JPH11501656A - 腫瘍を処置する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ドナーリンパ球をアロ活性化するのに十分な条件下で、患者由来のリンパ球の存在下で同時培養された同種異系ドナーリンパ球の患者への投与によって、腫瘍を有する哺乳動物患者の処置のための方法を提供する。ドナーリンパ球は、病変内に導入されることが望ましい。本方法は、ヒトにおける神経膠芽腫の処置に好ましい。

Description

【発明の詳細な説明】 腫瘍を処置する方法 発明の背景 本出願は、1995年３月17日出願の米国特許出願第08/406,388号の一部継続出願 である。 １．発明の分野 本発明は、腫瘍細胞増殖を阻害する方法に関する。さらに詳細には、本発明は 、腫瘍に対して免疫学的に応答する患者の能力を増強することによる腫瘍細胞増 殖を阻害する方法に関する。 ２．関連技術の記載 古典的な治療法は、高度の脳腫瘍（例えば、神経膠芽腫）および多くの他のタ イプの腫瘍（例えば、全身性黒色腫）、ならびに頭部および首部のガンを有する 患者の症状をほとんど改変できずに行われてきた。切除可能な一次腫瘍を有する 患者は、一般に、手術、化学療法、または放射線照射後、１年以内に腫瘍の再発 を経験している。これらの腫瘍は、しばしば、さらなる従来の治療法を施しても または施さなくても、迅速に進行する。従って、これらの致命的な腫瘍について の新規の様式の治療法の開発が必要とされる。 ガン治療の新規のファミリーは、免疫療法に基づいて近年発達した。一般に、 腫瘍免疫療法は、２つのアプローチのうちの１つを利用する：１）腫瘍を攻撃す るように患者の免疫系を活性化するために、種々の技術を利用する；または２） 患者のリンパ系細胞を取り出し、そしてインビトロ技術によって活性化させて抗 ガン活性を生じさせ、次いで、活性化させた細胞を、患者に全身的に再導入させ た。これらの種々のタイプの免疫療法の臨床的効果は、異なるガンのタイプを有 する患者で評価される。しかし、これら両方のタイプの免疫療法に関連する主要 な問題の１つは、免疫療法剤が全身投与された場合に観察された毒性である。こ の毒性を回避するために開発された方法は、免疫療法剤の病変内(intralesional )投与（例えば、腫瘍内に直接注射する）である。ガン患者に対する免疫療法の 種々の形態の病変内投与は、免疫剤の全身投与に見られる毒性を生じない(M．Fl etcherら、Lymphokine Res．６:45、1987; H.Rabinowichら、Cancer Res．47: 1 73、1987; S.A．Rosenbergら、Science 233:1318、1989;およびG．Pizzら、Int. J．Cancer 34:359、1984)。 最近の研究は、異なるサイトカインを分泌するように遺伝子操作された腫瘍細 胞での動物の免疫化が、治療的免疫応答の誘発を増強することを示した。サイト カインは、複雑な一連の反応を誘発すると考えられている。この一連の反応は、 以下の工程を包含する：a)腫瘍抗原の増加された発現；b)宿主リンパ系細胞によ る腫瘍の炎症および浸潤；c)腫瘍特異性免疫の誘発；およびd)腫瘍を破壊する非 特異性および特異性の両方の宿主抗腫瘍エフェクター機構の活性化。しかし、こ の技術は、最終的に有用であると証明され得る。しかし、この技術は極めて高価 で、かつ時間を要するので、その適用は限られ得る。 実験動物（主にマウス）における研究は、腫瘍内のサイトカインの慢性的放出 が、宿主の抗腫瘍応答および腫瘍緩解を誘発し得ることを示す。サイトカイン( 例えば、インターロイキン２(IL-2)、腫瘍壊死因子(TNF)、およびインターフェ ロンγ(INF-γ))の病変内反復注射が、皮膚肉腫の緩解を引き起こすことが示さ れている(S.P.Creekmoreら、Resident and Staff Physician 34:23-31、1988；P ．Greenbergら、Basic and Tumor Immunology(R.Herberman編)p.302、1983；E． Grimmら、Lymphokines、9:279-311、1984；G．Forniら、Lymphokines 14: 335-3 60、1987)。サイトカイン(例えば、IL-2、IL-4、TNF、および顆粒性単核白血球 コロニー刺激因子(Granulocyte Monocyte Colony Stimulating Factor)(GM-CSF) )を分泌するように遺伝子操作された動物腫瘍細胞の腫瘍内への注射が、宿主抗 腫瘍免疫を誘発することもまた示されている(E.Feronら、Cell 60、397-403、19 90；P.Galumbekら、Science 254：713-716、1991；A.Ascherら、J．of Immunol ．146：3227-3234、1991)。これらの後者の結果は、以前に非免疫原性であると 考えられていた腫瘍の処置においてさえも、得られた。 J.M.Reddら(Cancer Immunology and Immunotherapy 34(5):349、1992)は、ラ ットにおいて、ドナー同種異系抗原に対して感作した同種異系リンパ球が、９Ｌ 神経膠芽腫を有するラットの脳内に同時注射した場合、腫瘍形成を阻害し得るこ とを示した。別の研究において、ウイスターラット由来の正常脾臓細胞および同 種免疫脾臓細胞の両方を、フィッシャーラットの樹立された６日目のＴ９脳腫瘍 中に注射した。