JPH11502192A - ワクチンのアジュバント - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 界面を形成する構成物と組み合わせたスルホリピド多糖を含むワクチンのアジュバント。本発明はまた、抗体およびスルホリピド多糖の水溶液を乳化することによるワクチンの調製方法も提供する。当該アジュバントは高温で安定であり、かつ、少なくとも慣習的アジュバントと同じくらい有効である。それらの局所毒性すなわちそれらの反応生成性は一般に慣習的アジュバントのそれより低い。

Description

【発明の詳細な説明】 ワクチンのアジュバント 本発明は新規のワクチンのアジュバントに関する。 抗原は、例えば非経口に投与される場合に免疫応答、例えば抗体の形成を誘導 する、所定の生物体に対しての外来物質として定義される。 抗体は血液および他の体液中、ならびに組織中に含有される物質であり、また 、抗原と結合してそれを無毒にする物質である。抗体は身体の生来の防御メカニ ズムのひとつを構成する。それらは高度に特異的であり、また、それらの形成を 誘導した抗原を殺し得、それらに結合し得、もしくは無毒にし得る。 抗原は、免疫系に接触することで複雑な一連の細胞の相互作用を活性化し、抗 原を排除しそして／もしくは先にある平衡を再度確立する。 抗原の特徴的特色のうちの２つは、それらの免疫原性、すなわちインビボで免 疫応答を誘導するそれらの能力（特異的抗体の形成を包含する）、および、それ らの抗原性、すなわちその起源がその抗原である抗体により選択的に認識される それらの能力である。 ワクチンにより特異的抗原を投与することにより免疫応答を故意に刺激する方 法は既知である。当該処置は、当該抗原とのその後の接触の間のその生物体のよ り迅速かつより効果的な応答を可能にする、その生物体での免疫応答の状態の獲 得を可能にする。 しかしながら、若干の抗原は弱い免疫原性のみを有し、かつ、それらはその生 物体の有効な保護を獲得するのに不十分な免疫応答を誘導する。 抗原の免疫原性はアジュバントと呼ばれる物質との混合物でそれを投与するこ とにより増強され得る。アジュバントは、免疫系に直接作用す ることによるか、もしくは当該抗原の薬物動態的特徴を修飾することによるかの いずれかで、および、かように後者と免疫系との間の相互作用時間を増加させる ことにより、当該抗原に対する応答を増強する。 この時点で、多数の獣医学のワクチンは、鉱物油中水型（Ｗ／Ｏ）もしくは水 中鉱物油型（Ｏ／Ｗ）のアジュバントのような、鉱物油の標準的乳剤をなお含む アジュバントを使用する。何年かの間、低減された毒性で類似の有効性を有する 代替物を見出すために研究が実施されてきた。鉱物油に基づくこれらの標準的ア ジュバントの注入は、その重篤度が乳剤のタイプおよび使用される油の性質に大 部分依存する局所反応をしばしば伴う。鉱物油に基づくアジュバントの使用は結 果として家畜（ブタ、ニワトリ、反芻動物、など）および実験動物に限られる。 より以前、水中スクアラン（Ｓ）（Ｓ／Ｗ）乳剤に組み込まれた、硫酸基およ び脂質基をもつ、ポリスクロースおよびエピクロリドリン（原文ママ；エピクロ ロヒドリン）の合成コポリマー（フィコール）（ＳＬ−フィコール）が、いくつ かの重要なウイルス抗原を包含する異なるタイプの抗原に対し、異なる動物種（ ブタを含む）に対する高いアジュバント効果を有したことが示されている（ワク チン(Vaccine)、Vol.12、pp.653-660(1994)およびワクチン(Vaccine)、Vol.12、 pp.661-665(1994)、欧州特許第EPO 0,549,074号）。フィコールに基づくアジュ バントのこれらの処方は、種々の豚のワクチンで使用される水中鉱物油の標準的 処方に置き換わるのに十分に有効である。 しかしながら、局所毒性、すなわちブタおよびマウスでのフィコールに基づく これらの処方の反応生成性は、Ｏ／Ｗ型の鉱物油の標準的処方のそれより弱いこ とが判明しなかった。 加えて、フィコールに基づく処方に関しては、温度がその乳剤の安定性に対し 著しい効果を有する。これらの乳剤のいくつかは４℃で数年間安定であったが、 しかし、水相および油相は37℃で数日以内に、また60℃でおよそ10分以内に分離 した。 本発明の目的は、高温で増大した安定性を有しかつより低い局所毒性を呈する 、ワクチンのための有効なアジュバントを提案することである。 この目的は、界面を形成する構成物と組み合わされたスルホリピド多糖を含む 、ワクチンのためのアジュバントにより達成される（例えば、油／水型（Ｏ／Ｗ ）の乳剤）。 