JPH11501512A

JPH11501512A - ゲル化ポリマーによる新規の被包方法

Info

Publication number: JPH11501512A
Application number: JP8526910A
Authority: JP
Inventors: シー．エネボルド，カール
Original assignee: メタボレックス，インコーポレイティド
Priority date: 1995-03-03
Filing date: 1996-02-27
Publication date: 1999-02-09
Also published as: AU5028396A; CA2214088A1; WO1996027662A1; AU705108B2; EP0815212A1; US5738876A

Abstract

(57)【要約】本発明は、一般に、液滴発生装置を用いることなく溶液中で行われる新規なオーバーコート／被包方法に関する。本方法は、生物材料、例えば細胞、蛋白質等のような種々の材料並びに医薬品のオーバーコート又は被包に用いることができる。本発明の方法を用いて調製された組成物は、医薬製剤並びに細胞培養及び移植療法を含むいくつかの適用のための生物材料を被覆することに用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】ゲル化ポリマーによる新規の被包方法本発明は、一般に溶液中で部分的又は全体的に行うことができる新規の被包方法に関する。本方法は一般に、被覆又は被包されるべき粒子を多価イオンの溶液でおおい、次にゲル化ポリマーの溶液中に前記おおわれた粒子を懸濁することを含む。多価イオンのポリマーで溶液内への拡散は、ビーズ又は液滴発生装置を用いることなく粒子の周囲のポリマーのゲル化を引きおこす。本明細書に記載される方法を用いて被覆された粒子は、一般に、他の被包方法より均一な被包厚を有するだろう。発明の背景種々の微小被包方法及び組成物が当該技術で周知である。被包組成物及び方法は、例えばにがい薬剤の風味を隠すため、長期にわたる投与形態に製剤化するため、不適合な材料を分離するため、水分又は酸化から化学物質を保護するため、又は取扱い及び／又は処理の容易さのために材料の物理的特徴を改良するために、医薬製剤において主に用いられる。典型的な医薬被包組成物は、例えばゼラチン、ポリビニルアルコール、エチルセルロース、セルロースアセテートフタレート及びスチレン無水マレイン酸を含む。Remington's Pharmaceutical Sciences （Mack Publishing Co.，Easton PA(1990)）を参照のこと。微小被包は、移植療法による病気の治療にも適用されている。分泌及び他の生物器官の機能的欠損のための典型的医療処置は、欠陥のある器官の同定された通常の産物を天然又は合成医薬剤で置換することに集中しているが、移植療法は、その機能の細胞又は器官移植物での置換に集中している。例えば、膵臓のランゲルハンス島が機能しないインスリン依存真性糖尿病の治療は、インスリンの通常の分泌を膵臓中の前記島により置換することによって行うことができる。インスリンは、合成又は代わりの動物のインスリンの毎日の投与又は機能的なヒトもしくは動物の島の移植のいずれかによって、供給することができる。移植療法に用いるためのいくつかの微小被包方法は、被包組成物を供給するためにアルギネートポリマーを用いることに焦点が当たっている。アルギネートは、混合により散らばった、グルロネートブロックを形成するいくつかの隣接するグルロン酸残基のブロック及びマンヌロネートブロックを形成する隣接するマンヌロン酸残基のブロック、又は交互のグルロン酸及びマンヌロン酸残基の異種ブロックにおいて配列されたマンヌロン酸及びグルロン酸の直鎖ポリマーである。一般に、一価陽イオンアルギン酸塩、例えばアルギン酸ナトリウムは可溶性である。 Ca²⁺，Ba²⁺又はSr²⁺のような二価陽イオンは、グルロネートと相互作用する傾向があり、そしてグルロネートブロック内でのこれらの陽イオンの協同的結合は、安定なイオン対のアルギネートゲルの形成の原因である主要な分子内架橋を供する。アルギネート被包方法は一般に、これらの二価陽イオン溶液の存在下でアルギネートがゲル化する利点を有する。特に、これらの方法は、一価陽イオンアルギン酸塩、例えばナトリウム塩の溶液中で被包されるべき材料の懸濁に関する。次にその溶液の液滴が空気中で作られ、二価陽イオンの溶液、例えばCaCl₂中で収集される。二価陽イオンは、安定なアルギネートゲルマトリックスが形成される液滴と二価陽イオン溶液との間の相転移にアルギネートと相互作用する。周知のアルギネート被包方法は、アルギネート微小カプセルを形成するが、これらの過程の多くにはいくつかの問題がある。これらの方法は、一般に、後に微小カプセルを製造するために二価陽イオンの溶液中に収集される空気中の球形のアルギネート液滴の形成を要求する。アルギネート液滴の形成は、以前にいくつかの方法で行われている。例えば、液滴は、二価陽イオンの溶液への重力流動によるチューブを通してのアルギネートの押出しによって形成される。同様に、アルギネート溶液と二価陽イオン溶液との間の静電差に依存する静電液滴発生機が記載されている。その静電差により、アルギネート溶液はチューブを通して二価陽イオンの溶液に引かれる。被包過程における液滴発生の一般的議論については、例えばM．F．A．Goosen(Fundamentals of Animal Cell Encapsulation and Im mobilization，Ch6，114 〜142(CRC Press，1993))を参照のこと。更に、液滴が層状気流押出し装置を用いてアルギネート溶液の流れから形成される方法が記載されている。特に、この装置は、外側スリーブ内にキャピラリーチューブを含む。空気は、外側スリーブを通して駆動され、そのポリマー溶液は内側チューブを通して流れが調節される。外側スリーブからの空気の流れは、キャピラリーチューブから小さな液滴内へ流れる流体をばらばらにする。米国特許第5,286,495 号を参照のこと。