JPH11500426A - Ｖｅｇｆ特異的オリゴヌクレオチドを用いた血管新生の抑制 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 血管新生を低減させる方法および血管新生に付随する種々の疾患の治療方法を開示する。これら方法には、血管内皮増殖因子の核酸に特異的で血管内皮増殖因子の発現を抑制するのに有効な合成オリゴヌクレオチドを組織または患者に投与することを含む。

Description

【発明の詳細な説明】 ＶＥＧＦ特異的オリゴヌクレオチドを用いた血管新生の抑制 関連出願の相互参照 この出願は、１９９３年７月２７日に出願した、発明の名称が「血管内皮増殖 因子発現のアンチセンスオリゴヌクレオチド抑制」である同時継続中の特許出願 第０８／０９８,９４２号の一部継続出願である。基金 この出願は、国立衛生研究所により授与された付与番号Ｒ０１ ＥＹＯ８６９ のもと、政府の援助によりなされた。従って、政府は本発明の権利の一部を有す る。発明の背景 本発明は、血管新生に関する。さらに詳しくは、本発明は、血管内皮増殖因子 （vascular endothelial growth factor）に特異的なオリゴヌクレオチドを用い た、血管新生に関連する疾患の治療に関する。 糖尿病網膜症、未熟児網膜症および加齢黄斑変性症などの網膜の血管新生疾患 は、米国および世界における失明の主要な原因であり、これらプロセスに関連す る生化学的事象は未だ完全には解明されていない。 糖尿病網膜症は、米国において労働成人（２０〜６４）の失明の原因のトップ である（フォスター（Ｆoster）、Ｈarrison's Ｐrinciples of Ｉnternal Ｍed icine（イセルバッヒャー（Ｉsselbacher）ら編）マックグロー−ヒル、ニュー ヨーク（１９９４）１９９４〜１９９５頁）。真性糖尿病の経過中に網膜の血管 は、浸出性の血管となるばかりでなく網膜低酸素症をもたらす血管の脱落ともな る。これら合併症の結果は、出血、綿状白斑、網膜梗塞、および出血や網膜剥離 となる網膜の血管新生である。もし処置せずに放置したなら、６０％が視力喪失 する。増殖糖尿病網膜症の古典療法は汎網膜レーザー光凝固（ＰＲＰ）である。 しかしながら、汎網膜レーザー光凝固でも、中心窩熱症、出血、網膜剥離および 脈絡膜血管増殖などの合併症が起こり得る。さらに、この処置の他の都合の悪い 作用としては、周辺視力の低下、夜間視力の低下、および色知覚の変化がある（ Ａm.Ｊ.Ｏphthalmol.（１９７６）８１：３８３〜３９６；Ｏphthalmol.（１９ ９１）９８：７４１〜８４０）。 それゆえ、糖尿病網膜症の一層有効な治療法に対する必要性が存在する。 未熟児網膜症（ＲＯＰ）は、米国における子供の失明の共通の原因である（ピ アス（Ｐierce）ら（１９９４）Ｉnt.Ｏphth.Ｃlinics ３４：１２１〜１４８） 。未熟児は誕生後、補助酸素がなくとも酸素過剰状態に晒される。なぜなら、子 宮内の酸素分圧は通常の室内空気を呼吸する場合に比べてはるかに低いからであ る。このような相対的な酸素過剰症は、ＲＯＰになることがあるとしても生存に 必要なものである。網膜の血管は周辺網膜中への成長を止め、その結果、成長中 の網膜の代謝要求が増大するにつれて虚血および局限的な低酸素状態となる。こ うした低酸素症は、その後の網膜の血管新生を刺激する。この血管新生は通常、 寛解するが、不可逆的な視力喪失となることがある。１年に世界的推計で１００ ０万の症例につき少なくとも１０,０００の新たな症例がある。現在のところ、 ＲＯＰの有効な治療法はない。低温療法およびレーザー療法の２つの治療法が用 いられているが完全に有効なものではなく、これら方法自体が目に障害をもたら す（ピアスら（１９９４）Ｉnt.Ｏphth.Ｃlinics ３４：１２１〜１４８）。他 の多くの抗脈管形成化合物が試験されているが、網膜血管新生の抑制は報告され ていない（スミス（Ｓmith）ら（１９９４）Ｉnvest.Ｏphthalmol.Ｖis.Ｓci.３ ５：１４４２）。 それゆえ、ＲＯＰの有効な治療法に対する必要性が存在する。 加齢黄斑変性症は米国における老齢成人の失明の原因のトップであり、カフカ スアメリカ人（Ｃaucasian Ａmericans）のすべての両眼失明の３０％までを占 める（作者不明（１９９４）Ｐrevent Ｂlindness Ａmerica）。この疾患は、網 膜の光感受性光受容細胞に生理的支持を付与する網膜色素上皮細胞への障害によ る中心視力の喪失（通常、両眼性）を特徴とする。ほとんどの症例において、現 在のところ有効な治療法はない。早期に診断した滲出性の症例の約２０％におい てレーザー療法が視力のさらなる喪失を防ぐことはできる。しかしながら、この 作用は一過性のものである（ブレスラー（Ｂressler）ら、Ｐrinciples and Ｐr actices of Ｏphthalmology（アルバート（Ａlbert）およびジャコビアック（Ｊ akobiac）編）、ソーンダース（Ｗ.Ｂ.Ｓaunders Ｃo.）、フィラデルフィア、 ペンシルベニア（１９９４）Ｖol.２、８３４〜８５２頁）。 それゆえ、加齢黄斑変性症の一層有効で恒久的な治療法に対する必要性が存在 する。 黄斑血管新生はまた、鎌状赤血球網膜症、血管新生緑内障、網膜静脈閉塞症、 その他の低酸素症の基礎をなす病理でもある。これら眼科疾患並びに血管新生に 付随する他の病理学的状態（すなわち、腫瘍の増殖、損傷の治癒）は、共通因子 として低酸素症を有すると思われる（ナイトン（Ｋnighton）ら（１９８３）Ｓc ience２２１：１２８３〜１２８５；フォークマン（Ｆolkman）ら（１９８７） Ｓcience２３５：４４２〜４４６；クラグスブルン（Ｋlagsbrun）ら（１９９１ ）Ａnn.Ｒev.Ｐhysiol.５３：２１７〜２３９；ミラー（Ｍiller）ら（１９９３ ）Ｐrinciples and Ｐractice of Ｏphthalmology、ソーンダース、フィラデル フィア、７６０頁；アイエロ（Ａiello）ら（１９９４）Ｎew Ｅng.Ｊ.Ｍed.３ ３１：１４８０〜１４８７）。さらに、網膜血管新生は、低酸素症に応答して網 膜により放出される「血管形成因子（vasoformative factor）」の結果であると の仮説が立てられている（マイケルソン（Ｍichaelson）（１９４８）Ｔrans.Ｏ phthalmol.Ｓoc.Ｕ.Ｋ.６８：１３７〜１８０；およびアシュトン（Ａshton）ら （１９５４）Ｂr.Ｊ.Ｏphthalmol.３８：３９７〜４３２）。近年の実験データ は、血管内皮増殖因子の発現と網膜血管新生との間に高度の相関がみられること を示している（アイエロら（１９９４）Ｎew Ｅng.Ｊ.Ｍed.３３１：１４８０〜 １４８７）。さらに、糖尿病患者の硝子体液で上昇レベルの血管内皮増殖因子が 認められている（アイエロら、上掲）。それゆえ、このサイトカイン／増殖因子 は血管新生関連疾患において重要な役割を果たしていると思われる。 血管内皮増殖因子／血管透過性因子（ＶＥＧＦ／ＶＰＦ）は、内皮細胞特異的 なマイトジェンであり、最近、低酸素症によって刺激され腫瘍の血管形成に必要 であることが示された（センガー（Ｓenger）ら（１９８６）Ｃancer Ｒes.４６ ： ５６２９〜５６３２；キム（Ｋim）ら（１９９３）Ｎature３６２：８４１〜８ ４４；シュウェイキ（Ｓchweiki）ら（１９９２）Ｎature３５９：８４３〜８４ ５；プレート（Ｐlate）ら（１９９２）Ｎature３５９：８４５〜８４８）。Ｖ ＥＧＦ／ＶＰＦは、３４〜４３ｋＤａの（優勢な種は約４５ｋＤａにある）二量 体のジスルフィド様結合した糖タンパク質であり、種々の腫瘍細胞および正常細 胞により合成および分泌される。さらに、色素内皮細胞や血管周囲細胞などの培 養ヒト網膜細胞はＶＥＧＦを分泌し、低酸素症に応答してＶＥＧＦ遺伝子発現を 増加させることが示されている（アダミス（Ａdamis）ら（１９９３）Ｂiochem. Ｂiophys.