本発明によるアジュバントの利点のひとつは、それがフィコールに基づくアジ ュバントより高温でより安定であることである。 この目的は、界面を形成する構成物と組み合わせられたスルホリピド多糖を含 む、ワクチンのためのアジュバントにより達成される。 「多糖」という表現は、互いに共有結合された最低３個の反復する糖単位を有 する化合物を意味する。 「スルホリピド多糖」という表現は、互いに共有結合された最低３個の反復す る糖単位、最低１個の硫酸基、および最低１個の脂質基を有する化合物を意味す る。 好ましくは、スルホリピド多糖は疎水性多糖である。 「疎水性多糖」という表現は、無極性有機相よりも水相でより小さく可溶性で ある多糖を意味する。 最初の有利な態様により、スルホリピド多糖はシクロデキストリン、マルトデ キストリン、イヌリン、フィコールおよびプルランから成る群から選択される。 好ましくは、スルホリピド多糖はシクロデキストリン、マルトデキストリンお よびイヌリンから成る群から選択される。 好ましいスルホリピド多糖はシクロデキストリンである。 当該スルホリピド多糖は、その疎水性の特徴を維持しながら、平均で単糖あた り最低0.01個の硫酸基を含有する。好ましくは、当該スルホリピド多糖は、その 疎水性の特性を維持しながら、平均で単糖あたり最低0.12個の硫酸基を含有する 。 当該スルホリピド多糖は、その疎水性の特徴を維持しながら、平均で単糖あた り1.0個を超えない硫酸基を含有する。好ましくは、当該スルホリピド多糖は、 その疎水性の特徴を維持しながら、平均で単糖あたり0.23個を超えない硫酸基を 含有する。 好ましくは、スルホリピド多糖がマルトデキストリンである場合、それはその 疎水性の特徴を維持しながら、平均で単糖あたりおよそ0.23個の硫酸基を含有す る。 好ましくは、スルホリピド多糖がシクロデキストリンである場合、それはその 疎水性の特徴を維持しながら、平均で単糖あたりおよそ0.20個の硫酸基を含有す る。 好ましくは、スルホリピド多糖がイヌリンである場合、それはその疎水性の特 徴を維持しながら、平均で単糖あたりおよそ0.19個の硫酸基を含有する。 好ましくは、スルホリピド多糖がプルランである場合、それはその疎水性の特 徴を維持しながら、平均で単糖あたりおよそ0.16個の硫酸基を含有する。 好ましくは、スルホリピド多糖がフィコールである場合、それはその 疎水性の特徴を維持しながら、平均で単糖あたりおよそ0.12個の硫酸基を含有す る。 平均で、当該スルホリピド多糖は、その疎水性の特徴を維持しながら、単糖あ たり最低0.01個の脂質基を含有する。好ましくは、当該スルホリピド多糖は、そ の疎水性の特徴を維持しながら、平均で単糖あたり最低1.05個の脂質基を含有す る。 平均で、当該スルホリピド多糖は、その疎水性の特徴を維持しながら、単糖あ たり2.0個を超えない脂質基を含有する。好ましくは、当該スルホリピド多糖は 、その疎水性の特徴を維持しながら、平均で単糖あたり1.29個を超えない脂質基 を含有する。 好ましくは、スルホリピド多糖がマルトデキストリンである場合、それはその 疎水性の特徴を維持しながら、平均で単糖あたりおよそ1.29個の脂質基を含有す る。 好ましくは、スルホリピド多糖がシクロデキストリンである場合、それはその 疎水性の特徴を維持しながら、平均で単糖あたりおよそ1.05個の脂質基を含有す る。 好ましくは、スルホリピド多糖がイヌリンである場合、それはその疎水性の特 徴を維持しながら、平均で単糖あたりおよそ1.24個の脂質基を含有する。 好ましくは、スルホリピド多糖がプルランである場合、それはその疎水性の特 徴を維持しながら、平均で単糖あたりおよそ1.24個の脂質基を含有する。 好ましくは、スルホリピド多糖がフィコールである場合、それはその疎水性の 特徴を維持しながら、平均で単糖あたりおよそ1.22個の脂質基 を含有する。 当該脂質基は好ましくは４−22個の炭素原子を含有する。 硫酸基と脂質基の比は、有利には脂質基あたり硫酸基0.01−２個である。好ま しくは、硫酸基と脂質基の比は、その化合物の疎水性の特徴を維持しながら、脂 質基あたり硫酸基0.10−0.19個である。 好ましくは、スルホリピド多糖がマルトデキストリンである場合、硫酸基と脂 質基の比は、その疎水性の特徴を維持しながら、脂質基あたり硫酸基およそ0.18 個である。 好ましくは、スルホリピド多糖がシクロデキストリンである場合、硫酸基と脂 質基の比は、その疎水性の特徴を維持しながら、脂質基あたり硫酸基およそ0.19 個である。 