JPH11505105A - 抗線虫活性を有する細菌及びその農業的用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 抗線虫活性を有するＢ．ファーマス(B．firmus)種の新規の細菌株を発見した。この細菌及びその活性突然変異体は様々な植物の線虫感染を制御するために用いられる。これらの株は寄託しており、そしてCNCM I-1556 及びCNCM I-1562 のそれぞれの受託番号が付与されている。更に、活性成分としてのそれらに由来する株又は胞子と担体とを含む組成物を開示する。更に、病原性線虫、例えばネコブ病をもたらすことのできる線虫を制御する方法も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 抗線虫活性を有する細菌及びその農業的用途 発明の分野 本発明は抗線虫性細菌株、そして特に植物病原性線虫に影響を及ぼす株に関す る。本発明は更に農業用抗線虫組成物及び植物病原性線虫を制御する方法に関す る。 発明の背景 ネコブ(root knot)は世界中で最も重大な植物の病気の一つである。世界中で 、ネコブ病は平均して約５％の年間収穫損失を及ぼす。しかしながらその最大の 損失は、それを最低限でしか生産できない者、即ち、発展途上国の農家に生じて いる。その損失は有効農場面積の25〜50％ほどでありうる。更に、ネコブ病に関 わるいくつかの間接的な損失、例えばその他の病原体による二次的な攻撃（その 他の病原体と組合わさり、ネコブ病は破壊的となりうる）；肥料及び水の非効率 的な利用；並びに高額な化学処理が生ずる。 この病気を及ぼす最も一般的な寄生虫はメロイドジン(Meloidogyne)種に属す る。これらの線虫は主要な作物科を全て含む3000種以上の植物に寄生することが 示されている。ネコブ線虫は寒冷地帯よりも温暖地帯において一層多く見い出さ れ、且つ植物を攻撃している。ネコブ線虫により感染した植物は以下の症状の一 方又は双方を示す：根系が異常肥大する、短くなる、又は腐蝕により減少する； 幹が短く、且つ太くなり、そして葉は正常に成長しない。 ネコブ線虫により生ずる最も顕著な症状は根の上の瘤又は節である。瘤は針の 頭ぐらいから直径2.5 cm以上の複合瘤に至るサイズで ありうる。それらは不定形、球形又は紡錐形であり、そして虚弱な小根上に最も よく見い出せる。その構造には１から数百の雌線虫が宿り、それらはそのライフ サイクルを通じて定常的に残り、そして根の内側を食べてしまう。 商業的作物に対するその全世界的経済影響を鑑み、ネコブ線虫を制御する効率 的な手法の発見の緊急なニーズがある。今まで、化学薬品、例えば臭化メチル又 は二臭化エチルが線虫の制御に用いられてきた。しかしながら、抗線虫化学薬品 に対する病原体の耐性の発達、並びにこれら及びその他の化学薬品により生ずる 短期的及び長期的な環境的ダメージに対する意識の高まりは、環境的ダメージを 及ぼすことなく標的線虫に対して特異的に作用するバイオ抗線虫製品の開発への 関心を高めた。 発明の概要 本発明の目的はネコブを及ぼす線虫に対して抗線虫活性を有する細菌株を提供 することにある。 本発明の更なる目的はネコブ線虫に対して植物を保護するのに有用な農業用組 成物の提供にある。 本発明のその他の目的は植物病原性線虫を制御する方法の提供にある。 本発明に従うと、種Ｂ．ファーマス(B．firmus)の新規な細菌株が抗線虫活性 を有することが見い出された。その二種の細菌株をここでは「EIP-N1」及び「EI P-N2」と呼ぶ。双方の株は下記の日付及び下記の受託番号のもとでコレクション ・ナショナル・デ・カルチャーズ・デ・マイクロオルガニズム（Collection Nat ionale de Cultures de Microorganismes : CNCM）、インスティテュート・パス ツール（パスツール研究所）フランス国に寄託してある。 EIP-N1及びBIP-N2種の利用が現状、本発明の好適な態様である。本発明に従っ て有用なその他の株はEIP-N1及びEIP-N2に由来する抗線虫活性を有する様々な突 然変異株である。突然変異株は現時点では自発的に得られるが、例えば照射又は 突然変異因子の利用による突然変異誘発によっても得られる。当業者により理解 される通り、様々な種類の突然変異誘発であって、細菌の抗線虫活性及び保護育 成すべき作物の存在する土壌に投与したときにその抗線虫活性を発揮する能力に 実質上の変化を及ぼさない誘発を誘導することが可能である。 