JPH11500308A

JPH11500308A - 新規ｃ−ＭＰＬリガンド

Info

Publication number: JPH11500308A
Application number: JP8523594A
Authority: JP
Inventors: アール．スタテン，ニコラス; ピー．ファーバラ，ジーン; イー．カーン，ラリー; エム．バウム，チャールズ; イー．ペッグ，ライル; ピー．マクカーン，ジョン
Original assignee: ジー．ディー．サールアンドカンパニー
Priority date: 1995-02-03
Filing date: 1996-02-01
Publication date: 1999-01-12
Also published as: US6254870B1; WO1996023888A1; EP0807181A1; CA2212006A1; AU4658596A

Abstract

(57)【要約】本発明は、造皿分化及び膨張活牲を有する、（血小板新生用）ヒトｃ−ｍｐｌリガンドに関する。

Description

【発明の詳細な説明】新規ｃ−ＭＰＬリガンド本出願は、1995年２月４日付けで出願され本明細書文献として援用した、米国特許出願番号第 08/383,035 号の一部継続出願である。発明の技術分野本発明は、造血の分化及び膨張活性を有するヒトｃ−ｍｐｌリガンド（トロンボポイエチン）に関する。発明の背景巨核球（ＭＫ）の成熟及び血小板の生成は、赤血球（エリトロポイエチン）及び顆粒球（Ｇ−ＣＳＦ）の膨張及び成熟を誘発するシトキン(cytokine)のように、系列特異性を有する液性成長因子により調節されていると昔から考えられてきた。血小板は、静脈の傷による出血を予防することができる。従って、血小板の生成は、造血調整作用にとって非常に重要な役割をもっている。化学療法又は骨髄移植を受けている患者は、通常、血小板濃度の著しい減少（血小板減少症）を経験しており、これによって出血による生命の危険に曝される恐れもある。既知成長因子のあるもの及びシトキン類が巨核球及び血小板生成を刺激することが見いだされているが、その多くは、生体外でも生体内でも多面的に作用する（ＩＬ −３、ＩＬ−６、ＩＬ−11、ＳＣＦ）。血小板減少症に罹ったイヌ及びヒトから採取した血漿、血清、及び尿は、全ての既知シトキン類とは異なる固有の巨核球生産及び血小板新生活性を有する成長因子を含んでいることが認められた。これらの因子は、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、ＭＫ−ＣＳＦ、巨核球成長及び発生因子（ＭＧＤＦ）、メガカリオポイエチン、及びトロンボポイエチンと命名された。しかし、その分子構造は、最近まで確認されるに至っていない。血小板新生シトキン、ｃ−ｍｐｌリガンドの特定は、骨髄増殖性白血病ウィルスの同定から始まった（ＭＰＬＶ，Ｗending ら，ＶＩＲＯＬＯＧＹ 149: 2 42-246[1986]）。このウィルスに感染したマウスは、多血統骨髄増殖を起こす。その後の研究（Ｓouyri ら，Ｃell 63: 1137-1147，[1990]）により、このレトロウィルスがウィルスエンベロープ遺伝子と融合したときに、造血成長因子レセプター科の細胞質ドメインに似た、膜固定たんぱく質を生成するオンコジーン（ｖ−ｍｐｌ）をコード化することが明らかになった。Ｖ−ｍｐｌは、ヒト及びネズミＲＮＡの相同性遺伝子ライブラリーの探索に使用された。ヒト及びネズミでクローンを特定し、ｃ−ｍｐｌと命名した（Ｖigon ら，ＰＮＡＳ 89: 5640-564 4[1992]，Ｖigonら，Ｏncogene 8: 2607-2615[1993]）。ｃ-ｍｐｌは、ｍＩＬ− ５ｒｃ、ＩＬ３ｒｃ、ＩＬ４ｒｃ、ｍＥＰＯｒｃ及びｍＧＣＳＦｒｃと相同部を有するシトキン・レセプター上科のメンバーである。ｃ−ｍｐｌ細胞内ドメイン及びｈＩＬ−４ｒｃ細胞内ドメインのキメラを、成長因子依存セルライン（ＢａＦ３）にトランスフェクトした。一度トランスフェクトすると、これらの細胞はｈＩＬ４に反応して増殖した。このことは、ｃ−ｍｐｌ細胞質ドメインが、増殖シグナルを形質導入するに充分な量存在することを示している（Ｓkoda ら，ＥＭＢＯＪ．12(7): 2645-2653[1993]）。多能性セルラインＴＦ−１、Ｍｏ−７Ｅ、ＵＴ−７及びＫＵ８１２、及び赤血球／巨核球セルラインＨＥＬ、ＤＡＭＩ及びＫ１５３を含む、逆トランスクリプターゼ・ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により、多くの造血セルラインにｃ−ｍｐｌのメッセージが見いだされた。転写体は、骨髄、胎児の肝臓、巨核球、血小板及びＣＤ３４＋濃縮細胞の中でも存在が確認された（Ｍethia ら，Ｂ lood82(5): 1395-1401[1993]）。推定レセプターの存在が実際に確認されたことにより、いくつかの研究チームが、天然に存在するｃ−ｍｐｌリガンドの探索を開始した。1994年６月、いくつかの報告が同時に出され、ｃ−ｍｐｌに結合し、巨核球生産性を有するリガンドに関して報告された（de Ｓauvage ら，Ｎature 369: 533-539[1994]；Ｌok ら，Ｎature 369:565-568[1994]；Ｗendling ら，Ｎature 369: 571-574[1994]；及びＢartley ら，Ｃell 77: 1117-1124[1994]）。ｃ−ｍｐｌリガンド、巨核球成長及び発生因子（ＭＧＤＦ）又はトロンボポイエチン（ＴＰＯ）と呼ばれるこのリガンドは、推定分子質量 35,000 kＤa のペプチドである。このたんぱく質は、エリトロポイエチン（153 個のアミノ酸からなる）と相同性を有するアミノ末端基ドメイン、並びにセリン、トレオニン及びプロリン残基に多数のカルボキシ末端基を含む２重ドメイン構造を有し、いくつかのグリコシル化された部位も含んでいる。アルギニン開裂を行い得る部位も２か所あり、これにより、25 kＤa及び 31kＤa型の２つの短いペプチドが生成し、これらの短いペプチドは生物活性を有している。ヒト、ネズミ、ブタ、イヌ、ラット及びウサギのｃ−ｍｐｌリガンドの間には高い種間相同性が存在し、殆ど全ての形が、試験を行った全ての種に対して活性を示した。ｃ−ｍｐｌリガンドは、ＣＤ３４＋細胞を刺激して、巨核球の特性を有する細胞に分化させることが分かっている。ＣＤ３４＋細胞は、ｃ−ｍｐｌリガンドの存在下に核内分裂を起こし（Ｋaushansky ら，Ｎature 369: 568-571[1994]）、巨核球系列に固有の細胞表面抗原ＣＤ４１ａの特徴を示した。形態特性も巨核球と同じであった。ｃ−ｍｐｌリガンドを生体内投与することにより、正常なマウスの循環血小板の濃度増加が起こった（Ｌok ら，Ｎature 369: 565-568[1994] ）。遺伝子ターゲティングにより生まれたｃ−ｍｐｌ欠乏マウスは、循環血小板及び巨核球濃度が85％の減少を示していたが、その他造血系列濃度は正常であった（Ｇurney ら，Ｓcience 265: 1445-1447[1994]）。これらの動物には、絶対血小板減少症は観察されず、このことは、ＭＫ系列の膨張において、他のシトキン類が何がしかの活性を有していることを示している。これまでの研究結果は、ｃ−ｍｐｌリガンドが、巨核球の成熟及び血小板の生産に対して固有活性を有するシトキンであることを示している。ＩＬ−３、ＩＬ −６、ＩＬ−11及びｃ−ｋｉｔリガンドを含む他のシトキン類は、巨核球の膨張及び分化に対して活性を有することが分かっている。最近の研究結果から、これらのシトキン類（ＩＬ−３を除く）は、ｃ−ｍｐｌリガンドの生産を刺激することによって効果を発揮するが、それ自体は巨核球刺激活性を持たないことが示されている（Ｋaushansky ら，ＰＮＡＳ 92:3234-3236[1995]）。ＧＢ2,285,446 は、巨核球及び血小板減少症の治療に使用される先祖巨核球の複製、分化及び成熟に影響を与える、ｃ−ｍｐｌリガンド（トロンボポエチン）及び種々の形のトロンボポエチンに関する。ｃ−ｍｐｌリガンドに、巨核球の増殖及び成熟、並びに血小板の生産を刺激する能力があることから、病気、もしくは放射線又は化学療法或いはその両者を併用して治療を行ったために血小板数が減少したような場合、循環血小板濃度を通常水準まで回復させるために、ｃ−ｍｐｌリガンドを使って治療できることが分かる。ＥＰ675,201 Ａ1は、ｃ−ｍｐｌリガンド（巨核球の成長及び発生因子［ＭＧＤＦ］）、ｃ−ｍｐｌリガンドの対立遺伝子の変種、及びポリエチレングリコールのような水溶性ポリマーに付加したｃ−ｍｐｌリガンドに関する。ＷＯ95/21920は、ネズミ及びヒトのｃ−ｍｐｌリガンド及びそのポリペプチド・フラグメントを提供する。これらのたんぱく質は、血小板生産を刺激するために、生体内及び生体外治療に使用できる。前に公報に掲載されたことのある要約書（Ｅaton ら，Ｂlood 84（10）補足要約書948,[1994]）には、ｃ−ｍｐｌリガンドの代替スプライス形として、ヒト、イヌ及びマウスで特定されたｃ−ＤＮＡについて報告されている。このコード化たんぱく質は、ａａ１１２−１１５の位置で４個のアミノ基が欠失している。この分子は、彼らが行ったバイオアッセイでは活性を示さなかったが、この変異体のｍＲＮＡは、３つの種全てで豊富に存在することが分かった。このことから、ｃ−ＤＮＡは天然に存在するｃ−ｍｐｌリガンドの代替形であると考えられる。我々は、前の報告に反して、１−１５３ Δ１１２−１１５ｃ−ｍｐｌリガンド及び１−３３２ Δ１１２−１１５ｃ−ｍｐｌリガンドが生物活性を有することを見いだした。発明の要約本発明は、下記の式で示される新規のｃ−ｍｐｌリガンドに関する。ここに、位置３７のＸａａはＴｈｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕである。位置４６のＸａａは、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ又はＭｅｔである。位置４７のＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕである。位置１１２のＸａａは、欠失又はＬｅｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、又はＭｅｔである。位置１１３のＸａａは、欠失又はＰｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、又はＭｅｔである。位置１１４のＸａａは、欠失又はＰｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、又はＭｅｔである。位置１１５のＸａａは、欠失又はＧｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、又はＡｓｎである。位置１２２のＸａａはＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、又はＡｓｐである。位置２００のＸａａはＴｒｐ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ及びＬｙｓ、又はＨｉｓである。また、１から１７９のアミノ酸をＣ末端基から除くことが可能であり、少なくともＸａａで示されるアミノ酸の一つは、天然に存在するｃ−ｍｐｌリガンド（１ −３３２）の対応アミノ酸と異なっている。本発明は、また、下記の式を有するｃ−ｍｐｌフラグメントを指向している。ここに、位置３７のＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕである。位置４６のＸａａは、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、又はＭｅｔである。位置４７のＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕである。位置１１２のＸａａは、欠失又はＬｅｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、又はＭｅｔである。位置１１３のＸａａは、欠失又はＰｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、又はＭｅｔである。位置１１４のＸａａは、欠失又はＰｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、又はＭｅｔである。位置１１５のＸａａは、欠失又はＧｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、又はＡｓｎである。位置１２２のＸａａは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、又はＡｓｐであり、また、少なくともＸａａで示したアミノ酸の一つは、天然のｃ−ｍｐｌリガンド（１−３３２）の対応アミノ酸とは異なっている。これらのｃ−ｍｐｌリガンド変異体は、増殖活性が増しているとか、副作用が減少しているとか、の生理的性質が改良されているとか、或いは半減期、安定性、再生効率が改善されているとか言った、物理学的プロフィールの改善が認められる。本発明によるｃ−ｍｐｌリガンドを生体内で使用することに加え、患者に注入する前に、骨髄及び血球を刺激して活性化したり成長させたりするように、生体外でこれを使用することも考えられる。本発明は、シトキン(サイトカイン)、リンフォカイン、インターロイキン、造血成長因子（ここでは一括して「コロニー刺激因子」と呼ぶ）を含む１つ又は２つ以上のコロニー刺激因子（ＣＳＦ）に結びついた、組み換えヒトｃ−ｍｐｌリガンドの突然変異たんぱく質からなるキメラたんぱく質も包含する。これらの因子には、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ− ６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−10、ＩＬ−11、ＩＬ−12、ＩＬ−13 、ＩＬ−15、ＩＬ−16、ＬＩＦ、ｆｌｔ３／ｆｌｋ２、ヒト成長ホルモン、Ｂ− 細胞成長因子、Ｂ−細胞分化因子、好酸球分化因子、及びスチール因子又はｃ− ｋｉｔリガンド又はＩＬ−３変異体としても知られ、リンカーを有し又はこれを有しない幹細胞因子（ＳＣＦ）も含まれる。これらのヒトｃ−ｍｐｌリガンド突然変異たんぱく質には、アミノ酸の置換、欠失、挿入の全て又は一部が含まれることもあり、Ｎ−及びＣ−末端基のいずれか又はその両方において、アミノ酸欠失がある場合もある。本発明には、共有結合ポリペプチドから形成される混合機能コロニー刺激因子（キメラたんぱく質）も含まれ、これらの因子は、それぞれ異なる固有細胞レセプターによって、補助生物活動を開始することができる。これらのキメラは、キメラ分子を形成している両方のペプチドが通常示す活性を示し、さらに、ヒトｃ −ｍｐｌリガンド又は第２コロニー刺激因子のそれぞれの機能を合計した生物学的又は生理学的活性より大きな活性を有するのがその特徴である。このキメラ分子は、驚くべきことに、ヒトｃ−ｍｐｌリガンド又は第２コロニー刺激因子の存在から予想される活性より高い活性を示し、或いは期待される活性と異なる活性を示す。このキメラ分子は、天然ヒトｃ−ｍｐｌリガンド又は天然シトキンに関連する好ましからざる生物活性が減少するなど、活性プロフィールの改善も認められる。本発明によるキメラ分子を生体内で使用することに加え、患者に注射する前に骨髄及び血球細胞を、刺激して活性化・成長させる能力を生体外で利用することも考えられる。本発明は、シトキン、リンフォカイン、インターロイキン、造血成長因子（ここでは、一括して「コロニー刺激因子」と呼ぶ）など、１種又は２種以上の付加コロニー刺激因子（ＣＳＦ）と共同投与する、組み換えヒトｃ−ｍｐｌリガンド変異体又は突然変異たんぱく質（muteins）も包含する。これらの因子には、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ− ７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−10、ＩＬ−11、ＩＬ−12、ＩＬ−13、ＩＬ−15 、ＩＬ−16、ＬＩＦ、ｆｌｔ３／ｆｌｋ２、ヒト成長ホルモン、Ｂ−細胞成長因子、Ｂ−細胞分化因子、好酸球分化因子、及びスチール因子又はｃ−ｋｉｔリガンドとしても知られる幹細胞因子（ＳＣＦ）も含まれる。本発明は、共同投与されるコロニー刺激因子も包含すし、これらの各刺激因子は、それぞれ異なる特定の細胞レセプターによって補助的な生物学的活動を開始させる働きもある。ｃ− ｍｐｌリガンド及び他のコロニー刺激因子の共同投与には、両方のペプチドの通常活性を有し、且つヒトｃ−ｍｐｌリガンド又は第２コロニー刺激因子の単独使用における効果の合計より大きな、生物学的又は生理学的活性を有することに特徴がある。驚くべきことに、同時投与により、活性効果が期待以上に高められ、或いはヒトｃ−ｍｐｌリガンド又は第２コロニー刺激因子又はヒトｃ−ｍｐｌリガンド変異体の存在から期待される効果とは、異なる効果が得られる場合もある。共同投与により、天然ヒトｃ−ｍｐｌリガンド又は天然シトキンに起因する好ましくない生物活性が減少するなど、活性プロフィールも改善される。本発明における生体への共同投与法に加え、骨髄及び血球細胞の活性化及び成長の刺激能力を、患者に注入する前に体外で利用することも考えられる。本発明におけるｃ−ｍｐｌリガンドだけを使用し、他のコロニー刺激因子と共同投与し、又はキメラ分子の構成成分として使用する方法は、血液銀行にも応用できるものと考えられる。このｃ−ｍｐｌリガンドを予めドナーに与えて血小板計数値を高めておけば、血小板移入コストを節減できる。好ましくは、本発明におけるｃ−ｍｐｌリガンドの突然変異たんぱく質は、ＳＣＦ、ｃ−ｋｉｔリガンド、ｆｌｔ３／ｆｌｋ２、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−３又はＩＬ−３変異体とのキメラたんぱく質と共投与するか、或いはこれらキメラたんぱく質に組み込んで使用するとよい。さらに好ましくは、本発明のｃ−ｍｐｌリガンドの突然変異たんぱく質は、Ｇ −ＣＳＦ、又はＩＬ−３変異体とのキメラたんぱく質と共投与し、或いはこれらをキメラたんぱく質に組み込んで使用するとよい。発明の詳細な説明本発明におけるｃ−ｍｐｌリガンド変異体は、造血系巨核球細胞濃度が減少する病気の治療に使用できる。ｃ−ｍｐｌリガンド変異体、即ち突然変異たんぱく質は、血小板減少症の治療又は予防に使用できる。現在、血小板減少症に対する唯一の治療法は、血小板の移入である。しかし、この方法は高価であり、また、これにより病気（ＨＩＶ、ＨＢＶ）に感染したり、同種異系免疫を起こす重大な危険性を秘めている。ｃ− ｍｐｌリガンド変異体又は突然変異たんぱく質を使用することにより、血小板移入の必要性を減らすことができる。ファンコーニ貧血、ウィスコット・アルドリッヒ症候群、又はメイ・ヘグリン症候群のような遺伝子欠失によって、ひどい血小板減少症が起こる。