JPH11507232A

JPH11507232A - 機能的ヒト２−５ａ系を同時発現するトランスジェニック植物

Info

Publication number: JPH11507232A
Application number: JP9502075A
Authority: JP
Inventors: シルバーマン，ロバート・エイチ; ミトラ，アミタヴァ
Original assignee: Cleveland Clinic Foundation
Current assignee: Cleveland Clinic Foundation
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 1999-06-29
Also published as: US5866787A; EP0836377A1; WO1996039806A1; CA2224004A1; AU6382796A; BR9608588A

Abstract

(57)【要約】機能的２−５Ａ系、即ち、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）に応答して５'−リン酸化した、２',５'−結合したオリゴアデニレート（２−５Ａ）を産生する２−５Ａシンテターゼ、並びに２−５Ａ依存性（ＲＮａｓｅＬ）を発現する能力を有する新規なトランスジェニック植物が開示される。新規なトランスジェニックタバコ植物などの、機能的２−５Ａ系を発現する新規なトランスジェニック植物は、ウイルス感染に対して免疫を有し、耐性である。この新規なトランスジェニックタバコ植物が、３種類の異なる植物ウイルス、即ち、ＴＭＶ、ＴＥＶおよびＡＩＭＶに露出する場合、そのようなウイルスへの露出により典型的な全身感染の代わりに、そのようなトランスジェニックタバコ植物では壊死性炎局所損傷が生じる。

Description

【発明の詳細な説明】機能的ヒト２−５Ａ系を同時発現するトランスジェニック植物関連出願米国特許のための本出願は、１９９３年３月８日に出願された米国特許出願番号０８／０２８，０８６の一部継続出願である１９９４年２月１８日に出願された米国特許出願番号０８／１９８，９７３の一部継続出願である。発明の分野本発明は、２−５Ａを結合および／または２−５Ａに結合した際に一本鎖ＲＮＡを切断する能力を有する単離された２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ、そのコード配列、組み換えヌクレオチド分子、組み換えベクター、組み換え細胞、例えば２− ５Ａ依存性ＲＮａｓｅ、２−５Ａシンテターゼおよび／またはＰＫＲと類似または同一の活性を有する抗ウイルス性アミノ酸配列を発現する抗ウイルストランスジェニック植物、並びに、例えば、タバコ腐食（etch）ウイルス（ＴＥＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）およびアルファルファモザイクウイルス（ＡＩＭＶ）に対する耐性を示す抗ウイルストランスジェニックタバコ植物に関する。背景ＲＮＡ分解の調節は重要な細胞機能であり、遺伝子発現はＲＮＡ安定のレベルで制御されることが多い。例えば、Sha，G．およびKamen R.，Cell，46:659-667 (1986)を参照。にも係わらず、哺乳類または植物系でのＲＮＡ分解を仲介する生化学的経路については比較的ほとんど知られていない。例えば、哺乳類または植物細胞中でのｍＲＮＡの回転の原因となるリボヌクレアーゼの全部でないにしても殆どは未同定のままである。これはBrawerman，G.，Cell，57:9-10（1989）に概略された。現在、２−５Ａ系は、ヒトを含む高等動物由来の唯一の十分に解明されたＲＮＡ分解経路であると考えられている。図１を参照。例えば、Kerr，I.M.およびBr own，R.E., Prod ．Natl．Aacd．Sci．USA, 75:256-260(1978)およびCayley，P.J .他：Biophys Res ．Commun.，108:1243-1250(1982); Sen，G.C．およびLengyel ，P., J ．Biol．Chem., 267:5017-5020（1992）に概説、なども参照。２−５Ａ系の活性は２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅとして既知のエンドリボヌクレアーゼによって仲介されると考えられる。Clemens，M.J．およびWilliams，B.R.G.，Cell， 13:565-572（1978）を参照。２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅは、２−５Ａ、２’，５ ’ホスホジエステル結合を有する異常なオリゴアデニレート、ｐ_n(A2'p)_nA をリボヌクレアーゼ活性のために必要とする点で特別な酵素である。Kerr，I.M.およびBrown，R.E., Prod ．Natl．Aacd．Sci．USA, 75:256-260(1978)を参照。２− ５Ａは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を必要とする反応でシンテターゼのファミリーによってＡＴＰから産生する。図１を参照。Hovanessian，A.G．他., Nature, 256:537-539(1997); Marie，Ｉ及びHovanessian，A.G., J ．Biol．Chem,，267: 9933-9939（1992）も参照。２−５Ａは、２’，５’−ホスホジエステラーゼおよび５’−ホスファターゼの作用の組み合わせのために細胞中並びに無細胞系で不安定である。Williams，B.R.G.他; Eur ．J．Biochem.，92:455-562(1978); およびJohnson，M.I．およびHearl，W.G., J ．Bio．Chem.，262:8377-8382（198 7）を参照。２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅおよび２−５Ａの相互作用（Ｋ_d＝４×１０^-11Ｍ）、Silverman，R.H．他、Biol ．Chem., 263:7336-7341（1988）は高度に特異的である。Knight，M.他， Nature, 288:189-192（1980）を参照。２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅは、２−５Ａに結合することによってその活性状態に転換されるまで検出可能なＲＮａｓｅ活性を有さないと考えられる。Silverman，R.H．他、Anal ．Biochem.，144:450-460（1985）を参照。活性化された２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅは、ＵＵおよびＵＡ配列を優先して、ＵｐＮｐのＲＮＡ３’の一本鎖領域を切断する。Wreschner，D.H．他、Nature, 289:414-417(1981a); および Floyd-Smith，G．他、Science, 212:1020-1032（1981）を参照。マウス肝臓由来の不活性２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの分析により、それが約８０ｋＤａの単一ポリペプチドであることが分かった。Silverman，R.H．他、Biol ．Chem., 263:733 6-7341(1988)を参照。２−５Ａ系の完全な範囲および生物学的重要性は未知のままであるが、インターフェロン作用の分子機構の研究は少なくとも幾つかの機能を提供してきた。インターフェロンα、またはＹは２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ（Jacobsen，H.他、Vi rology ，125:496-501（1983a）およびFloyd-Smith，G., J ．Cellular Biochem., 38:12-21(1988)）および２−５Ａシンテターゼ（Hovanessian，A.G.,他、 Natu re, 268:537-539（1977）、Sen，G.C．およびLengyel，P., J ．Biol．Chem., 26 7:5017-5020(1992)に概説）の両方の蓄積を誘導すると考えられる。さらに、幾つかの調査により、インターフェロンがピコルナウイルスの複製を阻害する機構中での２−５Ａ系が示されている。実際、２−５Ａそれ自体および高度に特異的な２−５Ａ仲介ｒＲＮＡ切断生成物は、インターフェロンで処理した脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）感染細胞中で誘導された。Williams,B.R.G.，Nature，282:5 82-586(1979); Wreschner，D.H．他., Nucleic Acids Res., 9:1571-1581(1981b ); およびSilverman，R.H．他、Eur ．J．Biochem.，124:131-138（1982a）を参照。さらに、２−５ＡシンテターゼｃＤＮＡの発現はピコルスウイルスの複製を阻害し(Chebath，J., Nature, 330:587-588（1987）およびRysiecki，E.F.他、 J ．Interferon Res., 9:649-657(1989))、そして細胞内に２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの２−５Ａアナログ阻害剤を導入するとＥＭＣＶ複製のインターフェロン仲介阻害を減少した。Watling，D．他、EMBO J., 4:431-436（1985）を参照。さらに、２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ量はインターフェロンの抗−ＥＭＣＶ活性に相関して（Kumar，R．他、J ．Virol., 62:3175-3181(1988)）、ＥＭＣＶ由来のｄｓＲＮＡはインターフェロン処理した感染細胞で２−５Ａシンテターゼに結合し活性化した。Bribaudo，G.他、 J ．Virol.，65:1948-1757（1991）を参照。しかし、２−５Ａ系はほぼ確かに、インターフェロンの抗ピコルナウイルス活性を越える機能を提供する。例えば、細胞内への２−５Ａの導入（Hovanessian, A.G．および Wood，J.M., Virology, 101:81-90（1980））、２−５ＡシンテターゼｃＤＮＡの発現(Rysiecki，G.他、 J ．Interferon Res., 9:649-657(1989)) は、細胞成長速度を阻害する。さらに、２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ量は成長停止細胞で増大し（Jacobsen，H.他、Proc ．Natl．Aacd．Sci．USA，80:4954-4958(1 983b)、および２−５Ａシンテターゼ（Stark，G．他、Nature，278:471-473(197 9)）、および２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ量は細胞分化の間に誘導される。例えば、Krause，D.他、Eur ．J．Biochem.，146:611-618(1985)を参照。従って、興味深い関連が、２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅと細胞成長および分化の基本的調節の間に存在しており、２−５Ａ系が一般的なＲＮＡ代謝で機能しているかもしれないことが示唆される。爬虫類、鳥類および哺乳類で２−５Ａ系が共通して存在することは、その経路のための幅広い役割を確かに裏付けている。例えば、Cayl ey，P.J.他、Biochem ．Biophys．Res．Commun.，108:1243-1250(1982)を参照。２−５Ａ系が高等動物由来の唯一の十分に解明されたＲＮＡ分解経路であると現在では考えられている一方で、ＰＫＲとして知られるｄｓＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼ酵素もまた高等動物で抗ウイルス効果を有すると考えられる。２− ５Ａシンテターゼ酵素と同様に、ＰＫＲはｄｓＲＮＡによって刺激されると考えられる。活性化ＰＫＲは、翻訳因子ｅＩＦ₂−アルファのアルファサブユニットをリン酸化して、タンパク質合成開始を間接的に阻害するものと考えられる。インターフェロンα、およびＹはＰＫＲの蓄積を誘導すると考えられる。Hovaness ian 他： J ．Interferon Res., 9:641-647（1989）を参照。２−５Ａ系と同様に、ＰＫＲ系もまたインターフェロンの抗ピコルナウイルス活性を越える機能を提供するらしい。Meurs，E.F．他：J ．Virology, 66:5805-5 814(1992)を参照。例えば、ＮＩＨ３Ｔ３細胞での変異型のＰＫＲの発現は、ヌードマウスに注入した際に腫瘍形成を生じた。Meurs，E.F．他： Proc ．Natl．A acd．Sci．USA, 90:232-236(1993)を参照。簡単に言うと、２−５Ａ系およびＰＫＲ系はウイルスタンパク質合成を阻害する。これは、ｍＲＮＡおよびｒＲＮＡを分解することによって２−５Ａ系によって達成されると考えられる一方、ＰＫＲ系はタンパク質合成開始を間接的に阻害することによってこれを達成すると考えられる。ウイルス植物病は広地域流行のものであり、それらの重症度は穏やかな症状から植物の死に至るまで変化する。植物ウイルスの大部分は一本鎖ＲＮＡゲノムを有すると考えられる。さらに、植物は、上記の３種の酵素、ＰＫＲ、２−５Ａシンテターゼおよび２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅを欠いていると今日では考えられている。Cayley，P.J.他：Biochem ．Biophys．Res．Commun.，108:1243-1250(1982 )およびDevach，Y 他：Biochemistry，24: 593-599(1985)を参照；またCrum,C. 他： J ．Biol．Chem., 263:13440-13443(1988); Hiddinga，H.J．他: Science， 241:451-453(1988)；Sela，I.：TIBS，pp.31-33（1981，2 月）：および Devach ，Y．他: Science, 216:1415-1416も参照。インターフェロンファミリーのサイトカインは、高等脊椎動物の細胞中に抗ウイルス状態を誘導すると考えられる。J．Vilcek，G.C．Sen，In Virology，B．F ields 編(Raven，ニューヨーク、1995)。ウイルス感染した細胞はインターフェロンαおよびβを産生し分泌し、これらが、ウイルス感染が生じたことを未感染細胞に信号を送ると考えられる。インターフェロンは、インターフェロンに刺激された遺伝子を誘導するＪａｋ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路を活性化する、特異的細胞表面受容体に結合すると考えられる。Darnell，J.E．他: Science, 264:1 415(1994)。これらの遺伝子によってコードされるタンパク質が、抗ウイルス応答を含む、インターフェロンの生物学的作用の原因となるものと考えられる。２ −５Ａ系は(Kerr，I.M.他: Proc ．Natl．Aacd．Sci．USA, 75:256(1978)を参照 )は、爬虫類、鳥類および哺乳類の細胞中に存在する一つのそのようなインターフェロンに誘導された抗ウイルス経路である。Cayley，他：Biochem ．Biophys. Res．Commun. ，108:1243（1982）。２種の酵素が機能的２−５Ａ系に必須であると考えられている：１）２−５Ａ、一連の５’−リン酸化された、２’，５’− 結合したオリゴアデニレート類、を産生するためにｄｓＲＮＡを必要とする複数の２−５Ａシンテターゼのいずれか１つ、A.G．Hovanessian，A.G.他： Nature, 268:537（1977）、およびMarie，I．他: J ．Biol．Chem.，267:9933(1992); 並びに２）２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅL．Clemens，M.J.他: Cell，13:565（1978）、Slattery他： Proc ．Natl．Aacd．Sci．USA, 76:4778（1978）、およびZhou， A.他: Cell，72:753（1993）。２−５Ａは、主にＵｐＮｐ配列後に、ウイルスおよび細胞性一本ＲＮＡを切断するＲＮａｓｅＬを活性化すると考えられる。Floy d-Smith，G.E．他：Science, 212:1020(1981); およびWreschner，D.H．他:Natu re ，289:414（1981）。ウイルス感染細胞は、例えばＲＮＡウイルスの複製中間体として、２−５ＡシンテターゼのｄｓＲＮＡ活性化因子を含むことが多いので（例えば、Gribaudo G．他: J ．Virol., 65:1748（1991）を参照）、ＲＮａｓｅＬによるＲＮＡ分解はインターフェロンで処理したウイルス感染細胞で生じることが多いと考えられる。Wreschner，D.H．他: Nucleic Acids Res.，9:1571(1 981)；およびSilverman，R.H．他：Eur ．J．Biochem.，124:131(1982)を参照。２−５Ａ系は、インターフェロン処理した哺乳細胞中でピコルナウイルス、脳心筋炎ウイルスおよびメンゴウイルスの複製を阻害すると考えられる。Chebath，J ．他： Nature, 330:587(1987); Rysiecki，G.他： J ．Interferon Res., 9:649 (1989); Coccia，E.M．他、Virology，179:228(1990); およびHassel，B.A.他: EMBO J .，12:3297（1993）。ＲＮａｓｅＬは、２−５Ａ結合活性で分析した場合、タバコ、Nicotiana glut inosa および N.tabacum において検出されなかった。Cayley，他：Biochem ．B iophys．Res．Commun. ，108:1243（1982）を参照。さらに、２−５Ａシンテターゼはそのような植物では検出されず、そして２−５Ａシンテターゼは、対照、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）−に感染した、インターフェロンで処理した、またはポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）で処理した植物で検出されなかった。従って、植物は２−５Ａ系または哺乳類の２−５Ａ系の同等物を欠いているようである。以前は、ＲＮａｓｅＬの同時発現を伴わないラット２−５ＡシンテターゼｍＲＮＡのジャガイモでの発現は、全てではないがある種のトランスジェニック植物でジャガイモウイルスＸ（ＰＶＸ）に対する潜在的部分的耐性に関連していた。 Truve，E．他: Bio/Technology，11:1048(1993)を参照。この感知された効果と非トランスジェニックN．glutinosa 葉面中での２’，５’−オリゴアデニレートの抗ＴＭＶ効果の可能性の両方に対する生化学的基礎は確立していない。Y．D evash 他、Science, 216 (1982) を参照。植物オリゴアデニレートは存在すると考えられるけれども、２−５Ａとは相違するようである。Y．Devash 他：Biochem. 24:593（1985）を参照。従って、植物は２−５ＡシンテターゼおよびＲＮａｓｅＬを産生または発現しないと現在は考えられている。２−５Ａ系に対する２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの重要性にも係わらず、リボヌクレアーゼ機能を有する２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ酵素は、これまでに単離も精製も配列決定もなされていない。その結果、単離された活性な２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ並びにそれらの完全なアミノ酸配列を求める必要があり、また活性な２ −５Ａ依存性ＲＮａｓｅのコード配列を求める必要もある。また、ピコルナウイルス、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、タバコ腐食(etch)ウイルス（ＴＥＶ）およびアルファルファモザイクウイルス（ＡＩＭＶ）などのウイルスに対して免疫であるか耐性であるトランスジェニックタバコ植物などの、ウイルスに対して免疫であるか耐性であるトランスジェニック植物を求める必要もある。発明の要旨簡単に言うと、本発明は、新規な単離された２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅおよびそのコード配列の発見を通じて、当分野の現状の上記課題並びに欠点の一定のものを軽減して解消するものである。広く言うと、本発明の新規な２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅは、哺乳類などの動物細胞での一本鎖ＲＮＡ崩壊の基本的調節に関与し、また鳥類または爬虫類細胞などの動物細胞中に存在する。さらに詳細には、本発明の新規な２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅは、５’−リン酸化した２’，５’−結合オリゴアデニレート（本書中以下においては「２−５Ａ」と称す）に結合することによって活性化された後に、ＵｐＵｐまたはＵｐＡｐ配列の主として３’の一本鎖ＲＮＡを分解することができる能力を有している。その結果、この新規な２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅは細胞増殖速度、ウイルス複製の阻害に関連して、そしてウイルス感染および癌のインターフェロン治療に関連して有用であると考えられる。