これらの方法は、アルギネート微小カプセルを製造するであろうが、いくつかの更なる不利がある。第１に、これらの液滴発生方法は、付加的な装置、例えば静電液滴発生機又は気流押出し装置の使用を必要とする。これは、更なる低処理量ステップを微小被包過程に加え得、結果としてより高いコスト及びより労働の激しい過程となる。更に、これらの過程は、被包されるべき材料に潜在的に損傷を与え得る液滴発生ステップの間及び／又は液滴が陽イオン溶液に衝突する点において、被包されるべき材料が剪断力にしばしばさらされる。当該技術において記載される多くのアルギネート被包方法は、しばしば、薄すぎて不十分な防壁となるか又は厚すぎて細胞の連続的機能に必要とされる栄養素及び／又は細胞産物の透過性を欠くかのいずれでもある被包組成物の製造を引きおこすか、又はそれらの厚さが均一でなく、それは被包組成物の機能の予測性の欠如と生ずる。この均一性の欠如は、それが移植のための不十分な免疫保護、移植物への栄養素の不十分な拡散又は移植物からの要求される産物の不十分な拡散を引きおこし得る移植療法において特に問題となり得る。更に、これらの方法の多くは、特定のアルギネート液滴内で被覆されるべき粒子の組込みの機会に依存する。これにより、空の微小カプセル又は“ブランク”が発生する可能性が増加する。従って、１つの微小カプセル内及び微小カプセル間の両方で均一の厚さを有する微小カプセルを生ずる被包方法を提供することが必要されよう。更に、少いステップ数で、付加的な装置なしで、少い空又はブランクの微小カプセルの生産で、そして溶液内で行うことができる方法も要求されよう。本発明は、これら及び他の問題の解決方法を提供する。発明の概要本発明は、ポリマーゲルで粒子を被包する方法を提供する。本方法は、前記粒子を多価イオンの溶液でおおい、そして溶液から遊離多価イオンを除去するために粒子を洗浄することを含む。次に粒子はゲル化ポリマーの溶液中に懸濁され、それにより前記粒子からゲル化ポリマー溶液に多価イオンが拡散し、それにより前記粒子の表面上でポリマーがゲル化する。好ましいゲル化ポリマーはアルギネートであり、そして好ましい多価イオンは二価陽イオンである。更なる実施形態において、被覆されるべき粒子は、生物材料、例えば細胞を含む。生物材料は最初にマトリックス内で被包することができる。そのマトリックスはアルギネートゲルを含むことができ、そして更に又はかわりにそのマトリックスは規定されたマトリックス多孔性を有する架橋され混合された官能性ポリマーマトリックス、例えば架橋コラーゲンマトリックス被包の層を含むことができる。図面の簡単な説明図１は、静電（“ES”）液滴発生機並びに第１の被包のための方法及び第２の被包における液滴発生のための層状気流押出し装置を用いたアルギネートで二重被覆された島細胞の写真を示す。図２は、静電液滴発生装置を用いてアルギネートゲル内で最初に被包され、次に本発明の溶液被覆方法を用いてアルギネートで更に被覆された島細胞クラスターの写真である。図３Ａ及び３Ｂは、ES液滴発生機を用いてアルギネート中で最初に被包され、次に後に架橋されるコラーゲン及び次の本発明の溶液被覆方法を用いるアルギネートゲルのオーバーコートで被覆された赤血球の写真を示す。図４は、本発明の溶液被覆方法を用いてアルギネートゲルで溶液オーバーコートされた膵臓組織フラグメントの写真を示す。図５は、本発明の溶液被覆方法を用いてアルギネートゲルで被覆された木炭粒子の写真を示す。図６は、本発明の溶液被覆方法を用いてアルギネートゲルで溶液オーバーコートされた心臓組織断片の写真を示す。図７は、本発明の溶液被覆方法を用いてアルギネートゲルで二重被覆された肝臓組織フラグメントの写真を示す。図８は、本発明の方法によってオーバーコートされた微小カプセルの２つのサンプルの壁又は被覆厚の集団分布を示す一対の棒グラフである。２組からの平均被覆厚は各々33.23 μｍ及び31.44 μｍであった。図９は、本発明の方法を用いてオーバーコートされたアルギネート被包された赤血球の集団分布を示す棒グラフである。一重（“１”）、二重（“２”）、三重（“３”）及び未被覆ビーズ（“０”）としてビーズの分布を示す。好ましい実施形態の記載Ｉ．序文本発明は、ポリマー被覆において粒子を被包するための新規の方法を提供する。本発明の方法は、それが付加的な装置を必要とすることなく溶液中で行うことができ、そしてより多くの最終的に被覆された粒子を生ずるであろう点で周知の被包方法に優る利点を供する。更に、本発明のオーバーコート過程は、被覆されるべき粒子の表面からの多価イオンの拡散に依存するので、いずれかのブランクが形成されるであろうとしても極めて少量である。本発明の方法は医薬製剤の調製、細胞培養の適用、及び移植療法に適用することができる。 II．粒子オーバーコート一般本発明の１つの態様は、ポリマー被覆で粒子をオーバーコートするための方法を提供することである。本明細書に用いられる“オーバーコート”という言葉は、粒子が層によりおおわれるような、ゲル化ポリマーの層の粒子への適用をいう。対照滴に“被包”という言葉は、ゲル化ポリマー液滴内の粒子の組込みをいう。“溶液オーバーコート” とは、溶液中で行うことができ、これにより液滴発生ステップ又は装置を必要としないオーバーコート過程をいう。本明細書に用いられる“ゲル化ポリマー”という言葉は、多価イオンの存在下でゲル化するポリマーをいう。典型的には、多価陰イオン又は陽イオンはゲル化ポリマーと相互作用して安定なイオン対を形成し、結果としてポリマーのゲル化を引きおこすであろう。好ましいゲル化ポリマーは、その二価陽イオン、例えば Ca²⁺，Ba²⁺，及びSr²⁺との相互作用によりゲル化することができるアルギネートである。本発明の方法によれば、ゲル化ポリマーにおいて被覆されるべき粒子は最初に多価イオンの溶液でおおわれ、又は浸される。多価イオン溶液で粒子をおおった後、その粒子を、溶液及び粒子の表面から遊離多価イオンを除去するために洗浄する。次に粒子とゲル化ポリマーの溶液中に懸濁し、それにより粒子の表面に残った又はそれに結合した多価イオンが粒子からゲル化ポリマー溶液内に拡散する。