JPH11505129A

JPH11505129A - 治療的用途のためのｃｄ４４遺伝子発現の制御

Info

Publication number: JPH11505129A
Application number: JP9509313A
Authority: JP
Inventors: ピエトジコフ，ズビグニエブ; ダリウス，チエスラク; ルズデイーツ，サベラ
Original assignee: アイ・シー・エヌ・フアーマシユーテイカルズ
Priority date: 1995-08-14
Filing date: 1996-07-31
Publication date: 1999-05-18
Also published as: EP0846001A4; US5990299A; CN1193280A; SK18598A3; EP0846001A1; AU704579B2; CA2228965A1; KR19990036277A; IL122976A0; AU6686696A; MX9801264A; PL327628A1; WO1997006827A1; CZ43898A3

Abstract

(57)【要約】特に非小細胞肺癌および黒色腫癌細胞を含む、ＣＤ４４を過剰発現する腫瘍細胞を、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理してＣＤ４４の発現を制御する。調査結果は、特許請求したオリゴヌクレオチドが、肺癌または黒色腫細胞またはその両方におけるＣＤ４４配列に特異的な様式での細胞増殖を著しく減少させるが、正常な細胞に対しては主として非毒性であることを示す。臨床的セッティングにおける投与の例を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】治療的用途のためのＣＤ４４遺伝子発現の制御発明の分野本発明は、癌治療の分野、更に詳しくは、ＣＤ４４の発現を制御するアンチセンスオリゴヌクレオチドの用法に関する。発明の背景ＣＤ４４は、多数の異なる種類の細胞により発現される多型性族の膜糖蛋白質である。ＣＤ４４は、例えば、リンパ節ホーミング受容体として作用する循環リンパ球、および細胞−細胞接着に関与する上皮細胞上に見い出される（１）。ＣＤ４４は、同様に、細胞−細胞接着において機能する、肺、気管支上部の基底細胞、肺マクロファージ、肺胞性リンパ球および活性化ＩＩ型肺胞上皮細胞（alve olar pneuomocytes）にも見い出される（２）。ＣＤ４４は、ヒアルロン酸受容体に対する高親和性結合部位を有し、ＣＤ４４−ヒアルロン酸相互作用を利用して正しい場所に細胞を固定する（３）。単一の細胞内において、ＣＤ４４は、おそらく、細胞の変化する要求に依存して２種以上の変異型を発現することができる。変異型の多型の多様性は、ＣＤ４４遺伝子の種々のコード配列（エクソン）が、異なる組み合わせで転写（発現）される際におこる、ＣＤ４４のｍＲＮＡのオルタナティブスプライシングにより生じる。ＣＤ４４のスプライス変異型（アイソフォーム）の蛋白質生成物は、サイズ（１１０ｋＤａから２５０ｋＤａ以上）および機能において大きく変動する。ＣＤ４４蛋白質の細胞外領域は、細胞−細胞接着ならびにヒアルロン酸、フィブロネクチンおよびコラーゲンを含む細胞外マトリックス成分の結合に関与することが知られており、一方、ＣＤ４４の細胞内領域は、ＣＤ４４に依存する細胞の移動性に重要なアンキリン細胞骨格蛋白質と関係している。また、ＣＤ４４は、造血および全身循環へのリンパ球浸透においても機能することが分かっている（４、５、６）。ＣＤ４４の種々の機能を用いて活性化リンパ球および転移腫瘍細胞間の類似した挙動を説明することができることから、それらの機能は興味をそそる。両方の型の細胞が、比較的高くＣＤ４４を発現し、且つ、両方とも、侵襲性挙動、可逆的接着接触に関与する細胞移動、リンパ組織における蓄積および増幅、ならびに全身循環への放出を示す（６）。リンパ組織との関係は、リンパ球および転移腫瘍細胞の両方が、リンパ節の細胞外マトリックスまたはリンパ組織の樹枝状細胞もしくは他の細胞の表面のいずれかに存在する特定のリガンドを結合するためにＣＤ４４変異型を用いている点で特に興味深い。更に、リンパ節での増殖および分化後、リンパ球および腫瘍細胞の両方が、全身循環の遠心性リンパ管に同時に放出される。放出過程は、リンパ球および腫瘍細胞、細胞外マトリックス成分および周囲の細胞間の複雑な一連の相互作用を必要とし、おそらく、接着受容体、蛋白質分解酵素、増殖因子および増殖因子受容体が関与する。これらの過程は、ＣＤ４４分子のクリッピングに依存し、これらの過程の特異性は、ＣＤ４４アイソフォームと相互作用する組織特異的なリガンドにより仲介される。悪性細胞におけるＣＤ４４の発現は、従って、原発腫瘍増殖、局所的侵襲性および転移癖における重要な因子である（７、８、９）。ヒトゲノムのＣＤ４４遺伝子座は、染色体１１ｐ１３上に存在する（１０）。最近、ヒトＣＤ４４遺伝子のほとんどのゲノム構造が確立された（１１）。約６０キロ塩基（ｋｂ）の鎖長にわたり、少なくとも２０個のエクソンが分布している。これらの内１０個は、ＣＤ４４の標準型の配列をコードしている（エクソン１−５および１６−２０）。エクソン５から１６の間に、少なくとも１０個の更なるエクソンが位置し、これらは、オルタナティブスプライシングに供される（エクソン６−１５）。他の種におけるのと同様にヒトにおいても、ＣＤ４４遺伝子は、異なるサイズおよび機能を有する種々のオルタナティブスプライシングされた蛋白質をコードする。“標準”または“造血性”アイソフォーム（ＣＤ４４ｓ）と呼ばれる８９−９０ｋＤａ糖蛋白質、および“上皮性“２または変異型アイソフォーム（ＣＤ４４ｖ）と呼ばれる１８０ｋＤａ以上の糖蛋白質を含むいくつかのＣＤ４４アイソフォームが、現在までに精製され特徴づけられた。標準および上皮性アイソフォームをコードするｃＤＮＡクローンの単離および特徴付けにより、上皮アイソフォームが、細胞外領域をコードする少なくとも１０個のエクソン（ｖ１−ｖ１０）に由来する１３４個以上のアミノ酸の更なる配列を含有していること、および上皮性アイソフォームが、より強くグリコシル化されていることを除いては、これらの蛋白質の配列は同じであることが示された（１２、２７）。