好ましくは、スルホリピド多糖がイヌリンである場合、硫酸基と脂質基の比は 、その疎水性の特徴を維持しながら、脂質基あたり硫酸基およそ0.15個である。 好ましくは、スルホリピド多糖がプルランである場合、硫酸基と脂質基の比は 、その疎水性の特徴を維持しながら、脂質基あたり硫酸基およそ0.13個である。 好ましくは、スルホリピド多糖がフィコールである場合、硫酸基と脂質基の比 は、その疎水性の特徴を維持しながら、脂質基あたり硫酸基およそ0.10個である 。 「界面を形成する構成物」（すなわち「ＩＦＣ」）という表現は、水性媒体中 で物質と水相との間に物理的界面を形成する物質を意味する。 界面を形成する構成物は、水と混合できない液体（例えば、スクアラン、ダイ ズ油、鉱物油、ヘキサデカン）もしくは水相に不溶である固形 物から成る群から選択される。 本発明の水相に不溶な固形物は、不溶性塩（例えば、Ａｌ(ＯＨ)₃、ＡＩＰＯ₄ 、ミョウバン、オキザロ酢酸カルシウム）、微粒子、ナノ微粒子、ひとつもしく はそれ以上のポリマー、コポリマー（例えば、ポリアクリル酸エステル、ポリメ チルメタクリル酸エステル、ポリシアノアクリル酸エステル、ポリアクチド、ポ リグリコリド）のミクロスフェアおよびナノスフェア、あるいは脂質二重相もし くは脂溶性作用物質（例えばリン脂質）または界面活性剤のミセルを含む。 好ましくは、「ＩＦＣ」成分は水と混合できない液体である。 有利には、界面を形成する構成物は、ダイズ油、スクアランおよびヘキサデカ ンから成る群から選択される。 ワクチンのための安定なアジュバントは、スルホリピド多糖の（疎水性の）誘 導体、界面を形成する構成物、および乳化剤を含むそれらである。 加えて、本発明によるアジュバントの有効性は、標準的アジュバントのそれに 匹敵するかもしくはより大きくさえある。局所毒性、すなわち本発明によるアジ ュバントの反応生成性は、一般に標準的アジュバントのそれより小さく、また、 フィコールに基づくアジュバントのそれより小さい。 比較的より低い分子量のスルホリピド多糖が低減された局所毒性を有するよう である。 本発明の別の局面により、スルホリピド多糖をワクチンのアジュバントとして 使用することが提案される。 本発明のさらに別の態様により、乳剤中のワクチンを調製する方法が 提案される。これは抗原の水溶液がスルホリピド多糖、乳化剤および界面を形成 する構成物の存在下に乳化されることを特徴とする。 本発明の別の局面により、免疫原性の量の抗原（免疫原）および本発明による アジュバントを含むワクチンが提案される。 好ましくは、アジュバントの濃度は0.1−100mg/mL、好ましくは２−20mg/mLで ある。 当該ワクチンは、アジュバントの他に、例えば不活性化されたウイルス、生存 ウイルス、細菌、サブユニット、タンパク質、ペプチドならびに不活性化ＭＲＣ −11株インフルエンザウイルス、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、不活性化Ａ／Swin e株インフルエンザウイルス、および／もしくは不活性化偽狂犬病ウイルス（ｉ ＰＲＶ）の抗原を含む。 測定される抗体力価は商業的製品で使用される水中鉱物油の乳剤により得られ るそれらより高かった。ＳＬ−フィコールと当該乳剤との間に強い相乗活性が存 在することが見出されており、これはマウスでよりブタでより著しい（ヒルガー ス(Hilgers)ら、ワクチン(Vaccine)、Vol.12、pp.661-664、1994）。マウスでの 抗体応答は有意に増大した（ヒルガース(Hilgers)ら、ワクチン(Vaccine)、Vol. 12、pp.653-660、1994）。 反応生成性は処方中に包含される多糖および油のタイプに依存し、また、多糖 の分子量が重要な因子のうちのひとつであるという結論が引き出される。 シクロデキストリンおよびそれらの誘導体は、例えば製薬学的目的の物質のよ うな他の物質を、それらの環状構造により形成されるくぼみに封入する封入複合 体を形成するそれらの能力についてよく知られている。 これらの封入複合体により提供される利点は、溶解性、バイオアベイ ラビリティーおよび／もしくは化学的安定性の改善、半減期の長さの増大、二次 的効果の低下、ならびに、液体製剤の開始点として使用されるべき乾燥粉末のよ り容易な獲得のような産生の間のある利点を包含する。 シクロデキストリンに基づくスルホリピド多糖（ＳＬＰ）はかように上に記述 されるアジュバントとしてのそれらの使用に加えて興味深い応用を有し得る。 