【発明の詳細な説明】
発明の名称
単クローン抗イデイオタイプ抗体（ＡＢ２）及びその使用
技術分野
本発明は、免疫学の分野に関し、詳しくは、免疫応答における主要な関与因子
であるＢ及びＴヒトリンパ球のイディオタイプネットワーク及び認識に高度に結
合していることが主な特徴である抗イディオタイプの単クローン抗体（ＡＢ２）
ＩｇＧ型の選択及び使用に関する。
従って、本発明の目的は、Ｔリンパ球及びＢリンパ球と相互作用し、免疫調節
効果を発揮しうる免疫ネットワークに結合した抗イディオタイプの単クローン抗
体ＩｇＧ型を提供することである。
背景技術
免疫応答の基礎となるのは、主に抗原の表面特異的レセプターにおいて関係が
ある一部の決定Ｂリンパ球クローンの抗原刺激である。Ｔ細胞は、この過程を調
節する手段として、正と負のシグナルの生成能を有する。しかし、免疫系調節機
序は、Ｊｅｒｎｅ（Ｊｅｒｎｅ ＮＫ（１９７４）Ａｎｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ。Ｉ
ｎｓｔ．Ｐａｓｔｕｅｒ １２５、Ｃ：３７６：３８９）による仮説どおり、き
わめて複雑である。すなわち、免疫系は、イディオタイプで指示されている相互
作用による抗体分子及び相互関連リンパ球の有機的構造として「見る」ことがで
きるという仮説である。
抗体におけるイディオタイプは、それぞれの抗体が特定のイディオタイプ決定
因子を発現し、その中に抗原−抗体認識部位が含まれるようなさまざまな部位に
おけるエピトープと規定される。イディオタイプネットワークの理論は、免疫グ
ロブリン分子（ＡＢ１）におけるイディオタイプ決定因子が、この決定因子に対
して得られる抗イディオタイプ抗体（ＡＢ２）により認識されるという事実（Ｕ
ｒｂｉｎ．Ｊ（１９７６）Ａｎｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ。１２３７Ｃ：３５７）が証
明されたことに端を発する。
イディオタイプ決定因子とそれに対応する抗イディオタイプ決定因子との結合
は、免疫応答の経過時に混乱が起きることもある絶えず変化する状態で生じる。
７０年代にＪｅｒｎｅにより提案されたイディオタイプネットワークの理論は
、免疫レパトアが考えうるすべての抗原を含むと共に、これを認識することを暗
示している。自己抗原と非自己抗原との間のｄｉｃｔｏｍｙを無視することによ
り、リンパ球の自己反応性クローンの存在は生理的態様でみられる。
過去１０年間に行われた研究では、正常な被験者における自然自己反応性抗体
の存在が明らかにされた（Ａｖｒａｍｅａｓ．Ｓ．、（１９９１）Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．．Ｔｏｄａｙ、１３２Ｃ：２３１：２３６、Ａｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ（１９
８６）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３６、５０５：５１０、Ｌｕｎｄｋｖｉｓｔ（
１９８９）、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８６：５０７４−５０７８、Ｌｏｎｇｔｅｎｂ
ｅｒｇ．Ｔ（１９８８９）Ｊ Ｅｅｐ Ｍｅｄ、１７０：１３７４、１３３５）
）。
こうした実験的事実により、恒常性生理的機能の維持のために系統発生的に選
択される内基準（自己認識）により個体発生的に組織される特異的レセプターの
高度に結合したネットワークとして、また感染に対する正常な防御以上のものと
して免疫系をみる考えが提起されている。この意味で、自己の認識は正常であり
、自己に対する耐性及び記憶は、Ｂｕｒｎｅがクローン選択理論（Ｂｕｒｎｅｔ
Ｆ．Ｍ．（１９５６）、ロンドン、ケンブリッジ大学プレス）においてが仮設
したクローンの性質とは考えられないが、それらは統合された観点による免疫ネ
ットワークの性質を明らかにしている（Ｃｏｕｔｉｎｈｏ．Ａ（１９８４）Ｉｍ
ｍｕｎｏ．Ｒｅｖ．７９：１５１−１６８、Ｃｏｕｔｉｎｈｏ．Ａ（１９８９）
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ １１０：６３−８７）。
免疫系に関連した新しい考えは、自己免疫疾患の基本的機序の理解及び新しい
治療法における強い影響力をもっていた（Ｚｅｎｅｔｔｉ．Ｍ（１９８５）Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ６：２９９−３０２：Ｋａｖｅｒｉ ｅｔ ａｌ（１
９９１）Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ。８６：１９２−１９８：Ｋａｔｚ
ｔｃｈｉｎｅ．Ｄ．Ｍ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｌ。Ｒｅｖ１３９：７９−１０
７）。
異なる免疫グロブリン化合物による驚くべき治療効果が、多種多様な全身的・
臓器特異的自己免疫疾患において確認されており、これはこの新しい考えの臨床
的確認に有効である（Ｋａｔｚｔｃｈｉｎｅ ｅｔ ａｌ（１９９３）自己免疫
：生理学及び疾患Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、ニューヨーク）。
ＩｇＧ免疫グロブリン製剤は、抗体の自己反応性生理的ネットワークを示す健