今や、ＣＤ４４標準型が、細胞移動の制御に鍵となる役割を果たすことが認められているが、大部分の細胞型で際立って多いオルタナティブスプライシングされたＣＤ４４変異型の正確な機能は、分かっていない。標準または変異型のいずれかのＣＤ４４発現が、ヒト腫瘍の転移の可能性と概ね関係するかどうかという問題に関して、文献は決定的ではない。１９９３年の論文は、例えば、このような相関が決して確立されていないことを指摘している（１３）。他方、最も高い水準のＣＤ４４変異型アイソフォームを発現する細胞は、最もしばしば悪性転換を受ける細胞になりやすいことが知られている。これらの細胞は、ＣＤ４４ｖアイソフォーム及びおそらく他の接着分子の発現に関連する制御されない増殖により、より侵襲性且つ転移性になる可能性がある。また、多数の研究により、悪性転換または癌転移とＣＤ４４変異型アイソフォームの発現との間の関係が明らかになった。例えば、１９９４年の論文は、特定のＣＤ４４変異型が、ヒトグリオーマ細胞接着および侵襲を仲介するのに役立つことを証明している（１４、１５）。子宮頚管癌が、正常な頚管上皮において検出されたことがない、エクソンｖ７およびｖ８によりコードされたエピトープの強い発現を示すことも示されてきた（１６）。別の研究では、特定のＣＤ４４変異型が、結腸直腸腫瘍プログレッションの特定の段階で過剰発現することを示し、好ましくない予後は、結腸直腸腫瘍が、前に腫瘍転移と関係したＣＤ４４アイソフォームを発現することを示唆した（１７、１８）。ある研究では、特定の変異型のみの過剰発現が、癌と関係してきた。例えば、エクソンｖ６配列を含有する変異型の発現は、特定の腫瘍の発達の増悪期に起こるが、エクソンｖ６配列が無い特定のＣＤ４４変異型は、腫瘍形成の最も初期および初期の腺腫に現れる。胃腺癌のスクリーニングは、検査した全ての標本におけるＣＤ４４ｖ発現を示し、腸管型腺癌は、エクソンｖ５およびｖ６変異型を発現し、び漫型腺癌は、エクソンｖ５のみを主として発現した。正常な胃粘膜は、小窩増殖ゾーン内およびムコイド表面上皮上のエクソンｖ５の発現を示してきた（１９）。同じパターンの発現が、び漫型癌組織と比較して十分分化した腸管腫瘍に豊富に存在するエクソンｖ１１について確認された。正常な胃粘膜は、エクソンｖ１１スプライス型の顕著に低い発現を示した。ＣＤ４４の存在は、腫瘍再発および平均１４ヶ月の追跡中の増加した死亡率と関係している。ＣＤ４４の過剰発現が、長期臨床有意性を有することが、文献に示されている。８７％の原発性乳腺腫瘍および１００％の異所性リンパ節転移におけるエクソンｖ６の陽性の発現が見られた患者の一群において、乏しい全体の生存が、ＣＤ４４ｖエピトープの存在と関連していた（２０、２１９）。別の群では、同様の結果が見られたが、この影響が時間と共に弱まることを示唆した。グリオーマに関する研究において、ＣＤ４４発現を阻害するＣＤ４４に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドにより、侵襲が、２つの細胞系で大きく阻害され、５つの他の細胞系では完全に阻止された（１５）。本発明者等の知るところでは、ＣＤ４４アンチセンス療法は、ヒト肺癌、黒色腫または白血病に対して応用されたことがなく、ＣＤ４４の１種以上の変異型が、これらの型の腫瘍のいずれかと関係することが立証されたことはなかった。少なくとも２つの主要な型、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）があることから、肺癌に関して問題を複雑にする。ＳＣＬＣは、これらのケースの約１／４を構成し、神経内分泌マーカーを発現し、一般的に、リンパ節、脳、骨、肺および肝臓に初期に転移する。ＮＳＣＬＣは、残りの肺腫瘍型の大部分を構成し、腺癌、扁平上皮癌、および大細胞癌を含む。ＮＳＣＬＣは、上皮様増殖因子および受容体によって特徴づけられ、局部的に侵襲する。１９９４年、Ｐｅｎｎｏおよびその同僚は、ＣＤ４４標準型の転写および翻訳が、非小細胞腫瘍および肺の扁平上皮化生の間で一致して高いが、小細胞腫瘍および静止ＩＩ型肺胞上皮細胞では希であることを報告した（２）。メラニン形成細胞および黒色腫細胞は、正常ではなく悪性のメラニン形成細胞で発現する遺伝子の探求を含む、悪性転換に関与する変化を調査するモデルとして広範に研究されてきた。正常なメラニン形成細胞と異なり、黒色腫細胞は、外因性増殖因子の非存在下で増殖することができる。この独立性は、明らかに、オートクリン増殖刺激のための増殖因子およびサイトカインの産生を反映している（２２）。黒色腫細胞は、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、血小板が誘導する増殖因子ＡおよびＢ鎖、塩基性線維芽細胞増殖因子、ＩＬ−６、ＩＬ−１、顆粒球マクロファージコロニー形成刺激因子、およびＭＧＳＡを含む種々の増殖因子を分泌する。構成的に又は種々のサイトカイン類の誘導後のいずれかに発現するこれらの増殖因子は、オートクリン増殖因子として作用するか又は腫瘍細胞に対する宿主応答を変調するかのいずれかにより、転換した黒色腫表現型の発生に寄与することができる（２３、２４）。転移をもたらすために、黒色腫細胞は、原発腫瘍から離れ、宿主間質を通じて侵入して循環への入り口を獲得し、血流を介して播種し、取り付く必要がある離れた毛細管床に到達するよう生存し、実質器官へ滲出し、二次増殖へと増殖しなければならない。腫瘍細胞がオートクリン増殖因子を産生する場合、または腫瘍細胞が宿主細胞により産生されたパラクリン増殖因子に応答する場合に、離れた部位での細胞の増殖が起きる（２２）。約９５％の家族性悪性黒色腫および４０％の散発性黒色腫は、前駆疾患から起きる。３種の型のメラニン形成細胞疾患：先天性、普通の後天性および形成異常母斑がある。先天性および普通の後天性母斑は、正常なメラニン形成細胞の病巣増殖を示す。対照的に、形成異常母斑は、正常なメラニン形成細胞ならびに増加した色素沈着、核多形性および有糸分裂異型性を示すメラニン形成細胞の不均質な集団から成る。この理由で、形成異常母斑のメラニン形成細胞は、ヒト悪性黒色腫の前駆疾患に相当すると考えられる。ヒト黒色腫は、３段階：ｉ）放射増殖期の黒色腫：ｉｉ）垂直増殖期の黒色腫；およびｉｉｉ）転移黒色腫に分類することができる。放射および垂直増殖期の原発黒色腫および転移黒色腫は、正常なヒトメラニン形成細胞およびメラニン形成細胞前駆疾患との生物学的、生化学的および核型の著しい相違を示す（２３）。