JPH11501636A

JPH11501636A - 医薬組成物

Info

Publication number: JPH11501636A
Application number: JP8527186A
Authority: JP
Inventors: フロガールド，ハンス; バードラスムッセン，ポール
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1995-03-09
Filing date: 1996-03-11
Publication date: 1999-02-09
Also published as: AU716791B2; NO974123D0; WO1996028544A1; EP0871721A1; CA2214799A1; CN1099462C; AU4784896A; NO974123L; CN1181783A

Abstract

(57)【要約】本発明は、細胞に対するストレス損傷が関与する疾病又は状態の予防又は治療のための薬学組成物において、（ａ）セラミドと構造的に同一か又は類似している脂質含有物質を、接合体が生きた細胞と接触した時点で脂質含有物質がセラミド活性化タンパク質ホスファターゼを活性化して細胞代謝のダウンレギュレーションを結果としてもたらすような形で、（ｂ）前記脂質含有物質を結合することのできるタンパク質と接合させたもの及び（ｃ）薬学的に受容可能な希釈剤又は担体、を含んで成る薬学組成物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】医薬組成物発明の分野ヘパリン結合タンパク質(HBP)及びセラミド類似体から成るタンパク質−脂質接合体、及び細胞に対するストレス損傷が関与する状態の治療におけるその薬学的利用。発明の背景サイトカインカスケードの付隨する活性化を伴う局所的な感染又は炎症部位（例えば腹腔）における例えばグラム陰性菌といった重症の感染に対する全身的応答の結果として生じる敗血症性ショックは、過去50年にわたり発生頻度が増大してきており、現在米国における集中治療室での死亡の最も一般的な原因となっている。敗血症性ショックのこの増大及び高い発生率の理由は、脈管内カテーテルといったような侵入的装置の使用の増大、細胞毒及び免疫抑制薬の使用の増加、敗血症を発生しやすい患者の寿命の延長、及び抗生物質耐性をもつ生物によりひき起こされる感染の増大、にあると考えられている。敗血症に付隨する疾患は、陽性血液培養により特徴づけられる菌血症（敗血症としても知られている）；頻呼吸、頻脈、高体温、低体温の形での感染に対する全身性応答によって特徴づけられる敗血症；敗血症の臨床的証拠及び乳酸塩レベルの異常増加、尿量過少、又は精神状態の急変の形での器官灌流変化の徴候が存在する敗血症候群；敗血症候群の臨床的証拠ならびに１時間未満の時間持続し従来の療法に対する応答性をもつ低血圧が存在する早期敗血症性ショック；及び敗血症候群及び従来の療法にもかかわらず１時間以上持続する低血圧の臨床的証拠が存在する治療抵抗性の敗血症性ショック、である。グラム陰性敗血症に起因して高い死亡率及び羅患率が続いていることから、循環する細菌LPSの潜在的な致死効果を妨げることのできる治療用作用物質に対する集中的な探究が鼓舞されてきた。数多くの論文が、静脈内投与された高用量の免疫グロブリンの著しい治療効果について報告している。しかしながら、治療には、核LPSに対する自然に発生する高レベルの抗体についてスクリーニングされたドナーの血漿から又はきわめて大きなドナーのプール（＞1000）から由来する IgGが必要である。菌血症の治療用としても提案されてきたLPSに対するモノクローナル抗体は、おそらくはLPSにより誘発されたサイトカインカスケードを阻害しないことを理由として、ほとんど又は全く効果を示さなかった。その上、比較的わずかな敗血症患者しか循環する内毒血症及び菌血症を示さず、従って、循環 LPSを中和する抗体は敗血症が発生する部位に適用されない。酸化攻囲(oxidatine siaye)段階が持続する結果として高等脊椎動物においては、穏やかな酸化ストレスが正常の特長である。正常な条件下では、精巧な抗酸化剤の蓄積から成る効果的な防御系が、酸素を含まないラジカルと抗酸化剤の間のバランスを保つことによって無酸化ラジカルに生体が対処できるよう保証している。しかしながら、感染又は損傷部位においては、感染をひき起こす外来性の侵入病原体を殺すための必要条件として食細胞（活性化された好中球、白血球、マクロファージ及び単球）により数多くの攻撃的酸化種（無酸素ラジカル）が分泌される。これらの部位では、無酸素ラジカルの生成は、周囲の細胞の抗酸素能力をはるかに超え、これらの細胞は、無酸素ラジカルにより媒介された壊死又はアポプトーシス（プログラムされた細胞死滅）により損傷されたり死んだりする可能性がある。感染又は損傷部位においては、サイトカインカスケードが開始され、これが今度は好中性白血球を活性化させる。（グラム陰性菌中の）サイトカインカスケードのインジエータは、感染性又は炎症性部位で放出された内毒素(LPSと略されるリポ多糖体としても知られている)であり、この部位でこの内毒素はマクロファージその他の細胞からの腫瘍壊死因子α(TNFα)、インターロイキン−１、インターロイキン−６、インターロイキン−８及び血小板活性化因子(PAF)の放出を誘発する。TNFα、インターロイキン−１及びPAFの放出後、アラキドン酸が代謝されてロイコトリエン、トロンボキサンＡ₂及びプロスタグランジンを形成する。インターロイキン−１及びインターロイキン−６はＴ細胞を活性化してインターフェロン−γ、インターロイキン−２、インターロイキン−４及び顆粒球−単球コロニー刺激因子を産生する。好中球は、これらの媒介物質の大部分によって直接活性化され得る。かくして、好中球により誘発された損傷は、無酸素ラジカル及びリソソーム酵素の放出による脱顆粒の間、及び感染又は炎症部位での凝集の間に発生しうる。サイトカインカスケードのLPS媒介された開始の原因である分子メカニズムは完全に理解されていないものの、サイトカインTNFα、vitD₃及びINF-γのシグナル形質導入に関する最近の報告書は、この現象について幾分かの光明を与えた。サイトカインvitD及びINF-γは、セラミド及びホスフォリルコリンに対し膜スルフィンゴミエリンを加水分解する膜結合中性スフィンゴミエリナーゼを刺激することによって、HL−60細胞内のセラミドの産生を刺激するものであることが示された。（T．Okazaki et al.，J ．Biol．Chem. 265，1990，p15823〜15831参照）、セラミドは、それ自体X Ser/Thr Proタンパク質キナーゼの一族に属するセラミド活性化タンパク質キナーゼを活性化する第２のメッセンジャであることがわかった(S ．Mathias et al.，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 88，1991年、pp.1009〜10013 参照)。セラミドはさらに、セラミド活性化Ser/Thrタンパク質ホスファターゼを活性化することが示されてきた(R．T．Dobrowski及びY．A．Hannun，J ．Biol．C hem. 267，1992，p5048〜5051参照)。これらの初期反応は、MAPキナーゼカスケードの活性化、cMyc及びc-Fosといったような転写因子の刺激、NF−KB活性化、及びアラキドン酸誘導体の形成を導くPLA₂の刺激が関与する、複雑でありかつ今だによく理解されていない要領で、さらなる下流シグナリングを導くものであることが示された。