JPH11502191A - ワクチンアジュバント - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 アニオン構成反復単位及び疎水性構成反復単位を有するポリマーを含んでいる液体媒質を含んでなるワクチンアジュバント。該アジュバントは、都合よく、部分的にエステル化したポリアクリル酸の水溶液である。これらの新規のアジュバントは、非常に安定で、効果的で、そして比較的低レベルの局所毒性を有する。さらに、そのようなアジュバントを含んでなるワクチン及びアジュバントを生成するための方法が記述される。

Description

【発明の詳細な説明】 ワクチンアジュバント 本発明は、新規のワクチンアジュバントに関する。 抗原は、例えば、非経口で投与される場合、抗体産生を含む免疫反応を引き起 こす異物として定義される。抗体は、血液及び他の体液中、並びに組織中に含ま れ、抗原を無毒化するためにそれに結合する物質である。抗体は、体の生来の防 御機構の一つを構成する。抗体は、非常に特異的であり、それらの形成を誘導し た抗原を排除、結合、または無毒化することができる。 抗原は、従って、免疫システムと接触して、抗原を除去するための、そして／ または前の平衡状態を回復させるための複雑な一連の細胞の相互作用を活性化す る。 抗原の典型的な特徴の２つは、それらの免疫原性、すなわち、（特異的な抗体 の形成を含む）生体内で免疫反応を引き起こす能力、及びそれらの抗原性、すな わち、その抗原に由来する抗体により選択的に認識される能力である。 ワクチンを使って特定の抗原を投与することにより、故意に免疫反応を刺激す ることが可能であることは知られている。この処置は、その抗原との次の接触の 間の生体のより迅速でより効果的な反応を保証する、免疫学的記憶の状態を生体 内において発達させる。 しかしながら、いくつかの抗原は、弱い免疫原性のみを有し、そして生体に対 して効果的な防護をもたらすのに不十分な免疫反応を誘導する。 免疫システムに直接作用すること、または抗原の薬物動態学的特徴を修飾し、 従って免疫システムと抗原の間の相互作用時間を増すことのい ずれかにより抗原に対する反応を増大する、アジュバントと呼ばれる物質との混 合物において抗原を投与することにより、抗原の免疫原性は高められることがで きる。 最も一般的なアジュバントは、一方では、鉱油内の食塩水溶液中の死んだマイ コバクテリアを含んでなるエマルジョンであるフロインドアジュバントであり、 他方では、マイコバクテリアを含まないフロインド不完全アジュバントである。 これらのアジュバントは、抗原に対する免疫反応の強さを増すことまたは免疫 システムの非特異的な活性化を生じることのいずれかができる。 しかしながら、これらのアジュバントの使用は、注入場所での刺激または膿傷 の形成のような欠点を含んでなる。加えて、これらのアジュバントが効果的であ るためには、用いる濃度が注入容量の５０％以上でなければならず、このことは 、一回の服用量において注入することのできる抗原の有効な添加量を制限する。 油及び水に基づくこれらの標準アジュバントの高い粘性のために、注射器に入 れること及び動物に注入することが困難であるので、これらの使用は非実用的で ある。 記述されているアジュバントの別の型は、ポリアクリル酸の溶液を含んでなる （Ｄｉａｍａｎｓｔｅｉｎ等、Ｚ．Ｋｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｋｌｉｎ．Ｂｌｏｃｈ ｅｍ．、第８巻、６３２−６３６頁、（１９７０）及びＤｉａｍａｎｓｔｅｉｎ 等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１巻、３３５−３３９頁（１９７１）） 。この型のアジュバントの利点は、鉱油及び水に基づく従来のアジュバントより 粘性が低いことである。従って、より容易に操作され、注入されることができる 。しかしながら、こ れらのアジュバントの効力は、鉱油中の水（Ｗ／Ｏ）に基づくアジュバントのも のに匹敵しない。 本発明の目的は、低濃度においてそして鉱油を含まずに効果があるワクチン用 アジュバントを提示することである。 この目的は、アニオン構成反復単位及び疎水性構成反復単位を有するポリマー の水溶液を含んでなるワクチンアジュバントにより達成される。 