ポリマー溶液へのイオンの拡散は、粒子がゲル化ポリマーで被覆されるように、粒子を覆うポリマーのゲル化を生ずる。これにより、粒子の周囲のポリマーのゲル化を生ずるメカニズムは、被覆されるべき粒子上又は粒子内に含まれる。特に、粒子を被覆するポリマーゲルは多価イオンがその粒子から拡散するにつれて粒子が外側に形成される。これは、ゲル化溶液中でポリマーの液滴を捕獲し、これによりゲル化溶液との界面を形成する液滴の外側表面においてゲル層を形成し、これにより外側から内側にゲル層を形成することに関する古典的な被包方法と対照的である。この古典的な方法を用いる材料の被包は液滴中の材料の組込み機会に依存するので、その過程の効能を減少させるブランク又は空の微小カプセルを形成する可能性が大きい。Ａ．多価イオンで粒子をおおうこと一般に、粒子をおおうことは、多価イオンが粒子に浸透及び／又はしみ込むのを許容するのに十分な時間、多価イオンの溶液中に粒子を懸濁することによって行われる。多価イオンは、用いられるゲル化ポリマーにより、例えば二価陽イオン又は陰イオンを含み得る。ゲル化ポリマーが陰イオンポリマー、例えばアルギネートである場合、二価陽イオンが好ましい、他方陽イオンゲル化ポリマー、例えばキチンに関連する方法は、二価陰イオン、例えばSO₄ ^2-の使用に一般に関連するだろう。好ましい二価陽イオン溶液は、CaCl₂，SrCl₂、及びBaCl₂を含むが、BaCl₂が最も好ましい。多価イオン溶液中での粒子のインキュベーションの長さは、多価イオン溶液の濃度、被覆されるべき粒子の性質及びポリマー溶液中の一価カチオンの濃度を含むいくつかの因子に一般によるであろう。粒子が多価イオン溶液に透過可能である多孔質組成物である場合、インキュベーションは長期間行うことができる。しかしながら、粒子が多価イオン溶液に対透過性であるが、その表面上又はそれ内に二価イオンを保持することができる場合、インキュベーション時間は一般に減少され得る。好ましい態様において、粒子は、少なくとも約10分間、好ましくは約10分〜約２時間、多価イオンの存在下でインキュベートされる。好ましくは、粒子は、二価陽イオンの存在下で約１時間、インキュベートされる。被覆されるべき粒子の性質は、おおうステップのための適切な条件を選択することにおいても役割を演じ得る。特に、いくつかの態様において、粒子組成物は、二価陽イオンの極濃度に対して影響を受けない。これは、粒子が高濃度の陽イオン溶液により逆影響を受け得る生物材料、例えば細胞、組織断片又は蛋白質を含む場合である。従って、二価陽イオン溶液の濃度は、対応するおおっている時間の増加と共に削減され得る。二価陽イオンで粒子をおおうことは、例えば約0.1 mM超、一般に約１mM〜約50 0 mMの濃度の二価陽イオンを供する溶液中で典型的に行われるだろう。好ましくは、二価陽イオン溶液の濃度は、約１〜約50mMである。更に好ましい濃度は約１〜約20mMであり、約１〜約５mMが最も好ましい。Ｂ．おおわれた粒子の洗浄二価イオン溶液で粒子をおおった後、その粒子は粒子の表面上に残ったいずれの遊離多価イオンも除去するために洗浄することができる。この最初の洗浄ステップの目的は、ゲル化ポリマーの時期尚早又は不規則なゲル化を引きおこし得る未結合又は遊離した多価イオンを表面から除去することである。この時期尚早のゲル化は、粒子からの多価イオンの放射状の拡散により、個々の粒子の周囲のゲル化よりむしろ凝集した粒子の周囲のゲル形成を引きおこし得る。典型的には、この最初の洗浄ステップは、非イオン性溶液、例えば水、デキストラン、ポリエチレングリコール、ソルビトール、又はスクロース等中で行われる。更に好ましくは、洗浄ステップは、約５〜30％(w/v)、更に好ましくは約10％のスクロースであるスクロース溶液を用いて行われる。Ｃ．ゲル化ポリマーでの粒子の核形成又は被覆洗浄ステップの後、被覆されるべきおおわれた粒子は、被覆されるであろうゲル化ポリマーの溶液中に懸濁される。好ましい態様において、被覆過程に用いられるゲル化ポリマーは陰イオン性ポリマーであり、更に好ましくはアルギネートの一価陽イオン塩、例えばアルギン酸ナトリウムである。アルギネートは、混合により散りばめられた、グルロネートブロックを形成するいくつかの隣接するグルロン酸残基のブロック及びマンヌロネートブロックを形成する隣接するマンヌロン酸残基のブロック、又は交互のグルロン酸及びマンヌロン酸残基の異種ブロックに配列されたマンヌロン酸及びグルロン酸残基の直鎖ポリマーである。一般に、一価陽イオンアルギネート塩、例えばアルギン酸ナトリウムは可溶性である。Ca²⁺，Ba²⁺，Sr²⁺及びFe²⁺のような二価陽イオンはグルロネートと相互作用する傾向があり、そしてそのグルロネートブロック内でのこれらの陽イオンの協同的結合は、安定なアルギネートゲルの形成の原因となる主要な分子内架橋を供する。特定の適用のために、非繊維形成誘導性であるアルギネートゲルを用いることが要求され得る。これは特に、被包された生物材料が哺乳動物ホストに移植される場合である。アルギネートの繊維形成誘導性は、一般に、汚染フカン(fucan) 及びポリフェノールが豊富なフィソイド(physoides)並びに他の粒子汚染物が原因である。これらの汚染物は、その繊維形成誘導性を減少させるためにアルギネートから精製することができる。例えば発行されているPCT 出願番号WO93/24077 号を参照のこと。粒子に適用される被覆の厚さは、一般に、被覆された材料の特定の必要性に依存するであろう。その厚さは、いくつかの被覆パラメーターを調節することにより変化させることができる。例えばより厚い被覆は、より高いレベルの多価イオンで粒子をおおうことにより適用することができる。あるいは、より厚い被覆は、拡散ステップを長期化すること又はゲル化ポリマー溶液の等張性をも減少させることのいずれかによって、粒子からのイオンのより大きな拡散を許容することにより供され得る。同様に、より薄い被覆は、反対の調節を行うことにより達成することができる。典型的には、本発明の方法を用いて適用される被覆の厚さは、約10μｍ〜約200 μｍの範囲であろう。好ましくは、被覆厚は、約20〜約60μｍであり、更に好ましくは約30〜約40μｍであろう。