異なる段階の腫瘍プログレッションから単離した細胞は、研究室で培養および研究することができることから、ヒト黒色腫は、十分適合したモデル系を提供する。下記で考察した実験に用いたヒト黒色腫Ｈｓ２９４Ｔ（ＡＴＣＣ）を、リンパ節転移から樹立したが、これは、高度に転移性の黒色腫細胞系である（２５）。ＮＳＣＬＣ実験と関連して考えると、Ｈｓ２９４Ｔ実験は、ＣＤ−４４を過剰発現する腫瘍に対する特許請求した治療法の総体的な有効性を示すものであると考えられる。発明の概要本発明は、ＣＤ４４の発現を制御するための肺癌、黒色腫および白血病細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの適用に関する。本明細書で開示した好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドのいくつかは、この機能を果たすのに約９５％効果的であり、この作用は、配列特異性であり、正常な細胞にたいして非毒性であると考えられる。図面の簡単な説明図面において、同じ参照文字は、いくつかの観点を通じた類似した要素を表す。図１は、２つの系の肺癌細胞（ＮＣＩ−Ｈ４６０およびＮＣＩ−Ｈ６６１）の細胞増殖に対する、２２個の異なるオリゴヌクレオチドと共にインキュベーションした場合の影響を示す棒グラフである。本出願における重要な問題のオリゴヌクレオチドは、以下のものである：ライン１ − ＩＣＮ−２４０（配列番号：１）ライン３ − ＩＣＮ−２４８（配列番号：２）ライン６ − ＩＣＮ−２３７（配列番号：３）ライン１１− ＩＣＮ−３０８（配列番号：４）ライン１３− ＩＣＮ−３１０（配列番号：５）ライン１７− ＩＣＮ−３１４（配列番号：６）図２は、癌細胞に対する選択したオリゴヌクレオチドの細胞毒性を示す棒グラフである。図３Ａおよび３Ｂは、２つの系の肺癌細胞の細胞増殖に対する選択したオリゴヌクレオチド濃度の変化の影響を示す線グラフである。図４Ａおよび４Ｂは、２つの系の肺癌細胞の細胞増殖に対する選択したオリゴヌクレオチドの経過時間の影響を示す線グラフである。図５は、未処理の肺癌細胞（ＮＣＩ−４６０）における異なる対のプライマーでの増幅後のＣＤ４４遺伝子発現を示すアガロースゲル上のＲＴ−ＰＣＲ生成物の写真である。ライン１−Ｐ１（配列番号：９）＋Ｐ２（配列番号：１０）ライン２−Ｐ３（配列番号：１１）＋Ｐ４（配列番号：１２）ライン３−Ｐ５（配列番号：１３）＋Ｐ６（配列番号：１４）ライン４−Ｐ６（配列番号：１４）＋Ｐ７（配列番号：１５）ライン５−ｐＨＥ７ライン６−ＰＣＮＡ（増殖細胞核抗原）ライン７−１００塩基対ＤＮＡラダー図６は、アンチセンス、センスおよびランダム配列でのヒト肺癌細胞（ＮＣＩ −Ｈ４６０）の処理後のＲＴ−ＰＣＲ生成物のサザンブロット分析のオートラジオグラフである。未処理 − 未処理の細胞ライン１ − ＩＣＮ−２３７（配列番号：３）ライン２ − ＩＣＮ−２３６（配列番号：７）ライン３ − ＩＣＮ−２４０（配列番号：１）ライン４ − ＩＣＮ−２４８（配列番号：２）ライン５ − ＩＣＮ−３０８（配列番号：４）ライン６ − ＩＣＮ−３１０（配列番号：５）ライン７ − ＩＣＮ−３１４（配列番号：６）ライン８ − ＩＣＮ−８８（配列番号：８）図７は、内部基準としてｐＨＥ７を用い、アンチセンス、センスおよびランダム配列での肺癌細胞（ＮＣＩ−Ｈ４６０）の処理後の“ホットな”ＲＴ−ＰＣＲ生成物のフルオロラジオグラフである。未処理 − 未処理の細胞ライン１ − ＩＣＮ−３０８（配列番号：４）ライン２ − ＩＣＮ−２４８（配列番号：２）ライン３ − ＩＣＮ−２３６（配列番号：７）ライン４ − ＩＣＮ−２４０（配列番号：１）ライン５ − ＩＣＮ−３１０（配列番号：５）ライン６ − ＩＣＮ−８８（配列番号：８）図８は、内部基準としてβ−アクチン⁷を用い、アンチセンス／センスおよびランダム配列での肺癌細胞（ＮＣＩ−Ｈ６６１）の処理後のＲＴ−ＰＣＲ生成物のサザンブロット分析のオートラジオグラフである。ライン１ − 未処理の細胞ライン２ − ＩＣＮ−２３７（配列番号：３）ライン３ − ＩＣＮ−２４０（配列番号：１）ライン４ − ＩＣＮ−２３６（配列番号：７）ライン５ − ＩＣＮ−３０８（配列番号：４）ライン６ − ＩＣＮ−８８（配列番号：８）図９は、内部基準としてβ−アクチンを用い、アンチセンス、センスおよびランダム配列での黒色腫癌細胞（Ｈｓ２９４Ｔ）の処理後のＲＴ−ＰＣＲ生成物のサザンブロット分析のオートラジオグラフである。ライン１ − 未処理の細胞ライン２ − ＩＣＮ−２３７（配列番号：３）ライン３ − ＩＣＮ−２４０（配列番号：１）ライン４ − ＩＣＮ−２３６（配列番号：７）ライン５ − ＩＣＮ−３０８（配列番号：４）ライン６ − ＩＣＮ−２４８（配列番号：２）ライン７ − ＩＣＮ−８８（配列番号：８）図１０は、ＩＣＮ−２４０（配列番号：１）の投与後のヌードマウスにおけるヒト白血病（ＮＢ４）の抑制を示す棒グラフである。図１１Ａおよび１１Ｂは、ＩＣＮ−２４０（配列番号：１）および、ＩＣＮ− ２４０の糖結合修飾物であるＩＣＮ−９６７（配列番号：１）で処理後の、それぞれ、ＮＢ４およびＤａｕｄｉヒト白血病細胞の抑制を示す棒グラフである。詳細な説明下記の考察は、種々のオリゴヌクレオチド配列の製造、並びにこれらの配列の肺および／または黒色腫癌細胞に対する効果の試験について説明している。ヒトＣＤ４４ｃＤＮＡ用アンチセンスおよびセンスオリゴヌクレオチドは、Stam enkovic等（２６）により公開された配列で示されたものの断片である。合計２２個のヌクレオチドを合成および調査し、この中から以下のものを更なる評価のため選択した：全ての調査した配列は、標準ホスホロアミダイト化学を用いホスホジエステルオリゴヌクレオチドとして自動ＤＮＡ合成機（Applied Biosystems 社モデル 394）により合成した。その結果できたオリゴヌクレオチドを、０．１Ｍの酢酸トリエチルアンモニウム中の５％アセトニトリルおよびアセトニトリルの直線勾配を用い逆相 semiprep Ｃ８カラム（ABI 社）を用いたＨＰＬＣにより精製した。生成物の純度を分析用Ｃ１８カラム（Beckman 社）を用いたＨＰＬＣによりチェックした。 