤＶ
を、形質転換した細胞の上清から採取する。

【００４０】ビルナウイルスゲノムに変異を導入する方
法を本明細書に記載するが、当技術分野でも一般に使用
されている(Mundtおよび Vakharia, 1996 、前出; Curr
entProtocols in Molecular Biology, F.M. Ausubelら
編、Wiley N.Y., 1995版、pages 8.5.1.-8.5.9.)。

【００４１】ＩＢＤＶのＶＰ５ＯＲＦがＩＢＤＶゲノ
ムの必須でない領域であるという本発明者らによる予期
せぬ発見の他に、本発明に係るＩＢＤＶ変異体が保護的
免疫応答を誘導することができる、すなわち、ＩＢＤＶ
変異体を含むワクチンで免疫感作した動物は、病原性誘
発に対して保護されることも見いだされた。さらに、天
然のＩＢＤＶに感染した動物の抗血清は、非構造ＶＰ５
タンパク質に特異的な抗体を含み、これらの抗血清は、
本発明に係るＩＢＤＶ変異体に感染した動物由来の抗血
清と区別することができることが見いだされた。さら
に、上記したＩＢＤＶ変異体は、天然のＶＰ５タンパク
質を産生することができる親ＩＢＤウイルスと比較して
弱毒化されていることが見いだされた。

【００４２】従って、本発明の別の側面は、上記した特
徴を有するビルナウイルス変異体を薬剤的に許容され得
る担体または希釈剤とともに含む、動物をビルナウイル
ス感染に対して保護するのに使用されるワクチンであ
る。特に、本発明に係るワクチンは、上記したＩＢＤＶ
変異体を含む、家禽を伝染性ファブリキウス嚢病に対し
て保護するために使用されるワクチンである。

【００４３】本発明に係るビルナウイルス変異体は、生
きた、または不活化ウイルスとしてワクチンに混入する
ことができる。

【００４４】本発明に係るワクチンは、例えば市販のＩ
ＢＤＶ生または不活化ワクチンに対して通常使用される
ような常法によって調製できる。簡単に述べると、感染
しやすいサブストレートに、本発明に係るＩＢＤＶ変異
体を接種し、ウイルスが所望の感染力価に複製するまで
増殖した後、ＩＢＤＶ含有物質を採取する。

【００４５】ＩＢＤウイルスの複製を支持することがで
きるどのサブストレートも本発明で使用することがで
き、例えば、ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）もしくは
ニワトリ腎細胞（ＣＫ）などの一次（鳥類）細胞培養、
ＶＥＲＯセルラインもしくはＢＧＭ−７０セルラインな
どの哺乳類セルライン、またはＱＴ−３５、ＱＭ−７も
しくはＬＭＨなどの鳥類セルラインが挙げられる。通常
は、細胞をインキュベートした後、ウイルスを３〜１０
日間増殖させ、その後、細胞培養上清を採取し、所望な
らば、細胞壊死組織片を除去するために、濾過または遠
心分離する。

【００４６】あるいは、ＩＢＤＶ変異体を、胚含有鶏卵
で増殖させる。特に、これらのＩＢＤウイルスの増殖を
行うサブストレートは、ＳＰＦ胚含有卵である。胚含有
卵は、例えば、少なくとも10²TCID₅₀／卵を含む、0.2 m
lのＩＢＤＶ変異体を含む上清またはホモジネートを接
種し、次いで37℃でインキュベートすることができる。
約２〜５日後に、胚および／または膜および／またはア
ラントイン液を集めた後、この物質を適切にホモジネー
トすることにより、ＩＢＤウイルス産物を採取すること
ができる。ホモジネートは、その後、2500 x gで10分間
遠心分離し、次いで、上清をフィルター（100 μm）で
濾過することができる。

【００４７】生きたウイルスを含む本発明に係るワクチ
ンは、懸濁物または凍結乾燥形で作り、市販することが
でき、さらに、そのような組成物に対して通常使用され
る薬剤的に許容され得る担体または希釈剤を含む。担体
としては、安定剤、保存剤および緩衝剤が挙げられる。
適切な安定剤としては、例えば、ＳＰＧＡ、炭水化物
（ソルビトール、マンニトール、澱粉、ショ糖、デキス
トラン、グルタミン酸塩またはグルコースなど）、タン
パク質（乾燥乳血清、アルブミンまたはカゼインなど）
またはその分解産物が挙げられる。適切な緩衝剤として
は、例えば、アルカリ金属リン酸塩が挙げられる。適切
な保存剤しては、チメロサール、メルチオレートおよび
ゲンタマイシンが挙げられる。希釈剤としては、水、水
性緩衝剤（緩衝食塩水など）、アルコールおよびポリオ
ール（グリセロールなど）が挙げられる。

【００４８】所望ならば、本発明に係る生ワクチンは、
アジュバントを含むことができる。アジュバント活性を
有する適切な化合物および組成物の例は、下記に挙げる
ものと同じである。

【００４９】注射による投与、例えば本発明に係る生ワ
クチンの筋肉内、皮下投与が可能であるが、ワクチン
は、好ましくは、ＩＢＤＶワクチン接種に対して通常使
用される安価なマス投与法によって投与する。ＩＢＤＶ
ワクチン接種の場合、これらの方法としては、飲料水お
よび噴霧ワクチン接種が挙げられる。

【００５０】生ワクチンの別の投与法としては、in ov
o、点眼およびビーク浸漬投与が挙げられる。

【００５１】本発明の別の側面では、不活形のビルナウ
イルス変異体を含むワクチンが提供される。不活化ワク
チンの大きい利点は、長い期間、極めて高レベルの保護
抗体が達成できることである。

【００５２】増殖ステップ後に採取したウイルスの不活
化の目的は、そのウイルスの繁殖を排除することであ
る。一般に、これは、化学的または物理的手段によって
達成できる。化学的不活化は、ウイルスを例えば酵素、
ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、エチレン−
イミンまたはそれらの誘導体で処理することによって行
うことができる。必要であれば、不活化化合物をあとで
中和する。ホルムアルデヒドで不活化した物質は、例え
ば、チオスルフェートで中和できる。物理的不活化は、
好ましくは、ウイルスをエネルギーに富む照射、例えば
紫外線またはγ−線にかけることにより行うことができ
る。所望ならば、処理後、ｐＨを約７の値に調整するこ
とができる。