免疫性血小板減少紫斑、全身深在性エリテマトーデス、遺伝性の溶血性貧血、又は胎児母体不適合の場合のように、自己抗体又は同種異系抗体反応により、後天性血小板減少症が引き起こされる。これに加え、巨脾腫、播種性血管内凝固、血栓性血小板減少性紫斑病、ウィルス感染又は人工弁によって、血小板減少症が起こることもある。癌、或いは化学療法及び放射線療法又はそのいずれかにより、ひどい血小板減少症が起こることもある。骨髄がカルチノーマ、リンパ腫、白血病又は線維症に侵され、これによって、ひどい血小板減少症が起こることもある。本発明に係わるｃ−ｍｐｌリガンドにより、造血始原細胞及び幹細胞を末梢血の中へ可動化することができる。末梢血から誘導された始原細胞は、自家移植骨髄を定植させ、患者の再形成に有効であることが認められている。Ｇ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦを含む造血成長因子は、末梢血の中にある循環始原細胞及び幹細胞の数を増やすことも知られている。これによって、末梢幹細胞の採取操作を単純化でき、必要な血漿交換回数を減らすことにより、本操作に要するコストを大きく削減することができた。本発明によるｃ−ｍｐｌリガンドは、幹細胞の可動化に有効であり、末梢幹細胞の移植効率を、さらに高めることができる。このｃ−ｍｐｌリガンドにより、血漿交換の前に各ドナーの投与して、ドナーの血小板計数値を増加させることもできる。多くの薬剤が骨髄抑止症或いは造血欠失症の原因になることが知られている。このような薬剤の例に、ＡＺＴ、ＤＤＩ、アルキル化試薬、抗代謝剤のような化学療法用薬剤、クロラムフェニコール、ペニシリン、ガンシクロヴィール、ダウノマイシンのような抗生物質、フェノチアゾンのようなサルファ剤、メプロバメートのような精神安定剤、アミノピリン、ジピロンのような鎮痛剤、フェニトイン又はカルバマゼピンのような抗てんかん薬、プロピルチオウラシル、メチマゾールのような抗甲状腺薬、及び利尿薬がある。ｃ−ｍｐｌリガンドは、これらの薬剤で治療を受けた患者によく起こる、骨髄抑止症又は造血欠失症の予防又は治療に有効である。造血欠失症は、ウィルス、微生物又は寄生虫に感染して起こることもあり、腎臓病又は腎臓障害の治療、例えば透析を行うことにより起こることもある。ｃ− ｍｐｌリガンドは、このような造血欠失症の治療に有効である。幹細胞及び系列の制限を受けた始原細胞の増殖及び発育は、多数の造血成長因子或いはシトキンによって制御される。これらの成長因子の生体内における役割は複雑で、まだ充分に解明されていない。インターロイキン−３（ＩＬ−３）のような成長因子は、多能幹細胞及び系列による拘束を受けた始原細胞に刺激を与えることができる。エリトロポイエチン（ＥＰＯ）及びｃ−ｍｐｌリガンドのようなその他因子は、系列による拘束を受けている。造血には一連の複雑な細胞反応が関与する必要があり、これらの反応によって、幹細胞が連続的に生成し、全主要系列の成熟細胞の大集落を形成して行く。これら多くの増殖調節遺伝子は、生体外で、１−２種類のコロニー形成に刺激を与えることができ、各調節遺伝子により刺激されるコロニー形成のパターンは、極めて明確に区別できる。２種類の調節遺伝子が、全く同じコロニー形成パターンを刺激することはない。このパターン識別に使われる要素は、コロニーの数、並びに発育中のコロニーを形成している細胞系列及び成熟パターンであり、細胞系列及び成熟パターンは、より重要な要素である。増殖反応は、簡略化した生体外の培養系で容易に解析できる。３種類の全く異なる指標、即ちコロニーの大きさ、コロニーの数、細胞系列によって、コロニー形成パターンを区別することができる。より大きな数の後代を形成してコロニーサイズを大きくするなど、２つ以上の要因が始原細胞に作用することもある。２つ以上の要因が作用すると、より多くの始原細胞が増殖する。その理由は、只一つだけの要因に反応する、異なる小区分の始原細胞が存在するか、或いはある始原細胞が、２つ以上の要因の刺激を受けて始めて反応を起こすか、いずれかであると考えられる。２つ以上の要因により、一つの細胞上でさらに多くのレセプターが活性化されると、最初は別々だったシグナル経路が融合して、核に達する１つの共通経路を形成するために、細胞分裂シグナルの強度を高める可能性がある(Ｍetcalf Ｄ.，Ｎature 339: 27，1989。)相乗効果の説明に、その他の機構を考えることもできる。例えば、第２の要因により第２のシグナル経路が活性化され、これによって第１のシグナル経路が制約を受け、反応が増幅される場合である。ある場合には、あるレセプター型が活性化されると、これが他のレセプターの発現を誘発することも考えられる(Ｍetcalf Ｄ.，Ｂlood 82: 3515-352 3，1993)。２つ以上の要因がある場合には、その細胞系列が、要因が１つだけの場合と異なるパターンを示す可能性もある。本発明に係わるｃ−ｍｐｌリガンドを含むキメラ分子を使用するか、或いは本発明に係わるｃ−ｍｐｌリガンドを同時投与することによって、単一要因の場合には起こらなかった増殖反応が起こり、治療効果を高めることができる。本発明に係わる新規化合物は、下記グループのいずれかの式で示される。Ｒ₁−Ｌ−Ｒ₂，Ｒ₂−Ｌ−Ｒ₁，Ｒ₁−Ｒ₂，Ｒ₂−Ｒ₁，Ｒ₁−Ｌ−Ｒ₁，Ｒ₁−Ｒ₁ ここに、Ｒ１はｃ−ｍｐｌリガンド変異体であり、Ｒ２は、異なる、しかし補助的(相補的)な作用を有するコロニー刺激因子である。ここに言う補助活性とは、他の細胞修飾物質の反応を高めたり変化させたりする活性のことである。Ｒ１ポリペプチドは、直接又はリンカー・セグメントを介してＲ２ポリペプチドに結合している。ここに、「直接」とは、ポリペプチド同士がペプチド・リンカーなしで結合しているキメラを意味している。従って、Ｌは化学結合を表す場合もあり、Ｒ１とＲ２が結合して形成したポリペプチド・セグメントのフレームを表す場合もある。通常Ｌは線状ペプチドであり、Ｒ１のカルボキシ末端基がＬのアミノ末端基に、Ｌのカルボキシ末端基がＲ２のアミノ末端基に結合する形で、ＬにＲ１とＲ２がアミド結合で結びついている。「結合してフレームを形成する」とは、Ｒ１とＲ２をコード化する遺伝子の読取りフレームの間で、翻訳終結又は分断が起こっていないことを意味している。本発明に係わるｃ−ｍｐｌリガンド変異体と組み合わせることができる他の成長因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、シトキン、リンフォカイン、インターロイキン、Ｒ２の定義範囲内における増血成長因子には、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、エリトロポイチン（ＥＰＯ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ −６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−10、ＩＬ−11、ＩＬ−12、ＩＬ− 13、ＩＬ−15、ＩＬ−16、ＬＩＦ、ｆｌｔ３／ｆｌｋ２、ヒト成長ホルモン、Ｂ −細胞成長因子、Ｂ −細胞分化因子、好酸性分化因子、及びスチール因子又はｃ−ｋｉｔリガンドとしても知られる幹細胞因子（ＳＣＦ）などがある。これに加え、本発明には修飾Ｒ２分子、或いはこれらのＲ２分子をコード化する突然変異又は修飾ＤＮＡ配列の使用も包含される。さらに本発明には、Ｒ２がｈＩＬ−３変異体であるようなキメラ分子も包含される。「ｈＩＬ−３変異体」とは、ＷＯ94/12639、ＷＯ94/1 2638、ＷＯ95/00646で開示されたｈＩＬ−３変異体、及び当該技術で知られる、その他ｈＩＬ−３変異体として定義される。結合グループ（Ｌ）は、通常、１個から 500個のアミノ酸が配列したポリペプチドである。２個の分子を繋いでいるリンカーは、下記のように設計されていることが好ましい。即ち、（１）これら２つの分子が折り畳まれて、相互に独立に行動できること。（２）秩序ある二次構造を形成すると、これが２個のたんぱく質の機能ドメインを妨害する可能性があるので、そのような性向が無いこと。（３）疎水性又は荷電特性は、たんぱく質の機能ドメインと相互作用を起こす可能性があるので、このような特性がなるべく無いこと。（４）Ｒ１とＲ２が、単一細胞上にあるそれぞれの対応レセプターと同時に作用し合えるように、Ｒ１とＲ２を立体的に分離すること。柔軟たんぱく質領域にある表面アミノ酸には、通常、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒが含まれる。事実上、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒを含むアミノ酸配列の並べ換えが起こり、リンカー配列の上記基準が満たされることが期待される。Ｔｈｒ、Ａｌａのようなその他中性アミノ酸も、リンカー配列に使用できる。キメラの生成を容易にするために、リンカー配列に独自の抑制場を加えることによって、その他のアミノ酸もリンカーに加えることができる。このようなキメラ分子をつくる方法に関しては、ここに参考文献として掲げたＷＯ95/2 1254に、その全容が述べられている。活性を弱めたｃ−ｍｐｌリガンドも、キメラ分子に使用することができる。例えば、キメラ分子の他の成長因子構成成分の活性に比較して、ほんの少量、ＩＬ −３のような巨核球成熟活性及び血小板生成活性を加えれば、これが多能性幹細胞、及び巨核球を含む数系列の拘束始原細胞を刺激できるという利点が生じる。逆に、巨核球成熟活性及び血小板生成活性が、キメラ分子の他の成長因子構成成分の活性に比較して強いことが要求されるときには、活性を強めたｃ−ｍｐｌリガンドが使用できる。本発明に係わるｃ−ｍｐｌリガンドを、マウスの修飾Ｆｃ（ＩｇＧ２ａ）の定常領域に結合したキメラの構成成分の一つとすることも可能である（Ｇross Ａ .Ｈ.ら，Ｊ．Ｃlin．Ｉnvest．95: 2783-2789[1995]。このようなキメラは、ｃ−ｍｐｌリガンドの精製、たんぱく質の安定性増加、Ｆｃ領域におけるダイマーの精製に使用できるかも知れない。本発明の１つの側面は、幹細胞の選択的エクス・ビボ膨張の方法を提供することにある。「幹細胞」という用語は、全能の造血幹細胞、並びに骨髄、脾臓、又は末梢血から分離できる初期前駆細胞及び始原細胞を表している。「膨張」という用語は、細胞の分化及び増殖を表している。本発明は、幹細胞を選択的に半ビボ膨張させる方法を提供し、下記のステップからなる。即ち、（ａ）幹細胞を他の細胞から分離するステップ。（ｂ）当該分離幹細胞を、ｃ−ｍｐｌリガンド、又は部分的にｃ−ｍｐｌリガンドからなるキメラたんぱく質で構成された培地を選んで、その中で培養するステップ。（ｃ）当該幹細胞を収穫するステップ。幹細胞、及び将来好中球、赤血球、血小板などになる拘束始原細胞は、ＣＤ３４のような特定の始原細胞標識抗原が表面に存在するかどうか、或いはそれがどんな形態的特徴を持っているかによって、他の大部分の細胞から区別できる。高度に富化されたヒト幹細胞分画の表現型は、ＣＤ３４＋、Ｔｈｙ−１＋、ｌｉｎ−として報告されている。しかし、本発明は、この幹細胞固体群の膨張に限定されるものではない。ＣＤ３４＋で富化したヒト幹細胞分画は、既に報告されている多くの方法によって分離できる。これらの方法には、アフィニティカラム又はアフィニティビーズ、磁気ビーズ、或いはＣＤ３４＋のような表面抗原指向の抗体を使用するフローサイトメトリーなどがある。さらに、向流式水ひ法のような物理的な分離方法を用いて、造血始原細胞を富化することもできる。ＣＤ３４＋始原細胞は不均質で、さらにいくつかの小固体群に再分割できる。これらの小固体群は、種々の系列の細胞分子に関連した同時表現が，表面に有るかどうかによって特徴付けられる。成熟度が最も低い始原細胞には、ＨＬＡ−ＤＲ又はＣＤ３８のような、既知系列に関連した標識が表現されていない。しかし、これらの始原細胞にＣＤ９０（ｔｈｙ−１）は表現される。ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ７１、ＨＬＡ−ＤＲ、又はｃ−ｋｉｔのような、他の表面抗原も、造血始原細胞を選択的に分離するために使用できる。分離した細胞は、培養フラスコ、滅菌バッグ、又は中空繊維の中の選択培地で培養できる。種々のコロニー刺激因子を、選択的な細胞膨張に使用できる。これまで骨髄の半ビボ膨張に使用された代表的な要因には、ｃ−ｋｉｔリガンド、ＩＬ−３、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ｆｌｔ−３リガンド又はこれらの組合せがある。標準的な方法（例えば、血球計算盤、ＣＦＵ、ＬＴＣＩＣ）、或いはフローサイトメトリーによって、培養前後に幹細胞及び他の細胞の数を数えることによって、これらの幹細胞の増殖状況が監視できる。幹細胞のex-vivo膨張については、種々の選択方法、並びにｃ−ｋｉｔリガンド(Ｂrandtら，Ｂlood 83: 1507-1514[1994]、ＭcＫenna ら，Ｂlood 86:3413-3 420[1995])、ＩＬ−３(Ｂrandtら，Ｂlood 83: 1507-1514[1994]、佐藤ら，Ｂlo od 82: 3600-3609[1993])、Ｇ−ＣＳＦ(佐藤ら，Ｂlood 82: 3600-3609[1993]) 、ＧＭ−ＣＳＦ(佐藤ら，Ｂlood 82:3600-3609[1993])、ＩＬ−１(Ｍuenchら，Ｂlood 81:3463-3473[1993])、ＩＬ−６(佐藤ら，Ｂlood 82: 3600-3609[1993 ])、ＩＬ−11(Ｌemoliら，Ｅxp．Ｈem．21: 1668-1672[1993]、佐藤ら，Ｂloo d 82、3600─3609[1993])、ｆｌｔ−３リガンド(ＭcＫenna ら，Ｂlood 86: 341 3-3420[1995])、上記個々のコロニー刺激因子又はその組合せ(Ｂrandtら，Ｂl ood 83:1507-1514[1994]、Ｈaylock ら，Ｂlood 80:1405-1412[1992]、Ｋoller ら，Ｂiotechnology 11: 358-363[1993]、Ｌemoliら，Ｅxp．Ｈem．21:1668-167 2[1993]、ＭcＫennaら，Ｂlood 86:3413-3420[1995]、Ｍuenchら，Ｂlood 81:34 63-3473[1993]、Ｐatchen ら，Ｂiotherapy 7: 13-26[1994]、佐藤ら，Ｂlood 8 2:3600-3609[1993]、Ｓmith ら，Ｅxp．Ｈem．21:870-877[1993]、Ｓteen ら，Ｓtem Ｃells 12:214-224[1994]、辻野ら，Ｅxp．Ｈem．21:1379-1386[1993])を含む種々のコロニー刺激因子による膨張方法を用いた報告がある。個々のコロニー刺激因子の中で、ｈＩＬ−３は、末梢血ＣＤ３４＋細胞の膨張に最も効力のある因子の一つであることが示されている(佐藤ら，Ｂlood 82: 3600-3609[1993]、小林ら，Ｂlood 73: 1836-1841[1989])。しかし、単一の因子で、組合せ多重因子と同等の効力を有する因子は報告されていない。本発明は、ＩＬ−３単独よりさらに有効な分子を使用する、半ビボ膨張の方法を提供する。提案されている成長因子を使用するその他の臨床的な方法は、遺伝子治療の目的で、造血始原細胞及び幹細胞を生体内で活性化する方法であった。造血始原細胞の寿命が長いこと、及び娘細胞が体全体に分布していることにより、造血始原細胞は、半ビボ遺伝子移入に適している。必要な遺伝子を造血始原細胞又は幹細胞のゲノムに組み込むには、細胞分割及びＤＮＡの転写を刺激する必要がある。造血幹細胞のサイクル頻度は非常に低く、このことは、遺伝子の形質導入を促進するために成長因子が使えること、これによって臨床的な遺伝子治療の可能性が高まることを意味している。遺伝子治療応用の可能性(Ｒeview Ｃrystal，Ｓcie nce 270:404-410[1995])としては、１）多くの代謝障害及び免疫欠失症（Ｋay 及びＷoo，Ｔrends Ｇenet．10:253-257[1994])、２）精神障害(Ｆreedmann，Ｔrends Ｇenet．10:210-214[1994])、３）癌(Ｃulver 及びＢlaese，Ｔrends Ｇenet．10: 174-178[1994]、４）感染症(Ｇilboa及びＳmith，Ｔrends Ｇenet ．10: 139-143[1994])などの治療がある。当該技術に精通した者には、遺伝子物質を宿主細胞に導入する種々の方法が知られている。治療遺伝子を一次細胞の中へ移入するために、ウィルス性及び非ウィルス性のベクターが数多く開発された。ウィルス性ベクターには、複製欠失組み換えレトロウィルス（Ｂoris-Ｌawrie及びＴemin，Ｃurr．Ｏpin．Ｇenet．Ｄev．3: 102-109[1993]、Ｂoris-Ｌawrie及びＴemin，Ａnnal．Ｎew Ｙork Ａ cad．Ｓci．716:59-71[1994]、Ｍiller，Ｃurrent Ｔop．Ｍicrobiol．Ｉmmunol ．158: 1-24[1992])及び複製欠失組み換えアデノウィルス(Ｂerkner，ＢioＴech niques 6: 616-629[1988]、Ｂerkner，Ｃurrent Ｔop．Ｍicrobiol．Ｉmmunol ．158: 39-66[1992]、Ｂrody 及びＣrystal，Ａnnal．Ｎew Ｙork Ａcad．Ｓci ．716: 90-103[1994])などがある。非ウィルス性ベクターには、たんぱく質・ＤＮＡ複合体(Ｃristiano ら，ＰＮＡＳＵＳＡ 90:2122-2126[1993]，Ｃuriel ら，ＰＮＡＳＵＳＡ 88:8850-8854[1991]、Ｃuriel，Ａnnal．Ｎew Ｙork Ａcad ．Ｓci．716:36-58[1994])、エレクトロポレーションによる移入、及びカチオン性リポソームのようなリポソームを媒介とする移入（Ｆarhood ら，Ａnnal．Ｎew Ｙork Ａcad．Ｓci．716:23-35 [1994]）などがある。本発明は、新しい遺伝子物質の導入により、既存造血細胞膨張法の改良法を提供する。即ち、単一のコロニー刺激因子には見られないような活性を有するなど、生物学的性質が改良され、その上に物理的性質も改良されたキメラたんぱく質を使用する方法を提供する。本発明は、ｃ−ｍｐｌリガンド及びキメラたんぱく質をコード化し、遺伝子治療を行うために細胞に導入し得る遺伝子も提供する。本発明のもう一つの側面として、新規系列のヒトｃ−ｍｐｌリガンド突然変異たんぱく質を製造する新しい方法も提供する。本発明の方法には、ＤＮＡ配列のコード化を含む、新規ｃ−ｍｐｌリガンド突然変異ポリペプチドを表現するために、ベクターで形質転換した適切な細胞又は細胞系を培養することも包含される。適切な細胞又は細胞系としては、細菌性の細胞を使用することが多い。例えば、種々のＥ．coli 株は、生化学の分野では、宿主細胞としてよく知られている。このような菌株の例には、Ｅ．