Ｒes.Ｃommun.１９３：６３１〜６３８；プルート（Ｐlouet）ら（１ ９９２）Ｉnvest.Ｏphthalmol.Ｖis.Ｓci.３４：９００；アダミスら（１９９３ ）Ｉnvest.Ｏphthalmol.Ｖis.Ｓci.３４：１４４０；アイエロら（１９９４）Ｉ nvest.Ｏphthalmol.Ｖis.Ｓci.３５：１８６８；シモレ−ピナテル（Ｓimorre− Ｐinatel）ら（１９９４）Ｉnvest.Ｏphthalmol．Ｖis.Ｓci.３５：３３９３〜 ３４００）。対照的に、正常組織中ではＶＥＧＦは比較的低レベルである。それ ゆえ、ＶＥＧＦは血管新生に関連する多くの病理学的状態およびプロセスにおい て主要な役割を果たしていると思われる。それゆえ、上記種々の状態により引き 起こされる組織中のＶＥＧＦ発現を制御することは、低酸素症に付随する治療ま たは予防療法の鍵となるであろう。発明の要約 低酸素症の作用を受けた細胞はＶＥＧＦを発現することが知られている。ＶＥ ＧＦのｍＲＮＡに特異的な合成オリゴヌクレオチドが低酸素症誘発血管新生を抑 制しうることが今やわかった。この知見を用いて本発明を開発したが、本発明は 血管新生を低減させる方法および血管新生に関連する異常または疾患の治療方法 を包含するものである。本明細書において「血管新生」なる語は、血管および毛 細血管の増殖をいう。 本発明の方法において、血管内皮増殖因子の核酸に特異的で血管内皮増殖因子 の発現を抑制するのに有効な合成オリゴヌクレオチドを所定量、血管新生した組 織に投与する。この組織は培養液であってもよいし、またはヒトその他の哺乳動 物などの動物の体の一部もしくは全体であってもよい。 本明細書において「合成オリゴヌクレオチド」なる語は、少なくとも一つの５ ’から３’へのインターヌクレオチド結合を介して共有結合により連結したヌク レオチドからなる化学的に合成したポリマーをいう。幾つかの態様において、こ れらオリゴヌクレオチドは、少なくとも一つのデオキシリボヌクレオチド、リボ ヌクレオチド、またはデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとの両者を 含む。他の態様において、本発明の方法に用いる合成オリゴヌクレオチドは長さ が約１４〜約２８ヌクレオチドである。好ましい態様において、これらオリゴヌ クレオチドは約１５〜約２５のヌクレオチドを含む。 幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドはまた、ＶＥＧＦのｍＲＮＡ内に 含まれるヌクレオチド配列にハイブリダイズする能力を損なうことなく、多くの 仕方で修飾することができる。本明細書において「修飾オリゴヌクレオチド」な る語は、少なくとも２つのヌクレオチドが一方のヌクレオチドの５’末端と他方 のヌクレオチドの３’末端との間で合成結合、すなわちホスホジエステル以外の 結合により共有結合で連結されており、その際、該５’ヌクレオチドのリン酸基 がいずれかの化学基で置換されているようなオリゴヌクレオチドをいう。 幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドの少なくとも一つのインターヌク レオチド結合は、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオ エート、リン酸エステル、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、 カルバメート、カーボネート、リン酸トリエステル、アセトアミデート、および ／またはカルボキシメチルエステルである。 「修飾オリゴヌクレオチド」なる語はまた、修飾塩基および／または糖を有す るオリゴヌクレオチドをも包含する。さらに、分子当たり一つの非架橋性酸素中 に置換を有する、酸化されていないかまたは部分的に酸化されたオリゴヌクレオ チドは修飾オリゴヌクレオチドであると考えられる。３’および／または５’末 端にヌクレアーゼ耐性を付与する嵩ばった置換基および／またはヒトの介入なし にはインビボで認められない種々の他の構造的修飾を有するオリゴヌクレオチド もまた修飾オリゴヌクレオチドと考えられる。他の修飾としては、該オリゴヌク レオチド分子の内部または末端にあるものが挙げられ、インターヌクレオシドリ ン酸結合の該分子への付加、および開裂させ、または反対鎖または結合酵素もし くはゲノムに結合する他のタンパク質に架橋させる末端リボース、デオキシリボ ースおよびリン酸修飾が含まれる。 未熟児網膜症（ＲＯＰ）の治療方法が提供される。この方法は、血管内皮増殖 因子の核酸に特異的で血管内皮増殖因子の網膜中での発現を抑制しうるオリゴヌ クレオチドの治療学的量を、ＲＯＰを患う患者に投与する工程を含む。 本発明の他の側面において、糖尿病網膜症の治療方法が提供される。この方法 は、血管内皮増殖因子の核酸に特異的でＶＥＧＦの網膜中での発現を抑制しうる オリゴヌクレオチドの治療学的量を、糖尿病網膜症を患う患者に投与する工程を 含む。 本発明のさらに他の側面において、加齢黄斑変性症（ＡＲＭＤ）の治療方法が 提供される。この方法は、血管内皮増殖因子の核酸に特異的でＶＥＧＦの網膜中 での発現を抑制しうるオリゴヌクレオチドの治療学的量を、ＡＲＭＤを患う患者 に投与する工程を含む。 上記本発明の方法の幾つかの好ましい態様において、オリゴヌクレオチドを局 所（たとえば、黄斑内または病変内）および／または全身投与する。「局所投与 」なる語は生体の定められた領域または部位への送達をいい、一方、「全身投与 」なる語は経口摂取により、または筋肉内、静脈内、皮下もしくは腹腔内注射に よる生体全体への送達を包含することを意味する。 本発明の他の側面は、血管新生を抑制することができ、それゆえ本発明の方法 に有用な医薬組成物を含む。これら組成物は、血管内皮増殖因子の発現を特異的 に抑制する合成オリゴヌクレオチドおよび生理学的および／または薬理学的に許 容しうる担体を含む。 「薬理学的に許容しうる」なる語は、活性成分の生物学的作用の有効性を妨害 することのない非毒性物質を意味する。「生理学的に許容しうる」なる語は、生 物系、たとえば、細胞、細胞培養液、組織、または生物体などと両立しうる非毒 性物質をいう。 本発明の他の側面は、疾患状態に付随する血管新生におけるＶＥＧＦの役割を 評価することである。図面の簡単な説明 本発明の上記および他の目的、本発明の種々の特徴、並びに本発明それ自体は 、下記の記載を添付の図面とともに読んだときに一層完全に理解される。添付図 面において、 図１は、網膜血管新生のマウスモデルの模式図である； 図２は、未熟児網膜症における血管新生を抑制する本発明のオリゴヌクレオチ ドの能力を示すグラフである； 図３は、ＶＥＧＦの発現を抑制するヒトＶＥＧＦ特異的オリゴヌクレオチドの 能力を試験するのに用いたＥＬＩＳＡの模式図である； 図４は、ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフであり、本発明のヒトＶＥＧＦ特異的 オリゴヌクレオチドの存在下でのヒト細胞中でのＶＥＧＦの発現の低下を示す； および 図５は、ノーザンブロットの結果を示すグラフであり、種々の濃度の本発明の ヒトＶＥＧＦ特異的オリゴヌクレオチドの存在下でのヒト細胞によるＶＥＧＦの 発現の低下を示す。好ましい態様の詳細な説明 本明細書において言及する特許および科学文献は、当業者に利用できる知見を 確立するものである。本明細書中に引用する発行された米国特許、許された出願 、および引用文献は、参照のため本明細書中に引用する。 本発明は、網膜血管新生を含む血管新生に付随する疾患および異常を治療する のに有用な、ＶＥＧＦの核酸に特異的な合成アンチセンスオリゴヌクレオチドを 提供する。 アンチセンスオリゴヌクレオチド法は、遺伝子発現の抑制に新たなアプローチ を提供するものである（一般に、アグラワル（Ａgrawal）（１９９２）Ｔrends in Ｂiotech.