フィシャー同種異系抗原に対して以前に免疫化したウイスターラ ット由来の正常なウイスター脾臓細胞の病変内注射は、フィシャーラットの50％ で腫瘍を治癒した。それに対して、未処理の動物および非レスポンダー動物は、 30日以内に死亡した。生存者は完全に正常に見え、そして正常なラット中の同種 異系細胞の頭蓋内注射によって、３ヵ月にわたって挙動または生存において検出 可能な変化は起こらなかった。処置された腫瘍保有動物由来の脳の組織病理学的 試験は、以下を示した：ａ）単核細胞の浸潤（広範囲の腫瘍壊死、２〜４日目で 開始し、15日目までには全ての腫瘍が破壊する）；または２）細胞浸潤（初期の 腫瘍の破壊後、腫瘍再増殖が進行し動物が死滅する)。正常脳組織において損傷 のないことは、これらの動物においていつでも明らかであった。腫瘍緩解動物は 、全身免疫を発達させた。なぜなら、それらは、生存可能な腫瘍での頭蓋内再チ ャレンジに全体的に耐性であることが分かったからである。ラットにおけるこれ らの結果は興味深いが、非常に関連性のない種（例えば、ヒト）において見られ る理論的な予測におけるそれらの値は、特に、腫瘍に対する免疫学的応答に関し て存在するかなりの種の相違点を考慮すると非常に問題となる。 局在化し、かつ外科的にアクセス可能な腫瘍を有するヒト神経膠腫患者は、病 変内免疫療法の論理上の候補である。神経膠腫を有する成人患者における多施設 第I相研究は、IL-2を用いてインビトロで活性化した自家移植の末梢血リンパ球 の腫瘍内移植の利用が報告されている。臨床的効果はほとんど認められない一方 で、ネガティブな副作用はほとんど無く、そして過剰なレベルのIL-2が細胞と共 に同時投与された場合でのみ起こった(K.S.Jacobsら、Cancer Res.、47: 2101、 1986；R.Merchantら、Neurosurgery 23：725、1988)。これらの患者の研究は、 生存がサイトカインTNFを分泌する移植細胞の能力に直接関連することを示した 。血清または嚢腫液中およびこれらの患者由来の腫瘍の一次培養物中のTNFおよ びIL-1の両方についてのインヒビターの発見は、腫瘍細胞が、宿主抗腫瘍応答を ブ ロックする薬剤で囲まれていることを示唆する。これらのインヒビターは、サイ トカイン活性化移植細胞に、その破壊を引き起こすのに十分長く腫瘍中の活性を 残存させるのを妨げ得る。この概念は、ラットにおける脳腫瘍研究における発見 によって支持される。IL-2活性リンパ系細胞が、それぞれウイスターラットおよ びフィシャーラットのＣ６およびＴ９神経膠腫脳腫瘍中に移植された場合、組織 病理学的試験は、移植されたIL-2活性化リンパ系細胞が、４〜６日目の腫瘍部位 にのみ残存することを示した(W.Carsonら、J．of Immunotherapy 10(2):131-140 、1991)。 同種異系リンパ系細胞で処置された動物において腫瘍緩解を引き起こす操作可 能な機構は、腫瘍部位における移植片対宿主および宿主対移植片反応を包含する 。これらの強力な免疫学的反応は、腫瘍における高レベルの内因性サイトカイン 産生を刺激し得、局所的レベルのサイトカインインヒビターを克服し得、そして 浸潤、補充、ならびに特異的および非特異的両方の宿主抗腫瘍活性の活性化をお そらく刺激し得る。腫瘍緩解動物は、腫瘍の再チャレンジに対して耐性であるこ とが見出された。しかし、同様の方法に基づくどの処理が、ヒト腫瘍の処置にお いて効果的であると考えられるのに十分に、ヒト被験体において同様の結果を達 成し得るかどうかは、これまで知られていなかった。 従って、先行技術の限界を考慮すると、哺乳動物腫瘍を処置する新規でかつよ り良好な方法が必要とされる。特に、腫瘍内免疫療法の新規な方法は、個々の固 体腫瘍の緩解が救命となり得るヒトガン患者に必要とされる。 発明の要旨 本発明は、哺乳動物において腫瘍を阻害する方法を提供する。本発明の一般的 な実行において、腫瘍患者の末梢血単核細胞(peripheral blood mononuclear ce ll)(PBMC)をインビトロで同時培養し、正常なドナー（好ましくは、同種異系ド ナー)由来の健全なリンパ球との混合リンパ球細胞反応を誘発する。好ましくは 、正常なリンパ球は、腫瘍患者に関連しないドナー由来であり、そして好ましく は、正常なリンパ球は、全血から白血球搬出法により得られる。同時培養中、同 種異系ドナーのリンパ球は、患者の同種異系抗原に対して特に活性化される。本 明細書中において、混合リンパ球培養により生成された生きたアロ活性化ドナー リンパ球と患者リンパ球との混合物を「MLC」という。MLC活性化細胞は、インビ トロにおいて一次免疫応答を誘発することが示されているサイトカインの混合物 を産生する。例えば、神経膠芽腫の処置において、患者はヒトであり、そしてア ロ活性化リンパ球は、一次腫瘍部位で患者の脳に外科的に移植され(必要に応じ てMLC混合物として、同時培養由来の患者のPBMCと共に)、自家移植の腫瘍細胞を 攻撃するように患者の免疫系を誘発する。他のタイプの腫瘍の処置においては、 MLCは腫瘍部位、転移部位、または体腔（例えば、腹膜）に注入される。必要に 応じて、神経膠芽腫以外の腫瘍の処置においては、MLCは末梢(例えば、非一次的 腫瘍部位)に投与される。 本発明の１つの実施態様において、患者由来のリンパ球との同時培養によって 得られるアロ活性化ドナーのリンパ球を、MLC混合物より単離し、そして(例えば 、外科的に除去される腫瘍の付近に)腫瘍の再発に対する防御を所望する、また は手術不能の腫瘍の処置を所望する患者の腫瘍中に直接位置する移植として、病 変内に投与する。