本明細書で使用する場合、「２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ（単数または複数）」という用語は広義において使用され、２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅが２−５Ａによって活性化される場合に、２−５Ａ結合ドメインおよび／またはリボヌクレアーゼ作用を含む任意のアミノ酸配列を含むことを意味する。２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅという用語はまた「ＲＮａｓｅＬ」という用語も包含し、「２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ」という用語と交換可能的に使用される。本発明の新規な２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅは、ゲル電気泳動移動および／またはそれらの各々のコードヌクレオチド配列からの予測によって決定した場合で、約７４ｋＤａ（ネズミ）および約８４ｋＤａ（ヒト）の間の大きさの分子量を有するタンパク質酵素である。例えば、本発明のヒト２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅは、そのコード配列から予測したアミノ酸配列から決定した場合で約８３，５３９Ｄａの分子量を有する一方、ネズミの２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅは、ゲル電気泳動移動およびコード配列からのアミノ酸配列の予測によって決定した場合で約７４ｋＤａの分子量を有する。約７４ｋＤａの分子量がネズミ２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅに関して本明細書中に報告される一方で、報告された分子量が不完全なネズミ２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅのものであることが理解されるべきである。それにも係わらず、一度完全に配列決定されれば、即ち、約８４アミノ酸末端領域が同定されれば、完全なネズミ２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの分子量はヒトの分子量、即ち約８４ｋＤａと同様であるものと考えられる。しかし、ゲル電気泳動移動がネズミ２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの分子量を測定するために使用されているので、７４ｋＤａの分子量は相対移動度に基づく見積もりにすぎないことは、当業者にとって容易に自明であるはずでもある。ヒト２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅタンパク質のアミノ酸配列は図３および表１に記載する。ヒト２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅタンパク質のコード配列も表１に記載する。ヒト２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅのｍＲＮＡは約５．０Ｋｂの大きさである。ネズミ２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅタンパク質の実質的に完全なアミノ酸配列およびそのコード配列を表２に記載する。ネズミ２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅのｍＲＮＡは約５．７Ｋｂの大きさである。本発明の２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅのアミノ酸配列の分析により２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅに特徴的な幾つかの特徴が明らかになった。例えば、本発明の新規な２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅは、アミノ末端とカルボキシ末端の間に渡る以下の特徴的なドメインを含むことが見つかった。例えば、少なくとも４個、そして多分９個かそれ以上のアンキリン反復が存在し、そのうちの３個はアミノ末端に最も近い所に位置していることが見つかった。しかし、４個のアンキリン反復が見つかった一方で、本発明の２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅのアミノ酸配列をさらに分析すれば、全部で例えば約８個またはそれ以上のさらに追加のアンキリン反復が存在するかもしれないと考えられる。これらのアンキリン反復は多分、タンパク質−タンパク質相互作用において機能するかもしれないと考えられる。アンキリン反復１は一般に表１および２で５８−９０と付けられたアミノ酸の間に存在する。アンキリン反復２は一般に表１および２で９１−１２３と付けられたアミノ酸の間に存在する。アンキリン反復３は一般に表１および２で１２４−１５６と付けられたアミノ酸の間に存在する。アンキリン反復４は一般に表１および２で２３８−２７０と付けられたアミノ酸の間に存在する。図１０Ａおよび図１０Ｂも参照。この新規な２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅが、ＲＮＡ認識またはタンパク質二量体形成で多分機能する可能性がある、アミノ末端よりカルボキシ末端の近くに存在するシステイン豊富領域（ジンクフィンガーと相同性を有する）を含むことも見つかった。システイン豊富領域は、表１および図４に報告したヒト配列で３９５ −４４４と付けられたアミノ酸の間、あるいは表２および図４に報告したネズミ配列で４０１−４３６と付けられたアミノ酸の間に一般的に存在する約５または６個のシステイン残基を含むと考えられる。さらに、この新規な２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅは、アンキリン反復モチーフ内に一般的に存在する二重のホスフェート結合（２Ｐ−ループ）モチーフを含むことが見つかった。２個のＰ−ループは同一方向であり、２−５Ａに結合するのに必要な結合ドメインを構成していると考えられる。各Ｐ−ループモチーフは最大の２−５Ａ結合活性に必須であるリジン残基を含むものと考えられる。リジン残基は表１および２で２４０および２７４と付けられている。この２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅタンパク質は、タンパク質キナーゼに相同であると考えられるシステイン豊富領域の後に続くアミノ酸領域を含むことが見つかった。この領域内に、表１および２で４７０−５０４と付けられたアミノ酸残基の間に一般的に存在するドメインＶＩとＶＩＩと付けられた別々のドメインが存在するものと考えられる。さらに詳細には、ヒト配列の２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅに関しては、ドメインＶＩは表１および図４に報告したような、５０１−５０４と付けられたアミノ酸残基の間に一般的に存在する。ネズミ配列の２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅに関しては、表２および図４に報告したように、ドメインＶＩは４７０−４８９と付けられたアミノ酸残基の間に一般的に存在し、ドメインＶＩＩは４９９−５０２と付けられたアミノ酸残基の間に一般的に存在する。本発明の２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅと、E.Coliの変更ｍＲＮＡ安定性（ａｍｓ）／ｒｎｅ遺伝子によってコードされるＲＮａｓｅＥとのアミノ酸配列の間には限定された相同性が存在することも見つかった。驚くべきことに、限定された相同性は２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅのネズミおよびヒトのアミノ酸配列の間で一般的に保存されており、一般的に２００アミノ酸領域の間に存在する。さらに詳細には、ヒト配列については、そのアミノ酸領域は表１および図９Ａおよび９Ｂで１６０−３４９と付けられたアミノ酸残基に渡る。ネズミ配列に関しては、そのアミノ酸領域は表２および図９Ａおよび９Ｂで１６０−３４８と付けられたアミノ酸残基に渡る。本発明の新規な２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅタンパク質の完全でないにしてもほぼ全てのアミノ酸配列がリボヌクレアーゼ機能のために必要であることが見つかり、そのように考えられる。例えば、カルボキシ末端の約８４アミノ酸領域がヒト２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅに存在する場合、ヒト２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅは２−５Ａの存在下でリボヌクレアーゼ機能を有するものと考えられる。対照的に、ネズミ２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅがカルボキシ末端に約８４アミノ酸領域を欠く場合は、それはリボヌクレアーゼ機能を欠く。２−５Ａへのネズミ２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅタンパク質の結合活性に関しては、１個のＰ−ループをネズミ２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅタンパク質の反復Ｐ− ループモチーフから欠失させた場合、ほぼ全ての２−５Ａ結合活性が失われ、そして両方のＰ−ループを欠失させた場合、実質的に完全な活性が失われることが見つかった。しかし、反復Ｐ−ループモチーフの後のネズミ２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシ末端部分を欠失させた場合でさえも、部分的な２−５Ａ結合活性は維持されることが判明した。リジン残基２４０および２７４を両方のＰ−ループモチーフ中でアスパラギン残基で置換すると、ネズミ２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅタンパク質の有意な２−５Ａ結合活性は失われることがさらに見つかった。しかし、リジン残基２４０または２７４のいずれかをＰ−ループモチーフのいずれか中で置換すると、部分的のみの２−５Ａ結合活性が失われることもさらに見つかった。従って、本発明の２ −５Ａ依存性ＲＮａｓｅのためのアミノ酸配列中の両方のＰ−ループモチーフの存在が２−５Ａ結合活性で重要な役割を担っているものと考えられる。さらに、各々のＰ−ループモチーフ中のリジン残基２４０および２７４の存在が増加した２−５Ａ結合活性のために重要な役割を担っているものと考えられる。また、本発明の２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの実質的に完全なアミノ酸配列の存在が、さらに増加した２−５Ａ結合活性を付与し、同様にリボヌクレアーゼ機能を付与するものと考えられる。さらに、本発明はネズミおよびヒトの２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ並びに新規なネズミおよびヒトのクローンのクローニングに関する。２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの組み換え体および天然体は、実質的に同一の２−５Ａ結合性およびリボヌクレアーゼ特異性を示した。本発明はさらに、例えば、１）ウイルス疾患および癌を含むヒトおよび動物疾患の遺伝子治療における、２）おそらく癌またはウイルス感染によるヒト疾患のための遺伝マーカーとして、３）一定のウイルスに耐性である植物および動物を開発するために、そして４）ＲＮＡの構造の研究のため等のような研究開発に関連した酵素として、などの使用のために、新規な単離された２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ並びにそれのコード配列、並びにそのアナログおよび活性フラグメントを使用することを包含する。上記を達成するための一つの方法において、そして本発明により意図されるように、本発明のコード配列はｅｘｖｉｖｏ治療で利用することができ、即ち、当業者に公知の技術を使用して本発明のコード配列を使用して組み換え細胞を開発することができる。上記を達成するために使用することができるもう一つ別の方法において、本発明のコード配列を適当なプロモーターと組み合わせて組み換え分子を形成し、当業者に公知の技術を使用して動物、植物、または他の下等生命体中に導入するために適当なベクターに挿入することができる。もちろん、当業者に公知の手段の他の適当な方法を選択して、本発明の新規な２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅおよびコード配列が適した上記の目的または他の目的を達成することができる。本発明はまた、ピコルナウイルスなどのウイルスに耐性である、上記のような新規なトランスジェニック植物を意図する。一般的に言うと、本発明のトランスジェニック植物は、タンパク質を含む、任意の型の抗ウイルスアミノ酸配列をコードする任意の挿入されたヌクレオチド配列を含む。好ましくは、本発明により植物内に導入された抗ウイルスヌクレオチド配列は、インターフェロン産生および／または治療に応答して刺激される遺伝子などのような動物抗ウイルス遺伝子である。これらには、例えば、２−５Ａシンテターゼ(synthetase、合成酵素)、２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ、およびＰＫＲをコードする動物の抗ウイルス遺伝子が含まれる。これらのインターフェロンに調節されたタンパク質、２−５Ａシンテターゼ、２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅおよびＰＫＲ（ｄｓＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼ）は高等動物中で抗ウイルス効果を認識し、本発明のトランスジェニック植物において抗ウイルス効果を有すると考えられる。ＰＫＲはｄｓＲＮＡによって刺激されると、タンパク質合成開始を間接的に阻害する翻訳因子ｅＩＦ２をリン酸化する。一方、２−５ＡシンテターゼはｄｓＲＮＡによって活性化され、「２−５Ａ」ｐ_xＡ（２’ｐ５’Ａ）_y（式中Ｘ＝約１〜約３であり、ｙ≧約２）のＡＴＰからの産生を生じる。次いで、２−５Ａは２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ（ＲＮａｓｅＬまたはヌクレアーゼＦとしても知られる）と命名されるエンドリボヌクレアーゼを活性化する。活性化されたリボヌクレアーゼはｍＲＮＡおよびｒＲＮＡを分解し、タンパク質合成を阻害する。これらの上記経路は、ピコルナウイルスなどの、ｄｓＲＮＡ中間体を通じて複製する一本鎖ＲＮＡゲノムを有する動物中のウイルスを阻害する上で特に効果的であり、植物に感染する同様の型のウイルスを阻害する上でも効果的であると考えられる。この考えは、大部分の一本鎖ＲＮＡ植物ウイルスはそれらのウイルスレプリカーゼによる複製の間に二本鎖構造を産生し（Dawson，W.O.他：Acad ．Pr ess, 38:307-342(1990)）、植物ウイルスが構造、組成および細胞中での複製機構において動物ウイルスと類似しているという理解を前提としている。さらに、ウイルスのいわゆる一本鎖ＲＮＡでさえ、ＰＫＲおよび２−５Ａシンテターゼを活性化して植物ウイルスに対する広範囲の植物保護を導くことができる二次構造を含有している場合がある。２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅおよび２−５Ａシンテターゼの同時発現がウイルスｍＲＮＡおよびウイルスゲノムＲＮＡの破壊を導き、それによって本発明のトランスジェニック植物をウイルスから保護するものと考えられる。さらに、本発明のトランスジェニック植物によるＰＫＲの発現がウイルスタンパク質合成を阻害し、ウイルス複製を阻害し、トランスジェニック植物を保護するものと考えられる。従って、本発明は部分的には、植物ウイルスＲＮＡが本発明のトランスジェニック植物において２−５ＡシンテターゼおよびＰＫＲを活性化し、ウイルス感染に対する免疫を導くという考えを前提としている。さらに、２−５Ａシンテターゼ単独または２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ単独またはＰＫＲ単独の発現は、おそらくウイルス複製中間体などのウイルスＲＮＡに結合して、それによってウイルス複製を妨害することによって、ウイルスに対して植物を保護するのかもしれない。さらに、ＰＫＲおよび／または２−５ＡシンテターゼのｄｓＲＮＡ結合ドメインのみの発現も同様にウイルス感染に対して本発明のトランスジェニック植物を保護することができる。従って、ウイルス感染に対して耐性である新規なトランスジェニック植物が本発明に従って今や作製することができることを当業者は理解するべきである。上記のこれら３種の動物抗ウイルス遺伝子によってコードされる動物抗ウイルスタンパク質はウイルス生活環の異なる段階と干渉するので、抗ウイルス保護の有効性は、少なくとも３種の上記の動物抗ウイルス遺伝子を植物に挿入して本発明の例示的トランスジェニック植物を形成する場合に、増大または最大化することができるものと考えられる。さらに、これらの動物抗ウイルスタンパク質またはアミノ酸配列は、ヒト並びに他の哺乳類、鳥類および爬虫類において天然に生じているので、これらはヒトを含む動物に安全に与えて導入することができるらしいと考えられる。開示した特定の配列を参照して本発明が本明細書中に説明されているが、にも係わらず、本発明は、２−５Ａシンテターゼ活性、ＰＫＲ活性および／または２ −５Ａ依存性リボヌクレアーゼ活性を破壊しないアミノ酸および／またはヌクレオチド配列への変更を意図するということが当業者により理解されるべきである。従って、本発明は、任意の活性部分、および任意のコード配列などの活性である、２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ、２−５Ａシンテターゼ、およびＰＫＲの任意のアナログ、一部またはフラグメントを意図する。言い換えれば、本発明は、他のなかでも、本発明の目的を達成することができる能力を有する任意のアミノ酸、任意のヌクレオチド配列および任意のトランスジェニック植物を包含する。例えば、本発明には、抗ウイルス活性を有する任意のアミノ酸配列、並びにそれをコードする任意のヌクレオチド配列、並びにそのようなヌクレオチド配列を発現するトランスジェニック植物が包含される。さらに詳細には、本発明には、例えば：１）ＰＫＲ活性、２−５Ａシンテターゼ活性および／または２−５Ａリボヌクレアーゼ活性と同様または同一の活性を有するアミノ酸配列などのウイルス複製を阻害またはそれに干渉する能力を有する任意の動物アミノ酸配列、並びに任意のそのような活性を有するアミノ酸配列をコードする任意のヌクレオチド配列；並びに２）任意のそのような抗ウイルス活性を有する任意のそのようなアミノ酸配列をコードする任意の動物抗ウイルスヌクレオチド配列を有する任意のトランスジェニック植物が包含される。本発明によって意図されるさらに別の特徴によれば、ウイルス感染に対する免疫または耐性をトランスジェニック植物に付与するために機能的２−５Ａ系を発現する能力を有する、トランスジェニックタバコ植物などの新規なトランスジェニック植物が意外なことに見つかった。さらに詳細には、例えば、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、タバコ腐食ウイルス（ＴＥＶ）およびアルファルファモザイクウイルス（ＡＩＭＶ）に対する耐性を付与するために機能的２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ（ＲＮａｓｅＬ）および機能的２−５Ａシンテターゼを発現する能力を有するトランスジェニックタバコ植物が見つかった。これらの優れたトランスジェニックタバコ植物は、トランスジェニックではなくそのような２−５Ａ系を発現する能力を有さない同様の植物よりも、ＴＭＶ、ＴＥＶおよびＡＩＭＶによる感染に対して耐性および免疫が強いことが意外なことに見つかった。本発明による植物中での２−５Ａ系の発現は、これまでに利用されていた代替的な植物抗ウイルス戦略と比較して、幾つかの自明な利点を有しているようである。最も普通のアプローチは、病原体由来の耐性を包含し（Sanford，J.C．他：J ．Theor．Biol., 113:395（1985））、この場合植物は形質転換されて一定のウイルスにコードされたタンパク質またはアンチセンスＲＮＡを発現する（Wilson , T.M.A.他： Proc ．Natl．Aacd．Sci．USA, 90:3134（1993）：およびHull，R. 他：Crit ．Rev．Plant Sci., 11:17（1992））。このアプローチの潜在的限界は植物中で生じることがあるウイルス組み換えであり、多分より有毒なウイルス、ウイルスまたはベクター特異性の宿主範囲の拡大を生じる。Greene，A.E.他：Sc ience , 263:1423(1994); White，K.A．他： Proc ．Natl．Aacd．Sci．USA, 91: 3642(1994);およびTepfer，M.他：Bio/Technology，11:1125(1993)を参照。これらの危険は一般には高いとは考えられない。Falk，B.W.他：Science, 263:1395( 1994)を参照。しかし、ウイルス感染に対する実質的な耐性の場合でさえも、保護は、タンパク質またはアンチセンスＲＮＡが由来するウイルス、または密接に関連した株に通常は限定される。