１０：１５２；ワグナー（Ｗagner）（１９９４）Ｎature ３７２ ：３３３〜３３５；およびスタイン（Ｓtein）ら（１９９３）Ｓcience ２６１ ：１ ００４〜１０１２参照）。相補的な核酸配列（センス鎖）に結合することにより 、アンチセンスオリゴヌクレオチドはＲＮＡのスプライシングおよび翻訳を抑制 することができる。このようにしてアンチセンスオリゴヌクレオチドはタンパク 質の発現を抑制することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドはまたゲノ ムＤＮＡに結合して三本鎖を形成し、転写を抑制することも示されている。さら に、１７ｍｅｒの塩基配列は統計的にヒトゲノム中で１回しか起こらず、それゆ え、かかるアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることにより特定配列の極め て正確なターゲティングが可能である。 ＶＥＧＦをコードする領域は８つのエキソンからなることが決定されている（ ティッシャー（Ｔischer）ら（１９９４）Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２６６：１１９４７ 〜１１９５４）。１２１、１６５、および１８９アミノ酸長の３つのＶＥＧＦ転 写物が観察されており、別のスプライシング機構が存在することを示唆している （レング（Ｌeung）ら（１９８９）Ｓcience ２４６：１３０６〜１３０９；テ ィッシャーら（１９９１）Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２６６：１１９４７〜１１９５４） 。さらに最近では、２０６アミノ酸をコードする長さの第四のＶＥＧＦ転写物が 発見された（フック（Ｈouck）ら（１９９１）Ｍol.Ｅndocrinol.５：１８０６ 〜１８１４）。１２１および１６５アミノ酸ポリペプチドに相同な転写物がウシ の系で同定されており（レングら（１９８９）Ｓcience ２４６：１３０６〜１ ３０９）、１６５アミノ酸転写物に対応する転写物もまたマウスの系で同定され ている（コン（Ｃonn）ら（１９９０）Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci．（ＵＳＡ）８ ７：１３２３〜１３２７；センガーら（１９９０）Ｃancer Ｒes.５０：１７７ ４〜１７７８；クラフィー（Ｃlaffey）ら（１９９２）Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２６７ ：１６３１７〜１６３２２）。３つの形態のＶＥＧＦをコードする核酸配列もま たヒトで報告されており（ティッシャーら（１９９１）Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.２６６ ：１１９４７〜１１９５４）、ヒトＶＥＧＦとマウスＶＥＧＦとの比較により８ ５％以上の種間保存が明らかとなっている（クラフィーら（１９９２）Ｊ.Ｂiol .Ｃhem.２６７：１６３１７〜１６３２２）。 本発明のオリゴヌクレオチドは、ＶＥＧＦ発現を抑制するための標的として有 効に働くのであればＶＥＧＦ核酸配列のいずれの部分に向けられたものであって もよい。ＶＥＧＦをコードする遺伝子の配列はマウス（クラフィーら、上掲）お よびヒト（ティッシャーら、上掲）で報告されている。ＶＥＧＦ遺伝子のこれら ターゲティング領域には既知のエキソンのいずれの部分も含まれる。さらに、エ キソン−イントロン境界領域は、ＶＥＧＦ発現のアンチセンス抑制の潜在的に有 用な標的である。 ヒトＶＥＧＦに特異的な幾つかの代表的だが限定されないオリゴヌクレオチド のヌクレオチド配列を下記表１に列挙する。 刊行されている核酸配列および本明細書の開示に基づき、当業者であれば不当 な実験をすることなくＶＥＧＦ発現を抑制する他のアンチセンス核酸配列を同定 できるであろう。たとえば、ヒトＶＥＧＦ核酸に特異的にターゲティングされる 他の配列は、ＲＮアーゼＨにより開裂される能力に基づいて選択することができ る。 本発明のオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチ ド、または両者の組み合わせからなり、一つのヌクレオチドの５'末端と他のヌ クレオチドの３'末端とが共有結合により連結している。これらオリゴヌクレオ チドは長さが少なくとも１４ヌクレオチドであるが、１５〜２８ヌクレオチドの 長さであるのが好ましく、１５〜２５ｍｅｒが最も一般的である。 これらオリゴヌクレオチドの調製は、ホスホルアミデート化学またはＨ−ホス ホネート化学などの当該技術分野で認識された方法により行うことができ、これ らは手動または自動合成機により行うことができる（ウールマン（Ｕhlmann）ら 、Ｃhem.Ｒev.（１９９０）９０：５３４〜５８３）。 本発明のオリゴヌクレオチドはまた、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡにハイブリダイズす る能力を損なうことなく多くの仕方で修飾することができる。たとえば、オリゴ ヌクレオチドには一つのヌクレオチドの５'末端と他のヌクレオチドの３'末端と の間のホスホジエステル以外のインターヌクレオチド結合が含まれていてよく、 その際、５'ヌクレオチドホスホジエステル結合はいずれかの化学基で置換され ていてよい。そのような化学基の例としては、アルキルホスホネート、ホスホロ チオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホルア ミデート、リン酸エステル、カルバメート、アセトアミデート、カルボキシメチ ルエステル、カーボネート、およびリン酸トリエステルが挙げられる。これら結 合を有するオリゴヌクレオチドは公知の方法（たとえば、ウールマンら（１９９ ０）Ｃhem.Ｒev.９０：５４３〜５８３を参照）により調製できる。 他の修飾としては、オリゴヌクレオチド分子の内部または末端にあるものが挙 げられ、インターヌクレオシドリン酸結合の該分子への付加、たとえばアミノ基 と末端リボース、デオキシリボースとの間に種々の数の炭素残基を有するコレス テリルまたはジアミン化合物、および開裂させ、または反対鎖または結合酵素も しくはゲノムに結合する他のタンパク質に架橋させるリン酸修飾が含まれる。そ のような修飾オリゴヌクレオチドの例としては、２'−Ｏ−アルキル化リボース やリボースの代わりのアラビノースなどの修飾塩基および／または糖を有するオ リゴヌクレオチド、または３'位および５'位の両方でヒドロキシル基以外の化学 基（その３'位にて）およびリン酸基以外の化学基（その５'位にて）に結合した 糖を有する３',５'−置換オリゴヌクレオチドが挙げられる。他の修飾オリゴヌ クレオチドは、その３'末端および／または５'末端にてヌクレアーゼ耐性を付与 する嵩ばった置換基でキャッピングされており、ヌクレオチド当たり一つの非架 橋性酸素に置換基を有する。そのような修飾はインターヌクレオシド結合のいず れかまたはすべてでなされてよく、オリゴヌクレオチドのいずれかまたは両方の 末端および／または該分子の内部でなされていてよい。 これら修飾オリゴヌクレオチドの調製は当該技術分野でよく知られている（ア グラワルら（１９９２）Ｔrends Ｂiotechnol.１０：１５２〜１５８に概説され ている）。たとえば、ホスホルアミデート、Ｈ−ホスホネート化学、またはメチ ルホスホルアミデート化学などの当該技術分野で認識された技術を用いてヌクレ オチドを共有結合により連結することができる（たとえば、ウールマンら（１９ ９０）Ｃhem.Ｒev.９０：５４３〜５８４；アグラワルら（１９８７）Ｔetrahed ron Ｌett.２８：（３１）：３５３９〜３５４２；カルサーズ（Ｃaruthers）ら （１９８７）Ｍeth.