従って、本発明は、その観点の一つにより、Ｂ．ファーマス種に属し、且つ抗 線虫活性を有する細菌株を提供する。かかる株はEIP-N1(CNCM I-1556)及びEIP-N 2(CNCM I-1562)、並びにこのEIP-N1及びEIP-N2の抗線虫活性突然変異体より成る 群の構成員である。 本発明により更に提供されるのは、EIP-N1，EIP-N2、又はこのEIP-N1もしくは EIP-N2の抗線虫活性突然変異体より成る群から選ばれる細菌の純培養株である。 本発明の別の観点に従うと、植物保護において使用するための抗線虫組成物で あって、活性成分として、有効量の抗線虫細菌又はその胞子と、この抗線虫細菌 と適合性である担体とを含んで成る組成物を提供し、ここにこの細菌はEIP-N1， EIP-N2、及びこのEIP-N1又はEIP-N2の抗線虫活性突然変異体より成る群から選ば れる株である。 本発明の好適な観点に従うと、本組成物に、細菌の抗線虫活性を 発揮させる能力を向上又は強化する１又は複数種の添加剤を補充する。添加剤に は、例えば栄養素、例えば、ゼラチン、ゼラチン加水分解物、綿実のしぼりかす 及びカゼイン加水分解物でありうる。 本発明の別の観点に従うと、植物病原性線虫を制御する方法を提供し、ここで の方法は、植物の根又はその植物が育成される土壌環境の中に有効量の細菌又は その胞子を適用することを含んで成り、ここでこの細菌はEIP-N1，EIP-N2、及び このEIP-N1又はEIP-N2の抗線虫活性突然変異体より成る群から選ばれる株である 。この細菌は、液状担体内で細菌を土壌の下に適用することにより、土壌に導入 することができる。他方、細菌はドライ製剤であり、そして例えば植え付け又は 種まきの前に土壌と混合するものであってもよい。細菌は、土壌の中に植物の根 又は種子を植え付ける又は種まきする前に、それに細菌を含んで成る液状製剤を 含浸せしめることによっても適用できうる。 本発明の別の観点は、本発明の細菌を含んで成るポットミックスである。 本発明の細菌株はネコブ病を及ぼす線虫、そして特にメロイドジン種に属する ものを制御するうえで有用である。しかしながら、本発明の細菌の嚢子（cyst） 線虫の如きその他の病原性線虫に対しても有効でありうる。 図面の簡単な説明 図面において： した実験の結果を示す。 図２は、マイクロプロットで得た、図１に示すのと類似の実験の 結果を示す。 本発明は、グリーンハウス又はマイクロプロットにおいて線虫の病原活性を制 御するのに本発明の株を用いるいくつかの実験の結果をまとめた添付図面と共に 好適な態様の詳細な説明より一層よく理解されるであろう。 好適な態様の詳細な説明材料及び方法 Ｉ．同定 これらの株は、部分16Ｓ rDNA 配列ハイブリダイゼーションを利用する同定の ため、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkuturen GmbH(DSM)に 送った。 II．増殖条件 これらの株は、下記を含むMBS 液体培地（桿菌胞子形成用培地）上で増殖させ た： GE 90F （市販のゼラチン加水分解物）−10gr/L（EIP-N1）又はトリプト ース−５gr/L（EIP-N2）； 酵母抽出物−２gr/L； KH₂HPO₄−6.8gr/L ； 及び下記の微量元素： MgSO₄・７H₂O −0.3 gr/L； MnSO₄ −0.02gr/L； FeSO₃ −0.02gr/L； ZnSO₄・７H₂O −0.02gr/L； CaCl₂ −0.2 gr/L； pH：7.4 （NaOHで調整）。 EIP-N2はNutrient Agar Medium(Difco)上でも増殖できる。 これらの株を２リットルのErlenmyer フラスコ又は100 〜500 リットルの発酵 槽の中で、30℃で48〜72時間にわたりバッチ式発酵で増殖させた。Erlenmeyerは 180RPMのスピードで撹拌した。 III．計数測定 培地を遠心し(5000ｇ，20min，RT)、そして胞子及び栄養細胞の混合物を含む ペレットを少量の蒸留水に溶かした。総細胞数及び胞子数をそれぞれ計数測定す るため、サンプルに70℃で10min 加熱する前後にて播種を施した。 総胞子数は通常全細胞計数の75〜90％である。典型的な収量は５〜10⁸胞子／m lである。 