coli 株ＪＭ１０１(Ｙanisch-Ｐerronら，Ｇen e 33: 103-119[1985])及びＭＯＮ１０５(Ｏbukowicz ら，Ａppl．and Ｅnvir．Ｍicr．58: 1511-1523[1992])などがある。種々のＢ．subtilis 株も、この方法に使用できる。この技術に精通した人達には公知の酵母細胞の多くも、本発明におけるポリペプチド発現のために、宿主細胞として使用できる。本発明において、チャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ）のような、哺乳類の細胞も使用できる。哺乳類の細胞の異種遺伝子を発現させる通常の方法についても、調査が行われている(Ｋaufman，Ｒ．Ｊ．[1987]:Ｈigh level produc tion of proteins in mammalian cells，Ｇenetic Ｅngineering，Ｐrinciples and Ｍethods，Ｖol.9, Ｊ．Ｋ．Ｓetlow 編，出版Ｐlenum Ｐress，Ｎew Ｙor k)。発現ベクターが組み立てられ、哺乳類の細胞の中で機能する強力な促進因子が、真核性分泌シグナルペプチドのコード化領域における転写を促進し、これを翻訳してコード化領域に組入れ、ｃ−ｍｐｌリガンド変異体をつくる。例えば、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶのようなプラスミド (Ｉnvitrogen Ｃorp.，Ｓan Ｄiego，Ｃalifornia で入手できる）を使用することができる。ｃ−ｍｐｌリガンド遺伝子を含むベクターを組み立てた後で、このベクターＤＮＡを哺乳類の細胞に移入する。このような細胞としては、例えば、ＣＯＳ７、ＨｅＬａ、ＢＨＫ、ＣＨＯ、又はマウスのＬ細胞系がある。これらの細胞を培養し、例えばＤＭＥＭ培地（ＪＲＨＳcientific社）の中で培養する。細胞移入後の一過性発現から２４−７２時間後に、或いはネオマイシン耐性を有する細胞系を選択し、その安定細胞系を確立した後で、この培地の中へ分泌されたｃ−ｍｐｌリガンドを、標準的な生化学的方法で回収することができる。哺乳類宿主細胞の選択、及び形質変換、培養、増幅、スクリーニング及び生成物生産、精製の方法は文献に公知である。例えば、Ｇething 及びＳam brook、Ｎature 293: 620-625[1981]、或いはＫaufmanら，Ｍol．Ｃell Ｂiol ．5(7): 1750-1759[1985]、又はＨowley ら，米国特許第 4,419,446号を参照されたい。もう一つの適切な哺乳類細胞系は、サルのＣＯＳ−１細胞系である。ＣＶ−１細胞系も、これと同じように使える哺乳類細胞系である。必要なら、本発明の方法で、昆虫の細胞も宿主細胞として使用できる。これについては、例えば、Ｍiller ら，Ｇenetic Ｅngineering 8:277-298(Ｐlenum Ｐ ress 1986)及びその中に引用されている文献を参照されたい。これに加え、昆虫の細胞の中に、バキュロウィルスのベクターを用いて異種遺伝子を発現させる通常の方法については、Ｓummers，Ｍ．Ｄ.及びＳmith，Ｇ．Ｅ．(1987)− Ａ ma nual of methods for Ｂaculovirus vectors and insect cell culture procedu res，Ｔexas Ａgricultural Ｅxperiment Ｓtation Ｂulletin 第 1555号に述べられている。バキュロウィルス移植ベクターを含む発現ベクターを組み立て、この中で、（ポリヘドロン促進因子のような）強力なバキュロウィルス促進因子が、真核性分泌シグナルペプチドのコード化領域転写を促進する。このコード化領域は翻訳されてコード化領域に組み入れられ、ｃ−ｍｐｌリガンドのポリペプチドが得られる。例えば、プラスミドｐＶＬ１３９２（Ｉnvitrogen Ｃorp.,Ｓan Ｄiego，Ｃalifornia から入手できる）が使用できる。ｃ−ｍｐｌリガンド遺伝子を持ったベクターを組み立てた後、このＤＮＡ２マイクログラムをバキュロウィルス１マイクログラムとともに、昆虫細胞株ＳＦ９に同時移入する（Ｓumme rs 及びＳmith，1987を参照）。ｈＩＬ−３変異体を持つ、純粋な組み換えバキュロウィルスを使用して、培養される細胞、例えばＥxcell 401 の血清を除いた培地に感染させる(ＪＲＨＢiosciences，Ｌenexa，Ｋansas)。培地の中へ分泌されるｃ −ｍｐｌリガンドは、標準の生化学的方法で回収できる。本発明のもう一つの側面は、これら新規ｃ−ｍｐｌリガンド突然変異たんぱく質の発現方法で使用する、プラスミドＤＮＡベクターを提供する。これらのベクターは、上記の新規ＤＮＡ配列を含み、これが本発明に係わる新規ポリペプチドをコード化する。ｃ−ｍｐｌリガンド突然変異たんぱく質の発現能力を持った微生物を形質転換できる適切なベクターとして、ヌクレオチド配列を有する発現ベクターがある。このベクターは、転写及び翻訳調整配列に結合したｃ−ｍｐｌリガンド突然変異たんぱく質をコード化する。これらの突然変異たんぱく質は用いる宿主細胞に応じて選択される。上記の修飾された配列を組み込むベクターも本発明の範囲に含まれ、ｃ−ｍｐｌリガンド突然変異ポリペプチドの生産に使用することができる。この方法で使用されるベクターは、本発明のＤＮＡコード化配列の操作に関連して選択され、調節配列も含み、選択された宿主細胞の中で、その転写及び発現の方向付けを行う能力を有している。本発明のその他側面は、上記の状態を治療する方法及びこれに使用する治療用組成物に関する。このような組成物は、医薬品グレードの担体を使用し、これに本発明に係わる１種又は２種以上の、治療に有効な量のｃ−ｍｐｌリガンド突然変異たんぱく質を添加、混合して調製する。この組成物は、非経口投与、静脈内投与、皮下投与のいずれかの方法で投与できる。本発明で使用される治療用組成物は、発熱因子を含まない、非経口投与に適した水溶液の形で投与することが好ましい。このような非経口投与に適したたんぱく質溶液は、ｐＨ、等張性、安定性などに気をつけて調製するが、その方法は、当該技術に精通した者には公知である。上記の状態を治療する場合の投与計画は、治療に立ち会う医師が、薬剤の作用を修飾する種々の要因を考慮した上で決定する。これらの要因には、例えば、患者の病気の容体、体重、性別、食物、及び感染のひどさ、投与時刻、その他の臨床要因がある。通常、日常の養生は、体重１kg 当たり、未グリコシル化ｃ−ｍｐｌリガンドたんぱく質 0.1-100μ g/kgの範囲内にある。与えられた突然変異たんぱく質の活性によって、投与量を調節する。投与養生で使用する、体重１kg 、１日当たりの投与量は、0.1 マイクログラムという低い投与量でも、１マイクログラムという高い投与量でもよいことに注意しよう。これに加え、ｃ−ｍｐｌリガンド突然変異たんぱく質の投与量を、体重１ kg当たり、0.1-100μ g/kg の範囲より高く又は低く調節するような、特定の状況も存在すると考えられる。これらの状況には、他のＣＳＦ又は成長因子と同時投与する場合、化学療法薬品又は放射線或いはそのいずれかと同時投与する場合、グリコシル化ｃ−ｍｐｌリガンドを使用する場合、患者に既に本節で述べた種々の問題がある場合がある。上に指摘したように、本療法及び組成物には、他のヒト因子と同時投与する場合も含まれる。同時又は逐次投与する他の適切な造血剤、ＣＳＦ、インターロイキン、或いは本発明によるポリペプチドとのキメラの非独占リストには、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ− ６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−10、ＩＬ−11、ＩＬ−12、ＩＬ−13 、ＩＬ−15、ＩＬ−16、ＬＩＦ、ｆｌｔ２／ｆｌｋ３リガンド、Ｂ−細胞成長因子、Ｂ−細胞分化因子及び好酸性分化因子、スチール因子又はｃ−ｋｉｔリガンドとしても知られる幹細胞因子（ＳＣＦ）（これらを一括して「コロニー刺激因子」と呼ぶ）、又はこれらの組合せなどが含まれる。上記リストに加え、ＷＯ 9 4/12638、ＷＯ 94/12639、ＷＯ 95/00646 で開示されたＩＬ−３変異体も、同時投与するか、本発明によるｃ−ｍｐｌリガンドポリペプチドとのキメラとして使用できる。本発明によるｃ−ｍｐｌリガンドは、ＷＯ 95/20977 及びＷＯ 95/21 254 で開示されたような方法で、上述した他の「コロニー刺激因子」と同時投与するか、又はこれと結合して使用できる。上述した治療用組成物への添加量は、このような付加成分を勘案して調節される。治療を受けている患者の容体変化は、血液学的プロフィール、例えば分化細胞計数値などを定期的に評価することにより監視できる。ここに引用した全ての参考文献、特許、又は用途については、参考のために、その全容を記載した。組み換えＤＮＡ法他に記載が無い限り、全ての専門薬品はＳigma社(Ｓt Ｌouis，ＭＯ)から入手した。制限エンドヌクレアーゼ及びＴ４ＤＮＡリガーゼは、Ｎew Ｅngland Ｂiolabs(Ｂevedy，ＭＡ)から入手した。逆転写酵素及びポリメラーゼ連鎖反応ｃ−ｍｐｌリガンドの異性体は、逆転写酵素及びポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ／ＰＣＲ）の技術を使用して分離することができる。合成プライマーを、第１鎖相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の合成を活性化するために、ｃ−ｍｐｌリガンドＤＮＡ又はｍＲＮＡ（遺伝子銀行アクセス番号＃Ｌ３３４１０又は de Ｓauvage ら，Ｎature 369: 533-538[1994]）に基づくｃ−ｍｐｌリガンド配列にアニールするように設計する。その結果生じるｃＤＮＡをＰＣＲの鋳型として使用し（佐伯，1985）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ又はＤＮＡ）をつくり、この二本鎖ＤＮＡをその他のＰＣＲに使用するか、或いは適切な制限酵素とともに消化して、哺乳類のバキュロウィルス、或いはＥ．coliの表現プラスミドのような細菌類のバキュロウィルスに移入する。逆転写酵素（ＲＴ）反応のために、ヒト胎児の肝臓(ロット番号＃38130)及び成人の肝臓(ロット番号＃46018)のＡ＋ＲＮＡは、Ｃlontech 社(Ｐalo Ａlto，ＣＡ)から入手できる。このＲＴ反応は、Ｉnvitrogen 社(Ｓan Ｄiego，ＣＡ) から入手するcＤＮＡＣycle ＴＭＫitを使用して実施する。各ＲＮＡサンプル１マイクログラム(μg)を、ランダム・プライマー、オリゴｄＴプライマー、又は特殊３’アンチセンス・プライマーいずれかの存在下に、65℃で10分間かけて変性する。変性を行った後、このサンプルを氷の上で２分間冷却し、10,000ｘｇで10秒間遠心分離する。ＲＮＡｓｅ阻害因子、逆転写酵素緩衝液、デオキシヌクレオチド、ピロリン酸ナトリウム、及び逆転写酵素をメーカーの説明書に従って添加し、20マイクロリットルの反応液を42℃で１時間インキュベートする。ＰＣＲ特殊５’センス・プライマー及び特殊３’アンチセンス・プライマーをＲＴ反応液に添加し、Ｂoehringer Ｍannheim 社（Ｉndianapolis，ＩＮ）又はＰerkin-Ｅlmer 社(Ｎorwalk，ＣＴ)から入手した試薬を使用し、メーカーの説明書に従い、Ｔａｑポリメラーゼを使用して、ＰＣＲを実施する。ＰＣＲ反応に対して、94℃−１分、58℃−１分、72℃−90秒のサイクルを30回繰り返す。１ｘＴＢＥ／ＥｔＢｒ(トリスボレート−ＥＤＴＡプラス臭化エチジウム、Ｓambrook ら，Ｍolecular Ｃloning: ＡＬaboratory Ｍanual，第２版，Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory Ｐress 社，Ｃold Ｓpring Ｈarbor，ＮＹ[1989])の存在下に、１％ＳeaＫem ＲＬＥアガロース（ＦＭＣ社，Ｒockland，ＭＥ）ゲルを通してエレクトロフォレーシスを実施するために、10マイクロリットルの最終生成物に等容の負荷色素（ブロモフェノール青及びキシレンサイアノール青各 0 .01 ％）を添加する。分子量の標準として、ＨａｅＩＩＩ抑制酵素(Ｎew Ｅngla nd Ｂiolabs 社，Ｂeverly，ＭＡ)で消化した、１マイクログラムのｐｈｉＸ１７４ファージＤＮＡをゲルに負荷する。短波ＵＶを使用して、生成物（約 1090 個の塩基対）を視覚化する。Ｐromega 社(Ｍadison，ＷＩ)のＷizard ＴＭＰＣＲＰreps kitを使用し、この反応液を精製する。簡単に言えば、ＰＣＲ反応液を 100マイクロリットルのＤirect Ｐurification緩衝液に添加し、１ミリリットル（mＬ）のＰＣＲＰreps ＤＮＡＰurification Ｒesin をこの混合物に添加する。24℃で１分間インキュベートした後、上澄液を濾過カラムで真空濾過して除く。２mＬの80％イソプロパノールを使用して真空濾過し、樹脂を洗浄する。次に、樹脂を含むカラムを、10,000ｘｇで30秒間遠心分離し、残留イソプロパノールＰＣＲ生成物を、50マイクロリットルの10 mＭトリス−ＨＣｌ、１ mＭＥＤＴＡ、ｐＨ 7.4で、10,000ｘｇで30秒間遠心分離して溶出し、上澄液を新しい試験管に移す。ｃ−ｍｐｌリガンド型の発現ベクターへのサブクローニングｃ−ｍｐｌリガンドＰＣＲ生成物を適切な抑制酵素で消化し、バキュロウィルス、哺乳類発現ベクター、Ｅ．coli 発現ベクターのいずれかに結合する。哺乳類発現ベクターは、哺乳類発現カセットを含むｐＵＣ１８ベースのベクター（ｐＭＯＮ３３５９）の誘導体である。このカセットは、単純ヘルペスウィルス促進因子ＩＥ１１０（−８００から＋１２０）、及びｐＵＣ１８ポリリンカー（Ｈippenmeyer ら，Ｂio/Ｔechnology: 1037-1041[1993]参照）の中に予めサブクローニングされたＳＶ４０末期ポリアデニル化（ｐｏｌｙ−Ａ）シグナルを含んでいる。メーカーの説明書にある通り、37℃で１時間インキュベートして抑制酵素で消化してから、１％アガロース／1ＸＴＢＥ／ＥｔＢｒゲルを通して、エレクトロフォレーシスを行う。ＤＮＡの断片は、先ず長波ＵＶで視覚化し、Ｑia ex ＤＮＡＥxtraction キット（Ｑiagen 社，Ｃhatsworth，ＣＡ）を使用してゲル精製する。このＤＮＡの断片にＤＮＡ結合用樹脂を添加し、樹脂を水で満遍なく洗浄してから、アガロースで可溶化して樹脂から溶出する。このようにして精製したＤＮＡ生成物を、過剰モル数のＰＣＲベクター移入生成物と一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ用のメーカー推奨条件に従って、結紮反応を行わせる。細胞形質中で非相同たんぱく質の高レベル生産の方向付けをするＥ．coli表現ベクターは、他の論文に述べられている表現ベクター（Ｏlins ら，Ｍethods Ｅ nzym.，185: 115-119[1988]、Ｒangwalaら，Ｇene 122: 263-269[1992]）の誘導体である。この表現カセットは、ｒｅｃＡ促進因子及びＴ７遺伝子１０リボソーム結束場（ＲＢＳ）、並びに転写又はファージＰ２２遺伝子の縦列逆位反復（転写読み終わり暗号として作用）のＭ１３起始からなっている。これらのカセットは、ｐＢＲ３２７を転写起始とするプラスミド上にあり、遺伝子をコード化して、スペクチノマイシン又はアンピシリン抵抗を与える。Ｅ．coli菌株の形質転換ＴＧＩ(Ａmersham Ｃorp.社，Ａrlington Ｈeights，ＩＬ)、ＪＭ１０１(Ｙan ish-Ｐerron，Ｃ．ら，Ｇene 33: 103-119[1985])、又はＤＨ５α(Ｌife Ｔechn ologies 社，Ｇaithersburg，ＭＤ)などのＥ．coli菌株は、リゲーション反応の形質転換に使用され、哺乳類細胞に移入する場合のプラスミドＤＮＡ源となる。Ｅ．coli 菌株ＭＯＮ１０５及びＪＭ１０１は、Ａmerican Ｔype Ｃulture Ｃo llection 社(ＡＴＣＣ社，Ｒockville，ＭＤ)から入手でき、Ｅ．coli の細胞形質及び周縁細胞質空間に、異種ｃ−ｍｐｌリガンド型を表現する宿主細胞として使用できる。ＭＯＮ105 ＡＴＣＣ#55204: Ｆ-，lambda-,ＩＮ(rrnＤ，rrＥ)l，rpoＤ+，rpo Ｈ358 ＪＭ101 ＡＴＣＣ#33876: delta(pro lac)、supＥ，thi，Ｆ’(traＤ36，pro Ａ⁺Ｂ⁺，lacＩ^q，lacＺdeltaＭ15）ＴＧ1: delta（lac-pro），supＥ，thi，hsdＤ5/Ｆ’(traＤ36，proＡ⁺Ｂ⁺，l acＩ^q，lacＺdeltaＭ15）ＤＨ5α: Ｆ- Φ80dlacＺＭ15 Δ(lacＺＹＡ-argＦ)Ｕ169 deoＲ recＡl end ＡlhsdＲ17(r_K ^-，m_K ⁺)supＥ44 λ- thi-1 gyr96 relＡl1 Ｅ．coli 菌株には、ＣａＣｌ₂法によってＤＮＡ生着能力を持たせることができる。通常、Ｂaush ＆Ｌomb 社(Ｒochester，ＮＹ)製スペクトル分光光度計による 600ナノメートルにおける光学密度単位が約 1.0(ＯＤ600)になるまで、20−5 0 mＬの細胞をＬＢ培地（１％バクトトリプトン、0.5 ％バクトイースト抽出物、150 ミリモルＮａＣｌ）で成育させる。これらの細胞を遠心分離して採集し、ＣａＣｌ₂溶液（ＣａＣｌ₂ 50ミリモル、ｐＨ 7.4のトリスＨＣｌ10ミリモル）の１／５容培地中に再懸濁させ、４℃で30分間放置する。これらの細胞を再度遠心分離して採集し、ＣａＣｌ₂溶液の１／10容培地中に再懸濁する。結紮ＤＮＡを 0.2 mＬのこれら細胞に添加し、このサンプルを４℃で１時間保持する。さらに、このサンプルを42℃で２分間保持し、1.0 mＬのＬＢを添加してから、37 ℃で１時間振り混ぜる。これらのサンプルから得られる細胞を、抗アンピシリン形質転換株が欲しいときはアンピシリン（100 マイクログラム/mＬ、μ g/mＬ）を含むシャーレに、抗スペクチノマイシン形質変換株が欲しいときにはスペクチノマイシン（75μ g/mＬ）を含むシャーレ（ＬＢ培地プラス1.5 ％細菌寒天）に広げる。このシャーレを37℃で一晩インキュベートする。単一コロニーを拾い、適切な抗生物質を補ったＬＢ中で、37℃で６−16時間、振り混ぜながら育成する。コロニーを拾い、適切な抗生物質（100 μ g/mＬのアンピシリン又は 75 μ g/mＬのスペクチノマイシン）を添加したＬＢに接種し、37℃で振り混ぜながら成育させる。１μｌの細胞をＰＣＲで分析して、ｃ−ｍｐｌリガンド遺伝子の存在を確認してから、培養株を収穫する。ｃ−ｍｐｌリガンド遺伝子又はベクター、或いはその両方にアニールする組合せプライマーを使用して、ＰＣＲを実施する。