JPH11502307A - 競合的結合アッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 全血試料中の特定の表現型（例えば、ヒト血小板抗原ＨＰＡの表現型）の血液抗原の存在を免疫学的に検出するための、競合的結合アッセイキットおよびプロセス。上記キットは実質的に純粋な上記表現型の血液抗原が固定化された基質、該血液抗原に特異的に結合する抗体、および該血液抗原に結合した抗体の検出を可能にする手段を含む。上記方法は、全血試料中に存在するいずれの抗原に対しても抗体が結合するように、抗体の所定量と該全血試料を混合すること、該混合物を固定化されている抗原と接触させて、残りの結合していない抗体を該固定化抗原に結合させること、並びに固定化抗原の量を測定すること、および該固定化複合体の量を測定して、特定の血液抗原表現型の量を評価すること、を含む。

Description

【発明の詳細な説明】 競合的結合アッセイ発明の分野 本発明は、全血試料中の特定の表現型（例えば、ＨＰＡの表現型）の血液抗原 の存在を免疫学的に検出するための、競合的結合アッセイキットおよびプロセス に関する。発明の背景 ヒト血小板抗原１(ＨＰＡ１)(ＰＬＡ１としても知られている)は、糖タンパク (ＧＰ)IIｂ／IIIａ複合体上の多形性決定基であり、ＧＰIIIａのＮ末端領域に存 在する。コーカサス人口の大多数がＨＰＡ１ａに対して同型接合型（homozygous ）または異型接合型(heterozygous)である(それぞれ約７２％および２６％)(１) 。しかし、人口の２〜３％がＨＰＡ１ｂ（ＰＬＡ１陰性）に対して同型接合型で あり、このことにより、妊娠中またはＨＰＡ１ａ血小板を含む血液の輸血後にお いて、ＨＰＡ１ａに対する抗体が作成されるという危険にさらされている。例え ば、ＨＰＡ１ｂの妊娠した女性がＨＰＡ１ａ陽性の子供を妊娠すると、抗ＨＰＡ １ａ抗体を産生し、これにより、胎児または新生児の同種免疫血小板減少症（Ｆ ＡＩＴＰまたはＮＡＩＴＰ）をそれぞれ引き起こす可能性があり、その５０％が 最初の妊娠において起こる。１０００〜２０００人に１人の割合で生じるＦＡＩ ＴＰ／ＮＡＩＴＰの一つの結果として頭蓋内出血があり、その死亡率は６.５％ 〜１０％であり、また罹病率は２０％である（神経学的後遺症）（２）。 さらに、ＨＰＡ１ａ血小板を含む血液を輸血されたＨＰＡ１ｂ個体（多くは、 年配の経産婦）は、輸血から５〜１０日後に重症の血小板減少症を特徴とする後 輸血紫斑病（ＰＴＰ）を発症する可能性もある。ＮＡＩＴＰほど一般的ではない が（世界的には、約２００ケースが報告されているのみである）、ＰＴＰはやは り、１０〜２０％の致死率／罹病率を伴う（３）。 ＦＡＩＴＰ／ＮＡＩＴＰおよびＰＴＰの治療および処置は、基本的に、 ＨＰＡ１ｂ血小板の輸血と共に静脈内ＩｇＧ投与を数回行うか、または、静脈内 ＩｇＧ投与を単独で数回行う方法により行われる。ＦＡＩＴＰ／ＮＡＩＴＰおよ びＰＴＰの重篤な、または致死的な結果、およびその向上した効果的な治療とい う観点から、ＨＰＡ１ｂの胎児スクリーニングが、重要な予防処置として、広く 容認されつつある（４、５）。血小板抗原のモノクローナル抗体固定化（ＭＡＩ ＰＡ）、血小板懸濁免疫蛍光試験、またはフローサイトメトリーのような確立さ れたアッセイは、その技術的または経済的負担のために、このような広範なスク リーニングには適さない（６−８）。最近、メトカーフ(Metcalf)らが、ＭＡＩ ＰＡから改良した、胎児スクリーニングのための大規模なＨＰＡ１ａ表現型のた めの簡便な方法を報告した（９）。しかし、メトカーフらのアッセイは基本的に 、抗体とプレインキュベートを行った血小板から、糖タンパクＧＰIIｂ／IIIａ 抗体複合物を抽出することにより行われる。