【００５３】不活化ビルナウイルス変異体を含むワクチ
ンは、例えば、この目的に適する１以上の上記した薬剤
的に許容され得る担体または希釈剤を含むことができ
る。

【００５４】好ましくは、本発明に係る不活化ワクチン
は、アジュバント活性を有する１以上の化合物を含む。
この目的に適する化合物または組成物としては、水酸
化、リン酸もしくは酸化アルミニウム、または、例えば
鉱物油（Bayol F（登録商標）または Marcol 52（登録
商標）など）もしくは植物油（ビタミンＥ酢酸塩および
サポニンなど）をベースとする油／水もしくは水／油エ
マルジョンが挙げられる。

【００５５】本発明に係るワクチンは、有効量のビルナ
ウイルス変異体、すなわち、ワクチン接種した鳥類にビ
ルレントウイルスによる誘発に対する免疫を誘導する量
の免疫感作ビルナウイルス物質を活性成分として含む。
免疫は、本明細書では、ワクチン接種した後の鳥集団に
おける、ワクチン接種していない群と比較してかなり高
いレベルの保護の誘発として定義する。

【００５６】典型的には、本発明に係る生ワクチンは、
動物１匹に対して10²〜10⁹TCID₅₀感染用量₅₀（TCID₅₀）
の用量、好ましくは10^5.0〜10^7.0TCID₅₀の範囲の用量で
投与することができ、不活化ワクチンは、動物１匹に対
して10⁵〜10⁹TCID₅₀と同等の抗原量を含むと考えられ
る。

【００５７】不活化ワクチンは、通常は非経口投与、例
えば筋肉内または皮下投与する。

【００５８】本発明に係るＩＢＤＶワクチンは、ニワト
リにおいて有効に使用できるが、七面鳥、ホロホロチョ
ウおよびヤマウズラなどの他の家禽もそのワクチンによ
って十分ワクチン接種することができる。ニワトリに
は、ブロイラー、生殖群および産卵群が含まれる。

【００５９】本発明に係る生ワクチンまたは不活化ワク
チンを受ける動物の年齢は、通常の生または不活化ＩＢ
ＤＶワクチンを受ける動物の年齢と同じである。例え
ば、ブロイラー（母に由来する抗体−ＭＤＡを含まな
い）は、１日齢でワクチン接種するが、ＭＤＡのレベル
が高いブロイラーは、好ましくは、２〜３週齢でワクチ
ン接種する。ＭＤＡレベルの低い産卵群または生殖群
は、１〜１０日齢でワクチン接種した後、６〜８および
１６〜２０週齢で不活化ワクチンの追加接種を行うこと
ができる。

【００６０】本発明はまた、本発明に係るＩＢＤＶまた
はＩＰＮＶ変異体の他に、各々、家禽または魚に対して
感染性である他の病原体由来の１以上の免疫原を含む混
合ワクチンも含む。

【００６１】好ましくは、混合ワクチンは、さらに伝染
性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ニューカッスル病ウイ
ルス（ＮＤＶ）、egg drop症候群（ＥＤＳ）ウイルス、
シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス（ＴＲＴＶ）またはレ
オウイルスの１以上のワクチン株を含む。

【００６２】ビルナウイルスに対するマーカーワクチン
の他に、適切な診断テストの利用可能性は、ビルナウイ
ルス撲滅制御プログラムの適用に対する必須要件であ
る。そのような診断テストは本明細書で提供するが、家
禽におけるＩＢＤＶ感染および魚におけるＩＰＮＶ感染
の測定法を含む。すなわち、上記したワクチンを接種し
た現場の動物を、天然のＩＢＤＶまたはＩＰＮＶに感染
した動物から区別する方法を提供する。

【００６３】従って、本発明は、ビルナウイルス感染を
検出する方法、特に、動物サンプルのＶＰ５抗体または
抗原の有無を調べる工程を含む、動物のＩＢＤＶ感染を
検出する方法を提供する。動物は、現場の動物であり、
特に鳥類、好ましくはニワトリである。動物から得るサ
ンプルは、ＩＢＤＶ抗体または抗原が存在するサンプル
であればいずれでもよく、例えば血液、血清または組織
サンプルが挙げられ、血清サンプルが好ましい。

【００６４】動物におけるビルナウイルス感染の好まし
い測定法は、ＶＰ５タンパク質に対する抗体を検出する
方法であり、（ｉ）抗−ビルナウイルス抗体を含む疑い
のあるサンプルをＶＰ５抗原とインキュベートする工
程、（ii）抗体−抗原複合体を形成させる工程、および
（iii)抗体−抗原複合体の存在を検出する工程を含む。

【００６５】このイムノアッセイの設計は変わり得る。
例えば、イムノアッセイは、競合または直接反応をベー
スとしてもよい。さらに、プロトコールは固体支持体を
使用してもよく、または細胞物質を使用してもよい。抗
体−抗原複合体の検出は、標識抗体の使用を含むことが
でき、標識は、例えば、酵素、蛍光分子、化学ルミネセ
ンス分子、放射性分子または染料分子である。

【００６６】サンプル中のＶＰ５抗体の適切な検出法と
しては、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光
試験（ＩＦＴ）およびウェスタンブロット分析が挙げら
れる。

【００６７】ＥＬＩＳＡを例にとると、ポリスチレンマ
イクロ滴定プレートのウェルをＶＰ５抗原で被覆する。
次に、被覆したプレートのウェルにニワトリ血清を充填
し、順次希釈を行う。インキュベートした後、ニワトリ
抗−ＶＰ５タンパク質血清抗体を、被覆したものと特異
性が同じであるが、標識されている（例えば、ビオチン
で標識）抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）
を検出することにより測定する。標識した抗体は、ニワ
トリ血清中の抗−ＶＰ５抗体によって占領されていない
遊離の抗原を占領する。例えば、アビジンに結合したホ
ースラディッシュペルオキシダーゼを添加し、ペルオキ
シダーゼの量を酵素反応によって測定する。ＶＰ５に対
する抗体がニワトリ血清サンプルに存在しない場合は、
最大の吸光度が得られる。血清がＶＰ５に対して多くの
抗体を含む場合は、低い吸光度が予想される。あるい
は、ニワトリ血清とともにインキュベートした後、ＶＰ
５抗原に結合した、血清中に存在する抗体の量は、抗−
ニワトリコンジュゲート、次いで酵素反応を使用して直
接測定できる。

