JPH11507228A - う蝕の置換療法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 乳酸生産の欠陥および組換えアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）の生産により特徴づけられる組換えストレプトコッカス・ミュータンス株が記載される。これらの組換えＳ．ミュータンス株はう蝕の予防・治療方法において使用するのに適している。

Description

【発明の詳細な説明】 う蝕の置換療法連法政府による助成研究に関する供述 本発明は少なくとも一部分は、National Institute of Dental Research から のPublic Health Service 援助金第DEO4529 号を介して連法政府の基金を用いて なされた。政府は本発明に一定の権利を持ちうる。 発明の背景 発明の分野 本発明はう蝕(dental caries)を防止するための方法および組成物に関する。関連技術の説明 特定の細菌が宿主に定着(colonize)する能力は、種々の因子によって決定され る。例えば、該細菌の代謝上の要求、および該細菌と以前から存在している微生 物叢(flora)との相互作用などである。細菌の相互作用は、一般に「陽性」また は「陰性」に分類することができる。陽性相互作用においては、「エフェクター 」細菌株が微環境を変化させ、第２の「標的」生物の定着を促進する。「陰性」 相互作用においては、エフェクター株は標的細菌の定着を減少または完全に阻止 するように微環境を変化させる。競合する細菌間の宿主に定着する際の陰性相互 作用は、一般に細菌干渉と呼ばれる。 細菌干渉を利用して病原性細菌株を非病原性エフェクター株に置換する治療法 は、置換療法と呼ばれる。上首尾な置換療法は、１）非病原性であり、２）病原 性生物の定着または発芽後成長(outgrowth)を阻止するように微環境を変化させ 、３）危機に陥っている宿主に持続的に定着して標的病原性生物による再感染を 阻止し、また病原体が宿主の固有微生物叢の一部である場合には危機に陥ってい る組織から病原性生物を積極的に放逐するエフェクター株を必要とする。 う蝕は口腔に定着する細菌によって引き起こされることが周知である。ヒトに おいてう蝕を引き起こす主な細菌性病原体は、ストレプトコッカス・ミュータン ス(Streptococcus mutans)である。う蝕発生に関与するＳ．ミュータンスの特徴 は、乳酸を生産する能力および歯のエナメル質上に集積する能力（すなわち、歯 垢形成）である(Gibbonsら，1969，J．Bacteriol.，98:341-346; Makinenら，19 72，Int．Dent．J.，22:362-386;およびJordan，1965，Ann．N.Y．Acad．Sci.， 131:905-912)。置換療法の原理の適用は、Ｓ．ミュータンスの非う蝕発生性エフ ェクター株、例えば乳酸合成に欠陥のあるＳ．ミュータンス株の単離を必要とす るであろう。置換療法のう蝕への適用における進歩が最近総論された(Hillmanら ，1989，New Biotechnologies in Oral Research，H.M．Myers編，S．Karger，B asel，Switzerland，pp．1-17)。 乳酸欠陥Ｓ．ミュータンス株および、それゆえう蝕のための置換療法に適する 株の作製は相当の困難に直面した。乳酸合成における欠陥はＳ．ミュータンスに とって致死的である。Abhyanakarら(1985，J．Dent．Res.，64:1267-1271)は、 ピルビン酸代謝に影響する既存の（自然発生的）突然変異を有する非定型Ｓ．ミ ュータンス株を用いた化学的突然変異誘発によって乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH) 欠損Ｓ．ミュータンス変異体を作製した。しかし、この株における化学的に誘導 された、および自然に発生した突然変異は、形質化されずに(uncharacterized) 残る。さらに、化学的に誘導された、形質化されない突然変異は、野性型の、そ れゆえ病原性でう蝕発生性の表現型に復帰しうる。他のＳ．ミュータンス株にお いてLDH欠損を作製するその後の試みは失敗した(Hillmanら，1994，Infect．Imm un.，62:60-64; Chenら，1994，J．Bacteriol.，176:1542-1545)。 う蝕の予防および／または治療における置換療法に用いるのに適した、安定で 、乳酸欠損で、非う蝕発生性のＳ．ミュータンス株に対する明確な必要がこの分 野には存在する。 発明の概略 本発明は、乳酸合成経路に関与する遺伝子に突然変異を導入し、そして組換え アルコールデヒドロゲナーゼ(adh)遺伝子を乳酸欠損細菌に導入して上記突然変 異の致死性を妨げることにより、乳酸欠損ストレプトコッカス・ミュータンス株 を作製することができるという発見に基づいている。組換えadh は細菌における 代謝物（例えばピルビン酸）の蓄積を妨げ、その結果、乳酸欠損の致死性を回避 する。この戦略を、う蝕のための置換療法に使用するのに適したＳ．ミュータン ス株の作製に適用することができる。 全般的には、本発明はう蝕を発生しやすい宿主におけるう蝕の予防および／ま たは治療のための方法および組成物を特徴とする。 １つの側面において、本発明は乳酸生産の欠陥（例えば、乳酸デヒドロゲナー ゼ活性の除去による）および、それに代わる組換えアルコールデヒドロゲナーゼ （ＡＤＨ）の生産によって特徴づけられる組換えストレプトコッカス・ミュータ ンス株を特徴とする。「乳酸生産の欠陥」または「乳酸欠損」とは、組換えＳ． ミュータンス株が野性型Ｓ．ミュータンスに較べて実質的に減少した量の乳酸を 生産することを意味する。好ましくは、「乳酸欠損」組換えＳ．ミュータンスは 検出可能な乳酸を全く生産しない。本発明はまた、本発明の組換え株を作製する 方法をも特徴とする。 好ましい組換えＳ．ミュータンス株は、１）乳酸生産の欠陥；２）組換えアル コールデヒドロゲナーゼの生産；３）バクテリオシン感受性のストレプトコッカ ス・ミュータンス株に対する抗菌活性を有するバクテリオシンの生産によって特 徴づけられ、そして４）場合により栄養要求性でありうる（例えば、D-アラニン 栄養要求性）。 付加的な好ましい組換えＳ．ミュータンス株は、乳酸生産に欠陥があり、組換 えアルコールデヒドロゲナーゼを生産し、そして栄養要求性である（例えば、D- アラニン栄養要求性）。 本発明はさらに、乳酸欠損でかつ組換えADH を生産する組換えＳ．ミュータン ス株および製剤上許容される担体からなる医薬組成物を特徴とする。 本発明はさらに、う蝕を発生しやすい宿主におけるう蝕の発生率または重症度 を低下させる方法であって、う蝕を発生しやすい宿主に、１）組換えアルコール デヒドロゲナーゼ遺伝子および２）乳酸生産の欠陥を有する組換えストレプトコ ッカス・ミュータンス株を、宿主の口腔内のう蝕を引き起こすストレプトコッカ ス・ミュータンス宿主株を置換するのに有効な量で経口的に投与することを含ん でなる方法を特徴とする。 本発明はさらに、D-アラニン栄養要求細菌株を維持する量のD-アラニンを含有 する、宿主の口腔内のD-アラニン栄養要求細菌株（例えば、D-アラニン栄養要求 Ｓ．ミュータンス株）を維持するための組成物を特徴とする。 本発明の１つの利点は、組換えＳ．ミュータンス株が１）乳酸欠損であり、し たがってう蝕を引き起こさないこと、および２）宿主の口腔内のう蝕を引き起こ すＳ．ミュータンス株を効果的に置換するということである。 別の利点は、組換えＳ．ミュータンスがD-アラニン栄養要求株である場合、D- アラニンの投与によって該株の定着を制御できることである。 本発明の他の特徴および利点は、以下の好ましい実施態様の記述および請求の 範囲より明らかであろう。 図面の簡単な説明 図１は、Ｚ．モビリスのアルコールデヒドロゲナーゼIIのアミノ酸配列（配列 番号Ｉ）およびＤＮＡ配列（配列番号２）を示す。 図２は、ストレプトコッカス・ミュータンス株 CH4tsおよび NG8（対照）の増 殖、生存および細胞内ピルビン酸濃度に及ぼすグルコースの効果を示す。記号： グルコース存在下のNG8 ─□─; グルコース不在下のNG8 ─○─; グルコース存 在下のCH4ts ─○─; グルコース不在下のCH4ts ─△─。 図３は、グルコース濃度および温度が、ストレプトコッカス・ミュータンス株 CH4ts の希釈率10% での連続培養に及ぼす効果を示す。パネルＡの記号：─□─ 光学密度；─○─グルコース濃度；パネルＢの記号：─○─ pH ；─□─乳酸濃 度；─△─理論ウォッシュアウト(washout)；─○─エタノール濃度；─□─ア セトイン濃度。 図４は、グルコース濃度および温度が、ストレプトコッカス・ミュータンス株 CH4ts の希釈率0.6%での連続培養に及ぼす効果を示す。記号：─□─光学密度； ─○─グルコース；─○─理論ウォッシュアウト。 詳細な説明 う蝕は、通常口腔に定着するＳ．ミュータンスによる乳酸の生産および蓄積に よって引き起こされる。しかし、Ｓ．ミュータンスの乳酸生産経路における突然 変異は該細菌にとって致死的なので、乳酸欠損Ｓ．ミュータンスを口腔に導入し て乳酸生産Ｓ．ミュータンス株と置換することはこれまで不可能であった。 本発明は、組換えアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）をコードする核酸を 有する細菌株を形質転換し、そして乳酸合成経路に突然変異を導入して該組換え ＡＤＨ生産株を乳酸欠損とすることにより、生存可能な乳酸欠損ストレプトコッ カス・ミュータンス株を作製することができるという発見に基づいている。