JPH11507016A

JPH11507016A - 貯蔵安定性ヘモグロビン溶液

Info

Publication number: JPH11507016A
Application number: JP8533458A
Authority: JP
Inventors: エイ．カーウィン，ブルース; エル．ルッカー，ダグラス
Original assignee: ソマトジェン，インコーポレイテッド
Priority date: 1995-05-02
Filing date: 1996-05-01
Publication date: 1999-06-22
Also published as: DE69614105T2; WO1996034889A1; CA2216382A1; AU708264B2; EP0826004B1; DE69614105D1; US5929031A; EP0826004A1; AU5852096A; ATE203546T1

Abstract

(57)【要約】本発明は、部分的に脱酸素化されたヘモグロビンおよび驚くほど少量の還元剤を含む貯蔵安定性ヘモグロビン溶液に関する。このような貯蔵安定性ヘモグロビン溶液を調製する方法もまた、この溶液を貯蔵するためのシステムと同様に提供される。

Description

【発明の詳細な説明】貯蔵安定性ヘモグロビン溶液発明の分野本発明は、貯蔵安定性ヘモグロビン溶液、そしてより詳細には、部分的に脱酸素化されたヘモグロビンおよび還元剤を含む溶液に関する。発明の背景赤血球の酸素運搬部分はヘモグロビンであり、これは２つの同一のαグロビン（α₁、α₂）、２つの同一のβグロビン（β₁、β₂）、および４つのヘム分子から構成されるテトラマーのタンパク質分子である。ヘム分子は、αおよびβグロビンのそれぞれに取り込まれてαおよびβサブユニットを得る。ヘムは、その中心に鉄原子を含む巨大環状有機分子である；各ヘムは１つのリガンド分子、例えば酸素と可逆的に結合し得る。ヘモグロビンテトラマーにおいて、各αサブユニットは、１つのβサブユニットと会合されて、２つの安定なα／βダイマーを形成し、これは順に会合してテトラマー（ホモダイマー）を形成する。サブユニットは、ファンデルワールス力、水素結合、および塩橋梁（salt bridge）により非共有的に会合される。配位されていない（脱酸素化されたまたは「デオキシ」）状態において、４つのサブユニットは、「Ｔ」（「緊張した（tense）」）状態として知られる四次構造を形成する。リガンド結合の間、α₁β₁およびα₂β₂の界面は比較的固定されたまま残るが、α₁β₂およびα₂β₁の界面はかなりの動きを示す。リガンドがヘモグロビン分子に結合される場合、グロビンは互いに関して動き、そして結果としてサブユニット間の距離は脱酸素化された距離に対して増加する。したがって、リガンドがヘム基で結合される場合、分子は、リガンドが３またはそれより多くのヘムで結合される場合、分子の熱動力学的に安定な形態である「弛緩した（relaxed）」または「Ｒ」四次構造と仮定される。リガンド、特に酸素は、ヘム中で還元された形態の鉄（第一鉄、Fe⁺²）に可逆的に結合する。ヘム中の鉄がFe⁺³（第二鉄形態の鉄）に酸化されるとき、酸素およびいくつかの他のリガンドはヘムの鉄に結合し得ず、そしてヘモグロビンは酸素運搬に関して機能的でない。ヘム基中の鉄は多くの様式で酸化され得る。例えば、鉄は、ヘム鉄における水分子の結合を介する経路により酸化されてメトヘモグロビンを産生し得る（「自動酸化」）。自動酸化は、溶液中の微量の金属の存在により増強され得る。メトヘモグロビンはまた、フェリシアニドのようなより高い酸化還元電位を有する化学薬品による直接的酸化の結果として、あるいは過酸化水素が媒介する経路を介する還元剤による間接的酸化により産生され得る（ Castro，C.E.ら、Biochemical and Clinical Aspects of Hemoglobin Abnormali ties ，Academic Press，Inc.，495-503頁，1978）。さらに、デオキシヘモグロビンは、酸素の非存在下においてもフェリシアニドのような化学薬品によりメトヘモグロビンに酸化され得る。タンパク質自体は、ヘム基中の鉄の付随する酸化なしに、同様に酸化され得る。例えば、ヘモグロビンは、メトヘモグロビン中間体を経ることなくヒドラジンのような化学薬品により酸化的に変性され得る。（総説については、Bunn，H.F.およびForget，B.G．Hemoglobin: Molecular ，Gene tic and Clinical Aspects ，W.B．Saunders Company，Philadelphia，634-662頁を参照のこと）。しかし、産生されたメトヘモグロビンは、酸素または一酸化炭素を結合し得ず、そして著しく変更された酸化窒素結合特徴を示す、非機能的形態のヘモグロビンである。メトヘモグロビン分子は、ヘミクローム形成、ヘム喪失、沈殿、毒性ラジカルを形成するための過酸化水素との反応などのため、加速された分解を受けやすい。メトヘモグロビンの形成によるヘモグロビン溶液の機能性の低減に加えて、ヘモグロビン分子のタンパク質部分は、酸化的傷害により改変および変更され得る。例えば、ヘムの鉄の酸化は、過酸化水素（Watkins，J.A．Bioc ．Biophys．Res .Comm. 132: 742-748，1985）および過酸化物（Thillet，J.およびMichelson，A . M.，Free Rad ．Res．Comm. 1: 89-100，1985）の産生を生じる。次いで、これらの活性化酸素種は、例えば分子の重合を引き起こすことによるか（Thillet，J . 前出）、または個々のアミノ酸に傷害を与え、それにより三次構造を破壊することにより（Stefek，R.P．およびThomas，M.J.，Free Rad ．Res．Comms. 12-13 : 489-497，1991）、ヘモグロビンタンパク質に傷害を与え得る。これらの変化は増加した免疫原性を生じ得る（Riechlin，M.，Adv ．Immunol．20: 71-132，19 75；Noble，R.W.ら、Bioc. 11:3326-3332，1972）。最終的に、起源に関係なく、活性化酸素腫から生じる傷害は、分子の酸化的変性およびその沈殿を導き得る。したがって、ヘモグロビン溶液の貯蔵中、タンパク質自体またはタンパク質中のヘム基のいずれにしても酸化を回避することは、溶液中のヘモグロビンの機能性ならびに三次および四次構造を維持するために、ならびに免疫原性を制限するために必要である。酸化された条件よりも脱酸素化された条件下で貯蔵された場合、ヘモグロビン溶液がよりゆっくりとメトヘモグロビンを形成することが長く知られていた（An tonlniおよびBrunori、Hemoglobin and Myoglobin in Their Reactions with Li gands ，North Holland PUblishing Company，Amsterdam 13-39，1971；Di Iorio , E.E.