循環中のリポタンパク−結合タンパク質(LBP)はLPSに結合し、特異的CD14レセプタに対するLPSの結合を媒介する。HL−60細胞上のCD14レセプタを介したLPSによるシグナル形質導入の最近の研究では、LPSがその細胞応答、例えばセラミド活性化タンパク質キナーゼの刺激によるサイトカインカスケードの開始を誘発することが示された。構造分析は、LPSの脂質Ａ半分の還元末端の一部分がセラミドの一部分に酷似していることを立証した。(C．K．Joseph et al.，J ．Biol．C hem. 269，1994，p17606〜17610参照)。従って、LPSが、細胞のセラミド経路の中に入ることによってその活性を及ぼすことがわかるだろう。発明の要約驚くべきことに、LPSは、LBP以外のタンパク質に接合された時点で、セラミド活性化タンパク質キナーゼを活性化させることによる以外の方法でセラミドの第２のメッセンジャ機能を模擬することができる、ということが発見された。従って本発明は、細胞に対するストレス損傷が関与する疾病及び状態の予防又は治療のための医薬組成物において、（ａ）セラミドと構造的に同一か又は類似した脂質部分をもつ脂質含有物質を、接合体が生きた細胞と接触した時点で脂質含有物質がセラミド活性化タンパク質ホスファターゼを活性化して細胞代謝のダウンレギュレーションをもたらすような形で、（ｂ）前記脂質含有物質を結合することのできるタンパク質、と接合させたもの、及び（ｃ）薬学的に受容可能な希釈剤又は担体、を含んで成る医薬組成物に関する。もう１つの形態においては、本発明は、細胞に対するストレス損傷が関与する疾病又は状態を予防又は治療する方法において、このような治療を必要としている患者に対して、（ａ）セラミドと構造的に同一か又は類似した脂質部分をもつ脂肪含有物質を、接合体が生きた細胞と接触した時点で脂質含有物質がセラミド活性化タンパク質ホスファターゼを活性化して細胞代謝のダウンレギュレーションを結果としてもたらすような形で、（ｂ）前記脂質含有物質を結合することのできるタンパク質、と接合させたものを有効量投与する段階を含んで成る方法に関する。さらにもう１つの形態では、本発明は、（ａ）セラミドと構造的に同一か又は類似した脂質部分をもつ脂質含有物質を、接合体が生きた細胞と接触した時点で脂質含有物質がセラミド活性化タンパク質ホスファターゼを活性化して細胞代謝のダウンレギュレーションを結果としてもたらすような形で、（ｂ）前記脂質含有物質を結合することのできるタンパク質、と接合したものの、細胞に対するストレス損傷が関与する疾病又は状態の予防又は治療のための薬剤の製造を目的とした利用に関する。発明の詳細な開示好ましい一実施形態においては、本発明の組成物は、脂質含有物質が接合されるタンパク質として、グリコシル化された形で28kD（還元条件下でSDS-PAGEにより決定されたもの）という見かけの分子量を有するヘパリン結合タンパク質(HBP )を含んでおり、このタンパク質は、多形核白血球のアズール顆粒の中で産生される。ヒト及びブタ由来の末梢好中性白血球から分離されたヘパリン結合タンパク質の共有結合構造は、最近になって決定された(H．Flodgaard et al.，Eur ．J．Bi ochem. 197，1991，pp535-547: J．Phol et al., FEBS Lett. 272，1990，p20 0 ff.参照)。ヒト及びブタのタンパク質は両方共、好中性エラスターゼに対する高い類似性を示すが、活性セリン195及びヒスチジン57の選択的突然変異のため( キモトリプシン番号付け(B．S．Hartley「セリンプロティナーゼにおける相同性」Phil ．Trans．Roy．Soc．Serie 257，1970，p77 ff))、タンパク質にはタンパク質分解酵素活性が欠如している。タンパク質は、ヘパリンに対するそれらの高い親和力のためそれぞれヒトヘパリン結合タンパク質（hHBP）及びブタヘパリン結合タンパク質（pHBP）と名付けられた。Schafer et al.（W．M．Schafer et a l.，Infect ．Immun. 53，1986，p651 ff.）は、タンパク質を、その抗菌活性のためカチオン性抗菌タンパク質(CAP37)と名付けている。このタンパク質は同様に1.3×10^-9Ｍ〜10^-8Ｍの範囲全体にわたり単球に対し走化性をもつことも示されており(H．A．Pereira et al.，J ．Chem． Invest ．85，1990，p1468 ff)，Flodgaard et al.,（前掲書中）から明らかな結果と一貫している。さらに、HBPは、単層培養の中で成長させられた細胞に添加された時点で内皮細胞及び線維芽細胞の剥離及び収縮を媒介するものであることが示されてきた。 HBPは同様に単球の生存及びトロンボスポンジン分泌をも刺激する(E．φstergaa rd及びH．Flodgaard，J ．Leukocyte Biol. 51，1992，p316 ff)。アズール顆粒から、アズロシジンと呼ばれるhHBP及び(AP37のものと同じ最初の20のＮ末端アミノ酸残基を伴うタンパク質も分離され（J．E．Gabay et al.，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 86 ，1989，p.5610 ff; C．G．Wilde et al.，J ．B iol．Chem．265 ，1990，p2038 ff）、その抗菌特性が報告された(D．Campanelli et al.，J ．Chem．Invest．85，1990，p904 ff)。好中性白血球内のhHBPの存在及び、白血球が食作用のあるStaph aureusである場合に（hHBPと同一である）CAP37の89％が放出される（H．A．Pereira et al. ，前掲書中）という事実は、このタンパク質が明らかに活性化された好中球から放出されることから、hHBPの１つの機能が炎症プロセスに対するその関与にあると考えられる、ということを表わしている。Pereira et al(前掲書中)は、CAP37 の機能が、それが特異的に単球をひきつけひいては第２の炎症波における単球の内向き流を担う要因の１つであり得る炎症部位におけるものである、ということを示唆した。φstergaard及びFlodgaard(前掲書中)は、単球の動員にとって重要であることに加えて、HBPは、好中球のメカニズムならびに単球の溢出において主要な役割を果たす可能性がある。好中性球白血球は、それがHBPを分泌する炎症性又は感染性部位に侵入する最初の細胞であることから、HBP媒介の細胞剥離及び同型凝集とそれに付隨する細胞代謝のダウンレギュレーションは、炎症又は感染中の細胞損傷に対するもう１つの防御メカニズムであり得る。ひとたび感染が一掃されると、HBPの作用により酸化ストレスを生きのびた基質細胞は、いつでも炎症性部位に再侵入できる状態となり、HBPにより部位にひきつけられた単球及びマクロファージから分泌されたサイトカイン及び成長因子の精巧なアレイによって組織化された切合プロセスに貢献する。 HBPの製造はWO89/08666及びH．Flodgaared et al.,(前掲書中)から明らかになる。HBPは、他のところではCAP37(WO91/00907参照)及びアズロシジン（C．G．Wi lde et al.，J ．Biol．Chem. 265，1990，p2038参照）。 HBPは、LPS又はセラミドであり得る脂質含有物質と合わさって、細胞代謝をダウンレギュレートすることができると現在考えられている。