組換 えＡＤＨは細菌中の代謝物の蓄積を妨げ、その結果乳酸欠損の致死性を回避する 。この戦略を、う蝕のための置換療法に使用するのに適した組換えＳ．ミュータ ンス株の作製に適用することができる。本発明の組換えストレプトコッカス・ミュータンス株 組換えストレプトコッカス・ミュータンス株とは、種々の組換え核酸技法（す なわち、ＤＮＡまたはＲＮＡの操作を含む技法）の任意のものを用いて作製され た、天然には存在しないＳ．ミュータンス株である。一般に、本発明の組換えス トレプトコッカス・ミュータンス株は少なくとも１）乳酸生産の欠陥、および２ ）組換えアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）の生産によって特徴づけられる 。 好ましくは、組換えＳ．ミュータンス株はさらにバクテリオシン感受性のスト レプトコッカス・ミュータンス株に対する抗菌活性を有するバクテリオシンの生 産によって特徴づけられる。本明細書中に使用する「バクテリオシン」という用 語は、Ｓ．ミュータンス株JH1000（Hillmanら，1984，Infect．Immun.，44:141- 144）によって生産される特定のバクテリオシンまたはバクテリオシンに類似し た毒素を意味する。Ｓ．ミュータンス株JH1000のバクテリオシンは見かけ分子量 が約1,000 Da未満で、バクテリオシン感受性のＳ．ミュータンス株に対する抗菌 活性を有する。したがってバクテリオシンの生産は、該Ｓ．ミュータンスに口腔 中に通常存在する非バクテリオシン生産Ｓ．ミュータンス株に対する選択有利性 を提供する。本発明の組換えＳ．ミュータンス株中に存在する場合、バクテリオ シンは既存のバクテリオシン感受性Ｓ．ミュータンス株を排除し、その結果バク テリオシン感受性株の定着を妨げ、組換えＳ．ミュータンスの口腔定着を促進す る。 本発明の組換えＳ．ミュータンス株による口腔定着をコントロールすることが 望ましい場合があるので、該組換えＳ．ミュータンス株は好ましくは哺乳動物宿 主の口腔中に通常存在しない有機物に対する栄養要求株であり、より好ましくは D-アミノ酸栄養要求株、さらに好ましくはD-アラニン栄養要求株である。栄養要 求株の定着は、該株が栄養要求する有機物の量を調節することによりコントロー ル可能である。したがって、宿主から組換えＳ．ミュータンスを駆逐する必要が 生じた場合は、該株が栄養要求する特定有機物の投与を止めることにより、定着 を停止させることができる。 したがって、本発明の組換えＳ．ミュータンス株は、１）乳酸生産の欠陥、お よび２）組換えアルコールデヒドロゲナーゼの生産によって特徴づけられ、そし てさらに３）バクテリオシン感受性のストレプトコッカス・ミュータンス株に対 する抗菌活性を有するバクテリオシンの生産、および／または４）特定の有機物 、好ましくはD-アミノ酸、より好ましくはD-アラニンに対する栄養要求性によっ て特徴づけられる。以下に本発明の組換えＳ．ミュータンス株のそれぞれの作製 を詳細に説明する。本発明の組換えＳ．ミュータンス株の作製に用いる親ストレプトコッカス・ミュ ータンス株 本発明の組換えＳ．ミュータンス株の作製に用いるストレプトコッカス・ミュ ータンス株は、任意のＳ．ミュータンス株であることができる。好ましくは、本 発明の組換えＳ．ミュータンス株の作製に用いるストレプトコッカス・ミュータ ンス株は、普通口腔に定着している野性型Ｓ．ミュータンス株に対し選択有利性 を有する。選択有利性は、該組換え株による口腔定着および口腔に定着した既存 株の置換を促進する種々の特徴（例えば、抗菌性化合物の生産、相対代謝要求、 相対増殖率、代謝物スカベンジャーの生産、等）の任意ものによって付与されう る。 好ましくは、本発明の組換えＳ．ミュータンス株による定着は、他の非Ｓ．ミ ュータンス株の定着（例えば、う蝕発生に関連しない通常の細菌叢）を実質的に 崩壊させないであろう。例えば、増大したレベルのバクテリオシンを生産するＳ ．ミュータンスJH1000の変異株を用いてヒトボランティアを感染させたところ、 口腔内の他の既存グラム陽性種に対して作用することなく、既存のう蝕発生性Ｓ ．ミュータンス株の置換をもたらした(おそらく、部分的にはJH1000株によるバ クテリオシンの生産による)(Hillmanら，1987，J．Dent．Res.，66:1092-1094) 。 好ましくは、該Ｓ．ミュータンス株はＳ．ミュータンスJH1000のバクテリオシ ンを生産する。より好ましくは、組換えＳ．ミュータンス株は、Ｓ．ミュータン スJH1000が生産する量よりも大きい量のバクテリオシンを生産するＳ．ミュータ ンスJH1000変異株から作製される。「変異体」とは、それが誘導された親株と較 べて表現型の変更を示す、遺伝子的に改変された細菌である。表現型の変更は、 種々の遺伝子的損傷(lesion)の任意のものによってもたらされうる。例えば、１ ）構造遺伝子に機能しうる形で連結されたプロモーターにおける変更（例えば、 遺伝子転写の増大を達成するため）；および／または２）特定産物をコードする 構造遺伝子における変更（例えば、該産物が増強した活性をもつように）、等で ある。遺伝子的損傷とは、細菌の表現型変更をもたらす、野性型ヌクレオチド配 列における変更を言う。 例えば、Ｓ．ミュータンスJH1000の「バクテリオシン変異体」は、Ｓ．ミュー タンスJH1000親株と較べて増大したバクテリオシン活性を有する細菌である。好 ましくは、Ｓ．ミュータンスJH1000変異体のバクテリオシン活性は、Ｓ．ミュー タンス親株のバクテリオシン活性と較べて好ましくは約10倍、好ましくは約1.5- ５倍、より好ましくは約2-4 倍、一般的には約３倍Ｓ．ミュータンスJH1000親株 よりも増大している。これら変異体の増大したバクテリオシン活性は、親株に較 べて増大したレベルのバクテリオシン生産および／または野性型Ｓ．ミュータン スのバクテリオシンと較べて増強された抗菌活性を有するバクテリオシンの生産 によってもたらされうる。 「変異体」は当分野で公知の種々の方法によって作製することができる。例え ば、突然変異誘発（すなわち、細菌の突然変異原への暴露）、自然突然変異体の 選択、または組換え技法を用いた遺伝子操作、等である。突然変異誘発は、当分 野で周知に方法によって、細菌を紫外線または種々の化学的突然変異原の任意の ものに暴露することにより達成できる。例えば、エチルメタンスルホン酸(EMS) 、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、ヌクレオチド類似体（例えば、5-ブロモウラシ ル、2-アミノプリン）または挿入剤（例えば、アクリジン）等である。細菌突然 変異体の作製方法は、当分野で周知である（例えば、Sambrookら，1989，Molecu lar Cloning: A Laboratory Manual(第２版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY参照）。 「自然突然変異」とは、自然に発生する、すなわちヒトによる直接的遺伝子操 作または突然変異原への暴露なしに発生する突然変異である。自然突然変異体の 選択は、その細菌株を培養し、そして例えば変異体細菌による特定因子（例：バ クテリオシン）の生産または過剰生産によって所望の変異体を選択することによ り実施できる。自然突然変異体の選択方法は、当分野で周知である（例えば、Sa mbrookら、前出参照）。 組換え技法を用いて変異体を作製する方法は、当分野で周知である（例えば、 Sambrookら、1989、前出参照）。例えば、バクテリオシンをコードするＤＮＡの 多数コピーの発現および／またはより高レベルの転写をもたらすためのバクテリ オシンプロモーターの突然変異によって、増大したバクテリオシン活性を有する Ｓ．ミュータンスJH1000変異体を作製することができる。アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子 Ｓ．ミュータンスにとって乳酸生産の欠陥は致死的なので(Hillmanら，1994， Infect．Immun.，62:60-64; Hillmanら，1994，J．Bacteriol.，176:1542-1545) 、組換え乳酸欠損Ｓ．ミュータンス株における該欠陥を組換えアルコールデヒド ロゲナーゼ（ＡＤＨ）の生産によって補わなければならない。組換えＡＤＨの生 産は代謝物、例えばピルビン酸（これは蓄積すれば乳酸欠損Ｓ．ミュータンスの 死を引き起こす）の蓄積を阻止する。 「組換えＡＤＨの生産」とは、組換えＳ．ミュータンス株が、組換えＤＮＡ技 法を用いてＳ．ミュータンス株に導入された機能性のＡＤＨ酵素を発現すること を意味する（すなわち、該Ｓ．ミュータンスはＡＤＨ酵素をコードするＤＮＡに よって形質転換されている）。「形質転換」とは、新しいＤＮＡ（すなわち、細 胞にとって外因性のＤＮＡ）の組み込み後に細胞中に誘導された永久的な（つま り安定な）遺伝子変化を意味する。 ＡＤＨをコードするＤＮＡは、任意の生物から、好ましくは細菌から、より好 ましくはチモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)またはストレプトコッカス ・ラッス(Streptococcus rattus)、さらに好ましくはＺ．モビリスから誘導する ことができる。ＡＤＨをコードするＤＮＡの導入が、天然のＳ．ミュータンスの ａｄｈ遺伝子と組み合わせられてＳ．ミュータンスのゲノム中にＡＤＨをコード するＤＮＡの多数コピーを提供するように、ＡＤＨをコードするＤＮＡをＳ．ミ ュータンスから誘導することができる。または、Ｓ．ミュータンスａｄｈ遺伝子 の調節機構に突然変異（例えば、ａｄｈ遺伝子の増大した転写をもたらすための ａｄｈプロモーターにおける突然変異）を導入することにより、組換えＡＤＨを 作製することができる。