，Meth ．Enzymol. 76: 57-72，1981）。しかし、脱酸素化された条件下でのヘモグロビンの保存は、著しい技術的困難性を有するか（Di Iorio，E.E.，Me th ．Enzymol. 76: 57-72，1981）、または潜在的な毒性化学薬品の添加を必要とする。さらに、外来の化学薬剤の選択は非常に困難であった。なぜなら、これらの添加物は、溶液の状態および予測し得ないタンパク質／薬剤相互作用に依存して、酸化剤または還元剤として作用し得るからである（Akers，M.J．J ．Parent. Sci．Tech. 36: 222-228，1982）。ヘモグロビン溶液の場合、還元剤として作用する外来化学薬剤の選択は、すべての還元剤がヘモグロビンを還元し得るわけではないという事実、およびいくつかの還元剤が所定のヘモグロビン処方物において酸化剤として作用し得るという事実により、さらに複雑になる（Eyer，P.,M ol ．Pharmacol. 11: 326-334，1975；Kikugawa，K．Chem ．Pharm．Bulletin 29: 1382-1389，1981；Stratton，L.P．Hemoglobin 12: 353-368，1988）。外来の化学薬品が溶液中でメトヘモグロビンの形成を減少するように作用する場合、タンパク質の構造に影響を及ぼし得る予期し得ない副反応があり得る（AntoniniおよびBrunori、Hemoglobin and Myoglobin in Their Reactions with Ligands, N orth Holland Publishing Company，Amsterdam 13-39，1971）。貯蔵中の外来の還元剤の必要性を低減または排除するために、Nho（PCT公開公報 WO 92/08478）は、ヘモグロビン溶液の迅速な脱酸素化を可能にする装置を設計した。ヘモグロビン溶液は、溶液を気体交換デバイスの一方に通し、そして不活性ガスである窒素を他方の気体透過性膜に通すことによって脱酸素化された。ヘモグロビンは、少なくとも90％脱酸素化されるまで循環された。外来の還元剤はヘモグロビン溶液に添加されなかった；酸化は、完全には排除されなかったが、ヘモグロビン溶液中の酸素の注意深い除去により遅延された。このように、薬学的処方物で用いられる場合に不測の生物学的応答を誘起し得るかまたは予測し得ない様式でヘモグロビン自体と反応し得る化学還元剤の導入はなかった。ヘモグロビン溶液の貯蔵への異なるアプローチは、Kandler，R．L.およびJ.C. Spicuzza（米国特許第5,352,773号およびPCT公開公報 WO 92/02239）により記載された。彼らは、精製ジアスピリン架橋ヘモグロビン溶液の、外来の化学還元剤の全くの非存在下で「自動還元」する本来の能力を利用した。この溶液において、メトヘモグロビン濃度は、過剰包装された酸素不透過性容器に溶液を貯蔵することにより低下された。これらの過剰包装された容器のいくつかは、過剰包装と内部の容器との間に位置する酸素捕捉袋を含んでいた。50％の高いメトヘモグロビン濃度は、酸素が溶液の貯蔵の間に容器から厳密に排除される限り、単独での貯蔵により1.5％の低いレベルに低下され得た。この方法論は、最初の溶液が貯蔵前に脱酸素化されているかどうかに依存しなかった。しかし、たとえこの方法論が外来の還元剤の添加を必要としなくても、材料は、メトヘモグロビンが臨床的に受容可能なレベルに減少されることを確実にするために長期間保持され、および／または比較的高い温度で保持された。延長された貯蔵または上昇した温度での貯蔵は、不十分に滅菌された場合、ヘモグロビン構造の改変または微生物の増殖を生じ得る。ヘモグロビン溶液の脱酸素化のみでは、長期の貯蔵、特に室温での貯蔵を可能にするためにヘモグロビン溶液に十分な安定性を提供し得ない。例えば、DeVenu to（DeVenuto，F.，J ．Lab．Clin．Med. 92: 946-952，1978）は、脱酸素化されたヘモグロビン溶液が酸素の存在下で貯蔵された比較溶液よりも迅速なメトヘモグロビン形成を示すことを見いだした。さらに、彼は、室温で安定性を示す溶液を何ら証明し得なかった。アスコルベート（アスコルビン酸またはビタミンＣ）は、薬学的組成物中でおよびヘモグロビン組成物中で酸素を捕捉するか、または抗酸化剤として作用するための試薬としての両方で通常用いられてきた。製剤として、アスコルベートは、インビボでメトヘモグロビン血症を処置するために直接投与されている（Kies e, M．Methemoglobinemia: A Comprehensive Treatise，CRC Press，Inc.，Clea veland，Ohio，23頁，1974；Deeny，J.ら、Br ．Med．J. 1:721-723，1943）。アスコルベートは、多くのタンパク質溶液中（特に血液産物に由来するタンパク質中）で、保存剤および安定化剤として使用されている。例えば、G.P．Wiesehahn ら（米国特許第4,727,027号）は、血液または血液成分（特に第VIII因子）由来の生物学的に活性なタンパク質の溶液の光汚染除去による汚染除去を記載している。彼らは、高濃度の酸素スカベンジャー（例えば10mMアスコルベート）の添加によるか、不活性ガスを流すことによるか、あるいは酸素スカベンジャーの添加および不活性ガスを流すことの両方によるかのいずれかによる溶液の脱酸素化に開公報 WO 94/26286）もまた、グルタチオン、アセチルシステイン、メチオニン、トコフェロール、ブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、またはフェノール性化合物のような抗酸化剤で増大される第VIII因子の安定化され脱酸素化された処方物を記載している。これらの抗酸化剤は、低用量での使用に適しており、したがって低投与容量の第VIII因子に適切であるが、これらの抗酸化剤の多くは高用量で毒性であり得、したがって高容量の治療剤（例えばヘモグロビン）が投与され得る処方物における使用は適切でない。さらに、上記の出願 rらが、第VIII因子の脱酸素化溶液へのアスコルベートの添加が還元された第VII I因子の安定性を生じることを報告していることに注意すること。 1940年代のような初期には、高濃度のアスコルベートはヘモグロビン組成物中でメトヘモグロビンを還元するために使用された（Gibson，Q.H.，Bioc ．J. 37: 615-618，1943）。しかし、アスコルベートとヘモグロビンとの相互作用は予測し得なかった。例えば、Kikugawaら（Kikugawa，K.ら、Chem ．Pharm．Bull. 29: 1382-1389，1981）は、アスコルベートが、ヘモグロビンの酸化された処方物に添加されるとき、実際に酸化を増強する酸化促進物として作用することに注目し rattonら、前出は、ヘモグロビン溶液へのアスコルベートの添加もまた、酸化からの保護よりも増強された酸化を生じることを示唆した。