HBPに接合されたLPS は、HBPの強いヘパラン硫酸−結合モチーフのため、LPSレセプタCD14には結合しないが細胞表面には結合すると思われる。単球による好中球由来のHBPの急速な摂取の測定からの新しいデータは又、CD14とは全く異なる単球上のHBP特異的リガンドについても立証している(Heinzelmann，M et．al.，Critical Care，1996 年印刷中)。LPSはその後細胞膜中に合体され、細胞のシグナリング器官と接触し、究極的にセラミド活性化タンパク質ホスファターゼを活性化する。ホスファターゼの活性化は、今度は細胞代謝のダウンレギュレーションを導くことができる。この仮定を裏づけにして、Swiss 3T3細胞に対して分子に対するヘキサノイル基の添加により膜透過性を付与され水溶性にされた外因性セラミドを添加することによって、細胞の生活能力を保ちながら収縮、剥離及び同型凝集といった形態的変化が導かれることになる、ということが報告された。セラミドは、抗増殖性のアポプトシス経路の主要な調節因子そしてタンパク質トラフィッキング及び分泌の阻害物質であると思われ、これらの事象は、75kDのTNFαレセプタを介してのセラミド活性化タンパク質ホスファターゼのTNFαにより誘発された活性化と結びつけられた。（Y．A．Hannun，J ．Biol． Chem.269 ，1994，pp3125-3128参照）。LPSは、セラミド類似体として、同様に、 HBPに接合された時点でセラミド活性化されたタンパク質ホスファターゼを刺激するということが示唆されている。かくしてHBP及びLPS（又は類似の脂質含有物質）の接合体を調製することにより、炎症性部位での細胞増殖及び活性を阻害することによる（セラミド活性化タンパク質ホスファターゼの刺激によって媒介された）内皮細胞、平滑筋及び線維芽細胞の保護と、（単球中のセラミド活性化タンパク質キナーゼの刺激によって媒介される）細胞の必要なサイトカイン活性化防御の間のバランスを調整するために使用できる薬学組成物を提供することが可能である。このようなバランス調整は、細胞防御機構に利がなく害しかない条件下で必要とされ得る。細胞中の「休眠」表現型を結果としてもたらす炎症性フォーカスにおける内皮細胞、線維芽細胞及び平滑筋に対するHBP／LPSの直接的作用は、これらの細胞をストレス損傷から保護し、感染がひとたび一掃された時点で修復プロセスをいつでも受け継ぐことができる状態にこれらを保つことができる。 HBPは、適切には哺乳動物、特にヒト又はブタ由来のものであり得る。特にHBP は、配列番号１として配列リストの中に示されたアミノ酸配列をもつヒトHBPであるか、又は、配列番号２として配列リスト内に示されたアミノ酸配列を伴うブタHBP、又は、LPSの脂質Ａ部分を結合できるその機能的類似体又はペプチドフラグメントである。このような機能的類似体の例としては、未変性タンパク質のＣ又はＣ末端のいずれか又は両方に対する単数又は複数のアミノ酸残基の添加、未変性タンパク質のいずれか又は両方の末端における単数又は複数のアミノ酸残基の置換、未変性タンパク質のいずれか又は両方の末端又はアミノ酸配列中の単数又は複数の部位における単数又は複数のアミノ酸残基の欠失、又は、未変性アミノ酸配列内の単数又は複数の部位における単数又は複数のアミノ酸残基の挿入によって得られる未変性タンパク質の誘導体が含まれる。 HBPは、適切には、DK特許出願第1452／94で記述された方法によって調製でき、より特定的に言うと、HBPをコードするDNA配列は、立証済みの標準的方法、例えばS．L．Beaucage及びM．H．Caruthers, Tetrahedron Letters 22，1981，pp 1859-1869により記述されたホスフォアミダイト方法又はMatthes et al.，EMBO Journal ら、1984，p801〜805により記述された方法によって合成的に調製可能である。ホスフォアミダイト方法に従うと、オリゴヌクレオチドが、例えば自動DN A合成装置内で合成され、精製され、アニールされ、連結され、適当なベクター内でクローニングされる。 DNA配列は同様に、ゲノミック又はcDNAライブラリを調製し、例えば、標準的技術に従って（Sambrook et al.，分子クローニング；実験室マニュアル、第２版、Cold Spring Harbor，1989）合成オリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーションによりHBPの全て又は一部についてコードするDNA配列についてスクリーニングすることによって得られる。ゲノミック又はcDNA由来のものであってもよい。DNA配列は又、例えばUS4683202又はR．K．Saiki et al.，Scienc e 239 ，1988，p487〜49）に記述されているように、特定のプライマを用いてポリメラーゼ連鎖反応によっても調製可能である。このときDNA配列は、適切には組換え型DNA手順に付され得るあらゆるベクターであってよい組換え型発現ベクター内に挿入される。ベクターの選択は、導入されるべき宿主細胞によって左右される。従って、ベクターは自律的に複製するベクター、すなわち、染色体外の実体として存在し、その複製が染色体複製とは独立している、例えばプラスミドといったベクターであってよい。代替的にはベクターは、宿主細胞内に導入された時点で、宿主細胞ゲノム内に組込まれ、それが組込まれた染色体と共に複製されるようなベクターであってもよい。ベクター内では、HBPをコードするDNA配列は、適切なプロモータ配列に対し作動的に連結されていなくてはならない。プロモータは、選択された宿主細胞の中で転写活性を示すあらゆるDNA配列であってよく、宿主細胞と相同又は非相同のタンパク質をコードする遺伝子から誘導できる。哺乳動物の体内でHBPをコードするDNAの転写を導くのに適したプロモータの例としては、SV40プロモータ(Subr amani et al.，Mol ．Cell．Biol. １，1981，p854〜864)、MT−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモータ(Palmiter et al.，Science 222，1983，p809〜814) 又はアデノウイルス２主要晩期プロモータがある。昆虫細胞内で使用するための適切なプロモータはポリヘドリンプロモータである（Vasuvedan et al.，FEBS L ett ．311 ，1992，pp7-11）。酵母宿主細胞内で使用するための適切なプロモータとしては、酵母解糖遺伝子（Hitzeman et al.，J ．Biol．Chem. 255，1980，pp1 2073〜12080; Alber及びKawasaki，J ．Mol．Appl．Gen. １，1982，p419-434）又はアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(Young et al.，「化学薬品用の微生物の遺伝工学」 (Hollaender et al．eds.)，Plenum Press，New York，1982)からのプロモータ、又はTPI1(US4599311)又はADH2-4C(Russell et al.，Na ture 304 ，1983，p652-654)プロモータが含まれる。糸状真菌宿主細胞において使用するための適切なプロモータは、例えば、ADH3プロモータ（Mc Knight et a l.，The EMBO J．