【００６８】サンドイッチＥＬＩＳＡでは、ポリスチレ
ンマイクロ滴定プレートのウェルをＶＰ５タンパク質に
特異的なモノクローナル抗体で被覆することができる。
次に、これらの被覆したプレートのウェルは、ＶＰ５抗
原とともにインキュベートする。抗原を捕獲した後、ウ
ェルにニワトリ血清を充填し、順次希釈を行う。次い
で、上記したプロトコールを行うことができる。このテ
ストは、被覆したモノクローナル抗体の代わりにＶＰ５
に対するポリクローナル血清を使用することによっても
行うことができる。

【００６９】別の診断テスト（ウェスタンブロット分
析）では、ＶＰ５抗原（含有）物質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ
にかける。次に、分離したタンパク質をニトロセルロー
ス膜上に電気ブロットする。その後、膜をレーンに切り
分け、それらのレーンをニワトリ血清とともにインキュ
ベートする。サンプル中のＶＰ５抗体の存在は、抗体が
ＶＰ５抗原に結合したかどうかを、例えば抗−ニワトリ
コンジュゲート、次いで酵素反応を使用して調べること
により測定できる。ＶＰ５に対する抗体が存在する場合
は、約17 kDaのバンドが確認できる。

【００７０】ＶＰ５抗原は、ＶＰ５抗原−ＶＰ５抗体複
合体の形成を可能にする物質を含むどのＶＰ５タンパク
質（断片）でもよい。好ましくは、ＶＰ５抗原が通常の
組換え宿主細胞またはウイルスの発現産物、例えば、大
腸菌発現ＶＰ５(Mundtら、J.Gen. Virol. 76, 437-443,
1995) またはバキュロウイルス発現タンパク質(Vakhar
ia ら、Vaccine 12, 452-456, 1994; Vakharia ら、J.
Gen Virol. 74, 1201-1206, 1993)などを含む。本発明
のさらに別の実施態様によれば、上記した本発明に係る
診断テストを行うのに適した診断テストキットが提供さ
れる。

【００７１】特に、通常存在する成分の他に、免疫学的
試薬としてＶＰ５抗原（所望ならば固相上に被覆）を含
む診断テストキットが提供される。そのようなテストキ
ットに通常存在する他の成分としては、ビオチンまたは
ホースラディッシュペルオキシダーゼが結合した抗体、
酵素基質、洗浄緩衝剤などが挙げられる。

【００７２】現場の動物のテストサンプルにおけるビル
ナウイルスＶＰ５抗原を測定するために、ＶＰ５特異的
抗体を免疫学的試薬として使用し、好ましくは、固相に
固定する。テストサンプルを添加し、抗体−抗原複合体
を形成させるべくインキュベートした後、標識した第二
の抗体を添加してその複合体を検出することができる。

【００７３】

【実施例】実施例１組換えＶＰ５ ^-ＩＢＤウイルスの構築および分析ＩＢＤＶセグメントＡの全長ＶＰ５^-クローンの構築：
ＶＰ５陰性ＩＢＤＶを構築するために、Ｄ７８株セグメ
ントＡ(pUC19FLAD78;Mundt および Vakharia, Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 93, 11131-11136, 1996)の全長ｃ
ＤＮＡの３’−端のすぐ後ろのEcoRI 部位を欠失させ
た。Ｔ７ポリメラーゼ結合部位および続くセグメントＡ
の完全な配列を含むEcoRI-KpnI断片を切り出してEcoRI-
KpnI開裂ベクターpUC18 に挿入した後、そのベクター配
列内のユニークなNdeIを不活化して、プラスミドpAD78/
EKを得た。その後、ＶＰ５に対する開始コドンを含むゲ
ノム領域を、各々、プライマーA1F5' およびVP5MutR 、
ならびにVP5MutF およびA2R を使用して２片で増幅した
（プライマーの配列および位置に対しては表１を参
照）。ＰＣＲ断片を別々にクローン化し、次いで、各々
のプライマー内の変異によって作ったユニークなAflII
部位によって融合した（図２参照）。Ｔ７ポリメラーゼ
結合部位を含むEcoRI-NdeI断片および導入した変異を含
むセグメントＡの５’−部分を切り出して、pAD78/EKに
おける野生型EcoRI-NdeI断片との置換に使用し、プラス
ミドpAD78/VP5^-を得た。導入した３個の変異のうち、一
つはＶＰ５に対する開始メチオニンコドンをアルギニン
コドンに変えた（図２）。

【００７４】表１：変異体構築物の生成に使用したオリ
ゴヌクレオチドプライマーの配列

【００７５】

【表１】

【００７６】a)下線部のヌクレオチドは、ウイルス特異
的ヌクレオチドを示す。Ｔ７プロモーター配列は、イタ
リック体で示す。変異したヌクレオチドは太字であり、
プライマーの方向は、センス（＋）およびアンチセンス
（−）に対して示す。プライマーの位置は、血清型ＩＰ
２株の発表された配列に従って示す（Mundt ら、Virolo
gy 209, 209-218, 1995)。