好ましくは、組換えＡＤＨはＺ．モビリスのアルコール デヒドロゲナーゼIIであり、これはすでにクローン化され配列決定されている(G enBank 受託番号 M15394; 参考のためここに組み入れる Conwayら，1987，J．Ba cteriol.，169:2591-2597)。Ｚ．モビリスのアルコールデヒドロゲナーゼIIのア ミノ酸配列（配列番号１）およびＤＮＡ配列（配列番号２）を図１に示す。 興味のあるＤＮＡ（例えばＡＤＨ）をコードするＤＮＡ断片の同定、クローン 化、安定な形質転換、および発現のための方法は、当分野では日常的なものであ り、周知である（例えば、Sambrookら、1989，Molecular Cloning: A Laborator y Manual，第２版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbo r，NY 参照）。例えば、ＡＤＨをコードするＤＮＡの単離は、ゲノムＤＮＡ由来 の、または該遺伝子の既存クローン由来の配列のＰＣＲ増幅によって実施できる 。組換えＡＤＨの発現は、ａｄｈ構造遺伝子をＳ．ミュータンス中での発現を促 進するプロモーター（例えば、spaPまたは天然のldh プロモーター）に機能しう る形で連結することにより実施できる。 機能性ＡＤＨの生産は、例えば、当分野で周知の、従来のＡＤＨ活性アッセイ （例えば、エタノールのＮＡＤ依存性酸化についてのアッセイ）を用いてアッセ イすることができる(参考としてここに組み入れる Nealら，1986，Eur．J．Bioc hem.，154:119-124)。乳酸欠損Ｓ．ミュータンスの作製 「乳酸欠損」または「乳酸生産の欠陥」とは、Ｓ．ミュータンス株が野性型Ｓ ．ミュータンスに較べて実質的に減少した量の乳酸を生産することを意味する。 好ましくは、「乳酸欠損」組換えＳ．ミュータンスは検出可能な乳酸を全く生産 しない。 本発明の組換えＳ．ミュータンス株は、乳酸合成経路における欠陥の結果、乳 酸欠損である。「欠陥」とは、機能性遺伝子産物の発現を妨げる、該遺伝子をコ ードするＤＮＡにおける変更である。「欠陥」は、遺伝子の転写および／または 翻訳の阻止または実質的減少をもたらす変更を含む。「欠陥」はまた、転写され 翻訳された遺伝子産物が非機能性であるか、または野性型遺伝子産物と較べて実 質的に低下したレベルで機能するような、構造遺伝子における変更をも含む。 「乳酸合成経路における欠陥」は、乳酸の生産を阻止または実質的に減少させ る遺伝子的欠陥をいう。乳酸合成経路の欠陥は、例えば、乳酸合成を促進する酵 素における、および／または乳酸合成に必要な酵素をコードする構造遺伝子に機 能しうる形で連結したプロモーターにおける遺伝子的損傷を含みうる。好ましく は、乳酸合成経路における欠陥は乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｌ ｄｈ）における欠陥によるものである（例えば、ｌｄｈ構造遺伝子における欠陥 、および／またはｌｄｈ構造遺伝子に機能しうる形で連結したプロモーターにお ける欠陥）。乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）に欠陥を有するＳ．ミュータンス は、ＬＤＨ株と呼ばれる。 乳酸合成経路における欠陥は、突然変異誘発（すなわち、細菌の突然変異原へ の暴露）、自然突然変異体の選択、または組換え技法を用いた遺伝子操作によっ て導入することができる。先に論じたように、これらの技法のそれぞれは当分野 で周知である（例えば、Sambrookら、前出参照）。好ましくは、乳酸合成経路に おける欠陥は組換え技法を用いて導入される。例えば、欠陥ｌｄｈ構造遺伝子を 細菌に導入し、その後部位特異的組換えにより野性型ｌｄｈを欠陥ｌｄｈと置換 する。Ｓ．ミュータンスｌｄｈ遺伝子はクローン化され、そのヌクレオチド配列 は決定され(GenBank受託番号 M72545)、そして組換えｌｄｈ遺伝子は大腸菌にお いて発現されている(Duncanら，1991，Infect．Immun.，59:3930-3934; Hillman ら，1990，Infect．Immun.，58:1290-1295、これらはそれぞれ参考として本明細 書に組み入れている)。栄養要求性組換えＳ．ミュータンス株の作製 口腔に定着している組換えＳ．ミュータンスを宿主から放逐することが望まし くなった場合には、感染している組換えＳ．ミュータンス株は好ましくは栄養要 求株である。「栄養要求株」とは、増殖するために炭素源の他に特定の有機物源 を必要とする細菌である。例えば、「D-アラニン栄養要求株」とは、D-アラニン の源がなければ増殖できない細菌である。栄養要求株は必要な有機物の不在下で でしばしば短期間存続する（すなわち、増殖せずに生き残る）が、栄養要求株の 定着の維持は該有機物の定期的な補充を必要とする。 例えば、D-アラニン栄養要求細菌は増殖し、そして口腔等の生態的場における 定着を維持するため、定期的なD-アラニンの補充を必要とする。哺乳動物は普通 D-アミノ酸を生産しないので、そしてD-アラニンは正常な微生物叢の生物によっ て普通は選択されないので、D-アラニン栄養要求株は宿主の口腔の正常な環境か らD-アラニンを獲得することはできない。したがって、本発明の治療法における 栄養要求株の使用は、特定の有機物の補充（例えは、D-アラニン補充）を止める ことによって組換えＳ．ミュータンスによる口腔定着を妨げることができるとい う利点を提供する。 栄養要求細菌株は、化学的突然変異誘導、自然突然変異体の選択、および／ま たは組換え技法等の当分野で周知の種々の技法を用いて作製することができる（ 例えば、トランスポソン突然変異誘発、組換えによる欠陥性または非機能性遺伝 子との置換、等）（例えば、Sambrookら、前出参照）。好ましくは、栄養要求Ｓ ．ミュータンス株は、自然突然変異体の選択または組換え法（例えば、D-アミノ 酸合成経路への欠陥の導入）によって作製される。好ましくは、D-アラニン栄養 要求Ｓ．ミュータンス株は、アラニンラセマーゼ（L-アラニンをD-アラニンに変 換する酵素）をコードする遺伝子に欠陥を導入することにより作製される。幾つ かの異なる細菌のアラニンラセマーゼをコードする遺伝子がクローン化されてい る〔バシラス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)，Taniz awaら，（1988）Biochem．27:1311-16; 枯草菌(Bacillus subtilis)，Ferrariら ，（1985）Biotechnol．(NY)3:1003-7;大腸菌、Lobocka，（1994）J．Bacteriol ．176:1500-10; ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)，Galakatosら，（19 86）Biochem．23:3255-60; およびネズミチフス菌、Wassermanら，（1984）Bioc hem．23:5182-7]。本発明の組換えＳ．ミュータンスを含有する医薬組成物 「医薬組成物」とは、本発明の組換えＳ．ミュータンスの、う蝕を発生しやす い患者への経口投与に適切な組成物である。一般に、本発明の医薬組成物は組換 えＳ．ミュータンス株および製剤学上許容される担体からなる。「製剤学上許容 される担体」とは、組換えＳ．ミュータンス株を宿主の口腔に運ぶためのヒビク ルを意味し、ここで該ビヒクルは細菌細胞および宿主細胞の両方の生存能と適合 する。本発明の生存可能な組換えＳ．ミュータンス株の投与に用いるのに適した 製剤学許容される担体は、当業者に周知である。製剤学上許容される担体の選択 は、投与される組換えＳ．ミュータンス株、該組換えＳ．ミュータンスを運ぶた めに使用される剤形を含む種々の因子に依存する。 本発明の組換えＳ．ミュータンス株と共に用いるのに適した製剤学上許容され る担体は以下のものを含むがそれらだけに限定されない。すなわち、緩衝化生理 食塩溶液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩溶液）、製剤学上許容される培養培地 〔例えば、ルリアブロス、脳−心臓注入ブロス(BHI)]、または該細胞の生存を維 持する他の溶液である。さらに、そのような製剤学上許容される担体は、水性ま たは非水性溶液、懸濁液、およびエマルジョンであってよい。生存可能な、また は凍結乾燥した細菌の経口投与に適する、種々の製剤学上許容される担体が当分 野で周知である（例えば、参考としてここに組み入れるRemington's Pharmaceut ical Sciences，第18版、Gennaro編、1990、Mack Publishing Co.，Easton，P A ：および生存可能なラクトバシルス属(Lactobacillus)細菌の経口投与のため の市販の製剤であるLACTINEX^TM参照）。 本発明の組換えＳ．ミュータンス株は経口投与に適した種々の組成物のうち任 意のものに製剤化できる。例えば、組換えＳ．ミュータンス株を、該株の培養物 から調製されたリオフィル(lyophil)または細胞ペーストとして投与するために 製剤化することができる。または、組換えＳ．ミュータンス培養物を直接口腔に 投与することができる。また、組換えＳ．ミュータンス株をうがい薬、練り歯磨 き、フロス、チューインガムまたはチュアブル錠の形で投与することもできる。 上記医薬組成物は、組成物中の細菌の生存能を維持するための栄養素を付加的 に含有することができる。該医薬組成物はまた、風味強化剤、着色剤、香料およ び該組成物の効果を損なうことなく口あたりを良くし、および／または患者の該 組成物受け入れを容易にする他の化合物も含有することができる。