４，1985，pp2093〜2099）又はtpi Ａプロモータである。 HBPをコードするDNA配列は、同様に、ヒト成長ホルモンターミネータ(Palmite r et al.，前掲書中)又は（真菌宿主については）TP11（Alber and Kawasaki、前掲書中）又はADH3(McKnight et al.，op ．cit)プロモータといった適切なターミネータにも作動的に連結され得る。ベクターはさらに、ポリアデニル化シグナル（例えばSV40又はアデノウイルス5E1b領域から）、転写エンハンサ配列（例えばSV40エンハンサ）及び翻訳エンハンサ配列（例えばアデノウイルスVA RNAをコードするもの）といったような要素をさらに含んでいてよい。組換え型発現ベクターはさらに、ベクターが問題の宿主細胞の中で複製できるようにするDNA配列を含むことができる。このような配列（宿主細胞が哺乳動物細胞である場合）の一例は、SV40複製起点である。ベクターは同様に、選択可能なマーカー、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）についてコードする遺伝子といったような宿主細胞中の欠損をその産物が補足するような遺伝子、又は、ネオマイシン、ヒグロマイシン又はメトトレキセートといった薬物に対する耐性を付与する遺伝子を含む可能性がある。 HBPについてコードするDNA配列、プロモータ及びターミネータをそれぞれ連結し、それらを複写に必要な情報を含む適当なベクター内に挿入するのに用いられる手順は、当業者には周知のものである（例えば、Sambrook et al.,前掲書中参照）。発現ベクターが中に導入される宿主細胞は、HBPを産生することができるあらゆる細胞であってよく、好ましくは、例えばXeno pus laevis 卵母細胞又は哺乳動物細胞の無脊椎動物（昆虫）細胞又は脊椎動物細胞、特に昆虫及び哺乳動物の細胞といった真核性細胞である。適切な哺乳動物細胞系統の例は、COS(ATCC CRL 1650)，BHK（ATCC CRL 1632，ATCC CCL 10）又はCHO（ ATCC CCL 61）細胞系統である。哺乳動物細胞をトランスフェクションし、細胞内に導入されたDNA配列を発現する方法は、例えばKaufman and Sharp，J ．Mol． Biol．159 ，1982，pp.601-621; Southern and Berg, J ．Mol．Appl．Genet. １，1982，pp.327-341; Loyter et al., Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 79，19 82，pp.422-426; Wigler et al., Cell 14，1978，p.725; Corsaro and Pears on，Somatic Cell Genetics ７，1981，p.603，Graham and van der Eb，Virol ogy 52，1973，p.456; and Neumann et al., EMBO J ．１，1982，PP.841-84 5の中で記述されている。代替的には、宿主細胞として真菌細胞（酵母細胞を含む）を使用することもできる。適切な酵母細胞の例としては、Saccharomyces spp又はSchizosaccharomyc es spp．の細胞、特にSaccharomyces cerevisiaeの菌株が含まれる。その他の真菌細胞の例としては、Aspergillus spp又はNeurospara spp．などの糸状真菌の細胞、特に、Aspergillus oryzae又はAspergillus niger，菌株がある。タンパク質の発現のためのAspergillus sppの使用は、例えばEP238023の中に記述されている。細胞を培養するのに用いられる培地は、適切な補足物を含む血清含有又は無血清培地といったような哺乳動物細胞を成長させるのに適した従来のあらゆる培地、又は昆虫、酵母又は真菌細胞を成長させるための適切な培地であってよい。適切な培地は、商業的供給業者から入手でき、又公表された処方箋（例えばAmeric an Type Culture Collectionのカタログ中のもの）に従って調製できる。このとき細胞によって産生されたHBPは、遠心分離又はろ過により培地から宿主細胞を分離すること、塩、例えば硫酸アンモニウムを用いて上清又はろ液のタンパク様成分を沈殿させること、例えばイオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィなどのさまざまなクロマトグラフィ手順により精製することを含む従来の手順により、培地から回収され得る。本発明の好ましい実施形態においては、脂質含有物質はLPSである。本発明の組成の中に内含するのに適したLPSは、グラム陰性菌の細胞壁から得ることができる。代替的には、脂質含有物質は、LPSの脂質Ａ部分であり得る。脂質Ａは、脂質Ａの前駆物質である脂質Ｘを合成することによって適切に調製できる。脂質Ｋの合成については、I．Macher, Carbohydrate Res．162，1987，pp79〜84及びK．Ikeda et al., Chem ．Pharm．Bull．35 1987, pp1383〜1387の中で記述されている。脂質Ａは、P．L．Stuetz et al．「内毒素反応の細胞及び分子的側面」、Eds，A．Nowotny，J．J．Spitzer及びE．J．Ziegler，1990，pp.129〜145 に記述されているように、E．coliからの脂質Ａシンセターゼの粗調製物の存在下でUDP−脂質Ｘを反応させることによって合成される。さらに脂質含有物質はセラミドであり得る。セラミドは、リン酸セラミド及びガラクトシルセラミドといったような化合物を含む化学的にさまざまなクラスの生体分子であるスフィンゴ脂質のグループに属する。好ましいセラミドは以下のような構造をもつ。なお式中、Ｒ¹はα位置でヒドロキシル基で置換されるか又はω位置で飽和又は不飽和Ｃ₁ _6-30 脂肪酸によりエステル化され得る線状又は有枝Ｃ_14-30アルキルであり、Ｒ²′は、水素原子又はリン酸塩基であり；Ｒ³は、α位置で飽和されているか又はされていない、又はα位置でヒドロキシ基により置換されており任意には単数又は複数のＣ_1-14アルキル基により置換され得るＣ_15-26アルキルであるか、或いは、Ｒ³は、Ｆ，Cl及びBr又はメチルを含むヒドロキシル、ハロゲンによって置換され得るアリル基、好ましくはフェニル基であり；Ｒ⁴は、水素又はヒドロキシル基である。より好ましいセラミドは、という構造をもち、ここでＲ¹はＣ₁₄アルキル、Ｒ²は水素又はヒドロキシル又はリン酸塩基であり、Ｒ³はＣ₁₅−アルキル又はフェニルであり、Ｒ⁴は水素又はヒドロキシル基である。好ましいセラミドは、Ｎ−ヘクサノイルスフィンゴシン（Ｃ₆−セラミド）である。望まれる無水物形態の脂肪酸を伴うＤ−エリスロースピンゴシンのアシル化を用いる、P．Van Veldhoven et al., Anal ．Biochem. 183，1989，pp177-189の中に記述されているとおり、さまざまな鎖長の脂肪酸での炭素２（Ｒ¹）上での置換により、さまざまなセラミドを合成することができる。炭素３（Ｒ³，Ｒ⁴）での置換は、A．Bielawska et al., J ．Biol．Chem. 267，1992, pp18493〜18497及び A．Bielawska et al., J ．Biol．Chem. 268，1993，pp26226〜26232の中で記述されてきた。