このアッセイはまた、多数のインキ ュベーションおよび遠心工程を必要としており、非常に時間を消費するものであ る。 従って、実質的に精製された全血試料を必要としない、免疫アッセイ法が必要 とされている。 本発明の目的は、上記の欠点の幾つかを、回避および／または軽減することで ある。 概して述べると、本発明は、インビトロにおいて、全血試料中の特定の血液抗 原（例えばＨＰＡ１ａ）の存在を測定するための、容易でかつオートメーション 化可能な競合的結合アッセイおよびアッセイキットを提供するものである。本発 明は、全血試料中の特定の血液抗原の有無を測定することができるという、アッ セイの驚くべき性質に基づくものである。全血中に通常存在する細胞および他の 物質はそのようなアッセイに干渉（または妨害）するものと考えられてきた。本発明の要約 第一の観点において、本発明は、インビトロにおける、全血試料中の特定の血 液抗原表現型の存在を測定するための、競合的結合免疫アッセイ方法を提供する ものであり、該方法は、以下の方法を含む。 −全血試料中に存在するいずれの抗原に対しても抗体が結合するように、該血液 抗原表現型に特異的な抗体の所定量と、全血試料を混合する； −上記混合物を、該表現型の抗原が固定化されている基質と接触させて、残りの 結合していない抗体を該固定化抗原に結合させ、このようにして、固定化抗原− 抗体複合体を形成する； −該固定化抗原−抗体複合体を洗浄し、および； −固定化複合体の量を測定して、特定の血液抗原表現型の量を評価する。 本発明のさらなる観点において、本発明は全血試料中の特定の血液抗原表現型 の存在を測定するための、競合的結合免疫アッセイキットを提供するものであり 、該キットは、以下を含む。 −実質的に純粋な上記表現型の血液抗原が固定化された基質； −該抗原に特異的に結合する抗体を供給するもの、および； −上記の特異的に結合した抗体の検出を可能にする手段。 本発明の免疫アッセイは、本質的に競合的結合免疫アッセイと呼ばれるが、こ れは、全血試料中に存在する特定の表現型の血液抗原が、所定量の抗体に対して 、上述した固定化抗原と競合するからである。 上記免疫アッセイは、特定の表現型を有する、適する内因性血液細胞抗原の存 在を検出するのに使用することができる（ウィルス抗原のような外来種を除く） 。血液抗原としては、血小板糖タンパク上の抗原決定基、特に１ａまたは１ｂ表 現型のＨＰＡ１抗原が挙げられる。他の適する抗原としては、血液細胞、特に白 血球（例えば顆粒球）上の糖タンパクまたは他の決定基が挙げられる。 全血試料は、試験を行う個体から新たに得てもよく、または４℃において保存 された、２５日以内の全血（例えばクエン酸（citrated）またはＥＤＴＡを加え た全血）から得てもよい。全血試料は、未処理で使用してもよく、または試験を 行う前に洗浄工程に附すこともできる（e.g.血液を希釈し、遠心を行い、バッフ ァーに再懸濁する）。 典型的には、上記血液抗原に特異的な抗体の高力価を含む血清からの試料を免 疫アッセイに使用してもよい。または上記血液抗原に特異的なモノクローナル抗 体を使用することもできる。 実質的に純粋な、上記表現型の抗原を固定化する基質は、当業界における既知 のいかなる基質を用いてもよい。典型的には、基質としては紙、ニトロセルロー スのようなプラスチック、またはガラス（e.g.顕微鏡スライド）を用いることが できる。最も好ましい基質は、通常免疫アッセイに使用されている、プラスチッ ク製マイクロタイタープレートのウェルである。 固定化される抗原は、実質的に純粋であることが好ましい。すなわち、抗原は 、免疫アッセイに影響する可能性のある他の血液抗原または血液成分から分離精 製されていることが好ましい。もし使用される抗体が血清試料中のものである場 合には、抗原が実質的に純粋であることは重要である。