経口投与用製 剤の調製方法は、当分野で周知である（例えば、参考としてここに組み入れるRe mington's Pharmaceutical Sciences，第18版、前出参照）。本発明の栄養要求性組換えＳ．ミュータンスを維持するための組成物 組換え栄養要求性Ｓ．ミュータンス株による口腔定着は、該株が栄養要求する 有機物の定期的投与によって維持されねばならない。該有機物の長期的不在下で は、栄養要求株は増殖をやめ、そしてもはや持続的に口腔に定着できなくなる。 例えば、D-アラニンの不在下では、D-アラニン栄養要求株は弱まった細胞壁のた めに溶菌を経験する。本発明の治療法における栄養要求性組換えＳ．ミュータン スの使用は、何らかの望ましくない副作用が生じた場合に該細菌株を排除するた めの「フェイルセイフ(fail safe)」機構を提供する。しかし、本発明の組換え Ｓ．ミュータンスは、普通口腔に定着している固有のＳ．ミュータンス株と類似 しているので、望ましくない副作用の可能性は低い。 本発明の栄養要求性組換えＳ．ミュータンス株による口腔定着の維持は、栄養 要求株を維持する量の、該細菌が栄養要求する有機物を経口投与することにより 実施できる。「栄養要求細菌株を維持する量」とは、栄養要求細菌株の口腔内に おける生存能を維持するに十分なある有機物の量を言う。例えば、組換えＳ．ミ ュータンスがD-アラニン栄養要求性である場合、「D-アラニン栄養要求細菌株を 維持する量」とは、D-アラニン栄養要求細菌株の宿主口腔内における生存に十分 な量のD-アラニンを意味する。一般に、D-アラニン栄養要求細菌株を維持する量 のD-アラニンの１回の投与量は、約１〜100 mg、好ましくは約5 〜75 mg、より 好ましくは約10〜50 mg、さらに好ましくは約20〜25 mgのD-アラニンを含む。溶 液形態の医薬組成物中のD-アラニンの濃度は約 0.01 mg/mlから167 mg/ml（後者 は25℃の水に溶解したD-アラニンの飽和溶液である）、好ましくは約 0.1 mg/ml から50 mg/ml、より好ましくは約1 mg/mlから25 mg/mlである。医薬組成物中のD -アラニンの濃度は、用いられる担体、および該特定の担体中におけるD-アラニ ンの飽和点によって変わりうる。 口腔内の栄養要求性組換えＳ．ミュータンスの維持に必要な有機物は、種々の 方法で製剤化できる。例えば、組換えＳ．ミュータンスがD-アラニン栄養要求性 である場合、D-アラニン栄養要求株の維持のための組成物はうがい薬、チューイ ンガム、フロス、練り歯磨き、チュアブル錠、または宿主口腔への経口投与に適 する他の任意の剤形に製剤化できる。有機化合物（例えば、D-アラニン）の他に 、該組成物は風味強化剤、着色剤、香料および該組成物に含まれる有機物の効果 を損なうことなく口あたりを良くし、および／または患者の該組成物受け入れを 容易にする他の化合物も含有することができる。 本発明の組換えＳ．ミュータンス株の経口投与および、所望の場合には、口腔 内での該株の維持のために製剤される医薬組成物は、口腔および口腔に定着して いる任意の望ましい正常な細菌叢に本来備わった特徴の範囲内で開発されねばな らない。経口投与に適した製剤の調製方法は当分野で周知である（例えば、参考 としてここに組み入れるRemington's Pharmaceutical Sciences，第18版、Genna ro 編、1990、Mack Publishing Co.，Easton，PA 参照）。投与 本発明の組換えＳ．ミュータンス株は、う蝕を発生しやすい任意の宿主に、好 ましくはＳ．ミュータンスがその口腔に定着できる宿主に、好ましくは哺乳動物 宿主（例えば、ヒト、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、等）、より好ましくはヒト宿 主に投与することができる。組換えＳ．ミュータンス株は、子供、青春期、大人 等の如何なる年齢の宿主にも投与できる。 本発明の組換えＳ．ミュータンス株は種々の方法で経口投与することができる 。例えば、組換えＳ．ミュータンス株を懸濁物、チュアブル錠、丸薬、カプセル 、持続性放出剤（例えば、組換えＳ．ミュータンス株を含有する口腔インプラン ト）またはリオフィル粉末の形で投与することができる。また、組換えＳ．ミュ ータンス株は、リオフィル、培養物、または細胞ペーストを患者の歯に直接適用 することによって投与することも可能である。治療組成物が口腔に適用される限 り、どの投与様式も適切である。好ましくは、組換えＳ．ミュータンスは、患者 の歯に細菌細胞懸濁物を直接適用する（例えば、ブラシで塗ってフロッシングす る）ことによって投与される。 一般に、患者に投与される組換えＳ．ミュータンスの量は、宿主の口腔内のう 蝕発生性Ｓ．ミュータンス株を置換するのに有効な量である。「宿主の口腔内の う蝕発生性Ｓ．ミュータンス株を置換するのに有効な量」とは、組換えＳ．ミュ ータンス株による口腔定着、および既存の乳酸生産性、う蝕発生性Ｓ．ミュータ ンス株の排除（例えば、細菌間の栄養素に対する競合および／または組換えＳ． ミュータンス株によるバクテリオシンの生産による）に有効な量である。「単位 用量」という用語は、本発明の医薬組成物に言及して使用された場合、患者への 単位剤形として適した物理的に別個の単位をいう。各単位は、必要な希釈剤（担 体またはビヒクル）と共に、所望の治療効果を奏するようにあらかじめ定められ た量の活性物質を含有する。 具体的用量は、患者の大きさ、体重、年齢、疾患の重篤度（例えば、乳酸生産 性、う蝕発生性既存Ｓ．ミュータンスの執着性または数）および療法への応答性 （例えば、宿主口腔の定着しやすさ）を含む患者の変数によって変わりうる。適 切な投与経路および用量は、一般に担当の歯科医または他の臨床家によってケー スバイケースで決定される。このような決定は当業者にとって決まりきったもの である（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版、Gennaro 編 、Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990 参照）。 一般に、患者に投与される組換えＳ．ミュータンスの数は、約10²から10¹⁵個 の細菌、好ましくは約10³から10¹⁴個の細菌、より好ましくは約10⁵から10¹²個の 細菌、普通は約10¹¹個の細菌である。投与に適切な用量は、動物モデルにおける 口腔定着（例えば、ラットの口腔へのＳ．ラッスの定着）に十分なストレプトコ ッカス属種の量から容易に外挿できる。適切な用量は、バクテリオシン生産Ｓ． ミュータンスJH1000株または種々のレベルのバクテリオシン活性を発現するその 変異体によるヒトロ腔定着に適切であると判明した用量から、推定することも可 能である（参考としてここに組み込むHillmanら，1987，J．Dent．Res.，66:109 2-0194 参照）。 組換えＳ．ミュータンス株の多数回投与を行なって該株の口腔定着および宿主 の既存のう蝕発生性Ｓ．ミュータンス株の置換を達成することができる。一般に は、本発明の組換えＳ．ミュータンス株は患者に１回投与するだけでよい。組換 えＳ．ミュータンス株が栄養要求株である場合は、適切な有機物を含有する組成 物を投与することにより該株の定着を維持しなければならない。例えば、組換え Ｓ．ミュータンス株がD-アラニン栄養要求株である場合、持続的な口腔定着のた めにD-アラニンを投与しなければならない。D-アラニンまたは他の適切な有機物 は一般に少なくとも週１回、好ましくは少なくとも１日１回、より好ましくは少 なくとも１日２回投与され、患者の日常的な歯の手入れの一部として、例えば練 り歯磨き、フロスまたはうがい薬の成分として投与することができる。 組換えＳ．ミュータンス株による上首尾な宿主の口腔定着は、患者の口腔の細 菌を培養し、該組換え株を例えば、組換えＡＤＨ生産、バクテリオシン生産、Ｅ ＬＩＳＡ、選択ｐＨインジケーター培地上での増殖、または当分野で周知の他の 細菌株同定方法によって同定することにより確立することができる。 以下の実施例は本発明を説明するものであって、限定するものではない。それ らは使用されるであろう手順の典型であるが、代わりに当業者に公知の他の手順 を用いてもよい。実施例 実施例１．材料および方法 細菌株、プラスミド、および増殖条件 Ｓ．ミュータンスCH4ts 株の作製(Chenら，1994，J．Bacteriol.，176:1542-1 545)およびＳ．ミュータンスNG8 株の単離(Leeら，1989，Infect．Immun.，57:3 306-3313)は以前に記述されている。クローン化に用いた大腸菌株DH5αは広く入 手可能である。クローン化チモモナス・モビリスピルビン酸デカルボキシラーゼ (PDC)遺伝子を含むプラスミドpLO1276（Conwayら，1987，J．Bacteriol.，169:9 49-954）、クローン化Ｚ．モビリスアルコールデヒドロゲナーゼII(adh)遺伝子 を含むプラスミドpLO1286（Conwayら，1987，J．Bacteriol.，169:2591-2597） 、クローン化Ｓ．ミュータンスspaP遺伝子を含む、pCR2に基づくプラスミドpCR3 -8（Conwayら，1995，J．Dent．Res.，74:要約第1511）、およびＳ．ミュータン ス由来のテトラサイクリン耐性遺伝子を含むプラスミドpVA981（Tobianら，1984 ，J．Bacteriol.，160:556-563）の構築は以前に記述されている。上に引用した 文献のそれぞれは、上記プラスミドの構築および上記菌株の作製または単離の記 述を参考としてここに組み入れてある。 