常なドナーの血液プールから得られる。こうした製剤における反応性分析では、
自己抗体及び本質的に自己抗体において発現するイディオタイプと相互作用する
抗体の存在が明らかにされている（Ｒｏｓｓｉ．ｅｔ ａｌ（１９８９）Ｃｌｉ
ｎ Ｅｘｐ。Ｉｍｍｕｎｏ １。７４：３１１ー３１６、Ｒｏｓｓｉ．ｅｔ ａ
ｌ（１９８９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ。１４３：４１０４ー４１０９）。両タイプ
の反応性は、プール内部のほかの分子よりも関係している総数のＩｇＧ分子が高
濃度である（Ｄｉｅｔｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ。２２：１７０１−１７０６）。このようにして、これらの製剤の免疫調
製効果により、自己免疫患者における結合性及び多様性を回復させるための新し
い治療法の計画が正当化される。この臨床的価値により、結合抗体のさまざまな
部位における調節ネットワークの欠落による自己免疫疾患は、治療に急を要する
という考えが正当化される。以前の研究において、腫瘍関連ガングリオサイドに
対する一連の単クローン抗体が得られ、抗原はＴ細胞依存自己抗原と分類された
（欧州特許番号：０６５７４７１Ａ１）。これらのＭａｂｓは、イディオタイプ
ネットワーク全体を活性化することが可能なイディオタイプを有し、抗原の非存
在下に抗体反応を生成するＩｇＭ型であり、すなわち、反復性イディオタイプで
ある。これらの抗体は、特にＮｅｕｃＡｃ ＧＭ２ガングリオサイドを認識する
と報告されている（Ａｌｆｏｎｓｏ．Ｍ ｅｔ ａｌ（１９９５）ハイブリドー
マ１４（３）：２０９−２１６）。
本発明は、ガングリオサイドを認識する最初のＩｇＭ抗体に対する一連の抗イ
ディオタイプ単抗体（ＡＢ２）の生成及び選択における新規性を提供するもので
ある。
一連の抗イディオタイプ単抗体（ＡＢ２）から、Ｂ７と呼ばれる抗体の一つに
対する別の特徴付けが行われ、Ｂ７は抗原（Ｋｄ １０ Ｅ−８）及び同型であ
るがα型にたいする中等度の結合活性を有するＩｇＧ２ａであり、ｓｉｎｇｅｎ
ｅｉｃモデル（Ｂａｌｂ／ｃ）における抗体（ＡＢ１）依存反応を誘発すること
が可能であることを示した。
抗イディオタイプ抗体Ｂ７の研究において驚くべき性質が示されている。すな
わち、異なる種のヒトＢ及びＴリンパ球認識の免疫グロブリンとの高いイディオ
タイプ結合性と、以前に活性化したＢ及びＴリンパ球の免疫調節効果である。
自己免疫のほか、感染症及び癌の治療のための抗イディオタイプ抗体における
この性質を提案した治療は知られていない。
本発明の新規性は、ヒトＢリンパ球及びＴリンパ球と相互作用が可能であるさ
まざまな部位及びそれらの免疫調節効果により免疫ネットワークと高度に結合し
た抗イディオタイプ単クローン抗体ＩｇＧ型の選択で構成される。
発明の開示
免疫ネットワークと高度に結合した単クローン抗イディオタイプ抗体の生成及
び製造。
単クローン抗イディオタイプ抗体の生成及び製造のため、免疫原としてガング
リオサイドに対するＭａｂを用い、免疫法をほかに記載（欧州特許出願 ６５７
４７１Ａ１）されているとおり実施する
血清中の抗イディオタイプ抗体の力価が高いマウスを再免疫化し、３日後に脾
臓を摘出し、脾細胞を得る。
これらの細胞を骨髄腫細胞と融合させ、細胞融合は周知の方法のいずれに従っ
て実施してもよく、こうしてハイブリドーマを得る。この方法は、この目的のた
めのいずれかの手順において詳細に述べる。
得られた抗体は、免疫検定法、好ましくは免疫酵素法により分析し、上清につ
いて固有抗原の特異的認識の存在を評価する。抗体−抗体結合を酵素で標識した
二次抗体により検出する。
抗原（Ｎｅｕ Ａｃ ＧＭ２）との抗原グリオサイドＭａｂ（Ｅ１）の結合阻
止能のために上清を選択し、水濃縮中上清をインキュベートした後、抗原と共に
Ｅ１ Ｍａｂを選択する。
望ましいハイブリドーマが選択され、限界濃度により少なくとも２回クローン
化されていれば、その結果としてのＭａｂは数種類の培養法で得ることができる
。
一つの方法では、Ｍａｂが高濃度で得られる腹水を産生するマウスの腹膜腔に
適量の細胞を接種することができる。
得られた抗イディオタイプＭａｂは、対応する抗原に関連し、又は関連しない
異なるＭａｂｓ抗ガングリオサイドを認識すると共に、対応する抗原との抗ガン
グリオサイドＭａｂの結合を阻止しないことにより特徴も明らかにされる。
Neuc Ac GM２のガングリオシドを認識するモノクロナール抗体抗ガングリオシド
E1に対して生産されるIgGタイプの抗イデオタイプモノクローナル抗体のイデオ
タイプ結合の評価は、PVCプレート内における間接免疫酵素検定を用いて行われ
る。
プレートは、特別の抗ガングリオシドMabsで、コーテングされており、マウス
由来または他の種由来の非特定のMabsと、人間由来のＭａｂｓをこの目的とIgG
プールのために用いられる。このようなウエルは、ＰＢＳと牛血清アルブミン（
１％）を用いて、室温で約１時間ブロックされる。それに引き続いて370℃の湿
気のあるチャンバ中で２時間、濃度 250ug〜 10ug／mL の抗イデオタイプモノク
ロナール抗体を添加する。このプレートは、PBSを用いて少なくとも４回洗浄し
、アルカリホスファターゼ抱合体を用いてラベルした抗マウスFcを４時間にわた
り加える。この作業終了後、基質が加えられ、このプレートはOD 405nmであった
。負の制御を加え、すなわち、イデオタイプネットワークに結合されていない他