実際、ＳＬ−シクロデキストリンは、これらの分子中の陰イオン基（硫酸基） および疎水性基（脂肪鎖）の同時の存在により界面活性剤である。この特性は、 水相でのミセルもしくは他の界面活性剤の存在下での混合ミセルの形成、ならび に水と混合できない液体の乳剤、不溶の粒子の水相中の懸濁剤の形成、または水 相と液体もしくは固形の不溶物質との間の界面の形成の発端である。 かように、ＳＬ−シクロデキストリンは封入複合体の形成が可能であることお よび界面活性剤であることの二重の利点を呈する。 それらは、かように、製薬学的分野での独創的応用にそれら自身を与える新規 の特性を呈する生成物の一族を形成すると考えられ得る。 多数の異なるＳＬ−シクロデキストリンが得られており、それらは、シクロデ キストリンのタイプ（例えば、α、β、γ）、硫酸基の含量ならびに脂質基の含 量および性質から生じるそれらの物理化学的特性において異なる。 実施例１ 異なる多糖が、合成に使用される有機溶媒でのそれらの溶解性を決定するため 試験されており、そして不十分な溶解性をもつそれらは断念された。マルトデキ ストリン（マルトデキストリン15；アミルム(Amylum)、 ベルギー）4.5g、β-シクロデキストリン（アクロス(ACROS)）4.5g、イヌリン（ ダリアの塊茎、シグマ(Sigma)、ＵＳＡ）4.5gおよびプルラン（林原株式会社）4 .5gを、無水ジメチルホルムアミドおよび無水ピリジン（体積比１：１）の混合 物（100mL）に別個に溶解した。短時間（48時間）、これらの多糖の溶液を分子 メッシュ（サイズ２Ａ）（メルク(Merck)、ダルムシュタット、ドイツ）により 乾燥した。塩化ラウロイル（メルク、ドイツ）6.6gを添加し、そして当該混合物 を60℃で６時間さらに室温（およそ15−22℃）で18時間インキュベーションした 。その後、無水ジメチルホルムアミドおよび無水ピリジンの混合物（10mL）中の クロロスルホン酸（メルク、ドイツ）0.6gを添加し、そして室温でのインキュベ ーション処置を繰り返した。溶媒を60℃で１−２時間の減圧（200mb）での蒸発 により除去し、そして、10,000Ｄのカットオフ閾値を有する再生セルロース膜（ スペクトラ(SPECTRA)／ＰＯＲ）を使用し、等張のリン酸緩衝液処理生理的食塩 水溶液（この生理的食塩水ＰＢＳ溶液は、7.3のｐＨを有し、水１リットルあた り、塩化ナトリウム８g、塩化カリウム0.2gおよびリン酸水素二ナトリウム1.15g を含む）を使用し、さらにその後超純水を使用して、濾液中に溶媒の痕跡が検出 されなくなるまで透析した。透析溶液（ＰＢＳ生理的食塩水溶液もしくは超純水 ）と透析の間に使用される残渣との間の体積比は10：１（体積／体積）より上に 維持する。透析は最低10日間実行し、透析溶液は最低１日１回交換する。このよ うに得られたスルホリピド多糖（ＳＬＰ）を、0.1mbより小さな内圧かつ−25℃ より低い温度のコールドトラップで、室温で凍結乾燥した。 ＳＬＰの組成を、上に記述されるように（ワクチン(Vaccine)、Vol.1 2、pp.653-660）、多糖、結合された硫酸基、総脂質含量および結合された脂質 含量をアッセイすることにより測定した。 ２体積／体積（ｖｏｌ／ｖｏｌ）％のトウィーン(Tween)80を含有するリン酸 緩衝液処理生理的食塩水溶液（ＰＢＳ）中の１重量／体積（ｗｔ／ｖｏｌ）％の ＳＬＰの溶液は、まず、ＳＬＰを最小体積(20mL)のメチルブチルエーテル（メル ク）中に溶解することにより、ＳＬＰ１グラムあたり２mLのトウィーン 80（メ ルク）を添加することにより、そして、トウィーン 80中のＳＬＰの粘稠な溶液 が得られるまで高温（±60℃）でおよび減圧（50mb）でメチルブチルエーテルを 蒸発させることにより、調製した。ＳＬＰ１グラムあたり10mLの水をゆっくりと 添加し、そしてその後、適切な量のＰＢＳおよび油を添加した。この混合物をミ クロ流動化装置（マイクロフルイディクス コープ(Microfluidics Corp.)、ニ ュートン、ＵＳＡ）を使用し、顕微鏡下（倍率1000×）で２もしくは３μmより 大きな油滴が見えなくなるまで乳化した。この乳剤は、使用するまで４℃で保存 した。 ワクチンは、１体積の抗原を１体積のアジュバントと混合することにより調製 した。抗原は上に記述されるように（ワクチン(Vaccine)、Vol.12、pp.653-660 およびワクチン(Vaccine)、Vol.12、pp.661-665）調製した。異なる抗原の２個 の溶液を使用した。