あるいは、アロ活性化ドナーリンパ球は、腫瘍の処置において 末梢的に、例えば、二次または転移腫瘍部位に投与され得る。別の実施態様にお いて、同種異系活性化リンパ球を、患者由来のリンパ球と同時培養し、そしてML Cの混合物を、混合物として末梢に移植または導入する。 図面の簡単な説明 図１は、MLC細胞の腫瘍内移植で処置された神経膠芽腫患者の生存時間を示す 。 図２は、腫瘍のサイズの減少を示すMRIスキャンを示すグラフであり、９人の 神経膠芽腫患者中２人の患者、すなわち４×10⁹MLCの単回移植用量を受けた１人 の患者および６×10⁹MLCの単回移植用量を受けた１人が、それぞれ、58週間およ び74週間にわたり腫瘍塊の進行性の縮小を今日まで示し続けた。 発明の詳細な説明 本発明は、哺乳動物における腫瘍を処置するための方法を提供する。この方法 は、患者の腫瘍関連抗原に対してドナーリンパ球を活性化するために、混合リン パ球（MLC）反応において患者の単核細胞（好ましくは、末梢血に由来する）と インビトロにおいて同時培養されたドナーリンパ球の同種異系移植片を使用する 。同種異系移植片に対する対宿主性移植片応答および対移植片宿主応答は、サイ トカイン産生および組織破壊を生じる腫瘍部位における強力な免疫学的反応を誘 発すると考えられている。この反応の間に、宿主のリンパ系細胞は、移植片リン パ系細胞および組織の両方を外来であると同定し、そして両方は局所的および全 身的免疫応答により阻害または破壊される。この宿主反応は、移植片リンパ系細 胞の移植部位のみで生じるのではなく、末梢でも（例えば、二次的なまたは転移 した腫瘍部位で）生じ得る。さらに、移植されたドナーのリンパ球は、対宿主移 植片応答において腫瘍を免疫学的に攻撃する。従って、腫瘍の中央における強力 な免疫学的反応は、腫瘍部位に存在し得るサイトカインインヒビターを克服する 環境を生成する。免疫学的反応の増加は、樹立された腫瘍または進行性の転移の 、増殖を阻害し、サイズを減少させ、そして／あるいはこれを根絶し、そして外 科的に除去（debulk）された腫瘍の部位での再発を阻害する。従って、本発明は 、患者に本明細書に記載のアロ活性化細胞の生存調製物を導入することにより、 患者の腫瘍に対する全身的な免疫応答を増強するための方法を提供する。 多数の研究により、混合リンパ球反応におけるインビトロ環境が、同種異系の 抗原および腫瘍関連抗原に対する活性な一次免疫応答を促進することが示された （M．Gatelyら、JNCI 69:1245，1982; S．Leeら、J．Experimental Medicine 14 7 :912，1978; J．Zarlingら、Nature 262:691，1976）。本発明において、MLC反 応は、患者自身の腫瘍組織内で生じ、それにより患者がそれ自身の腫瘍に応答す るように刺激する。好ましくは、同時培養は、一般に１〜５日間実施される。鍵 となるサイトカインの放出は同時培養の初期段階の間に起こるので、同時培養さ れた細胞が同時培養反応の初期段階に（通常、サイトカインのレベルが通常最高 である反応の最初の48時間の間に）移植されることが好ましい。この方法は、腫 瘍組織へ直接の鍵となるサイトカインの放出を生じる。その結果、抗原認識およ びこの抗原に対して指向される細胞媒介性免疫性の発達を促す環境を作り出す。 標準的な技術（例えば、イムノアッセイに基づく技術）を用いて、MLC培養上清 中に存在する種々のサイトカイン（TNF、LTおよびγインターフェロンを含む） のレベルを測定し得る。TNFおよびLTのレベルは、50〜150生物学的活性単位/ml または500〜3500 pg/ml上清で変化する。インビトロ同時培養の結果、ドナー由 来の健常同種異系リンパ系細胞が、患者の同種異系抗原に対して特異的に活性化 される。 一般に、移植された細胞は、腫瘍細胞と直接接触することが可能になる。従っ て、本明細書において用いられる用語「移植」および「移植された」は、細胞が 患者の身体中に群として（任意に、凝固血清あるいは他の懸濁液またはゲル様物 質の濃厚化マトリックス内で）、配置されることを意味する。 本発明の方法により処置され得る腫瘍の例は、以下を包含する： 脳腫瘍（例えば、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、脳室上衣細胞腫、髄芽細胞腫 、およびPNET（未分化神経外胚葉性腫瘍））； 膵臓腫瘍（例えば、膵管腺ガン）； 肺腫瘍（例えば、小および大細胞腺ガン、扁平上皮ガン、および気管支肺胞ガ ン）； 結腸腫瘍（例えば、上皮腺ガン、およびこれらの腫瘍の肝臓転移）； 肝臓腫瘍（例えば、肝ガン、および胆管ガン）； 乳ガン（例えば、管の腺ガンおよび小葉の腺ガン）； 婦人科学的腫瘍（例えば、子宮頸の鱗状腺ガン、ならびに子宮および卵巣上皮 腺ガン）； 前立腺腫瘍（例えば、前立腺ガン）； 膀胱腫瘍（例えば、移行、扁平上皮ガン）； RES系の腫瘍（例えば、ＢおよびＴ細胞リンパ腫（小節のおよび散在性の）、 プラスマ細胞腫、ならびに急性および慢性白血病）； 皮膚腫瘍（例えば、悪性黒色腫）；および 軟組織腫瘍（例えば、軟組織肉腫および平滑筋肉腫）。 本発明の方法の１つの実施態様において、アロ活性化ドナーリンパ球は、腫瘍 部位に移植されて（必要に応じて、同時培養物からの患者のPBMCとともに）、自 己腫瘍細胞に対する患者の免疫系攻撃を補充および増強する。例えば、本発明の １つの実施態様において、患者由来のPBMCまたはPBMCの細胞溶解物との同時培養 により得られたアロ活性化ヒトドナーリンパ球は、ヒトにおいて病変内投与され る（例えば、神経膠芽腫腫瘍の再発に対する防御を所望する患者の脳に直接配置 される移植物として）。