ＰＣＲが完了したら、サンプルに負荷色素を添加して、前述したエレクトロフォレーシスを実施する。期待通りのサイズのＰＣＲ生成物が観察されたら、遺伝子はベクターへの結紮を完了している。ＤＮＡの分離及び特性評価Ｐromega Ｗizard ＴＭＭiniprep キット(Ｍadison，ＷＩ)又はＱiagen ＱＩＡwell Ｐlasmid 分離キット（Ｃhatsworth，ＣＡ）を使用して、プラスミドＤＮＡを分離する。これらのキットの操作法は、いずれも一般的には同じで、これらによってプラスミドＤＮＡを分離できる。簡単に言えば、細胞を遠心分離（5000 xg）してペレット化し、先ずＮａＯＨ処理、続いて酸処理を行ってプラスミドＤＮＡを放出させ、遠心分離(10000 x g)して細胞の残骸を除く。上澄液（プラスミドＤＮＡを含む）を、ＤＮＡ結合樹脂を含むカラムに供給し、カラムを洗浄し、ＴＥでプラスミドＤＮＡを溶出する。切形されたｃ−ｍｐｌリガンドのクローンから得られた 0.2−1.0μｇのプラスミドＤＮＡを、適切な抑制酵素で消化し、前述したようにエレクトロフォレーシスを行って、ベクターから放出されたｃ−ｍｐｌ遺伝子断片の存在を確認する。希望するプラスミドＤＮＡに宿を提供しているＥ．coliを、適切な抗生物質を添加した 100 mＬのＬＢ中へインキュベートし、空気インキュベーターの中で、37℃で一晩、振り混ぜながら育成する。Ｑiagen Ｐlasmid Ｍidi キット(Ｃhatsworth，ＣＡ)を使用して、プラスミドＤＮＡを分離する。このＭidi キットは、前述したＱiagen ＱＩＡwel l Ｐlasmid 分離キットのスケールアップ版である。このＤＮＡを使用して、ＤＮＡ配列の決定、抑制酵素による消化の続行、ＤＮＡ断片のサブクローニングの続行、哺乳類又はＥ．coli細胞への移入を行う。Ａpplied Ｂiosystems 社製（ＡＢＩ，Ｆoster Ｃity，ＣＡ）ＰＲＩＳＭＴＭＲeady Ｒeaction ＤyeＤeoxy ＴＭＴerminator Ｓequencing Ｓystem 又はＵnited Ｓtates Ｂiochemical 社(Ｃleveland，ＯＨ)製Ｓequenase ＴＭ第２版ＤＮＡ配列決定用キットを使用して、精製した組み換え二本鎖ＤＮＡの配列を決定する。ＡＢＩシステムでは、増幅を何度も繰り返す間に、４種類の蛍光標識を付けたジデオキシヌクレオチドを単一鎖ＤＮＡに組み込んで使用する。プラスミドＤＮＡ及び配列決定プライマーを反応混合物（ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、ヌクレオチドを含む）に添加し、この混合物について25サイクルの増幅を行う（96℃で30秒、50℃で15秒、60℃で４分）。増幅に続き、Ｐrincet on Ｓeparations 社（Ａdelphia，ＮＪ）に述べられている方法で、Ｃentri- Ｓepスピンカラム（水中で平衡させておく）を使用して、残留ヌクレオチドを除く。簡単に述べれば、２分間遠心分離（700 x g）して過剰の水を除いたカラムにサンプルを、供給し、精製配列決定用生成物を、４分間遠心分離（700 x g）して溶出させる。次にＳpeed Ｖac（Ｓavant 社，Ｈicksville，ＮＹ）でサンプルを乾燥し、負荷溶液を添加する。１ＸＴＢＥ中に７Ｍの尿素を含む4.75％のポリアクリルアミド配列決定ゲルを通して、70ワットの一定電力で、サンプルのエレクトロフォレーシスを行う。ＡＢＩシステムには、エレクトロフォレーシスを行ったときに各分差標識ＰＣＲ生成物を認識する、検出器が使用されている。Ｓequenase^TM配列決定システムで分析を行う場合、（メーカーの説明書に書いてあるように）プラスミドＤＮＡをＮａＯＨで変性し、水酸化アンモニウムで中和し、単一鎖ＤＮＡを得て、その配列を決定する。緩衝液の存在下で、配列決定プライマーを変性ＤＮＡに30分間アニールしてから、アルファ［³³Ｐ］デオキシアデノシン・トリホスフェート、ＤＤＴ、デオキシ及びジデオキシヌクレオチドを添加する。室温で５分間保持した後、反応液を４本の試験管に分割する。その各々は、追加分のデオキシヌクレオチド、及びジデオキシヌクレオチド１種類を含んでいる。37℃で５分間保持してから、反応を負荷色素で停止する。サンプルを80℃で２分間加熱し、７Ｍ尿素の１ＸＴＢＥ溶液を含む6.0 ％のポリアクリルアミド配列決定ゲル上で、70ワットの一定電力でエレクトロフォレーシスにかける。ゲルを10％酢酸中で30分間かけて固定し、80℃で30分間、真空乾燥する。乾燥したゲルをＸ線フィルムに隣接して一晩、室温で保持し、Ｅastman Ｋodak 社(Ｒochester，ＮＹ)製Ｘ-ＯＭＡＴＭ20 プロセサーを使用して、フィルムを現像する。新型ｃ−ｍｐｌリガンドの生産哺乳類細胞への移入及び馴化培地の生産ＢＨＫ−２１細胞系は、ＡＴＣＣ社(Ｒockville，ＭＤ)から入手できる。この細胞を、ダルベッコ修飾イーグル培地（高グルコースＤＭＥＭ）中で培養し、２ミリモル（mＭ）Ｌ−グルタミン及び10％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）に補充する。この処方は、ＢＨＫ育成培地と呼ばれている。選択培地は、453 単位／ mＬのハイグロマイシンＢ(Ｃalbiochem 社，Ｓan Ｄiego，ＣＡ)を補充したＢＨＫ育成培地である。ＢＨＫ−２１細胞系は、前に安定な状態でＨＳＶトランス活性化たんぱく質ＶＰ１６を移入したものである。このトランス活性化たんぱく質ＶＰ１６は、プラスミドｐＭＯＮ３３５９に見出されるＩＥ１１０促進因子をトランス活性化する(Ｈippenmeyer ら，Ｂio/Ｔechnology: 1037-1041[1993]参照)。ＶＰ１６たんぱく質は、ＩＥ１１０促進因子の背後に挿入された遺伝子表現の原動力となる。トランス活性化たんぱく質ＶＰ１６を表現するＢＨＫ−２１細胞は、ＢＨＫ−ＶＰ１６と呼ばれている。プラスミドｐＭＯＮ１１１８（Ｈighkin ら，Ｐoultry Ｓci．70: 970-981[1991]参照）は、ＳＶ４０促進因子から得られる抗ハイグロマイシン遺伝子を表現する。同じようなプラスミド（ｐＳＶ２−ｈｐｈ）が、ＡＴＣＣ社から入手できる。ＢＨＫ−ＶＰ１６細胞は、移入24時間前に、60ミリリットル（mm）の組織培養皿に、１皿当たり３x 10 5個が接種される。細胞は16時間で、10μｇのプラスミドＤＮＡを含む、３mＬのＯＰＴＩＭＥＭ"ＴＭ(Ｇibco-ＢＲＬ社，Ｇaithers burg，ＭＤ)の中に移入される。このプラスミドには目的の遺伝子が含まれ、その量は１皿当たり３μｇの抗ハイグロマイシン・プラスミド（ｐＭＯＮ１１１８）及び80μｇのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ"ＴＭ（Ｇibco-ＢＲＬ社）である。その後、この培地を吸い出し、３ mＬの成長培地と置換する。後移入後48時間目に、各皿の培地（一過性馴化培地）を集め、その活性を評価する。細胞をトリプシン−ＥＤＴＡにより皿から取り出し、１：10に希釈し、10 mＬの選択培地を含む 100 mm の組織培養皿に移す。選択培地に移してから約７日後、耐性細胞は成長して、直径５−６ミリメートルのコロニーを形成する。このコロニーを、（コロニーとほぼ同じ大きさに切り、トリプシン／ＥＤＴＡに浸した）濾紙とともに皿から取り出し、１ mＬの選択培地を入れた24個の凹みがあるシャーレの、個々の凹みに移した。クローンが成長して集合を形成した後、馴化培地の再評価を行い、確実なクローンを成長培地の中で展開する。Ｅ．coli から得られた組み換えｃ−ｍｐｌリガンドたんぱく質の発現及び精製目的のプラスミドを宿しているＥ．coli菌株ＭＯＮ１０５を、Ｎew Ｂrun swick Ｓcientific 社（Ｅdison，Ｎew Ｊersey）製空気インキュベーター型式Ｇ２５に入れ、37℃のＭ９＋カザミノ酸培地の中で、振り混ぜながら育成する。ＯＤ₆₀₀で、その値が 1.0に達するまで、育成状態を監視する。この値に達したら、ナリジクス酸(10ミリグラム /mＬ)の 0.1ＮＮａＯＨ溶液を添加して、最終濃度を50μ g/mＬに調節する。次に、この培地を37℃で、さらに３−４時間振り混ぜる。目的とする遺伝子生成物の生産量を最大にするために、培養期間中は高度のエアレーションを維持する。この細胞を顕微鏡で調べ、封入小体（ＩＢ）の存在を確認する。培養液１mＬを分取し、ペレット化細胞を煮沸し、還元性緩衝液で処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｍaniatis ら，Ｍolecular Ｃloning:ＡＬabo ratory Ｍanual[1982]参照）を通してエレクトロフォレーシスを行い、たんぱく質含量を分析する。遠心分離（5000 x g）して細胞をペレット化した後、音波処理又は均質化のいずれかの方法により、第１ステップのたんぱく質精製を行う。音波処理では、細胞を（培養サイズに対して）１／10容の音波処理用緩衝液（トリスＨＣｌ 10 mＭ、ｐＨ 7.5、ＥＤＴＡ１mＭ）に再懸濁する。これらの再懸濁細胞を、Ｈeat Ｓystems-Ｕltrasonics 社(Ｆarmingdale，Ｎew Ｙo rk)製ＳonicatorＣell Ｄisruptor 型式Ｗ−３７５のマイクロチップを使用し、音波処理で破裂させる。音波処理がどの程度進行したかは、光学顕微鏡でホモジェネートを調べて監視する。全ての細胞が破裂したら、ホモジェネートを４℃ で、ＪＡ−２０ローターとＪ２−２１遠心分離機（Ｂeckman 社製，Ｆullerton ，ＣＡ）を使用し、10000 x g で20分間遠心分離して分画する。もう一つの方法は、細胞を音波処理緩衝液の中で、Ｍanton-Ｇaulin ホモジナイザー（オランダ製）で溶解し、細胞からＩＢを放出させ、上記のようにして遠心分離する。ＩＢペレットの組み換えたんぱく質は高度に富化されているが、これに対してもう一度、上記の音波処理と遠心分離を繰り返す。この組み換えたんぱく質を、種々の標準法で精製する。最も一般的な方法として、ＩＢを４−６モルの尿素又はｐＨ９−12ノグアニジン−ＨＣｌ緩衝液で可溶化し、触媒量のシステイン、ベータ・メルカトエタノール、又はジチオスレイトールの存在下で、24−72時間空気酸化して折り畳む方法である。このたんぱく質を、Ｑ−セファローズ（陰イオン）又はＳ−セファローズ（陽イオン）のようなイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、疎水性クロマトグラフィー又は逆相ＨＰＬＣを使用して、残留Ｅ．coliから分離、精製する。イオン強度の弱い緩衝液に対して透析を行った後、精製たんぱく質を、凍結状態又は凍結乾燥して貯蔵する。変異体及びキメラたんぱく質をつくり、細菌、哺乳類又は昆虫の細胞の中に発現するために使用する組み換えＤＮＡ法について、その他の詳細、希望するたんぱく質の精製及び再折り畳み、並びにたんぱく質の生物活性決定のための評価方法に関する情報については、ここに文献として全容を引用した、ＷＯ 95/00646 、ＷＯ 94/12639、ＷＯ 94/12638、ＷＯ 95/20976、ＷＯ 95/21197、ＷＯ 95/20 977、ＷＯ 95/21254 の中に記述されている。本技術に精通した者に知られている、これ以上の詳細情報については、Ｔ．Ｍ aniatis ら，Ｍolecular Ｃloning，ＡＬaboratory Ｍanual，Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory(1982)（本特許に引用）及びその引用文献、及びＪ．Ｓamb rook ら，Ｍolecular Ｃloning，ＡＬaboratory Ｍanual，第２版，Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory(1989)（本特許に引用）及びその引用文献の中に述べられている。以上の説明により、当該技術に精通した者であれば、本発明を最大限に活用できるものと考えられる。従って、下記の優先態様は単なる例証であり、ここに開示されていない内容について、これが制限を加えるものでは決してない。例１ｃ−ｍｐｌリガンド遺伝子生成物の分離Ａ．逆転写酵素反応ヒト胎児(ロット番号# 38130)及び成人の肝臓(ロット番号# 46018)のＡ＋ＲＮＡは、Ｃlontech 社(Ｐalo Ａlto，ＣＡ)から入手した。第１鎖ｃＤＮＡの反応は、Ｉnvitrogen 社(Ｓan Ｄiego，ＣＡ)から入手したｃＤＮＡＣｙｃｌｅ^TMキットを使用して実施した。第１の逆転写酵素反応（ＲＴ＃１）では、ランダムプライマー（ｃＤＮＡＣｙｃｌｅ^TMキットとともに供給）を使用した。第２の逆転写酵素反応（ＲＴ＃２）では、オリゴｄＴプライマー（ｃＤＮＡＣｙｃｌｅ^TM キットとともに供給）及び特定３’アンチセンスプライマー、ｃ−ｍｐｌＥｃｏＲＩ［ＳＥＱＩＤＮｏ：２３(配列番号２３)］を使用した。ｃ−ｍｐｌＥｃｏＲＩプライマーは、ｃ−ｍｐｌリガンド遺伝子コード化配列(Ｇenebankアクセス番号＃Ｌ33410又は de Ｓauvage ら，Ｎature 369: 533-538[1994])のｃ−ｍｐｌリガンド配列に基づく塩基番号＃1257−1278）の３’末端にアニールし、ＥｃｏＲＩ制限酵素サイト３’を読み終わりコードンに合わせてコード化する。Ｂ．重合酵素連鎖反応１．１−３３２ｃ−ｍｐｌリガンド１−３３２アミノ酸ｃ−ｍｐｌリガンド遺伝子断片を増幅するために、逆転写酵素反応ＲＴ＃１及びＲＴ＃２の生成物を、ＰＣＲにおける鋳型として使用した。第１の重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ＃１）においては、ＲＴ＃１が鋳型として役立ったので、プライマーｃ−ｍｐｌＥｃｏＲＩ［ＳＥＱＩＤＮＯ：２３］及び５’センスプライマーｃ−ｍｐｌＢｇｌＩＩ［ＳＥＱＩＤＮＯ：２４］を反応に添加した。ｃ−ｍｐｌＢｇｌＩＩ［ＳＥＱＩＤＮＯ：２４］プライマーは、ｃ−ｍｐｌリガンド遺伝子（塩基＃２０７−２３０）のコード化配列の５’ 末端にアニールし、ＢｇｌＩＩ制限酵素サイト５’を、読み始め暗号メチオニンコードンに合わせてコード化する。（ＰＣＲ＃２）において、ＲＴ＃２は鋳型として役立ったので、ｃ−ｍｐｌＢｇｌＩＩ［ＳＥＱＩＤＮＯ：２４］プライマーのみを添加した。２．１−１５３ｃ−ｍｐｌリガンド１−１５３アミノ酸ｃ−ｍｐｌリガンド遺伝子の断片を、下記プライマーの組合せを用いて増幅する場合に、ＰＣＲ＃２が鋳型として役立った。ｃ−ｍｐｌＮｃｏＩ［ＳＥＱＩＤＮＯ：２５］、ｃ−ｍｐｌＨｉｎｄＩＩＩ［ＳＥＱＩＤＮＯ：２６］、Ｅｃｏｃｍｐｌ［ＳＥＱＩＤＮＯ：２９］重合酵素連鎖反応＃３（ＰＣＲ＃３）において、翻訳読み終わりコードンで、アミノ酸＃１５３に続いて１−１５３ｃ−ｍｐｌリガンドを生成させるために、ｃ−ｍｐｌＮｃｏＩ［ＳＥＱＩＤＮＯ：２５］及びｃ−ｍｐｌＨｉｎｄＩＩＩ［ＳＥＱＩＤＮＯ：２６］プライマーを使用した。ｃ−ｍｐｌＮｃｏＩプライマー［ＳＥＱＩＤＮＯ：２５］はｃ−ｍｐｌリガンド遺伝子（塩基＃２７９−３１１）にアニールし、コードン選択縮退を起こす。その結果、この遺伝子をＥscherichia coli(Ｅ．coli)の中に効率良く転写し、翻訳することができる。外来遺伝子のＥ．coliへの転写及び翻訳は、この遺伝子の５’末端におけるコードンの選択によって影響を受け、Ｅ．coli優先コードン（Ｃhenら，ＤＮＡ:365-374[1982]参照）を使用することにより、通常、より高度の表現水準を得ることができる。コードン配列の多重選択により、多重クローンをスクリーニングして、高度の表現を得ることができる。メチオニン・コードン及びアラニン・コードンの遺伝子コードの５’末端に、セリンより前に付加したＮｃｏＩ制限酵素サイトを、ここではｃ−ｍｐｌリガンド・アミノ酸＃１と呼ぶ。ｃ−ｍｐｌＨｉｎｄＩＩＩ［ＳＥＱＩＤＮＯ：２６］は、読み終わりコードン及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素サイトを、最終コードン（アルギニン）の直後に付加する。この最終コードンを、ここではアミノ酸＃１５３と呼ぶ。重合酵素連鎖反応＃４（ＰＣＲ＃４）において、読み終わりコードンなしでアミノ酸＃１５３に続き１ −１５３ｃ−ｍｐｌリガンドを生成させるために、ＰＣＲ＃２を鋳型として、ｃ −ｍｐｌＮｃｏＩ［ＳＥＱＩＤＮＯ：２５］及びＥｃｏｃｍｐｌ［ＳＥＱＩＤＮＯ：２９］プライマーを使用した。Ｅｃｏｃｍｐｌ［ＳＥＱＩＤＮＯ：２９］プライマーは、ＥｃｏＲＩサイト（ＧＡＡＴＴＣ）を骨格内でｃ−ｍｐｌリガンド遺伝子でコード化し、これによって、グルタメート及びフェニルアラニンのコードンが形成される。配列の中に塩基＃２７９−７３７から生じた生成物が、アミノ酸＃１−１５３をコード化し、これらのアミノ酸を多重表現システムの中へ移入できるように、これらのＰＣＲ反応を設計した。例２１−３３２ｃ−ｍｐｌリガンド遺伝子生成物のＢＨＫ発現プラスミド完全な長さのｃ−ｍｐｌリガンドＰＣＲ生成物（ＰＣＲ＃１及びＰＣＲ＃２）をＢｇｌＩＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し、組み合わせて、哺乳類ｃ現ベクターへ移入した。この発現ベクター（ｐＭＯＮ３９７６）をＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ（約3750 bp）で消化し、これによって、ＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩＰＣＲ断片(約1050 bp)を受け入れられるようにした。ｐＭＯＮ３９７６は、ｐＭＯＮ３３５９の誘導体で、ｐＵＣ１８を基本とするベクターで、哺乳類発現カセットを含んでいる。このカセットは、ｐＵＣ１８ポリリンカー（Ｈippenmeyer ら，Ｂio/Ｔechnology: 1037-1041[1993]参照）にサブクローニングした単純ヘルペスウィルス促進因子ＩＥ１１０（−８００〜＋１２０）及びＳＶ４０末期ポリアデニル化（ｐｏｌｙ−Ａ）シグナルを含んでいる。この促進因子の元のＥｃｏＲＩサイト５’は既に除かれ、新しいＥｃｏＲＩサイトがＢａｍＨＩサイトに対して３’に付加されている。これらの固有制限酵素サイトは、促進因子とｐｏｌｙ −Ａシグナルの間に位置して、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片又はＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片としてのＤＮＡ断片を５’−３’方向にサブクローニングし、転写及び翻訳を容易に行えるようにしている。ＢｇｌＩＩサイト（遺伝子の５’末端）は、ベクターのＢａｍＨＩサイトに結紮されたときに破壊される。プラスミドＤＮＡを個々のクローンから調製し、ｃ−ｍｐｌリガンド挿入部の配列を決定した。同定したクローンの一つ（ｐＭＯＮ２６４５１−３）は、アミノ酸＃１−３３２のｃ−ｍｐｌリガンドをアミノ酸＃１１２−１１５の欠失をでコード化する。