すなわち、溶液IIは、１mLあたり、不活性化インフルエンザ ウイルスＭＲＣ−11株（ソルヴェイ ダファー(SOLVAY DUPHAR)）10μg＋1000μ gＯＶＡ（シグマ）を含み、また、溶液Ｉは、１mLあたり、不活性化インフルエ ンザウイルスＡ／Swine株（ソルヴェイ ダファー）4.4μg/mL、ＭＲＣ−11株の 不活性化インフルエンザウイルス（ソルヴェイ ダファー）4.0μg、Ｘ−79株の 不 活性化インフルエンザウイルス（ソルヴェイ ダファー）2.0μgおよび10⁸ Ｔ ＣＩＤ₅₀の不活性化偽狂犬病ウイルス（ｉＰＥＶ）（ソルヴェイ ダファー）を 含む。 ８−10週齢(およそ20g)の雌性ＮＭＲＩマウス（チャールズ リヴァー(Charle s River)、ドイツ）を、ワクチン0.025mLを足に注入することにより免疫し、そ して抗体力価を３週間後に測定した。 抗体力価は幾何平均（²log＋ＳＥＭ）として表した。抗体力価の分析を標準化 された検定により実施した。また、妥当性の基準は以前に記述されている（ワク チン(Vaccine)、Vol.12、pp.653-660）。 ステューデント(Student)のｔ検定を実施して結果の統計学的有意を分析し、 また、ｐ＜0.05は有意であると考えた。 アジュバントの処方をマウスでの２回の独立した実験で試験した。 全てのＳＬＰ／油／水乳剤はＭＲＣ−11株のインフルエンザウイルスに対する およびＯＶＡに対する体液性応答を増大させた。アジュバント効果に関する限り 、異なる処方間に差異が存在することが示されており、また、いくつかはＳＬ− フィコール／Ｓ／Ｗ（の活性）と同等の活性を引き起こした。ＳＬＰのタイプに よるはっきりした効果は観察され得なかった。使用された油のタイプに関しては 、スクアラン（Ｓ）を含む乳剤はヘキサデカンを含有する乳剤より有意に高い応 答を生み出したが、 一方、ダイズ油は最小に高い応答を引き起こした。 実施例２ ８−10週齢のブタを、問題のウイルス抗原に対する抗体のいかなる存在も検出 するために試験し、そして検出可能な抗体力価をもつ動物を排除した。 スヴァキシン(SUVAXYN) Ｏ／Ｗ乳剤（ソルヴェイ ダファー）の名称で販売 される水中鉱物油乳剤、および水中スクアラン乳剤中のＳＬＰの処方を、実施例 １に記述される方法に従って調製した。 アジュバントを含む処方を含有するワクチンを実施例１に記述される方法に従 って調製した。 ＳＬＰ／スクアラン／水の処方を、抗体としてｉＰＲＶならびに不活性化イン フルエンザウイルス（ＭＲＣ−11株およびＡ／Swine株）とともに、ブタに対す るそれらのアジュバント効果を測定するために試験した（第２表）。動物を２回 （第０および第３週）免疫しそして抗体力価を２回目の注入３週後（第６週）に 測定した。 ＰＲＶに対する抗体（抗ＰＲＶ）の力価は、ＳＬ−フィコール／スクアラン／ 水、ＳＬ−マルトデキストリン15／スクアラン／水、ＳＬ−イヌリン／スクアラ ン／水およびＳＬ−シクロデキストリン／スクアラン／水の乳剤により増大した 。測定された抗体力価は商業的製品で使用される水中鉱物油の乳剤により得られ るそれらに匹敵するかもしくはより高かった。Ａ／Swineに対する抗体応答もま た、異なるＳＬＰ／スクアラン／水の処方により増大したが、しかし、ある応答 は標準的な油／水乳剤により得られるそれらと同じくらい高かった。ＭＲＣ−11 に対する抗体の力価は異なる処方により増大し、また、いくつかのＳＬＰ／スク アラン／水の乳剤は鉱物油／水乳剤で得られるそれらに匹敵するもしくはより高 い力価を生み出した。 これらの分析の結果は第２表に列挙される。 ２種の動物種に対するアジュバント効果を同時に試験する先行する実験から、 ＳＬ−フィコールと当該乳剤との間に強い相乗効果が存在すること、および、そ の相乗効果はマウスでよりもブタでより著しいことが示されている（ワクチン(V accine)、Vol.12、pp.653-660、1994；ワクチン(Vaccine)、Vol.12、pp.661-664 、1994）。マウスでの抗体応答は有意に増大し、また、使用される油のタイプの 著しい効果が存在するが しかし多糖のタイプの効果は存在しないことが示されている。 抗原を受けなかった動物と比較した増大の係数はマウスで１もしくは２²log単 位に限られた。ブタでは、このアジュバント効果はより著しく、それは主として アジュバントなしの抗原に対する応答が非常に低いためであった。抗ｉＰＲＶな らびに抗Ａ／Swineおよび抗ＭＲＣ−11の抗体力価は、６²log単位を越えて増加 した。 