これは血清試料中に存在 し得る他の抗体が、それぞれの血液抗原に結合するのを防ぐためである。もし、 モノクローナル抗体を用いる場合には、必ずしも抗原を高度に精製しなくてもよ く、特定の抗原に特異的であるモノクローナル抗体の交差反応性の度合いに依存 する。使用される抗原は、試験されるものとは異なり、血液源から精製されなけ ればならない。これは、形成される可能性のあるさらなる抗原−抗体複合体の免 疫アッセイへの妨害を最小化するためである。 典型的には多数の免疫(i.e．抗原−抗体)複合体が、混合物を基質と接触させ る際に形成されてもよく、例えば、 ａ）特定の抗体と固定化抗原、 ｂ）特定の抗体と全血中に存在する抗原、および ｃ）固定化抗原に、非特異的に結合した非特定の抗体、 である。洗浄は、特定の抗体と固定化抗原の複合体を除く、全ての複合体を除去 する。 全血試料を抗体と混合する工程と、該混合物を基質と接触させる工程は、同時 に行うことが可能であり、また、二段階の分離した工程として行うことも可能で ある。 一般に、基質が結合した免疫複合体は、酵素ラベル（e.g.セイヨウワサビ過酸 化酵素ＨＲＰ）、放射線ラベル、蛍光ラベルまたは他の当業界において既知のラ ベル化システムのような適するラベルによりラベル化された抗ヒトＩｇＧまたは ＩｇＭを用いて評価される。酵素ラベルを用いて、酵素結合免疫吸着アッセイ （ＥＬＩＳＡ）法を高感度、特異的、低価格、迅速に行うことができ、また、該 アッセイ法は全血抗原の大規模な自動化スクリーニングのために使用できる可能 性がある。免疫複合体を産生する際のインキュベーションおよびラベル化した抗 体の評価は、室温で行えることが見いだされ、従って、インキュベーターを使用 する必要がなく、有利である。 特に好ましい免疫アッセイは、ＨＰＡ１ａ抗原の検出を含むものであると考え られる。ＨＰＡ１ａの抗原決定基は、ＧＰIIIａサブユニット上に存在するため 、全血試料中のＨＰＡ１ａ抗原の存在を検出する競合的結合免疫アッセイは、固 定化ＨＰＡ１ａ抗原を含むものである。典型的には、これはＨＰＡ１ａ型血小板 （これはすでに、例えばWilliamsonら(13)により報告された技術を用いて、遺伝 子型に分類されている(genotyped)）、精製糖タンパク複合体ＧＰIIｂ／IIIａ（ 例えば、Bessosら(10)により報告されたプロセスにより調製される）、精製糖タ ンパクＧＰIIIａ、または合成的に製造されたＨＰＡ１ａ抗原である。 第一の観点における、特に好ましい実施態様として、本発明はインビトロにお ける、全血試料中のＨＰＡ１ａ抗原の存在を測定するための競合的結合免疫アッ セイを行う方法を提供するものであり、該方法は以下を含む。 −全血試料中に存在するいずれのＨＰＡ１ａ抗原に対しても抗体が結合するよう に、抗ＨＰＡ１ａ抗体の所定量と、全血試料を混合する； −上記混合物を、ＨＰＡ１ａ抗原が固定化されている基質と接触させて、残りの 結合していない抗ＨＰＡ１ａ抗体を該固定化ＨＰＡ１ａ抗原に結合させ、このよ うにして、固定化ＨＰＡ１ａ抗原−抗ＨＰＡ１ａ抗体複合体を形成する； −該固定化ＨＰＡ１ａ抗原−抗ＨＰＡ１ａ抗体複合体を洗浄し、および； −固定化複合体の量を測定して、ＨＰＡ１ａ抗原の量を評価する。 本発明のさらなる観点における特に好ましい実施態様において、本発明は全血 試料中のＨＰＡ１ａ抗原の存在を測定するための、競合的結合免疫アッセイキッ トを提供するものであり、該キットは、以下を含む。 −固定化された実質的に純粋なＨＰＡ１ａ抗原を含むウェルを有するマルチウェ ルマイクロタイタープレート； −該ＨＰＡ１ａ抗原に特異的に結合する抗ＨＰＡ１ａ抗体を供給するもの，およ び； −上記の特異的に結合した抗体を検出を可能にする手段。 典型的には、各ウェルは、１つのウェルあたり、０.