アロ活性化ドナーリンパ球は、外科的に除去された腫瘍 、あるいは照射、化学療法、または他の適切な技術により処置された腫瘍に近接 して移植され得る。別の好ましい実施態様において、同種異系活性化リンパ球は 、患者由来リンパ球と同時培養され、そして同時培養された同種異系および自己 細胞の混合物（本明細書において「MLC」として知られる）が病変内移植される 。 代表的な移植物は、治療量のアロ活性化ドナーリンパ球を含む。本明細書にお いて用いられる用語「治療量」は、樹立された腫瘍の増殖を阻害し、サイズを減 少させ、そして／またはこれを根絶する、および／あるいは外科的に除去された または化学療法もしくは照射を用いて処置された腫瘍の部位での腫瘍再発を防止 するに十分量の、MLCまたは混合リンパ球培養物から得られるドナーアロ刺激リ ンパ系細胞を意味する。より一般的には、治療量は、アロ活性化ドナー細胞の各 バッチの能力；所望の治療的または他の効果に必要とされる量、投与の様式（す なわち、腫瘍または体腔中への直接移植によるかあるいは静脈内のような末梢投 与によるかのいずれか）；および一旦移植または投与されたときの身体によるML Cの除去または分解の速度により変化し得る。従来の慎重な処方慣例に従って、 有用な範囲の低い側の端付近の投与量が最初用いられ得、そして投与量は、観察 される応答から示されて、医師の通常の手順で、増加または減少される。しかし 、一般に、直接移植のための単位投与量は、約2×10⁹〜約6×10⁹のMLCを含む。 例えば、脳腫瘍の処置において、移植され得る細胞の上限は、約6×10⁹であるこ とが見出された。あるいは、末梢投与のための単位投与量は、通常約2×10⁹〜約 2×10¹⁰のMLCを含む。 本発明は、MLCの単位投与量を含む組成物を保持する無菌バイアルまたはその 他の容器をさらに包含する。代表的には、バイアルまたは容器は、ヒトにおける 腫瘍の処置における組成物の薬学的使用に関する情報を記載するラベル（例えば 、本明細書に記載のようにそれに対して本発明の処置方法が有効である１以上の 腫瘍を有するヒトの処置における組成物の使用についてのFDAの承認）を有する 。 ドナーからPBMCを得る任意の公知の方法が使用され得るが、支持的アフェレー シスのために当該分野において周知の白血球搬出法の技術を白血球搬出法装置の 製造者の説明書に従って利用して、ドナーPBMCを含有する約150〜300 mlの白血 球搬出法懸濁液を得ることが好ましい。例えば、白血球搬出法は、Cobe 2997，C emonetics（Braintree，MA）血球セパレーターを用いて実施され得る。一般に、 リンパ球収量２〜４×10⁹での２〜４時間の40〜50 ml/分の流速が、総ドナー血 液容量7,000〜12,000 mlを処理して、１ml未満の赤血球を有する200〜250 mlの 白血球搬出法懸濁液を得るために使用され得る。例えば、Cobe 2997血球セパレ ーターが使用される場合、遠心分離速度は、一般に約５×gであり、流速は約45m l/分までであり、そして採集速度は2.5 ml/分以下である。当業者は、リンパ球 の収量が、使用されるドナーおよび白血球搬出法の機械により変化することを理 解する。例えば、ドナーの前絶対（pre-absolute）リンパ球数が0.6×10⁹〜1.0 ×10⁹のレベル内にある場合、150 mlほどのドナー白血球搬出法懸濁液が抜かれ 得る。 所望であれば、同時培養の間に患者由来抗原に対する細胞の活性化を引き起こ すために、そしてリンパ球増殖をさらに刺激するために、ドナー細胞は、IL-2の ような刺激サイトカインと接触され得る。 ドナーPBMCは、ドナー血液画分から、単核細胞の破裂を避けるように注意して 、 を通して350×gで７〜10分間遠心分離することにより得られる。当業者は、容易 に利用され得る他のPBMC細胞分離技術を知る。ドナー血液は、代表的には、外科 手術の３〜７日前に、HIV、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎ならびにVDRLに ついて予備スクリーニングされる。 十分な抗凝固剤（例えば２％クエン酸塩）が、ドナーおよび患者の血液または 血液画分に、引き抜く際の凝固を防止するために添加される。当業者に公知の以 下のような代替の抗凝固剤およびその混合物もまた、使用され得る：抗凝固剤ク エン酸デキストロース（anti-coagulant citrate dextrose）Ａ剤（ACDA）15 ml /クエン酸100 ml；抗凝固剤クエン酸デキストロースＢ剤（ACDB）25 ml/クエン 酸100 ml；またはクエン酸リン酸デキストロース（citrate phosphate dextrose ）（CPD）14 ml/クエン酸100 ml。 代表的には、全血を、本発明に従って処置されるべき患者から、静脈穿刺のよ うな当該分野に公知の方法を用いて引き抜く。PBMCは、患者の全血から、通常Hi 分離により単離され、そして細胞から患者の血液中の凝固因子を取り除くために 十分に洗浄される。 ドナーおよび患者の両方の血液または血液画分のサンプルを、細胞の同時培養 の前に無菌性を確実にするために十分に試験しなければならない。当業者により 実施され得る血液成分の無菌性についての試験の代表的なものは、チオグリコレ ートブロス、トリプチックソイブロス、および10％熱不活化ウシ胎児血清（FBS ）（RPMI-10％）および１％Ｌ-グルタミンを含み、抗生物質を添加しないRoswel l Park Memorial Institute Tissue Culture Medium（RPMI）のような増殖培地 を用いる試験である。