【００７７】ｃＲＮＡからのウイルス回収：ＲＮＡプラ
スミドを in vitro 転写するために、pAD78/EK、pAD78/
VP5^-および pBP2 （図２）を、各々、BsrGI およびPstI
による開裂によって線状化した。線状化ＤＮＡの処理、
ＲＮＡの転写および精製、ならびにトランスフエクショ
ンは、Mundt およびVakharia(1996 、前出) の記載に従
って行ったが、トランスフェクションの実験について
は、二次ＣＥＣを使用した。トランスフェクションの３
日後、ＣＰＥをＣＥＣ中に見ることができた。細胞を凍
結／解凍し、700 x g で遠心分離して細胞の壊死組織片
を除去し、得られた上清を0.45μm のフィルターで濾過
して、−20℃で保存した。トランスフェクション実験の
ために、ＶＰ５を発現することができるＤ７８株のセグ
メントＡの全長ｃＤＮＡクローン（pAD78/EK）または発
現できないクローン（pAD78/VP5^-）を合成ＲＮＡに転写
し、セグメントＢ全長ｃＲＮＡとともにＣＥＣに共トラ
ンスフェクションした。得られたウイルスの子孫ＩＢＤ
Ｖ／ＥＫおよびＩＢＤＶ／ＶＰ５^-を、さらに解析し
た。

【００７８】免疫蛍光および放射線免疫沈殿アッセイ
（ＲＩＰＡ）によるトランスフェクション子孫の分析：
ＶＰ５を、Mundt ら (J. Gen. Virol. 76, 437-443, 19
95) の記載に従って、大腸菌で発現させた。ＶＰ５に対
するウサギモノ特異的ポリクローナル抗血清およびマウ
スモノクローナル抗体を、標準的プロトコールに従って
調製した。ＩＢＤＶ／ＶＰ５^-感染ベロ細胞、ＩＢＤＶ
／ＥＫ感染ベロ細胞および非感染細胞を、各々、ウサギ
抗−ＩＢＤＶ血清、ウサギ抗−ＶＰ５血清および抗−Ｖ
Ｐ５ mAb DIE 7とともにインキュベートし、蛍光−結合
二次抗体で染色した。抗血清およびモノクローナル抗体
の両方が、ＩＢＤＶ／ＥＫ感染細胞の細胞質におけるＩ
ＢＤＶ抗原を認識した。これに対して、抗−ＩＢＤＶ血
清は、ＩＢＤＶ／ＶＰ５^-感染細胞におけるウイルス抗
原を容易に検出したが、モノ特異的抗ＶＰ５血清もモノ
クローナル抗−ＶＰ５抗体も特異的反応性を示さなかっ
た。これらの免疫学的試薬はどれも、感染していない対
照とは反応しなかった。

【００７９】複製中に発現されるウイルスタンパク質を
分析するために、ＩＢＤＶ／ＶＰ５ ^-（図４、レーン１
〜３）およびＩＢＤＶ／ＥＫ（図４、レーン４〜６）を
感染させた放射能標識したＣＥＣの溶解産物を、ウサギ
抗−ＩＢＤＶ血清、ウサギ抗−ＶＰ５血清および mAb D
IE 7 によって免疫沈殿させた。感染していないＣＥＣ
を対照として使用した（図４、レーン７〜９）。ＩＢＤ
Ｖ／ＥＫ（レーン４）およびＩＢＤＶ／ＶＰ５^-（レー
ン１）感染ＣＥＣは、ウサギ抗−ＩＢＤＶ血清による免
疫沈殿により、ウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ３およ
びＶＰ４を示した。ウサギ抗−ＶＰ５血清（レーン５）
および mAb DIE 7（レーン６）は、ＩＢＤＶ／ＥＫ感染
細胞のみに由来する分子量21 kDaのＶＰ５を沈殿させ
た。ウサギ抗−ＶＰ５（レーン２）およびＶＰ５特異的
mAb DIE 7（レーン３）による沈殿においては、ＩＢＤ
Ｖ／ＶＰ５^-感染ＣＥＣは、特異的反応性を示さなかっ
た。感染していないＣＥＣは、特異的反応性を示さなか
った（レーン７〜９）。

【００８０】ＣＥＣにおけるＩＢＤＶ／ＶＰ５^-の複
製：ＩＢＤＶ／ＶＰ５^-の複製をさらに詳細に分析する
ために、一ステップ増殖を分析した（図５）。コンフル
エント二次ＣＥＣを、各々、10^7.2TCID₅₀を有するＩＢ
ＤＶ／ＥＫおよびＩＢＤＶ／ＶＰ５^-で感染させた。感
染細胞を5 mlの増殖培地で覆った直後に、各ウイルスの
１個の感染ＣＥＣ組織プレートの上清を取り出して、−
20℃で保存した（0 h p.i.）。残りの組織培養プレート
はさらにインキュベートし、4h、8h、16h 、24h および
48h p.i.上清を取り出して、−20℃で保存した。上清を
遠心分離し、標準的方法に従って力価測定した。感染後
の種々の時点でのTCID₅₀は、ＶＰ５発現ウイルス（ＩＢ
ＤＶ／ＥＫ）が、ＶＰ５に欠けるウイルス変異体（ＩＢ
ＤＶ／ＶＰ５^-）よりも速く複製することを示した。感
染の16時間後、ＩＢＤＶ／ＥＫは、ＩＢＤＶ／ＶＰ５^-
よりも100 倍高いことを示した（図５）。しかし、48h
p.i.では、ＩＢＤＶ／ＶＰ５^-は、10^7.2TCID₅₀/ml に達
し、これは、ＩＢＤＶ／ＥＫ（10^7.45TCID₅₀/ml ）と同
じであった。

【００８１】組換えＩＢＤＶＶＰ５^-−２の調製：プ
ラスミド pAD78/VP5^--2を、上記した方法と同様の方法
で調製した。変異誘発したＶＰ５遺伝子の一部のヌクレ
オチド配列を配列番号７および図３に示す。変異を含む
制限酵素断片を使用して、pAD78/EKにおける野生型EcoR
I-NdeI断片と置き換えた。組換えプラスミドの調製に対
するプロトコールの概略を図３に示す。pBD78 の構成も
図３に示す。組換えウイルスは、上記と同様に作製した
が、Ｄ７８株のセグメントＢ（配列番号８）を使用し、
ＱＭ−７細胞をトランスフェクション実験に使用した。