０５μg 〜０.５μg の抗 原を含み、好ましくは０.１μg の抗原を含む。 ＨＰＡ１ａ抗原がその上に固定化された基質は、一般的に、混合物と基質を接 触させる前には、ウシ血清アルブミンのような非特異的タンパク混合物でブロッ クされている。好ましい実施態様の詳細な説明 本発明の実施態様を、以下に例示のためにのみ、以下の図面と共に述べる。 図１は、ＨＰＡ１ａ陽性および陰性ＧＰ抽出物の相違点を、抗−血清Ｔを用い て示した図である。 図２は、ＨＰＡ１ａ陽性および陰性血小板の相違点を、抗−血清Ｔおよび抗− 血清Ｃを用いて示した図である。 図３は、ＨＰＡ１ａ陽性および陰性試料の相違点を新鮮な全血および保存全血 を用いて示した図である。 図４は、３３の予め遺伝子型を分類した血液試料を用いて、陽性および陰性コ ントロールと比較して行った競合的結合アッセイの評価を示した図である。 図５は、４７５の血液試料の研究から得られたアッセイ結果の代表例を示した 図である。実施例１：ＧｐIIｂ／IIIａの精製 使用した様々な試薬は、アナラー（Analar）グレードのものを使用し、ICN(UK )、Sigma(UK)、またはAldrich Chemicals Ltd,(UK)から購入した。抗ＨＰＡ１ａ 血清は、ＮＡＩＴＰの子供の母親から得た。ＨＲＰ−接合ヒツジ抗−ヒトＩｇＧ を、Scottish Antibody Production Unit より得、およびウシ血清アルブミン( ＢＳＡ)、ボセラル(Boseral)をOrganon Technika(Holland)より購入した。合成 ペプチドおよびＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂは、Calbiochem/Novabiochem(U K)およびPharmacia Ltd.(UK)からそれぞれ購入した。遺伝子型を分類した血小 板（分離洗浄したもの、または全血中のもの）を新規ＣＢアッセイの性能を評価 するために使用した。 血小板膜糖タンパクＧＰIIｂ／IIIａを、前述したように抽出し、および実質 的に精製を行った（１０、１１）。簡単に述べると、ＨＰＡ１ａ１ａ、ＨＰＡ１ ａ１ｂまたはＨＰＡ１ｂ１ｂアフェレースを行った(apheresed)血小板濃縮物（ ＰＣ）を洗浄し、５０ｍＭトリス／ＨＣｌおよび１５０ｍＭ NaCl を含むｐＨ７ .５のバッファー（ＴＢＳ）中の１００ｍＭオクチルグルコピラノシドおよび２ ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライドにより抽出を行った。抽出物にカチ オンを追加して加え、２g の固定化合成ペプチドＧＲＧＤＳＰＫ（１２ｍｇペプ チド／g セファロース４Ｂ）と４℃において一晩混合した。セファロースビーズ を次に遠心分離を行い(室温において１０００ｒｐｍで５分間)、上澄み液を除去 した。ＧＰIIｂ／IIIａ吸着ビーズを数回洗浄した後、合成ペプチドＧＲＧＤＳ Ｐを含む、カチオンを多く含んだバッファー（１ｍＭ MgCl₂および１ｍＭ MnCl₂ ）で溶出した。溶出液を４℃において２回、１リットルのトリス／ＨＣl バッフ ァー(１０ｍＭトリス／ＨＣl、１５０ｍＭ NaCl 、ｐＨ７.４)に対して透析を行 い、一部を−４０℃において必要になるまで冷凍保存した。典型的には、約１ｍ ｇのＧＰIIｂ／ＧＰIIIａをアフェレースした純度９５％のＰＣの各ユニットか ら除去した。実施例２：適する抗ＨＰＡ１ａ血清、およびその、異なるＨＰＡ表現型の溶解性 ＧＰIIｂ／ＧＰIIIａに対する識別能の測定 ３種類の抗ＨＰＡ１ａ血清の、被膜化ＨＰＡ１ａ１ａに対する結合を、２倍階 段希釈により評価しした。このうち、２種類（ＣおよびＴ）のみが十分な結合を 示した（データは示されていない）（１０）。