JPH11507207A - トリプシン（トリプシノーゲン）の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 トリプシン（トリプシノーゲン）が、シグナルペプチドをコードする DNA配列にＮ−末端で融合される、トリプシン又はその誘導体をコードする DNA配列を含んで成るベクターにより糸状菌を形質転換し、前記形質転換された糸状菌を、トリプシノーゲンを生成するための適切な培地において培養し、そして前記培地からトリプシノーゲン及び／又はトリプシンを回収することにより、糸状菌において生成され得る。

Description

【発明の詳細な説明】 トリプシン（トリプシノーゲン）の製造法 発明の分野 本発明は、糸状菌におけるトリプシンの製造法及びそのような方法に使用され る DNA配列に関する。 発明の背景 近年、糸状菌、たとえばアスペルギラス・ニガー（Aspergillus niger ）、 アスペルギラス・オリザエ（Aspergillus oryzae）及びアスペルギラス・ニジ ュランス（Aspergillus nidulans）の形質転換のための方法が、開発されて来 た。アメリカ特許第 4,885,249号（Allelix）は、選択マーカーをコードする遺 伝子を担持するプラスミドの導入により例示される、Ａ．ニガーの形質転換のた めの一般方法を記載する。 この方法は一般的に、他の微生物源に起因するタンパク質の発現及び生成のた めに使用されるが、しかし哺乳類タンパク質もまた、そのような系において生成 される。 しかしながら、トリプシン、特に哺乳類トリプシンの発現は、単に非常に低い レベルで達成されることが経験されている。 発明の要約 選択されたトリプシノーゲン（プロトリプシン）をコードする遺伝子が、アス ペルギラス sp.において発現される場合、分泌されるトリプシンのレベルは他の 微生物系から明らかなレベルに比較して、数倍高められることが驚くべきことに 見出された。 従って、本発明は、トリプシン（トリプシノーゲン）又はその誘導体の糸状菌 における製造方法に関し、ここで前記方法は、 （ａ）生来の配列であってもよく、又は真菌類たとえばアスペルギラス・オリ ザエの TAKA アミラーゼ遺伝子に由来する他のシグナル配列であってもよいシグ ナルペプチド、あるいはそのようなペプチドの誘導体をコードする DNA配列にＮ −末端で融合される、トリプシノーゲン（プロトリプシン）又はその誘導体をコ ードする DNA配列を含んで成る組換え DNAベクターにより糸状菌宿主生物を形質 転換し、 （ｂ）トリプシノーゲン（プロトリプシン）の発現並びに培地へのトリプシノ ーゲン及びトリプシンの分泌の助けとなる条件下で、前記形質転換された糸状菌 宿主生物を適切な培地において培養し、そして （ｃ）前記プロトリプシンもしくはトリプシン、又はその誘導体を前記培地か ら回収する、 ことを含んで成る。 本明細書において、用語“誘導体”とは、Ｃ−もしくはＮ−末端のいづれか又 は両者での１もしくは複数のアミノ酸の付加、生来のアミノ酸配列における１も しくは複数の異なった部位での１もしくは複数のアミノ酸の置換、生来のアミノ 酸配列のいづれか一端もしくは両端で、又は生来の配列中の１もしくは複数の部 位での１もしくは複数のアミノ酸の欠失，あるいは生来のアミノ酸配列における １又は複数の部位での１又は複数のアミノ酸の挿入をもたらすことにより、生来 のトリプシン／シグナルペプチドをコードする DNA配列を適切に修飾することに よって、生来のトリプシン又はシグナルペプチド（場合によれば）から誘導され るポリペプチドを示すことが意図される。そのような DNA配列の変性は、当業界 において良く 知られている方法により行なわれ得る。 用語“糸状菌”とは、フィコマイセテス（Phycomycetes）、ザイゴマイセテス （Zygomycetes）、アスコマイセテス（Ascomycetes）、バシジオマイセテス（Ba sidiomycetes）及び不完全菌類（fungi imperfecti）、たとえばハイフォマイセ テス（Hyphomycetes）、たとえばアスペルギラス（Aspergillus）、ペニシリウ ム（Penicillium）、トリコダーマ（Trichoderma）、フサリウム（Fusarium）及 びヒューミコラ（Humicola）属を包含することが意図される。 シグナル配列の存在は、トリプシノーゲン又はトリプシンが培養培地から容易 に単離され得るよう、発現されたトリプシノーゲン又はその誘導体を宿主細胞の 分泌経路中に効果的に向けるよう作用する（回収された生成物の少なくとも幾ら かは、細胞から分泌されるトリプシノーゲンが自己成熟又は宿主細胞により生成 されるプロテアーゼによる成熟にゆだねられるので、成熟トリプシンであろう） 。 