好ましい実施形態において、ゲル化ポリマー溶液は、一般に、それによって被覆されるべき粒子からの多価イオンの拡散の比率が増強されるように製剤化されよう。例えば、ゲル化ポリマーは、それにより粒子と溶液との間にイオン勾配が形成されるように溶液中に供され得る。例えば、ゲル化ポリマー溶液は、粒子とアルギネート溶液との間にイオン勾配を形成するために、非イオン性又は低イオン強度溶液と混合され得る。また、このステップに用いるための非イオン性溶液は、最初の洗浄ステップのための上述のスクロース溶液を含み得る。典型的には、非イオン性溶液は、ゲル化ポリマー溶液を加える前に粒子組成物に添加されよう。スクロース溶液が用いられる場合、スクロースの濃度はゲル化ポリマーとの希釈の前に、一般に約５〜約50％(w/v)、好ましくは約10〜30％であろう。更に、スクロース溶液は、一般にゲル化ポリマー溶液に対して約0.5 ：１〜約２：１の容量比のスクロース溶液において粒子に添加されよう。好ましくは、スクロース溶液は、ゲル化ポリマーに約１：１のスクロースの容量比で添加されよう。アルギネートが用いられるゲル化ポリマーである場合、スクロース溶液で希釈する前のアルギネート溶液は、好ましくは、約0.5 ％〜約４％の濃度で供されよう。被覆過程の間、多価イオンは、粒子からゲル化ポリマーの周囲の溶液に拡散する。多価イオンとゲル化ポリマーとの間の相互作用は、粒子を直ちに覆うポリマーゲルの形成を引きおこす。被覆過程の間、更に粘度を減少させ、ゲル化ポリマーの全体のゲル化を防ぐためにゲル化ポリマー溶液を希釈することが要求されよう。これは、成長するポリューゲル被覆粒子内の浸透圧を増加させることにより、粒子からの多価イオンの拡散の比率を更に増強する効果を有し得る。ポリマーのゲル化は多価イオンがそれから拡散し得る粒子の存在に依存するので、空又はブランクの微小カプセルの製造は、ポリマー液滴内の粒子の組込みの機会に依存する他の被包方法に優り、実質的に削減され得る。オーバーコート過程の後、被覆された材料はいずれの遊離したゲル化ポリマーを除去するために洗浄され得る。この洗浄ステップは、遊離ゲル化ポリマーを有効に除去するであろういずれかの手段、例えば水又は一価イオン例えばアルギネートの場合、一価陽イオン、即ちナトリウムを含む溶液で洗浄することにより行うことができる。好ましくは、この洗浄ステップは、一価イオン溶液で行われるだろう。典型的には、アルギネートがゲル化ポリマーである場合、約５mM〜約50 0 mM、最も好ましくは125 mMの塩濃度及び上述のようなスクロース濃度を有する塩類溶液又は塩類／スクロース溶液がこの洗浄ステップのために用いられる。この洗浄は、必要に応じて繰り返しても行うことができる。Ｄ．ポリマー被覆の最終的ゲル化被覆過程の後、第２の多価イオン溶液中に粒子を懸濁することにより、被覆層のより完全なゲル化が確実にされ得る。この溶液に、おおうステップの用いられるのと同じであるか、又は他の適切な多価イオン溶液、例えばアルギネートの場合Ca²⁺，Ba²⁺又はSr²⁺であり得る。これは被覆層を有効に硬化させゲル被覆を安定化させる。ゲル化ポリマー及びゲル化を引きおこすための二価陽イオンとしてアルギネートを用いることが主に記載されているが、本発明の方法が陽イオンゲル化ポリマー、例えばキチン、及びゲル化を引きおこす二価陰イオン、例えばSO₄ ^2-を用いて行うことができることが認められ得る。更に、上述の方法を用いて被覆された粒子は、更なる処理がなされ得る。例えば、被覆された粒子は、周知の被包方法を用いて更に被包され得、又は付加的な類似したもしくはかわりの方法により被覆され得る。更に、被覆された粒子は、外側の半透膜を形成するために安定剤又は架橋ポリマーを安定化することで処理され得る。例えばアルギネート被覆において、アルギネートは、ポリリシン（J ．Pharm．Sci．70: 351〜354(1981)）もしくはポリエチレンイミンを用いて被覆され得、又はかわりにコラーゲンの付加的ポリマー層が加えられ、架橋され得る、。全体のオーバーコート過程は、より厚い又は多層の被覆が要求される場合、繰り返され得る。 III．被覆されるべき粒子Ａ．全般本発明の方法は、一般に、種々の粒子タイプを被覆するのに用いることができる。被覆するための粒子は、一般に、いくつかの点で多価イオンに結合もしくはそれを保持することができ、次に二価イオンをゲル化ポリマーに放出又は拡散することができるであろう。多価イオンは安定なイオン対を形成するためにゲル化ポリマーと相互作用して、粒子の周囲にポリューゲルを形成する。例えば、被覆されるべき粒子は、それにより多価イオンが粒子の孔のネットワーク内に保持される多孔質構造を含むことができる。ゲル化ポリマー溶液中の粒子の懸濁に基づいて、多価イオンはその孔からゲル化ポリマー溶液に拡散するであろう。あるいは、粒子はその表面上又はそれ内の多価イオンに結合してゲル化ポリマー溶液中に懸濁に基づいてそれらを放出し得る。更に、粒子は、浸透圧によりイオンをゲル化ポリマー内に拡散する透過膜内に多価イオンを保持することができる。この後者の例は、細胞及び組織断片のような生物材料の粒子、並びにリポソーム、アルギネート微小カプセル及び被覆されたアルギネート微小カプセルのような他の微小カプセル製剤を含む。Ｂ．生物材料好ましい態様において、本発明の方法を利用して被覆されるべき粒子は生物材料を含むであろう。“生物材料”という句は、本明細書に用いられる場合、生物活性を有する生物源のいずれかの材料をいう。例えば、生物材料は、個々の細胞又は凝集した組織断片のいずれかとしての細胞、即ちバクテリア、哺乳動物、昆虫、植物等を含むであろう。また、生物材料の定義には蛋白質、酵素、細胞断片、又はオルガネラ等も含む。本発明の方法を用いて被覆された生物材料は、医薬、移植及び細胞培養の適用を含む種々の適用に用いることができる。典型的には、生物材料は本発明の方法を用いて直ちに被覆され得るが、時折生物材料は被覆する前に固体支持体に付着され得る。次に、支持体に結合した材料は、本発明の方法を用いてアルギネートで被覆され得る。適切な固体支持体は、当該技術で一般に公知であるものを含み市販されている。