IV．安定性 胞子は室温にて乾燥状態で６ヶ月経ても100 ％の生存率を示した。胞子は以下 の条件下で保存できうる： １）ペースト状で−70℃で６ヶ月以上； ２）10％の脱脂乳溶液中での胞子の凍結乾燥及び４℃での貯蔵； ３）４℃で保存するスラント； ４）胞子を、泥炭ごけ又はシリカの存在下でオーブン中で乾燥させる。 最後の３通りの条件下では、生存は１年以上である。 Ｖ．タンパク質分解活性 タンパク質分解活性は、Azocasein（Sigma）の分解による溶液への有色生成物 の放出の結果としての光学密度の上昇を測定することにより決定した。 反応混合物（１ml）は、0.5 ml中の６mgのAzocasein と、５mMのCaCl₂ を含む 0.05ＭのトリスHCl バッファーpH7.6 の増殖培地の上清液由来のもの0.5 mlとを 含んだ。反応混合物を37℃で15min インキュベーションし、そして反応は0.5 ml の10％のTCA の添加により 停止させた。氷上での30min の更なるインキュベーション及び遠心分離（10,000 RPM，15min）を経て、400 nmでの波長での光学密度の上昇をコントロール（増殖 培地上清液抜きの１mlの反応混合物）と対比させて決定した。 VI．コラーゲン分解活性 コラーゲン分解活性は、コラゲナーゼによる合成ペプチド（４−フェニルアゾ ベンジルオキシカルボニル−Pro-Leu-Gly-Ｄ-Arg）の分解後、溶液に放出された 有色生成物の量を測定することによりアッセイした。 反応混合物は0.5 mlの増殖培地上清液、２mlの合成ペプチド（ストック溶液は 、0.1 mlのメタノール及び10mlのベロナールバッファ−pH7.6 の中に10mgのペプ チドを含む）及び0.25mlの50mMのＮ−エチルマレイミドを含んだ。 この混合物を37℃で20min インキュベーションし、そして反応は0.5 mlの反応 混合物に対して１mlの0.5 ％のクエン酸及び５mlの酢酸エチル混合物を添加する ことにより停止させた。20sec の撹拌後、溶液を二相に分け、上相を分離し、そ してその吸収を320 nmの波長で決定した。10.D./６・10⁷細胞が１酵素単位に相 当する。 VII．応用技術 １．胞子を添加剤の存在下又は非存在下で土壌と混合する（５・10⁷胞子／ｇ 土壌）：ポット実験では500 ｇの土壌を使用し、一方マイクロプロット試験にお いては、15〜30kgの土壌を含むバケットを使用した。マイクロプロット試験にお けいてコントロールとして使用した化学剤はNemacar (登録商標)(Bayer)とする 。 ２．泥炭ごけ又はシリカに配合した胞子をポット土壌又は実生成長用チャンバ ーの中に添加する：胞子を泥炭ごけ又はシリカと混合し、そして適用前にオーブ ンの中で乾燥させる（40℃で一夜）。 VIII．線虫活性アッセイ 全ての実験において、トマトの実生（Na'ama株）を使用した。土壌を人工的に 0.7 匹の線虫／ｇ土壌で感染させ、そして実生を感染土壌の中に植え込んだ。ト マトの根の上で発育した卵塊から幼虫を用意した。各試験は30日続いた。 定量は０〜５に範囲する「異常肥大指数」の％変化に基づき、ここで「０」は 根の上に瘤がないことを示し、そして「５」は最大の根感染を示す。結果 Ｉ．EIP-N1 EIP-N1株はイスラエル国の中央平野領域から得た土壌より、グリーンハウスポ ット実験を経て、単離した。実験中、土壌は、トマトの実生の植え込み前に、0. 3 ％の綿実のしぼりかす(CSM)で富化しておいた。30日後、土壌を水の中でホモ ジナイズし、そしてサンプルをアガープレート上にまいた。そのプレートはEIP- N1株の単離のための起源を担う。 EIP-N1はバチルス．ファーマスに対して最大の配列類似性を示した（98.7％） 。Ｂ．ファーマスはボツリチス・シネレア（Botrytis cinerea）に対する有能な 生物学的制御剤であると予めわかっており（Yildiz，F．J．のTurkish Phytopat hology(1991)，30，11-22）、そしてアイランサス・トリフィサ（Ailanthus tri physa）の鱗翅類ペストについての新たな昆虫病原体としても同定されている(Va rma，R．V.ら、J．of Invertebrate Pathology，(1980)，47，379-380)。しかし ながら、この細菌による抗線虫活性について報告は何もない。 II．