CH4ts のバッチ培養物および連続培養物を、0.5%トリプトンおよび1%グルコー スを補充したCarlssonの規定培地(Carlssonら，1970，Caries Res.，4:297-304) 中で増殖させた。ＡＤＨ活性のアッセイ用の細胞は、1%グルコースを補充したTo dd-Hewittブロス中で増殖させた。適切な場合には、アピシリン(50μg/ml)、テ トラサイクリン(10μg/ml)およびエリスロマイシン(5μg/ml)を用いた。培養物のアッセイ バッチおよび連続培養物のサンプルを指示された時点で除去し、それらのｐＨ および550 nmにおける吸光度を測定した。4 ℃で遠心して細胞を除去し、得られ た細胞を含まない液体をグルコース、エタノールおよび乳酸について酵素的に(S igma Chemical Co.，St．Louis，MO)アッセイし、またアセトインについてガス −液体クロマトグラフィー(Hillmanら，1987，Infect．Immun.，55:1399-1402) によりアッセイした。リン酸緩衝化生理食塩溶液（ＰＢＳ）を用いた遠心により 細胞ペレットを１回洗浄し、化学的にアッセイして(Friedmannら，1957，S.P．C olowick and N.O．Kaplan(編)，Methods in Enzymology，Academic Press，Inc. ，New York，p.414-418)細胞内ピルビン酸濃度を測定した。数字として示すデ ータは、２回の実験の平均値である。アルコールデヒドロゲナーゼ活性のアッセイ 大腸菌およびＳ．ミュータンス株の200 mlの一晩培養物由来の細胞を4 ℃で遠 心して回収し、100 mM KPO₄緩衝液(pH 8.5)を用いて２回洗浄した。細胞ペレッ トを1 mlの緩衝液に再懸濁し、15,000 psiでフレンチプレスを通過させることに より破壊した。4 ℃で30分間遠心することにより細胞破砕物を除去した。細胞を 含まない抽出物を氷上に保ち、Nealeらの方法(Nealeら，1986，Eur．J．Biochem .，154:119-124)に従って、エタノールのＮＡＤ依存性酸化についてアッセイし た。乳酸デヒドロゲナーゼ活性のアッセイ ＬＤＨ活性アッセイを以前に記述されたように実施した(Hillmanら，1990，In fect．Immun.，58:1290-1295)。すなわち、ＬＤＨ活性を、分光光度計を用いて3 40 nmで測定したフラクトース-1,6- ジホスフェート（ＦＤＰ）およびピルビン 酸に依存するＮＡＤＨの酸化としてアッセイした。反応混合物は、最終容量1 ml 中に100 μmolのリン酸カリウム、pH 6.2、0.2 μmolのＮＡＤＨ、10μmol のピ ルビン酸ナトリウムおよび1-5 μlの試験すべきサンプルを含有していた。活性 のバックグラウンドレベルを１分間測定し、次に20μmolのＦＤＰの添加によっ て反応を開始させた。実施例２：Ｓ．ミュータンス中で発現させるためのチモモナス・モビリスａｄｈ 構造遺伝子のクローン化 プラスミドpADHは、Ｓ．ミュータンスspaP遺伝子の調節配列に融合させたＺ． モビリスのａｄｈオープンリーディングフレームを含む。pADHは、まずプラスミ ドpCR3-8を SacI およびDraIIIで消化し、次に消化されたＤＮＡをマングビーン (mung bean)ヌクレアーゼで処理し、プロモーター、リボソーム結合部位、およ びオープンリーディングフレームの5'末端の52塩基を除く全spaP遺伝子を除去し た。直鎖状にしたpCR3-8プラスミドの4.2 kb断片をアガロースゲル電気泳動によ り回収した。 ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）を用いて、翻訳開始コドン(ATG )およびプラスミドpLO1286由来の１個の付加的(G)塩基を除くＺ．モビリスａｄ ｈ遺伝子の全オープンリーディングフレームを増幅した。上記ＰＣＲには、フォ ワード（5’CTTCTTCAACTTTTTATATTCCTTTGG（配列番号３））およびリバース（5 ’CGGAGGCATTGTTTG（配列番号４））合成プライマーを用いた。増幅した断片を アガロースゲル電気泳動により回収し、マングビーンヌクレアーゼおよびポリヌ クレオチドキナーゼで処理し、上記pCR3-8断片に連結してspaPとの翻訳融合物を 形成した。得られたプラスミドpADHを使用して大腸菌DH5α細胞を形質転換した 。DH5αの形質転換体を、アンピシリンを含有するＬＢ培地上で選択した。pADH 挿入配列の適切なサイズおよび配向を制限酵素分析によって確認した。 Ｓ．ミュータンス中にクローン化する準備において、Ｓ．ミュータンス由来の テトラサイクリン耐性遺伝子を含むプラスミドpVA981（Tobianら，1984，J．Bac teriol.，160:556-563）の3.5 kb HincII断片を pADH のScaI部位に挿入するこ とによって、pADHをpADH-tetに変換した。pADH-tet構築物を用いてDH5αを形質 転換し、テトラサイクリンを含有するルリアブロス(LB)上で選択した形質転換体 をアンピシリンへの感受性について試験した。次に、PerryおよびKuramitsuの方 法(Perryら，1981，Infect．Immun.，32:1295-1297)を用いて、Ｓ．ミュータン スをpADH-tetで形質転換した。実施例３：バッチ培養におけるCH4ts およびNG8 の増殖に及ぼすグルコース濃度 の効果 CH4ts(ldh^ts)およびその親株であるＳ．ミュータンスNG8 の一晩バッチ培養物 を30℃で増殖させた。CH4ts は乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の温度感受性突 然変異を有する。CH4ts のＬＤＨは30℃では野性型のように挙動するが、培養温 度が42度に変わると、その熱不安定なＬＤＨは不活性となる。したがって、この 細菌株は、実験がＳ．ミュータンスのＬＤＨ突然変異体の致死性におけるＬＤＨ の役割を決定するのを可能とする。洗浄した細胞を、グルコースを含む、および 含まない新鮮な培地を用いて１：1000に希釈し、42℃の水浴中でインキュベート した。図２（パネルＡ）に示す各時点で、サンプルを脳心臓注入(BHI)(brain he art infusion)プレート上に広げ、プレートを30℃でインキュベートすることに より生菌数を測定した。結果は、グルコースの不在下（点線）では、CH4ts（白 抜き三角）およびNG8（白抜き丸）は同じ挙動をしたこと；および増殖が３時間 後に停止し、ゆっくりした細胞死が続いたことを示している（半減期＝23.5時間 ）。しかし、親株（白抜き四角）とは異なり、CH4ts（白抜き丸）はグルコース の存在下（実線）に置かれて３時間以内に増殖を停止し、加速した細胞死を経験 した（半減期＝12.1時間）。この相違は、突然変異体におけるピルビン酸の高い 細胞内濃度の蓄積に一時的に相関していた（図２、パネルＢ参照）。実施例４：連続培養におけるCH4ts およびNG8 の増殖および最終産物濃度に及ぼ すグルコースおよび温度の効果 ケモスタットの反応器中で30℃でCH4ts を飽和するまで増殖させた。培養物の 温度を42℃に移行させる前に、希釈率0.1 hr^-1をもたらす培地流入量を72時間維 持した。３時間以内に理論ウォッシュアウト率に等しい率で細胞密度が減少しは じめ、細胞増殖の停止を示した（図３参照）。これは、反応器中で観察されたグ ルコース濃度の増加と相関していた。 希釈率0.006 hr^-1を用いて連続培養実験を繰り返したところ、温度を42℃に変 化させた時にCH4ts の安定した増殖が達成された（図４参照）。該温度変化の直 後に、乳酸濃度は予想されたウォッシュアウト率に一致して減少した。乳酸生産 の停止は、エタノールおよびアセトインの生産を伴い、連続培養物のｐＨの段階 的な増大をもたらした。実験を通じて、グルコース濃度は検出不可能なままであ った。 これらのデータは、42℃におけるCH4ts の安定した増殖が、グルコース制限条 件下の連句培養において達成できることを示している。グルコース制限条件下で は、乳酸生産のかわりにエタノールおよびアセトインの生産が増大したという点 で、CH4ts は化学的に誘導したＳ．ラッスのＬＤＨ欠損突然変異体のように挙動 した(Hillmanら，1987，Infect．Immun.，55:1399-1402)。これらの結果は、Ｓ ．ミュータンスはピルビン酸代謝のための調節された、別の経路を持つと指摘す る、発酵および酵素学的研究と一致する。培養の適切な条件下では、野性型Ｓ． ミュータンスは乳酸に加えてかなりの量のギ酸、酢酸、エタノールおよびアセト インを生産する(Yamadaら，1975，J．Bacteriol.，124:55-61; Hillmanら，1987 ，Infect．Immun.，55:1399-1402)。しかし、これらの別の経路はＬＤＨ活性の 不在を埋め合わせるには明らかに不充分である。実施例５：ＡＤＨの生産はＳ．ミュータンスのＬＤＨ^-致死性を救う Ｓ．ミュータンス spaP 調節配列に融合させたＺ．モビリスａｄｈオープンリ ーディングフレームを含むpADHを用いて形質転換した大腸菌DH5α株は、クロー ン化されたＡＤＨの活性を発現した（比活性：6.95μmol/分/mg タンパク質）。 この結果は、spaPプロモーターおよびリボソーム結合部位(rbs)は大腸菌中で活 性であることを示す以前に公表されたデータと一致した(Leeら，1988，Infect． Immun.，56:2114-2119)。このＡＤＨ活性のレベルは、Ｚ．