鉱物油に基づくアジュバントは抗体応答を有意に増大させるが、しかし、異な る新規のアジュバントの処方はより高い力価さえ引き起こした。上に提示される ＳＬ−フィコール／Ｓ／Ｗアジュバント（ワクチン(Vaccine)、Vol.12、pp.653- 660およびワクチン(Vaccine)、Vol.12、pp.661-665）は鉱物油よりも有効である ことが示されたが、一方、いくつかの新規のＳＬＰはＳＬ−フィコールと同等も しくはより大きな活性を発揮している。 実施例３ アジュバント効果以外に、他の特性もワクチンの評価で重要なことである。そ れらは重要な局面である局所反応を包含するが、とは言え注入部位でのあるレベ ルの反応はある動物種により一般に許容される。局所毒性を、ワクチン注入後の マウスの足の腫脹をモニターすることによりインビボで試験した。この方法は非 常に感受性が高いことが示されている。 水中スクアラン、水中ダイズ油、水中鉱物油およびヘキサデカン、の乳剤中の ＳＬＰの処方、ならびにアジュバントなしの対照を、実施例１に記述される方法 に従って調製した。 アジュバントを含む処方を含有するワクチンを実施例１に記述される 方法に従って調製した。 ６匹のマウスの群を、後左足底での皮下注入によりワクチン25μLで処理した 。このワクチンは、ＰＢＳ１mLあたり10μgのＭＲＣ−11および１mgの卵白アル ブミン（ＯＶＡ）を含有する抗原溶液ならびにアジュバント１体積を含んだ。 足の太さは、注入の１日前および注入後いくつかの間隔で、オランダのユトレ ヒト州立大学によりこの目的のために特別に開発された半電子的装置を使用して 測定した。この装置の精度はおよそ0.02mmである。 腫脹を、処理後の足の太さから処理前の足に太さを差し引くことにより算出し 、そしてそれを0.01mmで表す。 これらの実験の結果は第３表に列挙される。 処方は注入部位で異なる程度の腫脹を引き起こし、また、この腫脹は、初期の 数日間、若干の例で非常に強かったが、ゆっくりと消失した（第３表）。ヘキサ デカンを含む乳剤は一般にダイズ油を含有するそれらより強い反応を引き起こし た。ＳＬＰに関しては、ＳＬ−フィコールを含むスクアランの乳剤はより強い腫 脹を引き起こし、これは３週間を超えて維持された。ＳＬ−マルトデキストリン 15、ＳＬ−イヌリンもしくはＳＬ−プルランを含有する乳剤はかなりの腫脹反応 を引き起こしたが、しかしながら、これはＳＬ−フィコールにより引き起こされ たそれらより迅速に消失し、また、それらは１ないし２週間のみ存続した。 異なる油中に包含されるＳＬ−シクロデキストリンの反応生成性は非常に弱い かもしくは非存在ですらあった。スクアランもしくはヘキサデカン中にＳＬ−シ クロデキストリンを含有する乳剤は注入後１もしくは２日間、若干の腫脹を引き 起こし、一方、ダイズ油中のＳＬ−シクロデキストリンは目に見える応答を引き 起こさなかった。 マウスで試験された反応生成性すなわち局所毒性は、油のタイプおよび多糖の タイプの機能としての著しい効果を示した。一般に、ＳＬ−フィコールは試験さ れた他のＳＬＰより強い反応を引き起こした。スクアランもしくは鉱物油のいず れかと組み合わせられたＳＬ−フィコールは非常に強くかつ持続する局所反応を 引き起こしたが、一方、ヘキサデカンおよびダイズ油と組み合わせられたＳＬ− フィコールはそれぞれ中程度もしくはより弱い反応のみを生み出した（第２表） 。スクアランに基づく乳剤はヘキサデカンを含むそれらより有意に強い反応を引 き起こした。ダイズ油は非常に弱い反応のみを引き起こした。 これらの油の疎水性の特徴は異なる。スクアラン、鉱物油およびヘキ サデカンは強く疎水性の炭化水素であり、一方、異なる物質の混合物であるダイ ズ油はより小さく疎水性である。異なる油の疎水性の特徴は、安定な水中乳剤を 得るのに必要とされる界面活性剤のＨＬＢ値により例証される。 ＳＬ−プルランは他の３種のＳＬＰよりも強い局所毒性を引き起こした。ＳＬ −イヌリンおよびＳＬ−マルトデキストリン15はかなりの局所腫脹を引き起こし たが、一方、ＳＬ−シクロデキストリンは１もしくは２日間のみ顕著な反応を引 き起こした。 他の特徴のうち、ＳＬＰはそれらの分子量で異なり、それらはＳＬ−プルラン のそれに等しいＳＬ−フィコールから＞ＳＬ−イヌリン＞ＳＬ−マルトデキスト リン15＞ＳＬ−シクロデキストリンと減少する。反応生成性と分子量との間の並 行が観察され得るが、しかし、直接の関連を確立する他の研究が行われる必要が ある。 上から、反応生成性はその処方に包含される多糖および油のタイプに依存する こと、および、多糖の分子量が重要な因子であることが結論された。 