【００８２】実施例２種々のＩＢＤＶ株におけるＶＰ５タンパク質の同定種々のＩＢＤＶ株を、ＶＰ５遺伝子の発現について調べ
た。これは、免疫蛍光法（ＩＦＴ）を使用して行った。
マイクロタイタープレートで増殖させたニワトリ胚繊維
芽細胞に種々のＩＢＤＶ株を感染させた。37℃でのイン
キュベートの３〜５日後に細胞を70 %エタノールで固定
し、次いで、各々、ポリクローナルウサギ抗ＩＢＤＶ血
清（Ｒ1928）、ポリクローナルウサギ抗ＶＰ５血清（Ｒ
αＶＰ５）またはＶＰ５に対して特異的なモノクローナ
ル抗体（DIE7）で処理した。種々のＩＢＤＶ株に対する
ポリ−またはモノクローナル抗体の結合を、蛍光標識コ
ンジュゲート（ヤギ−抗−ウサギまたはヤギ−抗−マウ
ス）を使用することにより可視化した。結果を表２に示
す。

【００８３】表２：種々の血清型およびサブタイプのＩ
ＢＤＶ株の同定：ＶＰ５タンパク質の存在の測定

【００８４】

【表２】

【００８５】これらのデータから、種々の血清型および
サブタイプに属するＩＢＤＶの種々の株は、ＶＰ５遺伝
子を発現すると結論付けることができる。さらに、組換
えＶＰ５^-ＩＢＤＶワクチン株は、現場およびワクチン
ウイルスと区別することができ、従って、組換えＶＰ５
^-ウイルスはマーカーワクチンとして使用することがで
きる実施例３組換えＶＰ５ ⁺およびＶＰ５ ^-ＩＢＤＶワクチンの、市販
のＩＢＤＶ生ワクチンとの比較のための in vivoテストＩＢＤＶワクチンの調製：一次ニワトリ胚繊維芽細胞
（ＣＥＦ）を 2 × 10⁶/ml の最終濃度で調製した。細
胞は、5 ％のウシ胎児血清を含むイーグル最少必須培地
で培養した。この細胞懸濁物25 ml に、0.1 mlのＩＢＤ
Ｖ／ＥＫまたはＩＢＤＶ／ＶＰ５^-ウイルス（約3.0 log
10 TCID₅₀/mlの感染力価を有する）を添加した。37℃
の高湿度インキュベーターで５日間インキュベートした
後、懸濁物全体をさらに精製することなく動物実験に使
用した。上清の感染力価は、10^7.1TCID₅₀/ml であっ
た。

【００８６】動物実験：この実験では、種々のワクチン
（ＶＰ５陽性株ＩＢＤＶ／ＥＫおよびＶＰ５陰性株ＩＢ
ＤＶ／ＶＰ５^-ならびに市販のＩＢＤＶワクチン Nobili
sＤ７８株 (Intervet International B.V., NL)）の効
力を調べた。３週齢のＳＰＦニワトリを、処理計画に示
すように処理した。

【００８７】処理計画：

【００８８】

【表３】

【００８９】VP5⁺ＶＰ５陽性ワクチンクローンによる
嚢病（bursal disease）ワクチン接種、点眼法、用量は
動物１匹につき10^4.6TCID₅₀、0.1 ml VP5^-ＶＰ５陰性ワクチンクローンによる嚢病ワクチン
接種、点眼法、用量は動物１匹につき10^5.9TCID₅₀、0.1
ml D78 ＩＢＤＶワクチン NobilisＤ７８株による嚢病ワ
クチン接種、点眼法、１フィールド用量 ch 嚢病ウイルス Farragher F52/70株による誘発、点
眼法、用量は動物１匹につき10^2.0TCID₅₀、0.1 ml bl 血清学的実験；ＶＮ−検定／ウェスタンブロット x 嚢（bursae）に対する組織学的実験（H.E.染色）お
よびＭＣＡ−８ＥＬＩＳＡ xl 嚢に対する組織学的実験（H.E.染色）およびＭＣＡ
−８ＥＬＩＳＡならびにファブリキウス嚢由来のウイ
ルスの再単離 + 嚢の臨床実験および10日後の組織学的実験ファブリキウス嚢におけるウイルスの検出：点眼による
ワクチン接種の３、７、１４および２０日後、動物を屠
殺し、血液および嚢を得た。嚢中のウイルスの存在を、
モノクローナル抗体８（ＭＡＢ−８）の使用による固相
酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。ＭＡ
Ｂ−８は、ＩＢＤＶに対して特異的である。データを表
３に示す。

【００９０】さらに、ワクチン接種の３および７日後、
第２群の動物の嚢を、組換えＶＰ５^-ウイルスの存在に
ついて調べた。その目的のために、嚢をモジネートし、
ニワトリ胚繊維芽細胞上で培養した。ＶＰ５^-ウイルス
の存在は、ＩＢＤＶもしくはＶＰ５に対するポリクロー
ナルウサギ血清またはＶＰ５に対するモノクローナル抗
体を使用して、ＩＦＴにより測定した。調べた15の嚢の
うち13（87 %）からＶＰ５^-ウイルスを再単離し、同定
することができた（R1928 に対して陽性であり、 RαVP
5 およびDIE 7 に対して陰性である）。このことは、動
物の継代後のウイルスがなおもＶＰ５^-であることを示
し、これは、そのウイルスが安定であって、ＶＰ５⁺に
戻らないことを示している。さらに、種々のポリ−およ
びモノクローナル抗体の使用により、ＶＰ５^-ワクチン
ウイルスを、他の全てのワクチンおよび／または現場の
ＩＢＤＶウイルスと区別することができる。従って、Ｖ
Ｐ５^-ワクチンは、マーカーワクチンとして使用でき
る。

【００９１】誘発（challenge）の３日後、第１、２お
よび３群では、ウイルスが検出されなかった（ＭＣＡ−
８ＥＬＩＳＡ）。これに対して、第４群（ワクチン接
種していない対照群）の全動物は、誘発の３日後にファ
ブリキウス嚢に誘発ウイルスを含んでいた。それらの結
果は、組換えＶＰ５⁺でワクチン接種した動物（第１
群）、組換えＶＰ５^-でワクチン接種した動物（第２
群）およびＩＢＤＶワクチン NobilisＤ７８でワクチン
接種した動物（第３群）が、過酷な誘発に対して保護さ
れたことを示している。