モビリス由来の元の クローン化ａｄｈ遺伝子および調節領域を含むpLO1286 を用いて形質転換したDH 5αにおいて見いだされたレベル（比活性：41.8μmol/分/mg タンパク質）の約1 7% であった。pVA981（pADH-tet）由来のテトラサイクリン耐性遺伝子の挿入に よるpCR2骨格上のアンピシリン耐性遺伝子の中断は、ＡＤＨ活性レベルに影響を 与えなかった。 １μｇ のpADH-tetを用いてCH4tsを形質転換した。キャンベル型組換えはspaP ::adh 融合をCH4ts の染色体に組み込んだ。挿入部位は同定されていないが、sp aPまたは内因性adh 遺伝子によって提供される相同領域にある可能性が高い。形 質転換CH4ts は、テトラサイクリンを含有する培地上での42℃における増殖によ って選択された。生じた数百のクローンから得た、CH4ts::adhと称する１個の精 製された単離株はその野性型親株の親株(grandparent)NG8（比活性：<1.0μmol/ 分/mg タンパク質）よりも実質的に高いＡＤＨ活性（比活性：60.43μmol/分/mg タンパク質）を示した。 CH4ts::adhおよびNG8 を、2%グルコースを補充したTodd-Hewittブロス中で42 ℃で48時間増殖させた。細胞を含まないCH4ts::adhの培養液は、NG8 の培養液(p H 4.0 およびエタノール含有量 <1 mM)よりも有意に高いｐＨ(4.7)およびエタノ ール含有量(21.60 mM)を有していた。より高い(5、10または20%)濃度のグルコー スを用いた場合も同一の結果が得られた。 0.5%トリプトンおよび種々の炭素源を1%の割合で補充した規定培地における42 ℃でのCH4ts::adhの増殖を、NG8 の増殖と比較した（表１参照）。 グルコース、ラクトースまたはスクロースが炭素源として働いた場合は、増殖 速度および細胞収量はほぼ同等であった。ガラクトース、ソルビトールまたはマ ンニトールが炭素源として働いた場合は、CH4ts::adhはNG8 よりも実質的に短い 倍加時間およびより高い収量を有した。どの炭素源を用いて増殖させた場合も、 CH4ts::adhの培養液には乳酸は全く検出されなかった。そして、エタノールがNG 8 の培養液に見いだされるよりもはるかに大量に存在していた。 これらのデータは、組換えＳ．ミュータンス株CH4ts::adhが、同一の増殖条件 下で、NG8 野性型対照株よりも実質的に高いレベルのＡＤＨ活性を示したことを 示す。さらに、CH4ts の形質転換体は非許容温度で増殖し、クローン化ＡＤＨ活 性がＬＤＨ欠損によって引き起こされた代謝遮断を回避したことを示した。 これらのデータはさらに、グルコース、ラクトースまたはスクロースが唯一の 炭素源として働いた場合は、CH4ts::adhおよびNG8 の増殖速度および増殖収量が 類似していることを示す。しかし、好気性条件下でマンニトールおよびソルビト ールを使用した場合には両方ともNG8 の増殖は不十分であったが、CH4ts::adhは よく増殖した。この結果は、クローン化ＡＤＨ活性がポリオール代謝の間に発生 した過剰な電子の適切なシンク(sink)として役立つに十分なエタノール生産をも たらしたことを示す。NG8 はガラクトースを用いた場合も増殖が不十分であった 。Ｓ．ミュータンス中でタガトース6-リン酸経路を経て代謝されるこの炭素源を 用いた場合、何故CH4ts::adhがNG8 よりも良く増殖するのかは、特にラクトース を用いた場合これら細菌株の増殖が同等であったため、不明である(Hamiltonら ，1979，J．Bacteriol.，140:1102-1104)。実施例６：ピルビン酸デカルボキシラーゼの生産はＳ．ミュータンスのＬＤＨ^- 致死性を救わない ＬＤＨ欠陥がピルビン酸デカルボキシラーゼの生産によって救われうるかどう かを確認するため、実施例２〜５に記述した試験と類似の試験を実施した。Ｚ． モビリス由来のピルビン酸デカルボキシラーゼ（pdc）遺伝子(Conwayら，1987， J．Bacteriol.，169:949-954)をspaPに融合させ、Ｚ．モビリスadh 遺伝子につ いて記述したように自殺ベクターを用いてCH4tsに導入した。テトラサイクリン 耐性で、ＰＤＣを発現する形質転換体を単離し、上記のように非許容温度42℃で 増殖について試験した。クローン化ＰＤＣ活性を発現するＬＤＨ^-Ｓ．ミュータ ンスは、上記非許容温度では増殖しなかった。これらの結果は、Ｓ．ミュータン スにおけるＬＤＨ^-欠陥の致死性は、ＰＤＣの生産によって救うことができない ことを示す。さらに、これらのデータは、Ｓ．ミュータンスのＬＤＨ欠損突然変 異体におけるピルビン酸代謝において、ＡＤＨ濃度は飽和状態でないことを示す 。実施例７：JH1000および増大したレベルのバクテリオシン活性を奏するJH1000変 異体の単離 Ｓ．ミュータンスJH1000の単離はすでに記述されている（Hillman ら，1984， Infect．Immun.，44:141-144）。簡単に述べると、JH1000は115 被験者から得た Ｓ．ミュータンスの新しい単離株から、バシトラシンを含有するミティスサリバ リウス(mitis salivarius)寒天を用いて同定された。JH1000は遅延拮抗作用アッ セイにおいて他のＳ．ミュータンス株のすべて、および多数かつ種々の実験室株 の増殖を阻止した。証拠(Hillmanら，1984，Infect．Immun.，44:141-144)は、J H1000が今特徴づけを行なおうとしている、小さい(1,000 Da 未満)、抗生物質に 類似した、バクテリオシン様の化合物を生産することを示している。この化合物 をＳ．ミュータンスバクテリオシンと名付ける。微生物学的および血清学的アッ セイが、JH1000はＳ．ミュータンス種の代表的なものであることを確認した。天 然に存在するものであれ、化学的突然変異誘発によって作製されたものであれ、 バクテリオシンのキリング(killing)特性に耐性であるバクテリオシン感受性株 の変異体はこれまで同定されていない。この結果は、殆どの抗生物質と違って、 耐性の野性型（疾患を引き起こす）株による重感染の危険が最少であることを示 している。 当分野で周知の方法にしたがって、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）を用い てJH1000株を化学的突然変異誘発にかけた(Hillmanら，1978，Infect．Immun.， 21:206-212)。JH1005は、JH1000の典型的なＥＭＳ誘導変異体である。試験すべ き細菌株のブロス培養物を８時間以上増殖させることによって、増大したレベル のバクテリオシンを生産する変異体を同定した。培養物を遠心して細菌細胞を除 去し、培養上清の20μlのサンプルをマイクロタイタープレートのウエルで連続 希釈した。標的細菌株(通常はＳ．ラッスBHT-2，Str^R)を含有する100 μlのトッ プアガー(Top agar)および1 mg/mlのストレプトマイシンを各ウエルに添加した 。一晩インキュベーションした後、インジケーター細菌株の増殖を阻止した最低 希釈物を確認した。 この上に載せる方法を用いて、約３倍増大したレベルのバクテリオシンに類似 した活性を奏する、JH1000のＥＭＳに由来する(JH1005)および自然発生の(JH114 0)変異体が見いだされた。JH1000およびJH1000変異体は乳酸を生産し、したがっ てう蝕の予防および／または治療のための置換療法には適さない。実施例８：Ｓ．ミュータンスJH1000変異体によるヒト口腔への定着 増大したバクテリオシン活性を有するJH1000変異体による謡歯類およびヒトロ 腔への定着が記述されている(Hillmanら，1987，J．Dent．Res.，66:1092-1094) 。簡単に述べると、標準的歯科予防処置およびそれに続いて約10¹¹個のJH1000細 菌またはJH1000変異体細菌を含有する細胞懸濁物をブラシで塗りフロッシングす ることを含む感染法を用いて、JH1000またはJH1000変異体をヒトボランティアの 歯に塗った。 バクテリオシン活性のレベルおよび口腔に定着する能力は、強く相関していた 。JH1005株による感染後１年以上の期間にわたって、固有のストレプトコッカス ・ミュータンスは徐々にJH1005によって置換された。さらに、試験した３人の被 験者の２人において、全ストレプトコッカス・ミュータンス数は有意に減少した 。実施例９：トランスポゾン突然変異誘発Ｓ．ミュータンス株を用いたＳ．ミュー タンスの組換え突然変異体の作製 プラスミドpTV1-OK は、Ｓ．ミュータンスおよび大腸菌の両方における条件的 複製のための、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)プラスミドpW V01(Leenhoutsら，1991，Plasmid，26:55-66)のrepA(ts)誘導体である。該プラ スミドは、Ｓ．ミュータンスおよび大腸菌の両方において発現される、プラスミ ド骨格上のカナマイシン耐性遺伝子、およびＳ．ミュータンスにエリスロマイシ ン耐性を付与するトランスポゾンTn917 を有する。 pTV1-OK プラスミドをＳ．ミュータンスJH1005に導入し、カナマイシンを含有 するＢＨＩ寒天上で28℃で形質転換した細胞を選択した。1 mgのpTV1-OK ＤＮＡ を用いたJH1005の形質転換は、４個のカナマイシン耐性形質転換体をもたらした 。これは以前の実験による形質転換頻度と一致している（Hillmanら，Infect．I mmun.，62:60-64）。Camilliら(1990，J．Bacteriol.，172:3738-3744)が記述す るように、温度変化(45℃)によって、宿主染色体ＤＮＡ中のTN917 挿入物の独立 したプールを作製した。