アニオン構成反復単位という用語は、本発明の目的のための、アニオンを形成 しながら水に解離することのできる基を含んでいる、ポリマーを構成するモノマ ー単位を意味する。 アニオン構成反復単位を形成するために本発明において有用なそのようなモノ マー単位の例は、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸、フマル酸、エチレン スルホン酸、ビニル硫酸、スチレンスルホン酸、ビニルフェニル硫酸、２−メタ クリロイルオキシエタンスルホン酸、３−メタクリロイルオキシ−２−ヒドロキ シプロパンスルホン酸、２−アクリル−２−メチルプロパンスルホン酸、３−ア クリルアミド−３−メチルブタン酸、３−メタクリルアミド−３−メチルブタン 酸、ビニルリン酸、４−ビニル安息香酸、３−ビニルオキシプロパン−１−スル ホン酸、及びＮ−ビニルスクシイミド酸である（から選択される）。 好ましくは、この型のモノマー単位が、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン 酸、フマル酸、エチレンスルホン酸、ビニル硫酸、及びスチレンスルホン酸から 選択される。 この型のモノマー単位が、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸、及びフマ ル酸から選択されることが好ましい。 この型のモノマー単位がアクリル酸単位であることが特に好ましい。 疎水性構成反復単位という用語は、本発明の目的のための、水に解離しない、 親油性とも呼ばれる、疎水性の基のみを含んでいる、ポリマーを構成するモノマ ー単位を意味する。 疎水性構成反復単位を形成するために本発明において有用なそのようなモノマ ー単位の例は、上記の酸（アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸、フマル酸、 エチレンスルホン酸、ビニル硫酸、スチレンスルホン酸、ビニルフェニル硫酸、 ３−メタクリロイルオキシ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、２−メタクリ ロイルオキシエタンスルホン酸、２−アクリル−２−メチルプロパンスルホン酸 、３−アクリルアミド−３−メチルブタン酸、３−メタクリルアミド−３−メチ ルブタン酸、ビニルリン酸、４−ビニル安息香酸、３−ビニルオキシプロパン− １−スルホン酸、またはＮ−ビニルスクシイミド酸）のアルキルエステル、シク ロアルキルエステル、及びヒドロキシアルキルエステル、並びにエーテル（例え ば、メトキシメチル、エトキシエチル、アリルオキシメチル、２−エトキシエト キシメチル、ベンジルオキシメチル、シクロヘキシルメチル、１−エトキシエチ ル、２−エトキシエチル、２−ブトキシエチル、メトキシメトキシエチル、メト キシエトキシエチル、１−ブトキシプロピル、１−エトキシブチル、テトラヒド ロフルフリル、またはフルフリルエーテル）である（から選択される）。 好ましくは、この型のモノマー単位が、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン 酸、フマル酸、エチレンスルホン酸、ビニル硫酸、またはスチレンスルホン酸の アルキルエステルから選択される。 好ましくは、この型のモノマー単位が、アルキル基が４−８個の炭素原子を含 む、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸、またはフマル酸 のアルキルエステルから選択される。 この型のモノマー単位が、アルキル基が４−８個の炭素原子を含む、アクリル 酸の直鎖状アルキルエステルであることが特に好ましい。 本発明により用いられるアジュバントは、アニオン構成反復単位を形成するた めに用いられるモノマー単位がアクリル酸からなり、疎水性構成反復単位を形成 するために用いられるモノマー単位が、アルキル基が４−８個の炭素原子を含む 、アクリル酸の直鎖状アルキルエステルから選択される、ポリマーの水溶液であ ることが特に好ましい。 アニオン構成反復単位及び疎水性構成反復単位を有するポリマーの水溶液を含 んでなるワクチンに対する体液性反応は、例えば、ポリアクリル酸のようなアニ オン構成反復単位のみを有するポリマーにより誘導される反応より大きい。 