プラスミドｐＭＯＮ２６４５１−３はＤＮＡ配列［ＳＥＱＩＤＮＯ：３９］を含み、このＤＮＡ配列が、［ＳＥＱＩＤＮＯ：３７］で表されるポリペプチドをコード化する。同定されたクローンの一つ（ｐＭＯＮ２６４５１−１）は、アミノ酸１−３３２のｃ−ｍｐｌリガンドを、アミノ酸置換体Ｋ（１２２）Ｅでコード化する。プラスミドｐＭＯＮ２６４５１−１はＤＮＡ配列［ＳＥＱＩＤＮＯ：５９］を含み、これが［ＳＥＱＩＤＮＯ：６６］で表されるポリペプチドをコード化する。同定されたクローンの一つ（ｐＭＯＮ２６４５１− ４）は、アミノ酸１−３３２のｃ−ｍｐｌリガンドを、２つのアミノ酸置換体、Ｐ（４６）Ｌ及びＷ（２００）Ｒでコード化する。プラスミドｐＭＯＮ２６４５１− ４はＤＮＡ配列［ＳＥＱＩＤＮＯ：６０］を含み、これが［ＳＥＱＩＤＮＯ：６７］で表されるポリペプチドをコード化する。例３１−１５３ｃ−ｍｐｌリガンド遺伝子生成物のＢＨＫ発現プラスミド１−１５３ｃ−ｍｐｌリガンドＰＣＲ生成物（ＰＣＲ＃３）をＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素(約460 bp)で消化し、哺乳類発現ベクターに移入した。この発現ベクター（ｐＭＯＮ３９３４）をＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ(約3800 bp) で消化した。ｐＭＯＮ３９３４は、ｐＭＯＮ３３５９の誘導体であり、ｐＭＯＮ３３５９はｐＵＣ１８を基本とし、哺乳類の発現カセットを含むベクターである。このカセットには、修飾ヒトＩＬ−３シグナルペプチド配列である単純ヘルペスウィルス促進因子ＩＥ１１０（−８００〜＋１２０）及びｐＵＣ１８ポリリンカー（Ｈippenmeyer ら，Ｂio/Ｔechnology: 1037-1041[1993]参照）にサブクローニングしたＳＶ４０末期ポリアデニレーション（ｐｏｌｙ−Ａ）シグナルが含まれている。ＢａｍＨＩ断片として、ＩＥ１１０促進因子とｐｏｌｙ−Ａシグナルの間にある固有ＢａｍＨＩサイトの中へサブクローニングされた、ヒトＩＬ− ３シグナルペプチド配列は、その３’末端にＮｃｏＩサイトを含み、その後にＨｉｎｄＩＩＩサイトがある。このクローニングもＢａｍＨＩサイト５’をシグナルペプチドに残し、もう一つのＢａｍＨＩサイト３’をＨｉｎｄＩＩＩサイトに残す。ＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＭＯＮ３９３４の中へサブクローニングすると、ＮｃｏＩサイトとＨｉｎｄＩＩＩサイトの間のＤＮＡ配列が消失しる。この発現カセットは、細胞の外にあるたんぱく質の分泌に有用である。シグナルペプチドのＤＮＡ配列を下記に示す（制限酵素のサイトを、その上に示す）。ＮｃｏＩサイトの中のＡＴＧ（メチオニン）コードンは、シグナルペプチド（下線部）の: :開始ＡＴＧとともにフレームの中にある。個々のクローンからプラスミドＤＮＡを調製し、ｃ−ｍｐｌリガンド挿入部の配列を決定した。同定されたクローンの一つ（ｐＭＯＮ２６４４８）がアミノ酸１ −１５３ｃ−ｍｐｌリガンドをコード化する。プラスミドｐＭＯＮ２６４４８はＤＮＡ配列［ＳＥＱＩＤＮＯ：５８］を含み、この配列は、［ＳＥＱＩＤＮＯ：６５］で表されるポリペプチドをコード化する。同定されたクローンの一つ（ｐＭＯＮ２６４５０）は、アミノ酸１−１５３のｃ−ｍｐｌリガンドをアミノ酸＃１１２−１１５の欠失でコード化する。プラスミドｐＭＯＮ２６４５０はＤＮＡ配列［ＳＥＱＩＤＮＯ：４０］を含み、この配列は、［ＳＥＱＩＤＮＯ：３８］で表されるポリペプチドでコード化する。例４１−１５３Δ１１２−１１５ｃ−ｍｐｌリガンド遺伝子生成物のＥ．coli発現プラスミド１１５３ｃ−ｍｐｌリガンドＰＣＲ生成物（ＰＣＲ＃３）を、ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素(約 460 bp)を消化し、ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ(約3250 bp)で消化したＥ．coli発現ベクターｐＭＯＮ３９３５に移入する。ｐＭＯＮ３９３５は、細胞形質の中で非相同たんぱく質の高水準生産を方向付ける。ｐＭＯＮ３９３５の発現カセットは、他の報告(Ｏlins ら，Ｍethods Ｅnzym．185:1 15-119[1988]) に述べられているｒｅｃＡ促進因子及びＴ７遺伝子１０リボソーム結束サイト（ＲＢＳ）、及び転写ターミネーターとして機能するファージＰ２２遺伝子の縦列逆位繰り返し配列からなっている。カセットは、複製のｐＢＲ３２７起始、及びスペクチノマイシン抵抗をコード化する遺伝子を含むプラスミド上にある。ＮｃｏＩ制限酵素サイトは遺伝子１０ＲＢＳの後にあり、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素サイトは、ＮｃｏＩサイトとＰ２２転写ターミネーターの間に位置している。前述したように、いくつかの異なるクローンを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを通してスクリーニングし、固有１７ｋｄたんぱく質を発現させた。アミノ酸１−１５３のｃ− ｍｐｌリガンドを、アミノ酸＃１１２−１１５の欠失でコード化するｐＭＯＮ２６４５３は、このクローニングの結果生じる。プラスミドｐＭＯＮ２６４５３は、ＤＮＡ配列［ＳＥＱＩＤＮＯ：４９］を含み、この配列は、［ＳＥＱＩＤＮＯ：３８］で表されるポリペプチドをコード化する。例５１−１５３ｃ−ｍｐｌリガンド／マウスＦｃのバキュロウィルス発現プラスミド１−１５３ｃ−ｍｐｌリガンドＰＣＲ生成物（ＰＣＲ＃４）をＮｃｏＩ制限酵素及びＥｃｏＲＩ制限酵素（約460 bp）で消化し、バキュロウィルス発現ベクターに移入した。この発現ベクターｐＭＯＮ２６４４０をＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩ( 約10 kb)で消化した。ｐＭＯＮ２６４４０は、修飾マウスＦｃ（ＩｇＧ２ａ）の定常領域及び蝶番部(Ｇross Ａ.Ｈ.，Ｊ．Ｃlin．Ｉnvest 95: 2783-2789[1995] )をコード化するＤＮＡ配列を含むｐＶＬ１３９３（インビトローゲン）の誘導体である。ｈＩＬ−３分泌シグナルペプチドをコード化するＤＮＡ配列をベクターのＢａｍＨＩサイトにサブクローニングし、クローニングに使用するシグナル配列のＮｃｏＩサイトを３’末端に残した。マウスＦｃ遺伝子断片（ＥｃｏＲＩ −ＢｇｌＩＩ）を、このベクターのＢｇｌＩＩサイトの中にサブクローニングし、このＦｃの５’末端で、ＥｃｏＲＩサイトがクローニングに使用できるようにした。これによって、遺伝子をＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片として、ベクターの中へ容易にクローニングできるようになる。 :終結コドンを、目的の遺伝子とＥｃｏＲＩサイトの間のフレーム中へ導入する。ＥｃｏＲＩサイト（ＧＡＡＴＴＣ）を目的の遺伝子の３’末端に直接付加し、これがグルタメート（ＧＡＡ）及びフェニルアラニン（ＴＴＣ）コードンをコード化する。ＥｃｏＲＩサイトの後に、第Ｘａ因子たんぱく質分解サイトをコード化するＤＮＡ配列がある。このたんぱく質分解サイトは、小さなポリペプチド・リンカー領域で、この後にはマウスＦｃ遺伝子断片がある。各クローンからプラスミドＤＮＡを調製し、ｃ−ｍｐｌリガンド挿入部の配列を決定した。マウスＦｃに結合した１−１５３Δ＃１１２−１１５ｃ− ｍｐｌリガンドからなるキメラたんぱく質をコード化するｐＭＯＮ２６４５４− ４は、このクローニングによって得られたものである。プラスミドｐＭＯＮ２６４５４−４はＤＮＡ配列［ＳＥＱＩＤＮＯ：５０］を含み、この配列が［ＳＥＱＩＤＮＯ：４１］で表わされるポリペプチドをコード化する。マウスＦｃに結合したアミノ酸１−１５３ｃ−ｍｐｌリガンドからなるキメラたんぱく質をコード化するｐＭＯＮ２６４５４−８も、このクローニングの結果生じたものである。プラスミドｐＭＯＮ２６４５４−８はＤＮＡ配列［ＳＥＱＩＤＮＯ：６１］を含み、この配列が［ＳＥＱＩＤＮＯ：６８］で表されるポリペプチドをコード化する。例６１−１５３ｃ−ｍｐｌリガンドΔ１１２−１１５／マウスＦｃのＢＨＫ発現プラスミド１−１５３ｃ−ｍｐｌリガンドΔ１１２−１１５／マウスＦｃを発現するＢＨＫプラスミドをつくるために、ｐＭＯＮ２６４４８のＮｃｏＩ−ＰｓｔＩ断片(約3 10 bp)を、ｐＭＯＮ２６４５４−４のＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ断片(約 150bp)と組み合わせ、ｐＭＯＮ３９９３(約4550 bp)のＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩベクター断片に結紮した。ｐＭＯＮ３９９３はｐＭＯＮ３９３４（上記）の誘導体で、修飾マウスＦｃ遺伝子断片を含んでいる。ＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩマウスＦｃ遺伝子断片を：ＮｃｏＩサイトのベクター３’の中へ移入し、ＮｃｏＩサイトとマウスＦｃ遺伝子の間にＥｃｏＲＩサイトを残した。ベクターの中のどこか別の場所にあるＥｃｏＲＩサイトは、既に破壊されている。これによって、ＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片として遺伝子をベクター内に容易にクローニングできるようになり、目的の遺伝子をマウスＦｃのフレーム内に融合させる。終結コドンを、目的の遺伝子とＥｃｏＲＩサイトの間に導入した。ＥｃｏＲＩサイト（ＧＡＡＴＴＣ）を問題の遺伝子の３’に直接付加し、グルタメート（ＧＡＡ）コードン及びフェニルアラニン（ＴＴＣ）コードンをコード化する。マウスＦｃに結合したアミノ酸１−１５３Δ１１２−１１５ｃ−ｍｐｌリガンドをコード化するｐＭＯＮ２６４６５は、このクローニングの結果生成したものである。プラスミドｐＭＯＮ２６４６５はＤＮＡ配列［ＳＥＱＩＤＮＯ：５１］を含み、この配列が、［ＳＥＱＩＤＮＯ：４２］で表されるポリペプチドをコード化する。例７１−１５３ｃ−ｍｐｌリガンド△１１２−１１５のＢＨＫ発現プラスミドアミノ酸１−１５３△１１２−１１５ｃ−ｍｐｌリガンドをコード化する第２のＢＨＫ発現プラスミドを組み立てた。この中で、その結果生じるアミノ酸配列が変化しないように、１−１５３Δ１１２−１１５ｃ−ｍｐｌリガンド遺伝子の５ ’末端のＤＮＡ配列を変化させ、このたんぱく質の分泌量が増えるように、その発現を最適化した。ｐＭＯＮ２６４６５(約370 bp)のＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ断片、ｐＭＯＮ２６４４８（約90 bp）のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片、及びｐＭＯＮ３９３４(約3800 bp)のＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を結紮することにより、このプラスミドｐＭＯＮ３０２１４を組み立てた。プラスミドＤＮＡを個々のクローンおよびｃ−ｍｐｌリガンド挿入部から調製した。プラスミドｐＭＯＮ３０２１４はＤＮＡ配列［ＳＥＱＩＤＮＯ：４８］を含んでいる。この配列は、［ＳＥＱＩＤＮＯ：３８］で表されるポリペプチドをコード化する。例８１−１５３ｃ−ｍｐｌリガンド/グリサー(glyser)/ＩＬ−３変異体１３２８８のＥ.coli表現プラスミドキメラたんぱく質１−１５３ｃ−ｍｐｌリガンド／グリサー／ＩＬ−３変異体１３２８８(ＷＯ 94/12638)をコード化するｐＭＯＮ２６４６１を、ｐＭＯＮ２６４５４−８（約460 bp）のＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片と合成リンカー（ＥｃｏＳｎａｌ［ＳＥＱＩＤＮＯ：３０］、ＥｃｏＳｎａ２［ＳＥＱＩＤＮＯ：３１］をｐＭＯＮ１３０５７(ＷＯ 95/21254)のＳｎａＢＩ−ＮｃｏＩベクトル断片(約3500 bp)に結紮することにより組み立てた。プラスミドｐＭＯＮ２６４６１はＤＮＡ配列［ＳＥＱＩＤＮＯ：７２］を含み、この配列は、［ＳＥＱＩＤＮＯ：７３］で表されるポリペプチドをコード化する。例９１−１５３ｃ−ｍｐｌリガンド／ＦＸａ／グリサー／ＩＬ−３変異体１３２８８のＢＨＫ発現ベクターキメラたんぱく質１−１５３ｃ−ｍｐｌリガンド／ＦＸａ／グリサー／ＩＬ−３変異体をコード化するｐＭＯＮ２６４７４を、ｐＭＯＮ２６４７２(約860 bp)のＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、ｐＭＯＮ３９３４(約3800 bp)のＮｃｏＩ− ＨｉｎｄＩＩＩ断片に結紮することによって組み立てた。ｐＭＯＮ２６４７２（アミノ酸１−１５３ｃ−ｍｐｌリガンド／ＦＸａ／グリサー／ＩＬ−３変異体１３２８８）のＥ．coliを現プラスミドを、ｐＭＯＮ２６４６１(約 460 bp)のＮｃｏＩ−ＳｎａＢＩ断片及びｐＭＯＮ３９８８(約400 bp) (ＷＯ 95/21254)のＳｎａＢＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＭＯＮ３９３５(約3250 bp)のＮｃｏＩ− ＨｉｎｄＩＩＩベクター断片に組み合わせ、結紮することによって組み立てた。プラスイミドｐＭＯＮ２６４７４はＤＮＡ配列［ＳＥＱＩＤＮＯ：６４］を含み、この配列が、［ＳＥＱＩＤＮＯ：７１］で表されるポリペプチドをコード化する。例10 １−１５３Δ１１２−１１５ｃ−ｍｐｌリガンド／ＦＸａ／グリサー／ＩＬ−３変異体１３２８８のＢＨＫ発現プラスミド。ＩＬ−３変異体１３２８８に結合したキメラたんぱく質１−１５３Δ＃１１２−１１５ｃ−ｍｐｌリガンドをコード化するｐＭＯＮ２６４６９を組み立てた。ｐＭＯＮ２６４５４−４（約370 bp）のＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ断片を、ｐＭＯＮ２６４７４（約490 bp）のＢａｍＨＩ− ＨｉｎｄＩＩＩ断片及びｐＭＯＮ３９３４(約3800 bp)のＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩベクター断片と組合せた。プラスミドｐＭＯＮ２６４６９はＤＮＡ配列［ＳＥＱＩＤＮＯ：５２］を含み、この配列は、［ＳＥＱＩＤＮＯ：４３］で表されるポリペプチドをコード化する。例11 １−１５３Δ１１２−１１５ｃ−ｍｐｌリガンド／ＩＬ−３変異体１３２８８キメラのＢＨＫ発現プラスミドＩＬ−３変異体１３２８８に結合したキメラたんぱく質１−１５３Δ１１２−１１５ｃ−ｍｐｌリガンドをコード化するｐＭＯＮ３０２４３を、ｐＭＯＮ２６４６９（約460 bp）のＮｃｏＩ−ＳｎａＢＩ断片を、ｐＭＯＮ２６４２７(ＷＯ９ 5/21254)のＳｎａＢＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（約400 bp）と組み合わせ、ｐＭＯＮ３９３４のＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片(約3800 bp)に結紮することによって組み立てた。プラスミドｐＭＯＮ３０２４３はＤＮＡ配列［ＳＥＱＩＤＮＯ：５３］を含む。この配列が、［ＳＥＱＩＤＮＯ：４４］で表されるポリペプチドをコード化する。例12 ＩＬ−３変異体１３２８８／ＦＸａ／グリサー／１−１５３ｃ−ｍｐｌリガンドのＥ．coli発現プラスミドｐＭＯＮ２６４６０（キメラたんぱく質ＩＬ−３変異体１３２８８／ＦＸａ／グリサー／アミノ酸１−１５３ｃ−ｍｐｌリガンド生産用Ｅ．coli発現プラスミド）を、ｐＭＯＮ２６４４８（約460 bp）のＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＭＯＮ１３０１８(ＷＯ 95/21254)のＡｆｌＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩベクター断片 (約3500 bp)に結紮ことによって組み立てた。プラスミドｐＭＯＮ２６４６０はＤＮＡ配列［ＳＥＱＩＤＮＯ：６２］を含み、この配列が、［ＳＥＱＩＤＮＯ：６９］で表されるポリペプチドをコード化する。例13 ＩＬ−３変異体１３２８８／グリサー／１−１５３ｃ−ｍｐｌリガンドのＥ．c oli発現プラスミドｐＭＯＮ２６４７１（キメラたんぱく質ＩＬ−３変異体１３２８８／グリサー／１−１５３ｃ−ｍｐｌリガンドのＥ．coli発現プラスミド）を、ｐＭＯＮ２６４２６（約370 bp）のＮｃｏＩ−ＳｍａＩ断片を、ｐＭＯＮ２６４６０(約490 b p)のＳｍａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片に結紮することによって、ｐＭＯＮ３９３５ (3250 bp)のＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩベクター断片の中に組み立てた。ｐＭＯＮ２６４２６は、ｐＭＯＮ１３０５６(ＷＯ 95/21254)のＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（約950 bp）を、ｐＭＯＮ３９３４(約3800 bp)のＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩベクター断片(約3800 bp)に移入することによって組み立てた。プラスミドｐＭＯＮ２６４７１はＤＮＡ配列［ＳＥＱＩＤＮＯ：６３］を含み、この配列が、［ＳＥＱＩＤＮＯ：７０］で表されるポリペプチドをコード化する。例14 ＩＬ−３変異体１３２８８／グリサー／１−１５３Δ１１２−１１５ｃ−ｍｐｌリガンドのＢＨＫ発現プラスミドグリシン−セリン・リンカーを経由してアミノ酸１−１５３Δ１１２−１１５ｃ −ｍｐｌリガンドに結合したＩＬ−３変異体１３２８８を発現するｐＭＯＮ３０２７２を、ｐＭＯＮ２６４７３（約700 bp）のＮｃｏＩ−ｐｓｔＩ断片を、ｐＭＯＮ３０２１４（約160 bp）のｐｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片と組み合わせ、ｐＭＯＮ３９３４(約3800 bp)のＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片に結紮することによって組み立てた。ｐＭＯＮ２６４７１(約880 bp)のＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、ｐＭＯＮ３９３４（約 3800 bp）のＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩベクター断片に結紮することによりｐＭＯＮ２６４３７を組み立てた。プラスミドｐＭＯＮ３０２７２はＤＮＡ配列[ＳＥＱＩＤＮＯ：５４]を含み、この配列が、［ＳＥＱＩＤＮＯ：４５］で表されるポリペプチドをコード化する。