５０％最大結合（両抗血清に対し て１：４０）を与える制限抗体希釈を用いて、ＣＢアッセイを行った。最初の例 では、溶解性ＨＰＡ１ａ１ａおよびＨＰＡ１ｂ１ｂＧＰ（４μｇ／ｍｌから始ま る）の２倍階段希釈における抗体結合を比較した。両抗血清（ＣおよびＴ）は、 ２つの表現型を識別することが見いだされた。実施例３：競合的結合（ＣＢ）アッセイ 正常なボランティアから得た全血または血小板試料を、１４８ｍＭ NaCl 、５ ｍＭグルコース、０.６ｍＭＥＤＴＡおよび２０ｍＭトリスを含む、ｐＨ７.４血 小板洗浄バッファー中で洗浄または希釈した。ＥＬＩＳＡにおけるマイクロタイ タープレートのウェルの洗浄を、１３７ｍＭ NaCl 、１.５ｍＭ KH₂ PO₄、８.１ ｍＭNa₂HPO₄．12H₂、２.７ｍＭ KCl、０.０５％ツウィーン２０、ｐＨ７.５を含 むＥＬＩＳＡ洗浄バッファー中で行った。 ＣＢ ＥＬＩＳＡの基本的な、被膜化、ブロッキング、洗浄および顕色(colour development)の工程は既に述べられているように行った（１０、１２）。Maxiso rp免疫プレートＩＦ（Ａ／Ｓ Nunc 、デンマーク）を１００μｌ／ウェルの精製 したＨＰＡ１ａ１ａＧＰIIｂ／ＧＰIIIａを用いて、１μｇ／ｍｌ、４℃、一晩 で被膜化し、５％ＢＳＡ（被膜バッファー液）を用いて室温（ＲＴ）で１時間ブ ロッキングを行った［ＧＰIIｂ／ＧＰIIIａを含有せず、かつ被膜化バッファー を含有するウェルをバックグラウンド結合のコントロールとして加えた］。 最初に、適する抗ＨＰＡ１ａ血清を決定するために、ウェルをＥＬＩＳＡ洗浄 バッファーおよび１００μｇ／ｍｌの濃度で２倍階段希釈で３回加えた血清で洗 浄し、１時間インキュベートを行った。結果をグラフ上にプロットした（データ は示されていない）ところ、Ｓ字状曲線となり、５０％最大結合を与える抗体の 希釈を決定することができた。この“制限”抗体量は、該抗体に対する細胞性Ｈ ＰＡ１ａ抗原と被膜化抗原の間の競合を可能にする。 ＣＢアッセイの顕色(development)のため、精製したＧＰIIｂ／ＧＰIIIａ、１ ：１０の割合のクエン酸またはＥＤＴＡ添加全血(citrated or EDTA whole bloo d)の血小板洗浄バッファー液（i.e.抗体と混合した場合は１：２０−下記参照） 、または血小板洗浄バッファー中の洗浄血小板(全ての種々の表現型)を、５０μ g ／ウェルの割合で、ウェルに３回加えた。次にウェルに、５０μg ／ウェルの 、１：２０の割合の抗ＨＰＡ１ａ血清のＥＬＩＳＡバッファー液を加え（i.e.最 終希釈で１：４０）、プレートを室温で１時間、静かに攪拌した（rotatest震盪 機、Luckham 、ＵＫ）。これにより、所定量の抗ＨＰＡ１ａ血清に対する、被膜 化し たＨＰＡ１ａＧＰIIｂ／ＧＰIIIａと、可溶性ＧＰまたは血小板（分離されてい るかまたは全血中に存在する）上の、これに相当する表現型とが競合する。試料 中に存在する同じＨＰＡ表現型（ＨＰＡ１ａ）は、ウェル中の固定化抗原に対す る抗体の結合を顕著に抑制するが、一方ＨＰＡ１ｂは抑制しない。インキュベー ション後、ＥＬＩＳＡ洗浄バッファー３×１００μｌ／ウェルを１０回まで吹き 掛けて洗浄した。前述したように、顕色および洗浄の前にウェルに結合した抗Ｈ ＰＡ１ａ抗体を、１：４００の割合のＨＲＰ複合化ヒツジ抗ヒトＩｇＧのＥＬＩ ＳＡ洗浄バッファー液でインキュベートすることによって、ウェルに結合した抗 ＨＰＡ１ａ抗原を検出した（12）。特定の結合は、バッファーのみにより被膜化 されたウェルの吸収を、精製されたＧＰIIｂ／ＧＰIIIａで被膜化されたウェル の吸収から減ずることにより得られた。実施例４：異なるＨＰＡ１ａ表現型を有する血小板から抽出されたＧＰを用いた ＣＢアッセイ 表現型洗浄血小板から得られた非精製抽出物（上記に述べたオクチルグルコピ ラノシド洗剤抽出により）を、２倍階段希釈におけるＣＢアッセイにより試験を 行った（１：１０から開始）。