実際、本発明のアジュバントの効力は、鉱油中の水に基づく標準アジュバント のものに匹敵し、一方、一般的に、これらの毒性はかなり低い。 水中鉱油（Ｏ／Ｗ）または鉱油中水（Ｗ／Ｏ）のエマルジョンに基づく標準ア ジュバントは、塩濃度、温度などのような安定化因子にいつも影響されやすく、 このことは本発明のアジュバントには当てはまらないので、従って、本発明のア ジュバントは、前者が有するようないかなる不安定性の問題も有さない。原則と して、これらの安定性は、ポリアクリル酸のようなアニオン構成反復単位のみを 含んでいるポリマーの安定性に相当する。 本発明のアジュバントの利点の一つは、少量の服用量で有効であることである 。従って、注入される容量当たりの抗原の添加量を増加することが可能である。 Ｗ／Ｏに基づくワクチンにおいて、鉱油はワクチンの 容量の約５０％を占め、一方、（例えば、炭化水素鎖に結合したポリアクリル酸 に基づく）本発明のアジュバントにより占められる容量比は、ワクチンの容量の 約１０％に減少されることができる。 第一の有益な態様により、ポリマーの分子量は、１０及び１０，０００ｋＤの 間である。 都合よく、疎水性構成反復単位及びアニオン構成反復単位のモル比は、０．０ ５及び１．００の間、好ましくは、０．１０及び０．４０の間である。 好ましくは、ポリマーの水溶性は、少なくとも１ｇ／Ｌである。 本発明の他の特徴により、ポリマーを得るための方法が記述される。ポリマー は、以下の方法、すなわち、 １．アニオン及び疎水性モノマーの共重合、 ２．ポリマーの部分グラフト化 ３．ポリマーの部分加水分解、及び ４．中間無水物による、 の一つにより得られることができる。 他の好ましい態様により、ワクチンの１−４０ｍｇ／ｍＬ、好ましくはワクチ ンの４−２４ｍｇ／ｍＬ、そしてより好ましくはワクチンの８−１６ｍｇ／ｍＬ のポリマーの濃度で、ワクチンが提示される。 本発明の他の特徴により、ワクチンは、家畜の予防接種用のニューカッスル病 ウイルス（ＮＤＶ）及び／または伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）の不活性化 した抗原を含んでなる。 炭化水素鎖に結合したポリアクリル酸に基づくアジュバントを含んでなるワク チンは、アジュバントが溶液であるので、Ｗ／ＯもしくはＯ／ Ｗエマルジョンに基づくまたは水中の鉱油中水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）に基づくアジュバ ントを含んでなるワクチンよりかなり安定である。 本発明のさらに他の特徴により、ワクチン中のアジュバントとしてアニオン構 成反復単位及び疎水性構成反復単位を有するポリマーの水溶液の使用が提示され る。 本発明の他の特徴により、抗原の水溶液、並びにアニオン構成反復単位及び疎 水性構成反復単位を有するポリマーが混合されることを特徴とする、溶液中のワ クチンを調製するための方法が提供される。実施例１ ４５０，０００Ｄの分子量を有するポリアクリル酸（Ｃａｒｂｏｐｏ１ ９０ ７（ＰＡＡ）、Ｇｏｏｄｒｉｃｈ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、Ｏｈｉｏ、Ｕ．Ｓ．Ａ ．）の部分エステル化により、本発明の異なる水溶性ポリマーを合成した。本出 願において、「ＰＡＡ」という用語は、「Ｃａｒｂｏｐｏｌ ９０７」をいう。 このポリアクリル酸を、Ｊ．Ｐｏｌｙ．Ｓｃｉ．、第１４巻、７−２２頁（１９ ７６）においてＣｏｈｅｎ、Ｈ．Ｌ．により記述された方法により、異なるヒド ロキシアルカンとエステル化する。以下「アルキル−ＰＡＡ」（表Ｉ参照）と呼 ぶ得られたポリマーは、アクリル酸のモノマー単位及びアルキルアクリル酸エス テル型のモノマー単位を含む。 １グラムのＰＡＡを５０ｍｌの対応するアルカノールに溶解し、この溶液を１ ３５℃に加熱した。５０μｌのＨ₂ＳＯ₄を加え、この反応混合物を１３５℃で保 持した。反応混合物を迅速に冷却し、そして１容量の蒸留水を加えることにより 、反応を停止した。次に、この溶液のｐＨをｐＨ＝６に調整し、そして溶媒を減 圧（１０^-6ｂ）で８０℃で蒸発させ た。このようにして得られた生成物を蒸留水に溶解し、蒸留水に対して透析し、 そして次に凍結乾燥した。 