例えばセルロース、アガロース、シリカ、スターチ、ジビニルベンゼン、又はポリスチレン等である。特定の理論に結びつけるわけではないが、固体支持体及び／又は生物材料は陰イオンポリマー溶液に懸濁される場合と同じ拡散を許容するのに十分な量の二価陽イオンに結合し又はそれを組み込み、結果として固体支持体／生物材料組成物の周囲にゲルを形成するであろう。更に好ましい態様において、本発明の方法により被覆された生物材料は、移植療法に用いるための分泌器官組織を含む。移植療法は、組織が、ホストがその機能を欠損又は欠如しているホストにおいてドナーの器官の機能を置換することを意図するドナー器官からのホストへの組織の移植に関連する。当業者は移植のための種々の組織タイプを被覆することにおける本発明の方法の利用性を認めるであろうが、特に好ましいドナー器官組織は、膵臓島細胞、肝細胞、ニューロン細胞、腎皮膚細胞、脈管内皮細胞、甲状腺細胞、副腎細胞、胸腺細胞及び卵巣細胞を含む。特に好ましい例において本発明の方法によって被覆された生物材料は膵臓島細胞である。島細胞のソーフーは、例えば、ヒト、ヒトに近い霊長類、ブタ、ウシ、ウサギ、ラット、マウス等を含み、ヒト及びブタがより好ましい。島細胞の移植、及びこれによるそれらを被覆する方法は、特に真性糖尿病を患う患者を治療するのに役立ち得る。Ｃ．被包された組成物のオーバーコート１．全般本発明の方法は、問題の粒子の直接の被覆に関して主に記載されている。例えば、組織のサンプル又は組織断片をオーバーコートすることを意図する場合、その組織には本明細書に記載されるオーバーコート法が行われる（例えば図４，６及び７を参照のこと）。このような直接のオーバーコートは、被覆されるべき材料がおおうステップの間に十分な量の多価イオンに結合し又はそれを組み込み得る場合に直ちに行われる。直接被覆された粒子は、いくつかの適用、例えば細胞培養に用いることができる。しかしながら他の態様において、本発明の方法は、先に被包された組成物に更なる被覆層を供するか、又は最終的にいくつかの層の被覆を含む組成物に最初の層を供するのに用いられ得る。これは一般に、問題の粒子に、より厚く、より平らで、及び／又はより耐久性のある被覆を供することが要求される場合であろう。例えば、移植のための組織の被包において、それにより移植物が免疫系の効果から保護されるであろう移植物とホストの免疫系との間の障壁を形成することが要求される。同時に、その障壁は、移植物の機能の予測性を許容するために均一な厚さのものでなければならない。粒子の最初の被包は、本明細書に記載される方法により、又は当該技術で周知であるいくつかの方法の１つにより行うことができる。例えば、種々の被包組成物、例えばゼラチン、ポリビニルアルコール、エチルセルロース、セルロースアセテートフタレート及びスチレン無水マレイン酸を用いることができる（Reming ton's Pharmacentical Science，Mack Publishing Co.，Easton PA(1990)を参照のこと）。次にこれらの被包された組成物は、それにより更なるアルギネートの層で被覆される本明細書に記載される方法にかけられる。２．アルギネート被包組成物好ましい態様において、被包されるべき粒子は、アルギネートゲル内で最初に被包されよう。後にオーバーコートされるべき粒子の最初のアルギネート被包は、本明細書に記載される方法により、又は当該技術において以前に記載されている被包方法により行うことができる。これらの組成物は、例えばポリリシン等により更に安定化され得る。J．Pharm．Sci．70: 351〜354(1981)、米国特許第4,6 73,566 号、第4,689,293 号、第4,789,550 号、第4,806,355 号及び第4,789,550 号を参照のこと。３．架橋され混合された官能性ポリマーマトリックス被覆粒子１つの態様において、本発明の方法を用いて溶液オーバーコートされるべき被包組成物は、安定化され、架橋された混合官能性ポリマーの層を含み得る。被覆過程における混合官能性ポリマーマトリックスの使用は、全ての目的のために、引用により本明細書に組み込まれる本願と同時に出願された米国特許出願通し番号08/399,295号（Attorney Docked No．016325-00100 ）に実質的に詳細に記載される。“混合官能性ポリマー”という言葉は正及び負電荷基の両方を有する長鎖ポリマー化合物をいう。混合官能性イオン性ポリマーは、繊維状凝集物を形成、中性pH周辺で巨視的粒子の周囲で核形成する能力を特徴とし得る。特に、核形成は、約pH4.0 〜約pH11.0でおこるべきである。好ましくは、核形成は、約pH５〜約pH9.0 でおこるべきである。混合官能性ポリマーの例は、高分子複合体に自己集合することができるコラーゲン、誘導化コラーゲン、合成コラーゲン様ポリペプチド、及び誘導化ポリサッカリドポリマーを含む。架橋された混合官能性ポリマーマトリックス層は、上述の解離又はデグラデーションに耐える安定な高分子を生ずる。架橋ポリマーマトリックスでの被覆は、一般に以前に記載されるものより堅い被包組成物を生ずる。架橋は、一般に、改良された構造的特徴及び免疫バリアーを供する。架橋は以下により詳細に議論される。架橋ポリマーマトリックス層の更なる利点は、その層の多孔度を制御する能力である。層の多孔度を制御することにより、その組成物は、用いられるべき特定の適用により、即ち特定の分子量の分子を排除又は保持するように調節することができる。例えば、移植組成物において、多孔度は典型的には、移植物に損傷を与え得る抗体及び／又は補体蛋白質を排除するよう調節されよう。典型的には、多孔度は、その層が20,000ダルトン超の分子について制限された拡散速度を有するよう調節されよう。適用されるポリマーマトリックス被覆のレベル、もしくは架橋のレベルを変えることにより、又はマトリックス一体性を促進もしくは減退させるために種々の量のかわりのポリマー中で混合することにより被覆層の多孔度及び／又は強度を調節することができる。例えば被覆材料が例えば組織培養容器内でせん断又は研磨力にさらされるであろう場合に、より強い混合官能性ポリマーマトリックス層が一般に役立つ。