【００９２】表３：ワクチン接種または誘発後の異なる
時点（日数）でのファブリキウス嚢におけるＭＣＡ−８
ＥＬＩＳＡによる個々のウイルス検出データ

【００９３】

【表４】

【００９４】ファブリキウス嚢における病変の検出：種
々のＩＢＤＶ（組換え）ワクチンまたは誘発ウイルスに
より誘起される病変の顕微鏡による平均得点を表４に示
す。

【００９５】誘発前は、組換えＶＰ５⁺ＩＢＤＶワクチ
ンでワクチン接種した（第１群）またはＩＢＤＶワクチ
ン NobilisＤ７８でワクチン接種した（第３群）動物の
嚢の病変は小〜中程度であった。誘発の３日後に、慢性
の病変のみがファブリキウス嚢で確認された。これは、
第１および３群の動物が誘発に対して保護されたことを
示す。さらに、誘発の１０日後には、非常に小さい病変
（ 0〜20％のリンパ球の消耗）のみがＶＰ５⁺組換えＩ
ＢＤＶワクチンまたは NobilisワクチンＤ７８でワクチ
ン接種した動物の嚢で確認された。これに対して、ワク
チン接種または誘発を行わなかった動物は、誘発の１０
日後に重い病変を示した。言い換えると、ＶＰ５⁺組換
えＩＢＤＶワクチンまたは NobilisワクチンＤ７８でワ
クチン接種した第１および３群の全動物（100％)が、過
酷な誘発に対して保護された。

【００９６】組換えＶＰ５^-ＩＢＤＶワクチンによるワ
クチン接種の３、７、１４および２０日後、ならびに誘
発の３および１０日後に、第２群の動物は、嚢の病変を
ほとんど示さなかった（ 0〜20 %のリンパ球の消耗）。
ＶＰ５^-組換えＩＢＤＶワクチンを接種した第２群の全
動物を第１または３群の動物（組換えＶＰ５⁺または市
販のワクチンを接種）と比較すると、組換えＶＰ５^-ワ
クチンは、病変の誘起が小さく、従って、この実験でテ
ストしたワクチンよりも安全で刺激が少ない。

【００９７】誘発の３日後、第４群のワクチン接種しな
かった全動物は、嚢に急性の重い病変を示した（全リン
パ球の消耗、得点 5.0）。誘発の１０日後には、全動物
（17匹中17匹）が全リンパ球の消耗を示した。これは、
これらの動物が、過酷な誘発に対して保護されなかった
ことを示す。誘発後に死亡した動物は、全部がファブリ
キウス嚢に重い病変を示した。対照の第４群は、過酷な
誘発に対して保護されず、これは、テスト条件が最適で
あったことを示すとの結論を下した。

【００９８】表４：ワクチン接種または誘発後の種々の
時点（日数）での嚢の病変の平均得点：病変の平均得点
は、次のように計算する。すなわち、ある一定の日に、
群毎に動物の全ての病変の得点を加える。この数値を次
いで、その日にその群で調べた動物の総数で割る。個々
の得点は１〜５の範囲である。得点０＝リンパ球の消耗
なし、得点１＝リンパ球の消耗が 0〜20％、得点２＝20
〜40 %、得点３＝40〜60％、得点４＝60〜80％および得
点５＝80〜100％（全リンパ球の消耗）

【００９９】

【表５】

【０１００】血清学的応答：動物の血清学的応答を、血
清による古典的伝染性嚢病ウイルス株の中和能をウイル
ス中和（ＶＮ）検定で測定することにより求めた。血清
は、ワクチン接種の３、７、１４および２０日後に調べ
た。中和力価の平均を表５に示す。

【０１０１】結果は、第１群のニワトリに適用した組換
えＩＢＤＶワクチンＶＰ５⁺が、ワクチン接種の２０日
後に良好で高い血清学的応答を誘起したことを示してい
る。これは、市販のＩＢＤＶワクチン NobilisＤ７８株
を接種したニワトリ（第３群）の血清学的応答に匹敵す
る。第２群のニワトリに適用した組換えＩＢＤＶワクチ
ンＶＰ５^-も、良好な血清学的応答を誘起した。ワクチ
ン接種の２０日後に9.4log 2 の力価が確認された。組
換えＶＰ５^-ＩＢＤＶワクチンによって誘起される血清
学的応答は、組換えＩＢＤＶＶＰ５⁺ワクチンまたは
市販のＩＢＤＶワクチン NobilisＤ７８株によって誘起
される血清学的応答と比較して遅かった。

【０１０２】ワクチン接種しなかった第４群は、ＩＢＤ
Ｖに対する血清学的応答を示さなかった。

【０１０３】表５：ワクチン接種後の異なる時点（日
数）での第１〜４群のＩＢＤＶ−ＶＮ平均力価（希釈度
の log 2として表す）

【０１０４】

【表６】

【０１０５】抗血清間の血清学的差異の認識：ＶＰ５に
対する血清学的応答を、ウェスタンブロット分析を使用
することにより調べた。この目的のために、ＶＰ５タン
パク質を大腸菌またはバキュロ発現系で発現させた。発
現したタンパク質をＳＤＳＰＡＧＥで分離した。次
に、タンパク質をニトロセルロース膜上に電気ブロット
した。その後、膜をレーンに切り分け、それらのレーン
をウサギ抗−ＶＰ５血清、ＶＰ５⁺組換えワクチンに対
して特異的なニワトリ血清、ＶＰ５^-組換えワクチンに
対して特異的なニワトリ血清またはＳＰＦニワトリ由来
の陰性血清とともにインキュベートした。データを表６
にまとめる。表６から分かるように、ＶＰ５^-血清は、
ＶＰ５に対する血清学的応答を誘起しない。これに対し
て、ウサギ抗−ＶＰ５血清およびＶＰ５⁺組換えワクチ
ンに対して特異的なニワトリ血清は、ＶＰ５タンパク質
を認識し、従って、ＶＰ５に対する血清学的応答を誘起
する。これは、ニワトリ血清が、動物がＶＰ５タンパク
質を発現するウイルス（例えば、現場のウイルス）また
はＶＰ５^-組換えワクチンに動物がさらされたかどうか
を調べるために使用できることを示している。