EIP-N2 EIP-N2株は、濾過滅菌した土壌及び0.05％の綿実しぼりかす(CS M)の混合物より、トマトの実生を植え込む試験管実験を経て、単離した。10日後 、土壌を水でホモジナイズし、そしてサンプルをアガープレート上にまいた。プ レートはEIP-N2株の単離のための起源を担う。 EIP-N2株は以下のバチルス種に対して最大の配列類似性を示した：Ｂ．メドゥ サ(B．medusa)(99.3 ％)、Ｂ．セレウス(B．cereus)(99.3 ％)、Ｂ．サーリンジ エンシス(B．thuringiensis)(99.3％)及びＢ．ミコイデス(B．mycoides)(99.3 ％)。更なる試験は、EIP-N2がＢ．セレウス種に属することを示した。 III．酵素活性 その他の微生物と対比してのEIP-N1及びEIP-N2（栄養細胞）のタンパク質分解 及びコラーゲン分解活性を測定し、そしてその結果を表Ｉ及びIIにそれぞれ示す 。本発明の株はその他の微生物よりも著しく高い活性を有することがわかる。 本発明を何ら限定するつもりもないが、タンパク質分解及びコラーゲン分解活 性は線虫の制御において、線虫のキューティクルに対する直接的な作用、又はタ ンパク質分解による線虫に対して毒素であることがわかっているアンモニアの放 出の上昇による間接的な作用により、重要な役割を果たしていると信じられる。 IV．抗線虫活性 EIP-N1及びEIP-N2胞子はグリーンハウス及びマイクロプロット条件下でネコブ 線虫に対して一貫して有意なバイオ抗線虫活性を示す。 メロイドジン種線虫に対するEIP-N1及びEIP-N2の抗線虫活性をグリーンハウス 条件下で測定した多数の実験の結果を図１にまとめ、そしてマイクロプロットに おける結果を図２にまとめる。図１のカッコ内の数値はその結果へと平均した試 験回数を示し、図２に示す に用いた：ａ）なし；ｂ）ゼラチン；ｃ）ゼラチン加水分解物；ｄ）ゼラチン＋ 綿実しぼりかす；ｅ）カゼイン加水分解物；及びｆ）Nemacur （登録商標）。 植物に細菌胞子のみ（添加剤なし）を適用した場合、グリーンハウス及びマイ クロプロット試験の双方において、細菌を加えていないコントロールと比べ、ネ コブ線虫感染の40〜50％の低下があった。添加剤、例えばゼラチン(0.2 ％w/w) 又はゼラチンと綿実しぼりかす(CSM)とのそれぞれ0.05％、及び0.25％の混合物 を細菌抜きで植物に適用すると、異常肥大指数の30〜40％の低下があった。しか しながら、細菌及び添加剤の双方を一緒に付加すると、グリーンハウス及びマイ クロプロット試験のそれぞれにおいて異常肥大指数の90〜100 ％及び70％の低下 をもたらす累積的に強化された効果があった。同様の結果がゼラチン及びカゼイ ンの加水分解物で得られた。 その他の添加剤も、単独で、又は組合せて、細菌の抗線虫活性を強めるために 利用できる。これらには栄養穀果、例えばエンドウマメ(pea)、マメ（bean）及 び腐蝕フラワー（humus flours）、並びに動物源由来の抽出物、例えば羽毛粉末 、粉末肉及びその他の安価 なタンパク質加水分解物が含まれる。好適な添加剤の組合せ例は粗ゼラチン質材 料とCSM との、又は乳漿タンパク質とCSM との、それぞれ0.1 ％及び0.25％の組 合せである。 泥炭ごけ又はシリカに配合した胞子は、添加剤の存在下又は非存在下でポット 土壌と混合する前は、上記の通常の適用技術と比べ、同じ抗線虫活性を示した。 一般に、細菌及び添加剤はトマト植物の地上に出ている部分(top)の新鮮重量 に対して陽性の効果を有する。別々に用いると、それらはコントロールと比べ、 50〜100 ％地上に出ている部分の新鮮重量を増大させた。しかしながら、組合せ て用いると、細菌及び添加剤は200 〜300 ％の増大を供した。 Ｖ．安定性 EIP-N1及びEIP-N2は、一部を表Ｉ及びIIに示した多数のその他の株に比べ、抗 線虫活性に関して優れた長期安定性を示した。例えば、高いコラーゲン分解活性 を示す555TT 株はRT又は４℃で安定性が劣っていた。 まとめると、EIP-N1及びEIP-N2を、抗線虫活性、酵素活性及び安定性の３つの カテゴリーにおけるその優れた性能に基づき、選定した。 VI．抗線虫組成物 典型的な抗線虫組成物は、活性成分（EIP-N1又はEIP-N2胞子）、適当な添加剤 、胞子の活性及び処理する植物に対して適合性である担体、並びに好ましくは界 面活性剤を含むであろう。