Ｅnzymol.１５４：２８７〜３１３；米国特許第５,１４９, ７９８号を参照）。オリゴマー性のホスホロチオエートアナログの調製は、メト キシホスホルアミダイト（たとえば、アグラワルら（１９８８）Ｐroc.Ｎatl.Ａ cad.Ｓci.（ＵＳＡ）８５：７０７９〜７０８３を参照）またはＨ−ホスホネー ト（たとえば、フレーラー（Ｆroehler）（１９８６）Ｔetrahedron Ｌett.２７ ：５５７５〜５５７８を参照）化学などの当該技術分野でよく知られた方法を用 いて行うことができる。バーゴット（Ｂergot）らによって記載された合成法（ Ｊ.Ｃhromatog.（１９９２）５５９：３５〜４２）も用いることができる。 治療組成物の形態の本発明の合成アンチセンスオリゴヌクレオチドは、血管新 生に付随する疾患、異常および状態、たとえば、これらに限られるものではない が、網膜血管新生、腫瘍増殖および創傷治癒を治療するのに有用である。 本発明の合成オリゴヌクレオチドは、生理学的および／または薬理学的に許容 しうる担体とともに用いたときに医薬組成物の一部として用いることができる。 担体の特性は投与経路に依存するであろう。かかる組成物は、合成オリゴヌクレ オチドおよび担体に加えて、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定化剤、可溶化剤 、および当該技術分野でよく知られた他の物質を含んでいてよい。本発明の医薬 組成物はまた、ＶＥＧＦ発現の抑制を促進し、または血管新生を低減させるであ ろう他の活性因子および／または薬剤をも含んでいてよい。たとえば、それぞれ ＶＥＧＦ ｍＲＮＡの異なる領域に向けられた合成オリゴヌクレオチドの組み合 わせを本発明の医薬組成物中に用いることができる。本発明の医薬組成物はさら に、アジドチミジン、ジデオキシシチジン、ジデオキシイノシンなどのヌクレオ チドアナログを含んでいてよい。かかる付加的な因子および／または薬剤は、本 発明の合成オリゴヌクレオチドとともに相乗作用が得られるように、または本発 明の合成オリゴヌクレオチドによって引き起こされる副作用を最小限に抑えるた めに医薬組成物中に配合する。逆に、特定の抗ＶＥＧＦまたは抗血管新生因子お よび／または薬剤の副作用を最小限に抑えるために、これら抗ＶＥＧＦまたは抗 血管新生因子および／または薬剤の組成物中に本発明の合成オリゴヌクレオチド を配合することができる。 本発明の医薬組成物は、他の薬理学的に許容しうる担体に加えて本発明の合成 オリゴヌクレオチドを脂質などの両親媒性薬剤とともに配合したリポソームの形 態であってよく、該脂質などの両親媒性薬剤は水溶液中にミセル、不溶性の単層 、液晶、またはラメラ層として凝集形態で存在する。リポソーム組成物のために 適した脂質としては、これらに限られるものではないが、モノグリセリド、ジグ リセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸などが挙 げられる。一つの特に有用な脂質担体はリポフェクチンである。かかるリポソー ム組成物の調製は、たとえば、米国特許第４,２３５,８７１号、米国特許第４, ５０１,７２８号、米国特許第４,８３７,０２８号、および米国特許第４,７３７ , ３２３号に開示されているように、当業者の範囲内である。本発明の医薬組成物 はまた、オリゴヌクレオチドの細胞中への送達を促進するシクロデキストリンな どの化合物（ザオ（Ｚhao）ら、印刷中）、または遅放出ポリマーをさらに含ん でいてよい。 本明細書において「治療学的有効量」とは、意味のある患者の利益、すなわち 血管新生を特徴とする慢性状態の治癒または血管新生それ自体の低減またはかか る状態の治癒速度の上昇、を示すに充分な医薬組成物または方法の各活性成分の 合計量を意味する。単独で投与した個々の活性成分についていう場合は、この語 は該成分のみをさす。組み合わせたものについていう場合は、この語は、活性成 分を組み合わせて、順番に、または一度に投与したかにかかわらず、治療学的効 果を示す活性成分の合計量をいう。 本発明の治療または使用法を行うに際しては、１またはそれ以上の本発明の合 成オリゴヌクレオチドの治療学的有効量を、血管新生に関連する疾患または異常 を患う患者、または血管新生している組織に投与する。本発明の合成オリゴヌク レオチドは、本発明の方法に従い、単独か、または他の公知の血管新生療法剤と 組み合わせて投与することができる。１またはそれ以上の他の療法剤とともに投 与する場合には、本発明の合成オリゴヌクレオチドは他の治療剤と同時かまたは 順番に投与することができる。順番に投与する場合には、担当医師は他の治療剤 と組み合わせて本発明の合成オリゴヌクレオチドを投与する適当な順番を決定す るであろう。 本発明の医薬組成物中に用いたまたは本発明の方法を行うための本発明の合成 オリゴヌクレオチドの投与は、眼内、経口摂取、吸入、または経皮、皮下、筋肉 内、もしくは静脈内注射などの種々の通常の経路で行うことができる。 本発明の合成オリゴヌクレオチドの治療学的有効量を経口投与する場合には、 合成オリゴヌクレオチドは、錠剤、カプセル剤、散剤、液剤またはエリキシル剤 の形態であろう。錠剤の形態で投与する場合には、本発明の医薬組成物はさらに ゼラチンなどの固形担体やアジュバントを含有していてよい。錠剤、カプセル剤 および散剤は、約５〜９５％の合成オリゴヌクレオチドを含み、好ましくは約２ ５〜９０％の合成オリゴヌクレオチドを含む。液体の形態で投与する場合には、 水、石油エーテル、動物または植物由来の油、たとえばピーナッツ油、鉱油、ダ イズ油、ゴマ油、または合成油を加えることができる。液体形態の医薬組成物は さらに、生理食塩水、デキストロースその他の糖溶液、またはグリコール、たと えばエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール を含んでいてよい。液体形態で投与する場合には、医薬組成物は約０.５〜９０ 重量％の合成オリゴヌクレオチド、好ましくは約１〜５０重量％の合成オリゴヌ クレオチドを含む。 本発明の合成オリゴヌクレオチドの治療学的有効量を静脈内、皮下、筋肉内、 眼内、または腹腔内注射により投与する場合には、合成オリゴヌクレオチドは発 熱物質不含の非経口的に許容しうる水溶液の形態にあるであろう。ｐＨ、等張性 、安定性などに妥当な注意を払ったそのような非経口的に許容しうる溶液の調製 は当該技術の範囲内である。静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、または眼内注射の ための好ましい組成物は、合成オリゴヌクレオチドに加えて等張ビヒクル、たと えば塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、デキストロース注射液、デキスト ロースおよび塩化ナトリウム注射液、乳酸リンガー注射液、または当該技術分野 で知られた他のビヒクルを含有していなければならない。本発明の医薬組成物は また、安定化剤、保存剤、緩衝液、酸化防止剤、または当業者に知られた他の添 加剤を含んでいてよい。 本発明の医薬組成物中の合成オリゴヌクレオチドの量は、処置しようとする状 態の性質および重篤度、および患者が以前に受けた処置の性質に依存するであろ う。最終的には担当医師が、個々の患者を処置するに必要な合成オリゴヌクレオ チドの量を決定するであろう。最初は担当医師は低投与量の合成オリゴヌクレオ チドを投与し、患者の応答を観察するであろう。最適の治療効果が患者で得られ るまで投与する合成オリゴヌクレオチドの投与量を大きくしていき、その時点で 投与量をそれ以上は増加させない。本発明の方法を行うのに使用する種々の医薬 組成物は、体重または器官１ｋｇ当たり約１０μｇ〜約２０ｍｇの合成オリゴヌ クレオチドを含有していなければならない。 本発明の医薬組成物を用いた静脈内療法の期間は、処置しようとする疾患の重 篤度および各個々の患者の条件および潜在的な特異体質的応答に応じて変わるで あろう。