JPH114695A5

JPH114695A5 -

Info

Publication number: JPH114695A5
Application number: JP1998117873A
Authority: JP
Filing date: 1998-04-14
Publication date: 2005-09-15

Description

【００５２】
【実施例１−４】
〈ヘッジホッグ蛋白質をコードするＤＮＡ断片と組換えＤＮＡの調製〉
実施例１−１（ａ）の方法で得た全ＲＮＡの１．５μｇを微量反応管にとり、これに、２μｌの５×逆転写酵素用緩衝液、１μｌのリボヌクレアーゼインヒビター、２μｌの０．１ＭＤＴＴ、１μｌの１０ｍＭｄＮＴＰミックス、３´ＲＡＣＥ（ＰＣＲの一変法）用のアダプタープライマーとして、常法により調製した５´−ＡＡＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＡＡＧＣＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＧＡＡＴＴＣＴＧＧＡＧ（Ｔ）_１７−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドの適量と、滅菌蒸留水を加えて全量２９μｌとした。さらに１μｌのギブコ・ビー・アール・エル製の逆転写酵素『スーパースクリプトＩＩＲＴ』を加え混合し、３７℃で１乃至１時間半保持して反応させ、ポリ（Ａ）付加ＲＮＡの３´末端を含む配列に対する第一ストランドｃＤＮＡを合成した。この反応産物の１μｌを鋳型として用い、常法により調製した、５´−ＧＧＣＴＴＣＧＡＣＴＧＧＧＴＣＴＡＣＴＡ−３´及び５´−ＡＡＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＡＡＧ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをそれぞれセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとして用いたこと以外は、実施例１−３と同じ条件でＰＣＲを行った（第１回ＰＣＲ）。このセンスプライマーの塩基配列は配列表の配列番号７に示す塩基配列における第４６０乃至４７９番目の塩基からなる配列と一致し、アンチセンスプライマーの塩基配列は上記アダプタープライマーの塩基配列に基づくものである。第１回ＰＣＲの後、反応産物を適量の滅菌蒸留水で希釈した。引き続き、当該希釈物を鋳型として用い、常法により調製した、５´−ＡＴＧＣＧＣＴＴＣＧＧＣＣＡＧＣＧ−３´及び５´−ＧＡＣＡＡＧＣＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをそれぞれセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとして用いたこと以外は、実施例１−３と同じ条件でＰＣＲを行った（第２回ＰＣＲ）。このセンスプライマーの塩基配列は配列表の配列番号９に示す塩基配列おける第３６９乃至３８５番目の塩基からなる配列と一致し、アンチセンスプライマーの塩基配列は上記アダプタープライマーの塩基配列に基づくものである。第２回ＰＣＲの後、反応産物を適量の滅菌蒸留水で希釈した。さらに引き続き、当該希釈物を鋳型として用い、常法により調製した、５´−ＧＴＴＣＧＣＧＣＣＧＣＴＣＡＣＣＧ−３´及び５´−ＴＡＣＧＡＣＧＡＡＴＴＣＴＧＧＡＧＴ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをそれぞれセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとして用いたこと以外は、実施例１−３と同じ条件でＰＣＲを行った（第３回ＰＣＲ）。このセンスプライマーの塩基配列は、配列表の配列番号９に示す塩基配列における第４２４乃至４４０番目の塩基からなる配列と一致し、アンチセンスプライマーの塩基配列は上記アダプタープライマーの塩基配列に基づくものである。第３回ＰＣＲで得られた反応産物を、２％アガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイドで染色された約７５０ｂｐのＤＮＡのバンドを含むゲルを切り出し、これに宝酒造製のＤＮＡ精製キット『Ｓｕｐｒｅｃ−０１』を適用してＤＮＡ断片を含む水溶液２０μｌを得た。

Claims

ヒト由来のデザート・ヘッジホッグ蛋白質。
配列表における配列番号１乃至３のいずれかに示すアミノ酸配列、又は、配列番号１乃至３のいずれかに示すアミノ酸配列において、実質的にヒト由来のデザートヘッジホッグ蛋白質の活性を消失しない範囲内で、１又は２以上のアミノ酸残基が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含んでなる請求項１に記載のヘッジホッグ蛋白質。
請求項１又は２に記載のヘッジホッグ蛋白質をコードするＤＮＡ又はそれに相補的なＤＮＡ。
配列表における配列番号４乃至６のいずれかに示す塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を含んでなる請求項３に記載のＤＮＡ。
自律複製可能なベクターに挿入された請求項３又は４に記載のＤＮＡ。
適宜の宿主に導入された請求項３乃至５のいずれかに記載のＤＮＡ。
請求項１又は２に記載のヘッジホッグ蛋白質を認識する抗体。
ヒト由来のソニック・ヘッジホッグ蛋白質をも認識する請求項７に記載の抗体。
モノクローナル抗体である請求項７又は８に記載の抗体。
請求項９に記載のモノクローナル抗体を産生しうるハイブリドーマ。
請求項３乃至５のいずれかに記載のＤＮＡを導入してなる形質転換体を培養することにより、ヘッジホッグ蛋白質を発現させる工程と、生成したヘッジホッグ蛋白質を採取する工程を含んでなるヘッジホッグ蛋白質の製造方法。
請求項７乃至９のいずれかに記載の抗体を被検試料に接触せしめる工程と、免疫反応に基づきヘッジホッグ蛋白質を検出する工程を含んでなるヘッジホッグ蛋白質の検出方法。