安定な架橋され、混合された官能性ポリマーマトリックスの例は、種々のタイプのコラーゲンを含む。混合官能性ポリマーマトリックス層として役立つコラーゲンは、一般に、自己集合することができよう。好ましくは、この自己集合は、中性又は関連するpHにおいて、又はその周囲でおこるであろう。“関連するpH” は、被包されるべき生物材料の性質又は組成物が導入されるべき生物環境により種々であり得る。例えば、ほとんどの哺乳動物の適用において、関連するpHはほぼ中性であろう。しかしながら、被覆されるべき材料が塩基性又は酸性範囲のいずれかから外れたpHに影響を受けにくい場合、この範囲において被覆を許容するであろうコラーゲンを用いることが要求され得る。同様に、組成物が導入されるべき環境が酸性又は塩基性の範囲内である場合、この範囲内で不溶性であり続けるであろうコラーゲン被覆を供することが要求され得る。酸可溶性コラーゲンタイプが混合官能性ポリマーマトリックスに一般に用いられるが、当業者はいくつかのコラーゲン形態を用いることができることを認めるであろう。例えばMiyataらへの米国特許第4,164,559 号は、コラーゲンの誘導体化を変化させることによるフィブリル形成pHプロファイルの変化を報告する。そこに記載されるコラーゲン形態は、特定の被包された組成物についての関連する pHが中性範囲より低い又は高い場合に適用可能であり得る。多くの可溶性蛋白質と一緒の場合、種々のコラーゲンタイプの可溶性は、溶液中のpH、温度、存在するコラーゲンの主要形態の分子量、蛋白質濃度及び塩濃度に依存する。溶解度に影響を与える他の因子は、溶液中の粒状物の存在であり得る。このような粒状物は、穏やかな可溶性である蛋白質についての核形成の部位となり得る。特定の理論に結びつけるわけではないが、本明細書に記載される方法を用いて被覆されるべき材料は、コラーゲンのための巨視的核形成部位を供する、と確信される。従って、混合官能性ポリマーマトリックス層は、用いられるポリマー溶液の自然の特性を利用することにより調製することができる。特に、被包され、支持体結合され又は遊離した粒子のいずれかである生物材料は、混合官能性ポリマーの溶液に導入される。溶液の条件は、それによりポリマーがフィブリルを形成し、生物材料の周囲に核形成し始めるように調製することができる。例えば、コラーゲンの場合、pH、塩濃度、温度及び／又はコラーゲンの濃度が、フィブリル形成の開始速度、程度及び質を制御するために選択され又は調節され得る。調節される特定の条件及びこれらの調整の範囲は、例えば、pH、温度及び塩濃度の変化に対する被包されるべき材料のセンシティビティーを含むいくつかの因子に依存し得る。核形成の条件は、特定の被覆された材料についての適用により、種々であり得る。例えば、核形成は、pH、有機及び無機塩濃度、並びに核形成ステップの間の混合官能性ポリマーの濃度を変化させることによって影響を受け得る。これらの核形成条件は、本明細書と同時に出願された米国特許出願通し番号08/399,295号（Attorney Docket No．016325-00100）に実質的に詳細に論議される。核形成の条件を調節することに加えて、生物材料に適用される混合官能性ポリマー被覆のベルを調節することも要求され得る。被覆の量は被覆されるべき材料の表面領域に関連するので、被覆過程において添加される全ポリマーの量は、同様に、被覆されるべき材料の性質により種々であろう。例えば、混合官能性ポリマーとしてコラーゲンでの被覆の場合、被覆されるべき材料が、直径約50〜約250 μｍの範囲の大きさの小さな粒子、例えばアルギネート微小カプセル又はビーズを含む場合、コラーゲンは、充填されたビーズ容量の１ml当り0.3 重量％コラーゲン溶液約0.2 〜約2.0 mlで添加され得る。より大きなサイズの粒子又はより薄いコラーゲン被覆のために、より低レベルの全コラーゲンが添加され得、他方（充填ビーズ容量１ml当りにより大きな表面領域を有する）より薄い被覆又はより小さい粒子サイズは、より多くの全部の添加されたコラーゲンを利用し得る。混合官能性ポリマーマトリックスは、一体性を促進又は減少させ、これにより結果として生ずるマトリックスの多孔度を増加又は減少させる混合される官能性ポリマーと同じに添加される他のポリマーの添加を通して更に調節することができる。例えば、付加的架橋可能ポリマーは、連結するパズル片に極めて似たマトリックスの一体性の実質的な強化を供し得る。あるいは、マトリックスの一体性は、架橋のレベルを減少させる混合官能性ポリマーフィブリル間のスペーサーとして作用するポリマーを含むことにより減少され得る。一般に、コラーゲンが混合される官能性ポリマーである場合、コラーゲン溶液は、約pH4.5 における希釈酢酸溶液（酢酸でpH4.5 に調節された脱イオン水）中であろう。pH4.5 において、コラーゲン溶液は、一般に、フィブリルのプレアセンブリーのため、一般にいくらかの粘性であろう。pH５超へのコラーゲン溶液の pHは調節は、フィブリル形成及びポリマー核形成を生ずる。中性pH周囲のコラーゲンの核形成は、pHの極値にセンシティブである生物材料を被覆するのに特に適する。それゆえ、典型的には、コラーゲン核形成の開始は、コラーゲンのpHを約４超に調節することにより行われる。好ましくは、そのpHは約５〜8.0 、最も好ましくは約pH6.5 〜約pH6.9 の間に調節される。コラーゲン蛋白質は、約8.5 〜10の間の報告される等電点を有する。これにより、核形成pH、例えば５〜８の間のpHにおいて、コラーゲンペプチドは一般に、生味の正電荷を有するであろう。従って、好ましい方法において、被覆されるべき生物材料は、生味の負電荷を有し得る。核形成が要求される周囲のコラーゲンと材料との間の生味の電荷の差は、生物材料周囲の核形成を増強し得る。混合される官能性ポリマーマトリックスとして用いることができるコラーゲンは、市販のコラーゲンタイプ及び誘導体化コラーゲンを含む。蛋白質誘導体化は当該技術で公知であり、用いられる特定の蛋白質の特性の変化、例えば改良された核形成、架橋形態のより優れた安定性、核形成プロフィルの変化等を許容し得る。