最終的には担当医師が、本発明の医薬組成物を用いて静脈内療法を行う 適当な期間を決定するであろう。 幾つかの疾患は急性の処置に付されるが、他の疾患は長期にわたる療法を必要 とする。増殖網膜症は、ＲＯＰ、糖尿病網膜症の幾つかの症例、および血管新生 緑内障において認められるように数日のうちに閾値に達しうる。未熟児はまた、 妊娠３５週頃、誕生後数週間は血管新生のリスクにあり、網膜が血管形成する（ vascularized）までしばらくの間はリスクにあり続けるであろう。糖尿病網膜症 は急性ではありうるが、増殖相ではかなり長期にわたって燻り続けることもある 。糖尿病網膜症は、血管増殖シグナルが血管新生または網膜の破壊とともに減少 するにつれて最終的に静止される。 網膜疾患への急性および長期間の両介入は、目的とするに足る。ＶＥＧＦに対 するオリゴヌクレオチドの硝子体内注射は、急性の状況における網膜血管新生の 有効な抑制手段である。しかしながら、何年にもわたる長期間の治療の場合には 、食塩水、遅放出ポリマーまたはリポソームなどの担体を用いた全身送達（腹腔 内、筋肉内、皮下、静脈内）も考慮すべきである。 慢性血管新生疾患の幾つかの症例においては、オリゴヌクレオチドの全身投与 が好ましい。該疾患プロセスは異常で漏れやすい血管が関与するので、血液脳関 門の通過は問題とはならない。それゆえ、全身送達が有効であることがわかる。 注射の頻度は、疾患プロセスおよびオリゴヌクレオチドの生物学的半減期に応じ て連続的な注入から１カ月に１回である。 ＶＥＧＦに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、インビボで血管新生 を抑制することに加えて、血管新生が関与するプロセスにおける該サイトカイン の役割を決定するうえでも有用である。たとえば、この技術は、血管の形成およ び透過性を模倣するインビトロ系において、および下記マウスモデルなどの血管 新生のインビボ系モデルにおいて有用である。 酸素誘発による（oxygen-induced）網膜血管新生のマウスモデルは確立されて おり、この血管新生は処置動物の１００％で起こり、しかも定量的である（スミ スら（１９９４）Ｉnvest.Ｏphthalmol.Ｖis.Ｓci.３５：１０１〜１１１）。こ のモデルを用い、ＶＥＧＦメッセージの発現の増大と内顆粒層および神経節細胞 層（すなわち、ミュラー細胞）中での網膜血管新生の開始との間の相関関係を決 定した（ピアスら（１９９５）Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.（ＵＳＡ）（印刷中） ）。この結果を、血管新生の進展の間の種々の時点での全網膜のノーザンブロッ ティングおよびインシチュハイブリダイゼーション分析により確認した（ピアス ら、上掲）。 ＶＥＧＦが網膜血管新生において役割を果たしていることが、上記血管新生の マウスモデルを用いて示された。ＶＥＧＦに特異的なアンチセンスオリゴヌクレ オチド（ＪＧ−３（配列番号：４７）、ＪＧ−４（配列番号：４８）、およびＶ ｍ（配列番号：４６））および対応センスオリゴヌクレオチド（Ｖ２（配列番号 ：４９））を用い、３つの独立した実験を行った。これらオリゴヌクレオチドは 、マウスＶＥＧＦの既知の核酸配列（クラフィー（Ｃlaffee）ら（１９９２）Ｊ .Ｂiol.Ｃhem.２６７：１６３１７〜１６３２２）を用いて設計した。Ｖｍオリ ゴヌクレオチドの配列（配列番号：４６）は、翻訳ＴＧＡ停止部位（ＴＧＡ）の 周辺の配列をターゲティングするものである。ＪＧ−４の配列（配列番号：４８ ）は、マウスＶＥＧＦ分子の翻訳開始部位のＡＴＧを含み、該ＡＴＧの５'側の 配列をターゲティングするものである。ＪＧ−３の配列（配列番号：４７）は、 ５'非翻訳領域をターゲティングするものであり、Ｖ２センス配列は翻訳開始部 位（ＡＴＧ）の周辺の配列をターゲティングするものである。 これら実験結果の集積を図２に示す。これら結果は、Ｖｍ（配列番号：４６） アンチセンスオリゴヌクレオチドが未処理の対照およびセンスオリゴヌクレオチ ドＶ２（配列番号：４９）対照の両者と比べたときに網膜血管新生を有意に減少 させることを示している。ＪＧ−３（配列番号：４７）およびＪＧ−４（配列番 号：４７）は未処理の眼と比べたときに有意の活性を示す。センス対照オリゴヌ クレオチドＶ２（配列番号：４９）は未処理の眼と比べたときに有意の活性を示 さない。 上記試験において、マウスＪＧ−３に対応するヒトＶＥＧＦアンチセンスオリ ゴヌクレオチドはＨ−１（配列番号：１）であり、５'非翻訳領域をターゲティ ングするものであり、マウスＪＧ−４に対応するヒトＶＥＧＦアンチセンスオリ ゴヌクレオチドはＨ−１７（配列番号：３０）であり、ヒトＶＥＧＦ分子の翻訳 開始部位のＡＴＧを含み該ＡＴＧの５'側の配列をターゲティングするものであ り、マウスＶｍに対応するヒトＶＥＧＦアンチセンスオリゴヌクレオチドはＶＨ （配列番号：４６）であり、ヒトＶＥＧＦ分子の翻訳停止部位（ＴＧＡ）の周辺 の配列をターゲティングするものである。これら本発明のアンチセンスオリゴヌ クレオチドは、マウスのアンチセンスオリゴヌクレオチドがマウス細胞において ＶＥＧＦの発現を抑制するのと全く同様の仕方でヒト細胞においてＶＥＧＦの発 現を抑制することが期待される。 他のマウス配列に対応するヒトＶＥＧＦアンチセンス配列もまたわかっている 。たとえば、ヒトオリゴヌクレオチドＨ−６（配列番号：１２）はマウス配列Ｊ Ｇ−６（配列番号：５２）とＪＧ−７（配列番号：５３）とに跨がる領域に対応 し、ヒトオリゴヌクレオチドＨ−２（配列番号：５）はマウス配列ＪＧ−５（配 列番号：５１）と同じ領域にある。これら配列は、ＶＥＧＦ発現の抑制、それゆ え血管新生の制御に対して同様の効果を有すると思われる。 ＶＥＧＦ発現および血管新生に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果 をモニターする幾つかの方法が存在する。一つの方法は、細胞によって発現され たヒトＶＥＧＦタンパク質を定量するために発色させる捕捉ＥＬＩＳＡである。 このアッセイを用い、翻訳開始部位の直ぐ３'側の配列をターゲティングするア ンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドＨ−３（配列番号：６）が、 図４に示すようにランダム（Ｒ）およびセンス（Ｈ−１６、配列番号：２９）対 照に比べて配列特異的な仕方でＶＥＧＦ発現の低酸素誘発を抑制しうることが決 定された。この抑制は再現性があり、また、このインビトロ系ではリポフェクチ ン（脂質担体）の存在下でのアンチセンスオリゴヌクレオチドＨ−３（配列番号 ：６）のみがＶＥＧＦタンパク質の発現を抑制する結果となったが、リポフェク タミン（他の脂質担体）の存在下では抑制されなかったので、脂質担体特異的で アンチセンス特異的であると思われる。 ＲＮＡレベルではノーザンブロッティング（サンブルック（Ｓambrook）ら（ １９８９）Ｍolecular Ｃloning：ａ Ｌaboratory Ｍanual、コールドスプリン グハーバーラボラトリープレス、ニューヨーク、Vol.１、７.３８頁；アーセラ ナ −パンリリオ（Ａrcellana−Ｐanlilio）（１９９３）Ｍeth.Ｅnz.２２５：３０ ３〜３２８）を行って本発明のオリゴヌクレオチドがＶＥＧＦ ｍＲＮＡの発現 を抑制する程度を決定することができる。たとえば、図５に示すように、ノーザ ンブロッティング分析を示すヒストグラムは、アンチセンスオリゴヌクレオチド Ｈ−３（配列番号：６）で処理した培養ヒト細胞でのＶＥＧＦ ＲＮＡレベルの 減少を示しており、一方、センス対照Ｈ−１６（配列番号：２９）で処理した試 料ではＶＥＧＦ ＲＮＡレベルに最小の変化しか認められない。 さらに、幾つかの方法により生物活性を測定することができ、たとえば、血管 の透過性を測定するマイルズの血管透過性アッセイ（マイルズ（Ｍiles）および マイルズ（１９５２）Ｊ.