の抗イデオタイプモノクロナール抗体を例としてあげることができる。
結合していると想定される抗イデオタイプモノクロナール抗体は、異種とそれ
らに対応するフラグメントに由来する異種の抗体を認識し、また、健康なヒトの
ドナーから得たヒトプールIgGも認識する。
このようにして、他種の免疫グロブリンの可変領域におけるイデオタイプを認識
する、これらのMabsの、高レベルの結合性を示す。
イディオタイプ的に結合した抗イディオタイプ Mab（AB2）IgG 型による異種Ｂ
リンパ球およびＴリンパ球認識の評価手順
イディオタイプ的に結合した抗イディオタイプ Mab（AB2）IgG型による、異種
（マウス、ラット、サル、ヒト）から得たＢリンパ球およびＴリンパ球認識の評
価は、フローサイトメータにおける間接免疫蛍光検定によって行う。
異種から得たＢリンパ球およびＴリンパ球は、フィコール放射法により、研究
された種にしたがって、抹消血液および他のリンパ器官（脾臓、リンパ節、腹膜
）から分離する。細胞環を分離し、ノイバウアー計算板を用いて細胞の算定を行
う。細胞懸濁液(200 uL)は、湿ったチャンバ内で、抗イディオタイプ Mab（AB2
）とともに30分間インキュベートする。樹立状態へ正の制御を加え（ior t3 ま
たはior t4）、さらに負の制御も加える。抗マウスFITCまたはRPEのような適当
な抱合体を加え、30分間のインキュベートを行った後、試料をフローサイトメー
タで計測する。
インビトロ（IN VITRO）でのＢリンパ球およびＴリンパ球における、イディオタ
イプ的に結合した抗イディオタイプ Mab（AB2）IgG型の生物学的効果の評価手順
任意の哺乳類種のＢリンパ球およびＴリンパ球における、イディオタイプ的に結
合した抗イディオタイプ Mab（AB2）IgG 型の生物学的効果を評価するには、3H-
Thimidine の取り込みによって細胞増殖検定を行う。
単核周辺細胞は、フィコール放射法によって分離する。これらの細胞（100000
/ウエル）を、マイクロプレート内で、10％血清とともに適当な培地を用いてインキ
ュベートする。５ug/mLのような濃度でPHAなどのリンパ球活性化剤を、また、同
じ濃度のCon A、および同じ濃度のPWMを、異なる濃度（ 300 ug 〜15 ug / mL）
の抗イディオタイプ Mab 存在下で、この培養物に加える。活性化剤のみ、また
はリンパ球細胞のみ、のような制御をこの検定に加える。培養物は、５％ＣＯ2
の湿った雰囲気中で、72時間、370℃に保つ。
培養物が分裂停止する６時間前に、3H-Thymidine(１uCi、23uCi /mmoi)を各ウ
エルに加える。細胞を回収し、ベータカウンタ（スエーデン、ＬＫＢ社）を用い
3H-Thymidineを計測する。
高度に結合したこの抗イディオタイプ Mabは、前もって活性化した任意種のＢ
リンパ球およびＴリンパ球における刺激を、抑圧または促進することが可能であ
る。結合していない抗イディオタイプ Mabは、この効果を発揮することができな
い。
自己免疫疾患、感染症および悪性新生物についての異種動物モデルに関し、イン
ビボ（IN VIVO）でのＢリンパ球およびＴリンパ球における、イディオタイプ的
に結合した抗イディオタイプ Mab（AB2）IgG 型の生物学的効果の評価手順
自己免疫疾患、感染症および悪性新生物についての、Ｂリンパ球およびＴリン
パ球における、イディオタイプ的に結合した抗イディオタイプ Mab（AB2）IgG型
のインビボ（IN VIVO）生物学的効果は、異なる動物実験モデルを使用して計測
する。この動物は、汎発性の紅斑性狼瘡（ＤＳＬ）を発病する。
MRL/1pr/1prマウスに、以下のプログラムに従って高用量のＢ７抗イディオタ
イプ Mabを腹腔内注射する。すなわち、このプログラムは、マウス出生後24時間
にこの処置のイニシエーションを行うとともにこれを４週間施続けながら、１mg
/マウス、週３回の腹腔内注射を行うものである。
また、マウス出生時に抗イディオタイプ Mabを 100 ug施す低用量プログラム
についても評価を行う。
この治療効果は、いくつかの様相によって計測する。すなわち、臨床的兆候の
発現における遅延時間（皮膚病変リンパ節）によって、または、動物生存率の増
加によって、そしてまた、インディケータ（たんぱく尿、抗ＤＮＡ自己抗体）と
して考えられる任意の生物学的パラメータのバリエーションによって、計測され
る。処置を施さない動物からなる対照群は、比較例を確証するために使用した。
抗腫瘍効果の評価は、実験動物モデルを使用して行った。すなわち、異種移植
肺腫瘍細胞（RL-67）を有するマウス（C57BL/C）に、１mg/マウス、週３回、という
プログラムに従って、抗イディオタイプ Mabの異なる用量を施した。
治療効果は、処置を施した動物と対照群の生存率曲線を比較することにより計
測した。
感染症における抗イディオタイプ Mabの生物学的効果は、予めChabaudi変形体
のクローンに感染させたBalb/Cマウスを用いて評価した。（Conquy-Adib.M et a
l（1993）Mol Immunology 30(2)：119-127）。摂取３日後、このマウスに以下の
ような治療プログラムを施した。すなわち、１）全用量800ugを、300,100,200、
200ugの用量に分け１週間にわたり経時的に腹腔内注射を施した。
２）高用量である全量３mgを、４週間、注射によって投与した（１mgを２回、続