誘導体化コラーゲンの例は、ペジル化(pegylated)、コラーゲン（ポリエチレングリコールが共有結合したコラーゲン）、スクシニル化コラーゲン、アルキル化コラーゲン（例えばメチル化コラーゲン）、アミノ化コラーゲン、活性化アルデヒド誘導体化コラーゲン等を含む。例えば米国特許第4,164,559 号を参照のこと。混合される官能性ポリマーマトリックスの議論は主にコラーゲン被覆についてであるが、種々の他のポリマーを用いることができることも認められ得る。例えば、特に記載されるコラーゲン組成物に類似した特徴を有するポリマーが特に有用であり得る。特に関心のものは、酸性pH又は塩基性pHにおいて可溶性であるが、中性又は関連するpHの周辺で沈殿するポリマーである。より好ましいのは、中性pHにおいて被覆される材料と反対の生味の電荷を有するポリマーであろう。他の態様において、安定な架橋されたポリマーマトリックスは、誘導体化されたポリサッカリドポリマー、好ましくはアルギネートポリマーを含み得る。このような誘導体化アルギネートポリマーは、コラーゲン分子の交互の電荷に似た各々の鎖内の陰イオン基と陽イオン基との混合を特徴とする。ポリマー及びポリサッカリドの誘導体化は、当該技術において一般に公知である方法によって行うことができる。ポリマーマトリックス層の適用の後、その層はその層を安定化するために架橋することができる。用いられる架橋剤のタイプは、一般に、被覆過程に用いられるポリマーのタイプによるであろう。本発明を行うためにゼロレングス架橋剤が好ましい。“ゼロレングス架橋剤”とは、２つのポリマー分子の官能基の間に直接の架橋を媒介又は形成するであろう架橋剤をいう。例えば、２つの蛋白質の架橋において、ゼロレングス架橋剤は、外来材料を組み込み又は外生付加物を除去することなく、１つの蛋白質のアミノ酸側鎖からのカルボキシル基と他のもののアミノ基との間のブリッジ又は架橋を形成するだろう。特に役立つ架橋剤は、水、アンモニアもしくはアミン含有化合物、アルコール又は他の単純な基を遊離する縮合反応によって架橋を行う。このような架橋剤は、縮合架橋剤と呼ばれる。本発明のいくつかの態様において、コラーゲンが選択された架橋された混合される官能生ポリマーマトリックスである場合、当該技術で公知であるいくつかの有機架橋剤、例えばカルボジイミドを用いることができる。有機可溶性架橋剤は、その溶媒効果が生物材料により許容され得る限り用いることができ、更に好ましい態様においてコラーゲン層の架橋が水溶性架橋剤、例えば１−エチル−３− （３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロライド（“EDC”）を用いて行われる。架橋のレベルは、その層の強度及び／又は多孔度を変化させるよう調整することができる。あるいは、架橋コラーゲン被覆層の一体性を増強又は減少させるために層に加えることができる。これにより、本発明の方法を用いて、遊離した、被包され又は支持体に結合した生物材料を含む、種々の材料をオーバーコートすることができる。本発明の方法は粒子が陰イオン性ポリマーの溶液内への二価陽イオンの拡散に依存するので、付加的な液滴発生装置についての必要性がない。従って、本発明の全体のオーバーコート過程は溶液中で行うことができる。本発明は以下の実施例により更に詳説される。これらの例は単に本発明の態様を詳説するためであり、本発明の限定として意図されない。実施例実施例１−アルギネート溶液オーバーコート過程以下に記載されるアルギネートオーバーコート過程を、ES液滴発生機を用いて最初に被包された赤血球に適用し、次に架橋されたコラーゲンを被覆した。次にこれらの微小カプセル又は“ビーズ”をアルギネートゲルの付加的な層で溶液オーバーコートした。ポリプロピレンテストチューブ（５及び15ml）及び３ml転移ピペットをpH7.2 における0.5 ％ゼラチン、125 mM塩類溶液、10mM Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸（“HEPES ”)で被覆し、乾燥させた。ビーズをビーズを沈殿させる５mlポリプロピレンテストチューブ内に分注した。ビーズを加え又は排除して約0.3 mlの沈降ビーズ容量とした。その上清を沈降したビーズから除去した。次にそのチューブをpH7.2 における2.5 mM BaCl₂，125 mM塩類溶液、10mM HEPESで満たし、そしてそのビーズを室温で１時間、LabQuake^TM回転機上でインキュベートした。ビーズを再び５〜 10分、沈降させ、次に30秒間、1000〜1500rpm で遠心し、そしてその上清を0.4 〜0.5 mlまで除去した。次にそのチューブを、25％スクロース、2.5 mM BaCl₂， 125 mM Nacl，10mM HEPES，pH7.2 の溶液で満たし、逆さにすることにより混合し、再び室温で１時間、回転させた。次にそのビーズを５分間、沈降させ、30秒間、1000〜1500rpm で遠心し、そしてその上清を除去した。このステップを必要に応じて（一般的には３回）繰り返した。次にそのチューブを25％スクロース、 125 mM Nacl,10mM HAPES，pH7.2 の溶液で満たし、そして逆さにして混合し、次に上述のように即座に遠心した。このステップを繰り返した。0.75mlのスクロース／塩類溶液／HEPES 溶液を、ビーズペレットを乱すために加え、次に125 mM塩類溶液、10mM HEPES pH7.2中2.8 ％アルギン酸ナトリウムの2.5 mlを注意深く加えた。次にそのビーズを、３秒間、テストチューブを激しく振とうすることにより直ちに混合し、次に静かに逆さにするか又は３分間、回転させた。そのビーズ懸濁液を15mlポリプロピレンテストチューブに移し、５mlチューブを、15mlチューブが満たされるまでスクロース／塩類溶液／HEPES 溶液で洗浄した。このチューブを数回、逆さにして混合し、遠心した。その上清の大部分を除去し、そしてスクロース／塩類溶液／HEPES 溶液を加えて懸濁液の容量を８mlにした。