Ｐhysiol.（ロンドン）１１８：２２８）、細胞の増殖 を測定する内皮細胞マイトジェン活性、および内皮細胞上の受容体へのＶＥＧＦ 結合に応答して放出されるカルシウムを測定する内皮細胞における細胞内カルシ ウム放出（たとえば、ブロック（Ｂrock）およびカパソ（Ｃapasso）（１９８８ ）Ｊ.Ｃell.Ｐhysiol.１３６：５４を参照）が挙げられる。 下記実施例は本発明を製造および実施する好ましい態様を示すものであるが、 別の方法を利用して同様の結果を得ることができるので本発明の範囲を限定する ことを意図するものではない。 実施例１ ＶＥＧＦ特異的オリゴヌクレオチドの調製 ヒトＶＥＧＦ ｃＤＮＡをインビトロ真核細胞転写キット（ストラタジーン、 ラジョラ、カリフォルニア）を用いてインビトロで転写する。このＲＮＡを、サ ンブルックら（１９８９）Ｍolecular Ｃloning：ａ Ｌaboratory Ｍanual、コ ールドスプリングハーバーラボラトリープレス、ニューヨーク、Ｖol.１、５.７ １頁に記載されているように、Ｔ−４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて³²Ｐで 標識する。標識したＲＮＡをランダマー２０ｍｅｒライブラリーおよびＲＮＡ− ＤＮＡ二本鎖を開裂する酵素であるＲＮアーゼＨ（ベーリンガー・マンハイム、 インディアナポリス、インディアナ）の存在下でインキュベートする。開裂パタ ーンを６％ポリアクリルアミド尿素ゲル上で分析する。ヒトＶＥＧＦ配列ラダー を用い、開裂断片の特定の位置を決定する（シークエナーゼキット、ユナイテッ ド・ステイツ・バイオケミカル（Ｕnited Ｓtates Ｂiochemical）、クリーブラ ンド、オハイオ）。 実施例２ 網膜血管新生の動物モデル Ａ．オリゴヌクレオチドの調製 下記オリゴヌクレオチド：ＪＧ−３（配列番号：４７）、ＪＧ−４（配列番号 ：４８）、Ｖｍ（配列番号：４６）、およびＶ２（配列番号：４９）の合成を、 ホスホルアミダイト法（たとえば、ウールマンら（Ｃhem.Ｒev.（１９９０）９ ０：５３４〜５８３）を参照）を用い、ファルマシアジーンアセンブラー系列の 合成機で行った。組み立ておよび脱保護の後、オリゴヌクレオチドを２回エタノ ール沈殿し、乾燥させ、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に所望の濃度で懸濁した 。 これらオリゴヌクレオチドの純度をキャピラリーゲル電気泳動およびイオン交 換ＨＰＬＣにより試験した。オリゴヌクレオチド調製物中の内毒素レベルを発光 変形細胞アッセイ（バング（Ｂang）（１９５３）Ｂiol.Ｂull.（ウッズホール 、マサチューセッツ）１０５：３６１〜３６２）を用いて決定した。 Ｂ．動物モデルの調製 生後７日のマウス（Ｐ７、Ｃ５７ｂ１／６Ｊ、チルドレンズ・ホスピタル・ブ リーディング・ファシリティーズ（Ｃhildren's Ｈospital Ｂreeding Ｆacilit ies）、ボストン、マサチューセッツ）を、バード（Ｂird）３−Ｍ酸素ブレンダ ー（流速：１．５リットル／分；バード、パームスプリングス、カリフォルニア ）に連結した密封インキュベーター中で５日間の酸素過剰状態（７５±２％）酸 素に暴露した。酸素濃度を酸素アナライザー（ベックマン（Ｂeckman）、モデル Ｄ２、アービン、カリフォルニア）によりモニターした。５日後（Ｐ１２）マウ スを室内の空気に戻した。室内の空気に戻してから５日後（Ｐ１７）に最大網膜 血管新生を観察した。Ｐ１２後、網膜血管新生のレベルは、まさに寛解を開始す るところであった。 Ｃ．処置 マウスを酸素から取り出した後、ハミルトン注射器および３３ゲージの注射針 （ハミルトン・カンパニー（Ｈamilton Ｃompany）、レノ、ネバダ）を用いてア ンチセンスオリゴヌクレオチドを硝子体中に注射した。動物を処置のためにアベ ルチン腹腔内投与により麻酔した。マウスにＰ１２にてアンチセンスオリゴヌク レオチド（またはセンスもしくはナンセンス（non-sense）対照）を１回注射し て最終濃度約３０μＭとした。動物をＰ１７にてトリブロモエタノールの腹腔内 投与（０.１ｍｌ／ｇ体重）および頸部脱臼により屠殺した。 Ｄ．顕微鏡観察 眼を摘出し、４％パラホルムアルデヒド中に固定し、パラフィン中に埋設した 。全眼の連続切片を、角膜を通り、視神経に平行に矢尻状に切断した。これら切 片をヘマトキシリンおよび過ヨウ素酸−シッフ（ＰＡＳ）染色で染色した。処置 眼における血管新生の程度を、内境界膜を過ぎて硝子体中に延びている内皮細胞 核をカウントすることにより決定した。新たな血管からの核および血管プロフィ ールは網膜中の他の構造から識別でき、光学顕微鏡を用いて断面中でカウントし た。別の眼の切片も作製し、ＶＥＧＦプローブへのインシチュハイブリダイゼー ションにより調べた。 フルオレセイン−デキストランを用いて網膜血管網を調べるため、マウスを４ ％パラホルムアルデヒド中の高分子量フルオレセイン−デキストラン（シグマ・ ケミカル・カンパニー、セントルイス、ミズーリ）の５０ｍｇ／ｍｌ溶液で灌流 した。眼を摘出し、パラホルムアルデヒド中に固定し、グリセロール−ゼラチン で平板スライドを作製した（flat-mounted）。この平板スライドをオリンパスＢ Ｘ６０蛍光顕微鏡（オリンパス・アメリカ（Ｏlympus Ａmerica Ｃorp.）、ベリ ンガム、マサチューセッツ）を用いた蛍光顕微鏡観察により観察および写真撮影 した。 実施例３ 未熟児網膜症 Ａ．オリゴヌクレオチドの調製 ＶＥＧＦ特異的オリゴヌクレオチドを上記実施例２Ａと同様にして合成する。 滅菌および内毒素不含のオリゴヌクレオチドを、眼の眼房水または硝子体と同じ ｐＨおよび電解質濃度となるように平衡塩溶液（Ｂalanced Ｓalt Ｓolution） （ＢＳＳ、アルコン、フォートワース、テキサス）中に希釈する。エマルフォア （Ｅmalphor）ＥＣ６２０（２.５％、ＧＡＦ Ｃorp.）（バーセル（Ｂursell） ら（１９９３）Ｊ.Ｃlin.Ｉnvest.９２：２８７２〜２８７６；石油製品）を、 粘度を変え、送達特性を促進するために加える。０.１μＭ〜１００μＭの範囲 の硝子体内濃度を達成する投与量を、網膜／眼血管新生の重篤度に応じて投与す る。送達容量は眼の容量に応じて１μｌから１ｍｌの間である。 Ｂ．ＲＯＰ患者のプロフィール 処置した患者は、出生時に体重が１,０００ｇ未満の受胎後３４週、カフカス 女児の未熟児であり、人工呼吸器に依存している。この患者は両眼性３＋期の疾 患を有し、各眼に１１クロックアワーの（１１ clock hours）血管新生を有する 。片方の眼に出血がみられ、両眼とも国際分類（すなわち、各眼とも＞５０％の 確率で網膜剥離に進行する）によれば「閾値」に達している。両眼において網膜 外線維血管（fibrovascular）増殖が認められる。 Ｃ．処置 挿管した患者にフルオランで麻酔する。顔面および眼をベタジン洗浄（scrub ）で準備し、通常の滅菌手法で拭く。滅菌薬剤およびビヒクルを、滅菌注射器上 の３３ゲージの注射針を用い、後部縁（posterior limbus）（毛様体偏平部）に て完全厚の強膜を通して硝子体中へ注射する。漏出がみられない限り縫合する必 要はない。傷口が完全に縫合されるまで、ゲンタマイシンまたはエリスロマイシ ン軟膏を含有する抗生物質点眼を眼瞼裂中の眼球表面に１日数回適用する。注射 の頻度は、疾患プロセスの重篤度、眼内炎症の程度、ビヒクルの特性（すなわち 、低放出特性）、血管新生の抑制の程度および注射に対する眼の耐性に依存して 、隔日から６カ月に１回またはそれ以下の範囲である。血管新生疾患および注射 により起こる可能性のある網膜剥離について短期および長期にわたる追跡健康調 査が必要である。 Ｄ．