例15 １−１５３Δ１１２−１１５／ｈｉｓ６ｃ−ｍｐｌリガンドのＢＨＫ発現プラスミド１−１５３Δ１１２−１１５／ｈｉｓ６ｃ−ｍｐｌリガンドを街現するｐＭＯＮ３０２５３を、ｐＭＯＮ２６４６５をＥｃｏＲＩで消化し、Ｃ−末端にポリヒスチジン標識を付加する合成リンカーを結紮することによって組み立てた。このリンカーは、ＨｉｓＣ１［ＳＥＱＩＤＮＯ：３２］プライマー及びＨｉｓＣ２［ＳＥＱＩＤＮＯ：３３］プライマーをアニールすることによって組み立てた。このリンカーは、ｃ−ｍｐｌリガンド分子の直後に、ＧｌｕＰｈｅＨｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓ［ＳＥＱＩＤＮＯ：５７］尾部をつくる。最後のＨｉｓコドンに続く: :終結コドンにより、この点から先の翻訳が阻止される。このＤＮＡは、ｃ−ｍｐｌリガンド遺伝子に対して直接３’、ポリヒスチジン尾部に対して５’の位置にある、固有ＥｃｏＲＩサイトを保つリンカーの向きを確認するように配列された。プラスミドｐＭＯＮ３０２５３はＤＮＡ配列［ＳＥＱＩＤＮＯ：５５］を含み、この配列が［ＳＥＱＩＤＮＯ：４６］で表されるポリペプチドをコード化する。例16 ｈｉｓ₆／１−１５３Δ１１２−１１５ｃ−ｍｐｌリガンドのＢＨＫ発現プラスミドｈｉｓ₆／１−１５３Δ１１２−１１５ｃ−ｍｐｌリガンドを発現するｐＭＯＮ３０２７４を、ｐＭＯＮ３０２１４をＮｃｏＩで消化し、Ｎ−末端にポリヒスチジン標識を付加する、合成リンカーを結紮することにより組み立てた。このリンカーは、ＨｉｓＮ１［ＳＥＱＩＤＮＯ：３４］プライマー及びＨｉｓＮ２［ＳＥＱＩＤＮＯ：３５］プライマーをアニーリングすることによって組み立てられた。このリンカーは、ｃ−ｍｐｌリガンド分子のすぐ前に、ＨｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓＡｌａＭｅｔＡｌａ［ＳＥＱＩＤＮＯ：３６］標識をつくる。ＤＮＡは、この標識に対して３’、ｃ−ｍｐｌリガンド遺伝子に対して５’の固有ＮｃｏＩサイトを保持する、リンカーの向きを確認するように配列した。プラスミドｐＭＯＮ３０２７４はＤＮＡ配列［ＳＥＱＩＤＮＯ：５６］含み、この配列が、［ＳＥＱＩＤＮＯ：４７］で表されるポリペプチドをコード化する。例17 前例における遺伝子の組み立て例１−６から、制限酵素消化及び結紮（Ｓambrook ら，Ｍolecular Ｃloning: ＡＬaboratory Ｍanual，第２版，Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory Ｐress 社，Ｃold Ｓpring Ｈarbor，ＮＹ[1989]参照）によって、種々の遺伝子断片を組み合わせ、種々の異なるｃ−ｍｐｌリガンド遺伝子を組み立てることができる。これらの例から得られる遺伝子は、制限酵素で遺伝子のいずれかの末端及び内部で消化し、希望する遺伝子断片を切り離すことができる。次に、種々の断片を相補末端部を介して、ＤＮＡリガーゼで相互又は発現ベクターに結紮することができる。結紮したＤＮＡは、Ｅ．coli の中へ形質変換することができ、プラスミドＤＮＡの配列を決定してコロニーをスクリーニングし、希望する遺伝子生成物を得ることができる。ポジティブクローンを特定した後、プラスミドＤＮＡを適切な哺乳類細胞又はＥ．coli菌株に移入して、生産することができる。例18 サイト指向突然変異生成合成遺伝子組み立て技術又はサイト指向突然変異変異生成技術（Ｔaylor ら，Ｎ ucl．Ａcids Ｒes．13: 7864-8785[1985]、Ｋunkel ら，Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ 82: 488-492[1985]、Ｓambrook ら，Ｍolecular Ｃloning: ＡＬ aboratory Ｍanual，第２版，Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory Ｐress 社，Ｃold Ｓpring Ｈarbor，ＮＹ[1989]、ＷＯ 94/12639、ＷＯ 94/12638 参照）のいずれかを用いて、各位置で種々のアミノ酸置換を行うことができる。これらの置換は一度に一つずつしかできない場合もあれば、他のアミノ酸置換と組み合わせて行える場合もある。変化した配列を確認後、プラスミドＤＮＡを、適切な哺乳類細胞又はＥ．coli菌株の中へ移入して、生産に移すことができる。例19 ｃ−ｍｐｌキメラたんぱく質のＳＤＳ折り畳みプロトコルＡ．封入体からのｃ−ｍｐｌキメラたんぱく質の回収キメラたんぱく質を表現している300 mlの培養液から得られたＥ．coli細胞をトリスＨＣｌ 20 mＭ、ＥＤＴＡ５mＭ、ｐＨ 8.0からなる溶液 150 ml の中に再懸濁する。細胞の再懸濁液を標準手段で３分間、氷の上で音波処理し、次に５ 000 x g で 30 分間遠心分離する。回収した封入体（ＩＢ）のペレットを、トリスＨＣｌ 20 mＭ、ＥＤＴＡ１ml、ｐＨ 8.0からなる溶液 150 ml の中に再懸濁して２回洗浄し、上記の通り音波処理し、5000 x ｇで30分間遠心分離する。洗浄したＩＢペレットは、直ちに、或いは70℃で貯蔵した後に使用できる。ＩＢ物質を処理する場合、大規模処理を行う場合と同じように、Ｍanton-Ｇaulin ホモジナイザーを使用して、多量の細胞を分断することもできる。Ｂ．モノマーｃ−ｍｐｌリガンド・キメラたんぱく質の可溶化及び再折り畳み洗浄したＩＢペレットを、0.１％(w/v)のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を 50 mＬ/1 g 細胞ペレットの割合で含む、ｐＨ 9.0（ｐＨ 8.0-9.75 が適当）の 100 mＭトリスＨＣｌに、手動組織ホモジナイザーを使用して再懸濁する。懸濁液を同じ緩衝液で200 mＬに希釈し、４℃で（５−１５分間）掻き混ぜ、完全に混合する。ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加して濃度を20 mＭとし、次にＬ−システイン(Ｓigma #4820)を添加して、最終濃度を１mＭとする（ＤＴＴは、新しく50倍に希釈した元溶液を、システインは新しく 100倍に希釈した元溶液を添加する。元溶液は、ｐＨ 9.00 の100 mＭトリスＨＣｌを溶媒として調製する）。折り畳み溶液を、緩く蓋をした容器の中で、適当に掻き混ぜながら４ ℃（４℃−25℃が適当）で（18−72時間）空気酸化する。ｒＨＰＬＣ分析を使用して、折り畳み状況を監視し、その完了を確認する。例20 ｃ−ｍｐｌリガンド及びキメラ分子の生物活性の定量下記の定量分析においては、ｐＭＯＮ２６４４８（１−３３２ｃ−ｍｐｌリガンド）及びｈＩＬ−３変異体(ｐＭＯＮ１３２８８、ＷＯ 94/12638)を、活性対照標準として使用する。１．ＴＦ１増殖量の定量分析ｃ−ｍｐｌリガンドの増殖活性を、多潜能力のヒト細胞系ＴＦ１(北村ら，Ｊ．Ｃell Ｐhysiol 140: 323-334[1989])のサブクローンを使用して定量する。ＴＦ１細胞はｈ−ＩＬ３（100 Ｕ/mＬ）の中で保持される。ｃ−ｍｐｌリガンドに反応するサブクローンを確定するために、１−１５３型のｃ−ｍｐｌリガンド（ｐＭＯＮ２６４４８）を表現している遺伝子とともに移入した、ＢＨＫ細胞の上澄液10％を含む継代培地の中で、細胞を保持する。大部分の細胞は死ぬが、サブセットの細胞は生き延びる。希釈クローニングを行った後、分析の準備ができるまでに、ｃ−ｍｐｌリガンドに反応するクローンを選び出し、これらの細胞を、 0.3 x 10 6細胞/mＬの密度まで、継代培地の中へ分割添加する。これらの細胞には、ＲＰＭＩ１６４０（Ｇibco 社）、10％ＦＢＳ（Ｈarlan 社、ロット番号９１２０６）、形質移入したＢＨＫ細胞から得た10％ｃ−ｍｐｌリガンド上澄液、１mＭピルビン酸ナトリウム（Ｇibco 社）、２mＭグルタミン(Ｇibco 社)、及び100μ g /mＬペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇibco 社）からなる継代培地を使用した。翌日、細胞を収穫し、ＲＰＭＩ又はＩＭＤＭ培地で２回洗浄して、最後にＡＴＬ即ち分析に使用する培地の中で洗浄する。ＡＴＬ培地は、ＩＭＤＭ（Ｇibco 社）、ウシ血清アルブミン 500 μg/mＬ、ヒト・トランスフェリン 100 μ g/m Ｌ、大豆脂質 50 μ g/mＬ、ベータ−メルカプトエタノール４ｘ10^-8Ｍ、及びＡ９９０９（Ｓigma 社、抗生物質溶液）２mＬ/1000 mＬＡＴＬから成っている。細胞を、96個に区画された低蒸発プレート（Ｃostar 社）の分析培地の中で、最終密度0.25 x 10⁶細胞/mＬ、最終体積 50 μｌまで希釈する。移入クローンから得られる一過性上澄液（馴化培地）50 μｌを二重サンプルとして添加し、最終濃度を 50 ％とし、３倍希釈を繰り返して、最終濃度を 1.8％とした。1 ng/mＬから出発して３倍希釈を重ね、0.0014 ng/mＬまで希釈したＩＬ−３変異体（ｐＭＯＮ１３２８８）の投与量曲線の三重サンプルを、陽性対照標準として分析サンプルに含めた。平板を５％ＣＯ2 及び37℃でインキュベートした。培養６日目に、0.5 ciの３Ｈ／区画（ＮＥＮ）を、プレートに 20 μｌ／区画ずつ間欠的に添加し、５％ＣＯ2 及び 37 ℃で４時間インキュベートした。プレートを収穫し、ベータプレート・カウンターで計数を行った。表１．上表に挙げたｃ−ｍｐｌリガンドの試験は、ＴＦ１増殖分析法で実施した。試験した全ｃ−ｍｐｌリガンドは、この分析で活性を示した。その他体外細胞分析も、キメラで構成されるコロニー刺激因子の種類によっては、ｃ−ｍｐｌリガンド又はキメラ分子の活性定量に有用である。下記は、その他有用な分析方法の例である。さらに，キメラの構成成分の一つに対抗してつくられた単一クローン性遮断抗体が、キメラの各構成成分の活性を確認する細胞増殖分析に使用できる。３２Ｄ増殖分析：３２ＤはネズミのＩＬ−３に依存する細胞系で、ヒトのＩＬ− ３には反応しないが、ヒトのＧ−ＣＳＦ（種の制限を受けない）には反応する。Ｂａｆ／３増殖分析：Ｂａｆ／３はネズミのＩＬ−３に依存する細胞系で、ヒトのＩＬ−３又はヒトのｃ−ｍｐｌリガンドには反応しないが、ヒトのＧ−ＣＳＦ（種の制限を受けない）には反応する。Ｔ１１６５増殖分析：Ｔ１１６５細胞はＩＬ−６に依存するネズミの細胞系(Ｎo rdan ら，1986)で、ＩＬ−６及びＩＬ−11に反応する。ＡＭＬ１９３増殖分析：急性骨髄性貧血患者から確定されたこの細胞系は、成長因子依存性の細胞系で、培地にＧＭ−ＣＳＦを補充すると成長が高められることが認められた（Ｌange，Ｂ．ら（1987）、Ｖaltieri，Ｍ.ら(1987)。ＡＭＬ細胞系も、ヒトのＩＬ−３及びＧ−ＣＳＦに反応する。トランスフェクト(移入)細胞系：Ｂａｆ／３細胞系のような細胞系は、細胞系が持っていないヒトＩＬ−３レセプター又はヒトｃ−ｍｐｌリガンド・レセプターのような、コロニー刺激因子レセプターとともに移入できる。細胞系にレセプターを移入したリガンドの活性確定に、これらの形質移入細胞系が使用できる。ｃ−ｍｐｌ反応性細胞系のライブラリーから採取した、ｃ−ｍｐｌコード化ｃＤＮＡをクローニングして、このような移入Ｂａｆ／３細胞系の一つをつくり、これをプラスミドｐｃＤＮＡ３(Ｉnvitrogen 社，Ｓan Ｄiego，Ｃa)の多重クローニング・サイトの中にクローニングした。Ｂａｆ／３細胞は、エレクトロポーテーション法で、このプラスミドとともに形質移入した。この細胞を、マウスＩＬ−３の存在下、Ｗｅｈｉ馴化培地の中で、Ｇ４１８選択法で育成した。限界希釈法でクローンを確立した。表２．ｐＭＯＮ２６４６５及びｐＭＯＮ２６４５８の増殖活性は、ヒトｃ−ｍｐｌ−Ｒ（Ｂａｆ／３−ｃｍｐｌ−Ｒ）とともに形質移入したＢａｆ／３細胞、及びＴＦ1.2.Ｂ４細胞系の中で分析した。細胞には、１μＣｉ／トリチウム標識区画を一晩に亘り間歇添加（Ｂａｆ／３−ｃｍｐｌ−Ｒ細胞）するか、又は４時間に亘り間歇添加（ＴＦ1.2.Ｂ４細胞）し、ベータプレート・カウンターで全計数値 cpm（３Ｈ）を定量した。２．骨髄増殖分析ａ．ＣＤ３４＋細胞の増殖： 15−20 mＬの骨髄吸引物を、正常な骨髄ドナーからインフォームド・コンセントを得て採取した。細胞を食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ社、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）の中に１：３の割合で希釈し、30 mＬを 15 mＬのＨistopaque-1077（Ｓｉｇｍａ社）上に層状に重ね、30分間300 ＲＣＦで遠心分離した。単核界面層を採取し、ＰＢＳ中で洗浄する。ＰＢＳ中でＣＤ＋３４細胞を単核細胞試料から、メーカーの説明(ＣellＰro 社，Ｂothell ＷＡ)に従い、アフィニティカラムを使用して富化する。富化後、フルオロセインに共役した抗ＣＤ３４モノクロナール抗体及びフィコエリトリンに共役したＣＤ３８(Ｂecton Ｄickinson 社，Ｓan Ｊose ＣＡ)を使用し、フローサイトメトリック分析法で測定した結果、ＣＤ３４＋細胞の純度は平均70％であった。細胞を40,000個/mＬの濃度で10種類の半ビボ培地(Ｂio-Ｗhittaker 社，Ｗal kersville ＭＤ)に再懸濁し、１mＬを12個の区画を有する組織培養プレート（Ｃ ostar 社）で平板培養した。ヒトＩＬ−３変異体ｐＭＯＮ１３２８８を10 ng/m Ｌ又は100 ng/mＬ使用する。ｃ−ｍｐｌリガンドをコード化するプラスミドとともに形質移入したＢＨＫ細胞から馴化培地を採取、この馴化培地100 μｌの上澄液を１mＬの培養液に添加（約10％に希釈）してテストする。細胞を、37℃の加湿インキュベーターの中で、ＣＯ２濃度５％、37℃で８−14日間インキュベートする。ｂ．細胞の収穫及び分析：培養期間の終わりに、各条件について、全細胞計数値を求める。蛍光分析及び倍数分析のために、細胞を巨核球緩衝液（ＭＫ緩衝液、クエン酸ナトリウム 13. ６mＭ、テオフィリン１mＭ、ＰＧＥｌ 2.2μ m、グルコース 11 mＭ、ＢＳＡ３％ v/w、ＰＢＳ溶液中、ｐＨ 7.4）で洗浄(Ｔomer ら，Ｂlood 70(6): 1735-4 2[1987])する。即ち、抗ＣＤ４１ａＦＩＴＣ抗体を含むＭＫ緩衝液 500μｌの中に再懸濁（１：200、ＡＭＡＣ社，Ｗestbrook 社，ＭＥ）して洗浄する。ＤＮＡ分析のために、氷の上で20分かけて、0.5 ％のＴween20（Ｆisher 社，Ｆair Ｌawn ＮＪ）を含むＭＫ緩衝液の中に細胞を浸透させ、30分かけて、0.5 ％のＴween 20 及び１％のパラホルムアルデヒド（Ｆisher Ｃhemical 社）で固定し、氷の上で、55％ v/v ＭＫ緩衝液（200 mＯsm）中にＲＮＡａｓｅ（400 Ｕ/mＬ）を加えて調製したヨウ化プロピジウム(50μ g/mＬ、Ｃalbiochem 社，Ｌa Ｊo lla ＣＡ)の中で１−２時間インキュベートする。細胞をＦＡＣＳｃａｎ又はＶ antageフロー・サイトメーター(Ｂecton Ｄickinson 社，Ｓan Ｊose ＣＡ)で分析する。緑色蛍光（ＣＤ４１ａ−ＦＩＴＣ）を、赤色蛍光（ＰＩ）の直線及びログ信号とともに集め、ＤＮＡ倍数性を求めた。全ての細胞を採取し、ＣＤ４１＋細胞の割合を求める。ＬＹＳＩＳソフトウェア(Ｂecton Ｄickinson 社，Ｓan Ｊose ＣＡ)を使用してデータ解析を行う。フロー・サイトメトリー分析から、ＣＤ４１抗体を表現している細胞の割合（％）を求める。ＣＤ４１＋細胞/mＬの絶対（Ａｂｓ）数を下式により計算する：（Ａｂｓ）＝（細胞計数値）＊（％）／100 表３．上記ｃ−ｍｐｌリガンドの試験は、巨核球液体培養分析で実施した。この分析において、ｐＭＯＮ２６４４８及びｐＭＯＮ２６４５１−１が活性を示した。表４．上記ｃ−ｍｐｌリガンドは、上記の巨核球液体培養分析法でテストした。ｐＭＯＮ２６４５０及びｐＭＯＮ２６４５１−３は、それ自体に活性は認められなかったが、ヒトＩＬ−３レセプター作動薬ｐＭＯＮ１３２８８とともに同時投与した場合には、ｐＭＯＮ１３２８８を越える活性を示した。３．巨核球フィブリン凝固分析ＣＤ３４＋富化固体群を、上記のように分離した。シトキンの存在下又は不存在下に、細胞を 25,000 個/mＬの濃度で、基本ＩｓｃｏｖｅｓＩＭＤＭ培地にＢＳＡ 0.3％、アポトランスフェリン 0.4 mg/mＬ、ＦｅＣｌ₂ 6.67 μＭ、ＣａＣｌ₂ 25 μ g/mＬ、Ｌ−アスパラギン 25 μ g/mＬ、Ｅ−アミノ−ｎ−カプロイン酸 500μ g/mＬ、及びペニシリン／ストレプトマイシンからなる培地に懸濁する。35 mm のプレートの中に移植する前に、トロンビンを添加（0.25単位/mＬ）し、凝固物生成を開始させる。ＣＯ₂濃度５％で、細胞を37℃で13日間、加湿インキュベーターの中でインキュベートする。培養期間の終わりに、プレートをメタノール：アセトン（１：３）混合物で固定し、空気乾燥し、-200 ℃で貯蔵し、染色する。抗ＣＤ４１ａ、抗ＣＤ４２、及び抗ＣＤ６１からなる第１モノクロナール抗体カクテルによる、ペルオキシダーゼ免疫細胞化学染色法(Ｚymed 、Ｈistostain-ＳＰ社，Ｓan Ｆrancisco ＣＡ)で染色する。染色後、コロニーを数え、陰性、ＣＦＵ−ＭＫ（焦点数１−２個、細胞数２５個未満の小コロニー）、ＢＦＵ−ＭＫ（多焦点、細胞数２５個を越える大コロニー）、又は混合コロニー（陽性細胞と陰性細胞の混合体）に分類する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年２月２８日【補正内容】請求の範囲１．下式のｃ−ｍｐｌリガンド：ここに、位置３７のＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、又はＧｌｕであり、位置４６のＸａａは、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、又はＭｅｔであり、位置４７のｘａａは、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、又はＧｌｕであり、位置１１２のＸａａは、欠失又はＬｅｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、又はＭｅｔであり、位置１１３のＸａａは、欠失又はＰｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、又はＭｅｔであり、位置１１４のＸａａは、欠失又はＰｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、又はＭｅｔであり、位置１１５のＸａａは、欠失又はＧｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、又はＡｓｎであり、位置１２２のＸａａは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、又はＡｓｐであり、位置２００のＸａａは、Ｔｒｐ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、又はＨｉｓであり、ここに、アミノ酸１から１７９をＣ−末端から欠失することができ、且つ、Ｘａａで示した少なくともアミノ酸の一つは、天然のｃ−ｍｐｌリガンド（１−３３２）のアミノ酸配列と異なり、当該たんぱく質は、Ｍｅｔ−1、Ａｌａ−1又はＭｅｔ−2Ａｌａ−1によって、場合により先行されていてもよい。