【０１０６】表６：ウェスタンブロット分析：ＶＰ５⁺
またはＶＰ５^-組換えワクチンを接種した動物由来の血
清ならびにＳＰＦニワトリ血清および抗ＶＰ５−ウサギ
血清のＶＰ５−タンパク質との反応を調べた。

【０１０７】

【表７】

【０１０８】死亡率および臨床上の徴候：ＶＰ５⁺ＩＢ
ＤＶワクチンを接種した動物（第１群）、組換えＶＰ５
^-ＩＢＤＶワクチンを接種した動物（第２群）または市
販のＩＢＤＶワクチン NobilisＤ７８株を接種した動物
（第３群）はいずれも、誘発後、死亡しなかったし、あ
るいは、伝染性嚢病の臨床上の徴候を示さなかった。こ
れは、それらの動物が、過酷な誘発に対して保護された
ことを示す。ワクチン接種していない対照群の動物は全
て、過酷な誘発に対して保護されなかった。

【０１０９】実施例４組換えＶＰ５ ^-−２ワクチンの in vivoテストＩＢＤＶワクチンの調製：一次ニワトリ胚繊維芽細胞
（ＣＥＦ）を、2 × 10⁶/ml の最終濃度で調製した。細
胞は、5％のウシ胎児血清を含むイーグル最少必須培地
で培養した。この細胞懸濁物の15 ml に、0.1 mlのＩＢ
ＤＶ／ＶＰ５^-−２（D78/D78/VP5^-）ウイルスを添加し
た。高湿度のインキュベーター（37℃）で６日間インキ
ュベートした後、上清を力価測定した。上清の感染力価
は、10^8.2TCID₅₀/ml であった。第二の動物実験に対し
ては、上清を希釈して、ワクチン用量を 10^5.5TCID₅₀／
動物とし、第一の動物実験の場合は、上清を希釈して、
10^4.0TCID₅₀／動物または10^5.0TCID₅₀／卵とした。

【０１１０】第一の動物実験：ワクチンの効果を、14日
齢での誘発ウイルスの投与によって得られる血清学的応
答および誘発耐性を測定することにより評価した。ワク
チン（10^5.0TCID₅₀／卵または10^4.0TCID₅₀／動物のD78/
D78/VP5^-）は、 in ovo または１日齢では筋肉内に投与
した。誘発の３および10日後の嚢の病変を顕微鏡により
調べた。誘発に対する保護を測定し、14日齢での血清学
的応答をＶＮ−検定によって測定した。

【０１１１】１．誘発の３および10日後の嚢の病変の顕
微鏡による平均得点

【０１１２】

【表８】

【０１１３】２．誘発後の保護

【０１１４】

【表９】

【０１１５】３．ＩＢＤＶに対する血清学的応答

【０１１６】

【表１０】

【０１１７】結論：１．D78/D78/VP5^-株は、かなり弱毒化されたＩＢＤ−ウ
イルスである。

【０１１８】２．そのウイルス株は非常にマイルドであ
る。

【０１１９】３．そのウイルスは、血清学的応答を誘起
することができる。

【０１２０】４．そのウイルスは、保護を誘起すること
ができる。

【０１２１】５．そのウイルス株は、１日齢のＳＰＦニ
ワトリに筋肉内注射によって投与することができ、18日
齢の胚含有ＳＰＦ卵には in ovo で投与することができ
る。

【０１２２】第二の動物実験：ワクチンの効果を、ガン
ボロワクチン投与の21日後に誘発ウイルスを投与するこ
とによって得られるＩＢＤＶに対する血清学的応答およ
び誘発耐性を測定することにより評価した。ワクチン
（10^5.5TCID₅₀／動物のD78/D78/VP5^-）は、14日齢のＳ
ＰＦニワトリに筋肉内投与した。ワクチン接種の３、
７、１４および２０日後ならびに誘発の３日後に、嚢、
脾臓、胸腺、肝臓、十二指腸、膵臓、ceacal tonsilsお
よび harderian腺の病変を顕微鏡で調べた。誘発の10日
後に、嚢の病変を顕微鏡で調べた。血清をＶＮ−検定で
テストし、誘発後の死亡率を記録した。

【０１２３】１．誘発後の死亡率（％）：

【０１２４】

【表１１】

【０１２５】２．誘発の前後のワクチン接種群の顕微鏡
による病変の調査：

【０１２６】

【表１２】

【０１２７】ＮＤ＝調査していない３．ワクチン接種後の血清学的応答

【０１２８】

【表１３】

【０１２９】結論１．D78/D78/VP5^-株は、かなり弱毒化されたＩＢＤ−ウ
イルスである。

【０１３０】２．そのウイルス株は非常にマイルドであ
り、臓器の病変を誘起しない。

【０１３１】３．そのウイルスは、血清学的応答を誘起
することができる。

【０１３２】４．そのウイルスは、保護を誘起すること
ができる。

【０１３３】

【配列表】

配列番号１配列の長さ：２８２７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：１１２．．２７４５配列

【０１３４】

【化１】

【０１３５】

【化２】

【０１３６】

【化３】

【０１３７】

【化４】

【０１３８】

【化５】

【０１３９】配列番号２配列の長さ：８７８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列

【０１４０】

【化６】

【０１４１】

【化７】

【０１４２】

【化８】

【０１４３】

【化９】

【０１４４】配列番号３配列の長さ：３２６１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：９７．．５３１配列

【０１４５】

【化１０】

【０１４６】

【化１１】

【０１４７】

【化１２】

【０１４８】配列番号４配列の長さ：１４５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列

【０１４９】

【化１３】

【０１５０】配列番号５配列の長さ：３２６１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：１３１．．３１６６配列