比較的高濃度のアスコルベートは、脱酸素化されたヘモグロビン溶液を安定化するためのいくつかの成功とともに使用されている。例えば、Bonhardら（米国特許第4,777,244号）は、脱酸素化されたヘモグロビンを架橋する前にヘモグロビン溶液中で酸素スカベンジャーとしてアスコルベートを使用した。彼らは、すべての酸素がヘモグロビン溶液中で捕捉されることを確実にするために、高レベルのアスコルベート（１モルのヘモグロビン当たり少なくとも４モルのアスコルビン酸）を使用する必要性を強調した。Kotheら（Kothe，N.，Eichentopf，B.およびBonhard，K．Surg ．Gyn．Obst. 161: 563-569 1985）はまた、脱酸素化されたヘモグロビン溶液を安定化するためにアスコルベートを使用した。これらの著者らは、8.5 gm/dl ヘモグロビン溶液中5.45 mM アスコルベートを使用し（１モルのヘモグロビン当たり約４モルのアスコルベート）、そして４℃で１年間の貯蔵の後、ヘモグロビン処方物中に顕著なメトヘモグロビンの形成を報告しなかっ 11,1987）は、４℃にて11カ月間の貯蔵の間、Kothe溶液（4:1モル比のアスコルベート対ヘモグロビン）に基づく処方物中で同様の低レベルのメトヘモグロビン形成を報告した。Kikugawaら、前出は、５mM アスコルベートで処理した希釈（2 50 mg/dl）脱酸素化されたヘモグロビン溶液（約13:1モル比のアスコルベート対ヘモグロビン）がこの研究で60分間安定であったことを報告した。脱酸素化されたアスコルベート含有溶液の長期安定性は、これらの著者らにより議論されていなかった。Nhoら（来国特許第5,234,903号）は、5-6 gm/dlの脱酸素化されたウシヘモグロビン溶液におけるメトヘモグロビン形成を追求し、そして30 mMシステインが同量のアスコルベート（約35:1モル比のアスコルベート：ヘモグロビン）よりもメトヘモグロビン形成の防止に５倍有効であることを見いだした。さらに、アスコルベートのそのヘモグロビン処方物への添加は、遊離鉄の著しい放出を生じた。実際、Estepは、ヘモグロビン溶液に添加される還元剤が脱酸素化された条件下でこれらの溶液を維持するためにアスコルベートよりも高い酸化還元電位を有さなければならないことを論じた；アスコルベートはヘモグロビン溶液の脱酸素化を維持するために単に十分に還元しているのではない（Estep，T.N . 米国特許第4,861,867号）。抗酸化剤または酸素スカベンジャーとしてアスコルベートを使用したすべての組成物が、少なくとも4:1モル比のアスコルベート対ヘモグロビンを使用したことに留意すること。室温での既知のヘモグロビン処方物の貯蔵は、問題があることが示されている（Keipert，P.E.およびChang，T.M.S.，Biomat. ，Art．Cells，Art．Org.，16:1 85-196，1988：Christensen，S.M.ら、J ．Bioc．Biophys．Meth. 17: 143-154， 1988；Moore，G.L.ら、Artif ．Organs 16: 513-518，1992）。しかし、最近、Ka ndlerおよびSpicussa（PCT公開公報 WO 92/02239）ならびにNho（PCT公開公報 W O 92/08478）もまた、10カ月までの期間室温にて外来の化学還元剤の添加なしに脱酸素化された条件下で貯蔵されたヘモグロビン溶液中で、遅いメトヘモグロビン形成またはメトヘモグロビン形成がないことを証明し得た。本発明は、ヘモグロビンが、顕著な量のメトヘモグロビンが出現する前でさえも、生理学的関連を有し得る著しい改変を受けるという、驚くべき所見に基づく。さらに、ヘモグロビン処方物中の酸素の量とヘモグロビンを安定化するために必要なアスコルベートの量との間に関係があることが発見されている。さらに、ヘモグロビン、還元剤、および酸素の一定の割合が貯蔵の間のヘモグロビンの安定性を改善することが、驚くべきことに発見されている。発明の要旨本発明は、部分的に脱酸素化されたヘモグロビン溶液ならびにヘモグロビン１モル当たり４モルより少ない還元剤、好ましくはヘモグロビン１モル当たり３モルより少ない還元剤、そしてより好ましくはヘモグロビン１モル当たり２モルより少ない還元剤を含む、貯蔵安定性ヘモグロビン組成物に関する。還元剤は、ジチオナイト、水素化ホウ素ナトリウム、およびアスコルベートからなる群より選択され、そして最も好ましくはアスコルベートである。部分的に脱酸素化されたヘモグロビン溶液は、100万当たり5000部より少ない酸素、より好ましくは100万当たり500部より少ない酸素、最も好ましくは100万当たり150部より少ない酸素を含む。本発明の貯蔵安定性ヘモグロビン組成物は、少なくとも３カ月、より好ましくは少なくとも６カ月、最も好ましくは少なくとも１年間貯蔵安定性である。本発明の組成物は、意図された使用および所望の貯蔵条件に依存して、約40℃より低い温度で、より好ましくは約25℃より低くあるいは約４℃またはそれ以下で貯蔵され得る。さらに、本発明は、約6.5と9.5との間のpHで、好ましくはpH 6.6〜7. 8で、最も好ましくはpH 6.8〜7.6で、部分的に脱酸素化されたヘモグロビン、ヘモグロビン１モル当たり４モルよりも少ない還元剤、薬学的に受容可能なキャリア、およびキレート化剤を含む処方物を提供する。好ましくは、キレート化剤は EDTAまたはDTPAであり、より好ましくはキレート化剤はEDTAである。本発明は、還元剤と部分的に脱酸素化されたヘモグロビン溶液とを、ヘモグロビン１モル当たり４モルより少ない還元剤の割合で組み合わせる工程を包含する、本発明の貯蔵安定性ヘモグロビン組成物の調製方法を提供する。ヘモグロビン溶液の部分的脱酸素化の方法は、気体-液体接触方法を包含する。さらに、本発明は、ヘモグロビン溶液の貯蔵のためのシステムを提供する。このシステムは、適切な容器中の本発明の貯蔵安定性ヘモグロビン組成物を含む。図面の簡単な説明図１は、ｙ軸にβ/ジ-α比およびｘ軸にアスコルベート濃度（mM）のグラフである。β/ジ-α比を、逆相HPLCクロマトグラムから決定した。試料を、150ppm酸素（-○-）、1000ppm酸素（-●-）、5000ppm酸素（-■-）、および15000ppm酸素（-▲-）での貯蔵後21日目に分析した。β/ジ-α比のより低い値は、改変された βグロビンのより多い量を示す。発明の詳細な説明本発明は、部分的に脱酸素化され、そしてヘモグロビン１モル当たり４モルよりも少ない還元剤を含む貯蔵安定性ヘモグロビン溶液、およびこのような貯蔵安定性ヘモグロビン溶液を製造する方法に関する。ヘモグロビンは、溶液中に、あるいは天然に存在するかまたは人工的な細胞（例えば、リポソーム）内の溶液中で遊離であり得、そして天然、合成、または組換え起源に由来し得る。