２．請求項１のｃ−ｍｐｌリガンドにおいて、位置３７のＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、又はＧｌｕであり、位置４６のＸａａは、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、又はＭｅｔであり、位置４７のＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、又はＧｌｕであり、位置１１２のＸａａは、欠失し、位置１１３のＸａａは、欠失し、位置１１４のＸａａは、欠失し、位置１１５のＸａａは、欠失し、位置１２２のＸａａは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、又はＡｓｐであり、位置２００のＸａａは、Ｔｒｐ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、又はＨｉｓであるｃ−ｍｐｌリガンド、ここに、アミノ酸１１２−１１５は欠失し、アミノ酸１−１７９はＣ−末端から除くことができ、Ｘａａで示される１つ又は２つ以上のアミノ酸は対応する天然ｃ−ｍｐｌリガンド（１−３３２）のアミノ酸と異なり、これらのアミノ酸はＭｅｔ−1、Ａｌａ−1又はＭｅｔ−2Ａｌａ−1によって、場合により先行されていてもよい。３．請求項１のｃ−ｍｐｌリガンドにおいて、位置３７のＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、又はＧｌｕであり、位置４６のＸａａは、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、又はＩｌｅであり、位置４７のＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、又はＧｌｕであり、位置１１２のＸａａは、欠失又はＡｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、或いはＰｈｅであり、位置１１３のＸａａは、欠失又はＰｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、或いはＭｅｔであり、位置１１４のＸａａは、欠失又はＰｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、或いはＭｅｔであり、位置１１５のＸａａは、欠失又はＡｓｎであり、位置１２２のＸａａは、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、又はＡｓｐであり、位置２００のＸａａは、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、又はＭｅｔであるｃ−ｍｐｌリガンド。４．請求項１のｃ−ｍｐｌリガンドにおいて、位置３７のＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、又はＧｌｕであり、位置４６のＸａａは、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、又はＩｌｅであり、位置４７のＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、又はＧｌｕであり、位置１１２のＸａａは、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、又はＰｈｅであり、位置１１３のＸａａは、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、又はＭｅｔであり、位置１１４のＸａａは、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、又はＭｅｔであり、位置１１５のＸａａはＡｓｎであり、位置１２２のＸａａは、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、又はＡｓｐであり、位置２００のＸａａは、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、又はＭｅｔであるｃ−ｍｐｌリガンド。５．請求項１のｃ−ｍｐｌリガンドにおいて、位置３７のＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、又はＧｌｕであり、位償４６のＸａａは、Ｌｅｕ、又はＰｈｅであり、位置４７のＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、又はＧｌｕであり、位置１１２のＸａａは、欠失又はＬｅｕであり、位置１１３のＸａａは、欠失又はＰｒｏであり、位置１１４のＸａａは、欠失又はＰｒｏであり、位置１１５のＸａａは：欠失又はＧｌｎであり、位置１２２のＸａａは、Ｌｙｓ又はＧｌｕであり、位置２００のＸａａは、Ｔｒｐ又はＡｒｇであるｃ−ｍｐｌリガンド。６．請求項１のｃ−ｍｐｌリガンドにおいて、位置４６における当該ＸａａがＬｅｕであり、位置１１２におけるＸａａがＬｅｕであり、位置１１３におけるＸａａがＰｒｏであり、位置１１４におけるＸａａがＰｒｏであり、位置１１５におけるＸａａがＧｌｎであり、位置１２２における当該ＸａａがＧｌｕであり、且つ、位置２００における当該ＸａａがＡｒｇであるｃ−ｍｐｌリガンド。７．下記突然変異の一つを有する天然ｃ−ｍｐｌリガンド（１−３３２）配列を有する請求項１のｃ−ｍｐｌリガンド。位置１２２がＧｌｕ、又は位置４６がＬｅｕで、且つ位置２００がＡｒｇ、又は、位置２００がＡｒｇ。８．下式のｃ−ｍｐｌリガンド、ここに、位置３７のＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、又はＧｌｕであり、位置４６のＸａａは、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、又はＭｅｔであり、位置４７のＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、又はＧｌｕであり、位置１１２のＸａａは、欠失又はＬｅｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、或いはＭｅｔであり、位置１１３のＸａａは、欠失又はＰｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、或いはＭｅｔであり、位置１１４のＸａａは、欠失又はＰｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、或いはＭｅｔであり、位置１１５のＸａａは、欠失又はＧｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、或いはＡｓｎであり、位置１２２のＸａａは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、又はＡｓｐであり、ここに、Ｘａａで示されるアミノ酸の少なくとも一つは、天然のｃ−ｍｐｌリガンド（１−１５３）のアミノ酸配列と異なり、且つ、Ｍｅｔ−1、Ａｌａ−1又はＭｅｔ−2Ａｌａ−1によって、場合により先行されていてもよい。９．請求項８のｃ−ｍｐｌリガンドにおいて、位置３７のＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、又はＧｌｕであり、位置４６のＸａａは、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、又はＭｅｔであり、位置４７のＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、又はＧｌｕであり、位置１１２のＸａａは、欠失し、位置１１３のＸａａは、欠失し、、位置１１４のＸａａは、欠失し、位置１１５のＸａａは、欠失し、位置１２２のＸａａは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、又はＡｓｐである、ｃ−ｍｐｌリガンド、ここに、Ｘａａで示される１つ又は２つ以上のアミノ酸は、天然ｃ−ｍｐｌリガンド（１−１５３）のアミノ酸配列と異なり、当該たんぱく質は、Ｍｅｔ−1、Ａｌａ-1又はＭｅｔ-2Ａｌａ-1によって、場合により先行されていてもよい。 10．請求項８のｃ−ｍｐｌリガンドにおいて、位置３７のＸａａがＴｈｒ、Ａｓｐ、又はＧｌｕであり、位置４６のＸａａがＬｅｕ、又はＰｈｅであり、位置４７のＸａａがＳｅｒ、Ａｓｐ、又はＧｌｕであり、位置１１２のＸａａが欠失又はＬｅｕであり、位置１１３のＸａａが欠失又はＰｒｏであり、位置１１４のＸａａが欠失又はＰｒｏであり、位置１１５のＸａａが欠失又はＧｌｎであり、位置１２２のＸａａがＬｙｓ又はＧｌｕであり、且つ、 11．天然のｃ−ｍｐｌリガンド（１−１５３）配列を有し、次の突然変異の一つ、位置１２２にＧｌｕ、又は、位置４６にＬｅｕを有する請求項８のｃ−ｍｐｌリガンド。 12．請求項１に準拠し、［ＳＥＱＩＤＮＯ：３７］のたんぱく質配列を有する請求項１のｃ−ｍｐｌリガンド。 13．請求項８に準拠し、［ＳＥＱＩＤＮＯ：３８］のたんぱく質配列を有する請求項８のｃ−ｍｐｌリガンド。 14．請求項１に準拠し、マウスＦｃ定常領域のキメラであり、［ＳＥＱＩＤＮＯ：４１］及び［ＳＥＱＩＤＮＯ：４２］のグループから選ばれたたんぱく質配列を有するｃ−ｍｐｌリガンド。 15．Ｒ₁は請求項１のｃ−ｍｐｌリガンドであり、Ｒ2 は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ｈＩＬ−３変異体、ＩＬ− ５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−10、ＩＬ−11、ＩＬ−12 、ＩＬ−13、ＩＬ−15、ＩＬ−16、ＬＩＦ、ｆｌｔ３／ｆｌｋ２、ヒト成長ホルモン、Ｂ−細胞成長因子、Ｂ−細胞分化因子、好酸性分化因子、及び幹細胞因子（ＳＣＦ）からなるグループから選ばれたコロニー刺激因子であり、且つ、ＬはＲ１及びＲ２の連結が可能なリンカーである、Ｒ１−Ｌ−Ｒ２、Ｒ２−Ｌ−Ｒ１、Ｒ１−Ｌ−Ｒ１からなるグループから選ばれた式を有するキメラたんぱく質。 16．Ｒ１は請求項８のｃ−ｍｐｌリガンドであり、Ｒ２は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ｈＩＬ−３変異体、ＩＬ− ４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−10、ＩＬ−11 、ＩＬ−12、ＩＬ−13、ＩＬ−15、ＩＬ−16、ＬＩＦ、ｆｌｔ３／ｆｌｋ２、ヒト成長ホルモン、Ｂ−細胞成長因子、Ｂ−細胞分化因子、好酸性分化因子、及び幹細胞因子（ＳＣＦ）からなるグループから選ばれたコロニー刺激因子であり、且つ、ＬはＲ１及びＲ２の連結が可能なリンカーである、Ｒ１−Ｌ−Ｒ２、Ｒ２−Ｌ−Ｒ１、Ｒ１−Ｌ−Ｒ１からなるグループから選ばれた式を有するキメラたんぱく質。 17．[ＳＥＱＩＤＮＯ：４３]、[ＳＥＱＩＤＮＯ：４４]、及び[ＳＥＱＩＤＮＯ：４５]からなるグループから選ばれたアミノ酸配列を有する、請求項16に準拠するキメラたんぱく質。 18．[ＳＥＱＩＤＮＯ：４０]、[ＳＥＱＩＤＮＯ：４８]、及び[ＳＥＱＩＤＮＯ：４９]からなるグループから選ばれたＤＮＡ配列を有するベクターＤＮＡ、及び請求項８のリガンドをコード化するＤＮＡを含む組み換えＤＮＡ配列。 19．［ＳＥＱＩＤＮＯ：３９］のＤＮＡ配列を有するベクターＤＮＡを有し、且つ請求項12のリガンドをコード化するＤＮＡを含む組み換えＤＮＡ配列。 20．［ＳＥＱＩＤＮＯ；５０］及び［ＳＥＱＩＤＮＯ：５１］からなるグループから選ばれたＤＮＡ配列を有するベクターＤＮＡ、及び請求項14のリガンドをコード化するＤＮＡを含む組み換えＤＮＡ配列。 21．[ＳＥＱＩＤＮＯ：５２]、[ＳＥＱＩＤＮＯ：５３]、及び[ＳＥＱＩＤＮＯ：５４]からなるグループから選ばれたＤＮＡ配列を有するベクターＤＮＡ、及び請求項16のリガンドをコード化するＤＮＡを含む組み換えＤＮＡ配列。 22．下記のステップを含む変異体ｃ−ｍｐｌリガンドを生産する方法。（ａ）ベクターＤＮＡ、及び請求項１のポリペプチド、請求項２のポリペプチド、請求項３のポリペプチド、請求項４のポリペプチド、請求項５のポリペプチド、請求項６のポリペプチド、請求項７のポリペプチド、請求項８のポリペプチド、請求項９のポリペプチド、請求項10のポリペプチド、請求項11のポリペプチド、請求項12のポリペプチド、請求項13のポリペプチド、請求項14のポリペプチド、請求項15のポリペプチド、請求項16のポリペプチド、請求項17のポリペプチドからなるグループから選ばれた、組み換えＤＮＡからコード化ポリペプチドの発現を許容できる条件下で、ポリペプチドのアミノ酸配列を有するｃ−ｍｐｌリガンドをコードするＤＮＡ配列からなる組み換えＤＮＡ配列を含む宿主細胞培養ステップ、および（ｂ）この培養液からポリペプチドを収穫するステップ。 23．治療有効量の、請求項１、２、８、９、11、12、13、14、15、16、又は17 のｃ−ｍｐｌリガンド、並びに医薬品に許容される担体を含む医薬組成物。 24．治療有効量の、請求項１のｃ−ｍｐｌリガンド、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ｈＩＬ−３変異体、ＩＬ−４、ＩＬ− ５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−10、ＩＬ−11、ＩＬ−12 、ＩＬ−13、ＩＬ−14、ＩＬ−15、ＩＬ−16、ＬＩＦ、ｆｌｔ３／ｆｌｋ２、ヒト成長ホルモン、Ｂ−細胞成長因子、Ｂ−細胞分化因子、好酸球分化因子、及び幹細胞因子（ＳＣＦ）からなるグループから選ばれたコロニー刺激因子、並びに、医薬品に許容される担体を含む医薬組成物。 25．治療有効量の、請求項８のｃ−ｍｐｌリガンド、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ｈＩＬ−３変異体、ＩＬ−４、ＩＬ− ５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−10、ＩＬ−11、ＩＬ−12 、ＩＬ−13、ＬＩＦ、ｆｌｔ３／ｆｌｋ２、ヒト成長ホルモン、Ｂ−細胞成長因子、Ｂ−細胞分化因子、好酸球分化因子、及び幹細胞因子（ＳＣＦ）、のグループから選ばれたコロニー刺激因子、並びに、医薬品に許容される担体を含む医薬組成物。 26．下記式のｃ−ｍｐｌリガンドから成る医薬組成物、ここに、位置３７のＸａａはＴｈｒ、Ａｓｐ、又はＧｌｕであり、位置４６のＸａａはＰｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、又はＭｅｔであり、位置４７のＸａａはＳｅｒ、Ａｓｐ、又はＧｌｕであり、位置１１２のＸａａは、欠失又はＬｅｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、或いはＭｅｔであり、位置１１３のＸａａは、欠失又はＰｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、或いはＭｅｔであり、位置１１４のＸａａは、欠失又はＰｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、或いはＭｅｔであり、位置１１５のＸａａは、欠失又はＧｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、或いはＡｓｎであり、位置１２２のＸａａは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、又は、Ａｓｐであり、位置２００のＸａａは、Ｔｒｐ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、又は、Ｈｉｓであり、ここに、アミノ酸１から１７９まではＣ−末端から欠失でき、且つ、位置１１２、１１３、１１４、１１５のアミノ酸の少なくとも一つは欠失するか、又は天然のｃ−ｍｐｌリガンド（１−３３２）のアミノ酸配列と異なり、位置３７、４６、４７、１２２、又は２００のアミノ酸の少なくとも一つは場合により、天然ｃ −ｍｐｌリガンドのアミノ酸配列と異なり、同タンパク質は場合によりＭｅｔ^-1 、Ａｌａ^-1またはＭｅｔ^-2Ａｌａ^-1により先行されていてもよい。 27．患者の体内で造血細胞生産を刺激する、薬剤を製造するための、請求項１、２、８、９、11、12、13、14、15、16、又は17記載のｃ−ｍｐｌリガンド、或いは請求項26で定義されるｃ−ｍｐｌリガンドの使用。 28．（ａ）幹細胞を他の細胞から分離し、（ｂ）当該分離幹細胞を、請求項１、２、８、９、11、12、13、14、15、16、又は17のｃ−ｍｐｌリガンド、或いは請求項26のｃ−ｍｐｌリガンドを含む選択培地で培養し、（ｃ）当該培養細胞を収穫する、各ステップを含む幹細胞の選択的ex-vivo膨張方法。 29．請求項１、２、８、９、11、12、13、14、15、16、又は17のｃ−ｍｐｌリガンド、或いは請求項26で定義されるｃ−ｍｐｌリガンドの使用であって、（ａ）幹細胞を取り出し、（ｂ）幹細胞を他の細胞から分離し、（ｃ）当該分離細胞を、治療薬剤を含む選択培地で培養し、（ｄ）当該培養細胞を収穫する、各ステップを含む造血障害患者の治療薬剤を調製するための使用。 30．請求項１、２、８、９、11、12、13、14、15、16、又は17のｃ−ｍｐｌリガンド、或いは請求項26で定義されるｃ−ｍｐｌリガンドを使用であって、（ａ）幹細胞を取り出し、（ｂ）幹細胞を他の細胞から分離し、（ｃ）当該分離幹細胞にＤＮＡを導入し、（ｄ）当該分離幹細胞を、当該リガンドを含む選択培地で培養し、（ｅ）当該培養細胞を収穫し、（ｆ）当該収穫細胞を、このような治療を必要とする患者に移植する、各ステップを含むヒト遺伝子治療用薬剤の調製のための使用。 31．請求項１、２、８、９、11、12、13、14、15、16、又は17のｃ−ｍｐｌリガンド、或いは請求項26で定義されるｃ−ｍｐｌリガンドを使用であって、（ａ）当該リガンドを投与し、（ｂ）造血細胞を血液ドナーから採取する、血液ドナー造血細胞の生産刺激薬剤の調製のための使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 38/27 Ｃ０７Ｋ 19/00 48/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ０７Ｋ 14/52 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＹ 19/00 37/36 Ｃ１２Ｐ 21/02 37/24 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ファーバラ，ジーンピー. アメリカ合衆国 63021 ミシガン州ボールウィン，ホーリィガーデンドライブ 142 (72)発明者カーン，ラリーイー. アメリカ合衆国 63146 ミズーリ州セントルイス，テンポドライブ 1030 (72)発明者バウム，チャールズエム. アメリカ合衆国 63131 ミズーリ州セントルイス，メイソンノールロード 1712 (72)発明者ペッグ，ライルイー. アメリカ合衆国 63017 ミズーリ州チェスターフィールド，オークバラドライブ 1164 (72)発明者マクカーン，ジョンピー. アメリカ合衆国 63038 ミズーリ州セントルイス，バブラーメドウズドライブ 18612