このような増殖培地中の血球の培養物を利用する無菌性試 験は、本出願の実施例１に例示される。別の無菌性試験は、当業者に公知である 。 混合リンパ球培養を実施し得る前に、代表的には、全血から単離されたPBMCは 、単位容積あたりの生存細胞数を測定するために分析される。これは、例えば、 生存および死滅細胞の間を区別する染色を用い、そしてNeubauerチャンバー中の 細胞を計数することにより実施され得る。この使用のための代表的な染色は、ト リ パンブルーおよびEosin Y色素である（その両方は、湿潤調製物において使用さ れ得る）。別の染色は、当業者に公知である。一般に、生存細胞の濃度は、単位 容量あたりの生存細胞の所定の濃度を達成するために、PBMCの調製物を希釈する ことにより標準化される。当業者は幾分より高いまたはより低い数を選択し得る が、一般に、混合リンパ球培養を実施する目的のために、生存細胞の数は約10⁷ 細胞/mlの濃度で固定されことが好ましい。代表的にはドナー細胞は、患者の細 胞に比較して10:1〜20:1の割合で培養される。 哺乳動物（すなわち、ヒト）細胞を用いる混合リンパ球培養を実施するための 標準的な技術は当該分野において周知であり、そして本出願の実施例１に例示さ れる。例えば、Current protocols in Immunology、J.E．Coliganら編，John Wi ley & Sons，Inc.，1994，7.10節ならびにM．Gatelyら、前出；S．Leeら、前出 ；およびJ．Zarlingら前出を参照のこと（これらはその全体が本明細書に参考と して援用される）。患者のスティミュレーター細胞のドナーのレスポンダー細胞 に対する応答（バック刺激（back stimulation））をブロックするために、当該 分野で周知なように、患者の細胞の増殖能を減少または除去するために、細胞の 混合前、同時培養の間に、患者の細胞を照射するか、またはDNA結合剤（例えば 、マイトマイシンＣ）で処理することが好ましい。本発明において、ドナーリン パ細胞は、代表的には、少なくとも48時間、そして好ましくは１〜５日間、患者 のPBMCと短期間混合リンパ球培養で同時培養される。インビトロ同時培養の結果 として、無関係なドナー由来の健常リンパ系細胞が、患者の腫瘍関連抗原に対し て特異的に活性化される。 非経口または静脈内投与のための調製物は、代表的には、「生理学的に適合性 のキャリア」中に含まれる。本発明の実施において利用される細胞は生存してい るので、生理学的に適合性のキャリアは、細胞の生存性を損なわない（すなわち 、低張性であり、そして生理学的pHにある）キャリアである。そのようなキャリ アは、無菌水性塩溶液、懸濁液および乳濁液を包含し、これらは、生理食塩水お よび緩衝化媒質、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウ ム、ならびに乳酸加リンガー液を包含する。静脈内ビヒクルは、液体および栄養 補充物、電解質補充物（例えば、リンガーデキストロースに基づく補充物）など を包 含する。非静脈内経路による投与のためには、キャリアは凝固血漿、好ましくは 患者の凝固血漿の形態であり得る。あるいは、キャリアは、無血漿の、生理学的 に適合性、生分解性固体または半固体（例えば、ゲル、懸濁液、または水溶性ゼ リー）であり得る。アカシア、メチルセルロースおよびその他のセルロース誘導 体、アルギネートナトリウムならびにトラガカント懸濁液またはゲルが、本発明 の実施におけるキャリアとしての使用のために適切である。例えば、カルボキシ メチルセルロースナトリウム2.5％、トラガカント1.25％およびグアーゴム0.5％ 。 腫瘍部位での移植の好ましい方法において、同時培養されたリンパ球を、同時 培養上清から（同時培養の少なくとも48時間後）、外科手術の際に遠心分離によ り採集する。採集された細胞を、２回注射用生理食塩水で洗浄し、そして前日こ 患者から得られた無血小板、カルシウム除去血漿中に再懸濁する。血漿中の細胞 を外科手術に運び、血漿をカルシウム（好ましくは、グルコネートカルシウムの 形態で）を添加することによりカルシウム再添加し、その結果、血漿を凝固し、 細胞を自己血漿凝塊中に包埋する。次いで、患者の腫瘍を外科的に除去し、そし て凝塊を無菌的に細かく切り、腫瘍部位中に移植する。 以下の実施例は、本発明が実施され得る様式を例示する。しかし、この実施例 は例示の目的のためであり、本発明がその中のどの特定の材料にも条件にも限定 されるとみなされないことが理解される。 実施例１ Ａ．混合リンパ球細胞（MLC）培養手順 １．無関係なドナーからのレスポンダーPBMCの採集 末梢血単核細胞（PBMC）を、患者に無関係な正常健常ドナーからの白血球搬出 法により採集した。ドナーを、分画を有する全血球算定（CBC）、Ａ、Ｂ，およ びＣ型肝炎、VDRL、ならびにHIV-1について試験するために前スクリーニングし た。 PBMCを含有する約150〜300mlの白血球搬出懸濁物を、製造者の説明書に従って 支持アフェレーシスのための標準的な献血手順を用いて各ドナーから採取した。 白血球搬出法を、Fenwall CS 3000（Deerfield、IL）血球セパレーターを用いて 行った。2〜4×10⁹のリンパ球収量での２〜４時間の40〜50ml/分の流速は、7,00 0〜12,000mlの全ドナー血液容量を処理して、1ml未満の赤血球を含む200〜250ml の白血球搬出懸濁物を生じた。