例えば、屠殺場では非常に大量のヘモグロビン含有血液が生じる。特定の使用に特に適切なヘモグロビンを産生する特定の種または品種の動物は、ヘモグロビンを供給するために特別に飼育され得る。非内因性ヘモグロビンを発現するトランスジェニック動物が産生され得る（Logan，J.S.ら、PCT 出願 PCT/US92/05000）。ヒトヘモグロビンは、一定の期限の後に廃棄されなければならない古くなったヒト血液から収集され得る。動物起源からの抽出の他に、所望の天然に存在するまたは変異体ヘモグロビンのサブユニットをコードする遺伝子がクローニングされ、適切な発現ベクターに入れ、そして、生物（例えば、微生物、動物、または植物）中あるいは培養された動物もしくは植物の細胞または組織中に挿入され得る。これらの生物は標準的な組換えDNA技法を使用して産生され得、次いでこれらの生物により産生されたヘモグロビンは、例えば、Hoffman，S.J.およびNagai，K．米国特許第5,028,588 号、およびHoffmanら、WO 90/13645（これらは両方とも参考として本明細書に援用される）に記載のように発現されて収集され得る。任意の起源からのヘモグロビンの精製は、当該分野で公知の精製技法を使用して完了され得る。例えば、ヘモグロビンは、赤血球の溶血、次いでクロマトグラフィー（Bonhard，K.ら、米国特許第4,439,357号；Tayot，J.L.ら、欧州特許公開公報第0 132 178号；Hsia，J.C.、欧州特許公開公報第0 231 236 B1号）、濾過（Rabiner，S.F．(1967)ら、J ．Exp．Med. 126: 1127-1142；Kothe，N.および Eichentopf，B．米国特許第4,562,715号）、加熱（Estep，T.N.、PCT公開公報 P CT/US89/014890、Estep，T.N.、米国特許第4,861,867号）、沈殿（Simmonds，R. SおよびOwen，W.P.、米国特許第4,401,652号；Tye，R.W.、米国特許第4,473,494 号）、またはこれらの技法の組み合わせ（Rausch，C.W.およびFeola，M.、EP 02 77 289 B1）により、古くなったヒト赤血球から単離されて精製され得る。トランスジェニック動物中で産生された組換えヘモグロビンは、クロマトフォーカシング（Townes，T.M.およびMcCune、PCT公開公報 PCT/US/09624）により精製されており、一方、酵母および細菌で産生された組換えヘモグロビンは、イオン交換クロマトグラフィー（Hoffman，S.J.およびNagai，K.、米国特許第5,028,588号、およびHoffmanら、WO 90/13645）により精製されている。ヘモグロビンは、精製前、精製中、または精製後のいずれかに特定の使用のために遺伝学的または化学的手段により改変され得る。例えば、酸素親和性は、化学的改変により、あるいは適切な変異の導入によるヘモグロビンの遺伝学的改変により変更され得る。ヘモグロビンは、化学的に架橋され得、または遺伝学的に連結され得、または化学的架橋および遺伝学的連結の両方で連結され得、α/β サブユニット（ダイマー化）への分子の解離を防止し、ヘムの損失を防止し、あるいは分子のサイズを増大させる。ヘモグロビン溶液は、当該分野で公知の任意の手段により部分的に脱酸素化され得る。窒素またはアルゴンのような不活性ガスでのヘモグロビン溶液の処理は、１つのこのようなアプローチである。これは、気体−液体接触技法を使用して完了され得、ここで、酸素は溶液から非酸素気体相へ輸送される。気体−液体接触のためのいくつかの選択が以下に挙げられる：パックされたカラム、この中では、非酸素気体は上方へ通り抜け、一方、溶液はパッキングのベッドを通って下方へ流れ落ちる；プレートカラム、溶液を捕獲する一連の水平プレートを含むこと以外は、パックされたカラムと同様；湿潤壁カラム、この中で、溶液は鉛直チューブの傾斜の下へフィルムとして流れ落ちる；気体移送膜、ここで酸素は、一方の側に液体を、そして他方の側に非酸素気体を保持する薄い膜を通して輸送される；気体散布タンク、この中で、非酸素気体は溶液を含むタンクを通って泡立たせる；循環気圧増大法、ここで、溶液を含む容器は、非酸素気体で循環により加圧され、次いで出口を開けて、気体を放出し、そして溶液中で泡の形成を誘導する；および、液体噴霧、ここで、溶液は非酸素気体を含むチャンバー中にスプレーされる。脱酸素化への他のアプローチは、液体−液体接触技法であり、ここでは、２つの混和し得ない液体が一緒に混合されており、その一方は溶解した酸素を含んでいないが酸素はその中に容易に溶解する。第２の液体が酸素を吸着した後、液体は重力によりまたは遠心分離で分離され得る。脱酸素化への第３のアプローチは吸着であり、ここでは、溶解した酸素を吸着する大きな内部表面領域を有する固体粒子（例えば、モレキュラーシーブ）が溶液に添加される。吸着後、固体粒子は遠心分離または濾過により溶液から分離され得る。これらの技法の中で特に有用な技法はパックされたカラムの使用であり、ここで、溶液は、酸化されたヘモグロビン溶液をカラムに流すことにより脱酸素化され、一方不活性ガスの流れはヘモグロビン溶液の流れに逆流する。不活性ガスは、ヘモグロビン分子のヘム基に結合しない任意の気体、例えば、アルゴンまたは窒素である。別の実施態様では、所望の残存酸素濃度が得られて部分的に脱酸素化されたヘモグロビン溶液を生じるまで、溶液は、繰り返して、ヘモグロビン溶液を排気すること、そしてアルゴンまたは窒素のような不活性ガスでヘモグロビン処方物を洗浄または押し流すことにより脱酸素化される。部分的に脱酸素化されたヘモグロビン溶液は、上部空間（headspace）の100万当たり（ppm）約5,000部よりも少ない酸素容量を含むヘモグロビン溶液である。ヘモグロビン溶液中の残存酸素は、好ましくは約1000ppmより少なく、より好ましくは約500ppmより少なく、そしてさらにより好ましくは約150ppmより少ない。上部空間の残存酸素は、当該分野で公知の任意の手段によって測定され得、この手段には、例えば、上部空間のサンプリング、および適切に装着されたガスクロマトグラフまたはジルコニウムに基づく検出器を用いる上部空間の酸素の測定が含まれる。例えば、残存酸素濃度は、「MOCON」（Mocon、Minneapolis、MN）分析機を使用する充填環境のサンプリングにより測定され得る。充填環境は、ヘモグロビンが、例えば実施例２に記載のように、貯蔵のために調製される環境である。充填環境には、グローブバッグ、グローブボックス、または残存酸素レベルが制御される任意の適切な環境が挙げられるが、これらに限定されない。ヘモグロビン処方物の上の上部空間は、充填環境と平衡であると考えられる。容器内に上部空間がない場合は、溶液は充填環境と直接的に平衡であると考えられる。充填前に排気された容器中に溶液を入れる場合、ヘモグロビンは接触した最後の気体と平衡であると考えられる。