進展のモニター 拡張後の眼を、炎症、感染、および血管新生の消散の兆候について直像および 倒像検眼鏡で網膜および眼底を観察することによりモニターする。前眼部疾患の 幾つかの症例では細隙灯検査を用いる。処置の陽性応答としては、一層少ない血 管新生ふさ状分岐（neovascular tufts）、進行における一層少ないクロックア ワー（fewer clock hours of involvement）および一層少ない大血管の蛇行が挙 げられる。モニターは、未熟児が増殖ＲＯＰのために網膜剥離の危険にさらされ ている場合のような症例では毎日くらいの頻繁さで行うことができる。モニター の頻度は、血管新生の消散につれて減少するであろう。 実施例４ 糖尿病網膜症 Ａ．オリゴヌクレオチドの調製 ＶＥＧＦ特異的オリゴヌクレオチドを上記実施例２Ａと同様にして合成し、上 記上記３Ａと同様にして投与用に調製する。０.１〜１００μＭの範囲の硝子体 内濃度を達成する投与量を、網膜／眼血管新生の重篤度に応じて投与する。送達 容量は、眼の容量、および糖尿病性眼疾患のための硝子体切除術を行う間のよう に硝子体を前以て切除したか否かに応じて１μｌから１ｍｌの間である。 Ｂ．糖尿病患者のプロフィール 処置した患者は、若年期に発症した糖尿病を２５年間患う３０歳のアフリカ− アメリカ人男性である。この患者は両眼性の増殖網膜症を有し、網膜下出血、綿 状白斑および浸出物を呈している。フルオレセイン血管造影をしたところ、両眼 にはっきりと定められた血管新生の領域が認められ、毛細血管の脱落した領域も 存在した。 Ｃ．処置 患者を、適当なビヒクル（ＢＳＳ）エマンフォア）中に０.１〜１００μＭの 濃度範囲で再懸濁したオリゴヌクレオチドの眼内注射で１週間毎に処置する。こ の処置に加えて、疾患プロセスおよびオリゴヌクレオチドの生物学的半減期に依 存して１日に２〜５回から１カ月に１回の範囲のオリゴヌクレオチドの全身送達 （すなわち、静脈内、皮下、または筋肉内）を行ってよい。 Ｄ．進展のモニター 患者の眼を上記実施例２Ｄと同様にしてモニターする。拡張後の眼を血管新生 の寛解について直像および倒像の両検眼鏡で網膜および眼底を観察することによ りモニターする。前眼部疾患の症例では細隙灯検査を用いる。必要に応じ、血管 新生の抑制の程度および注射に対する眼の耐性に基づき繰り返し注射を行う。血 管新生疾患および注射により起こる可能性のある網膜剥離について短期および長 期にわたる追跡健康調査を行う。 実施例５ 加齢黄斑変性症 Ａ．オリゴヌクレオチドの調製 ＶＥＧＦ特異的オリゴヌクレオチドを上記実施例２Ａと同様にして合成し、上 記実施例３Ａと同様にして投与用に調製する。１μｌ〜１ｍｌの範囲の硝子体内 濃度を達成する投与量を、網膜／眼血管新生の重篤度に応じて投与する。送達容 量は、眼の容量および硝子体を前以て切除したか否かに応じて１μｌから１ｍｌ の間である。 Ｂ．ＡＲＭＤ患者のプロフィール 患者は、浸出性の加齢黄斑変性症を患う５０歳のカフカス男性である。この患 者はフルオレセイン血管造影から明らかな脈絡膜の血管新生を有する。疾患は両 眼性であり、患者の視力は各眼で２０／６０から２０／１００へ低下している。 Ｃ．処置 患者を、適当なビヒクル（ＢＳＳ、エマンフォア）中に０.１〜１００μＭの 濃度範囲で再懸濁したオリゴヌクレオチドの眼内注射で１週間毎に処置する。こ の処置に加えて、１日に２〜５回から１カ月に１回の範囲のオリゴヌクレオチド の全身送達（すなわち、静脈内、皮下、または筋肉内）を行ってよい。 Ｄ．進展のモニター 拡張後の眼を血管新生の寛解について直像および倒像の両検眼鏡で網膜および 眼底を観察することによりモニターする。血管新生の寛解のチェックはフルオレ セイン血管造影を用いて行う。前眼部疾患の症例では細隙灯検査を用いる。必要 に応じ、血管新生の抑制の程度および注射に対する眼の耐性に基づき繰り返し注 射を行う。血管新生疾患および注射により起こる可能性のある網膜剥離について 短期および長期にわたる追跡健康調査を行う。 実施例６ ヒト細胞の培養 Ｕ３７３ヒト神経芽腫細胞を、ペニシリン／ストレプトマイシン（１００ＩＵ ／ＭＩ／１００ｍｃｇ／ｍｌ、メディアテック（Ｍediatech）、ワシントン、Ｄ Ｃ）を補足したグルコース（４５００ｍｇ／ｍｌ）およびグルタミン酸（２ｍＭ ）（メディアテック、ワシントン、ＤＣ）を含有するダルベッコ変性アール（Ｄ ulbecco's modified Ｅarls）（ＤＭＥ）培地中で培養した。細胞を３７℃で１ ０％ＣＯ₂下で培養した。細胞を９６ウエル組織培養皿（コスター（ＣostarＣor p.）、ケンブリッジ、マサチューセッツ）中にプレーティングし、上記のまま保 持した。細胞を嫌気チャンバ（ＢＢＬ、ガス・パック（Ｇas Ｐak）、コッキー スビル、メリーランド）を用いて無酸素条件下に１８〜２０時間置いた。 実施例７ ノーザンブロッティング 本発明のオリゴヌクレオチドの存在下でＶＥＧＦ発現の抑制が細胞中で起こる レベルを決定するため、ノーザンブロッティングを行った。上記実施例６に記載 のようにして培養したヒトＵ３７３細胞を１００ｍｍ組織培養皿中にプレーティ ングし、それぞれ０.０５μＭ、０.５μＭおよび２.０μＭのオリゴヌクレオチ ドＨ−３（配列番号：６）（アンチセンスオリゴヌクレオチド）およびＨ−１６ （配列番号：２９）（センスオリゴヌクレオチド）とともに脂質担体としての５ μｇ／ｍｌのリポフェクチン（ギブコ−ＢＲＬ、ゲイサーズバーク、メリーラン ド）の存在下で１２時間処理した。これら細胞を１２〜１５時間後に新たな培地 ＋オリゴヌクレオチド（リポフェクチン不含）を用いて再培養し、５〜７時間回 復させた。細胞を低酸素状態に１８〜２０時間置き、チョムスジンスキー（Ｃho mczynski）およびサッチ（Ｓacchi）により記載された（Ａnal.Ｂiochem.（１９ ８７）１６２：１５６〜１５９）単一工程の酸グアニジニウムチオシアネート− フェノール−クロロホルム抽出法により全ＲＮＡを単離した。ノーザンブロッテ ィングを、サンブルックらの方法（Ｍolecular Ｃloning：ａ Ｌaboratory Ｍan ual、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、ニューヨーク（１ ９８９）Ｖｏl.１、７.３８頁）またはアーセラナ−パンリリオの方法（Ｍeth. Ｅnz.（１９９３）２２５：３０３〜３２８）に従って行った。すべてのＲＮＡ シグナルをホスホルイメージャー（Ｐhosphorimager）（バイオラド（ＢioＲad ）、ヘルキュールズ、カリフォルニア）で定量し、３６Ｂ４ ｃＤＮＡプローブ （ラボルダ（Ｌaborda）（１９９１）Ｎucleic Ａcids Ｒes.１９：３９９８） を用いて正規化した。 実施例８ ＥＬＩＳＡ ＶＥＧＦタンパク質試験 上記実施例６に記載したＵ３７３神経芽腫細胞を９６ウエル組織培養皿中にプ レーティングし、５μｇ／ｍｌのリポフェクチンの存在下、ヒトＶＥＧＦに対す る種々の濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドで一夜処理した。これら細胞を １２〜１５時間後に新たな培地＋オリゴヌクレオチド（リポフェクチン不含）を 用いて再培養し、５〜７時間回復させた。細胞を嫌気チャンバ（ガス・パック、 コッキースビル、メリーランド）を用いて低酸素条件下に１８〜２０時間置いた 。この培地を上記抗原捕捉ＥＬＩＳＡアッセイを用いて分析した（処理後約３６ 時間）。使用したヒトＶＥＧＦオリゴヌクレオチドは、Ｈ−３（配列番号：６） （アンチセンス、コーディング）、Ｈ−１６（配列番号：２９）（開始部位／コ ーディング、センス対照）およびランダム対照（Ｒ）であった。 実施例５に記載した細胞からの培養液を、ＶＥＧＦタンパク質について以下の ようにして分析した。９６−ウエルプレート（マクシゾーブＥＬＩＳＡヌンクＡ ／Ｓ、カンストラップ、デンマーク）を４℃にて１００μｌ／ウエルの捕捉抗体 、ヒトＶＥＧＦに対するモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓyst ems）、ミネアポリス、ミネソタ、１×ＰＢＳ中に２.