Claims

【特許請求の範囲】１．下式のｃ−ｍｐｌリガンド：ここに、位置３７のＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、又はＧｌｕであり、位置４６のＸａａは、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、又はＭｅｔであり、位置４７のＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、又はＧｌｕであり、位置１１２のＸａａは、欠失又はＬｅｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、又はＭｅｔであり、位置１１３のＸａａは、欠失又はＰｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、又はＭｅｔであり、位置１１４のＸａａは、欠失又はＰｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、又はＭｅｔであり、位置１１５のＸａａは、欠失又はＧｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、又はＡｓｎであり、位置１２２のＸａａは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、又はＡｓｐであり、位置２００のＸａａは、Ｔｒｐ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、又はＨｉｓであり、ここに、アミノ酸１から１７９をＣ−末端から欠失することができ、且つ、Ｘａａで示した少なくともアミノ酸の一つは、天然のｃ−ｍｐｌリガンド（１−３３２）の対応するアミノ酸と異なり、当該たんぱく質は、Ｍｅｔ−１、Ａｌａ−1 又はＭｅｔ−2Ａｌａ−1によって、場合により先行されていてもよい。２．請求項１のｃ−ｍｐｌリガンドここに、位置３７のＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、又はＧｌｕであり、位置４６のＸａａは、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、又はＭｅｔであり、位置４７のＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、又はＧｌｕであり、位置１１２のＸａａは、欠失し、位置１１３のＸａａは、欠失し、位置１１４のＸａａは、欠失し、位置１１５のＸａａは、欠失し、位置１２２のＸａａは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、又はＡｓｐであり、位置２００のＸａａは、Ｔｒｐ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、又はＨｉｓであり、ここに、アミノ酸１１２−１１５は欠失し、アミノ酸１−１７９はＣ−末端から除くことができ、Ｘａａで示される１つ又は２つ以上のアミノ酸は対応する天然ｃ−ｍｐｌリガンド（１−３３２）のアミノ酸と場合により異なり、これらのアミノ酸はＭｅｔ-1、Ａｌａ-1又はＭｅｔ-2Ａｌａ-1によって、場合により先行されていてもよい。３．請求項１のｃ−ｍｐｌリガンド、ここに、位置３７のＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、又はＧｌｕであり、位置４６のＸａａは、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、又はＩｌｅであり、位置４７のＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、又はＧｌｕであり、位置１１２のＸａａは、欠失又はＡｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、或いはＰｈｅであり、位置１１３のＸａａは、欠失又はＰｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、或いはＭｅｔであり、位置１１４のＸａａは、欠失又はＰｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、或いはＭｅｔであり、位置１１５のＸａａは、欠失又はＡｓｎであり、位置１２２のＸａａは、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、又はＡｓｐであり、位置２００のＸａａは、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、又はＭｅｔである４．請求項１のｃ−ｍｐｌリガンドにおいて、位置３７のＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、又はＧｌｕであり、位置４６のＸａａは、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、又はＩｌｅであり、位置４７のＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、又はＧｌｕであり、位置１１２のＸａａは、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、又はＰｈｅであり、位置１１３のＸａａは、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、又はＭｅｔであり、位置１１４のＸａａは、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、又はＭｅｔであり、位置１１５のＸａａはＡｓｎであり、位置１２２のＸａａは、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、又はＡｓｐであり、位置２００のＸａａは、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、又はＭｅｔであるｃ−ｍｐｌリガンド。５．請求項１のｃ−ｍｐｌリガンドにおいて、位置３７のＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、又はＧｌｕであり、位置４６のＸａａは、Ｌｅｕ、又はＰｈｅであり、位置４７のＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、又はＧｌｕであり、位置１１２のＸａａは、欠失又はＬｅｕであり、位置１１３のＸａａは、欠失又はＰｒｏであり、位置１１４のＸａａは、欠失又はＰｒｏであり、位置１１５のＸａａは：欠失又はＧｌｎであり、位置１２２のＸａａは、Ｌｙｓ又はＧｌｕであり、位置２００のＸａａは、Ｔｒｐ又はＡｒｇであるｃ−ｍｐｌリガンド。６．請求項１のｃ−ｍｐｌリガンドにおいて、位置４６における当該ＸａａがＬｅｕであり、位置１１２におけるＸａａがＬｅｕであり、位置１１３におけるＸａａがＰｒｏであり、位置１１４におけるＸａａがＰｒｏであり、位置１１５におけるＸａａがＧｌｎであり、位置１２２における当該ＸａａがＧｌｕであり、且つ、位置２００における当該ＸａａがＡｒｇであるｃ−ｍｐｌリガンド。７．下記突然変異の一つを有する天然ｃ−ｍｐｌリガンド（１−３３２）配列を有する請求項１のｃ−ｍｐｌリガンド。位置１２２がＧｌｕ、又は位置４６がＬｅｕで、且つ位置２００がＡｒｇ、又は、位置２００がＡｒｇ。８．下式のｃ−ｍｐｌリガンド、ここに、位置３７のＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、又はＧｌｕであり、位置４６のＸａａは、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、又はＭｅｔであり、位置４７のＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、又はＧｌｕであり、位置１１２のＸａａは、欠失又はＬｅｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、或いはＭｅｔであり、位置１１３のＸａａは、欠失又はＰｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、或いはＭｅｔであり、位置１１４のＸａａは、欠失又はＰｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、或いはＭｅｔであり、位置１１５のＸａａは、欠失又はＧｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、或いはＡｓｎであり、位置１２２のＸａａは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、又はＡｓｐである、ｃ−ｍｐｌリガンド、ここに、Ｘａａで示されるアミノ酸の少なくとも一つは、対応する天然のｃ−ｍｐｌリガンド（１−１５３）のアミノ酸と異なり、且つ、Ｍｅｔ-1、Ａｌａ-1 又はＭｅｔ-2Ａｌａ-1によって、場合により先行されていてもよい。９．請求項８のｃ−ｍｐｌリガンドにおいて、位置３７のＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、又はＧｌｕであり、位置４６のＸａａは、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、又はＭｅｔであり、位置４７のＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、又はＧｌｕであり、位置１１２のＸａａは、欠失し、位置１１３のＸａａは、欠失し、、位置１１４のＸａａは、欠失し、位置１１５のｘａａは、欠失し、位置１２２のＸａａは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、又はＡｓｐである、ｃ−ｍｐｌリガンド、ここに、Ｘａａで示される１つ又は２つ以上のアミノ酸は、対応する天然ｃ−ｍｐｌリガンド（１−１５３）のアミノ酸と異なり、当該たんぱく質は、Ｍｅｔ− 1、Ａｌａ-1又はＭｅｔ-2Ａｌａ-1によって、場合により先行されていてもよい。 10．請求項８のｃ−ｍｐｌリガンドにおいて、位置３７のＸａａがＴｈｒ、Ａｓｐ、又はＧｌｕであり、位置４６のＸａａがＬｅｕ、又はＰｈｅであり、位置４７のＸａａがＳｅｒ、Ａｓｐ、又はＧｌｕであり、位置１１２のＸａａが欠失又はＬｅｕであり、位置１１３のＸａａが欠失又はＰｒｏであり、位置１１４のＸａａが欠失又はＰｒｏであり、位置１１５のＸａａが欠失又はＧｌｎであり、位置１２２のＸａａがＬｙｓ又はＧｌｕであり、且つ、 11．天然のｃ−ｍｐｌリガンド（１−１５３）配列を持ち、突然変異して、位置１２２にＧｌｕ、又は、位置４６にＬｅｕで、且つ位置２００にＡｒｇ、又は、位置２００にＡｒｇの一つ：を有する請求項８のｃ−ｍｐｌリガンド。 12．請求項１に準拠し、［ＳＥＱＩＤＮＯ：３７］のたんぱく質配列を有する請求項１のｃ−ｍｐｌリガンド。 13．請求項８に準拠し、［ＳＥＱＩＤＮＯ：３８］のたんぱく質配列を有する請求項８のｃ−ｍｐｌリガンド。 14．請求項１に準拠し、マウスＦｃ定常領域のキメラであり、［ＳＥＱＩＤＮＯ：４１］及び［ＳＥＱＩＤＮＯ：４２］のグループから選ばれたたんぱく質配列を有するｃ−ｍｐｌリガンド。 15．Ｒ₁は請求項１のｃ−ｍｐｌリガンドであり、Ｒ2 は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ｈＩＬ−３変異体、ＩＬ− ５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−10、ＩＬ−11、ＩＬ−12 、ＩＬ−13、ＩＬ−15、ＩＬ−16、ＬＩＦ、ｆｌｔ３／ｆｌｋ２、ヒト成長ホルモン、Ｂ−細胞成長因子、Ｂ−細胞分化因子、好酸性分化因子、及び幹細胞因子（ＳＣＦ）からなるグループから選ばれたコロニー刺激因子であり、且つ、ＬはＲ１及びＲ２の連結が可能なリンカーである、Ｒ１−Ｌ−Ｒ２、Ｒ２−Ｌ−Ｒ１、Ｒ１−Ｌ−Ｒ１からなるグループから選ばれた式を有するキメラたんぱく質。 16．Ｒ１は請求項８のｃ−ｍｐｌリガンドであり、Ｒ２は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ｈＩＬ−３変異体、ＩＬ− ４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−10、ＩＬ−11 、ＩＬ−12、ＩＬ−13、ＩＬ−15、ＩＬ−16、ＬＩＦ、ｆｌｔ３／ｆｌｋ２、ヒト成長ホルモン、Ｂ−細胞成長因子、Ｂ−細胞分化因子、好酸性分化因子、及び幹細胞因子（ＳＣＦ）からなるグループから選ばれたコロニー刺激因子であり、且つ、ＬはＲ１及びＲ２の連結が可能なリンカーである、Ｒ１−Ｌ−Ｒ２、Ｒ２−Ｌ−Ｒ１、Ｒ１−Ｌ−Ｒ１からなるグループから選ばれた式を有するキメラたんぱく質。 17．［ＳＥＱＩＤＮＯ：４３］、[ＳＥＱＩＤＮＯ：４４]、及び[ＳＥＱＩＤＮＯ：４５]からなるグループから選ばれたアミノ酸配列を有する、請求項16に準拠するキメラたんぱく質。 18．［ＳＥＱＩＤＮＯ：４０］、[ＳＥＱＩＤＮＯ：４８]、及び[ＳＥＱＩＤＮＯ：４９]からなるグループから選ばれたＤＮＡ配列を有する、ベクターＤＮＡ、及び請求項８のリガンドをコード化するＤＮＡを含む組み換えＤＮＡ配列。 19．［ＳＥＱＩＤＮＯ：３９］のＤＮＡ配列を有するベクターＤＮＡ：および、請求項12のリガンドをコード化するＤＮＡを含む組み換えＤＮＡ配列。 20．［ＳＥＱＩＤＮＯ：５０］及び［ＳＥＱＩＤＮＯ：５１］からなるグループから選ばれたＤＮＡ配列を有する、ベクターＤＮＡ、及び請求項14のリガンドをコード化するＤＮＡを含む組み換えＤＮＡ配列。 21．［ＳＥＱＩＤＮＯ：５２］、[ＳＥＱＩＤＮＯ：５３]、及び[ＳＥＱＩＤＮＯ：５４]からなるグループから選ばれたＤＮＡ配列を有する、ベクターＤＮＡ、及び請求項16のリガンドをコード化するＤＮＡを含む組み換えＤＮＡ配列。 22．下記のステップを含む変異体ｃ−ｍｐｌリガンドを生産する方法。（ａ）ベクターＤＮＡ、及び請求項１のポリペプチド、請求項２のポリペプチド、請求項３のポリペプチド、請求項４のポリペプチド、請求項５のポリペプチド、請求項６のポリペプチド、請求項７のポリペプチド、請求項８のポリペプチド、請求項９のポリペプチド、請求項10のポリペプチド、請求項11のポリペプチド、請求項12のポリペプチド、請求項13のポリペプチド、請求項14のポリペプチド、請求項15のポリペプチド、請求項16のポリペプチド、請求項17のポリペプチドからなるグループから選ばれ、組み換えＤＮＡからコード化ポリペプチドの発現を許容できる条件下で、ポリペプチドのアミノ酸配列を有するｃ−ｍｐｌリガンドをコードするＤＮＡ配列からなる組み換えＤＮＡ配列を含む宿主細胞培養ステップ、および（ｂ）この培養液からポリペプチドを採取するステップ。 23．治療有効量の、請求項１、２、８、９、11、12、13、14、15、16、又は17 のｃ−ｍｐｌリガンド、並びに医薬品に許容される担体を含む医薬組成物。 24．治療有効量の、請求項１のｃ−ｍｐｌリガンド、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ｈＩＬ−３変異体、ＩＬ−４、ＩＬ− ５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−10、ＩＬ−11、ＩＬ−12 、ＩＬ−13、ＩＬ−15、ＩＬ−16、ＬＩＦ、ｆｌｔ３／ｆｌｋ２、ヒト成長ホルモン、Ｂ−細胞成長因子、Ｂ−細胞分化因子、好酸球分化因子、及び幹細胞因子（ＳＣＦ）からなるグループから選ばれたコロニー刺激因子、並びに、医薬品に許容される担体を含む医薬組成物。 25．治療有効量の、請求項８のｃ−ｍｐｌリガンド、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ｈＩＬ−３変異体、ＩＬ−４、ＩＬ− ５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−10、ＩＬ−11、ＩＬ−12 、ＩＬ−13、ＬＩＦ、ｆｌｔ３／ｆｌｋ２、ヒト成長ホルモン、Ｂ−細胞成長因子、Ｂ−細胞分化因子、好酸性分化因子、及び幹細胞因子（ＳＣＦ）、のグループから選ばれたコロニー刺激因子、並びに、医薬品に許容される担体を含む医薬組成物。 26．治療有効量の、請求項１、２、８、９、11、12、13、14、15、16、又は17 のｃ−ｍｐｌリガンドを患者に投与することを含む造血細胞生産の刺激方法。 27．（ａ）幹細胞を他の細胞から分離し、（ｂ）当該分離幹細胞を、請求項１、２、８、９、11、12、13、14、15、16、又は17のｃ−ｍｐｌリガンドを含む選択培地で培養し、（ｃ）当該培養細胞を収穫する、各ステップを含む幹細胞の選択的エクスビボ膨張方法。 28．（ａ）幹細胞を取り出し、（ｂ）幹細胞を他の細胞から分離し、（ｃ）当該分離細胞を、請求項１、２、８、９、11、12、13、14、15、16、又は17のｃ− ｍｐｌリガンドを含む選択培地で培養し、（ｄ）当該培養細胞を収穫する、各ステップを含む造血障害患者の治療方法。 29．（ａ）幹細胞を取り出し、（ｂ）当該幹細胞を他の細胞から分離し、（ｃ）当該幹細胞にＤＮＡを導入し、（ｄ）当該分離幹細胞を、請求項１、２、８、９、11、12、13、14、16、又は17 のｃ−ｍｐｌリガンドを含む選択培地で培養し、（ｅ）当該培養細胞を収穫し、（ｆ）当該培養細胞を、このような治療を必要とする患者に移植する各ステップを含むヒト遺伝子治療方法。 30．（ａ）治療有効量の、請求項１、２、８、９、11、12、13、14、15、16、又は17のｃ−ｍｐｌリガンドを投与し、（ｂ）血液ドナーから造血細胞を採取する、各ステップを含む血液ドナー造血細胞の生産刺激方法。