対照的に、本発明の機能的２−５Ａ系を含有するトランスジェニック植物は、感染細胞にｄｓＲＮＡを産生する任意の植物ウイルスに対する免疫および耐性を与えることができるという実現性を根拠にしている。経済的に重要なポチウイルス（potyvirus）群のものを含む大部分の植物ウイルスは、複製プロセスの間にｄｓＲＮＡ中間体を産生する正のセンス一本鎖ＲＮＡウイルスである。さらに、植物ウイルスは機能的２−５Ａ系に対して裸のまま（naive）であるので、これらのウイルスは高等脊椎動物のウイルスよりもそれに対してより傷を受けやすいようであると考えられる。従って、トランスジェニック植物中での機能的２−５Ａ系の発現は意外にもウイルス感染に対する幅広い耐性を提供すると考えられる。従って、本発明によるトランスジェニック植物戦略は、地面でのウイルス感染から作物および他の植物を保護するための意外で有利なアプローチを提供する。本発明の上記の特徴および利点は、添付する図面、詳細な説明および実施例を参照してより良く理解されるであろう。本発明を例示する特定の方法、アミノ酸配列、コード配列、構築体、ベクター、組み換え細胞、および抗ウイルストランスジェニック植物は例示的なものにすぎず、本発明の限定とみなされるべきではないことも理解されるべきである。図面の簡単な説明以下、添付する図面を参照するが、そこには本発明の例示的態様が示され、そこから本発明の新規な特徴および利点が明らかになるであろう。図１は、２−５Ａ系である：インターフェロン作用の分子機構で作用すると考えられるリボヌクレアーゼ経路。５’−ホスファターゼ、Ｐ’ターゼ；２’−５ ’−ホスホジエステラーゼ、２’−ＰＤＥ。図２Ａおよび２Ｂは、ネズミ２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの組み換え体および天然体の２−５Ａ結合活性の比較である。図２Ａは、２−５Ａに対する先端切断したネズミ２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの特異的親和性である。³²Ｐ−２−５Ａプローブ（レーン１−７）のタンパク質へのＵＶ共有架橋は、ネズミ２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅｍＲＮＡ（クローンＺＢ１由来）を有するか（レーン１−３）、ＲＮＡを添加しない（レーン４）小麦胚抽出物（５μｌ）中、あるいはインターフェロンで処理したマウスＬ細胞の抽出物（１００μｇのタンパク質）中での翻訳反応後に行われる。反応は競合物質の添加なし（レーン１、４および５）または、いずれかのタイマーコアの存在下である。(A2'p)₂A,（１００ｎＭ）（レーン２および６）またはタイマー２−５Ａ、p₃ (A2'p)₂A,（１００ｎＭ）（レーン３および７）。レーン８および９は、各々２ −５Ａ依存性ＲＮａｓｅｍＲＮＡの不在下または存在下で小麦胚抽出物を³⁵Ｓ− メチオニンと一緒にインキュベートするこによって産生される。図２Ｂは、同一のキモトリプシン切断生成物であり、２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの組み換え体および天然体から得られる。部分的キモトリプシン消化（矢印）は、小麦胚抽出物中で産生した先端切断した２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ（クローンＺＢ１）（「組み換え」）並びにネズミＬ細胞２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ（「天然」）上で、２−５Ａプローブへの架橋およびゲルからの精製後に行う。図３Ａおよび３Ｂは、ヒト２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの完全コード配列のクローニングである。図３Ａは、ヒト２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅクローンの構築である。最初のヒト２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅクローン。最初のヒト２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅｃＤＮＡクローン、ＨＺＢ１は、放射標識したネズミ２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅｃＤＮＡ（クローンＺＢ１）をプローブとして使用して、λｇｔ１０中の成人ヒト腎臓ｃＤＮＡライブラリーから単離される。実施例を参照。放射標識したＨＺＢ１ＤＮＡを使用して、部分的にオーバーラップするｃＤＮＡクローンＨＺＢ２２を単離し、これをＮｃｏＩ部位でＨＺＢ１ＤＮＡに融合し、クローンＺＣ１を形成する。コード配列の５’領域は、放射標識したＨＺＢ２２ＤＮＡフラグメントをプローブとして使用して単離したゲノミックＳａｃＩフラグメントから得られる。示したＳａｃＩ部位でゲノミックＳＡＣＩフラグメントをＺＣ１と融合してクローンＺＣ３が得られる。次いで、幾つかのフランキング配列を有するコード配列をＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＫＳ（＋）（Strategene）中にサブクローニングして、クローンＺＣ５が得られる。複合クローンＺＣ５の制限地図を示す。クローンＨＺＢ１は、表Ｉで６５８−２２２３として示したヌクレオチドを含み、これは表Ｉで２２０−７４１として示したアミノ酸をコードする。クローンＨＺＢ２２は、表Ｉで６２−３９７として示したアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を含む。クローンＺＣ１は、表Ｉで１ −７４１として示したアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を含む。図３Ｂは、フランキングヌクレオチド配列を有するヒト２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列である。右への番号はヌクレオチドおよびアミノ酸残基の位置を示す。図４は、ネズミ型およびヒト型の２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの推定アミノ酸配列の並列である。反復Ｐ−ループモチーフ、ジンクフィンガーとの相同性を有するシステイン（Ｃｙｓ）豊富領域、およびタンパク質キナーゼドメインＶＩおよびＶＩＩと相同の領域の位置を示す。示したドメインの重要な成分であるアミノ酸残基は太いタイプで表示され、イタリック体とされている。ネズミおよびヒトの２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ中の同一のアミノ酸残基をその間に隣接したコロン（：）記号で表示する。図５Ａおよび図５Ｂは、インビトロで産生した組み換えヒト２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの２−５Ａ結合性およびリボヌクレアーゼ活性である。図５Ａは、２−５Ａに対する組み換えヒト２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの特異的親和性である。タンパク質への２−５Ａプローブ（レーン１−７）の架橋は、ヒト２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅｍＲＮＡ（レーン１−３）を含むか、ＲＮＡの添加なしに（レーン４）小麦胚抽出物（５λｌ）中で、あるいはヒトインターフェロンαで処理した（１０００ユニット／ｍｌで１６時間）ヒトＨｅＬａ細胞の抽出物（３５０μｇのタンパク質）中での（レーン５−７）翻訳反応後に行う。反応は、競合物質の添加なし（レーン１、４及び５）またはいずれかのタイマーコアの(A2'p)₂A,（１００ｎＭ）（レーン２および６）またはタイマー２−５Ａ、p₃( A2'p)₂A,（１００ｎＭ）（レーン３および７）の存在下である。³⁵Ｓ−メチオニンによるインキュベーションをレーン８から１２に示す。レーン８は小麦胚抽出物およびヒト２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅｍＲＮＡによるものである。２−５Ａ− セルロースに予め吸着させた網状赤血球ライセートを、シクロヘキシミドの不在下（レーン９）または存在下（レーン１０）で、あるいは添加したｍＲＮＡの不在下（レーン１１）で、ヒト２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅｍＲＮＡと一緒にインキュベートする。レーン１２は、未吸着の粗製網状赤血球ライセート中で産生するヒト２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅを示す。マーカータンパク質の位置および相対分子量（ｋＤａ）を示す。図５Ｂは、内生の２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅを除去するために前処理した網状赤血球ライセートであり、添加したｍＲＮＡの不在下（■）、阻害剤なしでヒト２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅｍＲＮＡの存在下（○、□）、あるいは２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅｍＲＮＡとシクロヘキシミド（５０μｇ／ｍｌ）の両方の存在下（ ●）においてインキュベートされる。実施例Ｉを参照。続いて、組み換え２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ（または対照）を２−５Ａセルロースに吸着させ、リボヌクレアーゼ分析を、一般のヌクレアーゼ活性を減少するためにマトリックスを激しく洗浄した後に行う。放射標識した基質ＲＮＡはポリ（Ｕ）（○、●、■）またはポリ（Ｃ）（□）のいずれかであった。図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは、シクロヘキシミドの存在下でさえネズミＬ９２９細胞のインターフェロン処理によって誘導される２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅｍＲＮＡの量を示す。図６Ａは、異なる期間（示したもの）ネズミインターフェロン（α＋）（１０００ユニット／ｍｌ）および／またはシクロヘキシミド（５０μｇ／ｍｌ）で処理したネズミＬ９２９細胞から単離されたポリ（Ａ）⁺ＲＮＡ（４μｇ／レーン）で作製したノーザンブロットであり、これは放射標識したネズミ２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅｃＤＮＡでプローブ検索される。インターフェロン、ＩＦＮ；シクロヘキシミド、ＣＨＩ。図６Ｂは、ビデオカメラ及びQuickCapture及びイメージコンピュータープログラムでパネル（ａ）に示したオートラジオグラムから見積もられる２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの量を示す。図６Ｃは、パネル（ａ）に示した同一ブロット中で測定したグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡの量を示す。図７Ａおよび図７Ｂは、先端切断した組み換えネズミ２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ、クローンＺＢ１、および反復Ｐ−ループモチーフに位置した同一の２−５Ａ結合活性を有するネズミＬ細胞２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅである。図７Ａは、小麦胚抽出物中で産生した先端切断した２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ、クローンＺＢ１（「組み換え体」）（上段のパネル）、あるいは³²Ｐ−２−５Ａプローブを有するネズミＬ細胞２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ（「天然」と命名、下部パネル）（２．４ｎＭ）のインキュベーションであり、未標識２’，５’− ホスホジエステル結合したオリゴヌクレオチド（示した通り）の不在下または存在下であり、その後にＵＶ共有架橋を行った。乾燥ＳＤＳ／１０％ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラムを示す。オリゴヌクレオチド競合物質の濃度を示す。それはイノシンである。図７Ｂは、フィルター結合法によって２−５Ａ結合活性について分析した小麦胚抽出物中で産生した、先端切断した一連のネズミ２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ変異体を示す（ＺＢ１からＺＢ１５）。実施例およびKnight 他．1980を参照。Ｐ −ループモチーフの位置および翻訳産物の長さが示される。クローンＺＢ１は、 Lys，Pro，Leu，Ser およびGly である最後の５アミノ酸酸基を除き、表２で１ −６５６と示したアミノ酸をコードする。クローンＺＢ２は表２で１−６１９と示したアミノ酸をコードする。クローンＺＢ３は表２で１−５１５と示したアミノ酸をコードする。クローンＺＢ５は表２で１−４７４と示したアミノ酸をコードする。クローンＺＢ９は表２で１−４０３と示したアミノ酸をコードする。クローンＺＢ１０は表２で１−３６５と示したアミノ酸をコードする。クローンＺＢ１３は表２で１−２９４と示したアミノ酸をコードする。クローンＺＢ１４は表２で１２６５と示したアミノ酸をコードする。クローンＺＢ１５は表２で１− ２１８と示したアミノ酸をコードする。図８Ａおよび８Ｂは、２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅのＰ−ループモチーフ中のリジン残基の置換変異体である。図８Ａは、先端切断したネズミ２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ、クローンＺＢ１、並びに、小麦胚抽出物中で合成したクローンＺＢ１のリジンからアスパラギンへの置換変異体を示す。（Ａ）では、未標識翻訳産物はブロミド置換した、³²Ｐ標識２−５Ａプローブ、Ｂｒ−２−５Ａ−〔³²Ｐ〕ｐＣｐに共有結合している。No lan-Sordan他，1990を参照。図８Ｂは、別の反応で³⁵Ｓ−メチオニンの存在下で翻訳されるｍＲＮＡ種を示す。乾燥したＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラムを示す。翻訳産物（標識「ＲＮａｓｅ」）の大きさと位置およびタンパク質マーカーの相対分子量（ｋＤａ）を示す。図９Ａおよび９Ｂは、ＲＮａｓｅＥと２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅのアミノ酸配列の比較である。図９Ａは、E.ColiのＲＮａｓｅＥおよびネズミ型とヒト型の２ＤＲとの間で示される同一で保存的な対合を示す。図９Ｂは、２ＤＲの構造と機能のモデルである。略号：Ｐ−ループモチーフ、Ｐ−ループと相同性を有する反復配列；Ｃｙｓ_x、一定のジンクフィンガーと相同性を有するシステイン豊富領域；ＰＫ、タンパク質キナーゼドメインＶＩおよびＶＩＩに相同。図１０Ａおよび１０Ｂは、ヒトおよびネズミ２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅタンパク質中のアンキリン反復のアミノ酸配列の比較である。図１０Ａは、４個のアンキリン反復を含有するネズミ型およびヒト型の２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅを示す。アンキリンコンセンサス配列と、ネズミ型とヒト型の２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅとの間の相同性を示す。Ψ，疎水性アミノ酸。図１０Ｂは、提案された２−５Ａ結合ドメイン（↓）（反復したＰ−ループモチーフ）の位置と比較した、２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ中の４個のアンキリン反復の相対位置を示すモデルである；Ｃｙｓ_x、システイン豊富領域；ＰＫ、タンパク質キナーゼホモロジー領域、およびＲＮａｓｅ活性に必要なカルボキシ末端領域。図１１は、インターフェロン処理に対する細胞の抗ウイルス応答における２− ５Ａ依存性ＲＮａｓｅの役割を示す。インターフェロンは特異的細胞表面受容体に結合して、細胞核中の１セットの遺伝子を活性化するシグナルの生成を生じる。２−５Ａシンテターゼの遺伝子はこのように活性化して、不活性なネイティブな２−５Ａシンテターゼを産生する。細胞のインターフェロン処理はまた、２− ５Ａ依存性ＲＮａｓｅ遺伝子を活性化する（図示せず）。続いて、インターフェロン処理した細胞はウイルスに感染する。ウイルスはその複製サイクルの間に二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を産生する。ウイルスｄｓＲＮＡは次いで２−５Ａシンテターゼを活性化して、２−５Ａの産生を生じる。次いで２−５Ａは２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅを活性化して、ウイルスＲＮＡを分解して、ウイルス自体を破壊する。図１２は、約１２ＫｂｐのＴ；に基づいた２成分ベクターｐＡＭ９４３の物理的地図を示す。略号：Ｂ_L、左端；ＡＭＴ、クロレラウイルスからのアデニルメチルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーター；３５Ｓ、カリフラワーモザイクウイルスからの３５ＳＲＮＡのプロモーター；ＴＥＲ、ＲＮＡ終始シグナル；ＤＮＡ複製のＯｖｉＶおよびＯｒｉＫオリジン。図１３は、哺乳類抗ウイルスタンパク質をコードするｃＤＮＡを含み、植物ゲノムに再移入されるＴ−ＤＮＡｓの右端と左端の間の重要なＤＮＡ要素を示す、一定の組み換えプラスミド構築体の位置の物理的地図を示す。図１３Ａは、プラスミドｐＡＭ９４３：ＰＫ６８の一定の部分を示す；図１３Ｂは、プラスミドｐＡＭ９４３：ｍｕＰＫ６８の一定の部分を示す；図１３Ｃは、プラスミドｐＡＭ９４３：シンテターゼの一定の部分を示す；図１３Ｄは、プラスミドｐＡＭ９４３：２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの一定の部分を示す；図１３Ｄ／ａは、プラスミドｐＡＭ９４３：２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ（センス）の一定の部分を示し、図１３Ｅは、ｐＡＭ８２２：２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ（アンチセンス）を示す。略号：Ｂ_L、左端；Ｂ_R、右端；Ｋａｎ^r、カナマイシン耐性；Ｈｙｇｒｏ^r、ヒグロマイシン耐性；ＡＭＴ、クロレラウイルスからのアデニルメチルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーター；３５Ｓ、カリフラワーモザイクウイルスからの３５ＳＲＮＡのプロモーター；ＰＫＲ、ヒトＰＫＲに対するｃＤＮＡ；ｍｕＰＫＲ、ＰＫＲのリジン（アミノ酸＃２９６）からアルギニンへの変異型に対するｃＤＮＡ；シンテターゼ、ヒトＰＫＲに対するｃＤＮＡ；ｍｕＰＫＲ、ＰＫＲのリジン（アミノ酸＃２９６）からアルギニンへの変異型に対するｃＤＮＡ；シンテターゼ、ヒト２−５Ａシンテターゼの低分子量型に対するｃＤＮＡ；２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ、ヒト２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅに対するｃＤＮＡ；ＴＥＲ、ＲＮＡ終始シグナル。図１４は、Ｔｉを基礎とした、約１４．６ＫｂｐのバイナリーベクターｐＡＭ８２２の物理的地図を示している。略語：ＢＬ、左側端；ＢＲ、右側端；Ｋａｎ^r 、カナマイシン耐性；Ｈｙｇｒｏ^r、ハイグロマイシン耐性；Ｔｅｔ^r、テトラサイクリン耐性；ＡＭＴ、クロレラウィルス由来のアデニルメチルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーター；３５Ｓ、カリフラワーモザイクウィルス由来の３５ＳＲＮＡに対するプロモーター；ＴＥＲ、ＲＮＡ終止シグナル；ＯｖｉＶ、ＤＮＡの複製開始点。図１５は、ノザンブロットにおいてｍＲＮＡ濃度を測定することにより決定した、トランスジェニックタバコ植物における、ヒト２−５Ａ−合成酵素ＤＮＡｃＤＮＡの発現を示している。構築物Ｃ（ｐＡＭ９４３：合成酵素）を植物中に導入した。対照の葉から（“Ｃ”と標識）、そしてトランスジェニック植物から、ＲＮＡＳＴＡＴ−６０（Ｔｅｌ−ＴｅｓｔＢ．，Ｉｎｃ．）を使用して全ＲＮＡを調製した。３０μｇのＲＮＡをグリオキサルで処理し、１．５％アガロースゲル中で分離した。電気泳動の後、ＲＮＡをマグナグラフ（ＭＳＩ）ナイロン膜に転写し、ランダムプライムにより［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰで標識したヒト２− ５Ａ合成酵素ｃＤＮＡでプローブした。オートラジオグラムは、乾燥したブロットから行った。図１６は、ノザンブロットにおいてｍＲＮＡ濃度を測定することにより決定した、トランスジェニックタバコ植物における、変異型および野生型ヒトＰＫＲのｃＤＮＡの発現を示している。野生型および変異型（２９６番のリジンがアルギニンに置換）のＰＫＲをそれぞれコードする、構築物Ａ（ｐＡＭ９４３：ＰＫ６８）およびＢ（ｐＡＭ９４３：ｍｕＰＫ６８）を植物に導入した。対照の葉から（“Ｃ”と標識）、そしてトランスジェニック植物から、ＲＮＡＳＴＡＴ−６０（Ｔｅｌ−ＴｅｓｔＢ．，Ｉｎｃ．）を使用して全ＲＮＡを調製した。３０μ ｇのＲＮＡをグリオキサルで処理し、１．５％アガロースゲル中で分離した。電気泳動の後、ＲＮＡをマグナグラフ（ＭＳＩ）ナイロン膜に転写し、ランダムプライムにより［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰで標識したヒトＰＫＲのｃＤＮＡでプローブした。