薬学組成物の中では、接合体は、例えばRemington's Pharmaceutical Science ，1985中に記述されているように薬学組成物の立証された方法のいずれかによって処方され得る。組成物は、標準的には、局所又は全射注射又は注入に適した形をしていてよく、従って、無菌水又は等張食塩水又はグルコース溶液と共に処方され得る。組成物は、当該技術分野において周知のものである従来の滅菌技術により滅菌できる。結果として得られた水溶液は、使用のため包装させるか又は無菌状態でろ過させ、凍結乾燥させることができ、凍結乾燥された調製物は、投与に先立ち無菌水溶液と組合わせる。組成物には、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなどの緩衝剤、浸透圧調整剤などといった薬学的に受容可能な補助物質を含むことができる。HBPの濃度は約0.5重量％未満、例えば１重量％から15〜20重量％に至るまで、大幅に変動し得る。組成物の単位用量には、標準的に約10mg〜約１ｇのHBPが含まれている可能性がある。本発明の薬学組成物は、炎症、ウイルス感染、虚血性再灌流症候群、細菌性内毒血症、敗血症、敗血症性ショック、播種性血管内凝固の治療といった治療的利用のため、又は単球の活性化により患者の免疫系を刺激するために、使用するのが有利であると考えられている。この目的で、治療すべき状態の重大さ及び患者の状態に応じて、体重１kgにつき１〜100mgの接合体という一日の用量が適当であると考えられている。本発明については、さらに、以下の例の中で証明されているが、この例は請求されているような発明の範囲をいかなる形であれ制限するよう意図されたものではない。例１．２重突然変異を受けたHBP(Cvs^26.42) HBP内のLPS結合部位は、２つのシステイン、Cys²⁶及びCys⁴²によりフランキングされている。HBP誘導体がLPSを結合できないようにするため、２つのシステインは、PCR突然変異誘発によってセリンに変えられた。Cys⁴²が変えられた突然変異誘発の第１ラウンドにおいて、トランスファ構成体pVL1392-HBPを鋳型として用いた。Pfuポリメラーゼ及び２対のプライマPBRa247 での２つのPCR反応において、各々突然変異を含む２つの重複するフラグメントが生成された。プライマPBRa246及びPBRa247での新しいPCR反応に対し、各フラグメントの10分の１を添加した。結果として得られた全長DNAフラグメントをBam HIで消化させ、正しい配位にてPVL1393内に連結した。配列決定によって突然変異誘発を確認し、トランスファ構成体をpVL1393-HBP-Cys⁴²と呼称した。同様にp VL1393-HBP-Cys⁴²内でCys²⁶を変えるため、２つの重複するプライマPBRa261（GG CAGGCACTTCTCCGGAGGTGCCCTGATC）及びPBRa262（GATCAGGGCACCTCCGGAGAAGTGCCTGC C）を、それぞれPBRa246及びPBRa247と共に、上述の通りのPCR突然変異誘発の新しいラウンドにおいて使用した。ここでも又、生成された全長DNAフラグメントをpVL1393のBam HI部位の中へクローニングし、配列決定（pVL1393-HBP-Cys^26.4 ² ）により突然変異を確認した。線形化されたAcRP23.lac ZバキュロウイルスDNA （Pharmingen，San Diego）及びpVL139 3-HBP-Cys^26.42とSF９昆虫細胞を同時トランスフェクションすることにより、２重突然変異を受けたHBP誘導体をコードする組換え型にバキュロウイルスを分離した。この２重突然変異を受けた形のHBPを産生するため、10％のFCSを伴う補足されたグレース培地(Gibco)の中で成長する３×10⁸のSF９細胞を遠心分離させ、１というMOI(感染多重度)を示すウイルス系統からの標本の中で再懸濁させた。ウイルスを伴う細胞を0.5ｌのBillcoスピナーフラスコ（＃1965-00500）に移し、２％のFCSを伴う補足された新鮮なグレースの培地を最終体積300mlとなるまで添加した。最後に、25mlの無菌0.9％NaCl内で加圧蒸気滅菌した1.5ｇのヘパリンセファロース（CL-6B，Pharmacia）を培養に添加した。培養を３日間27℃でインキュベートした。昆虫細胞培養からヘパリンセファロースビーズと分離するため、３分間300rpm で、Sorvall Instruments TECHNOSPINR遠心分離機の中で50ml入り管に収容した4 00mlの量を遠心分離させた。細胞を伴う上清を吸引によりとり除き、各々の管に添加された30mlの0.9％のNaClの中での再懸濁とそれに続く300rpmでの遠心分離により、残りの汚染性細胞から、ペぺレット化されたヘパリンセファロースビーズを分離した。最終的に、各管に添加された20mlの無菌0.5Ｍ NaClの中でビーズを洗浄した。次に、１本の50ml入り管内で少量の0.5Ｍの無菌NaCl（20〜30ml ）中にビーズを収集し、無菌ガラスフィルタ漏斗に移送した。ビーズを排出させ、HBP突然変異体を最終的に30mlの無菌の３ＭのNaClでビーズから流出させた。W O89/08666内に記述されている方法に従って、３Ｍの溶出物からHBP突然変異体を精製した。以下に記述される検定を用いてLPS結合能力についてHBP突然変異体材料をテストし、いかなるLPS結合も観察されなかった。 LPS結合能力にいついての検定ウシ血清アルブミン（Sigma St．Louis MO）１mg／ml, List Biological Lab oratories Inc．CA，USAの比活性1.45×10⁶dpm／ミリグラムの大腸菌（Escheric hia coli）K12 LCD25 Lot #5012Aからの4.5ピコモルの［³Ｈ］リポ多糖体及び０ pmol（対照）、35pmol，18pmol及び3.6pmolという量のHBP突然変異体を含む無菌 0.9％NaCl155μｌの中で、結合実験を行なった。水浴を用いて、混合物を37℃で 20分間インキュベートした。10μｌの量で各標本に対して10μｌのウサギポリクローナル抗HBP抗体を添加し、室温で60分間のインキュベーションを実施した。最後に、50μｌの量で各標本に対し、８mgのプロテインＡセファロース（Pharma cia Sweden）を添加した。室温で10分間のインキュベーションの後、５分間2000 λｇでセファロース／抗HBP抗体の複合体を振り落とし、ベータシンチレーションカウンタ(Packcard Instrument)の中で各標本からの100μｌの上清のアリコートを計数することにより、上清中の放射能を決定した。上清中に残っている計数値から、リポ多糖体の結合を、モル対モル反応を仮定して計算した。 φstergaard及びFlodgaard(前掲書中)により記述された通り、線維芽細胞及び内皮細胞上の細胞剥離及び同型凝集を媒介するその能力について、HBP突然変異体材料をテストした。いかなる効果も観察できず、このことはこれらの効果を媒介するためにはHBP とLPSの間の接合体が必要であるという考えを裏付けていた。例２．組換え型の野生型及びキメラHBP 組換え型のヒト野生型HBPを、昆虫細胞(SF９／BRL)内のバキュロウイルス発現系を用いて産生させた。前述の通りに（１）， HBPを精製した。分子の全体的ひだ形成を変えることなくHBP内の推定上のLPS結合を妨害することを目的として、キメラ形態のHBPを構築した。