図１に示されるように、ＨＰＡ１ａ１ａまたはＨ ＰＡ１ａ１ｂとＨＰＡ１ｂ１ｂＧＰ抽出物との間に明らかな違いが存在し、抽出 されたＧＰを使用する血小板表現型を決定するアッセイの適性を示している。実施例５：ＨＰＡ１ａおよびＨＰＡ１ｂボランティアから得られた洗浄血小板を 使用したＣＢアッセイ ＨＰＡ１ａおよびＨＰＡ１ｂボランティアから得られたクエン酸を加えた血液 試料（１０ｍｌ）を、室温で、７５０ｇで１０分間遠心を行い、バフィーコート を除去し、血小板洗浄バッファーで２回洗浄を行い、同様の血小板計測のため洗 浄バッファー中に再懸濁を行い、１０Ｘ（１０倍）の段階希釈法で試験を行った 。ＨＰＡ１ａ血小板は抗体結合において顕著な抑制を示したが、ＨＰＡ１ｂ血小 板は、何も示さなかった（図２）。抗血清Ｔは、一貫して２種類の表現型間にお いてよりよい識別(distinction)を示したので、ＣＢアッセイにおいてルーチン 的 に使用することにした。この実験の繰り返しから、正常な血小板数内での変化は 、観察される２種類の表現型間の相違点において重要ではないことが示された（ データは示されていない。）。実施例６：ＨＰＡ１ａおよびＨＰＡ１ｂボランティアから得られた、新鮮および 保存クエン酸またはＥＤＴＡ添加全血を用いたＣＢアッセイ アッセイの適用可能性を、抽出したＧＰおよび無処置の血小板を用いて試験す ると同時に、非処置全血に対するアッセイの適用可能性が調査された。クエン酸 およびＥＤＴＡ添加全血を両者共ＨＰＡ１ａおよびＨＰＡ１ｂボランティアから 得て、４℃で保存を行い、１：１０の血小板洗浄バッファー液中で、様々な時間 間隔で試験を行った。図３に示されるように、ＨＰＡ１ａ血液を使用した特定の 吸収は、保存７日後まで一貫してＨＰＡ１ｂ血液とは区別された。以下の点を除 いて実施例３に記載された方法に従った。１日後および２日後における血液とイ ンキュベーションした後、ウェルは７回洗浄し、残りの保存期間のものについて は、最初の２日間におけるクエン酸添加血液のアッセイが比較的質が低かったの で、これを改良するために１０回洗浄した。実施例７：遺伝子型試料ブラインド（blind）試験による、ＣＢアッセイ能の評 価 アッセイ能を評価するために、異なる試験の３セットを、ケンブリッジ地域輸 血センター(Cambridge Regional Blood Transfusion Centre)より得たブライン ド試料を用いて異なる回数行った。これらの試料は、Williamsonらにより最近報 告されたレビュー（13）に記載されているように、遺伝子型のＥＤＴＡ血液を含 有していた。抗血清Ｔを用いて、１：１０の希釈の血液試料をアッセイするため に、実施例３のアッセイ方法に従った。各試験において、４℃において保存され たＨＰＡ１ａ陽性および陰性コントロールをインキュベートした。第一の試験で は、コントロールは、３日後の血液試料であった。第二の試験において、コント ロールは、８日後の血液試料であった。第三の試験において、コントロールは１ ５日後の試料であった。ＣＢアッセイは、非常に満足のいく性能を示し(図４)、 ６ＨＰＡ１ｂ試料（第１番および第４番、第一試験；第２、８、１４番、第二試 験；および第１２番、第三試験）を含む全ての試料の表現型を正確に決定した。 この実験後、最初の全血洗浄工程を加えることによりシグナルとノイズの比が最 大となるようにアッセイを改良した。すなわち、１：１０に血小板洗浄バッファ ー中に希釈した５ｍｌの血液を、室温で、７５０ｇで１０分間遠心し、１ｍｌの 血小板洗浄バッファー中に細胞を再懸濁した（シグナルとノイズの比の改良に関 しては、図５を参照）。