オートラジオグラムは、乾燥したブロットから行った。図１７は、サザンブロットで決定した、トランスジェニック植物における、２ −５Ａ依存性ＲＮａｓｅのｃＤＮＡの存在を示している。構築物Ｄ／ａ（ｐＡＭ９４３：２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ、アンチセンス）を含むトランスジェニック植物の葉から、ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロマイド）を使用して、ＲｏｇｅｒｓとＢｅｎｄｉｃｈの方法（１９８８，植物分子生物学マニュアル，Ａ６，ｐｐ．１−１０，ＫｌｕｗａｒＡｃａｄｅｍｉｃＰｕｂｌｉｓｈｅｒ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ）に従って、ゲノムＤＮＡを単離した。１０μｇのゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで３７℃、５時間消化し、そして１％アガロースゲル中で分画し、続いてキャピラリー転写法を使用してマグナグラフ（ナイロン転写膜、ＭｉｃｒｏｎＳｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．）に転写した。２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ（プラスミドｐＺＣ５由来）に対するｃＤＮＡを、Ｐｒｉｍｅ− ａ−ｇｅｎｅキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を使用して企業が提供する手順書に従って、ランダムプライムにより［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰ（３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）で標識した。標識した２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅのｃＤＮＡ（１．０ｘ１０^9-ｃ．ｐ．ｍ．／μｇＤＮＡの比活性）を洗浄し、そしてオートラジオグラムは、乾燥した膜から行った。ＤＮＡマーカーの大きさ（キロベース）および位置を示す。“２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅのｃＤＮＡ”（矢印を参照）として示されるバンドは、対照植物のサザンブロットでは欠損していた（データは示していない）。図１８は、ヒトｐ６８キナーゼｍＲＮＡ（ＰＫＲ）のｃＤＮＡコード配列を示している。図１９は、図１８に示しているヒトｐ６８キナーゼｍＲＮＡ（ＰＫＲ）の完全なコード配列の翻訳産物を示している。図２０は、ヒト２−５Ａ合成酵素ｃＤＮＡのコード配列を示している。図２１は、図２０に示しているヒト２−５Ａ合成酵素のコード配列の翻訳産物を示している。図２２：トランスジェニックタバコ植物の確認（Ａ）トランスジェニック植物のサザンブロット全ゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、１％アガロースゲルで電気泳動し、膜に転写し、そして２−５Ａ合成酵素ｃＤＮＡまたはＲＮａｓｅＬのｃＤＮＡから作成した³²Ｐ標識しランダムプライムした断片とハイブリッド形成する。右の数字は、ｋｂｐで表したサイズマーカーである。（Ｂ）トランスジェニック植物のノザンブロット分析全細胞ＲＮＡを単離し、１％ホルムアルデヒドゲルで電気泳動し、膜に転写し、そして（Ａ）におけるものと同一のプローブとハイブリッド形成した。レーン１は対照のタバコ植物；レーン２〜５は２−５Ａ合成酵素およびＲＮａｓｅＬの両方を発現しているトランスジェニック植物；レーン６は２−５Ａ合成酵素のみを発現しているトランスジェニック植物；レーン７はＲＮａｓｅＬのみを発現しているトランスジェニック植物をそれぞれ示している。ＳＹＮは２−５Ａ合成酵素；ＲＬはＲＮａｓｅＬをそれぞれ示している。（Ｃ）は、発現プラスミドの部分的地図を示している。図２３：トランスジェニック植物中でのＲＮａｓｅＬタンパク質の免疫検出トランスジェニック植物からの全タンパク質抽出物をＳＤＳ／ＰＡＧＥにより単離し、ニトロセルロース膜上にブロットし、そして昆虫細胞中で発現しそしてそこから単離した組換えヒトＲＮａｓｅＬタンパク質に対するモノクローナル抗体試薬でプローブする（Ｄｏｎｇ，Ｂ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１４１５３，１９９４）。右側の数字は、ｋＤａで表したタンパク質のサイズマーカーである。ＲＮはヒトＲＮａｓｅＬタンパク質（２００ｎｇ）；ＴＣは対照タバコ植物からのタンパク質抽出物；Ｔ１−Ｔ５はトランスジェニックタバコ植物からのタンパク質抽出物；Ｔ１は２−５Ａ合成酵素のみを発現しているトランスジェニック植物；Ｔ２はＲＮａｓｅＬのみを発現しているトランスジェニック植物；Ｔ３−Ｔ５は２−５Ａ合成酵素およびＲＮａｓｅＬの両方を発現している植物をそれぞれ示している。図２４：２−５ＡはＲＮａｓｅＬタンパク質を発現するトランスジェニック植物中でのｒＲＮＡの変性を誘導する。葉に約２．５μＭの２−５Ａを注入し、全ＲＮＡを３時間後に抽出し、³²Ｐで標識した１８ＳのｃＤＮＡでプローブする。レーン１〜２は対照の植物；レーン３および４は２−５Ａ合成酵素のみを発現している植物（Ｓｙｎ）；レーン５はＲＮａｓｅＬのみを発現している植物（ＲＬ）；レーン６〜７は２−５Ａ合成酵素およびＲＮａｓｅＬの両方を発現している植物（Ｓｙｎ＋ＲＬ）をそれぞれ示している。図２５：トランスジェニック植物は、機能的なヒト組換え２−５Ａ合成酵素を産生する。ヒトＲＮａｓｅＬおよび２−５Ａ合成酵素の両方に対するｃＤＮＡを含む植物の抽出物（レーン８〜１１）、ベクターのみをトランスフォームする対照の植物の抽出物（レーン１２〜１５）、そしてインターフェロン処置したヒトＨｅＬａ細胞の抽出物（レーン１６および１７）を、２−５Ａ合成酵素活性を測定するためにアッセイする。トランスジェニック植物の抽出物中の２−５Ａ合成酵素活性を、２−５Ａに対する機能的アッセイにより測定する。植物抽出物は、約０．５％（ｖ／ｖ）Ｎｏｎ−ｉｄｅｔＰ−４０、約９０ｍＭのＫＣｌ、約５ｍＭの酢酸マグネシウム、約２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ約７．５、約５ｍＭの２−メルカプトエタノール、そして約１０μｇ／ｍｌのロイペプチンを含む、ＮＰ４０融解緩衝液中で葉をホモジナイズすることにより調製する。全細胞融解液は、約１０，０００ｘｇで約１０分間、約４℃で遠心分離し、上清を回収し、そしてタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．ら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７２：２４８，１９７６）に記載されているように決定する。インターフェロン処理した（約２００単位／ｍｌのヒトインターフェロンαで約１８時間）ヒトＨｅＬａ細胞の抽出物を、細胞をボルテックスで混和することにより破砕する以外は、同一の方法により調製する。アッセイごとにＮＰ−４０融解緩衝液で約６５μｌに調節した約２００μｇ（タンパク質）の抽出物を、約２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ約７．５、約５０ｍＭのＫＣｌ、約５ｍＭの酢酸マグネシウム、約４ｍＭの塩化マグネシウム、約５ｍＭの２−メルカプトエタノール、約１０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、約２ｍＭのＡＴＰ、約２０μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）の約６５μｌ（アッセイごとに）と、約３０℃で約２４時間インキュベートすることにより、２−５Ａ合成酵素アッセイを行う。反応混合物を約１００℃にして約５分間加熱することにより反応を停止し、そしてタンパク質を変性し除去し、ついで約１０，０００ｘｇで約１０分間遠心分離する。上清を回収し、スピードバック（Ｓａｖａｎｔ）中で約２０μｌにまで濃縮する。ついで２−５Ａ依存性リボヌクレアーゼＬアッセイにより２−５Ａをアッセイする。濃縮した上清（植物あたり約５および約１０μｌ）、あるいは本物の２− ５Ａ（ｐＡ（２’ｐ５’Ａ）₃）の希釈液を、約０．２ｍＭのポリ（Ｕ）−（³²Ｐ） −ｐＣｐ（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｒ．Ｈ．ｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４４：４５０，１９８５に記載されているように調製）を含む緩衝液中（約９０ｍＭのＫＣｌ、約１０ｍＭの酢酸マグネシウム、約２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ約７．５、約８ｍＭの２−メルカプトエタノールそして約１０ μｇ／ｍｌのロイペプチン）、約２５μｌの最終容量中で、約１μｇの組換えヒトＲＮａｓｅＬ（Ｄｏｎｇ，Ｂ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１４１５３，１９９４）とともにインキュベートし、そして約３０℃で約２時間インキュベートする。反応を約７．５μｌの停止緩衝液により停止し、約５分間沸騰させ、簡単に遠心分離し、そして約３μｌを６％ポリアクリルアミド／尿素ゲルにロードする。電気泳動の後、Ｘ線フィルムをゲルに暴露する。２ −５Ａは、昆虫細胞中で発現しそれから単離されたＲＮａｓｅＬ（Ｄｏｎｇ，Ｂ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１４１５３，１９９４）をポリ（Ｕ）を切断して個々別々の産物（矢印）にするように活性化する能力によりモニターする。レーン１〜７は本物のｐＡ（２’ｐ５’Ａ）３によるＲＮａｓｅＬの活性化を示している。シークエンスゲルのオートラジオグラムを示している。図２６：局部的な傷害を示すウィルスを接種した葉トランスジェニックまたは対照の植物から採取した葉を、ＴＥＶ、ＴＭＶあるいはＡＩＭＶのいずれかで機械的に接種する。トランスジェニック植物は、温室の中で成長させる。これらの植物から採取した葉を葉柄の部分で切断し、そしてペトリ皿中の湿らせたフィルター紙上に静置する。インキュベーションの期間ペトリ皿中で維持される葉は、生理学的によい状態を維持し続ける。タバコ腐食（ｅｔｃｈ）ウィルス（ＴＥＶ、重症系統、ＡＴＣＣ＃ＰＶ６９）、ＴＭＶ（一般的系統）、そしてアルファルファモザイクウィルス（ＡＩＭＶ、ネブラスカ系統）が全体的に感染したタバコの葉から新しく調製した抽出物の約１：２００、１：１０００、そして１：１５０希釈液それぞれを、葉に接種する。１：１０，０００、１：１００，０００そして１：１５，０００に希釈した液汁で接種した場合に、６種の対照植物のうち６種で全体的な感染が起こる。ウィルスを接種した後、葉を水で洗い、そしてペトリ皿をのばしたパラフィルムでシールし、約２２度で約１８時間の光条件のもと約７日間インキュベーター中に静置する。パネルａ、ｃ、ｅでは２−５Ａ合成酵素およびＲＮａｓｅＬの両方を発現する植物；パネルｇでは２−５Ａ合成酵素のみを発現する植物；パネルｈではＲＮａｓｅＬのみを発現する植物をそれぞれ示している。対照の植物（パネルｂ、ｄおよびｆ）は、ベクターのみの構築物をトランスジェニックしたものである。図２７では、（Ａ）ゲノムＤＮＡのサザンブロットおよび（Ｂ）対照植物（レーン１）およびヒト２−５Ａ合成酵素のトランスジェニックであった２種の植物（レーン２および３）の全ＲＮＡをヒト２−５Ａ合成酵素ｃＤＮＡでプローブするノザンブロットを示している。図２８では、対照植物（レーン１）およびヒトＲＮａｓｅＬのトランスジェニックである３種の植物（レーン２〜４）から採取したゲノムＤＮＡを、ヒトＲＮａｓｅＬのｃＤＮＡでプローブするサザンブロットを示している。図２９は、³²Ｐ−標識２−５Ａプローブと共有結合的に架橋させた後のＲＮａｓｅＬの検出を示している。対照植物（レーン１および２）、ヒトＲＮａｓｅＬのｃＤＮＡをトランスジェニックした植物（２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ）（レーン３〜１２）あるいはヒトＭＣＦ−７細胞（レーン１３および１４）からの抽出物を、紫外光下で³²Ｐ−標識２−５Ａプローブとインキュベートし、ＲＮａｓｅＬとの架橋形成を誘導する。架橋の特異性は、過剰量の非標識２−５Ａ（示したように）で測定する。タンパク質マーカーの位置および分子量（ｋＤａ）およびＲＮａｓｅＬの位置（矢印）を、乾燥したＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラム上に示す。図３０は、切断した葉中のＲＮａｓｅＬが、２−５Ａを含む溶液中でインキュベーションすることにより、ｒＲＮＡを切断するように活性化されることを示している。³²Ｐ−標識ｃＤＮＡで１８ＣのｒＲＮＡに対してプローブしたノザンブロットを示している。切断した葉は、対照の植物（レーン１および２）あるいはヒトＲＮａｓｅＬのｃＤＮＡをトランスジェニックした植物（レーン３および４）から採取する。２−５Ａの存在あるいは非存在、および２−５Ａ媒介性ｒＲＮＡ切断産物の位置を示している。発明の詳細な説明本発明のより完全な理解そしてそれに付随する利点の多くを示しそして提供するものとして、新規な２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ、それのコード配列、組換えヌクレオチド分子、構築物、ベクター、組換え細胞、抗ウィルストランスジェニック植物および方法に関する、以下の詳細な説明および実施例を提供する。２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅは、非常に量が少ないため（マウス肝臓中の全タンパク質量の１／５００，０００、Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｒ．Ｈ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：７３３６−７３４１，１９８８）、そのクローニングのためには、感度の高いスクリーニングの方法を確立することが必要である。２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの基礎的濃度が高いことから、マウスＬ９２９細胞をｍＲＮＡの供給源として選択する。２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの最適な誘導が細胞をインターフェロンおよびシクロヘキシミドの両方で処理しついで培養液のみで処理することにより得られるという観察に基づいて、２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅのｍＲＮＡ濃度を高めるためのプロトコルを開発する（実施例を参照）。ｃＤＮＡライブラリーは、ＤＮＡ結合タンパク質のクローニングのために開発された技術を応用することによりスクリーニングし（Ｓｉｎｇｈ，Ｈ．ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，５２：４１５−４２３，１９８８；Ｓｉｎｇｈ，Ｈ．ｅｔａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，７：２５２−２６１，１９８９）、その中で臭素置換³²Ｐ−標識２−５Ａ類似体（“２−５Ａプローブ”）（実施例、およびＮｏｌａｎ−Ｓｏｒｄｅｎ，Ｎ．Ｌ．ｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８４：２９８−３０４，１９９０）を放射線標識のオリゴデオキシリボヌクレオチドと置換した。このようにして約３，０００，０００のプラークから単一のクローン（ＺＢ１）を単離する。ＺＢ１クローンから発現され、プラークからフィルターリフトに転写されるタンパク質は、２−５Ａプローブおよび２ −５Ａ依存性ＲＮａｓｅに対する高度に精製されたポリクローナル抗体の両方に対して反応性を示す。特性を調べるための組換えタンパク質を得るために、ｃＤＮＡを無細胞系で転写し翻訳する（実施例を参照）。ついで２−５Ａ結合活性を、ＵＶ光下で２−５Ａプローブをタンパク質に対して共有結合的に架橋することにより測定する（たとえば、Ｎｏｌａｎ−Ｓｏｒｄｅｎ，Ｎ．Ｌ．ｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８４：２９８−３０４，１９９０を参照）。小麦胚抽出物中で生成した組換え７４ｋＤａタンパク質は、２−５Ａプローブに対して特異的な親和性を示す（図２Ａ、レーン１〜３を参照）。５’−ホスホリル基を欠く２−５Ａの核となる誘導体、（Ａ２’ｐ）₂Ａは、タンパク質が２−５Ａプローブに結合することを阻害することはできないが、一方で三量体２０５Ａ、ｐ₃（Ａ２’ｐ）₂Ａはプローブの結合を完全に阻害する（それぞれ図２Ａ、レーン２および３）。添加ＲＮＡの非存在下でインキュベーションする際に示されるように、小麦胚抽出物中には検出可能な２−５Ａ結合タンパク質は存在しない（図２Ａ、レーン４）。比較のため、ネズミＬ９２９細胞から採取し、オリゴヌクレオチドを添加せず、または競争物として（Ａ２’ｐ）₂Ａまたはｐ₃（Ａ２’ｐ）₂Ａを添加してインキュベートした、８０ｋＤａの２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅについて、２ −５Ａ結合活性の同様なプロフィールを得る（図２Ａ、レーン５から７）。３５Ｓ−標識翻訳産物を、図２Ａ、レーン９に示す。さらなる比較において、２−５Ａプローブを約７４ｋＤａのタンパク質に対してそしてネズミＬ９２９細胞の２ −５Ａ依存性ＲＮａｓｅに対して共有結合させた後、キモトリプシンで部分的に消化することにより、６種の標識ペプチドの独特のパターンを産生する（図２Ｂを参照）。同様に、２種の標識タンパク質をＳ．ａｕｒｅｕｓのＶ８プロテアーゼで部分的に消化することにより、標識した切断産物の独特のパターンも産生する。これらの結果から、および約８０ｋＤａの２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅと比較して、約７４ｋＤａの組換えタンパク質の見かけ分子量から（図２Ａを参照）、約７４ｋＤａのタンパク質は２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの先端切断したかあるいは部分的なクローンであることが示唆される。ヒト２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの完全なコード配列を得るために、ゲノムおよびｃＤＮＡを含む複合ＤＮＡを構築する（図３Ａを参照）。ヒト腎臓ｃＤＮＡライブラリーを放射線標識ネズミ２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅのｃＤＮＡでスクリーニングすることにより、ヒト２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅのクローン（ＨＺＢ１）の開始ｃＤＮＡ部分を得る（実施例を参照）。コード配列の５’部分を含むゲノムクローンを放射線標識したヒト２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅのｃＤＮＡで単離する。ヒト２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅのヌクレオチドおよび推定されるアミノ酸配列を特定し（図３Ｂ）、その結果として８３，５３９Ｄａのタンパク質をコードするオープンリーディングフレームであることがわかる。タンパク質の保存的な領域を特定しそして評価するために、ヒト型およびネズミ型の２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの推定されるアミノ酸配列間で比較を行う（図４を参照）。ネズミｃＤＮＡ（クローンＺＢ１）は、ネズミゲノムクローンに対してさらに２８の３’−コドンを添加した、２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅに対するコード配列の約８８％を含む。ネズミ型およびヒト型の２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの配列は、オーバーラップの領域において約６５％の同一性を示す（図４を参照）。さらに、ネズミおよびヒトの２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅについての対応するヌクレオチド配列間では、７３％の同一性を有する。ネズミおよびヒトの２− ５Ａ依存性ＲＮａｓｅ双方の見かけ上の翻訳開始コドンは、翻訳の開始のための適切な文脈、すなわちそれぞれＡＣＣＡＴＧＧおよびＧＴＣＡＴＧＧである（図３Ｂを参照、同様にたとえば、Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｃｅｌｌ，４４：２８３−２９２，１９８６も参照）。さらに、ヒトおよびネズミの２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの配列は両方とも、フレーム内停止コドンを翻訳開始点の上流に含む（図３Ｂ参照）。ヒト２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの組換え体および天然体のヒト２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの２−５Ａ結合特性は、２−５Ａプローブに対するＵＶ共有結合的架橋形成により比較する。小麦胚抽出物中で産生する組換えヒト２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅは、２−５Ａに対して特異的な親和性を示す（図５Ａ、レーン１から３を参照）。