22個のオリゴヌクレオチド配列の調査を、大細胞肺癌系ＮＣＩ−Ｈ４６０およびＮＣＩ−Ｈ６６１ならびにアメリカンタイプカルチャーコレクションから得た黒色腫癌細胞Ｈｓ２９４Ｔに関して行った。細胞を、３７℃の５％ＣＯ₂／９５％空気の常圧の加湿インキュベーター内で慣例的に培養増殖した。両方の細胞系は、１０％ウシ胎児血清を追加した９０％ＲＰＭＩ１６４０中で接着培養物として増殖した。細胞を、９６ウェルマイクロタイタープレートにウェル当たり２，０００個の細胞で接種し、引き続き、種々の濃度（０．１、０．２５、０．５、１．０μＭ）の下記で更に詳細に説明するアンチセンスおよびセンスオリゴヌクレオチドで処理した。７２時間の培養後、全ての細胞を、１μＣｉ／ｍｌの［³Ｈ］チミジンでパルスし、更に２時間培養し、自動ハーベスター９６（Tomte c 社）で回収し、［³Ｈ］チミジンの取り込みをβ−カウンター内で測定した。結果の正確さを保証するために、全培養を３回重複して行い、少なくとも３回繰り返した。予備肺癌スクリーニングにおいて、肺癌細胞系ＮＣＩ−Ｈ４６０およびＮＣＩ −Ｈ６６１の試料を、ＤＮＡ阻害の調査前に、０．５μＭの各オリゴヌクレオチドの存在下で７２時間インキュベートした。図１は、それぞれの垂直な線（１−２２）が、細胞増殖の抑制における特定のオリゴヌクレオチドの効果を示す、スクリーニングの結果を示す。６個のアンチセンスオリゴヌクレオチド、ライン１−ＩＣＮ−２４０（配列番号：１）；ライン３−ＩＣＮ−２４８（配列番号：２）；ライン６−ＩＣＮ−２３７（配列番号：３）；ライン１１−ＩＣＮ−３０８（配列番号：４）；ライン１３−ＩＣＮ−３１０（配列番号：５）；およびライン１７−ＩＣＮ−３１４（配列番号：６）；は、肺癌の細胞増殖をほとんど完全に抑制したが、一方、調査した残りのオリゴヌクレオチドは、細胞増殖に対して最小の影響であった。図２は、ニュートラルレッド（Clonetics 社、San Diego）の取り込みを用いた両方の肺癌細胞系に対する細胞毒性についてのこれらの６個のオリゴヌクレオチド（図１）の調査結果を示す。それぞれのオリゴヌクレオチドは、それらが処理中に細胞毒性ではないことを示す、未処理細胞の範囲を指した。図３Ａおよび３Ｂは、３個のアンチセンスＩＣＮ−２４０(配列番号：１)；ＩＣＮ−２３７（配列番号：３）；ＩＣＮ −３０８（配列番号：４）および１個のセンスＩＣＮ−２３６（配列番号：７）オリゴヌクレオチドの用量反応についての調査結果を示す。これらの実験において、２種の肺癌細胞の試料を、異なる濃度（０．１、０．２５、０．５、１．０ μＭ）のオリゴヌクレオチドで７２時間処理した。３個全てのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチド濃度の増加に伴って細胞増殖阻害の増大を示し、細胞増殖は、０．２５から０．５μＭの濃度で５５から９５％阻害された。センスオリゴヌクレオチドＩＣＮ−２３６（配列番号：７）は濃度が増大しても、細胞増殖に影響しなかった。図４Ａおよび４Ｂは、６日間にわたる２種の系の肺癌細胞に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドＩＣＮ−２３７（配列番号：３）、ＩＣＮ−２４０（配列番号：１）、およびＩＣＮ−３０８（配列番号：４）の調査結果を示す。容易に分かるように、細胞増殖阻害の最も高いパーセンテージ（２０−４５％）は、３個全ての選択したアンチセンスオリゴヌクレオチドで２４から４８時間の間にあり、効果は、実質的に７２−１２０時間までに無効になった。配列特異性を確認するために、ＲＴ−ＰＣＲを用い、種々のオリゴヌクレオチド、ＩＣＮ−８８（配列番号：８）；ＩＣＮ−２３６（配列番号：７）；ＩＣＮ−２３７（配列番号：３）；ＩＣＮ−２４０（配列番号：１）；ＩＣＮ−２４８（配列番号：２）；およびＩＣＮ−３０８（配列番号：４）を調査した。この手法で、両方の肺癌細胞系および黒色腫由来の全細胞ＲＮＡ抽出物を、イソチオシアン酸グアニジン法（グラス MAXRNA マイクロアイソレーションスピンカートリッジシステム−Gibco BRL）により単離し、製造元（Per kin Elmer Cetus）の指示書に従って、０．５μｇの全ＲＮＡ、オリゴ（ｄＴ）プライマーおよびＭ−ＭＬＶ逆転写酵素を用い最初のストランドｃＤＮＡ合成を行った。本発明者等は、次いで、ＣＤ４４遺伝子の特定の部分に特異的にアニールして、特異的ＣＤ４４蛋白質をコードする遺伝子の一部を増幅するプライマーを選んだ。ヒトＣＤ４４ｃＤＮＡのために本発明者等が用いたプライマーおよびＤＮＡプローブは、Stamenkovic 等(1989)(26)により公開された配列内で示された以下の通りのものであった：ＰＣＲプライマーＰ−１（配列番号：９）およびＰ−２（配列番号：１０）は、MatsamuraおよびTarin（２７）により用いられたプライマーに相当し、ＣＤ４４の標準部分をアニールするように設計されている。これらのプライマーにより、標準ＣＤ４４を発現する試料中の４８０塩基対のＰＣＲ断片、ＣＤ４４の上皮型を発現する試料中の８７８塩基対の断片およびオルタナティブスプライシングされた転写物を含有する試料中のいくつかの異なるバンドをもたらす断片が得られる。これらのｃＤＮＡ生成物（それぞれのケースで合計量の１０％）を、次いで、１ｘＴａｑバッファー、ＭｇＣｌ₂（１．５ｍＭ）、ｄＮＴＰ（５００μＭ）、適切な５´および３´プライマー、ならびにＴａｑＩポリメラーゼ（５０単位／ｍｌ）から成る反応混合物中でＰＣＲ用鋳型として用いた。全てのケースのサイクルパラメーターは、５５℃で８分間；９４℃で１分間；５５℃で１分間；および７２℃で２分間（３５サイクル）続いて７２℃で８分間であった。質および量を立証するために、内部基準として、リボソーム遺伝子（ｐＨＥ７）（２９）センスプライマー5′CTTCGAAAGGCAAGGAGGAA（配列番号：１６）およびアンチセンスプライマー5′TGGCTCTACA ATCCTCAGCA（配列番号：１７）、プライマーまたはβ−アクチンセンスプライマー5′CAGCCATGTACGTTGCTATC CAG（配列番号：１８）、ならびにアンチセンスプライマー5′GTTTCGTGGA TGC CACAGGA C（配列番号：１９）を用いたＰＣＲによるｃＤＮＡも増幅した。これは、リボソーム遺伝子用３００塩基対断片またはβ−アクチン用４５０塩基対の生成に帰した。１０ｕｌの各ＰＣＲ生成物を、１．