Cobe 2997血球セパレーターを使用した場合、遠 心分離速度は5×g、流速は45ml/分まで、そして採集速度は、2.5ml/分以下であ った。 しかし、ドナーの前絶対リンパ球数が0.6×10⁹〜1.0×10⁹の範囲である場合、 150ml程少ない白血球搬出生成物が取り出された。最終生成物についてのヘマト クリットは3.5％であった。少なくとも１つの全血液容量は、80％のリンパ球採 集の効率で処理された。 使用した抗凝固剤は、２％のクエン酸、またはACDA-15ml/クエン酸-100ml；AC DB-25ml/クエン酸-100ml；あるいはCPD-14ml/クエン酸-100mlの比のクエン酸／ 抗凝固剤のいずれかであった。最高の生成物純度を得るために、細胞セパレータ ー由来の実際のかつ最終的な生成物が、自己血漿中の細胞の純粋な濃縮物として 輸送された。細胞を洗浄せず、そしてアルブミンを添加しなかった。 ２．ドナー細胞の調製 白血球搬出生成物を、免疫療法のために同種異系混合リンパ球細胞（MLC）の 産生のためにMC Oncology Research Laboratoryに輸送した。 細胞を、白血球搬出パックから２つまたは３つの250mlの遠心分離チューブに 流し出し、遠心分離中に行われるべき無菌性試験のために3mlを取り出しそして 別にした。細胞濃縮物をリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で希釈し、そして2,000 rpmで７分間遠心分離した。遠心分離を２回繰り返して全部で３回行い、細胞を 洗浄しドナーの血清中の凝固因子を除いた。 白血球懸濁物から取り出した3mlからの３つの１mlのアリコートを、無菌性試 験のために滅菌したキャップをしたチューブに入れた。第１の1mlのアリコート を、チオグリコレート培地（Difco，Detroit，MI）に添加した（30〜35℃、48時 間）；第２の１mlをトリプチックソイブロス（tryptic soy broth）（Difco，De troit，MI）に添加した（25〜30℃、48時間）；そして第３の１mlを10％熱不活 化FBS（RPMI-10％）および１％ L-グルタミン酸を含むが、抗生物質を含まないR PMI 1640（GIBCO，Gaithersburg，MD）に添加した。 細胞を、PBS中で150gで10分間２回スピン洗浄して、血小板を除いた。細胞は スラリーでペレットではないので、上清を非常に注意深く捨てた。細胞を、２％ 熱不活化FBS（２％ AIM V）を補充したAIM V（GIBCO，Gaithersburg，MD）中に 再懸濁して420mlとし、そしてT-175cm²フラスコ中に入れた。 患者の血液またはドナーの血液を、滅菌生理食塩水で1:1に希釈した。細胞の 分離のために、35mlの細胞懸濁物を、それぞれの50mlチューブ中に15mlのHistop gで45分間遠心分離した。遠心分離をゆっくり開始し、そして最大速度まで徐々 有する界面を、25mlの滅菌ピペットで注意深く採集し、清潔な50mlの遠心分離チ ューブに入れ、２％のAIM V培地で1:1に希釈し、そして550gで７〜10分間遠心分 る。 上清を捨て、ペレットを２％のAIM Vに再懸濁して２つの50ml遠心分離チュー ブに分けて全容量40mlとし、そして550gで５分間遠心分離した。洗浄後、上清を 捨てた。洗浄工程を２回繰り返して全部で３回行った。最後の洗浄後、各チュー ブ内の細胞を50mlの２％ AIM Vに再懸濁した。１つのチューブ当たり１mlのアリ コートの再懸濁細胞を、２％のAIM Vで1:10の比で希釈し、次いでさらに、死細 胞を生存細胞と区別するためにTrypan Blue（Sigma，St．Louis，MO）で1:1に希 釈し、そして生存細胞をヘマチトメーターで計数した。細胞を、２％のAIM Vで2 ×10⁶/mlとした。 ３．腫瘍患者からのスティミュレーターPBMCの採集 200〜400mlの末梢血細胞を、静脈穿刺により各神経膠芽腫患者から抜き取り、 そして250mlの遠心分離チューブに入れ、スピン中に行われるべき無菌性試験の ために３mlを取り出し、そして別にした。遠心分離チューブ中の血球を、生理食 塩水で希釈し、そして550gで７分間遠心分離した。遠心分離を２回繰り返し、全 部で３回行い、細胞を洗浄し患者の血清中の凝固因子を取り除いた。無菌性試験 を上記のように行った。 細胞を、血小板を取り除くために生理食塩水中150gで10分間の遠心分離により ２回洗浄し、上清を非常に注意深く捨て、そして420mlの細胞をT-175cm²フラス コ中に生理食塩水で再懸濁した。 加し、そして生理食塩水中に懸濁された35mlの細胞を、各々の50mlチューブ中の 徐々に速度を増大して250gで45分間スピンした。 5mlの滅菌ピペットで２つの250mlの遠心分離チューブに注意深く採集し、そして ２％のAIM Vで最終容量250mlに希釈した。希釈した単核細胞を、550gで７〜10分 間遠心分離した。洗浄するために、上清を捨て、次いで細胞ペレットを２％のAI M Vで再懸濁し、そして、550gで５分間遠心分離した。洗浄工程を、全部で３回 繰り返した。 最後の洗浄工程後、細胞を50mlの２％ AIM Vに再懸濁し、１つのチューブ当た り細胞1mlの懸濁物を、２％のAIM Vで1:10で希釈し、そして、上記のようにTryp an Blue中の1:1希釈における計数により生存細胞数を決定した。 