クローン化ヒト２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅを２−５Ａプローブで放射線標識することは、（Ａ２’ｐ）₂Ａでは阻害されない（図５Ａ、レーン１および２を参照）。これと対照的に、三量体２−５Ａであるｐ₃（Ａ２’ｐ）₂Ａを添加すると、組換え２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅとの結合について効率よく２−５Ａプローブと競合する（レーン３を参照）。インターフェロンで処理したヒトＨｅＬａ細胞の抽出物中において、２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅに対する２−５Ａの結合活性について同一のパターンが得られる（図５Ａ、レーン５から７を参照）。ＨｅＬａ細胞の２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅおよび網状赤血球融解物中で生成した³⁵ Ｓ−標識組換えヒト２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの見かけ分子量は、完全に同一であると考えられる(約８０ｋＤａ)(図５Ａ、レーン５および９を参照)。小麦胚抽出物中で生成した組換えヒト２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅは、おそらくは翻訳後修飾により若干早めに移動する（図５Ａ、レーン１、２および８を参照）。クローン化２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅのリボヌクレアーゼ活性を示しそして特徴づけるために、網状赤血球融解物系における方が事実上タンパク質合成の効率がよいため、翻訳を小麦胚抽出物に代えて網状赤血球融解物中で行う（図５Ａ、レーン９および８を比較して参照）。翻訳の前に、内在性の網状赤血球２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅを親和性マトリックスである２−５Ａセルロースに融解物を吸着させて除去する（実施例を参照、同様にＳｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｒ．Ｈ．ｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４４：４５０−４６０，１９８５を参照）。２−５Ａセルロースでの処理により、融解物からすべての測定可能な内在性２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ活性を効率よく除去する（２−５Ａ依存性リボヌクレアーゼアッセイおよび図５Ｂにより特定される）。さらに、吸着−枯渇（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）プロトコルでは、翻訳の効率を減少しなかった。図５Ａのレーン９および１２は、それぞれ２−５Ａセルロース−前処理のおよび未処理の融解物中で生成された³⁵Ｓ−翻訳産物を示している。活性化親和性マトリックスである２−５Ａセルロース上に翻訳産物を固定化し精製した後、組換え２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅでのリボヌクレアーゼアッセイを行う。以前に示したように、ネズミＬ細胞の２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅは２−５Ａセルロースに結合し、結果としてポリ（Ｃ）に対してはなかったがポリ（Ｕ）に対してはリボヌクレアーゼ活性を示した（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｒ．Ｈ．ｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４４：４５０−４６０，１９８５を参照）。さらに、２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ：２−５Ａセルロースを洗浄し、ついで基質を添加することにより、一般的な非２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの濃度は大きく減少する（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｒ．Ｈ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４４：４５０−４６０，１９８５を参照）。添加したｍＲＮＡの非存在下において、あるいはヒト２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅのｍＲＮＡおよびシクロヘキシミドの両方の存在下において融解物をインキュベーションすることにより、結果としてほんのわずかな濃度のポリ（Ｕ）の分解しか引き起こさない（図５Ｂを参照）。さらに、シクロヘキシミドは２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの合成を完全に阻害することが示されている（図５Ａ、レーン１０を参照）。対照的に、ヒト２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅのｍＲＮＡの翻訳は、阻害剤の非存在下において、結果としてポリ（Ｃ）ではなくポリ（Ｕ）に対する実質的なリボヌクレアーゼ活性を引き起こす（図５Ｂを参照）。ポリ（Ｕ）は、半減期が約１０分で分解されるが、一方でポリ（Ｃ）は１時間のインキュベーションの後にわずか２０％しか分解されない。親和性マトリックスに対する組換え２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの結合は、³⁵ Ｓ−標識翻訳産物の存在をモニターすることによっても示された。これらの結果は、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて生成した組換えヒト２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅが機能的で強力なリボヌクレアーゼであることを示すことが考えられる。さらに、組換え型の２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅおよび天然型の２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの両方が、ポリ（Ｃ）を切断することができないがポリ（Ｕ）は切断することができる（図５Ｂ参照、同様に、Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｒ．Ｈ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４４：４５０−４６０，１９８５およびＦｌｏｙｄ−Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１２：１０２０−１０３２，１９８１を参照）。２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅのｍＲＮＡ濃度がインターフェロンにより調節されているかどうかを調べるため、インターフェロンおよびシクロヘキシミドで処理したネズミＬ９２９細胞からからのノザンブロットを、放射線標識したネズミの２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅのｃＤＮＡでプローブすることで行う（図６を参照）。２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅのｍＲＮＡ濃度は、インターフェロン（α＋β）の処理によりシクロヘキシミドの存在下でさえも、３倍に増進する（図６ＡおよびＢ、レーン１および２を比較して参照）。時間の関数としてのインターフェロンによる２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅのｍＲＮＡ濃度の調節が示される（図６ＡおよびＢ、レーン３から６）。最大の２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅのｍＲＮＡ濃度は、インターフェロン処理の１４時間後に観察された（図６ＡおよびＢ、レーン６）。２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅそれ自体の濃度が同様に上昇することが、細胞をインターフェロンで処理した後に観察される。比較的不変濃度のＧＡＰＤＨのｍＲＮＡにより、等量濃度のＲＮＡが、ブロットのそれぞれのレーンに存在することを示す（図６Ｃを参照）。これらの結果から、２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの発現の誘導がインターフェロン処理の最初の反応であることが示されると考える。ネズミおよびヒト２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅのｍＲＮＡは、ノザンブロットからそれぞれ５．７ｋｂおよび５．０ｋｂの長さであることが特定される（図６Ａを参照）。このことから、２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅのコード配列は、ｍＲＮＡ中に含まれるヌクレオチド配列の約４０％しか含まない。組換え型および天然型のネズミ２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの２−５Ａ結合機能は、競合剤としての非標識２−５Ａあるいは２−５Ａ類似体の存在下において２ −５Ａプローブに対して共有結合的に架橋することによって特徴づけられる（図７を参照）。興味深いことに、約７４ｋＤａの先端切断された２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅは約８４ｋＤａのアミノ酸をカルボキシ末端から欠損したものであるが（図４を参照）、それにも関わらず天然の２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅと区別することができないほどの２−５Ａ結合活性を有する（図７Ａを参照）。三量体の２ −５Ａ［ｐ₃（Ａ２’ｐ）₂Ａ］は、約２０ｎｍの濃度で効果的に２−５Ａプローブがどちらかのタンパク質に結合することを阻害する（図７Ａ、レーン８を参照）。対照的に、両方のタンパク質に対するプローブの結合を阻害するためには、５００倍高い濃度の（Ａ２’ｐ）₂Ａ（１０μＭ）が必要である（レーン１３を参照）。二量体種であるｐ₃Ａ２’ｐＡは、１０μＭの濃度においても、２−５Ａプローブがタンパク質に対して結合することを阻害することができない（レーン１８を参照）。しかしながら、イノシンの類似体であるｐ₃Ｉ２’ｐＡ２’ｐＡ（Ｉｍａｉ，Ｊ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０：１３９０−１３９３，１９８５）は、約１．０μＭの濃度で添加した場合にのみ両方のタンパク質に対するプローブの結合を阻害することができる（レーン２２を参照）。２−５Ａの結合に関与する配列をさらに特定するために、ネズミ２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅのｃＤＮＡ、クローンＺＢ１の、組となった３’−欠損したものを構築し、ｉｎｖｉｔｒｏで転写し、そして小麦胚抽出物中で発現する（図７Ｂを参照）。別個の欠損クローンは、³⁵Ｓ−メチオニンの取り込みによりモニターするように、比較的多量のポリペプチドを産生する。２−５Ａ結合活性のレベルは、膜結合アッセイ（Ｋｎｉｇｈｔ，Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８８：１８９−１９２，１９８０）およびＵＶ架橋アッセイ（Ｎｏｌａｎ−Ｓｏｒｄｅｎ，Ｎ．Ｌ．ｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８４：２９８− ３０４，１９９０）の両方において同様な結果が得られることを、２−５Ａプローブを使用して測定する（図７Ｂを参照）。アミノ酸残基１−３４２をコードするクローンＺＢ１１の発現により、結果としてクローンＺＢ１（アミノ酸残基１ −６５６）と比較した場合に２−５Ａ結合活性のうち約２６％しか損失していないことがわかる（図７Ｂを参照）。長さがＺＢ１とＺＢ１１の間であるクローン中間体のすべてが、結果として顕著なレベルの２−５Ａ結合活性を有する。対照的に、ＺＢ１３（アミノ酸残基１−２９４）から産生されるタンパク質は、結果としてクローンＺＢ１の２−５Ａ結合活性の約３８．３％しか有さず、そのことは２−５Ａ結合作用に対して重要な領域が影響を受けることを示唆している。実際、クローンＺＢ１４はアミノ酸残基１−２６５をコードするタンパク質を産生するが、それは２−５Ａ結合アッセイに関してはほとんど不活性である（クローンＺＢ１の活性の約１．９％のみ）。興味深いことに、ＺＢ１４で観察される２ −５Ａ結合活性の顕著な減少は、１または２個のＰ−ループモチーフ（多くのタンパク質においてヌクレオチド結合ドメイン）が欠損することにより起こる（図４および図７Ｂを参照、同様に、Ｓａｒａｓｔｅ，Ｍ．ｅｔａｌ．，ＴＩＢＳ，１４：４３０−４３４，１９９０も参照）。クローンＺＢ１５において両方のＰ−ループモチーフを欠損したところ、結果として２−５Ａ結合活性を完全に欠損するタンパク質（アミノ酸１−２１８）を産生する（図７Ｂを参照）。２−５Ａ結合活性におけるＰ−ループモチーフにおいて、コンセンサスリジン残基の関与をプローブするため、クローンＺＢ１によってコードしたネズミ２− ５Ａ依存性ＲＮａｓｅの先端切断型に対して、部位特定的変異誘導（サイト・ダイレクテド・ミュータジェネシス）を行う。以前に、真核細胞の開始因子４ＡのＰ−ループモチーフにおける保存的リジン残基の置換変異およびＢａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓのアデニリルシクラーゼに対する置換変異により結果としてＡＴＰ結合活性およびＡＴＰ触媒活性がそれぞれ減少することが報告されている（Ｒｏｚｅｎｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，９：４０６１−４０６３，１９８９およびＸｉａ，Ｚ．ａｎｄＳｔｏｒｍ，Ｄ．Ｒ．，ＪＢｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：６５１７−６５２０，１９９０を参照）。前者の研究において、不変のリジン残基をアスパラギンに変更させる（Ｒｏｚｅｎｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，９：４０６１−４０６３，１９８９を参照）。我々は、２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの２個のＰ−ループモチーフにおける２４０番および２７４番のコンセンサスのリジンをアスパラギンに、単独であるいは組み合わせて置換した（図８および実施例を参照）。これらの変異の２−５Ａ結合活性に対する効果の解析は、ＵＶ光下におけるｉｎｖｉｔｒｏ翻訳産物に対する³²Ｐ−２−５Ａプローブの共有結合的架橋により測定する（図８Ａ、Ｎｏｌａｎ−Ｓｏｒｄｅｎ，Ｎ．Ｌ．ｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８４：２９８−３０４，１９９０を参照）。³⁵Ｓ−メチオニンを含む別個の反応において示すように、タンパク質の同様の濃度を別個のｍＲＮＡ種から合成する（図８Ｂを参照）。２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの３種の変異体において、２−５Ａプローブに対する結合が減少することが示される（図８Ａ、レーン２から４）。クローンＺＢ１（Ｌｙｓ²⁴⁰→Ａｓｎ）（図８Ａ、レーン２）は、実質的には２−５Ａに対する親和性が低下した２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅを発現し、すなわち乾燥ゲルのＰｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ分析（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ）により測定されるように、クローンＺＢ１の活性の約４８．４％の活性しかない。２−５Ａ結合活性においてより穏やかに減少するものは（対照値の約７９％）は、クローンＺＢ１（Ｌｙｓ²⁷⁴→Ａｓｎ）から得られる（図８Ａ、レーン３）。対照的に、保存的リジン残基を両方ともアスパラギン残基に置換したものである、クローンＺＢ１（Ｌｙｓ²⁴⁰，²⁷⁴→Ａｓｎ）から得られる２−５Ａ結合活性（図８Ａ、レーン４）は、クローンＺＢ１の活性のわずか１２．２％に減少する（３回の別個の実験からの平均）。これらの結果から、２−５Ａの２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅに対する結合の際に、２４０番および２７４番のリジン残基が反復Ｐ−ループモチーフの文脈中において機能することが示される。２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの分子クローニングおよび発現、２−５Ａ系における終末因子、そしてインターフェロン作用の分子機構における鍵となる酵素について記述する（図１を参照）。ｉｎｖｉｔｒｏにおいて生成した組換えタンパク質は、天然に発生する型のネズミおよびヒト２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅと同一の２−５Ａ結合特性を有することを示す（図２、図５Ａおよび図７を参照）。さらに、先端切断したネズミ２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅおよびネズミＬ細胞２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅに対する³²Ｐ−２−５Ａ類似体の架橋に続いて、部分的にタンパク質融解をすることにより、標識ペプチドの同一のパターンを示す（図２Ｂを参照）。さらに、活性化親和性マトリックスである２−５Ａセルロース上で単離された完全長の組換えヒト２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅは、ポリ（Ｃ）には示さないがポリ（Ｕ）に対しては強力なリボヌクレアーゼ活性を示す（図５Ｂを参照）。同様に、以前に示されたことであるが、ネズミＬ細胞の２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅは２−５Ａセルロースにより活性化され、結果としてポリ（Ｃ）は切断しないがポリ（Ｕ）は切断した（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｒ．Ｈ．ｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４４：４５０−４６０，１９８５を参照）。網状赤血球の融解物中で生成した完全長のヒト２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅは、天然に発生する２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅと同じように、同一の見かけ分子量を有する（図５Ａを参照）。しかしながら、ヒト２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの実際の分子量は、推定されるアミノ酸配列（図３Ｂ）から約８３，５３９Ｄａであると測定される。以前に報告したように、インターフェロンにより細胞の種類により２−から２０倍に２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの濃度が上昇する（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｒ．Ｈ．ｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２６：３３３−３４１，１９８２ｂおよびＪａｃｏｂｓｅｎ，Ｈ．ｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１２５：４９６−５０１，１９８３ａを参照）。本明細書中で示した結果から、２ −５Ａ依存性ＲＮａｓｅに対する遺伝子はインターフェロン刺激化の遺伝子であり得る（図６を参照）。ネズミＬ９２９細胞における２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅのｍＲＮＡ濃度は、インターフェロン（α＋β）処理の時間の関数として、約３の因子で上昇する。さらに、シクロヘキシミドの存在下において観察されるため、誘導はインターフェロン処理の最初の反応であるように見えた。そのため、インターフェロンは、２−５Ａシンテターゼの合成のレベル（Ｈｏｖａｎｅｓｓｉａｎ，Ａ．Ｇ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２６８：５３７−５３９，１９７７）および２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅのレベル（Ｊａｃｏｂｓｅｎ，Ｈ．ｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１２５：４９６−５０１，１９８３ａ）を両方とも上昇することにより２−５Ａ経路を調節していると考えられる（図１、６および１１を参照）。２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅのクローニングから、タンパク質の幾つかの特徴が示される。