５％アガロースゲル中で電気泳動にかけ、次いで、ＣＤ４４オリゴヌクレオチドプローブ5′CCTGAAGAAG AT TGTACATC AGTCACAGAC（配列番号：２０）とのハイブリダイゼーションのため、陽性に荷電したナイロン膜（Boehringer Mannheim）に移した。このプローブを、Ｔ₄ポリヌクレオチドキナーゼの存在下で5′末端にｇ−³²Ｐ−ＡＴＰで放射性同位元素標識した。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを、ラピッドハイブリダイゼーションバッファー（Amersham社）中で４２℃で９０分間実施した。次いで、フィルターを、４２℃で、５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを加えた１ｘＳＳＣ中で連続して各１５分間２回洗浄し、モレキュラーイマージャー(GS-250,Bio-Rad 社)を用いて分析した。ＣＤ４４分子の発現を確認するために、本発明者等は、初めに、ＣＤ４４遺伝子の異なるコード領域を増幅するよう設計されたプライマーの組み合わせ（２６）を用いて、肺癌ＮＣＩ−Ｈ４６０由来の未処理細胞を調査した。この手法において、ＲＮＡ試料を、約５ｘ１０⁵個の細胞から調製し、上記と同じ条件下でのＲＴ−ＰＣＲにより分析した。予想通り、プライマーＰ−１（配列番号：９）およびＰ−２（配列番号：１０）を用いたＰＣＲ増幅により、標準ＣＤ４４アイソフォームのＲＮＡから４８０塩基対断片を得た（図５、ライン１）。対照的に、著しく異なる分子サイズを有するＣＤ４４の他の断片は、他のプライマの異なる組み合わせ（図５、ライン２−Ｐ３（配列番号：１１）＋Ｐ４（配列番号：１２）；ライン３−Ｐ５（配列番号：１３）＋Ｐ６（配列番号：１４）；およびライン４−Ｐ６（配列番号：１４）＋Ｐ７（配列番号：１５））により発現した。選択したアンチセンスオリゴヌクレオチドの一つがどのようにしてＣＤ４４ｍＲＮＡの発現を阻害することができるかという問題を扱うために、本発明者等は、次いで、ＲＴ−ＰＣＲとサザンブロットハイブリダイゼーションの組み合わせを用いてＣＤ４４発現を調査した。ＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーＰ− １（配列番号：９）およびＰ−２（配列番号：１０）を、変異型インサートに隣接した“標準”アイソフォーム配列をコードするエクソン（１−５および１６− ２０）から誘導した。再び、公開されたデータ（３０）および図５にまとめた本発明者等の先の結果から予期されるように、プライマーＰ−１（配列番号：９）およびＰ−２（配列番号：１０）を用いた増幅により、ＣＤ４４“標準”アイソフォームのみが得られた。ＲＮＡ試料を、次いで、両方の系の肺癌細胞から調製したが、そのあるものは、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理しておらず、あるものは、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理している（０．５μＭで２時間）。本発明者等は、６個の選択したアンチセンスオリゴヌクレオチド、ならびに対照として１個のセンスおよび１個のランダムオリゴヌクレオチドを試験した（図６）。ＲＴ−ＰＣＲおよびサザンブロッティング分析後、本発明者等は、３個のアンチセンスオリゴヌクレオチドがＮＣＩ−Ｈ４６０細胞系におけるＣＤ４４ｍＲＮＡ発現の卓越した阻害を一致して示すことを見い出した（図６参照、ライン１−ＩＣＮ−２３７（配列番号：３）；ライン３−ＩＣＮ−２４０（配列番号：１）およびライン５−ＩＣＮ− ３０８（配列番号：４））。ｍＲＮＡ阻害の同様の効果を、ＮＣＩ−Ｈ６６１においても見い出した（図８、ライン２−ＩＣＮ−２３７（配列番号：３）：ライン３−ＩＣＮ−２４０（配列番号：１）およびライン５−ＩＣＮ−３０８（配列番号：４））。対照的に、ＣＤ４４の発現は、未処理の細胞（図８、ライン１）、またはセンスもしくはランダムオリゴヌクレオチドのいずれかで処理した細胞（図８参照、ライン４−ＩＣＮ−２３６（配列番号：７）およびライン６−ＩＣＮ−８８（配列番号：８））において陽性であった。肺癌細胞のアンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理後のＣＤ４４ｍＲＮＡ分子の減少の定量的測定（図７）を、“ホット”ＰＣＲを用いて実施した。この手法は、混合物中のデオキシヌクレオチドの１つをＰＣＲ増幅中に放射性同位元素標識し、最終的ＰＣＲ生成物を標識したことを除いては、実質的に上記と同じプロトコールを含んでいた。結果は、アンチセンスオリゴヌクレオチド０．５μＭの濃度で２時間処理後、ＣＤ４４ｍＲＮＡ発現が、光学密度計測により測定した場合、７９−９４％減少していた。（図７、ライン１−ＩＣＮ−３０８（配列番号：４）；およびライン４−ＩＣＮ−２４０（配列番号：１））。センスもしくはランダムオリゴヌクレオチド（図７、ライン３ −ＩＣＮ−２３６（配列番号：７）；およびライン６−ＩＣＮ−８８（配列番号：８））、または２つの他のアンチセンスオリゴヌクレオチド（図７、ライン２−ＩＣＮ−２４８（配列番号：２）；およびライン５−ＩＣＮ一３１０（配列番号：５））のいずれを用いても同様の効果は観察されなかった。更に、試験したオリゴヌクレオチドのいずれもがリボゾームＲＮＡ水準（ｐＨＥ７）に影響せず、従って、標的のＣＤ４４ｍＲＮＡに対する選択性を示した。図９は、図６のそれと同様のサザンブロット分析である。しかしながら、ここでは、黒色腫癌細胞（Ｈｓ２９４Ｔ）の試料を、４種のアンチセンスと共にインキュベートした。しかしながら、ここでは、黒色腫癌細胞（Ｈｓ２９４Ｔ）の試料を、４種のアンチセンス、ＩＣＮ−２３７（配列番号：３）、ＩＣＮ−２４０（配列番号：１）、ＩＣＮ−３１０（配列番号：５）、およびＩＣＮ−２４８（配列番号：２）、１種のセンス、ＩＣＮ−２３６（配列番号：７）ならびに１種のランダム、ＩＣＮ−８８（配列番号：８）オリゴヌクレオチドと共にインキュベートした。ＲＴ−ＰＣＲおよびサザンブロッティング分析後、本発明者等は、２種のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ライン３−ＩＣＮ−２４０（配列番号：１）で９１％およびライン５−ＩＣＮ−２４８（配列番号：６）で８４％の非常に高い効果でＣＤ４４ｍＲＮＡ発現を阻害すること、および残りのアンチセンス、ライン５−ＩＣＮ−３０８（配列番号：４）が、約５４％の効果を示すことを見い出した。