実施例８：キャプチャー(Capture)−Ｐキットアッセイに対するＣＢアッセイの 比較試験 本発明のＣＢアッセイを、市販のキャプチャー−Ｐキット（Immucor Inc.，U. S.A.）アッセイと比較した。血小板洗浄バッファーによる１：１０の希釈を用い て、全血の予備的な洗浄工程と共に実施例３の方法を行った。 ４７５試料の試験を行ったところ、ＣＢアッセイおよびキャプチャー−Ｐキッ トアッセイは、１００％一致した（４６８がＨＰＡ１ａ陽性であり、７がＨＰＡ １ａ陰性であった）。ＨＰＡ１ａおよびＨＰＡ１ｂ試料の平均吸収は、それぞれ ０.１２(ＳＤ０.０８)および０.４９(ＳＤ０.１６)であり、Ｐ＜０.０００５（ スチューデント試験）であった（図５ａ）。ＣＢアッセイを用いて得られたヒス トグラムの例が図５ｂに示されている。この図において、試料番号３は明らかに ＨＰＡ１ｂである（陽性および陰性は、ＨＰＡ１ａ陽性およびＨＰＡ１ａ陰性［ i.e.ＨＰＡ１ｂ］、コントロールをそれぞれ意味する）。これら一連の試験のコ ントロールは、４℃において２５日間まで保存されていたＨＰＡ１ａまたはＨＰ Ａ１ｂ全血を含有した（溶解性ＨＰＡ１ａおよび１ｂＧＰは、他のコントロール として使用できることも、予備的な結果は示しているーデータは示していない） 。 ＣＢアッセイにおいてバックグラウンド結合が存在するが（抗原で被膜化され ていないウェル内において）、ＨＰＡ１ａ陽性血小板表現型および陰性血小板表 現型の明らかな識別（相違）を得ることが可能であった。一般に、この識別を得 るには２つの因子が重要である。第１に、強力な抗ＨＰＡ１抗血清を使用するこ とであり、第２にはインキュベーションの最後において、全血により、過度にウ ェルを洗浄することである。過度な洗浄は、非特異的に結合したＩｇＧを除去す るばかりでなく、幾つかの試料（例えば免疫性血小板減少症患者から得た試料） 中に時折存在する結合した抗ＧＰIIｂ／IIIａを除去するために必要である。そ のような抗体は恐らく、抗ＨＰＡ１ａ抗体ほど強力ではなく、アッセイにおいて 問題とならないであろう。 本アッセイは、以下の理由から、胎児試料の大容量スクリーニングに理想的で ある；非処理血液の使用を要するのみである；非常にわずかな量の抗ＨＰＡ１ａ 血清を必要とする（２.５μｌ／ウェル）；および容易に自動化が可能である。 抗ＨＰＡ１ａ抗体の出現の有無により、妊娠期間に続いてすぐに胎児血小板減少 症の兆候を検出することができるように、大量スクリーニングにより、ＦＡＩＴ ＰまたはＮＡＩＴＰの危険のある母親を検出できなければならない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，Ｓ Ｅ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．以下の方法を含む、インビトロにおける、全血試料中の特定の血液抗原表現 型の存在を測定するための競合的結合免疫アッセイ方法。 −該全血試料中に存在するいずれの抗原に対しても抗体が結合するように、該 血液抗原表現型に特異的な該抗体の所定量と、該全血試料を混合する； −上記混合物を、該表現型の抗原が固定化されている基質と接触させて、残り の結合していない抗体を該固定化抗原に結合させ、このようにして、固定化抗原 −抗体複合体を形成する； −該固定化抗原−抗体複合体を洗浄し、および； −該固定化複合体の量を測定して、特定の血液抗原表現型の量を評価する。 ２．該全血を該抗体と混合する前に洗浄することを特徴とする、請求の範囲第１ 項に記載の競合的結合免疫アッセイ法。 ３．該抗体が、該血液抗原に特異的な高力価の抗体を含む血清試料から得られる ことを特徴とする、請求の範囲第１項または第２項に記載の競合的結合免疫アッ セイ法。 ４．