すなわち、許容温度(28℃)でカナマイシンの存在下で増 殖させた飽和培養物を1/50または1/100継代培養した。温度を45℃に変化させ、 一晩インキュベートした後、選択濃度のエリスロマイシンを含有するＢＨＩ寒天 上にサンプルを播くことにより、宿主染色体中のTN917 挿入物を単離した。10⁹ 全コロニー形成単位のうち10⁵がこの抗生物質に対する耐性を保持していること が判明した。100個のランダムに選択したエリスロマイシン耐性コロニーのうち9 0個が、レプリカパッチングによってカナマイシン感受性であることが示された 。この発見は、エリスロマイシン耐性クローンの90% は、同時に起こったpTV1-O K の喪失およびTn917 のJH1005染色体中への転位の結果であることを示した。ラ ンダムに選択したエリスロマイシン耐性突然変異体のサザンブロット分析は、Tn 917 転位はランダムで単一の染色体挿入をもたらしたことを示唆した。サザンブ ロット分析はまた、10% のエリスロマイシン耐性／カナマイシン耐性クローンが 、全pTV1-OK プラスミドをJH1005染色体に組み込んだレプリコン融合の結果であ ることを示した。 カナマイシン感受性クローンの独立プールを、バクテリオシン生産、1%グリシ ンへの感受性、酸感受性、マンニトールを用いた場合またはD-アラニン補充の不 在下では嫌気性条件下で増殖できないこと、についてスクリーニングした。各カ テゴリーの突然変異体は１〜２ｘ１０^-3の頻度で単離された。 ２つのバクテリオシン欠損突然変異体のサザンブロット分析は、バクテリオシ ン生産に関与する少なくとも２個の連結していない遺伝子、および酸感受性に関 与する少なくとも３個の連結していない遺伝子座の存在を示した。JH1005におい て単離されたTn917 誘導酸感受性アレレを天然形質転換を介してNG8 への導入す ると、該トランスポゾン（エリスロマイシン耐性をコードする）は突然変異表現 型と共に高い頻度で同時遺伝した。この結合は、Tn917 によって誘導される損傷 は突然変異表現型に関与していることを示す。Tn917 突然変異体のプールは、温 度変化後の類似した転位頻度およびプラスミド喪失の効率を有する、天然におい て形質転換可能な細菌株NG8 を用いても得られた。 バクテリオシン生産に関与する１個の遺伝子を、マーカー救助技法を用いて大 腸菌中にクローン化した。突然変異体由来の染色体ＤＮＡをEcoRI を用いて完全 消化し(Tn917の中は切断しない)、pUC19 のマルチクローニング配列のEcoRI 部 位に連結した。このライブラリーをMC1061中に導入し形質転換して、アンピシリ ン耐性について選択した。生じたコロニーをエリスロマイシンを含有する培地上 に複製した。生じた２個のクローンが、ドットブロット分析においてTn917 プロ ーブと反応したプラスミドＤＮＡを含むことが示された。これらのプラスミドは 、Tn917 のエリスロマイシン近位末端およびエリスロマイシン遠位末端から外側 へ読み進むプライマーを用いて、現在配列決定されつつある。 これはＳ．ミュータンスおよび口腔ストレプトコッカス菌におけるTn917 突然 変異誘発の上首尾な使用である。pTV1またはpLTV3 等の構築体を用いた以前の失 敗は(Youngman，1987，Plasmids: A Practical Approach，Hardy編，IRL Press ，Oxford，pp．79-103; Camilliら，1990，J．Bacteriol.，172:3738-3744)は、 Ｓ．ミュータンス中でプラスミド骨格が複製できなかったことに起因した。ラク トコッカスのレプリコンpWV01Ts の複製機能を用いると、pTV1-OK は許容温度で はＳ．ミュータンス中に安定に維持され、それによって非許容温度でTn917 転位 が起こるのに十分な機会を提供することが判明した。したがって、上記の方法は 本発明に用いる栄養要求性Ｓ．ミュータンス株、および他のＳ．ミュータンス由 来の、所望の表現型を有する株の作製に用いることができる。実施例10: ＬＤＨ^-、ＡＤＨ⁺バクテリオシン生産Ｓ．ミュータンス株の構築 JH1000のldh 遺伝子は、クローン化され配列決定されている(Hillmanら、1990 ，Infect．Immun.，58:1290-1295; Duncanら，1991，Infect．Immun.，59:3930- 3934)。すなわち、ベクターとしてpBR322を用いて、JH1000 ldh遺伝子を大腸菌M C1061株中にクローン化した。JH1000から精製したＬＤＨタンパク質のアミノ末 端配列から推定したオリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーショ ンにより、ldh 遺伝子を含む１個のクローンp10-5 を同定した(Hillmanら、1990 ，Infect．Immun.，58:1290-1295)。これらの結果は、p10-5/MC1061形質転換体 の細胞を含まない粗抽出物においてJH1000 ＬＤＨ活性を示すことにより確認さ れた。クローン化ldh のヌクレオチド配列が決定され、その調節シグナルおよび オープンリーディングフレームが推定された。JH1000 ldh遺伝子の配列はGenBan k 受託番号M72545（記述LDH SM）より入手可能である。クローン化ldh 遺伝子は 、制限酵素HpaIを用いてp10-5 構築物を消化することにより不活性化してある。 これは、ldh オープンリーディングフレームからの510 塩基の除去をもたらし、 その結果永久的に該遺伝子を不活性化している。この消化物由来の、適切なサイ ズとなったＤＮＡ断片をアガースゲル電気泳動によって回収し、マングビーンヌ クレアーゼで処理して平滑末端とし、仔ウシ腸ホスファターゼと反応させて脱リ ン酸化した。 Ｚ．モビリスadh 遺伝子の全オープンリーディングフレーム（最初の３塩基の グアニジン残基との置換、およびオープンリーディングフレームの終わりへの翻 訳および転写コドンの付加を除く）をＰＣＲによって増幅する。ゲル精製の後、 この断片をマングビーンヌクレアーゼで処理して平滑末端とし、ポリヌクレオチ ドキナーゼと反応させてリン酸化する。この産物および上記のp10-5 産物を連結 し、大腸菌に導入してアンピシリン耐性に関する選択をおこなった。次に、精製 クローンの透過性にした細胞を、上記のようにＡＤＨ活性についてスクリーニン グした。次に、ＡＤＨ陽性クローン由来のプラスミドを精製し、制限酵素地図作 製によりチェックして遺伝子構築物を確認した。 このような遺伝子構築物の１個を、pBR322骨格上のアンピシリン耐性遺伝子を 除去し、pVA981由来のテトラサイクリン耐性遺伝子と置換することによりさらに 改変する。この構築物を用いてJH1140を形質転換し、形質転換体をテトラサイク リン含有培地で選択する。生じるヘテロ二倍体形質転換体を精製し、Todd-Hewit t ブロス中で一晩増殖させ、そして適切な希釈物をグルコーステトラゾリウム培 地上に播く。キャンドルジャー(candle jar)内で３日間インキュベートした後、 ＬＤＨの欠失を示す（または減少した酸生産を示す）赤色コロニーを単離し、推 定上のＬＤＨ欠損突然変異体として精製する。 形質転換体の表現型および遺伝子型を、２日齢ブロス培養物を乳酸およびエタ ノールについてアッセイすることにより、サザンブロット分析により、また無細 胞抽出物を上記のようにＬＤＨ活性について分光測光的にアッセイすることによ り確認する。これらの細菌株における乳酸生産は検出不可能であろうと予想され る。他方、培地のエタノール含有量は、1%以上のグルコースを含有するブロス中 で約25 mMであろうと予想される。これら形質転換体のＬＤＨ活性は、検出不可 能であろう予想される。 酸素の存在下および不在下で種々の炭素源を用いて、親株および形質転換体の 増殖を調べることにより、形質転換株をさらに特徴づけた。形質転換体は、世代 時間および細胞収量の点で親株と同等またはそれ以上に増殖することが予想され る。異なる増殖条件下における発酵最終産物を正確に評価するため、親株および 形質転換体をケモスタット培養でも増殖させた。形質転換株はすべての培養条件 下で検出可能な乳酸を全く生産せず、そして好気的インキュベーションの間にの み重大な量のアセトインを生産することが予想される。 該形質転換体がう蝕を発生させる可能性もまた、通常のおよび／または無菌の ラットを用いたう蝕のラットモデルにおいて測定される。該形質転換体は、事実 上非う蝕発生性であると予想される。他方、親株はう蝕病巣の高い発生率および 重症度を示すに違いない。形質転換体および親株の歯垢形成およびバクテリオシ ン生産もまたアッセイされる。 形質転換株が上記の予想を少なくとも最小限満たす（すなわち、乳酸生産が欠 損していて、非う蝕発生性である）場合、その形質転換体は本発明またはう蝕の 治療に用いるのに適した組換えＳ．ミュータンス株である。 以下の細菌株は1995年6 月7 日以前にAmerican Type Culture Collection，13 01 Parklawn Drive，Rockville，MD，USA(ATCC)に寄託された。 寄託 ATCC 受託番号 JH1000 受託番号 55677 JH1140 受託番号 55676 この寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約（ ブダペスト条約）に基づいてなされた。これは寄託の日から30年間、生存可能な 培養物の維持を保証するものである。上記細菌は、ブダペスト条約の規定に基づ いてATCCによって利用可能とされる。そして、出願人は当該米国特許の授与また は米国あるいは他の外国出願の公開のうちどちらが先であれ、その後に該培養物 の子孫を永久的かつ無制限に大衆に入手可能とすることを保証し、また35 U.S． C．