未処理の細胞、ライン１と共に、ライン４−ＩＣＮ−２３６（配列番号：４）、およびランダム、ライン７−ＩＣＮ−８８（配列番号：８）オリゴヌクレオチドは、何の効果も示さなかった。β−アクチンを、内部基準として用いた。図１０は、ＩＣＮ−２４０（配列番号：１）の投与後のヌードマウスにおけるヒト白血病（ＮＢ４）の阻害を示す棒グラフである。グラフは、２週間にわたる約８０％のインビボ増殖阻害を示しており、更には、５日から１５日の間の白血病細胞のほとんどぎりぎりの増殖を示している。図１１Ａおよび１１Ｂは、ＩＣＮ−２４０（配列番号：１）および、ＩＣＮ− ２４０の糖結合修飾物であるＩＣＮ−９６７（配列番号：１）で処理後の、それぞれ、ＮＢ４およびＤａｕｄｉヒト白血病細胞の抑制を示す棒グラフである。グラフは、Ｇ１期における白血病細胞のパーセンテージの著しい増加を示している。特にヒトを含めた哺乳類を含む動物の広い範囲に対する、本明細書で述べたようなオリゴヌクレオチドのデリバリー法は、当業界で周知である。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド療法におけるデリバリー方法（Deliverv Strateg ies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics ），CRC 印刷(Saghir Akhtar ,編集 1995年)は、多数のこのようなデリバリー経路および方法を詳述しており、参照によりその全体を本明細書に含めるものとする。この本全体の適応性を制限することなく例としてのみにより、５章は、その全てを本発明に応用することのできる、鼻腔内、眼、経皮およびイオン導入経路（同上、７１−８３ページ）のような“ダメージを与えない経路”と共に、伝統的な静脈内、腹腔内および皮下経路による投与について述べている。同じ本の６章は、オリゴヌクレオチド治療薬をヌクレアーゼ耐性にする修飾を扱っており、本明細書で用いたヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび核酸塩基とは、詳しくは、このような化合物の天然型の記載されている修飾物および他の全ての伝統的に修飾した変異型を含む。（同上、８５−１０４ページ）。特許請求したオリゴヌクレオチドは、リンカーと共に又はリンカー無しのいずれかで、細胞膜を通過して能動的に輸送される脂質または他の化合物に結合させて、やはり参照により本明細書に含めるものとする米国特許５，４１１，９４７で開示されたように経口的に投与することもできる。更には、本発明のオリゴヌクレオチドは、“裸”の形態で、カプセル化して、小嚢（vesicle）、リポソーム、ビーズ、ミクロスフェアと連携して、共役物（conjugate）として、および例えば ICN Biomedicals 社の製品番号ＳＰＡＧ２を用いてエアゾールとして直接肺に投与することができる。従って、本発明のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド類似体およびプロドラッグを生成する全ての許容することのできる変形体を用い、そして全ての適切な結合剤および賦形剤、剤形ならびに治療計画を含めて、実質的にオリゴヌクレオチドにとって全ての公知の投与経路により投与することができる。目下、本発明のオリゴヌクレオチドの最も好ましい投与は、約４０日間、１日につき１−２回、患者の体重１ｋｇ当たり約０．１から１０ｍｇのオリゴヌクレオチドの静脈投与を含んで成る。この投与計画は、蛋白合成による効果が、４８または７２時間まで持続することができるという観察と共に、数時間までのインビボの類似のオリゴヌクレオチドの測定した半減期に基づいている。個々の患者に与えられる特定の治療計画は、当然のことながら、関与する疾患、患者の健康状態および反応、副作用、および臨床医によく知られている多数の他の因子を秤にかける、このような臨床医の経験に依存する。例えば、より高い又はより低い投与水準、及びより長い又はより短い期間にわたる治療計画は、治療をする臨床医の判断に依存するであろうし、オリゴヌクレオチドでの治療を一時的に停止する休止期間を含めてもよい。治療は、適切な場合、他の抗癌および待期的療法と組み合わせることもできる。治療する疾患のプログレッション／寛解は、腫瘍のサイズ、転移の程度ならびに放射線分析および当業界で公知の他の方法を通じた他の因子に従うことにより決定することができ、副作用の存在および程度は、肝臓および／または腎臓の機能性に従うことにより、ならびに例えば再度当業界で周知であるＥＫＧの使用を通じたような血液循環に従うことにより決定することができる。このように、ＣＤ４４を過剰産生する癌細胞、特に非小細胞肺癌および黒色腫細胞におけるＣＤ４４の発現を制御するのに効果的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを開示している。臨床的実践においてこれらのオリゴヌクレオチドを用いる方法も開示されている。特定の態様および適用を示し説明してきたが、本明細書に開示された発明の概念から離れることなく更なる改変が可能であることは、当業者等に明白であろう。本発明は、従って、付記する特許請求の範囲の精神を除いては制限されるものではない。参考文献： Haynes F.B.，Telen，J.M.，Hale，P.L．Denning M.S．：ＣＤ４４−白血球接着およびＴ−細胞活性化に関与する分子． Immunology Today，1989，10:423-4282．２．Penno MB，August JT，Baylin SB，Mabry M，Linnoila RI，Lee VS，Crotea u D，Yang XL and Rosada C: ヒト肺腫瘍におけるＣＤ４４の発現．Cancer Res .，1994，54，1381-1387．３．Lesley J．Hyman R and Kincade PW: ＣＤ４４およびその細胞外マトリックスとの相互作用．Adv．Immunol．1994，54: 271-335．４．Sherman L.，Sleeman J.