細胞の採集のための上記の手順および無菌性の証明は、無菌性および品質管理 についてのState of Califoria for GMPにより承認された。 ４．ドナーの白血球での患者の単核細胞（PBMC）のアロ活性化 単離した患者のPBMCを、AIM V中に10⁷細胞/mlで再懸濁し、患者の細胞懸濁物 １ml当たり50μgのMitomycin C（Bristol-Mayer Squibb，Princeton，NJ）を添 加した。そしてPBMCの懸濁物を、レスポンダー細胞に対するスティミュレーター 細胞の応答（バック刺激）をブロックするために、37℃で１時間インキュベート した。１時間のインキュベーション後、過剰のマイトマイシンＣを別の遠心分離 （250g、５分間）により細胞から洗浄し、そして細胞をAIM-V中に再懸濁した。 患者のPBMCをマイトマイシン処理した後、細胞を20:1〜10:1のドナー：患者細胞 の比でドナー培養物（上記で得られた）に添加した。 同時培養のために、ドナーおよびマイトマイシンＣ処理した患者のPBMC懸濁物 を、患者中に再移植するためのPBMCを培養するために特に設計された、密封され た滅菌Fenwal組織培養システム中においた。細胞を、製造者の説明書に従ってFe nwal細胞転移ユニットおよびポンプを介して密封されたシステム内を通過させ、 そして37℃のインキュベーター中で48時間培養した。 ５．アロ活性化された細胞の無菌性試験 細胞懸濁物の移植の２日前に、以下の３つの無菌性試験を行った。10mlの無菌 アリコートを各組織培養バッグから取り出し、無菌のキャップをした15mlの遠心 分離チューブに入れ、そして450gで10分間遠心分離した。各チューブ内で、ペレ ットを3.0mlのPBSに再懸濁した。１mlのアリコートの細胞懸濁物を、２mlのチオ グリコレートブロス（thioglycollate broth）、トリプチックソイブロス、また はRPMI-10％を含有する３つの無菌のキャップをしたチューブにそれぞれ添加し 、そして48時間インキュベートした。各細胞懸濁物を、移植の前に微生物の増殖 の徴候を検出するために顕微鏡により調べた。 手術当日に、それらの培地から細胞を遠心分離し、生理食塩水で２回洗浄し、 前日の患者から得られた血小板非含有の、カルシウム除去された血漿に再懸濁し た。細胞を血漿中で手術室に運び、次いで血漿をグルコン酸カルシウムの添加に よりカルシウムに再添加して、腫瘍ベッドへの移植の直前に凝固するようにした 。 手術当日こ、採集した細胞ペレットの一滴を再び顕微鏡下で無菌性について試 験した。凝固の直前に、100μlのアリコートの細胞懸濁物を、無菌のキャップを したチューブ中の抗生物質、チオグリコレート、およびトリプチックソイブロス を含まない各２mlの各RPMI-10％に添加した。次いでサンプルを、手術後４日間 インキュベートし、そしてこの最後の無菌性試験の連続記録（running log）を 継続した。 上記の方法により産生される細胞移植（Cyto-implant）は、ヒトガン患者にお ける使用のためにFDA承認を受けた（IND-BB 6288）。 Ｂ．混合リンパ球細胞培養物の病変内移植 ヒト第１相試験を、再発性神経膠芽腫を罹患した患者におけるアロ活性化され た同種異系リンパ系細胞の病変内注射の効果を試験するために開始した。再発性 のグレード３およびグレード４の神経膠芽腫の総数９人の患者についてこの試験 を行った。上記のステップ３において混合リンパ球培養物から得られたMLCを、 外科手術時に除去された腫瘍中に病変内移植した。３人の患者を、2×10⁹、4×1 0⁹、および6×10⁹のMLCの３種類の細胞用量でそれぞれ試験した。患者を臨床的 に追跡し、そして磁気共鳴画像法（MRI）スキャンを、移植後各患者に対して種 々の月単位の間隔で行い、疾患の進行をモニターした。 全ての患者が、手術後の１〜２ヶ月間に頭痛および吐き気を訴えた。最高の細 胞用量を受容した患者は、最も多数の症状を示した。最高の用量を受容した全て の患者および低用量の各１人を含む５人の患者のうちの４人は、移植後１〜３ヶ 月間にわたってMRIスキャンにおいて腫瘍増強領域の50％またはそれより多くの の縮小を示した。MRIスキャンの結果を図１に示す。これは、MLC細胞の腫瘍内移 植で処置した神経膠芽腫患者の生存期間を測定する。２人の患者（１人は4×10⁹ のMLCの単回移植用量を受容し、そして１人は6×10⁹のMLCの単回移植用量を受容 した）は、それぞれ58週間および74週間にわたって腫瘍塊の進行性の縮小を今日 まで継続した。これらの２人の患者はまた、Karnofskyスコアにおいて著しい改 善を示した。MRIスキャンの結果を図２に示す。これは、MLC移植からの時間の関 数として腫瘍体積の縮小を測定する。 実施例２ 第Ｉ相研究を、全身性黒色腫の２人の患者において行った。患者およびドナー のリンパ球の混合培養物を、実施例１に記載のように調製した。患者を、皮膚腫 瘍への2×10⁹のMLC細胞の病変内注射により処置した。どちらの患者もネガティ ブな効果を示さなかった。第１の患者は、注射された皮膚腫瘍の壊死および崩壊 および離れた転移での炎症を示した。第２の患者は注射した腫瘍で炎症を示した が、この投与量レベルでは壊死は示さなかった。これらの患者の処置は進行中で ある。 実施例３ ヒト第Ｉ相臨床研究を、膵臓ガンの患者におけるMLC細胞の腫瘍内移植の効果 を試験するために行った。不治の、処置し得ない膵臓ガンを有する４人の患者が 、4×10⁹のMLC細胞の病変内移植を受けた。毒性がほとんど見られないか、また は全く毒性が見られなかった。