該抗体が、該血液抗原に特異的なモノクローナル抗体であることを特徴とす る、請求の範囲第１項または第２項に記載の競合的結合免疫アッセイ法。 ５．該基質が、プラスチックマイクロタイタープレートのウェルであることを特 徴とする、請求の範囲第１〜４項のいずれか一項に記載の競合的結合免疫アッセ イ法。 ６．固定化される該抗原が、実質的に純粋であり、かつそれ自体、他の血液抗原 または血液成分から分離精製されていることを特徴とする、請求の範囲第１〜５ 項のいずれか一項に記載の競合的結合免疫アッセイ法。 ７．固定化される該抗原が、試験されるものとは異なる血液源から精製されるこ とを特徴とする、請求の範囲第６項に記載の競合的結合免疫アッセイ法。 ８．全血試料と抗体との混合、および該混合物の基質への接触を同時に行うこと を特徴とする、請求の範囲第１〜７項のいずれか一項に記載の競合的結合免疫ア ッセイ法。 ９．全血試料と抗体との混合、および該混合物の基質への接触を２段階に分けて 行うことを特徴とする、請求の範囲第１〜７項のいずれか一項に記載の競合的結 合免疫アッセイ法。 10．基質結合免疫複合体が、酵素ラベル、放射線ラベル、および蛍光ラベルから なる群から選択される、適するラベルでラベル化された抗ヒト抗体を用いて評価 することを特徴とする、請求の範囲第１〜９項のいずれか一項に記載の競合的結 合免疫アッセイ法。 11．室温で行うことを特徴とする、請求の範囲第１〜１０項のいずれか一項に記 載の競合的結合免疫アッセイ法。 12．上記免疫アッセイが全血試料中のＨＰＡ１ａ抗原の存在を検出すること、お よび固定化ＨＰＡ１ａ抗原を含むことを特徴とする、請求の範囲第１〜１１項の いずれか一項に記載の競合的結合免疫アッセイ法。 13．固定化ＨＰＡ１ａ抗原が、ＨＰＡ１ａ型血小板、精製糖タンパク複合体ＧＰ IIｂ／ＧＰIIIａ、精製糖タンパクＧＰIIIａ、または合成的に製造されたＨＰＡ １ａ抗原からなる群から選択されることを特徴とする、請求の範囲第１２に記載 の競合的結合免疫アッセイ法。 14．以下の方法を含む、インビトロにおける、全血試料中のＨＰＡ１ａ抗原の 存在を測定するための競合的結合免疫アッセイ方法。 −該全血試料中に存在するいずれのＨＰＡ１ａ抗原に対しても抗体が結合する ように、所定量の抗ＨＰＡ１ａ抗体と、該全血試料を混合する； −上記混合物を、ＨＰＡ１ａ抗原が固定化されている基質と接触させて、残り の結合していない抗ＨＰＡ１ａ抗体を該固定化ＨＰＡ１ａ抗原に結合させ、この ようにして、固定化ＨＰＡ１ａ抗原−抗ＨＰＡ１ａ抗体複合体を形成する； −該固定化ＨＰＡ１ａ抗原−抗ＨＰＡ１ａ抗体複合体を洗浄し、および；該固 定化複合体およびＨＰＡ１ａ抗原の量を評価する。 15．全血試料中の特定の血液抗原表現型の存在を測定するための、競合的結合免 疫アッセイキットであって、以下を含む上記キット。 −実質的に純粋な上記表現型の血液抗原が固定化された基質； −該抗原に特異的に結合する抗体を供給するもの、および； −上記の特異的に結合した抗体を検出を可能にする手段。 16．全血試料中のＨＰＡ１ａ抗原の存在を測定するための、競合的結合免疫アッ セイキットであって、以下を含む上記キット。 −固定化された実質的に純粋なＨＰＡ１ａ抗原を含むウェルを有する、マルチ ウェルマイクロタイタープレート； −該ＨＰＡ１ａ抗原に特異的に結合する抗ＨＰＡ１ａ抗体を供給するもの、お よび； −上記の特異的に結合した抗体を検出を可能にする手段。 17．各ウェルが、１ウェル当たり０.０５μg 〜０.５μg の抗原を含むことを特 徴とする、請求の範囲第１６項に記載の競合的結合免疫アッセイキット。 18．ＨＰＡ１ａ抗原が固定化された基質を、非特異的タンパク混合物によりブロ ックしたのち、該混合物と基質を接触させることを特徴とする、請求の範囲第 １６項または第１７項のいずれか一項に記載の競合的結合免疫アッセイキット。