，Herrlich P.，Ponta H.，ヒアルロナート受容体：増殖、分化、移動および腫瘍のプログレッションにおける立役者.Current Opi nionin Cell Biology,1994，6: 726-733．５．Gunthert U．ＣＤ４４：多様な機能を有する多数のアイソフォーム．Curren t Topics in Microbiology and Immunology，1993，184: 47-55．６．Herrlich P.，Zoller M.，Pals T.，Ponta H.，ＣＤ４４スプライス変異型：転移はリンパ球と出会う．Immunol.Today，1993，14: 395-399．７．Salles G，Zain M，Wei-meng J，Boussiotis VA and ShippA: び漫性大細胞リンパ腫におけるオルタナティブスプライシングされたＣＤ４４転写物：特徴付け並びに正常な活性化Ｂ細胞および上皮悪性度との比較．Blood，1993，82: 3539-3547．８．Koopman G，Heider KH，Horst E，Adolf GR，van der Berg F，Ponta H，He rrlich P and Pals ST: 活性化ヒトリンパ球および攻撃性非ホジキンのリンパ腫は、ラットの転移関連ＣＤ４４変異型の相同体を発現する．J．Exp．Med.，1993 ，177: 897-904．９．Bartolazzi A，Peach R，Aruffo A，Stamenkovic I: ＣＤ４４およびヒアルロナート間の相互作用は、腫瘍進行の加減に直接関係している．J．Exp．Med.， 1994，180: 53-66．１０．Goodfellow PN，Banting G，Wiles MV，Tunnacliffe A，Parkar M．Solom on E，Dalchau R，Fabre JW: モノクローナル抗体Ｆ１０．４４．２により規定される抗原の発現を制御する遺伝子ＭＩＣ４は、ヒト染色体１１上に存在する． Eur．J.Immunol.，1982，12: 659-663．１１．Screaton GR，Bell MV，Jackson DG，Cornelis FB，Gerth U and Bell JI ，リンパ球ホーミング受容体ＣＤ４４をコードするＤＮＡのゲノム構造は、少なくとも１２個のオータナティブ・スプライシングされたエクソンを示す．Proc． Natl．Acad． Sci，USA，1992，89: 12160-12164．１２．Aruffo A，Stamenkovic I，Melnick M，Underhill CB and Seed B: ＣＤ４４は、ヒアルロナートの主要な細胞表面受容体である．Cell，1990，61: 1303 -1313．１３．Seiter S，Arch R，Reber S，Komitowski D，Hofmann M，Ponta H，Herrl ich P，Matzku S and Zoller M: 抗−変異型ＣＤ４４による腫瘍転移形成の阻止．J．Exp．Med.，1993，177: 443-455. １４．Li H，Hamou MF，Tribolet N．Jaufeerally R，Hofmann M，Deserens AC and Meir EG: 変異型ＣＤ４４接着分子は、膠芽細胞腫ではなくヒト脳転移における発現である．Cancer Res.，1993，53: 5345-5349．１５．Merzak A，Koocheckpour S and Pilkington GJ: ＣＤ４４は、ヒト神経膠腫細胞接着およびインビトロでの侵入を仲介する．Cancer Res.，1994，54: 398 8-3992．１６．Dall P，Heider KH，Hekele 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【手続補正書】【提出日】１９９８年４月１４日【補正内容】（１）請求の範囲を別紙の通り補正する。（２）明細書中、第 27 頁第１２行目に「５−ＩＣＮ−２４８」とあるを「６− ＩＣＮ−２４８」と補正する。請求の範囲１．配列 5′TTT ATC TTC TTC CAA G （配列番号:３）を含んで成ることを特徴とするオリゴヌクレオチド。２．配列 5′AAA TTT CCT CCC AG （配列番号:５）を含んで成ることを特徴とするオリゴヌクレオチド。３．配列 5′TTT ATC TTC TTC CAA GGC GAA GC（配列番号:２）を含んで成ることを特徴とするオリゴヌクレオチド。４．ＣＤ４４遺伝子とハイブリダイゼーションすることができる、以下のいずれかの配列を有するオリゴヌクレオチド５．肺癌細胞におけるＣＤ４４遺伝子発現を５０％以上減少させることのできるオリゴヌクレオチド。６．非小細胞肺癌細胞におけるＣＤ４４遺伝子発現を５０％以上減少させることのできるオリゴヌクレオチド。７．黒色腫細胞におけるＣＤ４４遺伝子発現を５０％以上減少させることのできるオリゴヌクレオチド。８．白血病細胞におけるＣＤ４４遺伝子発現を５０％以上減少させることのできるオリゴヌクレオチド。９．１３から２４の核酸塩基を含んで成る、請求項６から８のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。１０．約１３〜２４塩基対の鎖長を有し、且つ、ＣＤ４４をコードする配列の２５０から９９１あるいは１６２０から２０３８の位置のある部分に対する相補性を有するオリゴヌクレオチド。１１．ＤＮＡ分子を含んで成る、請求項６から８のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。１２．少なくとも部分的にＣＤ４４により仲介される腫瘍性症状がある患者を治療する方法であって、ＣＤ４４遺伝子発現を減少させることのできるオリゴヌクレオチドの効果的な量を患者に投与する処置を含んで成る前記方法。１３．当該腫瘍性症状が、非小細胞肺癌を含んで成る、請求項１２に記載の方法。１４．オリゴヌクレオチドが、以下の配列：の少なくとも１つを含んで成る、請求項１２から１３のいずれかに記載の方法。１５．当該腫瘍性症状が黒色腫を含んで成る、請求項１２に記載の方法。１６．オリゴヌクレオチドが、以下の配列：の少なくとも１つを含んで成る、請求項１２及び１５のいずれかに記載の方法。