【０１５１】

【化１４】

【０１５２】

【化１５】

【０１５３】

【化１６】

【０１５４】

【化１７】

【０１５５】

【化１８】

【０１５６】

【化１９】

【０１５７】

【化２０】

【０１５８】配列番号６配列の長さ：１０１２配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列

【０１５９】

【化２１】

【０１６０】

【化２２】

【０１６１】

【化２３】

【０１６２】

【化２４】

【０１６３】配列番号７配列の長さ：３２６１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：９７．．５３１配列

【０１６４】

【化２５】

【０１６５】配列番号８配列の長さ：２８２７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：１１２．．２７４５配列

【０１６６】

【化２６】

【０１６７】

【化２７】

【０１６８】

【化２８】

【０１６９】

【化２９】

【０１７０】

【化３０】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＩＢＤＶのセグメントＡおよびセグメントＢの
ゲノム構成。数字は、セグメント上の開始、末端および
コード領域のヌクレオチドの位置を示す。

【図２】ＩＢＤＶ／ＶＰ５^-を調製するためのゲノムｃ
ＤＮＡの構築。プラスミド pAD78/EK は、ポリタンパク
質（ＶＰ２−ＶＰ４−ＶＰ３）およびＶＰ５をコードす
る完全なＤ７８セグメントＡｃＤＮＡを含む。プラス
ミド pBP2 は、ＶＰ１をコードする完全株Ｐ２セグメン
トＢを含む。変異をプラスミド pAD78/VP5^-に導入し
て、ＶＰ５に対するメチオニン開始コドンをアルギニン
に変え、人工の AflII 開裂部位を作った。組換えプラ
スミドを、下線を引いた制限酵素で線状化し、次いでＴ
７ポリメラーゼ転写を行った。

【図３】ＩＢＤＶ／ＶＰ５^-−２を調製するためのゲノ
ムｃＤＮＡの構築。プラスミドpAD78/EK は、ポリタン
パク質（ＶＰ２−ＶＰ４−ＶＰ３）およびＶＰ５をコー
ドする完全なＤ７８セグメントＡｃＤＮＡを含む。プ
ラスミド pBD78は、ＶＰ１をコードする完全Ｄ７８株セ
グメントＢを含む。変異をプラスミド pAD78/VP5^-に導
入して、ＶＰ５に対するメチオニン開始コドンをグルタ
ミン酸に変え、人工の BstBI開裂部位を作った。さらに
変異をアルギニンおよびグルタミンコドンに導入した。
組換えプラスミドを、下線を引いた制限酵素で線状化
し、次いでＴ７ポリメラーゼ転写を行った。

【図４】組換えＩＢＤＶ感染ＣＥＣ細胞由来のタンパク
質の放射線免疫沈殿。ＩＢＤＶ／ＶＰ５^-感染ＣＥＣ細
胞（レーン１〜３）、ＩＢＤＶ／ＥＫ感染ＣＥＣ細胞
（レーン４〜６）および未感染の対照のウサギ抗−ＩＢ
ＤＶ血清（レーン１、４、７）、ウサギ抗−ＶＰ５血清
（レーン２、５、８）および mAb DIE7 （レーン３、
６、９）による免疫沈殿を行った。分子量マーカー
（Ｍ）の位置を示す。ウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ
３、ＶＰ４およびＶＰ５の位置に印を付ける。

【図５】ＩＢＤＶ／ＥＫおよびＩＢＤＶ／ＶＰ５^-の複
製動力学。上清の感染力価（縦軸）を、指示した時間に
測定した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者アドリアーン・アントニウス・ウイルヘルムス・マリア・フアン・ローンオランダ国、5836・べー・べー・サムビーク、マースストラート・２・ベー

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ビルナウイルスゲノムのＶＰ５遺伝子に
おける変異の結果としての、天然のＶＰ５タンパク質を
製造することができないビルナウイルス変異体。
【請求項２】変異が置換であることを特徴とする、請
求項１に記載のビルナウイルス変異体。
【請求項３】変異が異種核酸配列の挿入であることを
特徴とする、請求項１に記載のビルナウイルス変異体。
【請求項４】異種核酸配列がポリペプチドをコード
し、異種核酸配列が、ウイルス変異体感染細胞において
その配列の発現を調節する発現制御配列の制御下にある
ことを特徴とする、請求項３に記載のビルナウイルス変
異体。
【請求項５】ビルナウイルスが伝染性ファブリキウス
嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）であることを特徴とする、請
求項１〜４に記載のビルナウイルス変異体。
【請求項６】変異が現場の病原性の強いウイルスのゲ
ノム中にあることを特徴とする、請求項５に記載のビル
ナウイルス変異体。
【請求項７】変異がワクチン株のゲノム中、好ましく
はワクチンＤ７８株中にあることを特徴とする、請求項
５に記載のビルナウイルス変異体。
【請求項８】変異体が、配列番号７に示すように、Ｖ
Ｐ５遺伝子の５’端に変異した開始コドンおよび３個の
終結コドンを有することを特徴とする、請求項５〜７に
記載のビルナウイルス変異体。
【請求項９】ＩＢＤＶが、ＩＢＤＶの種々の抗原型の
ウイルス中和エピトープを含むキメラＶＰ２タンパク質
を発現することを特徴とする、請求項５〜７に記載のビ
ルナウイルス変異体。
【請求項１０】請求項１〜９に記載のビルナウイルス
変異体および薬剤的に許容され得る担体を含むことを特
徴とする、動物のビルナウイルス感染に対するワクチ
ン。
【請求項１１】動物のサンプルを、抗−ＶＰ５抗体の
存在について調べることを特徴とする、動物のビルナウ
イルス感染を測定する方法。
【請求項１２】（ｉ）抗−ビルナウイルス抗体を含む
疑いがあるサンプルをＶＰ５抗原とともにインキュベー
トする工程、（ii）抗原−抗体複合体を形成させる工
程、および（iii)抗原−抗体複合体の存在を検出する工
程を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】請求項１１〜１２に記載の方法を行う
のに適した診断用テストキット。
【請求項１４】ワクチン接種した動物を天然のビルナ
ウイルスに感染した動物と区別するための、ビルナウイ
ルス変異体による天然のＶＰ５タンパク質の発現の欠如
のマーカーとしての使用。