腫瘍塊の縮小が起こり、そして生存期間の延長が 観察された。３人の患者は、50％より多い腫瘍塊の縮小を示した。３番の患者に おいて、この腫瘍のマーカーであるCA-19-9の血清レベルは、２ヶ月間にわたっ て206の最高値から86に減衰した。処置の７ヶ月後、処置した患者の２人は仕事 に復帰し、腫瘍の臨床的な症状を有さず、そして全体的に通常の生活を行ってい る。 本発明の上記の記載は、説明および理解の目的のために例示される。種々の改 変が本発明の意図および範囲から逸脱することなく行われ得ることが理解される べきである。従って、以下の請求の範囲は、全てのこのような改変を包含すると 解釈されることが意図される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヒト患者における腫瘍を処置するためのアロ活性化ヒトドナーリンパ球を含 有する薬学的組成物の調製方法であって、該方法は以下の工程： a) エクスビボにおいて、ヒトドナー由来のリンパ球を患者由来の白血球とドナ ーリンパ球をアロ活性化するように同時培養する工程；および b) 該細胞を回収し、そして同時培養の開始後、該回収された細胞が該患者にお ける固形腫瘍のベッドにおける移植に際して該腫瘍の処置に有効である時にそれ らをヒトに投与するために調製する工程、 を包含する、方法。 ２．前記同時培養される細胞が、該同時培養される細胞の移植が前記患者におい て腫瘍に対する応答を誘導する時に回収される、請求項１に記載の方法。 ３．前記同時培養される細胞が、前記固形腫瘍のベッドにおける該同時培養され る細胞の単回移植がガンの処置に有効である時に回収される、請求項１に記載の 方法。 ４．前記腫瘍が、黒色腫、膵臓ガン、肝臓ガン、結腸ガン、前立腺ガン、および 胸部ガンからなる群から選択される悪性疾患である、請求項１〜３のいずれかに 記載の方法。 ５．前記工程a)における培養する工程が、培養開始後約48時間の期間行われる、 請求項１〜４のいずれかに記載の方法。 ６．請求項１〜５のいずれかに記載の方法により調製される、アロ活性化ヒトド ナーリンパ球を含有し、かつヒト投与に適切な、薬学的組成物。 ７．１つ以上の以下の特徴： i) 約２×10⁹と２×10¹⁰との間のドナー起源の培養末梢血単核細胞を含有する； ii) 約１×10⁸と２×10⁹との間の患者起源の培養末梢血単核細胞を含有する； iii) 外因的に添加されたリンパ球増殖剤を実質的に含まない； iv) 生理食塩水、緩衝化媒質、および凝固血漿からなる群から選択される生理学 的に適合性のキャリアを含有する、 を有する、請求項６に記載の薬学的組成物。 ８．ヒト患者における腫瘍の処置において有効な、アロ活性化ヒトドナーリンパ 球を含有する培養細胞集団の調製方法であって、該方法は以下の工程： a) ヒト患者から白血球を得る工程； b) 該ヒト患者に対して同種異系であるヒトドナーからリンパ球を得る工程； c) エクスビボにおいて、該ドナーリンパ球を、該患者白血球と、該ドナーリン パ球をアロ活性化するように同時培養する工程； d) 該同時培養された細胞を、回収された細胞が該患者における固形腫瘍のベッ ドにおける移植に際して該腫瘍の処置に有効である時に培養物から回収する工程 ； e) 該回収された細胞から培養培地を洗浄する工程；および f) 該洗浄された細胞がヒト投与のために十分に無菌であることを確認する工程 、 を包含する、方法。 ９．１つ以上の以下の特徴： i) 工程a)において前記ヒト患者から少なくとも約２×10⁸の末梢血単核細胞を得 ること； ii) 工程a)において黒色腫、膵臓ガン、肝臓ガン、結腸ガン、前立腺ガン、また は胸部ガンを有するヒト患者から白血球を得ること； iii) 工程b)において前記ヒトドナーから少なくとも約２×10⁹の末梢血単核細胞 を得ること； iv) 工程c)の前に前記患者白血球の増殖をブロックすること； v) 工程c)において前記ドナーリンパ球を約10:1〜20:1の比で前記患者白血球と 同時培養すること； vi) 工程d)において前記細胞を培養の開始後約48時間で回収すること；または vii) 工程f)の完了後に、ヒト投与に適切な、約２×10⁹と２×10¹⁰との間の同時 培養された細胞を生成すること、 を組み入れた、請求項８に記載の方法。 １０．腫瘍を有するヒト患者由来の白血球に対してアロ活性化されたヒトドナー 由来のリンパ球を含有する、外科手術または治療による該ヒト患者の処置方法に おける使用のための、細胞集団。 １１．腫瘍を有するヒト患者の白血球に対してアロ活性化されたヒトドナー由来 のリンパ球を含有する細胞集団の、該腫瘍の処置のための薬物または該患者にお ける抗腫瘍免疫学的応答の誘導のための薬物の調製のための、使用。 １２．前記薬物の投与が、前記患者における固形腫瘍のベッドの中または周囲で の移植を、該固形腫瘍の事前の切除または部分切除を伴うかまたは伴わないで包 含する、請求項１１に記載の使用。 １３．１つ以上の以下の特徴： i) 前記薬物の前記固形腫瘍のベッドの中または周囲での単回移植が前記腫瘍の 処置に有効である； ii) 前記薬物の前記固形腫瘍のベッドの中または周囲での単回移植が抗腫瘍免疫 学的応答の誘導に有効である；または iii) 前記薬物の前記固形腫瘍のベッドの中または周囲での単回移植がそのよう に処置された患者の期待寿命のメジアンの延長に有効である、 を組み入れる、請求項１１または１２に記載の使用。 １４．前記腫瘍が、黒色腫、膵臓ガン、肝臓ガン、結腸ガン、前立腺ガン、およ び胸部ガンからなる群から選択される悪性疾患である、請求項１１〜１３のいず れかに記載の使用。