５μｇ／ｍｌ）で一夜処理 した。プレートウォッシャー（ダイナテック、ガーンセイチャネルアイランズ） を用いてウエルを１×ＰＢＳ／０.０５％ツイーン−２０（ユナイテッド・ステ イツ・バイオケミカル、クリーブランド、オハイオ）で３回洗浄した。ウエル中 の非特異的な結合部位は、２％通常ヒト血清（１００μｌ）を加え、プレートを ３７℃で２時間インキュベートすることによりブロックした。このブロック溶液 を除き、 ヒトＶＥＧＦを含有する２００μｌのならし培地を各ウエルに加え、３７℃で２ 〜３時間インキュベートした。プレートを上記のようにして洗浄した。１００μ ｌの一次抗体（６１８／６１９、通常ヒト血清中に２μｇ／ｍｌ）を各ウエルに 加え、３７℃で１〜２時間インキュベートした。二次抗体はアフィニティー精製 したウサギ抗ヒトＶＥＧＦポリクローナル抗体であった。プレートを上記のよう にして洗浄した。１００μｌの検出抗体である西洋ワサビペルオキシダーゼ標識 ヤギ抗マウスＩｇＧモノクローナル抗体（１：１０,０００、ベクター・ラボラ トリーズ（Ｖector Ｌaboratories）、バーリンゲーム、カリフォルニア）を各 ウエルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを上記のようにし て洗浄した。ＴＭＢマイクロウエルペルオキシダーゼ発色システム（キルケガー ル・アンド・ペリー（Ｋirkegaard and Ｐerry）、ゲイサーズバーク、メリーラ ンド）を用いてウエルを発色させ、セレス（Ｃeres）９００プレートリーダー（ バイオ−テック・インスツルメンツ（Ｂio−Ｔek Ｉnstruments,Ｉnc.）、ウイ ノースキー、バーモント）を用いて４５０ｎｍで定量した。このアッセイの線形 範囲は２ｎｇ〜０.０１ｎｇヒトＶＥＧＦである。代表的な結果を図３に示す。 実施例９ 生物活性アッセイ 生物活性はマイルズの血管透過性アッセイ（マイルズおよびマイルズ（１９５ ２）Ｊ.Ｐhysiol.（ロンドン）１１８：２２８）により決定することができる。 簡単に説明すると、ハートレイモルモット（８００ｇ）を剃り、除毛し、１００ ｍｌ当たり０.５ｇのエバンスブルー染料を含有する通常食塩水（１.０ｍｌ）を 静脈内注射する。未知の量のＶＥＧＦを含有する血清不含培地の皮下注射（２５ ０μｌ）を行う。陽性（精製ＶＥＧＦ）および陰性対照（通常食塩水）も実験中 に含まれる。注射２０分後、動物を屠殺し、試験および対照部位を切り出し、エ バンスブルー染料の管外遊出を定量する。このアッセイの検出限界は５００ｐＭ である。 内皮細胞のマイトジェン活性も生物活性を示し得る。この方法ではヒト臍静脈 内皮（ＨＵＶＥＣ）を、バイオコート内皮細胞増殖環境（コラボラティブ・バイ オメディカル・プロダクツ（Ｃollaborative Ｂiomedical Ｐroducts）、ベッド フォード、マサチューセッツ）を用いて増殖および維持させる。ついで、１×１ ０⁴細胞を、１.４ｍｌ Ｅ−ＳＴＩＭ培地（コラボラティブ・バイオメディカル ・プロダクツ、ベッドフォード、マサチューセッツ）プラス５％熱不活化ウシ胎 仔血清中、３５ｍＭ組織培養皿上で２つずつプレーティングする。細胞付着後（ 約４時間）、２つの皿の細胞をトリプシン処理し、カウントし、開始細胞数とし て用いる。ついで、未知の量のＶＥＧＦを含有する試験試料を２つずつ、残りの 皿に０日目および２日目に加える。精製ＶＥＧＦ（陽性）およびＰＢＳ（陰性） を含有する対照も用いる。４日目に皿の細胞をトリプシン処理し、カウントし、 開始細胞数と比較する。このアッセイの検出限界は１０ｐＭである。 細胞内カルシウム放出アッセイも用いて生物活性をモニターする（たとえば、 ブロックおよびカパソ、Ｊ.Ｃell.Ｐhysiol.１３６：５４）。ヒト臍静脈内皮細 胞（ＨＵＶＥＣ）をＥＧＭ−ＵＶ培地中で維持する。細胞をＥＤＴＡおよびコラ ゲナーゼによりプレートから除く。カルシウム感受性の染料であるＦura−２（ モレキュラー・プローブズ（Ｍolecular Ｐrobes）、ユージーン、オレゴン）を 用いて細胞内カルシウムの濃度変化をモニターする。簡単に説明すると、未知濃 度のＶＥＧＦを含有する培地を、Ｆura−２を前以て負荷した懸濁ＨＵＶＥＣの アリコートに加える。細胞内カルシウム放出の変化を示す蛍光変化をヒタチ２０ ００Ｆ蛍光計を用いて測定する。陽性（ヒスタミン、トロンビン）および陰性（ ＥＧＴＡ）対照も分析する。この方法は極めて感度が高く、検出限界は０.２ｐ Ｍである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ， ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ロビンソン，グレゴリー・エス アメリカ合衆国01720マサチューセッツ州 アクトン、スクール・ストリート 194 番 (72)発明者 スミス，ロイス・エレイン・ホッジソン アメリカ合衆国02165マサチューセッツ州 ウエスト・ニュートン、バレンタイン・ ストリート 167番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．組織中での血管新生を低減させる方法であって、該組織に、血管内皮増殖 因子の発現を抑制するのに有効な血管内皮増殖因子の核酸に特異的な合成オリゴ ヌクレオチドを所定量投与することを含む方法。 ２．該オリゴヌクレオチドが修飾されている、請求項１に記載の方法。 ３．該修飾されたオリゴヌクレオチドが、アルキルホスホネート、ホスホロチ オエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミ デート、リン酸エステル、カルバメート、アセトアミデート、カルボキシメチル エステル、カーボネート、およびリン酸トリエステルよりなる群から選ばれた少 なくとも一つのインターヌクレオチド結合を含む、請求項２に記載の方法。 ４．該修飾されたオリゴヌクレオチドが、少なくとも一つのホスホロチオエー トインターヌクレオチド結合を含む、請求項３に記載の方法。 ５．該オリゴヌクレオチドが、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド 、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。 ６．該オリゴヌクレオチドが、少なくとも一つの２'−Ｏ−アルキル化リボヌ クレオチドを含む、請求項５に記載の方法。 ７．該オリゴヌクレオチドが、約１４〜約２８ヌクレオチドの長さである、請 求項１に記載の方法。 ８．該オリゴヌクレオチドが、約１５〜約２５ヌクレオチドの長さである、請 求項７に記載の方法。 ９．血管内皮増殖因子の発現を特異的に抑制する合成オリゴヌクレオチドおよ び生理学的に許容しうる担体を含む、血管新生を抑制しうる医薬組成物。 １０．血管内皮増殖因子の核酸に特異的で血管内皮増殖因子の網膜中での発現 を抑制するのに有効なオリゴヌクレオチドの治療学的量を、未熟児網膜症を患う 患者に投与する工程を含む、未熟児網膜症の治療方法。 １１．該オリゴヌクレオチドを局所または全身投与する、請求項１０に記載の 方法。 １２．血管内皮増殖因子の核酸に特異的で血管内皮増殖因子の網膜中での発現 を抑制するのに有効なオリゴヌクレオチドの治療学的量を、糖尿病網膜症を患う 患者に投与する工程を含む、糖尿病網膜症の治療方法。 １３．該オリゴヌクレオチドを局所または全身投与する、請求項１２に記載の 方法。 １４．血管内皮増殖因子の核酸に特異的で血管内皮増殖因子の網膜中での発現 を抑制するのに有効なオリゴヌクレオチドの治療学的量を、加齢黄斑変性症を患 う患者に投与する工程を含む、加齢黄斑変性症の治療方法。 １５．該オリゴヌクレオチドを局所または全身投与する、請求項１４に記載の 方法。