主要な特性を表Ｉに記載する以下の化合物、すなわち、デシル−ＰＡＡ（Ｃ１ ０−ＰＡＡ）、オクチル−ＰＡＡ（Ｃ８−ＰＡＡ）、ブチル−ＰＡＡ（Ｃ４−Ｐ ＡＡ）、及びメチル−ＰＡＡ（Ｃ１−ＰＡＡ）を合成した。 これらの化合物のエステル化の度合いをＮＭＲ分析により測定した。それをｍ ｏｌ％の単位で表す。 もし必要ならわずかに加熱しながら、これらのアルキル−ＰＡＡをリン酸バッ ファー（ｐＨ＝７．５）に溶解し、そして１容量のアジュバント溶液を１容量の 抗原を含んでいる溶液と混合した。 実施例２ アジュバントなしに株Ｍ４１及びＤ２７４を含んでなる、不活性化したＮＤＶ （ニューカッスル病ウイルス）ウイルス（Ｋｉｍｂｅｒ株）及び不活性化したＩ ＢＶ（伝染性気管支炎ウイルス）ウイルス（ｉＮＤＶ／ｉＩＢＶ）を含んでなる ０．５ｍＬのワクチンで、筋肉内注射（ＩＭ）により、ニワトリを４週の年齢で 、そして次に７週の年齢で今度はアジュバントを含む同じ抗原で免疫した。 陰性コントロール群の動物には、アジュバントの代わりにリン酸緩衝食塩水（ ＰＢＳ）溶液を与え、そして陽性コントロール群の動物には、鉱油中の水に基づ く標準アジュバントを含んでなるワクチンを接種した。 二回目のワクチン接種後３週で、ニワトリから血液を抜き取り、そしていくつ かの実験においては、数週間後に再び血液サンプルを集めた。 これらの血液サンプルを室温でインキュベートし、２時間後に血餅を除去し、 残っている細胞を遠心分離（２７００Ｇで１０分）により除き、そして各動物の 血清サンプルを集め、用いるまで−２０℃で保存した。 不活性化し、炭酸緩衝溶液（ｐＨ＝９．６；０．１Ｍ）中に希釈した、精製し たＮＤＶで９６穴マイクロタイタープレートを３７℃で２時間飽和させた。これ らのプレートを、炭酸バッファー中５％（重量／容量）のスキムミルク（ＳＫＭ ）で一晩４℃で飽和させた。 １容量の血清を４容量のホウ酸バッファー中２５％（重量／容量）のカオリン （ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．、Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ、Ｕ．Ｓ ．Ａ．）と３０分間インキュベートすることにより、ニワトリの血清をカオリン で処理した。次に、カオリンを遠心分離により除いた。 ニワトリの血清を、１％（重量／容量）ウシ血清アルブミンを含んで いるＰＢＳ（ＰＢＳ／ＢＳＡ）中に１００倍に希釈した。これらの血清サンプル を９６穴プレートにおいて同じ溶液中で順次２倍に希釈し、これらのプレートを ３７℃で１ないし２時間インキュベートする。ヤギにおいて作製し、そしてペル オキシダーゼに結合した、ＰＢＳ／ＳＫＭ中に１／１０００希釈したニワトリ抗 −ＩｇＧを加え、これらのプレートを３７℃で１−２時間インキュベートする。 ＡＢＴＳ＋Ｈ₂Ｏ₂の基質溶液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂ ｓ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．）の添加によりプレート中のペルオキシダーゼの量を定量し 、マルチスキャンＴｉｔｅｒｔｅｋを用いて４０５ｎｍで吸収を測定した。 逆数の希釈係数に対する光学密度プロットの回帰係数の２−ｌｏｇ値の形態に おいて、抗体価を表す。 相乗平均（値２−ｌｏｇ＋／−ＳＥＭ）及びこれらの平均の真数値（２の平均 乗）によっても、抗体価を表した。アジュバントの活性を、以下のように計算さ れる増加の割合として表した。 ％増加＝［真数（サンプル）−真数（陰性コントロール）］／［真数（陽性 コントロール）−真数（陰性コントロール）］＊１００ これらの結果の統計的有意性を分析するためにスチューデントのｔ検定を行い 、値ｐ＞０．０５を有意であるとみなした。 ４つの別個の実験において、一つまたはそれより多い部分的にエステル化した ポリアクリル酸のアジュバント効果を、エステル化していないＰＡＡのアジュバ ント効果と、並びにアジュバントを含まない陰性コントロール群（ＰＢＳ）及び 鉱油中の水（Ｗ／Ｏ）を含む陽性コントロール群と比較した。 上記の間接ＥＬＩＳＡ法を用いて抗体価を測定した。これらの実験の 結果を表IIに記載する。 