その他のヌクレアーゼと区別されるのは２−５Ａにより活性化されるという２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの能力であるため、２−５Ａ結合ドメインは特に興味深い。ネズミ２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの一組の３’−欠損を発現することにより、２−５Ａ結合活性に対して中心的であると考えられているアミノ酸残基２１８と２９４の間にある領域を特定する（図７Ｂを参照）。興味深いことに、特定される領域には残基２２９から２４１までに１回、そして残基２５３から２７５までにもう一回、反復したＰ−ループモチーフが含まれる（図４および表２を参照）。後者のＰ−ループモチーフ（アミノ酸２５３−２７５）を部分的に削除する場合、２−５Ａ結合活性が急速に減退する（図７ＢにおけるクローンＺＢ１４）。ヒト型およびネズミ型の２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ間でのＰ−ループの相同性は、高度に保存されていると考えられ、従って２−５Ａ結合活性に対するこの領域の重要性が考えられることを強調している（図４を参照）。Ｐ−ループの同一性は、グリシンの豊富な配列の前に３ペプチドの、すなわちグリシン−リジン− トレオニンがあることで構成される。この点においては、２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの通常はない構造として、Ｐ−ループモチーフが反復し、そして同一の方向であるものがある。Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓから採取したアデニリルシクラーゼには、複製されたＰ−ループモチーフも含まれるが、しかし、２種の配列は反対の方向に挿入されており、そしてオーバーラップしている（Ｘｉａ，Ｚ．ａｎｄＳｔｏｒｍ，Ｄ．Ｒ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：６５１７−６５２０，１９９０を参照）。保存されたＰ−ループリジン（２４０番および２７４番）の相対的な重要性は、ネズミ２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅであるクローンＺＢ１の部位特定的変異誘導（サイト・ダイレクテド・ミュータジェネシス）により評価する。２個のリジンに別々に置換変異を起こした場合２−５Ａ結合活性は顕著に減少するが、同一の変異ＲＮａｓｅ中の両方のリジンをアスパラギン残基に置換することにより、２ −５Ａ結合は極度に減少する（図８を参照）。おそらくは、２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅのほとんどの型の活性化に必要とされる三量体２−５Ａが、２−５Ａの第一あるいは第三のアデニリル残基が別個のＰ−ループ配列と相互作用して２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの構造的な変化を引き起こすかどうかを説明することができる。この点において、二量体２−５Ａは、おそらくは２つのＰ−ループモチーフを覆うためには短すぎるため、２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅに効率よく結合することも、２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅを活性化することもない（図７Ａ、Ｋｅｒｒ，Ｉ．Ｍ．およびＢｒｏｗｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｐｒｏｄ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５：２６５−２６０，１９７８およびＫｎｉｇｈｔ，Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８８：１８９−１９２，１９８０）。選択的には、点変異体であるＺＢ１（Ｌｙｓ²⁴⁰→Ａｓｎ）およびＺＢ１（Ｌｙｓ²⁷⁴→Ａｓｎ）において観察される残存する２−５Ａの結合活性、および２−５Ａの二重変異体であるＺＢ１（Ｌｙｓ²⁴⁰，²⁷⁴→Ａｓｎ）の非常に低い親和性から、２つのＰ−ループモチーフが別個の２−５Ａ結合ドメインの部分であることを示しうる。タンパク質キナーゼドメインＶＩおよびＶＩＩとの相同性を有する部分も、２ −５Ａ依存性ＲＮａｓｅ中に特定される（図４、同様にＨａｎｋｓ，Ｓ．Ｋ．ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：４２−５２，１９８８を参照）。ドメインＶＩはＡＴＰとの結合に関与していると考えられているが、２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ中のこの領域の欠損が２−５Ａに対する親和性を最小限しか減少しないため、２−５Ａ結合に対しては重要ではないと考えられている（図７Ｂを参照）。しかしながら、２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ活性に対するＡＴＰの緩やかな刺激活性（２倍）が報告された（Ｗｒｅｓｃｈｎｅｒ，Ｄ．Ｈ．ｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２４：２６１−２６８，１９８２およびＫｒａｕｓｅ，Ｄ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１：６８３６−６８３９，１９８６を参照）。後者の報告は、ＡＴＰは２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの活性には必要ではないが、酵素を安定化するために働きうることを示した。そのため、タンパク質キナーゼと相同性を有する領域がおそらくはＡＴＰと結合し、結果として酵素の安定化を通じてリボヌクレアーゼ活性の刺激を引き起こしうる。構造ＣＸ₄ＣＸ₃ＣＸ₁₇ＣＸ₃ＣＸ₃Ｃ（表２中のアミノ酸残基４０１−４３６）を有する６システイン残基から成る、コンセンサスのジンクフィンガードメイン（ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｄｏｍｅｉｎ）（Ｅｖａｎｓ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄＨｏｌｌｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｍ．，Ｃｅｌｌ，５２：１−３，１９８８において総説されている）を、ネズミ型の２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ中に特定する（図４を参照）。ヒト型２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ中の相同性領域は、ＣＸ₁₁ＣＸ₂₅ＣＸ₃ ＣＸ₆Ｃ（表１中のアミノ酸残基３９５−４４４）である。ジンクフィンガーは核酸結合ドメインであるため、２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ中のシステインリッチの領域は、ＲＮＡ基質との結合に関与しうる。選択的には、２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ中のシステインリッチの領域は、２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ二量体の形成を媒介しうる。２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの粗調製物を解析することにより、２ −５Ａ依存性ＲＮａｓｅが希釈抽出物中では起こらない二量体形成が濃縮抽出物中では起こりうることを示唆する（Ｓｌａｔｔｅｒｙ，Ｅ．ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：４７７８−４７８２，１９７９およびＷｒｅｓｃｈｎｅｒ，Ｄ．Ｈ．ｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２４：２６１−２６８，１９８２を参照）。他のリボヌクレアーゼのアミノ酸配列と２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅとの比較により、Ｅ．ｃｏｌｉから採取したエンドリボヌクレアーゼであるＲＮａｓｅＥといくつかの限定的な相同性を有する部位を特定する（図９Ａを参照、Ａｐｉｒｉｏｎ，Ｄ．ａｎｄＬａｓｓａｒ，Ａ．Ｂ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５３：１７３８−１７４２，１９７８およびＣｌａｖｅｒｉｅ−Ｍａｒｔｉｎ，Ｆ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：２８４３−２８５１，１９９１を参照）。ＲＮａｓｅＥとの相同性を有する部位は、ヒト型およびネズミ型２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの間で比較的保存されている部分であり、そして約２００アミノ酸残基の領域の範囲である。これらの領域の中に、ＲＮａｓｅＥとヒト型およびネズミ型２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅとの間にそれぞれ２４％および３２％の同一な、そしていくつかのギャップを伴う保存的なマッチした配列が存在する（図９Ａを参照）。ＲＮａｓｅＥをコードするｒｎｅ遺伝子および変化したｍＲＮＡ安定化（ａｍｓ）遺伝子（Ｏｎｏ，Ｍ．ａｎｄＫｕｍａｎｏ，Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１２９：３４３−３５７，１９７９）は、同一の遺伝子的位置に認められる（Ｍｕｄｄ，Ｅ．Ａ．ｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４：２１２７−２１３５，１９９０；Ｂａｂｉｔｚｋｅ，Ｐ．ａｎｄＫｕｓｈｎｅｒ，Ｓ．Ｒ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１−５，１９９１；およびＴａｒａｓｅｖｉｃｉｅｎｅ，Ｌ．ｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５：８５１−８５５，１９９１を参照）。ＲＮａｓｅＥは、Ｅ．ｃｏｌｉ中での効率的なｍＲＮＡのターンオーバーおよびｒＲＮＡの切断の両方に必要とされる（Ｍｕｄｄ，Ｅ．Ａ．ｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４：２１２７−２１３５，１９９０；およびＢａｂｉｔｚｋｅ，Ｐ．ａｎｄＫｕｓｈｎｅｒ，Ｓ．Ｒ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１−５，１９９１を参照）。２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅおよびＲＮａｓｅＥの切断の特異性は、２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅが主としてＵＵまたはＵＡの後を切断し（Ｗｒｅｓｃｈｎｅｒ，Ｄ．Ｈ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８９：４１４−４１７，１９８１ａ；およびＦｌｏｙｄ−Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１２：１０２０−１０３２，１９８１を参照）、そしてＲＮａｓｅＥが通常は（ＧまたはＡ）ＡＵＵ（ＡまたはＵ）の中心部分のＡＵＵ中を切断する（Ｅｈｒｅｔｓｍａｎｎ，Ｃ．Ｐ．ｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，６：１４９−１５９，１９９２）点で同様である。ＲＮａｓｅＥの相同性部位およびその他の２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ中に特定された特徴を示している（図９Ｂを参照）。これらの知見から、ＲＮａｓｅＥが２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの先祖前駆体であり得る可能性が考えられる。この点において、Ｅ．ｃｏｌｉ中の２’，５’−オリゴアデニレートの存在を示している（Ｂｒｏｗｎ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄＫｅｒｒ，Ｉ．Ｍ．，ＰｒｏｃｅｓｓｉｎＣｌｉｎｉｃａｌａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ，２０２：３−１０，１９８５；およびＴｒｕｊｉｌｌｏ，Ｍ．Ａ．ｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６９：１６７−１７３，１９８７を参照）。しかしながら、完全な２−５Ａ系（すなわち、２−５Ａ合成酵素と２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ）の進化的分布は、は虫類以降、あるいは可能性があったとして両生類からしか始まらないと報告されている（Ｃａｙｌｅｙ，Ｐ．Ｊ．ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１０８：１２４３−１２５０，１９８２を参照）。エンドリボヌクレアーゼは、ＲＮＡの分解における速度限定的な触媒作用により、ＲＮＡ代謝において調節的な働きをする（Ｂｒａｗｅｒｍａｎ，Ｇ．，Ｃｅｌｌ，５７：９−１０，１９８９を参照）。２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅは、ピコルナウィルスに対するインターフェロンの作用を媒介する、独特に調節されたエンドリボヌクレアーゼである。２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅは、２−５Ａに結合することにより作用し、それに引き続きウィルスのＲＮＡおよび細胞のＲＮＡを分解する（Ｗｒｅｓｃｈｎｅｒ，Ｄ．Ｈ．ｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，９：１５７１−１５８１，１９８１ｂを参照）。さらに、２− ５Ａ系は、インターフェロンの抗増殖作用にそしてＲＮＡの安定性を根本的に調節することに関与しうる。２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅおよび／または２−５Ａ合成酵素の細胞濃度は、インターフェロン処置の間（Ｈｏｖａｎｅｓｓｉａｎ，Ａ．Ｇ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２６８：５３７−５３９，１９７７；およびＪａｃｏｂｓｅｎ，Ｈ．ｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１２５：４９６− ５０１，１９８３ａ）、細胞増殖の捕捉の間（Ｓｔａｒｋ，Ｇ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７８：４７１−４７３，１９７９；およびＪａｃｏｂｓｅｎ，Ｈ．ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：４９５４−４９５８，１９８３ｂ）、細胞の分化の間（Ｋｒａｕｓｅ，Ｄ．ｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４６：６１１−６１８，１９８５）、ホルモン状態の変化の間（たとえば、Ｓｔａｒｋ，Ｇ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７８：４７１−４７３，１９７９）、そして肝臓の再生の間（Ｅｔｉｅｎｎｅ−Ｓｍｅｋｅｎｓ，Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：４６０９−４６１３，１９８３）、調節されている。しかしながら、２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅおよび２−５Ａ合成酵素の基礎的濃度は、すべてではないがほとんどのほ乳類の細胞中に存在する。別々の細胞内位置に複数の型の２−５Ａ合成酵素が存在する（Ｈｏｖａｎｅｓｓｉａｎ，Ａ．Ｇ．ｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．，６：１２７３−１２８０，１９８７）ことから、２−５Ａ系の多様な機能が示されうる。同様に、高等動物において２−５Ａ系が偏在的に存在することから、２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅについての機能の重要性が示唆される（Ｃａｙｌｅｙ，Ｐ．Ｊ．ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１０８：１２４３−１２５０，１９８２）。たとえば、２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅは正常のリボソームにおいて特異的な部位でｒＲＮＡを切断し（Ｗｒｅｓｃｈｎｅｒ，Ｄ．Ｈ．ｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，９：１５７１−１５８１，１９８１ｂ；およびＳｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｒ．Ｈ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４６：１０５１−１０５５，１９８３）、おそらくは翻訳の速度に影響を与える。２−５Ａの一過性の性質（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｂ．Ｒ．Ｇ．ｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９２：４５５−５６２，１９７８）および細胞中に導入した後のその成長阻害効果（Ｈｏｖａｎｅｓｓｉａｎ，Ａ．Ｇ．ａｎｄＷｏｏｄ，Ｊ．Ｎ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１０１：８１−８９，１９８０）から、２−５Ａ系は厳密に調節された経路であることが示される。実施例１ｃＤＮＡライブラリーを調製するためのｍＲＮＡの供給源は、約１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）と抗生物質を添加したＥＭＥＭ（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｉｎｃ．）中で増殖したネズミＬ９２９細胞である。細胞を約５０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドと１０００単位／ｍｌのネズミインターフェロン（α＋β）（１．３ｘ１０⁷単位／ｍｇのタンパク質：ＬｅｅＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ）で約２．５時間処理し、２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅのｍＲＮＡ濃度を上昇させる。ついで全ＲＮＡを単離し（たとえば、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ａｎｄＳａｃｃｈｉ，Ｎ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２：１５６−１５９，１９８７）、記載されているように、ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）− セルロースクロマトグラフィーにより調製する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔａｌ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８９）。第一鎖（ｆｉｒｓｔｓｔｒａｎｄ）ｃＤＮＡの合成は、５−メチル−ｄＣＴＰをｄＣＴＰに置換し、ＸｈｏＩ−オリゴ−ｄＴのアダプタープライマー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用すること以外は記載されているように逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ；ＢＲＬ）を使用することにより行う。第二鎖のｃＤＮＡの合成およびＥｃｏＲＩリンカーのライゲーションを記載されているように行った（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、あらかじめ消化したλＺＡＰＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に一方向性にクローン化する。ライブラリーは、ＧｉｇａｐａｃｋＧｏｌｄ抽出物を使用してパッケージし、そしてＰＬＫ−Ｆバクテリアを用いてタイターを測定する。ｃＤＮＡライブラリーは、あらかじめ増幅することなく直接的に、１５０ｍｍの培養プレートにつき約２５，０００のファージ密度でスクリーニングする。ファージは、プラークが見えるようになるまで、約４２℃で３．５時間増殖する。ＩＰＴＧ（１０ｍＭ）で飽和させその後乾燥したニトロセルロース膜をプレート上にのせ、３７℃でさらに４から６時間成長を継続させた。膜は、Ｓｉｎｇｈ，Ｈ．ら（Ｃｅｌｌ，５２：４１５−４２３，１９８８）およびＳｉｎｇｈ，Ｈ．ら（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，７：２５２−２６１，１９８９）の方法を改良することにより処理する。