いて500ugを２回施した）。対照群には、同様のプログラムに従い、生理食塩水0
.2 mL を投与した。
臨床的兆候発現の遅延に対する余裕は、処置を施した群に対照群を比較するこ
とにより評価した。
ネズミＢ７モノクローナル抗体のヒト化及び免疫原性の低減の手順
Ｂ７Ｍａｂを、その免疫原性を低減させるために、同時に齧歯類モノクローナ
ル抗体の免疫原性を低減させる（発行番号０６９９７５５の欧州特許公報＃１９
９６／１０による）手順で、全体としてその結合特性を保存しながら修飾した。
免疫グロブリンの抗原性はそれらの配列上のＴ細胞抗原性ペプチドの存在に依存
するため、異種もしくは同種抗体の免疫原性は、他の哺乳動物種の抗体に通常見
出されるものとは異なるＴ細胞抗原性配列に含まれる残基を置き換えることによ
り低減することが可能である。もちろん、この残基の置換は、正規の構造又は補
助帯に関与するものは含まない。この慎重な残基の置換は構造的な決定基又はそ
れに接触するインタードーマ（interdoma）に影響を及ぼさず、したがって、可
変領域フレームワークの残基に制限される変更の結果として、リガンド結合特性
は影響を受けない。
（１）−可変領域の相同性の分析。
本手順は、Kabat et al.，"Sequences of ptoteins of Immunological Intere
st"Fifth edition.，Bethesda，Maryland; National Inst．of Helth，1994によ
って編纂されたヒト抗体可変ドメインの利用可能な配列データを使用する。
第１の工程において、ネズミＢ７重鎖又は軽鎖の可変ドメインをヒトの配列の
対応する可変ドメインと比較する。
この比較は、自動化−コンピュータ化された方法（ＰＣ−ＤＯＳ、ＨＩＢＩＯ
ＰＲＯＳＩＳ ０６−００、Ｈｉｔａｃｈｉ）によって行う。その後、最も一致
するヒト可変領域の残基を対応するネズミの領域の残基と比較する。これは、各
マウス配列が最も似ているヒトのサブグループも定義する。
（２）−Ｔ−エピトープの推定。
第２の工程において、この２つの相同可変領域配列、マウス及びヒトを、Ｔ−
抗原性配列を推定するために分析する。アルゴリズムＡＭＰＨＩ（Bersofsky et
al.，The Journal of Imnunology 138: 2213-2229，(1987)）はらせん配列を推
定する。アルゴリズムＳＯＨＨＡはらせんの疎水性のストリップを推定する（El
liott et al.，J．Immnunol．138: 2949-2952，(1987)）。これらのアルゴリズ
ムはＴ細胞が提示する抗原性タンパク質の断片を推定する。
（３）免疫原性の低減の分析。
ヒトの対応物とは異なるマウスフレームワーク内の残基を、ヒトの対応物中に
存在する残基で置き換える。この切り換えは、Ｔ−抗原性配列の残基でのみ生じ
る。
最終的に、正規の構造の元になる残基又は補助帯に含まれる残基の置換は三次
構造に重大な影響を及ぼす。したがって、それらはこの置換には含まれない。提
示される置換の三次構造又は結合部位に対する影響に関するさらなる情報は、可
変領域の分子モデルから得ることができる。
（４）変更された抗体を構築し、発現する方法。
ネズミｍＡｂのＣＤＲ、軽鎖及び重鎖の両者をヒトのフレームワークに組込む
組換えＤＮＡ配列であって、免疫原性が少なく、かつ動物モノクローナル抗体の
抗原特異性を有する組換え抗体を発現させるために哺乳動物細胞の形質導入に用
いることができる組換えＤＮＡ配列の調製に、以下の手順を用いる。
ａ−）ＣＤＲ及びＦＲ領域を含む可変領域ドメインの変異誘発及び組み立て。Ｐ
ＣＲ−変異誘発法（Kamman et al.，Nucleic Acids Res．17: 5404-5409，(1989
)）が異なる位置の変更の導入に好ましく用いられる。
ｂ−）細胞に形質導入された際に親和性及び特異性の決定に十分なタンパク質の
分泌を生じる可変領域及び対応するヒト定常領域を含む発現ベクターの調製。
ｃ−）適切な細胞系への重鎖及び軽鎖発現ベクターの同時形質導入。
約２週間後、その細胞上清を、ＥＬＩＳＡによってヒトＩｇＧの生成について
分析する。その後、その試料を、あらゆる方法によって特定の抗原に結合し得る
ヒトＩｇＧについて分析する。
実施例１：同系モデルにおいて得られるＥ１Ｍａｂに対する免疫網に高度につな
がるモノクローナル抗イディオタイプ抗体（ＡＢ２）の生成及び製造。
ガングリオシドに対するＭａｂ（Ｅ１Ｍａｂ）を、Ｂａｌｂ／Ｃマウス（６−
８週齢）における免疫原として、他（ＥＰＯ ６６７ ４７１ Ａ１号）に記述
される通りに行われる手順で用いる。
血清中に高力価の抗イディオタイプ抗体を有するマウスを再度免疫し、３日後
に脾臓を取り出して脾臓細胞を得る。
これらの細胞を、幾つかの小さな変更を加えたKholer及びMilsteinによって記
述される方法（Nature（1975）256: 495-497）に従ってミエローマ細胞と融合さ
せ、ハイブリドーマを得る。ネズミの脾臓細胞を、非分泌ネズミミエローマ細胞
Ｐ３／Ｘ６３Ａｇ６６．５．３と、１０：１の割合で、ＰＥＧ（３０００−５０
００）を含有する０．５ｍＬの融合培地中において融合させる。
生成した抗体を、その上清を適正な抗原の特異的な認識の存在について評価す
るあらゆる免疫検定法で検定する。抗体−抗体結合を酵素で標識した二次抗体で
検出する。
上清を抗ガングリオシドＭａｂ（Ｅ１）の抗原（Ｎｅｕ Ａｃ ＧＭ２）への