添加してよい添加剤の例は0.1 ％のScanpro （商標） 210/Ｆ（粗ゼラチン質材料）＋0.25％のCSM 、又は0.1 ％のAMP （商標）800 （ 乳漿タンパク質）＋0.25％のCSM である。 本組成物は、それが使用されるであろう適用技術、即ち、１）灌 注系を介する適用；２）植物の土壌への混合；３）種子コーティング、に従って 改良されうる。 当業者は、本発明が記載されているものに限定されず、その範囲が請求の範囲 によってのみ限定されることを理解するであろう。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年４月２５日 【補正内容】 請求の範囲 １．抗線虫活性を有する細菌の株であって、EIP-N1(CNCM I-1556)、EIP-N2(CN CM I-1562)、並びにこのEIP-N1及びEIP-N2の抗線虫活性突然変異体より成る群の 構成員である株。 ２．EIP-N1(CNCM I-1556)及びEIP-N2(CNCM I-1562)、並びにこのEIP-N1及びEI P-N2の抗線虫活性突然変異体より成る群から選ばれる細菌株の純培養物。 ３．植物保護において利用するための抗線虫組成物であって、活性成分として の、EIP-N1(CNCM I-1556)、EIP-N2(CNCM I-1562)、並びにこのEIP-N1及びEIP-N2 の抗線虫活性突然変異体より成る群から選ばれる株の細菌又は胞子を含んで成り 、そして更にこの細菌又は胞子と適合性である担体とを含んで成る組成物。 ４．前記細菌の抗線虫活性を高める添加剤を更に含んで成る請求項３に記載の 組成物。 ５．前記添加剤が、ゼラチン、ゼラチン加水分解物、粗ゼラチン質材料、乳漿 タンパク質、カゼイン加水分解物及び綿実しぼりかすより成る群から選ばれる、 請求項４記載の組成物。 ６．植物病原性線虫を制御するための方法であって、前記植物にEIP-N1(CNCM I-1556)、EIP-N2(CNCM I-1562)、並びにこのEIP-N1及びEIP-N2の抗線虫活性突然 変異体より成る群から選ばれる株の細菌又は胞子を抗線虫的に有効な量で適用す ることを含んで成る方法。 ７．前記植物に請求項３〜５のいづれか１項記載の組成物を適用することを含 んで成る、請求項６記載の植物病原性線虫を制御するための方法。 ８．ネコブ病の原因となる線虫を制御するための、請求項６又は ７記載の方法。 ９．メロイドジン種に属する線虫を制御するための、請求項６又は７記載の方 法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．抗線虫活性を有する細菌の株であって、EIP-N1(CNCM I-1556)、EIP-N2(CN CM I-1562)、及びこのEIP-N1又はEIP-N2の抗線虫活性突然変異体より成る群の構 成員である株。 ２．EIP-N1(CNCM I-1556)及びEIP-N2(CNCM I-1562)、及びこのEIP-N1又はEIP- N2の抗線虫活性突然変異体より成る群から選ばれる細菌株の純培養物。 ３．植物保護において利用するための抗線虫組成物であって、活性成分として の、EIP-N1(CNCM I-1556)、EIP-N2(CNCM I-1562)、並びにこのEIP-N1及びEIP-N2 の抗線虫活性突然変異体より成る群から選ばれる株の細菌又は胞子と、この細菌 又は胞子と適合性である担体とを含んで成る組成物。 ４．前記細菌の抗線虫活性を高める添加剤を更に含んで成る請求項３に記載の 組成物。 ５．前記添加剤が、ゼラチン、ゼラチン加水分解物、粗ゼラチン質材料、乳漿 タンパク質、カゼイン加水分解物及び綿実しぼりかすより成る群から選ばれる、 請求項４記載の組成物。 ６．植物病原性線虫を制御するための方法であって、前記植物にEIP-N1(CNCM I-1556)、EIP-N2(CNCM I-1562)、及びこのEIP-N1又はEIP-N2の抗線虫活性突然変 異体より成る群から選ばれる株の細菌又は胞子を抗線虫的に有効な量で適用する ことを含んで成る方法。 ７．前記植物に請求項３〜５のいづれか１項記載の組成物を適用することを含 んで成る、請求項６記載の植物病原性線虫を制御するための方法。 ８．ネコブ病の原因となる線虫を制御するための、請求項６又は７記載の方法 。 ９．メロイドジン種に属する線虫を制御するための、請求項６又は７記載の方 法。