§122 およびこれに準じる長官規則（特に886 OG 638に言及した37 CFR §1. 14を含む）によって米国特許商標庁の長官によって定められた者に該培養物の子 孫の利用可能性を保証する。本出願の譲受人は、適切な条件下で培養されて該培 養寄託物が死滅、紛失、または破壊された場合、通告があり次第、迅速に同一培 養物の生存可能なサンプルと取り換えることに同意した。寄託された細菌株の利 用可能性は、特許法に基づいて任意の政府の権威のもとに授与される諸権利に反 して本発明を実施することへの許可と解釈すべきではない。 本発明の前記記載は例示および説明を目的としたものである。本発明の精神お よび範囲から逸脱することなく、いろいろな改変が可能であることが理解されよ う。したがって、次の請求の範囲はこのような改変をすべて包含するものと解釈 すべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ａ）乳酸生産の欠陥、およびｂ）組換えアルコールデヒドロゲナーゼの生産 により特徴づけられる組換えストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)株。 ２．乳酸生産の欠陥が乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の欠損による、請求項１に記 載の菌株。 ３．組換えアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子がチモモナス・モビリス(Zymomon as mobilis)のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子である、請求項１に記載の菌 株。 ４．チモモナス・モビリスのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子がアルコールデ ヒドロゲナーゼIIをコードする、請求項３に記載の菌株。 ５．組換えアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子がストレプトコッカス・ラツス(S treptococcus rattus)のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子である、請求項１に 記載の菌株。 ６．バクテリオシンの生産によりさらに特徴づけられる、請求項１に記載の菌株 。 ７．バクテリオシンが１０００ダルトン未満の分子量を有し、バクテリオシン感 受性のストレプトコッカス・ミュータンス株に対する抗菌活性を有する、請求項 ６に記載の菌株。 ８．D-アラニン栄養要求株である、請求項１に記載の菌株。 ９．アラニンラセマーゼ遺伝子の欠損を含む、請求項８に記載の菌株。 10．JH1000またはその変異体に由来する、請求項１に記載の菌株。 11．１）乳酸生産の欠陥、２）組換えアルコールデヒドロゲナーゼの生産、およ び３）バクテリオシン感受性のストレプトコッカス・ミュータンス株に対する抗 菌活性を有するバクテリオシンの生産により特徴づけられる組換えストレプトコ ッカス・ミュータンス株。 12．ストレプトコッカス・ミュータンスJH1000またはその変異体である、請求項 11に記載の菌株。 13．ストレプトコッカス・ミュータンスJH1000と比べて増加したレベルでバクテ リオシンを生産するストレプトコッカス・ミュータンスJH1000変異体である、請 求項12に記載の菌株。 14．ストレプトコッカス・ミュータンスJH1000変異体がストレプトコッカス・ミ ュータンスJH1140またはその変異体である、請求項13に記載の菌株。 15．D-アラニン栄養要求株である、請求項11に記載の菌株。 16．アラニンラセマーゼの欠損を有する、請求項15に記載の菌株。 17．ATCC受託番号55677 を有するストレプトコッカス・ミュータンスJH1000。 18．ATCC受託番号55676 を有するストレプトコッカス・ミュータンスJH1140。 19．乳酸生産の欠陥および組換えアルコールテヒドロゲナーゼの生産により特徴 づけられる組換えストレプトコッカス・ミュータンス株の作製方法であって、 ストレプトコッカス・ミュータンス株をアルコールデヒドロゲナーゼをコー ドする遺伝子で形質転換し、そして 乳酸合成経路に突然変異を導入する、 ことを含んでなる方法。 20．乳酸合成経路における突然変異が乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の欠損である 、請求項19に記載の方法。 21．アルコールデヒドロゲナーゼがチモモナス・モビリスのアルコールデヒドロ ゲナーゼである、請求項19に記載の方法。 22．ストレプトコッカス・ミュータンス株がバクテリオシン感受性ストレプトコ ッカス・ミュータンス株に対して抗菌活性を有するバクテリオシンを生産する、 請求項19に記載の方法。 23．ストレプトコッカス・ミュータンス株がJH1000またはその変異体である、請 求項22に記載の方法。 24．ストレプトコッカス・ミュータンスJH1000変異体がストレプトコッカス・ミ ュータンスJH1140である、請求項23に記載の方法。 25．前記菌株がD-アラニン栄養要求株である、請求項19に記載の方法。 26．前記菌株がアラニンラセマーゼの欠損を有する、請求項25に記載の方法。 27．う蝕を発生しやすい宿主におけるう蝕の発生率または重症度を低下させる方 法であって、う蝕を発生しやすい宿主に、１）組換えアルコールデヒドロゲナ ーゼ遺伝子および２）乳酸生産の欠陥を有する組換えストレプトコッカス・ミュ ータンス株を、宿主の口腔内のう蝕を引き起こすストレプトコッカス・ミュータ ンス宿主株を置換するのに有効な量で経口的に投与することを含んでなる方法。 28．組換えストレプトコッカス・ミュータンス株がバクテリオシン感受性ストレ プトコッカス・ミュータンス株に対して抗菌活性を有するバクテリオシンを生産 する、請求項27に記載の方法。 29．乳酸生産の欠陥が乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の欠損による、請求項27に記 載の方法。 30．組換えアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子がチモモナス・モビリスのアルコ ールデヒドロゲナーゼ遺伝子である、請求項27に記載の方法。 31．チモモナス・モビリスのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子がアルコールデ ヒドロゲナーゼIIをコードする、請求項30に記載の方法。 32．組換えストレプトコッカス・ミュータンス株がD-アラニン栄養要求株である 、請求項27に記載の方法。 33．組換えストレプトコッカス・ミュータンス株がアラニンラセマーゼ遺伝子の 欠損を含む、請求項32に記載の方法。 34．組換えストレプトコッカス・ミュータンス株がうがい薬、練り歯磨き、チュ ーインガム、フロス、チュアブル錠、リオフィル(lyophil)または培地中に含ま れる、請求項27に記載の方法。 35．前記宿主に、宿主の口腔内の組換えストレプトコッカス・ミュータンス株を 維持するのに有効な量のD-アラニンを経口的に投与することをさらに含む、請求 項32に記載の方法。 36．D-アラニンがうがい薬、練り歯磨き、フロス、チューインガムまたはチュア ブル錠中に含まれる、請求項35に記載の方法。 37．１）組換えアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子および２）乳酸生産の欠陥を 有する組換えストレプトコッカス・ミュータンス株、および 製剤学上許容される担体、 を含有する、う蝕の発生率または重症度を低下させるための医薬組成物。 38．組換えストレプトコッカス・ミュータンス株がバクテリオシン感受性ストレ プトコッカス・ミュータンス株に対して抗菌活性を有するバクテリオシンを生産 する、請求項37に記載の組成物。 39．乳酸生産の欠陥が乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の欠損による、請求項37に記 載の組成物。 40．組換えアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子がチモモナス・モビリスのアルコ ールデヒドロゲナーゼ遺伝子である、請求項37に記載の組成物。 41．組換えストレプトコッカス・ミュータンス株がD-アラニン栄養要求株である 、請求項37に記載の組成物。 42．組換えストレプトコッカス・ミュータンス株がアラニンラセマーゼ遺伝子の 欠損を含む、請求項41に記載の組成物。 43．D-アラニンをさらに含有する、請求項41に記載の組成物。 44．風味強化剤をさらに含有する、請求項37に記載の組成物。 45．うがい薬、練り歯磨き、チューインガム、フロス、チュアブル錠、リオフィ ルまたは培地として製剤化された、請求項37に記載の組成物。 46．D-アラニン栄養要求細菌株を維持する量のD-アラニンを含有する、宿主の口 腔内のD-アラニン栄養要求細菌株を維持するための組成物。 47．D-アラニン栄養要求細菌株がD-アラニン栄養要求ストレプトコッカス・ミュ ータンス株である、請求項46に記載の組成物。 48．D-アラニン栄養要求細菌株を維持する量が約0.01 mg/ml〜167 mg/ml である 、請求項46に記載の組成物。 49．風味強化剤をさらに含有する、請求項46に記載の組成物。 50．うがい薬、練り歯磨き、チューインガム、フロスまたはチュアブル錠として 製剤化された、請求項46に記載の組成物。