本発明において、シグナル配列は、決定的であるとは思われず、そしてたとえ ば、TAKA−アミラーゼ（EP 0 238 023）、PTRYP−トリプシン、並びにヒト HTRY PＩ−トリプシン及び HTRYPIIシグナル配列(Okayamaなど．、Methods in Enzymo logy 154，3-28（1987）； Emiなど．、Gene 41，305-310(1986))など多くがす でに試験されている。 本発明の方法により製造されるトリプシン（トリプシノーゲン）は、いづれか の起源のトリプシン、特に哺乳類トリプシン、たとえばブタ、ウシ及びヒトトリ プシンである。 さらに、本発明は、ブタトリプシン（トリプシノーゲン）をコードする一定の DNA配列、及びそれらの生物学的活性を保持しているトリプシンを発現すること ができるその対立遺伝子を含んで成る。 さらに、本発明は、前記 DNA配列を含んで成るベクター、及びそれにより形質 転換された宿主にも関する。 表及び図面の簡単な説明 本発明は、例及び図面に言及しながら、明細書の以後の部分に、より詳細に記 載され、ここで 図１は、pHW470の作製にし与する段階を示し、 図２は、pHW473の作製に関与する段階を示し、そして 図３は、pHW874の作製に関与する段階を示す。 発明の詳細な記載 示されるように、本発明は、その第１の観点において、糸状菌においてトリプ シン（トリプシノーゲン）又はその誘導体を製造するための方法に関し、ここで この方法は、 （ａ）生来の配列であってもよく、又は菌類たとえばアスペルギラス・オリザ エ TAKA アミラーゼ遺伝子に由来する他のシグナル配列であってもよいシグナル ペプチド、又はそのようなペプチドの誘導体をコードする DNA配列にＮ−末端で 融合される、トリプシノーゲン又はその誘導体をコードする DNA配列を含んで成 る組換え DNAベクターにより糸状菌宿主生物を形質転換し、 （ｂ）トリプシノーゲンの発現並びに培地へのその分泌の助けとなる条件下で 、前記形質転換された糸状菌宿主生物を適切な培地において培養し、そして （ｃ）前記プロトリプシンもしくはトリプシン、又はその誘導体を前記培地か ら回収する、 ことを含んで成る。 ベクターはさらに、遺伝子発現を促進する機能、典型的には、プロモーター、 転写開始部位、並びに転写終結及びポリアデニル化機 能をコードする DNA配列を含むことができる。 前記プロモーター、続く上流活性化配列、及び当業界において知られているエ ンハンサー配列は、アスペルギラス sp.、たとえばＡ．オリザエ及びＡ．ニガー において強い転写活性を示すいづれかの DNA配列であり得、そして細胞外又は細 胞内タンパク質、たとえばアミラーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、リパ ーゼ、セルラーゼ又は解糖酵素をコードする遺伝子に由来することができる。 適切なプロモーターの例は、Ａ．オリザエ TAKA アミラーゼ、リゾムコル・ミ エヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａ．ニガー中性 α−アミラーゼ、Ａ．ニガー酸安定性α−アミラーゼ、Ａ．ニガーグルコアミラ ーゼ、リゾムコル・ミエヘイリパーゼ、又はＡ．ニガーアルカリプロテアーゼを コードする遺伝子に由来するものである。解糖酵素をコードする遺伝子からのプ ロモーターの例は、Ａ．オリザエトリオースリン酸イソメラーゼ、 ADH及び PGK プロモーターである。 宿主生物として使用される糸状菌は好ましくは、アスペルギラス sp.、たとえ ばＡ．ニガー、Ａ．アワモリ（A ．awamori）又はＡ．オリザエから選択される。 終結及びポリアデニル化配列は、適切には、前記プロモーターと同じ源に由来 することができる。 宿主生物を形質転換するために使用される技法は、適切には、たとえばYelton など．、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 81，1984，PP.1470-1474又はEP 0 215 5 94に記載される、Ａ．ニガーを形質転換する方法から、Buxtonなど．、Gene 37 ，1985，PP.207-215又はアメリカ特許第 4,885,249号に記載される、Ａ．ニガー を形質転換する方法から、又はEP 238 023に記載される、Ａ．ニガーを形質転換 する方法から適合され得る。本発明の方法においては、Ａ．オリザ エ又はＡ．ニガーが、形質転換に基づいて宿主生物のゲノムに導入され得るが、 しかし形質転換の前、宿主により発現されないか、又は選択条件下で増殖を可能 にするための十分な量で発現されない、選択マーカーをコードする DNA配列を含 んで成るベクター系により形質転換され得る。