陽性及び陰性コントロール群は、４つの別個の実験において再現性のある抗体 価を生じ、そして陽性コントロールの抗体価は、陰性コントロール群のものより ３ないし４の２−ｌｏｇ単位（８−１６倍）高かった。 （被修飾）ＰＡＡは、６％及び３２％の間で抗−ｉＮＤＶ抗体の力価を増加し （実験Ｉ−IV）、この増加は、服用量に依るようであった（実験IV）。最高の刺 激が４０ｍｇ／ｍｌの服用量で得られる（実験II）。 アルキル−ＰＡＡは、非修飾ＰＡＡより著しく大きい反応を引き起こした。オ クチル−ＰＡＡ及びブチル−ＰＡＡは、デシル−ＰＡＡ、ｔ−ブチル−ＰＡＡ、 またはメチル−ＰＡＡより高い力価を生じた。 最大の反応が、８−４０ｍｇ／ｍＬの服用量のオクチル−ＰＡＡまたはブチル −ＰＡＡで得られた。これらの反応は、陽性コントロールとして用いた油及び水 に基づく標準アジュバントで得られた反応と同じくらい大きかった。 実験IVは、反応が、少なくともブチル−ＰＡＡに関する限り１−１６ｍｇ／ｍ Ｌの範囲において、用いた修飾ＰＡＡの服用量に依ることを示している。非常に 少ない投与量--１−２ｍｇ／ｍＬ--でさえ、ブチル−ＰＡＡは、体液性反応を著 しく増大した。かなり多い服用量の非修飾ＰＡＡで得られる抗体の力価に匹敵す るものが得られた。 体液性反応は、用いた修飾ＰＡＡの服用量と共に増加し、水及び油に基づく標 準アジュバントにより引き起こされるものに等しい最大値に達する。２４−４０ ｍｇ／ｍＬのブチル−ＰＡＡ及びオクチル−ＰＡＡの服用量は、８ｍｇ／ｍＬの 服用量より弱い反応を時々引き起こし、このことはこれらの化合物の最適濃度の 存在を示し、それは８−２４ｍｇ／ｍＬである。実施例３ 個々の血清サンプルにおける抗−ＮＤＶ抗体の力価を、プロトコルに従って、 市販されている抗−ｉＮＤＶ ＥＬＩＳＡキット（Ｆｌｏｃｋｃｈｅｃｋニュー カッスル病抗体検査キット；ＩＤＥＸＸ Ｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｍａｉｎｅ、Ｕ ．Ｓ．Ａ．）を用いても測定した。 これらの分析の結果を表IIIに記載する。 ４つの実験において、陰性コントロールの平均値間の違いは小さかった。４つ の実験において、陽性コントロールの平均値の違いも小さかった。修飾ＰＡＡｓ ２３−２１８％、ブチル−ＰＡＡ及びオクチル−ＰＡＡのアジュバントは、メ チル−ＰＡＡまたはデシル−ＰＡＡより効果的であった。 この方法により得られた結果は、これらの試験のために特に開発した最初の分 析方法の結果を確証する。実施例４ ９６穴プレートにおいて、抗血清の段階的な希釈を１０⁶感染性粒子（ＰＦＵ ）のＫｉｍｂｅｒ ＮＤＶ株と共に３７℃で１８時間インキュベートした。各ウ ェルに、１０⁵細胞のニワトリ（ａｖｉａｒｙ→ａｖｉａｎ？）系ＱＴ３５をプ レートに加え、置いた。これらのプレートを 蓋し、３７℃でさらに４８時間インキュベートした。感染性粒子の数において５ ０％の減少を生じる血清希釈を、抗体価であるとみなした。 これらの実験の結果を表IVに記載する。 陰性及び陽性コントロール群の動物は、４つの別個の実験において再現性のあ る抗体価を生じた。非修飾ＰＡＡにより達成される増加の割合は、用いたＰＡＡ の服用量の関数として４−３７％であった。 全てのアルキル−ＰＡＡは、非修飾ＰＡＡより大きい反応を引き起こした。 アルキル−ＰＡＡにより引き起こされた反応の特質は、用いたアルキル鎖の型 及びＰＡＡのエステル化の度合いに依った。 ブチル−ＰＡＡでは、アジュバントの服用量及び体液性反応の間に密接な関係 が見られ（実験IV）、一方、オクチル−ＰＡＡでは、４０ｍｇ／ｍＬの服用量に 対する反応が、必ずしもより少ない服用量より大きい反応を引き起こすとは限ら ず、このことは、オクチル−ＰＡＡの最適量が２４ｍｇ／ｍＬ及び４０ｍｇ／ｍ Ｌの間であることを示している。 ウイルス中和（ＶＮ）試験により行われた、抗体の生物学的機能の評価は、２ つのＥＬＩＳＡ試験及びＶＮ試験の間の密接な相関関係を示した。実施例５ ＰＡＡのアジュバント活性をマウスにおいても試験した。 ｍＬ当たり１０μｇの不活性化したインフルエンザウイルス（株ＭＲＣ−１１ ）及び１ｍｇのオボアルブミン（ＯＶＡ）（ＳＩＧＭＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）からな る１容量の抗原溶液、並びに１容量のアジュバントを含んでなる２５μＬのワク チンを、６匹のマウスの群に接種した。