結合をブロックするそれらの能力について選択し、適度な濃度のその上清をイン
キュベートした後、抗原を有するＥ１Ｍａｂ。
抗イディオタイプＭａｂを、それらが異なる関連もしくは非関連Ｍａｂ抗ガン
グリオシドを認識し（図１）、抗ガングリオシドＭａｂの対応する抗原への結合
をブロックしないことでも特徴付けられる場合に選択する。ハイブリッド４Ｂ７
を２回クローン化し、得られたＭａｂはＩｇＧ２ａクラスの抗イディオタイプＭ
ａｂＢ７であった。
実施例２：抗イディオタイプ抗体（ＩｇＧ型）におけるイディオタイプ型の結合
性を評価する手順。
Ｎｅｕｃ Ａｃ ＧＭ２ガングリオシドを認識するモノクローナル抗体Ｅ１に
対して得られたＩｇＧ型の抗イディオタイプモノクローナル抗体のイディオタイ
プ型の結合性の評価を、間接免疫酵素検定を用いて、ＰＶＣプレート（９６ウェ
ル、High Binding Costar）内で行う。プレートを、免疫原として用いられたも
の、Ｅ１Ｍａｂを含む特異的抗ガングリオシドＭａｂ及び非特異的Ｍａｂで、炭
酸塩−重炭酸塩バッファー中においてコートする。これらのウェルをＰＢＳ及び
ウシ血清アルブミン（１％）を用いて室温で１時間ブロックした後、２５０μｇ
ないし１０μｇ／ｍＬの濃度範囲の抗イディオタイプモノクローナル抗体を湿潤
チャンバー内において３７℃で２時間添加する。プレートを少なくとも４回洗浄
し（ＰＢＳ）、アルカリホスフェート結合体で標識した抗マウスＦｃを４時間添
加する。その後、基質を添加し、プレートをＯＤ４０５ｎｍで読み取る。
陰性対照、すなわち、このイディオタイプ網につながらない他の抗イディオタ
イプモノクローナル抗体を含める。
抗イディオタイプＭａｂを生成する異なるハイブリッドの上清は、この抗ガン
グリオシド関連Ｍａｂの可変領域を認識し、Ｂａｌｂ／Ｃ起源Ｍａｂの非関連Ｉ
ｇＭ及び新生児Ｍａｂも認識した（図１）。
このＩｇＧ２Ａ型の抗イディオタイプモノクローナル抗体は、抗ガングリオシ
ド関連Ｍａｂ、Ｂａｌｂ／Ｃ起源Ｍａｂの非関連ＩｇＭ、及び新生児Ｍａｂの可
変領域におけるイディオタイプを認識する、１０−８Ｍの親和性を有する高いイ
ディオタイプ型結合性を示した（図２）。
実施例３：イディオタイプ的に結合する抗イディオタイプＭａｂによる治療的な
ＩｇＧの調製における、ヒトミエローマ免疫グロブリン（ＩｇＧ）のイディオタ
イプの認識の特徴付け。
Ｂ７Ｍａｂによるヒトミエローマ免疫グロブリン（ＩｇＧ）イディオタイプ（
可変領域）の認識の能力を評価した。
この目的のため、間接免疫検定を用いる（９６ウェル、High Binding Costar
）。プレートを異なるＩｇＧ画分又は（Colligan，E．J．et al．Eds（1995）Cu
rrent Protocols in Immunologyに従って得られる）それらの断片でコートする
。これらのウェルをミエローマタンパク質を用いて炭酸塩−重炭酸塩バッファー
中でコートし、ＰＢＳ及びウシ血清アルブミン（１％）を用いて室温で１時間ブ
ロックした後、３８０μｇないし１１μｇ／ｍＬの濃度範囲の抗イディオタイプ
モノクローナル抗体を湿潤チャンバー内において３７℃で２時間添加する。プレ
ートを少なくとも４回洗浄し（ＰＢＳ）、アルカリホスフェートで標識した抗ヤ
ギＦｃ領域を添加して４時間インキュベートする。その後、基質を添加し、プレ
ートをＯＤ４０５ｎｍで読み取る。
このＢ７抗イディオタイプモノクローナル抗体は、ヒトミエローマ免疫グロブ
リンに存在する可変領域（イディオタイプ）を認識した（図３）。イディオタイ
プ的に結合してはいない他のネズミＭａｂは、このＩｇＧ画分とのいかなる反応
性も示さなかった（図４）。
高度に結合した抗イディオタイプＭａｂを生成する他のハイブリッドの上清は
、ＩｇＧヒトミエローマタンパク質の可変領域を認識した。認識プロフィールは
ＩｇＧヒトミエローマタンパク質の各々について異なっていた（図５）。
このＢ７抗イディオタイプモノクローナル抗体は、ヒトミエローマ免疫グロブ
リン断片に存在する可変領域（イディオタイプ）も認識した（図６）。
さらに、このＢ７Ｍａｂ及び異なる濃度の治療用ヒトＩｇＧによるヒトミエロ
ーマＩｇＧの認識についての競合検定により認識特異性を評価した。この実験は
、以下の通りに行った。
異なる濃度の治療用ヒトＩｇＧを固定濃度のＢ７Ｍａｂ（９５μｇ／ｍＬ）と
共に一晩インキュベートした後、この混合物を、ヒトミエローマＩｇＧと共に、
この例において既述の免疫検定を用いてインキュベートした。
治療用ヒトＩｇＧの濃度を増加させることにより、ヒトミエローマＩｇＧイデ
ィオタイプに対するＢ７Ｍａｂの認識が阻害される（図７）。
このネズミ起源のＢ７ＭａｂがヒトミエローマＩｇＧ及び治療用ヒトＩｇＧの
可変領域を認識することが可能であるという事実は、高いイディオタイプ型の結
合性を示し、かつ可変領域において認識される領域が種間で高度に保存されるこ
とを示唆する。
実施例４：イディオタイプ的に結合するＩｇＧ型抗イディオタイプＭａｂ（ＡＢ
２）によるヒトＢ及びＴリンパ球の認識の評価。
イディオタイプ的に結合するＩｇＧ型抗イディオタイプＭａｂ（ＡＢ２）によ
るヒトＢ及びＴリンパ球の認識の評価を、フローサイトメーターでの間接免疫蛍
光検定によって行う。
Ｂ及びＴリンパ球をフィコール勾配手法によって末梢血から単離する。細胞リ
ングを単離し、ノイバウエルチャンバーで細胞を数える。濃度及び細胞の生存能
力を決定した。
１０7個細胞に調整された細胞懸濁液（２００μＬ）を、抗イディオタイプＭ