次に、形質転換は、その導入され た選択マーカーに基づいて非形質転換体から選択され、そして単離され得る。 適切な選択マーカーは、Ａ．ニジュランス又はＡ．ニガー argB遺伝子、Ａ． ニジュランス trpC遺伝子、Ａ．ニジュランス amdS遺伝子、ニューロスポラ・ クラサ（Neurospora crassa）pyr4又はDHFR遺伝子、又はＡ．ニガーもしくはＡ ．オリザエ niaD遺伝子に由来することができる。 本発明に使用するための好ましい選択マーカーは、Ａ．ニジュランス又はＡ． ニガー amdS又はargB遺伝子から誘導される。argBが選択マーカーとして選択さ れる場合、ArgB^-突然変異体株（ArgB遺伝子を発現しない）は、宿主生物として 使用されるべきである。他方では、amdS遺伝子が、選択条件下での増殖を可能に する十分な量でこの遺伝子を発現しない野生型Ａ．オリザエ又はＡ．ニガー株に おいて選択マーカーとして使用され得る。 シグナル配列は、トリプシノーゲン遺伝子自体に由来するシグナル配列から、 又はたとえばＡ．オリザエ TAKA アミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイアスパラギ ン酸プロテアーゼ、Ａ．ニガー中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガー酸安定性α−ア ミラーゼ、Ａ．ニガーグルコアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイリパーゼ、又は Ａ．オリザエアルカリプロテアーゼをコードする遺伝子から選択され得る。解糖 酵素をコードする遺伝子の例は、Ａ．オリザエトリオースリン酸イソメラーゼ、 ADH及び PGKである。そのようなシグナル配列の組合せ及び／又は変異体もまた 、使用され得る。 シグナル配列に、並びにプロモーター及びターミネーター配列に融合されるト リプシノーゲンをコードする遺伝子は、選択マーカーを含むベクターに挿入され 得、又はそれは宿主細胞中への導入のために異なったベクターに挿入され得る。 前記ベクターは、線状、又は閉環された環状分子であり得る。 形質転換された宿主細胞を培養するために使用される培地は、糸状菌を増殖す るために適切ないづれかの従来の培地であり得る。形質転換体は通常、安定して おり、そして選択圧力の不在下で培養され得る。しかしながら、形質転換体が不 安定であることが見出される場合、細胞中に導入される選択マーカーは、選択の ために使用され得る。 宿主細胞により生成されるトリプシノーゲン又はトリプシンは便利には、遠心 分離又は濾過により培地から細胞を分離し、そして塩、たとえば硫酸アンモニウ ムにより、続いてクロマトグラフィー方法、たとえばイオン交換クロマトグラフ ィー、アフィニティークロマトグラフィー又は同様の手段により培地のタンパク 質性成分を沈殿せしめることを包含する良く知られた方法により培養培地から回 収され得る。 さらに、本発明は、ブタトリプシン（トリプシノーゲン）をコードする一定の DNA配列、及びそれらの生物学的活性を保持しているトリプシンを発現すること ができるその対立遺伝子を含む。 本発明は、さらなる観点において、前記 DNA配列を含んで成るベクターにも関 する。 本発明はまた、そのようなベクターにより形質転換された宿主も包含する。宿 主は、動物又は微生物起源のもの、たとえば哺乳類細胞系、細菌、酵母又は菌類 、特に糸状菌であり得る。 最後に、本発明は、ブタトリプシンを組換え製造するための方法 に関し、ここでこの方法は、 （ａ）生来の配列でもよく、又は他のペプチドでもよいシグナルペプチド、あ るいはそのようなシグナルペプチドの誘導体をコードする DNA配列にＮ−末端で 融合される、ブタトリプシノーゲン又はその誘導体をコードする DNA配列を含ん で成る組換え DNAベクターにより宿主を形質転換し、 （ｂ）ブタトリプシノーゲンの発現及び培地へのその分泌の助けとなる条件下 で、前記形質転換された宿主を適切な培養培地において培養し、そして （ｃ）前記ブタトリプシノーゲンもしくはトリプシン、又はその誘導体を前記 培地から回収する、 ことを含んで成る。 本発明はさらに、次の例により例示されるが、しかしそれらの例は本発明の請 求の範囲を限定するものではない。材料及び方法 例 例 １．ヒトトリプシノーゲンＩ及びII cDNAのクローニング Okayamaなど．、Methods in Enzymology 154 ，3-28（1987）に従って作製さ れたヒト膵臓cDNAライブラリーから、本発明者は、２種の主なヒトトリプシノー ゲンアイソザイム、 TRYＩ及び TRYIIをコードするcDNAクローンを単離した。 