約６Ｍのグアニジン−ＨＣｌを含む氷冷した結合緩衝液（約２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、約ｐＨ７．５、約２０ｍＭの酢酸マグネシウム、約５０ｍＭのＫＣｌ、約１ｍＭのＥＤＴＡ、約５０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、約０．１ｍＭのＰＭＳＦ、約５％のグリセロール）で、膜を約２０分間洗浄する。ついで膜を含む溶液を結合緩衝液で２倍に希釈し、氷上でさらに約５分間洗浄を続け、グアニジンの濃度が約１８７ｍＭになるまで連続的に２倍希釈を続けた。ついで膜を結合緩衝液で２回洗浄し、そして約５％の無脂乳を含む結合緩衝液でおよそ室温において１時間インキュベートする。ついで膜を結合緩衝液で２回洗浄し、ｐ（Ａ２’ｐ）₂（ｂｒ⁸Ａ２’ｐ）₂Ａ３’−［³²Ｐ］Ｃｐ（“２−５Ａプローブ”）（Ｎｏｌａｎ−Ｓｏｒｄｅｎ，Ｎ．Ｌ．ｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８４：２９８−３０４，１９９０）を約２ｘ１０⁵カウント／分・ｍｌ（約３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）で含む結合緩衝液中（約０．２５％脱脂粉乳、および約０．０２％アジ化ナトリウムを添加）で、約４℃で振とうしながら約２４時間インキュベートする。膜を結合緩衝液で２回洗浄し、水で２回洗浄し、風乾した後フィルムに暴露する。ネズミＬ９２９細胞は、約５０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドの存在下あるいは非存在下において約１０００単位／ｍｌのインターフェロン（α＋β）で処理し、ついで全ＲＮＡを記載されているように分離する（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ａｎｄＳａｃｃｈｉ，Ｎ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２：１５６−１５９，１９８７を参照）。ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）−セルロースクロマトグラフィーにより、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８９）により記載されているように調製し、そしてグリオキサルアガロースゲル上で分離し、そしてナイトラン膜に転写する。ＲＮＡをＵＶ架橋により膜上に固定化する（Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。ネズミ２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅのｃＤＮＡをランダムプライムにより³²Ｐ−標識し、ついで膜に約４２ ℃でハイブリッド形成する（約５０％のホルムアミド、約１０％の硫酸デキストラン、Ｄｅｎｈａｒｄｔの溶液（約１％ＳＤＳ、６ｘＳＳＰＥ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔａｌ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８９）、約２５０μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ）。ヒト２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅのｃＤＮＡクローンであるＨＺＢ１を、放射線標識（ランダムプライム）したネズミ２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅのｃＤＮＡ（クローンＺＢ１）をプローブとして、λｇｔ１０中の成人ヒト腎臓ｃＤＮＡライブラリーから単離する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔａｌ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８９）。クローンＨＺＢ２２を放射線標識したＨＺＢ１のＤＮＡをプローブとして使用することにより単離する。ゲノムヒト２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅのクローンを、放射線標識したＨＺＢ２２の断片をプローブとして、ベクターｐＶＥ１５中のヒト胎盤コスミドライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から単離する。ネズミゲノム２ −５Ａ依存性ＲＮａｓｅのクローンを、放射線標識した２−５Ａ−ＢＰのｃＤＮＡ（クローンＨＺＢ１）の断片をプローブとして、ベクターλＦＩＸＩＩ中のマウス１２９ＳＶゲノムライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から単離する。ＤＮＡのサブクローニングをＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター中に行う（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。ファージＲＮＡポリメラーゼによるプラスミドの転写は、反応混合物に１５％のジメチルスルフォキシドを添加し、インキュベーションを約３７℃で約９０分間行う以外は、記載されているように（Ｐｒｏｍｅｇａ）ｍＧｐｐｐｐＧの存在下において行う。ＲＮＡはセファデックスＧ５０スパンカラムを使用して精製し、エタノールで沈殿し翻訳をする。タンパク質合成は、記載されているように（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ミクロコッカスのヌクレアーゼで前処理したウサギ網状赤血球融解物中では約３０℃で約１時間、あるいは小麦胚抽出物中ではおよそ室温で１時間、ついで約４０℃で約１２時間行う。翻訳反応には、約５０μＭの硫酸亜鉛を含む。網状赤血球融解物中に存在する内在性の２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅを、セルロース（２−５Ａ−セルロース）に共有結合的に接着する約３０μＭのｐ₂ （Ａ２’ｐ）₃Ａ（Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：１３６３−１３７０，１９８４およびＳｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｒ．Ｈ．ａｎｄＫｒａｕｓｅ，Ｄ．，Ｉ．Ｒ．Ｌ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，ｐｐ．１４９−１９３，１９８７に記載されているように調製）に、記載されているように氷上で約１時間かけて吸着することにより除去する（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｒ．Ｈ．ｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４４：４５０−４６０，１９８５を参照）。２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ：２− ５Ａ−セルロース複合体を約４００ｘｇで約５分間、約２℃で２回遠心分離することにより回収する。上清は、測定可能な濃度の２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅを完全に含まない（図５を参照）。先端切断したネズミ２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅのｃＤＮＡであるＺＢ１の一組の３’−欠損したものを、エクソヌクレアーゼＩＩＩ／Ｓ１ヌクレアーゼ消化により作成し、続いて“Ｅｒａｓｅ−Ａ−Ｂａｓｅ”系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用することにより、KlenowＤＮＡポリメラーゼで埋め込み反応を行う。２−５Ａプローブであるｐ（Ａ２’ｐ）₂（ｂｒ⁸Ａ２’ｐ）₂Ａ［³²Ｐ］Ｃｐの合成、および２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅに対するその架橋を記載されているとおり正確に行う（Ｎｏｌａｎ−Ｓｏｒｄｅｎ，Ｎ．Ｌ．ｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８４：２９８−３０４，１９９０を参照）。簡単に言うと、２−５Ａプローブ（３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅで約０．７から２．５ｎＭ）を細胞抽出物（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｒ．Ｈ．ａｎｄＫｒａｕｓｅ，Ｄ．，Ｉ．Ｒ．Ｌ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，ｐｐ．１４９−１９３，１９８７に記載されているように調製）とともに約１時間、氷上で、未標識オリゴヌクレオチド競争物の存在下あるいは非存在下においてインキュベートする。共有結合的架橋は、ＵＶ光（３０８ｎｍ）のもと、氷上で１時間行い、そしてタンパク質をＳＤＳ／１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離する。２−５Ａプローブを使用して、氷上で約１時間かけて、２−５Ａ結合活性に対する膜をアッセイする（Ｋｎｉｇｈｔ，Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８８：１８９ −１９２，１９８０に記載）。ゲルで精製したタンパク質をゲル中でプロテアーゼ消化する。（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｄ．Ｗ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５２：１１０２−１１０６，１９７７に記載の通り）。２−５Ａセルロースを用いたリボヌクレアーゼアッセイを行う（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｒ．Ｈ．ｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４４：４５０ −４６０，１９８５に記載の通り）。簡単に言うと、融解物を約３０μＭの２− ５Ａ−セルロースに氷上で約２時間吸着させる。ついでマトリックスを遠心し緩衝液Ａで再懸濁することにより３回洗浄する（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｒ．Ｈ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４４：４５０−４６０，１９８５を参照）。ついでマトリックスをポリ（Ｕ）−［³²Ｐ］Ｃｐまたはポリ（Ｃ）−［³²Ｐ］Ｃｐ（両方ともヌクレオチド当量で約１６μＭ）とともに、約３０℃でインキュベートし、酸−沈殿可能な放射活性ＲＮＡの濃度をグラスファイバー膜での濾過により決定する。サンガーのジデオキシ配列決定法を使用し、ＤＮＡ配列を決定する（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ，ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ）。先端切断したネズミ２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ（クローンＺＢ１）中の、２４０番および２７４番のリジンを別々におよび一緒に、アスパラギン残基へ変異する。変異体ＺＢ１（Ｌｙｓ²⁷⁴→Ａｓｎ）および二重変異体ＺＢ１（Ｌｙｓ²⁴⁰，²⁷⁴ →Ａｓｎ）は、ＺＢ１のｃＤＮＡを記載されているように（Ｐｒｏｍｅｇａ）ｐＡＬＴＥＲ−１中にサブクローニングした後、変異オリゴヌクレオチドを使用して得る。変異配列に接着した独自のＨｉｎｃＩＩ部位を含む上流側プライマーと独自のＢｇｌＩＩ部位の下流側第二プライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応によるＺＢ１の分節の増幅の後、変異体ＺＢ１（Ｌｙｓ²⁴⁰→Ａｓｎ）を得る。ついでＨｉｎｃＩＩ−およびＢｇｌＩＩ−消化したポリメラーゼ連鎖反応産物と同様に消化したクローンＺＢ１とをライゲーションする。特異的変異は、コドン２４０についてのＡＡＡ→ＡＡＣとコドン２７４についてのＡＡＧ→ＡＡＣである。変異は、ＤＮＡ配列決定により確定する。実施例ＩＩタバコの種（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍｃｖ．Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）およびＴｉを基礎にしたバイナリベクターｐＡＭ９４３とｐＡＭ８２２をＤｒ．ＡｍｉｔＭｉｔｒａ（ネブラスカ大学植物病理学科、Ｌｉｎｃｏｌｎ，Ｎｅｂｒａｓｋａ）から入手した。ＡｒｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＬＢＡ４４０４およびＥ．ｃｏｌｉ系統のＫ８０２およびＭＭ２９４をＣｌｏｎｅｔｅｃｈ社（ＰａｌｏＡｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社（ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から購入した。植物組織培養培養液であるＭｕｒａｓｈｉｇｅとＳｋｏｏｇの調製混合物（ｒｅａｄｙｍｉｘ）（ＭＳ培地）はＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から購入した。ＰＫＲについてのヒトｃＤＮＡ、リジン→アルギニン変異ＰＫＲ、そして２−５Ａ合成酵素は、Ｄｒ．Ｂ．Ｒ．Ｇ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ（クリーブランド臨床財団、癌生物学部門）より入手した（たとえば、Ｍｅｕｒｓ，Ｅ．ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，６２：３７９−３９０，１９９０；Ｃｈｏｎｇ，Ｋ．Ｌ．ｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．，１１：１５５３−１５６２，１９９２；Ｒｙｓｉｅｋｉ，Ｇ．ｅｔａｌ．，Ｊ．ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＲｅｓ．，９：６４９−６５７，１９８９；Ｂｅｎｅｃｈ，Ｐ．ｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．，４：２２４９−２２５６，１９８５；およびＳａｕｎｄｅｒｓ，Ｍ．Ｅ．ｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．，４：１７６１−１７６８，１９８５を参照）。図３Ａに示した２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅに対するヒトｃＤＮＡは、Ｄｒ．Ｒ．Ｈ．Ｓｉｌｖｅｒｍａｎの研究室（クリーブランド臨床財団、癌生物学部門）でクローン化され、クリーブランド臨床財団の所有物である（Ｚｈｏｕ，Ａ．ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，７２：７５３− ７６５，１９９３を参照）。発現ベクターであるｐＡＭ９４３を使用し、ｃＤＮＡとカナマイシン耐性マーカー遺伝子を含むＴＤＮＡのＡｒｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性転写を得る。プラスミドベクターｐＡＭ９４３の物理的地図にはその構成要素を示している（図１２を参照）。プラスミドｐＡＭ９４３は、クロレラウィルス由来のアデニルメチルトランスフェラーゼ（ＡＭＴ）遺伝子のプロモーターおよびカリフラワーモザイクウィルス由来の野生型３５Ｓプロモーターからなる２つのプロモーターを含む。ベクターは、トランスフォーム植物を選択するために、カナマイシン耐性遺伝子も含む。最初に、ｃＤＮＡをｐＡＭ９４３にサブクローン化し、Ｅ．ｃｏｌｉ系統のＫ８０２またはＭＭ２９４中で、選択可能マーカーとしてテトラサイクリン耐性遺伝子を用いて増幅する。Ａｒｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞は、組換えｐＡＭ９４３でトランスフォームし、約５μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、約１０μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび約２５μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含む培地中で増殖することにより選択する。ＰＫＲに対するｃＤＮＡ（ＰＫ６８）をサブクローン化するために、リジン→ アルギニン変異ＰＫＲ（ｍｕＰＫ６８；変異ＰＫＲタンパク質は、ｄｓＲＮＡと結合するが、キナーゼ活性を有さず、そしてそれ故に対照として機能しうる）および低分子量型２−５Ａ合成酵素（合成酵素）、プラスミドｐＫＳ（＋）ＰＫＲ、ｐＫＳ（＋）ｍｕＰＫＲおよびｐＫＳ（＋）合成酵素を、最初はＸｂａＩ制限エンドヌクレアーゼで、ついでＣｌａＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、ｃＤＮＡ断片は低融点アガロースゲル中で精製し、そしてｐＡＭ９４３のＸｂａＩおよびＣｌａＩ部位にセンス方向にサブクローン化する（図１３を参照）。それぞれが図１３Ａ〜Ｃに記載する構築物に対応する組換えプラスミド（すなわち、構築物Ａ、ｐＡＭ９４３：ＰＫ６８；構築物Ｂ、ｐＡＭ９４３：ｍｕＰＫ６８；そして構築物Ｃ、ｐＡＭ９４３：合成酵素）を使用し、ＡｒｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＬＢＡ４４０４をトランスフォームする。それぞれＡＧ６８、ＡＧｍｕ６８、そしてＡＧＳｙｎと特定される結果としてできるバクテリアを、タバコの葉を使用したディスクトランスフォームに使用する。組換えプラスミドの産物（たとえば構築物Ａ、ｐＡＭ９４３：ＰＫ６８；構築物Ｂ、ｐＡＭ９４３：ｍｕＰＫ６８；そして構築物Ｃ、ｐＡＭ９４３：合成酵素）は、本明細書の以降にさらに詳細に記載する。２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅに対するｃＤＮＡのサブクローン化のために、プラスミドｐＫＳ（＋）２Ｃ５のＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ酵素で消化し、ｐＡＭ９４３のＨｉｎｄＩＩＩ部位に、両方向性にサブクローン化し（図１３を参照）、そしてそれぞれが図１３Ｄおよび図１３Ｄ／ａ中の構築物ＤおよびＤ／ａに対応する組換えプラスミド（構築物Ｄ、ｐＡＭ９４３：２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅセンスおよび構築物Ｄ／ａ、ｐＡＭ９４３：２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅアンチセンス）を使用して、Ａｒｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍをトランスフォームし、ＡＧ２ＤＲセンスおよびＡＧ２ＤＲアンチセンスとそれぞれ呼ばれる細菌を作出する。組換えプラスミドの生成（構築物Ｄ、ｐＡＭ９４３：２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅセンス、構築物Ｄ／ａ、ｐＡＭ９４３：２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅアンチセンスおよび構築物Ｅ、ｐＡＭ８２２：２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅアンチセンス）も、本明細書中の以降にさらに詳細に記載する。コンピテントのＡｒｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞を調製し、たとえばＡｎ，Ｇ．らの方法（ＰｌａｎｔＮｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＭａｎｕａｌ，ＡＤ：１−１９，１９８８）の方法に従ってトランスフォームを行う。プラスミドＤＮＡを調製することにより、そして特異的相補的オリゴヌクレオチドを使用したＰＣＲを行うことにより、そして制限酵素消化を観察することにより、トランスフォームしたＡｒｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞中の組換えプラスミドの存在を確認する。エレクトロポレーションにより植物細胞中に２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅに対する逆方向のｃＤＮＡを送達するために使用したベクターの一つである、プラスミドｐＡＭ８２２の物理的地図も示す（図１３Ｅおよび図１４を参照）。ｐＡＭ８２２中に２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅに対するｃＤＮＡをサブクローン化するために、ＡＴＧ（開始コドン）の前およびＴＧＡ（終止コドン）の後にＢａｍＨＩ制限酵素部位を含む２種のオリゴヌクレオチドプライマーを使用することにより、２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの完全なコード領域をＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで消化し、ｐＡＭ８２２ベクターのＢｇｌＩＩ部位にサブクローン化した。