ａｂ（ＡＢ２）と共に、湿潤チャンバー内において３０分間インキュベートする
。標準曲線を２５０ないし１０μｇ／ｍＬの濃度範囲で加える。陽性対照を確立
された条件で加え（ｉｏｒ ｔ３又はｉｏｒ ｔ４）、陰性対照も含めた（ｉｏ
ｒ ｒ３）。インキュベーションの後、細胞懸濁液を収容するこれらのウェルを
ＰＢＳ ＢＳＡアジドで洗浄し、上清を除去するために遠心して、さらに４回遠
心する。抗マウスＦＩＴＣ結合体を添加して湿潤チャンバー内で３０分間インキ
ュベートした後、試料を洗浄してさらに４回遠心し、最後にその細胞懸濁液を１
００μｌのＰＢＳに再懸濁してその試料をフローサイトメーターで測定する。
図（８Ａ）は、フローサイトメーターにおける、Ｂ７ＭａｂによるヒトＢ及び
Ｔリンパ球の認識分析を示す。図（８Ｂ）は陰性対照（ｉｏｒ ｒ３Ｍａｂ）イ
ディオタイプ的に結合していないＭａｂ）を示す。
Ｂ７Ｍａｂは、正常ドナーからのヒトリンパ球（末梢血リンパ球）の５３％を
認識することが可能であった。したがって、このイディオタイプ型の反応性を有
するＭａｂはＴ及びＢヒトリンパ球に存在する分子構造を認識することが可能で
ある。
実施例５：イディオタイプ的に結合するＩｇＧ型Ｂ７抗イディオタイプＭａｂ（
ＡＢ２）の、イン・ビトロでの、Ｂ及びＴリンパ球に対する生物学的効果の評価
。
イディオタイプ的に結合するＩｇＧ型Ｂ７抗イディオタイプＭａｂ（ＡＢ２）
のあらゆる哺乳動物種のＢ及びＴリンパ球に対する生物学的効果を評価するため
、細胞増殖検定を、３Ｈ−チミジンによって、企業内で行う。
末梢血リンパ細胞（ＰＢＬ）をフィコール勾配手法により単離する。ウェル当
り１０００００個の量の細胞を、マイクロプレート内において、１０％血清を含
むＲＰＭＩ１６４０培地中でインキュベートする。このインキュベーションに、
濃度が５μｇ／ｍＬであり得るＰＨＡ、同じ濃度のＣｏｎＡ及び同じ濃度のＰＷ
Ｍのようなリンパ球活性剤を、異なる濃度の抗イディオタイプＭａｂ（３００μ
ｇないし１５μｇ／ｍＬ）の存在下において添加する。活性剤のみ又はリンパ細
胞のみの対照を検定に含める。培養物を３７℃の５％ＣＯ２湿潤雰囲気下に７２
時間保持する。
この培養を止める６時間前に、各ウェルに３Ｈ−チミジンを添加する（１μＣ
ｉ、２３μＣｉ／ミリモル）。細胞を回収し、３Ｈ−チミジンをベータカウンタ
ー（ＬＫＢスウェーデン）によって測定する。
Ｂ７高度結合抗イディオタイプＭａｂは、予め活性化されたＢ及びＴリンパ球
の刺激を抑制することが可能であった（図９Ａ及びＢ）。この分裂促進性の刺激
の抑制効果は治療用ヒトＩｇＧによっても生じた（図１０Ａ及びＢ）。結合して
いない抗イディオタイプＭａｂはこの効果を発揮することはできなかった。
このＢ７Ｍａｂが予め活性化されたＢ及びＴヒトリンパ球において生物学的抑
制効果を発揮するという事実は、この高度に結合した抗イディオタイプＭａｂの
免疫調節能力を示す。
実施例６：イディオタイプ的に結合するＩｇＧ型抗イディオタイプＭａｂ（ＡＢ
２）の、イン・ビボでの、自己免疫疾患、感染性疾患及び悪性新生物の異なる動
物モデルのＢ及びＴリンパ球に対する生物学的効果の評価。
イディオタイプ的に結合するＩｇＧ型抗イディオタイプＭａｂ（ＡＢ２）の、
自己免疫疾患、感染性疾患及び悪性新生物に関するＢ及びＴリンパ球に対するイ
ン・ビボでの生物学的な効果を、異なる動物実験モデルを用いて測定した。自己
免疫疾患におけるＢ７Ｍａｂの効果の評価には実験モデルＭＲＬ／１ｐｒ／１ｐ
ｒマウスを用いた。この動物は播種性エリテマトーデス（ＤＳＬ）を発症する。
１ｍｇ／マウス、週３回、動物の誕生の２４時間後に治療を開始し、これを４
週間維持するというスキームに従い、ＭＲＬ／１ｐｒ／１ｐｒマウスに高用量の
Ｂ７抗イディオタイプＭａｂを腹腔内注射する。
動物の誕生時に１００μｇの抗イディオタイプＭａｂを用いて、低用量施療も
評価した。
その治療効果を、幾つかの側面、臨床的な徴候の出現（皮膚病変リンパ節）の
遅延時間、動物の生存数の増加及び指標として考えられるあらゆる生物学的パラ
メータ（タンパク尿、抗ＤＮＡ自家交代）の変動により測定する。非処置動物の
対照群を比較のために用いる。
抗腫瘍効果の評価を実験動物モデルを用いて行った。異種移植肺腫瘍細胞（Ｒ
Ｌ−６７）を有するマウス（Ｃ５７／ＢＬ／Ｃ）を、１ｍｇ／マウス、週３回の
スキームにしたがって、異なる用量の抗イディオタイプＭａｂで治療した。
その治療効果を治療動物対対照の生存曲線を比較することにより測定する。
感染性疾患における抗イディオタイプＭａｂの生物学的効果を、予めプラスモ
ジウム・チャバウディ（Plasmodium Chabaudi）のクローン（Conquy-Adib．M．e
t al（1993）Mol Immunolgy 30(2): 119-127）に感染させたＢａｌｂ／Ｃマウス
を用いて評価した。接種の３日後、以下の治療スキームでこれらのマウスを治療
した。
１）総用量８００μｇを、３００、１００、２００、及び２００μｇの連続用量
で１週間、腹腔内注射した。
２）３ｍｇの高総用量を４回の毎週注射（１ｍｇを２回、次いで５００μｇを２
回）で投与し、対照群には同じスキームで０．２ｍＬの生理食塩液を投与した。
臨床的な徴候の出現を遅らせる能力を、対照と治療群を比較することにより評
価する。
実施例７：抗イディオタイプモノクローナル抗体を含有する医薬組成物。
高度にイディオタイプ的に結合する抗イディオタイプモノクローナル抗体及び
それらの組み合わせの有効量を、二塩基性リン酸ナトリウム９．０ｍｇ、一塩基