E miなど．、Gene 41，305-310(1986)の配列が、単離のためのプローブを選択す るために使用された： NOR 948は、TRYＩ及び TRYIIに共通し、 NOR 949はTRIIに対して特異的である 。 Emiなど．、Gene 41，305-310(1986)により公開 された配列に従っての配列を有する十分な長さのクローンを単離した。プラスミ ドは、 TRYＩのためにpHW468として及び TRYIIのためにpHW469として命名された 。 例 ２．ブタトリプシノーゲンcDNAのクローニング mRNAを、標準の方法(Maniatis 1982)を用いて、ブタ膵臓から精製した。cDNA を前記mRNAから調製し、精製し、そしてAmersham，UKからのcDNAクローニングシ ステム−λgt11を用いてλgt11中に挿入した。ファージの調製、細胞のプレート 化、λgt11による感染、増幅及びスクリーニングを、製造業者の説明書及び標準 技法(Maniatis 1982)に従って行なった。上記のようなオリゴヌクレオチド NOR 948を、プラークのスクリーニングのために用いた。 陽性プラークを単離し、そして増幅した。単離されたλgt11 DNAを、EcoRＩに よる消化にゆだね、そして挿入されたcDNAを、Ｅ．コリ JM101形質転換体のアン ピシリン選択を用いて、EcoRＩ切断されたpBluescript SK（Stratagene）中にク ローン化した。選択されたプラスミドは、既知のブタトリプシンアミノ酸配列(H ermodsonなど．、Biochemistry 12，3146-3153(1973))と適合するcDNAを含むこ とが、 DNA配列分析（Sequenase，U．S．Biochemical Corp.）により示された。 ブタプレ−プロ−トリプシンのシグナルペプチドの最Ｎ−末端を欠いているほと んど完全な配列を、Ｎ−末端を包含する 130bp及びＣ−末端を包含する 740bpの ２種のEcoRＩフラグメントから得た。得られるプラスミドを、p185として命名し 、この配列は配列番号１に示される。 例 ３．Ａ．オリザエにおけるヒトトリプシノーゲンＩ及びIIの発現 アスペルギラスにおけるヒトトリプシノーゲンＩ及びIIの発現のためのベクタ ーを、図１及び図２に概略されるようにして作製した 。 BamHＩ− PvuIIリンカー： （配列番号５）は、EP 0 238 023に記載される菌類発現ベクターp777におけるBa mHＩ部位にcDNAを連結する。その共通リンカーは、その生来の配列においてプロ リンの代わりにロイシンを有する、位置３においてのみ TRYIIとは異なる TRYI のシグナル配列の最初の11個のアミノ酸を包含する。前記配列の残りの部分は、 両種に対して生来のままである。 トリプシノーゲン発現ベクターpHW470及びpHW473により、EP 238 023に記載さ れる方法を用いて、Ａ．オリザエ IFO4177又はそのプロテアーゼ欠損誘導体を形 質転換した。アセトアミドに基づく選択を、 WO 93／00426 に記載されるように して、 pToC186による同時形質転換により行なった。 形質転換体を、 YPD培地（Shermanなど．、Methods in Yeast Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory，1981）において、３〜４日間増殖せしめ、そして ヒトトリプシン種を検出するとは思われない、ブタトリプシンに対して生ぜしめ られたポリクローナル抗体を用いての SDS−PAGE及びウェスターンブロットによ り上清液における新規タンパク質種について分析した。しかしながら、基質とし てＬ−BAPNA（Ｌ−ベンゾイル−アルギニル−パラニトロアニリド）を用いての 活性アッセイは、Ａ．オリザエからの TRYＩ及び TRYIIの発現を納得のゆくよう に示した。また、両種を、Ａ．オリザエ上清液から精製した。 例 ４．Ａ．オリザエにおけるブタトリプシンの発現 アスペルギラスにおけるブタトリプシノーゲンの発現のためのベ クターを、図３に概略されているようにして構成した。TAKAアミラーゼシグナル の最初の18個のアミノ酸を、ブタトリプシンシグナルの最後の４個のアミノ酸に 連結するために、本発明者は、次の BanＩ−EcoRＩリンカーを用いた： この融合体はまた、TAKAアミラーゼプロモーターの一部及びトリプシン遺伝子 のＮ−末端部分を有する。トリプシン遺伝子のＣ−末端領域は、Sub2においてこ れに連結され、その配向が追跡される。最終の発現ベクターpHW874は、機能的要 素としてTAKAアミラーゼプロモーター及び AMGターミネーターを有する。