部分的に脱酸素化されたヘモグロビンに加えて、本発明の溶液はまた還元剤を含む。このような還元剤には、ジチオナイト、第一鉄塩（例えば、ピロリン酸第一鉄）、水素化ホウ素ナトリウムならびに他の水素化ホウ素、αトコフェロール、およびアスコルビン酸またはその塩が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のヘモグロビン溶液が製剤である場合、還元剤は好ましくは薬学的に受容可能な還元剤である。本発明のヘモグロビン溶液が非薬学的適用に使用される場合、還元剤は、薬学的に受容可能かまたはそうでないあらゆる還元剤であり得る。好ましくは、還元剤はアスコルビン酸ナトリウムである。還元剤は、部分的脱酸素化の前または後に添加され得る。好ましくは、還元剤は、標的の残存酸素レベルがヘモグロビン処方物中で達成された後に添加される。還元剤は液体または固体形態であり得るが、還元剤は、徹底的に脱酸素化され濃縮された液体溶液中にある場合に、特に有用である。本発明の組成物中の還元剤の量は、４モル／１モルのヘモグロビンより少なく、より好ましくは２モルの還元剤／１モルのヘモグロビンより少ない。処方物は、部分的に脱酸素化されたヘモグロビン溶液および１つ以上の還元剤に加えて、他の成分を含み得る。本発明のヘモグロビン溶液は、薬学的または非薬学的使用に適切な任意の組成物中に処方され得る。例えば、非経口治療用組成物は、0.001％と90％(w/v)との間のヘモグロビンを含む滅菌等張生理食塩溶液を含み得る。適切な組成物はまた、０〜200Mの１つまたはそれより多くの緩衝剤（例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、重炭酸緩衝液、またはGo od's緩衝液）を含み得る。塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウムのような塩類もまた、本発明の組成物中に０〜２Mの濃度で含まれ得る。さらに、本発明の組成物は、０〜２Mの１つまたはそれより多くの炭水化物（例えば、グルコース、マルトース、ラクトースのような還元炭水化物、あるいは、スクロース、トレハロース、ラフィノース、マンニトール、イソスクロース、またはスタキオースのような非還元炭水化物）、および０〜２Mの１つまたはそれより多くのアルコールまたはポリアルコール（ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、デキストラン、またはポリオールなど）を含み得る。本発明の組成物はまた、0.005〜１％の１つまたはそれより多くの界面活性剤および０〜200μMの１つまたはそれより多くのキレート化剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、エチレングリコール-ビス（β-アミノエチルエーテル）N,N,N',N'-四酢酸（EGTA）、ｏ-フェナンスロリン、ジエチルアミントリアミン五酢酸（五酢酸としても知られるDTPA）など）を含み得る。本発明の組成物はまた約pH6.5〜9.5であり得る。別の実施態様では、組成物は０〜300mMの１つまたはそれより多くの塩類（例えば、塩化物塩）、０〜100mMの１つまたはそれより多くの非還元糖、０〜100mM の１つまたはそれより多くの緩衝剤、0.01〜0.5％の１つまたはそれより多くの界面活性剤、および０〜150μMの１つまたはそれより多くのキレート化剤を含む。なおさらなる実施態様では、組成物は、０〜150mM NaCl、０〜10mM リン酸ナトリウム、および0.01〜0.1％界面活性剤、および０〜50μMの１つまたはそれより多くのキレート化剤、pH 6.6〜7.8を含む。最も好ましくは、ヘモグロビン含有組成物は、５mM リン酸ナトリウム、150mM NaCl，0.025％〜0.08％ポリソルベート80、および25μM EDTA、pH6.8〜7.6を含む。処方物への追加の添加物は、抗菌剤、膠質浸透圧剤（例えば、アルブミンまたはポリエチレングリコール）、ならびに当該分野で公知の他の処方物に受容可能な塩類、糖類、および賦形剤を含み得る。本発明に従った各処方物は、キャリア、希釈剤、充填剤、塩類、および当該分野で周知の他の物質を含む構成成分をさらに含み得、その選択は、達成されるべき特定の目的および当業者により容易に決定され得るこのような添加物の特性に依存する。本発明の組成物は、当該分野で公知の任意の方法により処方され得る。このような処方の方法には、例えば、単純混合、連続添加、乳化、ダイアフィルトレーションなどが挙げられる。本発明の薬学的組成物は、例えば、皮下、静脈内、または筋肉内注入、局所または経口投与、血液代用物として有用な大容量非経口溶液などに有用であり得る。本発明の薬学的組成物は、経口またはエアロゾル投与による、経皮または粘膜吸収による、または注射によるような、任意の従来の手段により投与され得る。本発明の非薬学的組成物は、例えば、参照標準、試薬溶液などを必要とする分析測定機器、細胞培養物の気体含量のコントロール（例えば、細胞培養物への酸素のインビトロ送達による）、および溶液からの酸素の除去のための参照標準として使用され得る。１つの実施態様では、組成物は治療適用における使用のために処方され得る。例えば、本発明の処方物は、赤血球が使用されるあらゆる適用において赤血球の代用物として有用な組成物中に使用され得る。赤血球代用物として処方される本発明のこのような組成物は、血液量が損失し、そして流体量および酸素運搬能力の両方が取り替えられなければならない出血の処置に使用され得る。さらに、本発明の組成物が薬学的に受容可能に製造され得るので、本発明の処方物は酸素を送達する血液代用物としてだけでなく、大きなヘモグロビンタンパク質分子の存在による膠質浸透圧を提供する単純容量増量剤としても使用され得る。血液代用物としてのヘモグロビンの代表的用量は、患者の体重１キログラム当たり10mg〜５gまたはそれより多い細胞外ヘモグロビンである。したがって、ヒト患者に対するの代表的用量は、２、３グラム〜350グラム以上であり得る。各投与形態の個々の用量中に含まれる有効成分の単位含量が本来有効量を構成する必要はないことが理解される。なぜなら、必要な有効量は、注入などとしての複数の投与により達成され得るからである。投与量の選択は、利用される投与形態、処置される状態、当業者の決定に従って達成されるべき特定の目的に依存する。細胞外ヘモグロビンの投与は、ヘモグロビンの用途の目的に依存して、数秒から数時間までの期間に起こり得る。例えば、血液送達ベヒクルとしては、通常の投与の時間経過はできるだけ迅速である。血液置換物としてのヘモグロビン溶液の代表的な注入速度は、約100ml〜3000ml/時間であり得る。しかし、造血を刺激するために使用される場合、投与はほんの数秒〜５分のみ持続し得、したがって、ヘモグロビンの投与量は出血を処置するために必要とされ得る投与量よりもずっと少ないので、投与速度はよりゆっくりであり得る。