性リン酸ナトリウム２．５５ｍｇ及び塩化ナトリウム４３．００ｍｇ、ポリソル
ベート８０１ｍｇ、ＷＦＩ ５．００ｍＬを含んでなる医薬ビヒクル中に含有す
る医薬組成物を得た。この医薬組成物は、自己免疫疾患、感染性疾患及びガンに
用いられる。
実施例８：Ｂ７モノクロナール坑体ＤＮＡのミューライン(Murine)可変領域シー
ケンス。
細胞質ＲＮＡが、ファロロ(Faloro)等による記載のようにして（Faloro，J.et
al．Methods in Enzimology 65:718-749)）、約１０６のＢ７ハイブリドーマ細
胞から抽出された。
重鎖(heavy chain)の可変領域に対する，5 ug RNA，50 mM Tris-HCL，pH 7.5
，75 mM KCL，10 mM DTT，3mM MgCl2，25 pmol ＣＧ２ＡＦＯＲ プライマー(5"G
GAAGCTTAGACCGATGGGGCCTGTTGTTTTG 3")、または、軽鎖(light chain)の可変領域
に対するＣＫ２ＦＯＲ(5"GGAAGCTTGAAGATGGATACAGTTGGTGCAGC 3")、ｄＡＴＰ，
ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ各250 uM、15 uリボヌクレアー インヒビター（
ＲＮＡガード、医薬品）からなる、総量50ulのｃＤＮＡ合性反応。
サンプルは、７００度Ｃで１０分間加熱され、その後３０分かけて３７０度ｃ
に徐々に冷却した。その後、１００ユニットの反転転写酵素（BRL）が加えられ
、さらに３７０度Ｃでの保温が１時間続けられた。
ＶＨとＶＫ ｃＤＮＡが、オーランディ(Orlandi)等の記述するように(Orland
i，R．et al．Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:3833-3837，(1989))、ＰＣＲを
使用して増幅された。5 ul cDNA，25 pmoles CG2A FOR
そして、VH1 BACK プライマー
からなるＶＫ，ＤＮＡ／プライマー混合物のＰＣＲ増幅に対して。
5 ul cDNA，25 pmoles の CK2 FOR
そして、VK10 プライマー
からなるＶＫ，ＤＮＡ／プライマー混合物のＰＣＲ増幅に対して。
これら２つの混合物には、最終容積が50ulとなるように、それぞれ2.5mMのdAT
P,dCTP,dTTP,dGTPと、5 ulの10X緩衝サーモラーゼ(thermolase)と、１ユニット
のサーモラーゼ(IBI)が加えられた。
サンプルは、９４０度Ｃで３０分、５００度Ｃで３０分、７２０度Ｃで１分、
最後に７２０度Ｃで５分間保温という、２５の熱サイクルに適応された。増幅さ
れたVH cDNAはPrep．A Gene 清浄化キット(BioRad)で清浄化された。
清浄化されたＶＨは、Ｍ１３ベクターにクローン化された。クローンは、T7 D
NA Pol（医薬品）を使用するダイデオキシ(dideoxy)法でシーケンスされた。図
１１を参照。
実施例９：予見されるＴ細胞抗原シーケンスを生起させるＢ７ミューライン・モ
ノクロナール坑体の重鎖を生起させる可変ドメインの修正。
Ｂ７の重鎖の可変領域シーケンスが、Ｔ細胞抗原シーケンスに付いて分析され
た。この分析は、コンピュータ・アルゴリズムAMPHIを用いて行われ、シーケン
ス１１アミノ酸のセグメントが長さ方向に両親媒性(amphipatic)の、即ち、一面
で親水性を、他面で親油性を持ち、MHC II 分子に結合することができる、螺旋
構造を伴うことが予見される。
重鎖の可変ドメイン・シーケンスには３このセグメントが予見された。これら
は：（Kabatの数字を用いて）
1.アミノ酸の８−２０の間のFR 1。
2.アミノ酸の２８−５４の間のFR 1，CDR 1，FR2。
3.アミノ酸の８８−１０９の間のFR3，CDR3，FR4。
図１１は、重鎖に関するシーケンスを示している。
このミューライン・シーケンスは、遺伝子バンクとEMBLのデータベースに含ま
れる免疫グロブリン・シーケンスと比較される。最も一致する人間の可変領域シ
ーケンスが決定され、そして、ミューライン・シーケンスが最も近く似ている、
人間のサブグループも定義される。この例では、発見された人間のシーケンスは
、TH9 Kabatのサブグループ１であった。
人間とミューラインの両方の可変領域シーケンスは、レジジュー(residue)毎
に比較され、そして、ベニレ(venire)ゾーンに含まれないか、または正規の構造
を伴なわない、それらのレジジューが選択される。それ故、それらは人間シーケ
ンスの同じ位置にあるそれらのレジジューによって変更可能である。
ミューラインB7の重鎖に対し、１３の置換を提案する：
1.位置９のＰＲＯをＡＬＡによって、
2.位置１１のＬＥＵをＶＡＬによって、
3.位置１２のＶＡＬをＬＹＳによって、
4.位置１６のＴＨＲをＡＬＡによって、
5.位置２０のＩＬＥをＶＡＬによって、
6.位置３７のＭＥＴをＶＡＬによって、
7.位置３８のＧＬＵをＡＲＧによって、
8.位置４０のＳＥＲをＡＬＡによって、
9.位置４１のＨＩＳをＰＲＯによって、
10.位置４３のＬＹＳをＧＬＮによって、
11.位置４４のＳＥＲをＧＬＹによって、
12.位置４８のＩＬＥをＭＥＴによって、
13.位置１０９のＳＥＲをＶＡＬによって。
実施例１０：ＰＣＲ突然変異誘導体(mutagenesis)によるＢ７の突然変異体重鎖