注射 後３週で、実施例１において記述した間接ＥＬＩＳＡ法を用いて抗体価を測定し た。 マウスの血清を、ＰＢＳ中５％のスキムミルク溶液（ＰＢＳ／ＳＫＭ）に前も って希釈した。これらの血清サンプルを９６穴プレートにおいて同じ溶液中で順 次２倍に希釈し、これらのプレートを３７℃で１−２時間インキュベートした。 ヤギにおいて作製し、そしてペルオキシダーゼに結合した、ＰＢＳ／ＢＳＡ中に １／３００希釈したマウス抗−ＩｇＧを加え、これらのプレートを３７℃で１− ２時間インキュベートした。ＡＢＴＳ＋Ｈ₂Ｏ₂の基質溶液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒ ｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｓ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いてプレート中のペルオ キシダーゼの量を定量し、マルチスキャンＴｉｔｅｒｔｅｋを用いて４０５ｎｍ で吸収を測定した。 これらの実験の結果を表Ｖに記載する。 ２つの別個の実験は異なる結果を生じたので、脂肪族鎖の添加によるＰＡＡの アジュバント活性における増加は、マウスにおいて部分的にのみ確認された。実施例６ アジュバント活性に加えて、他の特性がワクチンを評価することにおいて重要 である。これらの特性は、注射部位でのあるレベルの反応はいくつかの動物種に より一般的に受け入れられるけれども、重要な特徴である局所反応を含む。マウ スの脚の肉趾へのワクチンの注射後、マウスの脚の腫れを観察することにより、 局所毒性を生体内で試験した。この方法は非常に感度が高いことが示されている 。 ＮａＣｌ ０．９％（重量／容量）のｍＬ当たり１０μｇのＭＲＣ−１１及び １ｍｇのオボアルブミンを含んでいる１容量の抗原溶液で希釈した１容量のアジ ュバントを含んでいる２５μＬ＋／−５μＬのワクチンを、６匹のマウスの群の 左後ろ脚の裏に（皮下）注射した。 オランダのＵｔｒｅｃｈｔ州立大学によりこの目的のために特に考案された半 電子（ｓｅｍｉｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ）装置を用いて、注射の１日前及び注射後 異なる間隔で脚の太さを測定した。この装置の精度は、０．０２ｍｍ近くまでで あることが示されている。 ０．０１ｍｍ単位で表される、処置の前後の太さの間の違いを得ることにより 、脚の腫れを計算した。 これらの実験の結果を表VIに記載する。 マウスにおけるＰＡＡの局所毒性はほどほどであり、マウスの脚の腫れは数日 後に最大に達し、次いで２または３週後に徐々に減少する。 ＰＡＡへのアルキル鎖の添加は局所反応を増大するが、しかしながら、これは 注入した量により２−５週後に消失する。オクチル基は、ブチル基より強い反応 を誘発する。 それに反して、油及び水に基づくアジュバントの注入により引き起こされる腫 れは、８週間以上持続するかなり大きい腫れを生じる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｃ Ａ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． アニオン構成反復単位及び疎水性構成反復単位を有するポリマーの水溶 液を含んでなるワクチン用アジュバント。 ２． アニオン構成反復単位を形成するためのモノマー単位が、アクリル酸、 メタクリル酸、マレイン酸、フマル酸、エチレンスルホン酸、ビニル硫酸、スチ レンスルホン酸、ビニルフェニル硫酸、２−メタクリロイルオキシエタンスルホ ン酸、３−メタクリロイルオキシ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、２−ア クリル−２−メチルプロパンスルホン酸、３−アクリルアミド−３−メチルブタ ン酸、３−メタクリルアミド−３−メチルブタン酸、ビニルリン酸、４−ビニル 安息香酸、３−ビニルオキシプロパン−１−スルホン酸、及びＮ−ビニルスクシ イミド酸から選択されることを特徴とする、請求の範囲１に記載のアジュバント 。 ３． アニオン構成反復単位を形成するためのモノマー単位が、アクリル酸、 メタクリル酸、マレイン酸、フマル酸、エチレンスルホン酸、ビニル硫酸、及び スチレンスルホン酸から選択されることを特徴とする、請求の範囲２に記載のア ジュバント。 ４． アニオン構成反復単位を形成するためのモノマー単位が、アクリル酸、 メタクリル酸、マレイン酸、及びフマル酸から選択されることを特徴とする、請 求の範囲３に記載のアジュバント。 ５． アニオン構成反復単位を形成するためのモノマー単位がアクリル酸単位 であることを特徴とする、請求の範囲４に記載のアジュバント。 ６． 疎水性構成反復単位を形成するためのモノマー単位が、アクリル酸、メ タクリル酸、マレイン酸、フマル酸、エチレンスルホン酸、ビニル硫酸、スチレ ンスルホン酸、ビニルフェニル硫酸、３−メタクリロ イルオキシ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、２−メタクリロイルオキシエ タンスルホン酸、２−アクリル−２−メチルプロパンスルホン酸、３−アクリル アミド−３−メチルブタン酸、３−メタクリルアミド−３−メチルブタン酸、ビ ニルリン酸、４−ビニル安息香酸、３−ビニルオキシプロパン−１−スルホン酸 、またはＮ−ビニルスクシイミド酸のアルキルエステル、シクロアルキルエステ ル、及びヒドロキシアルキルエステル、並びにエーテルから選択されることを特 徴とする、請求の範囲１に記載のアジュバント。 ７． 疎水性構成反復単位を形成するためのモノマー単位が、アクリル酸、メ タクリル酸、マレイン酸、フマル酸、エチレンスルホン酸、ビニル硫酸、または スチレンスルホン酸のアルキルエステルから選択されることを特徴とする、請求 の範囲６に記載のアジュバント。 ８． 疎水性構成反復単位を形成するためのモノマー単位が、アルキル基が４ −８個の炭素原子を含む、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸、またはフマ ル酸のアルキルエステルから選択されることを特徴とする、請求の範囲７に記載 のアジュバント。 ９． 疎水性構成反復単位を形成するためのモノマー単位が、アルキル基が４ −８個の炭素原子を含む、アクリル酸の直鎖状アルキルエステルから選択される ことを特徴とする、請求の範囲８に記載のアジュバント。 １０． アニオン構成反復単位に対する疎水性構成反復単位のモル比が０．０ ５及び１．００の間であることを特徴とする、請求の範囲１−９のいずれか一つ に記載のアジュバント。 １１． アニオン構成反復単位に対する疎水性構成反復単位のモル比 が０．１０−０．４０であることを特徴とする、請求の範囲１−１０に記載のア ジュバント。 １２． ポリマーの分子量が１０−１０，０００ｋＤであることを特徴とする 、請求の範囲１に記載のアジュバント。 １３． 液体の媒質が、水溶液、懸濁液、またはエマルジョンであることを特 徴とする、請求の範囲１−１２のいずれか一つに記載のアジュバント。 １４． ポリマーが水溶性であることを特徴とする、請求の範囲１−１３のい ずれか一つに記載のアジュバント。 １５． 免疫を生じる量の抗原及び先行の請求の範囲の一つに記載のアジュバ ントを含んでなるワクチン。 １６． アジュバントの濃度が１−４０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは４−２４ｍｇ ／ｍＬであることを特徴とする、請求の範囲１５に記載のワクチン。 １７． アジュバントに加えて、家畜の予防接種用のニューカッスル病ウイル ス（ＮＤＶ）及び／または伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）の不活性化した抗 原を含んでなることを特徴とする、請求の範囲１５に記載のワクチン。 １８． ワクチン中のアジュバントとしての、疎水性構成反復単位及びアニオ ン構成反復単位を有するポリマーの使用。 １９． ポリマーが、請求の範囲２−５の一つに記載のアニオン構成反復単位 及び請求の反復６−９の一つに記載の疎水性構成反復単位を有することを特徴と する、請求の範囲１８に記載の使用。 ２０． 抗原の水性混合物、並びに疎水性構成反復単位及びアニオン 構成反復単位を有するポリマーが混合されることを特徴とする、溶液中のワクチ ンの調製方法。