プロテアーゼといったようなキモトリプシン族内でaa26〜42(HBP番号付け)を包含するループはきわめて可変的である（２）。HBP内のエフェクタ部位は、同様にLPS結合部位（２）も含んでいるこのループの中にある、ということが示唆されてきた。Pereira et al（２）は、このループ内の保存されたシステインブリッジの重要性の他に、ループ内の最初のＣのすぐ前の配列QGRHF内のRHモチーフもLPS結合にとって重要であるということを示した。分子の全体的構造を混乱させることなくLPS結合の無い分子を作り出すため、同じ場所で極性の低いアミノ酸を含むループをもう１つのセリンプロテアーゼから導入させた。ブタのカリクレイン配列YSSPQからの必要条件を満たす。さらに、分子の残りの部分にこのループを充てんすることも、Portage Quantaプログラムを用いた分子モデリングから演繹すると、充分に適合すると思われる。かくして、キメラ形のHBPは、YSSPQで置換されたCys²⁶に先行する５つのアミノ酸QGRHF を有していた。内皮細胞培養ヒト腑静脈内皮細胞(HUVEC)を前述のもの（３）に幾分かの修正（４）を加えた形で、分離し培養した。簡単に言うと、臍帯をCa²⁺及びMg²⁺を含まないPBS中で収集し、細胞分離に至るまで４℃で貯蔵した。臍帯は24時間以内に使用された。37℃で70Ｕ／mlの最終濃度でPBS中に希釈されたコラゲナーゼを用いてインキュベートする前に、Ca²⁺及びMg²⁺を含まないPBSで静脈を洗った。放出された細胞を遠心分離し、ウシ胎児血清（８％）、子ウシ血清（８％）、ヘパリン（16Ｕ／ml）、内皮細胞成長補足物（25μｇ／ml）及び抗生物質（ペニシリン83Ｕ／ml 、ストレプトマイシン83μｇ／ml及びフンギゾン83μｇ／ml）で補足された培地199中に懸濁させ、PBS中の２％のゼラチンで予めコーティングされた83cm²入りのフラスコの中に播種した。３〜７日間の培養の後、トリプシン−EDTA(0.05％：0.5mM)を用いて細胞を剥離させ、48ウェル付き平板内に播種した。いくつかの実験では、細胞を48ウェルの平板に播種する前に一回通過させる。丸石形態を表わした時点で、細胞を使用した。無傷細胞中のタンパク質リン酸化反応 48ウェルの平板中で成長した集密的HUVECを、pH7.4でグルコース(5.56mM)，Na Cl(117.2mM)，CaCl₂(1.8mM)，MgCl₂(0.81mM)，KCl(5.36mM)，NaHCO₃（17.9mM）及びHEPES(10mM)から成る、リン酸塩を含まない緩衝液で２回洗浄し、その後37 ℃で30分間熱で不活性化された10％のヒト血清で補足されたリン酸塩を含まない緩衝液中で25μのCi³²PO₄と共にインキュベートした。HUVECに試薬を添加し、さらに30分間インキュベートさせた。10％のジメチルスルホキシドの中にオカダイン酸を希釈させ、0.16％のジメチルスルホキシド中に１μＭのオカダイン酸という最終濃度で使用した。エタノール：ドデカン（98.2ｖ／ｖ）の中でセラミドを溶解させ、エタノールとドデカンの最終濃度はそれぞれ0.98％及び0.02％であった。不活性化された血清の最終濃度は、全てのインキュベーションにおいて10％であった。実験の終りで、HUVECをリン酸塩を含まない氷冷緩衝液で２回、氷冷P BSで１回洗浄した。５％のSDSを含む電気泳動標本緩衝液(190μｌ)(14)を、ウェルに添加し、振とう装置上で室温で一晩HUVECを溶解させた。 ³²PO₄ で標識づけされたタンパク質の分離及び分析 ³²PO₄で標識づけされたタンパク質をｐ−メルカプトエタノール（５％）で還元し、4〜16％のSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）で分離させた（５）。電気泳動ゲルをクーマシーブルーで染色し、Ｘ線フィルム又はFuji結像板に露呈させた。18−90のMr範囲をもつ支配的な放射性タンパク質の定量分析を、Biolmaging Analizer Bas2000（Fuj i Photo Film Co．Ltd.，Tokyo，Japan）上でFuji結像板に露呈されたゲル上で行なった。対照の百分率として放射能を表わした。選択されたタンパク質バンド内の放射能の平均的変化（３〜７つの異なるタンパク質の間）を計算した。キメラHBPのLPS結合能力 LPSに対し結合する野生型HBPの親和力については、すでに示されてきた（６）。マイクロタイタープレート上に固定されたLPSに対するキメラ及び野生型HBPの結合は、Tokias et al（７）により以前に前述された手順を修正して行なわれた。簡単に言うと、マイクロタイタープレートを一晩37℃で、50mMのホウ酸塩(pH9 .0)と20mMのEDTAの中の１ウェルにつき４μｇのLPSでコーティングした。非特異的結合を決定するため、コーティングされていないウェルに対するHBPの結合を含み入れた。プレートを大量の精製脱イオン水で洗い、37℃で乾燥させ、次に発熱物質を含まないPBS中で調製された５mg／mlの非常に低い内毒素ウシ血清アルブミンを用いて37℃で30分間遮断した。次に、発熱物質を含まない50mMのトリス (pH7.4)，500mMのNaCl，１mg／mlの非常に低い内毒素ウシ血清アルブミン及び0. 05％のTween-20から成る検定緩衝液内でプレートを４回洗浄した。それぞれ5322 及び5445cpm／ng HBPの比活性をもつ野生型組換え型〔¹²⁵Ｉ〕HBP及びキメラ〔¹ ²⁵ Ｉ〕HBPを、１ウェルにつき100μｌの合計量で指示された濃度で検定緩衝液中で希釈し、ウェルに添加した。37℃で１時間のインキュベーションの後、プレートを検定緩衝液中で３回洗浄し、各々に対し100μｌの20％SDSを添加し、次に室温で10分間充分振とうした。γ−カウンタ(Pack and Instrument)内でSDS溶液の放射能を検定した。野生型HBPとは対照的に、わずかな量のキメラHBPしか、固定化されたLPSに結合しなかった（図１）。統計分析実験グループ間の差異の意味を見極めた。Kruskal-Wallisの一方向分散分析とそれに続くMann-Whitney U試験を用いた順位多重比較又はMann-Whitney U試験のみによってデータを検討した。結果は算術平均＋／−SDとして示されている。0. 05未満のＰ値が、統計的に有意なものとみなされた。 LPS結合が欠如したキメラHBP 我々は、以前に野生型HBPがLPS(６)を結合させることを示してきた。タンパク質のリン酸化に対するHBPの効果にとってHBPに対するLPSの結合が重要であるか否かを調査するため、キメラHBPを構築したがこれはLPSを結合させることができなかった（図１）。野生型HBPとは対照的に、キメラHBPは、内皮細胞内タンパク質リン酸化を減少させず（図２）、これは、HBP内の無傷のLPS結合ドメインが実際、タンパク質リン酸化に対する効果にとって不可欠であったことを示している。野生型HBP(50μｇ／ml）によって誘発されるタンパク質リン酸化の低下は、キメラHBP(50μｇ／ml)及び対照（ｎ＝４，ｐ＝0.0209）の両方と著しく異なるものであった。これらの実験は、オカダイン酸（１μＭ）の存在下で行なわれたが、オカダイン酸の不在下でも類似の結果が観察された（データ示さず）。図１、キメラHBPはリポ多糖体に結合しなかった。１時間マイクロタイタープレート上で固定されたLPSに対する¹²⁵Ｉで標識づけされた野生型及びキメラHBP の結合を、全く同一に調査した。野生型HBPは、用量依存式にLPSに結合したのに対し、LPSに対するキメラHBPの結合は極くわずかしか見られなかった。