それら の要素は、EP 0 505 311に記載されるpHD414に由来した。 ブタトリプシン発現ベクターpHW874を用いて、例３に記載されるようにして、 Ａ．オリザエを形質転換した。形質転換体を YPD培地において増殖し、そして例 ３に記載されるようにして、 SDS−PAGE−ウェスターン及びＬ−BAPNA の切断に より分析した。この場合、ブタトリプシノーゲン及び成熟トリプシンについての 予測される大きさの明確なバンドがウェスターンブロット上に見出され、これは 、Ｌ−BAPNA による活性測定値に対応する。 明細書に引用された参考文献： アメリカ特許第 4,885,249号（Allelix） Okayama など．、Methods in Enzymology 154 ，3-28（1987） Emi など．、Gene 41，305-310（1986） Yeltonなど．、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 81，1984，PP.1470-1474 ヨーロッパ特許第 0 215 594号 Buxtonなど．、Gene 37，1985，PP.207-215 アメリカ特許第 4,885,249号 ヨーロッパ特許第 0 238 023号 Hermodson など．、Biochemistry 12，3146-3153（1973） WO 93／00426 Sherman など．、Methods in Yeast Genetics ，Cold Spring Harbor Laborat ory，1981 ヨーロッパ特許第 0 505 311号

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/76 Ｃ１２Ｒ 1:66） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．糸状菌におけるトリプシン又はその誘導体の製造方法であって、 （ａ）シグナルペプチドをコードする DNA配列にＮ−末端で融合されたトリプ シノーゲン（プロトリプシン）又はその誘導体をコードする DNA配列を含んで成 る組換えベクターにより糸状菌宿主を形質転換し、 （ｂ）プロトリプシンの発現及び培地へのその分泌の助けとなる条件下で、前 記形質転換された糸状菌宿主生物を適切な培養培地において培養し、そして （ｃ）前記培地からプロトリプシンもしくはトリプシン、又はその誘導体を回 収する、 ことを含んで成る方法。 ２．前記糸状菌がアスペルギラス sp.である、請求の範囲第１項記載の方法。 ３．前記アスペルギラス sp.が、Ａ．ニガー又はＡ．オリザエである請求の範 囲第２項記載の方法。 ４．前記 DNAベクターが、Ａ．ニガーアミラーゼプロモーター及びＡ．オリザ エ TAKA アミラーゼプロモーターから成る群から選択されたプロモーターをさら に含んで成る請求の範囲第３項記載の方法。 ５．前記シグナル配列が、生来のトリプシノーゲンシグナル配列、Ａ．ニガー アミラーゼシグナル及びＡ．オリザエ TAKA アミラーゼシグナルを含んで成る群 から選択される請求の範囲第１〜４のいづれか１項記載の方法。 ６．前記トリプシノーゲンが、動物起源のもの、特に哺乳類起源 のものである請求の範囲第１〜５のいづれか１項記載の方法。 ７．前記哺乳類がヒト又はブタである請求の範囲第６項記載の方法。 ８．前記トリプシノーゲンが、微生物起源のもの、特に細菌又は真菌類起源の ものである請求の範囲第１〜５のいづれか１項記載の方法。 ９．ブタトリプシノーゲンをコードし、そして特に、配列番号１に与えられる ような配列を有する DNA配列。 10．請求の範囲第９項記載の DNA配列を含んで成るベクター。 11．請求の範囲第10項記載のベクターにより形質転換された宿主。 12．哺乳類宿主である請求の範囲第11項記載の宿主。 13．微生物宿主である請求の範囲第11項記載の宿主。 14．酵母又は菌類である請求の範囲第13項記載の宿主。 15．糸状菌である請求の範囲第14項記載の宿主。 16．ブタトリプシンを組換え製造するための方法であって、 （ａ）生来の配列であってもよく、又はもう１つのペプチドであってもよいシ グナルペプチド、あるいはそのようなシグナルペプチドの誘導体をコードする D NA配列にＮ−末端で融合される、ブタトリプシノーゲン又はその誘導体をコード する DNA配列を含んで成る組換え DNAベクターにより宿主を形質転換し、 （ｂ）ブタトリプシノーゲンの発現及び培地へのその分泌の助けとなる条件下 で、前記形質転換された宿主を適切な培養培地において培養し、そして （ｃ）前記ブタトリプシノーゲンもしくはトリプシン、又はその誘導体を前記 培地から回収する、 ことを含んで成る方法。