実施例４ マルトデキストリン15、イヌリン、シクロデキストリンおよびプルランのスル ホリピド誘導体を合成し、そしてスクアラン、鉱物油、ヘキサデカンおよびダイ ズ油に基づく水中油乳剤中に取り込み、さらにその安定性をインビトロで検討し た。 本発明のＳＬＰを実施例１に記述される方法に従って合成し、そしてスクアラ ン、ヘキサデカンおよびダイズ油の水中油乳剤中に混合し、そしてそれらの乳剤 の安定性をインビトロで検討した。 水中スクアラン、水中ダイズ油および水中ヘキサデカンの乳剤中のＳＬＰの処 方を、実施例１に記述される方法に従って調製した。 乳剤の安定性を、当該処方を一定時間高温に曝すことにより試験した。一般に 、乳剤は高温でより小さく安定であり、また、より高温での試験はより低温での 長期間の挙動に対する指摘を与えると考えられた。 乳剤の安定性を37℃で測定した。乳剤の無菌のアリコート５mLを37℃でインキ ュベーションし、そして油滴の形成、油相の外観および他の変化を、各日、肉眼 での乳剤の点検で確かめた。 およそ0.1／1.0のＳ／Ｌ比のＳＬＰが、スクアラン、ヘキサデカンおよびダイ ズ油に基づく水中油型の乳剤中に取り込まれた。 チメロサール（シグマ）0.01％（重量／体積）を含む無菌のアリコートを37℃ でインキュベーションし、そして乳剤の状態を肉眼での異なる時間間隔の点検で 確証した。 これらの実験の結果は第４表に列挙される。 スクアラン油、ヘキサデカンもしくはダイズ油のこれらの乳剤中に取り込まれ た新規のＳＬＰ（ＳＬ−プルラン、ＳＬ−イヌリン、ＳＬ−マルトデキストリン 15およびＳＬ−シクロデキストリン）は注目すべき安定性を有する。スクアラン 中のＳＬ−イヌリン、ＳＬ−シクロデキストリンおよびＳＬ−マルトデキストリ ン15の乳剤は37℃で53日間以上安定のままである。これはＳＬ−フィコール／ス クアラン／水の乳剤と比較して大きな改善であると考えられる。37℃での安定性 試験の制限された予言的価値にもかかわらず、それは不安定化因子に対する増大 した抵抗性を示す。 ＳＬ−プルラン／スクアラン／水を除いた全ての乳剤は37℃で最低53日間安定 のままであった。115日後、ＳＬ−マルトデキストリン15、ＳＬ−シクロデキス トリンおよびＳＬ−イヌリンを含む乳剤のほとんどは安定のままであるが、とは 言えスクアランおよびヘキサデカンを含む乳 剤は乳剤上に数個の油滴を示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｃ Ａ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．界面を形成する構成物に組み合わせられたスルホリピド多糖を含む、ワクチ ンのためのアジュバント。 ２．スルホリピド多糖が疎水性多糖であることを特徴とする、請求の範囲１のア ジュバント。 ３．スルホリピド多糖がシクロデキストリン、マルトデキストリン、イヌリン、 フィコールおよびプルランから成る群から選択されることを特徴とする、請求の 範囲１のアジュバント。 ４．スルホリピド多糖がシクロデキストリンであることを特徴とする、請求の範 囲３のアジュバント。 ５．スルホリピド多糖が、その疎水性の特徴を維持しながら、平均で単糖あたり 最低0.01個の硫酸基を含有することを特徴とする、請求の範囲１のアジュバント 。 ６．スルホリピド多糖が、その疎水性の特徴を維持しながら、平均で単糖あたり 最低0.12個の硫酸基を含有することを特徴とする、請求の範囲５のアジュバント 。 ７．スルホリピド多糖が、その疎水性の特徴を維持しながら、平均で単糖あたり 1.0個を超えない硫酸基を含有することを特徴とする、請求の範囲１のアジュバ ント。 ８．スルホリピド多糖が、その疎水性の特徴を維持しながら、平均で単糖あたり 0.23個を超えない硫酸基を含有することを特徴とする、請求の範囲７のアジュバ ント。 ９．スルホリピド多糖がマルトデキストリンであり、かつ、それがその疎水性の 特徴を維持しながら、平均で単糖あたり0.23個の硫酸基を含有 することを特徴とする、請求の範囲１のアジュバント。 １０．スルホリピド多糖がシクロデキストリンであり、かつ、それがその疎水性 の特徴を維持しながら、平均で単糖あたり0.20個の硫酸基を含有することを特徴 とする、請求の範囲１のアジュバント。 １１．スルホリピド多糖がイヌリンであり、かつ、それがその疎水性の特徴を維 持しながら、平均で単糖あたり0.19個の硫酸基を含有することを特徴とする、請 求の範囲１のアジュバント。 １２．スルホリピド多糖がプルランであり、かつ、それがその疎水性の特徴を維 持しながら、平均で単糖あたり0.16個の硫酸基を含有することを特徴とする、請 求の範囲１のアジュバント。 １３．スルホリピド多糖がフィコールであり、かつ、それがその疎水性の特徴を 維持しながら、平均で単糖あたり0.12個の硫酸基を含有することを特徴とする、 請求の範囲１のアジュバント。 １４．スルホリピド多糖が、その疎水性の特徴を維持しながら、平均で単糖あた り最低0.01個の脂質基を含有することを特徴とする、請求の範囲１のアジュバン ト。 １５．スルホリピド多糖が、その疎水性の特徴を維持しながら、平均で単糖あた り最低1.05個の脂質基を含有することを特徴とする、請求の範囲１４のアジュバ ント。 １６．スルホリピド多糖が、その疎水性の特徴を維持しながら、平均で単糖あた り2.0個を超える脂質基を含有しないことを特徴とする、請求の範囲１のアジュ バント。 １７．スルホリピド多糖が、その疎水性の特徴を維持しながら、平均で単糖あた り1.29個を超える脂質基を含有しないことを特徴とする、請求 の範囲１６のアジュバント。 １８．スルホリピド多糖が、その疎水性の特徴を維持しながら、平均で単糖あた り1.29個の脂質基を含有するマルトデキストリンであることを特徴とする、請求 の範囲１のアジュバント。 １９．スルホリピド多糖が、その疎水性の特徴を維持しながら、平均で単糖あた り1.05個の脂質基を含有するシクロデキストリンであることを特徴とする、請求 の範囲１のアジュバント。 ２０．スルホリピド多糖が、その疎水性の特徴を維持しながら、平均で単糖あた り1.24個の脂質基を含有するイヌリンてあることを特徴とする、請求の範囲１の アジュバント。 ２１．スルホリピド多糖が、その疎水性の特徴を維持しながら、平均で単糖あた り1.24個の脂質基を含有するプルランであることを特徴とする、請求の範囲１の アジュバント。 ２２．スルホリピド多糖が、その疎水性の特徴を維持しながら、平均で単糖あた り1.22個の脂質基を含有するフィコールであることを特徴とする、請求の範囲１ のアジュバント。 ２３．脂質基が４−22個の炭素原子を含むことを特徴とする、請求の範囲１のア ジュバント。 ２４．硫酸基と脂質基の比が、その化合物の疎水性の特徴を維持しながら、脂質 基あたり硫酸基0.01−２個であることを特徴とする、請求の範囲１のアジュバン ト。 ２５．硫酸基と脂質基の比が、その化合物の疎水性の特徴を維持しながら、脂質 基あたり硫酸基0.10−0.19個であることを特徴とする、請求の範囲２４のアジュ バント。 ２６．スルホリピド多糖が、その疎水性の特徴を維持しながら、脂質基あたり硫 酸基およそ0.18個の硫酸基と脂質基の比を含有するマルトデキストリンであるこ とを特徴とする、請求の範囲１のアジュバント。 ２７．スルホリピド多糖が、その疎水性の特徴を維持しながら、脂質基あたり硫 酸基およそ0.19個の硫酸基と脂質基の比を含有するシクロテキストリンであるこ とを特徴とする、請求の範囲１のアジュバント。 ２８．スルホリピド多糖が、その疎水性の特徴を維持しながら、脂質基あたり硫 酸基およそ0.15個の硫酸基と脂質基の比を含有するイヌリンであることを特徴と する、請求の範囲１のアジュバント。 ２９．スルホリピド多糖が、その疎水性の特徴を維持しながら、脂質基あたり硫 酸基およそ0.13個の硫酸基と脂質基の比を含有するプルランであることを特徴と する、請求の範囲１のアジュバント。 ３０．スルホリピド多糖が、その疎水性の特徴を維持しながら、脂質基あたり硫 酸基およそ0.10個の硫酸基と脂質基の比を含有するフィコールであることを特徴 とする、請求の範囲１のアジュバント。 ３１．界面を形成する構成物が、水と混合できない液体および水相に不溶である 固形物から成る群から選択されることを特徴とする、請求の範囲１のアジュバン ト。 ３２．水と混合できない液体が、スクアラン、ダイズ油、鉱物油およびヘキサデ カンから成る群から選択されることを特徴とする、請求の範囲３１のアジュバン ト。 ３３．ワクチン中のアジュバントとしての、請求の範囲１−３０のいずれかひと つによるスルホリピド多糖の使用。 ３４．抗原、請求の範囲１−３０のいずれかひとつによるスルホリピド 多糖、界面を形成する成分および乳化剤の水溶液が乳化されることを特徴とする 、乳剤中のワクチンの調製方法。 ３５．免疫原性の量の抗原ならびに請求の範囲１−３０のいずれかひとつによる スルホリピド多糖および界面を形成する構成物を含むアジュバントを含むワクチ ン。