図は、１つの実験からの全く同一のウェル内の平均結合を示す。図２、リポ多糖体結合能力が欠如しているキメラHBPは、タンパク質リン酸化を減少させることができなかった。内皮細胞を30分間³²PO₄で標識づけし、その後さらに30分間、指示された濃度の野生型HBP又はキメラHBPと組合わせたオカダイン酸又はオカダイン酸単独（１μＭ）でインキュベートした。4〜16％のSDS-P AGEにより放射性タンパク質を分離し、Phospho-Imagerにより分析した。４つの個々の実験の平均±SDが示されている。結果は、キメラHBPが野生型HBPとは対照的にタンパク質リン酸化を減少させることができなかったことを示している（図６Ｂ）。Kruskal-Wallis試験の後でMann-Whitney U試験が行なわれ、野生型HBP( 50μｇ／ml)は、キメラHBP(50μｇ／ml)と対照（ｎ＝４，Ｐ＝0.0209）の両方と著しく異なっていた。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年４月２９日【補正内容】請求の範囲１．細胞に対するストレス損傷が関与する疾病及び状態の予防又は治療のための医薬組成物において、（ａ）セラミドと構造的に同一か又は類似した脂質部分をもつ脂質含有物質を、（ｂ）前記脂質含有物質を結合することのできるヘパリン結合タンパク質(HBP) と接合させたもの及び（ｃ）薬学的に受容可能な希釈剤又は担体を含んで成り、この接合体が、生きた細胞と接触した時点で脂質含有物質がセラミド活性化タンパク質ホスファターゼを活性化して細胞代謝のダウンレギュレーションを結果としてもらたらす、医薬組成物。２．脂質含有物質が接合されるタンパク質が、グリコシル化された形で28kD（還元性条件下でSDS-PAGEにより決定されるもの）の見かけの分子量をもつヘパリン結合タンパク質(HBP)であり、このタンパク質は多形核白血球のアズール顆粒の中で産生される、請求項１に記載の組成物。３．ヘパリン結合タンパク質がヒトHBPである請求項２に記載の組成物。４．配列番号１として配列リストに示されているアミノ酸配列、又は脂質含有物質を結合することのできるその類似体をHBPが有している請求項３に記載の組成物。５．ヘパリン結合タンパク質がブタのHBPである、請求項２に記載の組成物。６．配列番号２として配列リストに示されているアミノ酸又は脂質含有物質を結合できるその類似体をHBPが有している請求項５に記載の組成物。７．脂質含有物質がリポ多糖体(LPS)である請求項１に記載の組成物。８．脂質含有物質がLPSの脂質Ａ部分である請求項１に記載の組成物。９．脂肪含有物質がセラミドである請求項１に記載の組成物。ここでＲ¹が、炭素原子14個の鎖長を伴うアミド結合した脂肪酸であり、Ｒ²は水素又はヒドロキシル又はリン酸塩基であり、Ｒ³はＣ₁₅−アルキル又はフェニルであり、Ｒ⁴は水素又はヒドロキシル基である、請求項９に記載の組成物。ここで、Ｒ¹はα位置でヒドロキシル基で置換されるか又はω位置で飽和又は不飽和Ｃ₁ _6-30 脂肪酸によりエステル化され得る線状又は有枝Ｃ_14ー30アルキルであり、Ｒ²′は、水素原子又はリン酸塩基であり；Ｒ³は、α位置で飽和されているか又はされていない、又はα位置でヒドロキシ基により置換されており任意には単数又は複数のＣ_1-14アルキル基により置換され得るＣ_15-26アルキルであるか、或いは、Ｒ³は、Ｆ，Cl及びBr又はメチルを含むヒドロキシル、ハロゲンによって置換され得るアリル基、好ましくはフェニル基であり；Ｒ⁴は、水素又はヒドロキシル基である、請求項９に記載の組成物。 12．細胞に対するストレス損傷が関与する疾病又は状態を予防又は治療する方法において、このような治療を必要としている患者に対して（ａ）セラミドと構造的に同一か又は類似した脂質部分をもつ脂肪含有物質を、接合体が生きた細胞と接触した時点で脂質含有物質がセラミド活性化タンパク質ホスファターゼを活性化して細胞代謝のダウンレギュレーションを結果としてもたらすような形で、（ｂ）前記脂質含有物質を結合することのできるタンパク質、と接合させたものを有効量投与する段階を含んで成る方法。 13．脂質含有物質が接合されるタンパク質が、グリコシル化された形で28kD（還元性条件下でSDS-PAGEにより決定されるもの）の見かけの分子量をもつヘパリン結合タンパク質(HBP)であり、このタンパク質は多形核白血球のアズール顆粒の中で産生される、請求項12に記載の方法。 14．ヘパリン結合タンパク質がヒトHBPである請求項13に記載の方法。 15．配列番号１として配列リストに示されているアミノ酸配列、又は脂質含有物質を結合することのできるその類似体をHBPが有している請求項14に記載の方法。 16．ヘパリン結合タンパク質がブタのHBPである、請求項13に記載の方法。 17．配列番号２として配列リストに示されているアミノ酸又は脂質含有物質を結合できるその類似体をHBPが有している請求項16に記載の方法。 18．脂質含有物質がリポ多糖体(LPS)である請求項12に記載の方法。 19．脂質含有物質がLPSの脂質Ａ部分である請求項12に記載の方法。 20．脂肪含有物質がセラミドである請求項12に記載の方法。ここでＲ¹が、炭素原子14個の鎖長を伴うアミド結合した脂肪酸であり、Ｒ²は水素又はヒドロキシル又はリン酸塩基であり、Ｒ³はＣ₁₅−アルキル又はフェニルであり、Ｒ⁴は水素又はヒドロキシル基である、請求項20に記載の方法。 22．炎症、ウイルス感染、虚血性再灌流症候群、敗血症、敗血症性ショック、播種性血管内凝固症候群の予防又は治療のため、又は患者の免疫系を刺激するための請求項12〜21のいずれか１項に記載の方法。 23．タンパク質と脂質含有物質の接合体の有効量が、体重１kgにつき約１mg〜約100mgの範囲内にある請求項12〜22のいずれか１項に記載の方法。 24．（ａ）セラミドと構造的に同一か又は類似している脂質部分をもつ脂質含有物質を（ｂ）前記脂質含有物質を結合することのできるヘパリン結合タンパク質(HBP) 、と結合させたものの、細胞に対するストレス損傷が関与する疾病又は状態の予防又は治療のための薬剤の製造を目的とした利用であって、この接合体が、生きた細胞と接触した時点で脂質含有物質がセラミド活性化タンパク質ホスファターゼを活性化して細胞代謝のダウンレギュレーションを結果としてもたらす、利用。 25．脂質含有物質が接合されるタンパク質が、グリコシル化された形で28kD（還元性条件下でSDS-PAGEにより決定されるもの）の見かけの分子量をもつへパリン結合タンパク質(HBP)であり、このタンパク質は多形核白血球のアズール顆粒の中で産生される、請求項24に記載の利用。 26．ヘパリン結合タンパク質がヒトHBPである請求項25に記載の利用。 27．配列番号１として配列リストに示されているアミノ酸配列、又は脂質含有物質を結合することのできるその類似体をHBPが有している請求項26に記載の利用。 28．ヘパリン結合タンパク質がブタのHBPである、請求項25に記載の利用。 29．配列番号２として配列リストに示されているアミノ酸又は脂質含有物質を結合できるその類似体をHBPが有している請求項28に記載の利用。 30．脂質含有物質がリポ多糖体(LPS)である請求項24に記載の利用。 31．脂質含有物質がLPSの脂質Ａ部分である請求項24に記載の利用。 32．脂肪含有物質がセラミドである請求項24に記載の利用。ここでＲ¹が、炭素原子14個の鎖長を伴うアミド結合した脂肪酸であり、Ｒ²は水素又はヒドロキシル又はリン酸塩基であり、Ｒ³はＣ₁₅−アルキル又はフェニルであり、Ｒ⁴は水素又はヒドロキシル基である、請求項32に記載の利用。 