の可変領域の構築。
突然変異体重鎖可変領域のアミノ酸に起こる変化は、ＰＣＲ突然変異誘導体を
使用することで構築できる(Kammann，M．et al．Proc．Nat．Aca．Sci．USA，86
，4220-4224(1989))。
簡単に言えば：ＰＣＲによる２つの増幅である：反応混合物は次の通りである
：Ｍ１３にクローンされたシングル・ストランド(single strand)ＤＢＡのＶＨ
浮遊物(supernatant)0.5ul、25 pmolの突然変異オリゴ１または２、25 pmolの突
然変異オリゴ３または４プライマー（下記のプライマー・シーケンス参照）。
これらの混合物には、それぞれ2.5mMのdATP,dCTP,dTTP,dGTPと、10xのヴェン
ト・ポリメラーゼ・バッファ(NEB)および１ユニットのヴェントＤＮＡポリメラ
ーゼ(NEB)5 ulとが、最終容積が50 ulとなるように、加えられる。サンプルは、
９４０度Ｃで３０分、５００度Ｃで３０分、７５０度Ｃで１分、そして最後に７
５０度Ｃで５分の保温を含む、１２−１５の熱サイクルに適応される。両方のＰ
ＣＲの製造物は、プライマーの外だけ（３と４）を使用して直ちに一緒にされる
。増幅されたＶＨ ＤＮＡはPrep．Aの遺伝子清浄化キット(Bio Rad)で清浄化さ
れた。
使用されたプライマーの位置9,11,12,16,20の変更は：
これらのプライマーは１つのＰＣＲに結合される。
これらのプライマーは１つのＰＣＲに結合される。
それから、両方のＰＣＲ製造物は、３及び４プライマーを用いて１つのＰＣＲ
に結合される。
位置37,38,40,41,43,44,48の変更のために、プライマーは次のように設計され
る：
これらのプライマーは１つのＰＣＲに結合される。
これらのプライマーは１つのＰＣＲに結合される。
それから、両方のＰＣＲ製造物は、３及び４プライマーを用いて１つのＰＣＲ
に結合される。
突然変異ＶＨ遺伝子が記述ベクター(psvgpt)にクローンされた後に、プラスミ
ドB7-mut VH-psvgptが生ずる。
図面の簡単な説明
図１は、異なるモノクロナール坑体について、坑痴呆ハイブリドーマスに強く
結合する認識パターンを示す。
図２は、異なるモノクロナール坑体に対するB7 Mabの結合を示す。
図３は、異なるヒトIgGミエロマ(mieloma)蛋白とヒト静脈内IgGのB7 Mabによ
る認識を示す。
図４は、ヒト・ミエロマ蛋白＃２による異なるミューラインMabの結合を示す
。
図５は、異なるIgGヒト・ミエロマ蛋白による坑痴呆Mabとの強い結合の認識パ
ターンを示す。
図６は、未消化のIgGヒト・ミエロマと、B7 MabによるそれらのFab"2との結合
を示す。
図７は、ヒトIgGミエロマ蛋白に結合したB7 Mabの静脈内ヒトIgGによる競争し
得る拒絶を示す。
図８は、異なる通常のヒト・ドナーに対する周辺ヒト・リンパ細胞のフロー・
シトメトリック(cytometric)分析を示す。
Ａ−異なる通常のヒト・ドナー(50 ug/mlでのB7 Mab)のヒト・リンパ細胞に
対するB7 Mabの結合。
Ｂ−ポジティブ・コントロール(CD3 Mab)。
Ｃ−ネガティブ・コントロール(R3 Mab)。
図９は、CONA，PWM，PHAに対するヒト・リンパ細胞上のB7 Mabの増殖反応の効
果を示す。
Ａ−ヒト・リンパ細胞＋COANとPWN
Ｂ−ヒト・リンパ細胞＋PHA
図１０は、CONA，PHAに対するヒト・リンパ細胞上のヒト静脈内IgGの増殖反応
の効果を示す。
結果は、３回の独立した実験から得られる３重の値の平均cpmとして表現され
る。
Ａ−iv IgG単体＋iv IgGとCONA
Ｂ−iv IgG＋PHA
図１１は、坑体B7の重鎖の可変領域のヒューマナイゼーション(humanization)
による修正の分析を示す。
Ａ：ミューラインB7モノクロナール坑体の可変領域のシーケンス。
Ｂ：最も人に近い免疫グロブリンの可変領域のシーケンス。
Ｃ：B7の修正された可変領域のシーケンス。
網掛け：予測されるＴ細胞の抗原シーケンス
下線を付したアミノ酸レジジュー：第３級構造に含まれるアミノ酸
ボールド・フォント：相補的に決定される領域
ボックス内のアミノ酸レジジュー：推奨される置換
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08
(72)発明者 ペレス ロドリゲス，ローランド
キューバ共和国 10500 ハバナ シウダ
ド 10 デ オクトゥブレ ラ ビボラ
カレ フアン デルガド ナンバー 567
(72)発明者 ロドリゲス オバヤ，テレシタ
キューバ共和国 12300 ハバナ シウダ
ド プラザ デ ラ レボルシオン ベダ
ド エントレ 25 ワイ 27 カレ ６
ナンバー 602
(72)発明者 ラモス ツァモラ，メルセデス
キューバ共和国 12100 ハバナ シウダ
ド プラヤ エントレ ５ティーエー ワ
イ １アールエー カレ 172 ナンバー
シー−２ アパータメント 12
(72)発明者 ボンビーノ ロペス，グメルシンダ
キューバ共和国 12100 ハバナ シウダ
ド プラヤ エントレ ５ティーエー ワ
イ １アールエー カレ 172 ナンバー
シー−２ アパータメント 11
(72)発明者 ペナ マリシャル，オーランド
キューバ共和国 19290 ハバナ シウダ
ド ボエロス，ラパルト １アールオー
デ マヨ，カレ ４ティーエー ノルテ
ナンバー 34918−20 アパータメント
14