さらなる実施態様では、本発明の処方物は、貧血にかかっている患者に追加の酸素運搬能力を提供すること、ならびに造血を刺激することの両方により、貧血を処置するために用いられ得る。さらに、血管系中のヘモグロビンの分布は赤血球のサイズによって限定されないので、本発明のヘモグロビンは、赤血球が浸透し得ない領域に酸素を送達するために使用され得る。これらの領域には、赤血球の流れの閉鎖の下流に位置するあらゆる組織の領域、例えば、血栓、鎌状赤血球閉塞、動脈閉塞、血管形成術のバルーン、外科的機器使用の下流の領域、あるいは、酸素窮乏にかかっているかまたは低酸素圧である任意の組織などが含まれ得、る。さらに、あらゆるタイプの組織虚血が、本発明の架橋されたヘモグロビンを使用して処置され得る。このような組織虚血には、例えば、発作、突発性の発作、一過性虚血性発作、心筋性気絶および冬眠、急性または不安定性アンギナ、突発性のアンギナ、梗塞などが挙げられる。体内での広い分布のため、本発明のヘモグロビンはまた、薬物を送達するためにそしてインビボ画像化用に使用され得る。本発明の組成物はまた、外科的手順の間に取り出される血液の置換物として使用され得る。ここで、患者の血液は取り出されそして手術の最後または回復（急性の正常血液量の血液希釈または血液増量）の間での再注入のために蓄えられる。本発明のヘモグロビンは酸化窒素および他の非酸素リガンドならびに酸素を結合し得るので、本発明の処方物はまた、酸化窒素または非酸素リガンドの結合あるいは送達に有用である。これらの非酸素リガンドは、インビボまたはインビトロの両方で結合または送達され得る。例えば、本発明のヘモグロビンは、生体系から過剰の酸化窒素を除去するために使用され得る。過剰の酸化窒素は、低血圧から敗血症性ショックまでの範囲の症状に関与している。これらの場合では、本発明のヘモグロビンは過剰の酸化窒素を除去するために、あるいは毒性過剰で見いだされそしてヘモグロビンに結合され得る任意の他のリガンドを除去するために使用され得る。同様に、酸化窒素または他の非酸素リガンドは、病気の症状を緩和するためのシステムに送達され得る。例えば、酸化窒素は、高血圧の処置のために血管系に送達され得る。本発明の他の治療的使用には、薬物送達およびインビボ画像化が挙げられ得る。本発明の組成物はまた、多くのインビトロ適用に使用され得る。例えば、本発明の組成物による酸素の送達は、インビトロで酸素レベルを維持することによる細胞培養物中での細胞増殖の増強に使用され得る。さらに、本発明のヘモグロビンは、酸素の除去を必要とする溶液から酸素を除去するために、ならびに分析アッセイおよび測定機器用の参照標準として、使用され得る。本発明の組成物は、12カ月またはそれ以上の期間、40℃よりも低い温度で貯蔵され得る。好ましくは、本発明のヘモグロビンは、12カ月またはそれ以上の期間、 25℃で貯蔵され得る。さらに好ましくは、溶液は少なくとも６カ月の期間25℃で貯蔵され得、最も好ましくは、本発明の溶液は、少なくとも３カ月間25℃で貯蔵され得る。別の実施態様では、本発明の溶液は、少なくとも６カ月、より好ましくは12カ月間４℃で貯蔵され得る。さらなる実施態様では、本発明の溶液は、少なくとも３カ月間４℃よりも低い温度で貯蔵され得る。本発明のヘモグロビン溶液は、酸素不透過性容器中に貯蔵され得る。例えば、ステンレススチールタンク、酸素不透過性プラスチックバッグ、または低酸素透過性プラスチックバッグで覆われたプラスチックバッグ（ここでは、酸素スカベンジャーが内部プラスチックバッグと覆ったプラスチックバッグとの間に入れられる）である。別の実施態様では、貯蔵安定性ヘモグロビン溶液は、酸素が制御された環境で、酸素透過性または酸素不透過性の容器に貯蔵され得る。このような酸素が制御された環境には、例えば、グローブボックス、グローブバッグ、インキュベーターなどが挙げられ得る。好ましくは、酸素が制御された環境の酸素含量は、大気中の酸素濃度よりも低い。本発明のヘモグロビン溶液の安定性は、当該分野で受け入れられる任意の手段により決定され得る。一般的に、安定性は、ヘモグロビンの分解、例えば、酸化、タンパク質分解、または脱アミド化産物の形成、分子量分布の変化、有効性の変化、機能性の変化、凝集物のような不溶性物の増加、または非酵素的グリケーションのような賦形剤の存在による産物の修飾の測定によって決定され得る。さらに、安定性は、無菌性の喪失または例えば、揮発、吸着、化学的修飾などによる濃度の変化として決定され得る。好ましくは、ヘモグロビン溶液の安定性は、機能性の測定、酸化産物の測定、分子量分布の変化、および分解産物の増加により決定される。このような分解は、例えば、実施例１に記載のように、βグロビン対αグロビンの比の変化によりモニターされ得る。したがって、貯蔵安定性ヘモグロビン溶液は、10％未満のヘモグロビン分解、分子量分布の10％未満の変化を示すか、または５％未満のメトヘモグロビンを含むヘモグロビンの溶液である。貯蔵安定性溶液はまた、これらの特徴付けの任意の組み合わせを示し得る。貯蔵安定性溶液を含むヘモグロビンは、特定の適用に必要な機能性を有し得る。例えば、本発明の貯蔵安定性ヘモグロビンが血液代用物として使用されるべき場合、約27mmHgより高いP₅₀を有するか、または約1.7より大きなn_maxを有するべきである。実施例以下の実施例は、どのようにも本発明の範囲を限定することを意図することなく、本発明の特定の実施態様を記述するために提供される。実施例１安定性の測定技法分子量分布の測定本発明のヘモグロビン組成物の分子量分布を以下のように決定した。ヘモグロビン溶液を、５mMリン酸ナトリウム、150mM NaCl、pH 7.6中、約４mg/mlの濃度に希釈した。アリコート（25μl）を、Pharmacia「SUPEROSE」12（Piscataway、 New Jersey）サイズ排除カラムを使用してクロマトグラフィーにより分離した。カラムを、希釈緩衝液と同じ緩衝液で、0.5ml/分の流速にて溶出した。吸光度を 280nmでモニターした。グロビン組成の測定ヘモグロビン分子の分解を、βグロビンの改変をモニターすることにより決定し得る。βグロビン改変の定量のための簡単な方法は、相対グロビン組成（すなわち、βグロビン含量対αまたはジ-αグロビン含量）の変化の決定による。α グロビンのピーク面積またはジ-αグロビンのピークのいずれかを分析に使用し得る。適切なピークの使用は、実験下のヘモグロビンの組成に依存する。ヘモグロビンのグロビン組成（βグロビンおよびジ-αグロビン）を以下のように決定した。ヘムを、冷却した酸アセトン溶液（0.6％ HCl/アセトン）で沈殿させることにより、ヘモグロビン溶液から除去した。ヘモグロビンを、HPLCグレードの水で約10μg/μlに希釈した。この希釈ヘモグロビン溶液の100μlを、冷却した酸-アセトン混合液で混合し、沈殿させ、微量遠心分離して画分を分離した。上清を吸引して廃棄した；ペレットをアルゴン気流で乾燥し、そしてクロマトグラフィーによる分析まで−20℃で貯蔵した。 