34．炎症、ウイルス感染、虚血性再灌流症候群、敗血症、敗血症性ショック、播種性血管内凝固症候群の予防又は治療のため、又は患者の免疫系を刺激するための請求項24〜33のいずれか１項に記載の利用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 47/48 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＹＣ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＡ６１Ｋ 37/54 ＡＤＺＣ１２Ｐ 21/02 ＡＢＮ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．細胞に対するストレス損傷が関与する疾病及び状態の予防又は治療のための薬学組成物において、（ａ）セラミドと構造的に同一か又は類似した脂質部分をもつ脂質含有物質を、接合体が生きた細胞と接触した時点で脂質含有物質がセラミド活性化タンパク質ホスファターゼを活性化して細胞代謝のダウンレギュレーションを結果としてもたらすような形で、（ｂ）前記脂質含有物質を結合することのできるタンパク質、と接合させたもの、及び（ｃ）薬学的に受容可能な希釈剤又は担体、を含んで成る薬学組成物。２．脂質含有物質が接合されるタンパク質が、グリコシル化された形で28kD（還元性条件下でSDS-PAGEにより決定されるもの）の見かけの分子量をもつヘパリン結合タンパク質(HBP)であり、このタンパク質は多形核白血球のアズール顆粒の中で産生される、請求項１に記載の組成物。３．ヘパリン結合タンパク質がヒトHBPである請求項２に記載の組成物。４．配列番号１として配列リストに示されているアミノ酸配列、又は脂質含有物質を結合することのできるその類似体をHBPが有している請求項３に記載の組成物。５．ヘパリン結合タンパク質がブタのHBPである、請求項２に記載の組成物。６．配列番号２として配列リストに示されているアミノ酸又は脂質含有物質を結合できるその類似体をHBPが有している請求項５に記載の組成物。７．脂質含有物質がリポ多糖体(LPS)である請求項１に記載の組成物。８．脂質含有物質がLPSの脂質Ａ部分である請求項１に記載の組成物。９．脂肪含有物質がセラミドである請求項１に記載の組成物。ここでＲ¹が、炭素原子14個の鎖長を伴うアミド結合した脂肪酸であり、Ｒ²は水素又はヒドロキシル又はリン酸塩基であり、Ｒ³はＣ₁₅−アルキル又はフェニルであり、Ｒ⁴は水素又はヒドロキシル基である、請求項９に記載の組成物。ここで、Ｒ¹はα位置でヒドロキシル基で置換されるか又はω位置で飽和又は不飽和Ｃ₁ _6-30 脂肪酸によりエステル化され得る線状又は有枝Ｃ_l4-30アルキルであり、Ｒ²′は、水素原子又はリン酸塩基であり；Ｒ³は、α位置で飽和されているか又はされていない、又はα位置でヒドロキシ基により置換されており任意には単数又は複数のＣ_1-14アルキル基により置換され得るＣ_15ー26アルキルであるか、或いは、Ｒ³は、Ｆ，Cl及びBr又はメチルを含むヒドロキシル、ハロゲンによって置換され得るアリル基、好ましくはフェニル基であり；Ｒ⁴は、水素又はヒドロキシル基である、請求項９に記載の組成物。 12．細胞に対するストレス損傷が関与する疾病又は状態を予防又は治療する方法において、このような治療を必要としている患者に対して（ａ）セラミドと構造的に同一か又は類似した脂質部分をもつ脂肪含有物質を、接合体が生きた細胞と接触した時点で脂質含有物質がセラミド活性化タンパク質ホスファターゼを活性化して細胞代謝のダウンレギュレーションを結果としてもたらすような形で、（ｂ）前記脂質含有物質を結合することのできるタンパク質、と接合させたものを有効量投与する段階を含んで成る方法。 13．脂質含有物質が接合されるタンパク質が、グリコシル化された形で28kD（還元性条件下でSDS-PAGEにより決定されるもの）の見かけの分子量をもつヘパリン結合タンパク質(HBP)であり、このタンパク質は多形核白血球のアズール顆粒の中で産生される、請求項12に記載の方法。 14．ヘパリン結合タンパク質がヒトHBPである請求項13に記載の方法。 15．配列番号１として配列リストに示されているアミノ酸配列、又は脂質含有物質を結合することのできるその類似体をHBPが有している請求項14に記載の方法。 16．ヘパリン結合タンパク質がブタのHBPである、請求項13に記載の方法。 17．配列番号２として配列リストに示されているアミノ酸又は脂質含有物質を結合できるその類似体をHBPが有している請求項16に記載の方法。 18．脂質含有物質がリポ多糖体(LPS)である請求項12に記載の方法。 19．脂質含有物質がLPSの脂質Ａ部分である請求項12に記載の方法。 20．脂肪含有物質がセラミドである請求項12に記載の方法。ここで、Ｒ¹が、炭素原子14個の鎖長を伴うアミド結合した脂肪酸であり、Ｒ²は水素又はヒドロキシル又はリン酸塩基であり、Ｒ³はＣ₁₅−アルキル又はフェニルであり、Ｒ⁴は水素又はヒドロキシル基である、請求項20に記載の方法。 22．炎症、ウイルス感染、虚血性再灌流症候群、敗血症、敗血症性ショック、播種性血管内凝固症候群の予防又は治療のため、又は患者の免疫系を刺激するための請求項12〜21のいずれか１項に記載の方法。 23．タンパク質と脂質含有物質の接合体の有効量が、体重１kgにつき約１mg〜約100mgの範囲内にある請求項12〜22のいずれか１項に記載の方法。 24．（ａ）セラミドと構造的に同一か又は類似した脂質部分をもつ脂質含有物質を接合体が生きた細胞と接触した時点で脂質含有物質がセラミド活性化タンパク質ホスファターゼを活性化して細胞代謝のダウンレギュレーションを結果としてもたらすような形で、（ｂ）前記脂質含有物質を結合することのできるタンパク質、と接合したものの、細胞に対するストレス損傷が関与する疾病又は状態の予防又は治療のための薬剤の製造を目的とした利用。 25．脂質含有物質が接合されるタンパク質が、グリコシル化された形で28kD（還元性条件下でSDS-PAGEにより決定されるもの）の見かけの分子量をもつヘパリン結合タンパク質(HBP)であり、このタンパク質は多形核白血球のアズール顆粒の中で産生される、請求項24に記載の利用。 26．ヘパリン結合タンパク質がヒトHBPである請求項25に記載の利用。 27．配列番号１として配列リストに示されているアミノ酸配列、又は脂質含有物質を結合することのできるその類似体をHBPが有している請求項26に記載の利用。 28．ヘパリン結合タンパク質がブタのHBPである、請求項25に記載の利用。 29．配列番号２として配列リストに示されているアミノ酸又は脂質含有物質を結合できるその類似体をHBPが有している請求項28に記載の利用。 30．脂質含有物質がリポ多糖体(LPS)である請求項24に記載の利用。 31．脂質含有物質がLPSの脂質Ａ部分である請求項24に記載の利用。 32．脂肪含有物質がセラミドである請求項24に記載の利用。ここで、Ｒ¹が炭素原子14個の鎖長を伴うアミド結合した脂肪酸であり、Ｒ²は水素又はヒドロキシル又はリン酸塩基であり、Ｒ³はＣ₁₅−アルキル又はフェニルであり、Ｒ⁴は水素又はヒドロキシル基である、請求項32に記載の利用。 34．炎症、ウイルス感染、虚血性再灌流症候群、敗血症、敗血症性ショック、播種性血管内凝固症候群の予防又は治療のため、又は患者の免疫系を刺激するための請求項24〜33のいずれか１項に記載の利用。