次に６ mlのスクロース／BaCl₂／塩類溶液／HEPES を加え、そしてその溶液を、逆にして５分間、遠心することにより混合した。ビーズを沈降させ、遠心して、その上清をデカントした。次にビーズを、６mlのBaCl₂／塩類溶液／HEPES 溶液をビーズペレットに加え、混合し、回転させ、遠心し、そしてデカントすることにより安定化させた。このステップを繰り返した。その結果生ずるビーズを顕微鏡で分析した。結果として生ずるアルギネートオーバーコートビーズの写真を図３に示す。その過程を完了した後、オーバーコートされたビーズの代表的サンプルを顕微鏡での評価により分析した。オーバーコートされたビーズの集団分布を決定するためにいくつかの視察の場所を計数する。一重ビーズ（１）、二重（２）、三重（３）及び未被覆のビーズ（０）の分布を図８に示す。４以上のビーズ（４＋）の凝集物も示す。示されるように、調製されたビーズの90％超が被覆された一重又は二重ビーズであり、未被覆のビーズは総集団の少量であった。特定のタイプをオーバーコートするものとして記載されているが、この同じ方法を、実施例３〜５に示されるような他の材料にも適用した。実施例２−層状気流押出し装置を用いて二重被覆されたES被包島膵臓島細胞を第１の被包ステップのための静電（“ES”）液滴発生装置、次の層状気流押出し装置を用いる第２の被包を用いて二重に被包した。その島をES液滴発生機を用いて最初に被包し、そして塩化カルシウム（“CaCl₂”）中に収集した。次にその結果生ずるアルギネート被包島に、層状気流押出し装置及び以下の通りの方法を用いて第２の被包を行った：アルギネート中の被包された膵臓島の懸濁液をシリンジの束内におく。シリンジプランジャーを、その針から細胞懸濁液／アルギネート溶液を分配するために 0.3 ml／分の流速を供するように置き換え、他方空気を約30psi の入口圧においてその装置の外側スリーブに送り出す。その懸濁液の液滴を120 mM CaCl₂及び10 mM HEPES緩衝液を含む容器内に収集した。その容器を、CaCl₂溶液が針の先端から約160 〜165 mmであるように位置させた。実施例３−アルギネートで溶液オーバーコートされた一重被覆島細胞本実施例のために、アルギネート被包島細胞を、アルギネートの更なる層で溶液オーバーコートするために用いた。島細胞を実施例２に記載される静電液滴発生法を用いて一重Ca−アルギネート微小カプセル内に最初に被包した。アルギネート被包島を、実施例１の溶液オーバーコート法を用いてアルギネートの更なる層でオーバーコートした。結果として生ずるアルギネートオーバーコートされ、アルギネート被包された島細胞を図２に示す。外側層として示されるアルギネートオーバーコートは、オーバーコートの前に被包された島より均一な厚さを示す。実施例４−溶液オーバーコートされた組織断片本実施例のために、膵臓組織断片、心臓組織断片及び肝臓組織断片をBaCl₂でおおい、実施例１の方法に従って、アルギネートで溶液オーバーコートした（各々図４，６及び７に示す）。アルギネートで被覆された組織フラグメント溶液は、組織の周囲にアルギネートの均一な層を有することが示される。これは、より大きな材料の断片及び不規則な形状の断片が本発明の方法によって被覆され得ることを証明する。古典的な被包法はこの点でいくらか限定される。実施例５−溶液オーバーコートされた木炭粒子木炭断片も実施例１の溶液オーバーコート法により被覆した（図５に示す）。多孔質粒子である木炭粒子の被覆は、他の多孔質組成物、例えば固体支持体等を被覆することにおける本発明の被覆方法の効能を証明する。上述の発明は明快さ及び理解の目的のために詳細に記載されているが、形態及び詳細の種々の変化が本発明の範囲から離れることなく行われ得ることは本開示を読むことから当業者に明らかであろう。本願に言及される全ての出版物及び特許文献は、各々の個々の出版物又は特許文献が個々に言及されるのと同程度まで、全ての目的のためにその全体が引用により組み込まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．ポリマーゲルで粒子を被覆するための方法であって、該方法が、前記粒子を多価イオンの溶液でおおうステップと、前記組成物の表面上の遊離多価イオンを除去するために前記粒子を洗浄するステップと、それにより前記多価イオンが前記粒子からゲル化ポリマーの溶液に拡散するように該ゲル化ポリマーの溶液内に前記粒子を懸濁し、それにより前記粒子の表面上に前記ゲル化ポリマーの溶液をゲル化するステップと、を含むことを特徴とする方法。２．前記ゲル化ポリマーがアルギネートであり、そして前記多価イオンの溶液が二価陽イオンの溶液であることを特徴とする請求項１に記載の方法。３．前記粒子が生物材料を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。４．前記生物材料が細胞であることを特徴とする請求項３に記載の方法。５．前記細胞がマトリックス内に最初に被包されることを特徴とする請求項４に記載の方法。６．前記マトリックスがアルギネートゲルを含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。７．前記マトリックスが、規定されたマトリックス多孔度を有する架橋され、混合された官能性ポリマーマトリックスの層を更に含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。８．前記架橋され、混合された官能性ポリマーマトリックスが、架橋されたコラーゲンを含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。９．前記二価陽イオンの溶液がBa²⁺，Ca²⁺，Sr²⁺及び Fe²⁺からなる群から選択される二価陽イオンを含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。 10．前記二価金属陽イオンの溶液がBa²⁺を含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。 11．前記細胞が膵臓島細胞であることを特徴とする請求項４に記載の方法。