HPLCを、Zorbax C3 HPLC分析カラム（MAC-MOD Analytical，Inc.、Chadds For d、Pennsylvania）を使用して行った。分析前に、ペレットを0.5mlの0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）中に再懸濁して約２mg/mlの最終濃度を得た。未溶解の残存物質は、分析カラムへの適用の前に、試料を微量遠心分離で10分間回転させることにより除去した。約100μgのタンパク質を、以下の分離法を使用してZorbaxカラムで分離した：35％溶媒Ｂで５分間、次いで49％溶媒Ｂへの直線勾配で次の45 分間、ここで溶媒Ａは0.1％TFA含有HPLCグレード水であり、そして溶媒Ｂは0.1 ％TFA含有アセトニトリルであった。分離のための流速は１ml/分であった。吸光度を215nmでモニターした。 βポリペプチドピークの面積は、ある条件下で著しく変化した。例えば、上昇するアスコルベート濃度の存在での高酸素条件下で貯蔵されたヘモグロビンのβ ピークの面積は、貯蔵21日間で著しく減少した。βピークの面積の減少は、ジ- αグロビン面積に対するβグロビンピーク面積の比の低下を生じた。所定のヘモグロビン溶液の最初のジ-α含量の小さな差異のため、ジ-αピークに対するβピークに対する面積比は、異なるヘモグロビン溶液についての異なる貯蔵条件の効果の比較のために使用され得るヘモグロビン溶液の分解の測定を提供した。表１に示すように、実施例２に従って調製し、上記のようにβ/ジ-αピーク比を分析した溶液は、メトヘモグロビン形成が制御された場合、0.9より大きいβ/ジ-α 比で安定であることが明らかとなった。0.9のβ/ジ-α比は、ヘモグロビンの約1 0％の分解と等価であると考えられる。P₅₀ およびn_maxの決定ヘモグロビンの機能特性であるP₅₀およびn_maxを、HoffmanおよびNagai、米国特許第5,028,588号（本明細書に参考として援用される）に記載のようにHEMOX装置（TCS,Inc.）を使用して酸素平衡結合実験により決定した。P₅₀およびn_maxを、37℃、50mM HEPES、100mM Cl^-、pH7.4で決定した。メトヘモグロビン濃度メトヘモグロビンは、ヘム配位基の１つまたはそれより多くの鉄がFe⁺³（第二鉄）酸化状態であるヘモグロビンである。本明細書に記載のメトヘモグロビンの測定技法は個々のヘム鉄の酸化状態を測定する。したがって、報告された割合のメトヘモグロビンは、ヘモグロビン試料中の酸化されたヘムの割合を反映する。５μlのヘモグロビン溶液を、500μlの0.1M Tris、pH 8.0に添加した。次いで、200μlの希釈したヘモグロビン溶液を、4.5mlのキュベット中の2.8mlの0.1M T ris、pH 8.0に、1:1500の最終希釈になるように添加した。次いで、酸化された試料（Hb）を、Hewlett-Packard model HP 8452A分光光度計で分光光度法により分析した。436、425、420、404、400nmでの吸光度を収集し、そしてデータ貯蔵システム中に貯蔵した。次いで、キュベットを分光光度計から取り出し、各回15 秒間、２回、一酸化炭素を散布した。キュベットを各散布間に５回逆さにした。次いで、試料を分光光度計中に再挿入し、そして一酸化炭素ヘモグロビン（HbCO ）に対応するスペクトルの２回目のセットを収集した。次いで、キュベットを分光光度計から再度取り出し、そして30μlの0.1M KCN含有0.1M Tris、pH 8.0を試料に添加した。次いで、試料を３回逆さにし、５分間インキュベートし、そして最後の分光光度分析（HbCN）のために分光光度計中に再挿入した。次いで、メトヘモグロビンの割合を以下のように算出した：ここで、Ａ＝上付きのヘモグロビン種についての下付きの波長における吸光度。実施例２安定性研究のためのヘモグロビン溶液の調製 1994年11月14日に出願された「ヘモグロビンの精製」（本明細書中に参考として援用される）という表題の共有にかかるPCT特許出願番号第PCT/US94/13034号に記載されるように、ヘモグロビンを発現し、調製し、そして精製した。ついで、ヘモグロビンをダイアフィルトレーションにより100mg/mlの濃度に濃縮し、そしてポリソルベート80を添加して0.03％(w/v)の最終濃度にした。次いで、ヘモグロビン溶液を、丸底フラスコ中で約２時間、酸素を含まない窒素ガスをヘモグロビン溶液を通してに流すことにより脱酸素化した。この溶液を窒素で脱酸素化し、次いで研究のために選択された酸素混合物で平衡化した。アスコルベートを0.5Mの保存溶液として調製した。次いで、アスコルベート溶液を、保存溶液の繰り返しの排気および酸素を含まない窒素ガスを４〜５サイクル流すことにより、脱酸素化した。アスコルベート溶液を、本明細書中に記載の各実験のために新鮮に製造した。一旦アスコルベート溶液を調製すると、それを脱酸素化したヘモグロビン溶液とともにグローブバッグ（「充填環境」）中に移し、そしてグローブバッグを、繰り返しの排気および適切な酸素／窒素混合物で流すことにより、グローブバッグの上部空間中に必要とされる残存酸素レベルに平衡化した。グローブバッグ中の残存酸素濃度を、上記のように「MOCON」装置を使用して決定した。グローブバッグの平衡化の後、アスコルベートおよびヘモグロビン溶液を開け、そしてアスコルベートを添加して0.5〜５mMの最終濃度にした。アスコルベートを含むヘモグロビン溶液を２mlのガラスバイアル中に0.5m lアリコートとして分けた。このバイアルを灰色のブチルゴム栓でふたをし、クリンプで密封した。この溶液をグローブバッグから取り出し、そして雰囲気ガス条件下で４℃または25℃のいずれかに温度制御されたインキュベーター中に貯蔵した。溶液を３カ月まで貯蔵した。バイアルを、所定の安定性試験の適切な時点で貯蔵した試料から取り出した。これらの試験には、βおよびジ-α含量の決定のための逆相HPLC分析、高速サイズ排除クロマトグラフィー（HP-SEC）による分子量分布、P₅₀およびn_max値を使用する機能性決定、およびメトヘモグロビン濃度が含まれる。実施例３酸素／アスコルベート滴定研究：β/ジ-α比およびメトヘモグロビン濃度の効果時間に対するヘモグロビンの安定性におけるアスコルベート濃度の効果を決定するために、ヘモグロビンの溶液を上記のように調製した。これらの溶液は、上部空間中に150、1000、5000、および15000 ppmの酸素、ならびに溶液中に0.5、１、２、および５mM濃度のアスコルベートを含んでいた（それぞれ、0.3:1、0.6 :1，1.3:1、および3.2:1の比のアスコルベート対ヘモグロビンモルの濃度比）。溶液を４℃で３週間貯蔵した。溶液中のβ対ジ-α比およびメトヘモグロビンの割合を、貯蔵期間の最後で決定した。β/ジーα比の最大変化を、アスコルベートおよび残存酸素の両方の高レベルを含む試料中で観察したが、メトヘモグロビン割合の最大増加は酸素および低アスコルベートを含む処方物中で観察した（表１）。