１７．投与が、静脈内、腹腔内、皮下、鼻腔内、眼、気管支内、肺内、経皮およびイオン導入経路の少なくとも１つを含んで成る、請求項１２から１４のいずれかに記載の方法。１８．オリゴヌクレオチドを、以下の：ヌクレアーゼ耐性形態；細胞膜を通過して能動的に輸送される脂質または他の化合物に結合させて；“裸”の形態で；カプセル化して；小嚢と関連させて；リポソームと関連させて；ビーズに付着させて；ミクロスフェアに付着させて；抱合物として；およびエアゾールとしての少なくとも１つで投与する、請求項１２から１４のいずれかに記載の方法。【手続補正書】【提出日】１９９８年４月２７日【補正内容】請求の範囲１．配列 5 ′ATT CGA AAT GAA ACA A （配列番号：１）を含んで成ることを特徴とするオリゴヌクレオチド。２．肺癌細胞におけるＣＤ４４遺伝子発現を５０％以上減少させることのできるオリゴヌクレオチド。３．非小細胞肺癌細胞におけるＣＤ４４遺伝子発現を５０％以上減少させることのできるオリゴヌクレオチド。４．黒色腫細胞におけるＣＤ４４遺伝子発現を５０％以上減少させることのできるオリゴヌクレオチド。５．１３から２４の核酸塩基を含んで成る、請求項２から４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。６．約１３〜２４塩基対の鎖長を有し、且つ、ＣＤ４４をコードする配列の２５０から９９１あるいは１６２０から２０３８の位置のある部分に対する相補性を有するオリゴヌクレオチド。７．ＤＮＡ分子を含んで成る、請求項２から４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。８．少なくとも部分的にＣＤ４４により仲介される腫瘍性症状がある患者を治療する方法であって、ＣＤ４４遺伝子発現を減少させることのできるオリゴヌクレオチドの効果的な量を患者に投与する処置を含んで成る前記方法。９．当該腫瘍性症状が、非小細胞肺癌を含んで成る、請求項８に記載の方法。１０．オリゴヌクレオチドが、以下の配列を含んで成る、請求項８あるいは９のいずれかに記載の方法。１１．当該腫瘍性症状が黒色腫を含んで成る、請求項８に記載の方法。１２．オリゴヌクレオチドが、以下の配列を含んで成る、請求項８、９、及び11 のいずれかに記載の方法。１３．投与が、静脈内、腹腔内、皮下、鼻腔内、眼、気管支内、肺内、経皮およびイオン導入経路の少なくとも１つを含んで成る、請求項８あるいは９のいずれかに記載の方法。１４．オリゴヌクレオチドを、以下の：ヌクレアーゼ耐性形態；細胞膜を通過して能動的に輸送される脂質または他の化合物に結合させて；“裸”の形態で；カプセル化して；小嚢と関連させて；リポソームと関連させて；ビーズに付着させて；ミクロスフェアに付着させて；抱合物として；およびエアゾールとしての少なくとも１つで投与する、請求項８あるいは９のいずれかに記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ダリウス，チエスラクアメリカ合衆国、カリフオルニア・92700、サンタ・アナ、ピー・オー・ボツクス・ 26641 (72)発明者ルズデイーツ，サベラアメリカ合衆国、カリフォルニア・92704、サンタ・アナ、プラザ・ドライブ・3700、アパートメント・ジエイ・110

Claims

【特許請求の範囲】１．配列 5′TTT ATC TTC TTC CAA G （配列番号：３）を含んで成ることを特徴とするオリゴヌクレオチド。２．配列 5′ATT CGA AAT GAA ACA A （配列番号：１）を含んで成ることを特徴とするオリゴヌクレオチド。３．配列 5′AAA TTT CCT CCC AG （配列番号：５）を含んで成ることを特徴とするオリゴヌクレオチド。４．配列 5′TTT ATC TTC TTC CAA GGC GAA GC（配列番号：２）を含んで成ることを特徴とするオリゴヌクレオチド。５．当該オリゴヌクレオチドが、ＣＤ４４遺伝子とハイブリダイゼーションすることができる、請求項１から４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。６．肺癌細胞におけるＣＤ４４遺伝子発現を５０％以上減少させることのできるオリゴヌクレオチド。７．非小細胞肺癌細胞におけるＣＤ４４遺伝子発現を５０％超減少させることのできるオリゴヌクレオチド。８．黒色腫細胞におけるＣＤ４４遺伝子発現を５０％超減少させることのできるオリゴヌクレオチド。９．白血病細胞におけるＣＤ４４遺伝子発現を５０％超減少させることのできるオリゴヌクレオチド。１０．約１３〜２４塩基対の鎖長を有し、且つ、ＣＤ４４をコードする配列の２５０から２０３８の位置のある部分に対する相補性を有するオリゴヌクレオチド。１１．１３から２４の核酸塩基を含んで成る、請求項６から１０のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。１２．ＤＮＡ分子を含んで成る、請求項６から１０のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。１３．少なくとも部分的にＣＤ４４により仲介される腫瘍性症状がある患者を治療する方法であって、ＣＤ４４遺伝子発現を減少させることのできるオリゴヌクレオチドの効果的な量を患者に投与する処置を含んで成る前記方法。１４．当該腫瘍性症状が、非小細胞肺癌を含んで成る、請求項１３に記載の方法。１５．オリゴヌクレオチドが、以下の配列：の少なくとも１つを含んで成る、請求項１３に記載の方法。１６．当該腫瘍性症状が黒色腫を含んで成る、請求項１３に記載の方法。１７．オリゴヌクレオチドが、以下の配列：の少なくとも１つを含んで成る、請求項１３から１６のいずれかに記載の方法。１８．投与が、静脈内、腹腔内、皮下、鼻腔内、眼、気管支内、肺内、経皮およびイオン導入経路の少なくとも１つを含んで成る、請求項１３から１６のいずれかに記載の方法。１９．オリゴヌクレオチドを、以下の：ヌクレアーゼ耐性形態；細胞膜を通過して能動的に輸送される脂質または他の化合物に結合させて；“裸”の形態で；カプセル化して；小嚢と関連させて；リポソームと関連させて；ビーズに付着させて；ミクロスフェアに付着させて；共役物として；およびエアゾールとしての少なくとも１つで投与する、請求項１３から１６のいずれかに記載の方法。