低い残存酸素レベル（1000 ppmおよびそれより低い）では、処方物中にアスコルベートがあろうがなかろうが、β/ジ-α比にほとんど変化がなかった。しかし、処方物中にアスコルベートがない場合、貯蔵期間の最後には処方物中に高レベルのメトヘモグロビンが存在した。高い残存酸素レベル（5000および15000ppm ）では、高アスコルベート処方物（約0.5 mMより高いアスコルベート）が、低アスコルベート処方物よりもβ/ジ-α比の大きな変化を示した（図２および表１を参照のこと）。さらに、高残存酸素処方物において、メトヘモグロビンの感知し得る形成があった。貯蔵期間の最後に、5000 ppmより多くの酸素および１mMより少ないアスコルベートの存在下を除いて、メトヘモグロビンが低レベルで維持されたことに注目すべきである。したがって、ヘモグロビン処方物中にメトヘモグロビンの感知し得る形成がない場合でさえも、ペプチドサブユニットの改変があった。実施例４酸素／アスコルベート滴定研究：機能性の効果時間に対するヘモグロビンの機能性におけるアスコルベート濃度の効果を決定するために、ヘモグロビンの溶液を上記のように実施例４において調製した。溶液中のヘモグロビンの機能性を、上記のようにP₅₀およびn_maxの決定により３週間の貯蔵期間の最後に決定した。異なるアスコルベート濃度（表２）について、 150および1000 ppmの残存酸素レベルでP₅₀およびn_max値の最少の差があった。しかし、5000および15000 ppmの残存酸素濃度では、より高いアスコルベート濃度はP₅₀値の増加に伴っていた。さらに、15000 ppmの残存酸素濃度では、n_maxはアスコルベート濃度の増加に伴って減少した（表２）。実施例５部分的に脱酸素化された／アスコルベートを含むヘモグロビン処方物の長期、室温貯蔵４つの異なる脱酸素化された処方物（これらはすべて100mg/mlヘモグロビンおよび２mMのアスコルベートを含み、そして実施例２に記載のように調製されている）を25℃で３カ月間貯蔵した。処方物はすべて、150mM NaCl、５mM リン酸ナトリウム、２mM アスコルベート、0.03％ポリソルベート80を含み（標準処方）、そして以下の様式で異なっていた： (1) 標準処方、pH 6.75 (2) 標準処方、pH 7.21 (3) 標準処方、25μM EDTA、pH 6.75 (4) 標準処方、25μM EDTA，pH 7.21 貯蔵期間を通して、および３カ月貯蔵期間の完了時に、試料を、メトヘモグロビン含量、％高分子量ヘモグロビン（HMWHb）として測定された分子量の変化、β/ ジ-α比、力学的光散乱および光えん蔽技法の両方による凝集形成、および機能性（P₅₀およびn_max）について分析した。貯蔵期間の終結時には、研究期間を通してモニターされたいかなるパラメータにおいても臨床的に関連のある変化はなかった（表３）。本発明の先の記述は、例示および説明の目的の代表例である。本発明の意図および範囲を逸脱することなく、変更および改変が可能であることは、当業者には明らかである。以下の請求の範囲が、すべてのこのような変更および改変を包含すると解釈されることが意図される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．貯蔵安定性ヘモグロビン溶液を形成するために、部分的に脱酸素化されたヘモグロビン溶液、および１モルのヘモグロビン当たり４モルよりも少ない還元剤を含む、貯蔵安定性ヘモグロビン組成物。２．前記部分的に脱酸素化されたヘモグロビン溶液が、100万部当たり5000部よりも少ない酸素を含む、請求項１に記載の組成物。３．前記部分的に脱酸素化されたヘモグロビン溶液が、100万部当たり1000部よりも少ない酸素を含む、請求項２に記載の組成物。４．前記部分的に脱酸素化されたヘモグロビン溶液が、100万部当たり500部よりも少ない酸素を含む、請求項３に記載の組成物。５．前記部分的に脱酸素化されたヘモグロビン溶液が、100万部当たり150部よりも少ない酸素を含む、請求項４に記載の組成物。６．前記還元剤が、ジチオナイト、水素化ホウ素ナトリウム、およびアスコルビン酸またはその塩からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。７．前記還元剤がアスコルビン酸またはその塩である、請求項６に記載の組成物。８．前記還元剤が１モルのヘモグロビン当たり３モルよりも少ない還元剤である、請求項１に記載の組成物。９．前記還元剤が１モルのヘモグロビン当たり２モルよりも少ない還元剤である、請求項８に記載の組成物。１０．前記貯蔵安定性ヘモグロビンが少なくとも１年間貯蔵安定性である、請求項１に記載の組成物。１１．前記貯蔵安定性ヘモグロビンが少なくとも６カ月間貯蔵安定性である、請求項１に記載の組成物。１２．前記貯蔵安定性ヘモグロビンが少なくとも３カ月間貯蔵安定性である、請求項１に記載の組成物。１３．前記貯蔵安定性ヘモグロビンが40℃まで貯蔵安定性である、請求項１に記載の組成物。１４．前記貯蔵安定性ヘモグロビンが約25℃で貯蔵安定性である、請求項１３に記載の組成物。１５．前記貯蔵安定性ヘモグロビンが約４℃で貯蔵安定性である、請求項１１に記載の組成物。１６．前記還元剤がアスコルベートであり、そして前記部分的に脱酸素化されたヘモグロビン溶液が約150ppmよりも少ない酸素を含む、請求項１２に記載の組成物。１７．部分的に脱酸素化されたヘモグロビン溶液を１モルのヘモグロビン当たり４モルよりも少ない還元剤と合わせる工程を包含する、貯蔵安定性ヘモグロビン組成物を製造する方法。１８．ヘモグロビン溶液を部分的に脱酸素化する工程をさらに包含する、請求項１７に記載の方法。１９．前記脱酸素化が気体−液体接触方法によってである、請求項１８に記載の方法。２０．薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、請求項１に記載の組成物。２１．前記キャリアが少なくとも１つの薬学的に受容可能な賦形剤を含む、請求項２０に記載の組成物。２２．約6.5と約9.5との間のpHをさらに有する、請求項１に記載の組成物。２３．約6.6と約7.8との間のpHを有する、請求項１８に記載の組成物。２４．約6.8と約7.6との間のpHを有する、請求項２３に記載の組成物。２５．キレート化剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。２６．前記キレート化剤が、EDTAおよびDTPAからなる群より選択される、請求項２５に記載の組成物。２７．前記キレート化剤がEDTAである、請求項２６に記載の組成物。２８．貯蔵安定性ヘモグロビン溶液の貯蔵のためのシステムであって：１モルのヘモグロビン当たり４モルよりも少ない還元剤を含む部分的に脱酸素化されたヘモグロビン溶液；および、該部分的に脱酸素化されたヘモグロビン溶液の貯蔵のための容器、を含む、システム。