２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅに対して使用したｃＤＮＡは、Ｚｈｏｕ，Ａ．ら（Ｃｅｌｌ，７２：７５３−７６５，１９９４）において記載されたプラスミドｐＺＣ５中に存在するヒト型のｃＤＮＡである。配列も、本明細書中で開示している。プラスミドｐＡＭ８２２は、第二の選択可能なマーカー遺伝子であるハイグロマイシン耐性遺伝子を含み、これにより２−５Ａ合成酵素のｃＤＮＡおよび２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅのｃＤＮＡを両方とも含む植物の構築物を作成することができる。このようにして、２−５Ａ合成酵素のｃＤＮＡを含むカナマイシン耐性のトランスジェニックタバコ葉ディスク中への２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅのｃＤＮＡを含むｐＡＭ８２２：２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの挿入を行う（図１３Ｅ）。ＭＳ培地として知られるＭｕｒａｓｈｉｇｅとＳｋｏｏｇの培地に約３％のショ糖（ＭＳＯ培地）および約０．８％の寒天を添加したもので、成長チャンバー中で約１６時間の明期と約８時間の暗期の光周期のもと、約２８℃のプラスチックの箱（Ｐｈｙｔａｔｒａｙ）中で、タバコ植物を無菌的に成長させる。約２” の長さよりも大きな葉を、ＭＳＯ培地のもとで約２〜３ｃｍ片に切り刻み、６〜８片の葉を約２ｍｌのＭＳＯ培地を含む６ｃｍペトリ皿中に静置し、滅菌先細ピンセットで葉片に穴をあける。ＡＧ６８、ＡＧｍｕ６８、ＡＧＳｙｎ、ＡＧ２ＤＲセンスおよびＡＧ２ＤＲアンチセンスを、５０μＭのアセトシリンゴン（ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ）と適切な抗生物質を含むＬＢ（Ｌブロス）中にて、約２８℃の水浴中で一晩成長させる。１００μｌの一晩培養液を葉片を含むそれぞれのペトリ皿中に添加する。成長チャンバー中で散乱光のもと、約２８℃で約２日間インキュベーションを行う。葉片をＭＳＯ培地で何回も洗浄し、発芽再生培地（ＭＳＯ培地；約０．５ｍｇ／ｌのＢＡＰ（ベンジル編みのプリン）、約２００μｇ／ｍｌのカナマイシン、約２００μｇ／ｍｌのカルベニシリン、および約１００μｇ／ｍｌのセフォタキシン）中で選択するために固体寒天に、成長チャンバー中で散乱光のもと、約２８℃で移植する。３週間以内に、植物片の再生が観察される。植物片が約２〜３ｃｍ長である時に、約２００μｇ／ｍｌのカナマイシンと約２００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む根−誘導性の無ホルモンのＭＳＯ固体寒天培地に植物片を移植する。２−５Ａ合成酵素を発現するトランスジェニック植物を、２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅに対するｃＤＮＡを導入するために（図１３Ｄの構築物Ｄ、ｐＡＭ９４３：２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅセンスで）実質的にトランスフォームする。選択的には、２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅのｃＤＮＡをセンス方向に含み、かつハイグロマイシン耐性遺伝子を含むベクターｐＡＭ８２２（図１４）を使用し、２−５Ａ合成酵素を含む植物をトランスフォームする。これにより、ハイグロマイシン含有ＭＳＯ培地中での選択が可能になる。植物の組織培養および再生を、上述したように行う。トランスジェニック植物を生長させ、花を咲かせ、そして抗ウィルス遺伝子あるいはヌクレオチド配列が次の世代に移動していることを示すために種を採る。特異的なプラスミド構築物については本明細書中で記載しているが、本発明は誘導可能なプロモーターを含むベクターを含む任意の植物ベクターを含むことを意図している。４”から５”の高さの植物中でのＰＫＲ、変異ＰＫＲ、２−５Ａ合成酵素および２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの発現について、葉のタンパク質抽出物（１０，０００ｘｇの遠心分離の上清）中で試験する。ノザンブロットおよびサザンブロット、そして２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅに対する機能的結合アッセイの結果について、表１から５に報告している（図１５も参照、その中で、ノザンブロットにおいてｍＲＮＡ濃度を測定することにより決定した、トランスジェニックタバコ植物中での、ヒト２−５Ａ合成酵素のｃＤＮＡの発現について示している）。一方で図１６は、ノザンブロットにおいてｍＲＮＡ濃度を測定するとにより決定した、トランスジェニックタバコ植物中での変異型および野生型ヒトＰＫＲのｃＤＮＡの発現について示している。図１７は、サザンブロットにより決定した、トランスジェニックタバコ植物中での２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅのｃＤＮＡの存在について示している。放射性２−５Ａへの紫外線架橋による、ＰＫＲ、ｄｓＲＮＡで活性化した２− ５Ａシンテターゼ及び２−５Ａ依存性ＲＮアーゼのｄｓＲＮＡ依存性自己リン酸化アッセイ（Ｎｏｌａｎ−Ｓｏｒｄｅｎら：ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｓ，（１８４）：２９８−３０４（１９９０）参照）を葉抽出物で実施できる。ＰＫＲ、２−５Ａシンテターゼ及び２−５Ａ依存性ＲＮアーゼに対する抗体を使用するウェスタンブロット分析によりタンパク質のレベルも測定できる。図１３Ｄに示すような構築物Ｄ即ちｐＡＭ９４３：２−５Ａ−依存性ＲＮアーゼセンスを含むトランスジェニック植物における２−５Ａ依存性ＲＮアーゼの発現を立証するために、放射性標識２−５Ａ類似体と２−５Ａ依存性ＲＮアーゼとの結合を測定する機能的アッセイを実施した。表ＩＩＩ及びＶ参照。その結果、トランスジェニック植物Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ５及びＺ６に２−５Ａ依存性ＲＮアーゼが存在することが判明した。ヒト組換え２−５Ａ依存性ＲＮアーゼのレベルが最も高いのは植物Ｚ５であると考えられる。表Ｖ参照。 ^aタバコ植物は構築物Ｄ即ちｐＡＭ９４３：２−５Ａ依存性ＲＮアーゼ（センス）を含む。２−５Ａ結合アッセイはＫｎｉｇｈｔ，Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ（２８８）：１８９−１９２（１９８０）のフィルター結合法の変法により実施した。³² Ｐ標識臭素置換２−５Ａ類似体ｐ（Ａ２’ｐ）₂（ｂｒ⁸Ａ２’ｐ）₂Ａ³’−³² ［Ｐ］Ｃｐ（約３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌで約１５，０００ｃｐｍ／アッセイ、Ｎｏｌａｎ−Ｓｏｒｄｅｎ，Ｎ．Ｌ．ら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，（１８４）：２９８−３０４（１９９０））を、タンパク質約１００μｇ／アッセイを含む植物抽出物と共に氷上で約４時間インキュベートした。次に反応混合物をニトロセルロースフィルターに移し、蒸留水で２回洗浄し、乾燥し、フィルター上の２−５Ａ依存性ＲＮアーゼに結合した２−５Ａプローブの量をシンチレーションカウントにより測定した（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｒ．Ｈ．とＫｒａｕｓｅ，Ｄ．，Ｉｎ，Ｃｌｅｍｅｎｓ，Ｍ．Ｊ．，Ｍｏｒｒｉｓ，Ａ．Ｇ．，とＧｅａｒｉｎｇ，Ａ．Ｊ．Ｈ．，（編），ＬｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓａｎｄＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ − ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，Ｉ．Ｒ．Ｌ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐｐ．１４９−１９３（１９８７））。トランスジェニック植物で発現される２−５Ａ依存性ＲＮアーゼに結合した標識２−５Ａのｃｐｍとしてデータを示す。対照植物抽出物からのバックグラウンド放射能である７０５ｃｐｍは２−５Ａの非特異的結合から構成されるので、これらのデータから差し引く。２−５Ａ依存性ＲＮアーゼｃＤＮＡを含むトランスジェニック植物が機能的２ −５Ａ依存性ＲＮアーゼタンパク質又はアミノ酸配列を発現することを更に確認するために、アフィニティー標識法を実施した（データは示さず）。この方法では、Ｎｏｌａｎ−Ｓｏｒｄｅｎ，Ｎ．Ｌ．ら：Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８４：２９８−３０４（１９９０）に記載されているように、臭素置換³²Ｐ標識２−５Ａ類似体（「プローブ」）を用いてウェスタンブロットで２−５Ａ結合活性を測定した。より具体的に説明すると、２−５Ａ依存性ＲＮアーゼｃＤＮＡを含むトランスジェニック植物から葉を採取し、約５ｍＭアスコルビン酸、約１ｍＭシステイン、約２μｇ／ｍｌロイペプチン、約１００μｇ／ｍｌフェニルメチルスルホニルフルオリド及び約２μｇ／ｍｌペプスタチンを補充したＮＰ４０溶解用緩衝液（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｒ．Ｈ．とＫｒａｕｓｅ，Ｄ．（１９８７）Ｉｎ，Ｃｌｅｍｅｎｓ，Ｍ．Ｊ．，Ｍｏｒｒｉｓ，Ａ．Ｇ．，とＧｅａｒｉｎｇ，Ａ．Ｊ．Ｈ．，（編），ＬｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓａｎｄＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ − ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，Ｉ．Ｒ．Ｌ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐｐ．１４９−１９３参照）中でホモジナイズした。抽出物を約１０，０００×ｇで約１０分間遠心分離して清澄化した。タンパク質約１００μｇ／アッセイを含む抽出物の上清をＳＤＳ／１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した後、タンパク質をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜フィルター（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＣｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に移した。次に、Ｚｈｏｕ，Ａ．ら：Ｃｅｌｌ７３−７５３−７６５（１９９３）に従って、フィルターを約４×１０⁵ｃ．ｐ．ｍ．／ｍｌの³²Ｐ標識２−５Ａプローブと共に約４℃で約２４時間インキュベートした。洗浄乾燥したフィルターのオートラジオグラムは、植物Ｚ３、Ｚ５及びＺ６で約８０ｋＤａバンドに目視可能な機能的ヒト２−５Ａ依存性ＲＮアーゼの存在を示した（データは示さず）。タバコモザイクウイルス（ＡＴＣＣ）及びタバコ腐食（etch）ウイルス（ＡｍｉｔＭｉｔｒａ博士，Ｎｅｂｒａｓｋａから入手）を被覆したセライト粉末のラビングにより植物の抗ウイルス活性を測定した。対照及びトランスジェニック植物からの葉のウイルス感染症状をモニターし、写真に記録した。記載のプラスミド及び形質転換Ａｒｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株を使用して他の任意の植物をウイルス耐性植物に形質転換することができる。本発明により形質転換可能な植物の例としては、トウモロコシ、ジャガイモ、ニンジン、レタス、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、マメ、カボチャ（squash）、カボチャ（pumpkin）、コショウ、タマネギ、トマト、エンドウ、ビート、セロリ、キュウリ、カブ及びラディッシュ等の野菜類、バナナ、リンゴ、ナシ、プラム、アプリコット、モモ、ネクタリン、チェリー、キーライム、オレンジ、レモン、ライム、グレープフルーツ、ブドウ、ベリー及びメロン等の果物類、コムギ、オオムギ、コメ、エンバク及びライムギ等の穀類、牧草、花卉、樹木、潅木及び雑草（例えばＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ等の実験用雑草）が挙げられる。従って、本発明はウイルス感染に対する免疫又は耐性をもつトランスジェニック植物を形成するために抗ウイルス活性をもつアミノ酸をコードする任意のヌクレオチド配列を導入した任意の植物を含むとみなすべきである。ｐＡＭ９４３：ＰＫＲ（構築物Ａ）及びｐＡＭ９４３：ＭｕＰＫＲ（構築物Ｂ）の構築大腸菌細胞（ＣｌｅｖｅｌａｎｄＣｌｉｎｉｃ，Ｃｌｉｖｅｌａｎｄ，ＯｈｉｏのＢ．Ｒ．Ｇ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ博士から入手）中に存在する夫々野生型ＰＫＲ及びＰＫＲのコドン２９６のリシン→アルギニン突然変異体をコードするプラスミドｐＫＳ（＋）ＰＫＲ及びｐＫＳ（＋）ｍｕＰＫＲを標準方法により調製した。例えば、記載するような部位特異的突然変異誘発によるｍｕＰＫＲ即ちリシン−２９６→アルギニン突然変異体（Ｋ２９６Ｒ）の作製については、Ｋａｔｚｅ，Ｍ．Ｇ．ら：Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，１１：５４９７−５５０５（１９９１）参照。プラスミドｐＫＳ（＋）ＰＫＲ及びｐＫＳ（＋）ｍｕＰＫＲを構築するために使用したＰＫＲヌクレオチド配列を図１８に示す。植物翻訳器官がＰＫＲタンパク質を合成する能力を調べるために、ｉｎｖｉｔｒｏ転写により直鎖化ｐＫＳ（＋）ＰＫＲからキャップトＰＫＲｍＲＮＡを作製した。次に³⁵Ｓ−メチオニンの存在下でコムギ胚芽エキス（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗ．Ｉ．から入手）中でＲＮＡを翻訳した。乾燥ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラムで³⁵Ｓ標識ＰＫＲの合成を検出した。ＫｐｎＩ及びＸｂａＩで消化することにより、ＰＫＲ及びｍｕＰＫＲをコードするｃＤＮＡをプラスミドｐＫＳ（＋）ＰＫＲ及びｐＫＳ（＋）ｍｕＰＫＲから切り出した。ＰＫＲとｍｕＰＫＲをコードする完全配列を含む生成ＤＮＡフラグメントを低融点アガロースゲルから精製した。次に５’末端にＸｂａＩ部位、３ ’末端にＣｌａＩ部位を含むｃＤＮＡを作製するために、ＰＫＲｃＤＮＡ及びｍｕＰＫＲｃＤＮＡをＣｌａＩで消化し、精製した。得られた消化ＰＫＲｃＤＮＡ及びｍｕＰＫＲｃＤＮＡを次にＸｂａＩ及びＣｌａＩで消化したｐＡＭ９４３にＤＮＡ連結により強制クローニングした。得られたプラスミド（図１３の構築物Ａ及びＢ）を使用してＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＬＢＡ４４０４（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）を形質転換した。形質転換したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌から標準方法により組換えプラスミドを調製し、単離したプラスミドのＰＣＲ分析と制限酵素消化物によりＰＫＲ及びｍｕＰＫＲｃＤＮＡの存在を確認した。ｐＡＭ９４３：シンテターゼ（構築物Ｃ）の構築図２０に示す小型の２−５Ａ−シンテターゼ（１．８ｋｂｍＲＮＡを産生）のヒトｃＤＮＡ（ＣｌｅｖｅｌａｎｄＣｌｉｎｉｃ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯｈｉｏのＢ．Ｒ．Ｇ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ博士から入手）を含むプラスミドｐｔａｃ−１５を標準方法により調製し、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化した。シンテターゼｃＤＮＡを低融点アガロースゲルから標準方法により精製した後、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ部位でプラスミドｐＫＳ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）にサブクローニングした。得られた組換えプラスミドＤＮＡ（ｐＫＳ（＋）シンテターゼ）をＸｂａＩ及びＣｌａＩで消化し、２−５ＡシンテターゼｃＤＮＡを低融点アガロースゲルから精製した後、ＸｂａＩ及びＣｌａＩで消化したｐＡＭ９４３にサブクローニングし、構築物Ｃを得た（図１３）。形質転換Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌から標準方法により組換えプラスミドを調製し、単離したプラスミドのＰＣＲ分析と制限酵素消化物により２−５Ａ−シンテターゼｃＤＮＡの存在を確認した。ｐＡＭ９４３：２−５Ａ依存性ＲＮアーゼセンス（構築物Ｄ）及びｐＡＭ９４３：２−５Ａ依存性ＲＮアーゼアンチセンス（構築物Ｄ／ａ）の構築ヒト２−５Ａ依存性ＲＮアーゼの完全コーディング配列をコードするプラスミドｐＫＳ（＋）ＺＣ５をＨｉｎｄＩＩＩで消化した。２−５Ａ依存性ＲＮアーゼの２．５ｋｂｐｃＤＮＡを低融点アガロースゲルで精製した後、ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＡＭ９４３にセンス（順方向）及びアンチセンス（逆方向）の両方向にサブクローニングし、夫々図１３Ｄ及びＤ／ａに示すようなｐＡＭ９４３：２−５Ａ依存性ＲＮアーゼセンス（構築物Ｄ）及びｐＡＭ９４３：２−５Ａ依存性ＲＮアーゼアンチセンス（構築物Ｄ／ａ）を作製した。制限酵素消化物とＰＣＲ分析により、形質転換Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍが２−５Ａ依存性ＲＮアーゼｃＤＮＡを含むことを調べた。ｐＡＭ８２２：２−５Ａ依存性ＲＮアーゼアンチセンス（構築物Ｅ）の構築ヒト２−５Ａ依存性ＲＮアーゼをコードするプラスミドｐＫＳ（＋）ＺＣ５でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、ｃＤＮＡの両末端にＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩ部位を生成し、５’及び３’非翻訳配列を還元した。使用したＰＣＲプライマーは、及びである。ＰＣＲ産物（約２．２５ｋｂｐ）を低融点アガロースゲル上で精製した後、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、次いでＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミドｐＫＳ（＋）にサブクローニングした。得られたプラスミドｐＫＳ：ｐＺＣ５をＢａｍＨＩで消化し、２−５Ａ依存性ＲＮアーゼｃＤＮＡフラグメントを精製し、ＢｇＩＩＩで消化したｐＡＭ８２２にクローニングした。逆方向（アンチセンス）で単離した組換え株をｐＡＭ８２２：２−５Ａ依存性ＲＮアーゼアンチセンス（構築物Ｅ）とする。図１３Ｅ参照。本明細書に開示するヌクレオチド配列に関して、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミン、Ｕはウラシルを意味する。本明細書に開示するアミノ酸配列に関しては、Ａはａｌａ即ちアラニン、Ｒはａｒｇ即ちアルギニン、Ｎはａｓｎ即ちアスパラギン、Ｄはａｓｐ即ちアスパラギン酸、Ｃはｃｙｓ即ちシステイン、Ｅはｇｌｕ即ちグルタミン酸、Ｑはｇｌｎ即ちグルタミン、Ｇはｇｌｙ即ちグリシン、Ｈはｈｉｓ即ちヒスチジン、Ｉはｉｌｅ即ちイソロイシン、Ｌはｌｅｕ即ちロイシン、Ｋはｌｙｓ即ちリジン、Ｍはｍｅｔ即ちメチオニン、Ｆはｐｈｅ即ちフェニルアラニン、Ｐはｐｒｏ即ちプロリン、Ｓはｓｅｒ即ちセリン、Ｔはｔｈｒ即ちトレオニン、Ｗはｔｒｐ即ちトリプトファン、Ｙはｔｙｒ即ちチロシン、Ｖはｖａｌ即ちバリンを意味する。下記材料はブダペスト条約に基づき、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１２３０１ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ２０８５２，米国に寄託し、下記寄託番号を付与されている。 *この種子は図１３に示す構築物ＤであるｐＡＭ９４３：２−５Ａｄｅｐ．ＲＮアーゼを含む。 **この種子は図１３に示す構築物ＣであるｐＡＭ９４２：シンテターゼを含む。 *元のコドン番号９５即ちアミノ酸番号９５をコードするＣＴＴ即ちロイシンは正しいが、コドン番号９５の上の括弧内に示す代替コドン即ちアミノ酸番号９５の下の括弧内に示す代替アミノ酸プロリンをコードするＣＣＴがこの位置に存在してもよいと考えられる（８１頁参照）。配列番号１はヒト２−５Ａ依存性ＲＮアーゼタンパク質をコードするＤＮＡ配列を表す。配列番号２は配列番号１のＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列を表す。配列番号３は代替コドン番号９５のＣＣＴをもつ配列番号１のＤＮＡ配列を表す。配列番号４は代替アミノ酸番号９５のプロリンをもつ配列番号３によりコードされるアミノ酸配列を表す。配列番号５はマウス２−５Ａ依存性ＲＮアーゼをコードするＤＮＡ配列（部分）を表す。配列番号６は配列番号５によりコードされるアミノ酸配列を表す。実施例ＩＩＩクロレラウイルスのアデニルメチルトランスフェラーゼ（ＡＭＴ）の遺伝子の上流領域と最短長の３５Ｓプロモーターから構成されるデュアルプロモーターを含むＴｉ系バイナリベクターであるプラスミドｐＡＭ９４３（Ｍｉｔｒａ，Ａ．ら：ＰｌａｎｔＭｏｌＢｉｏｌ，２６：８５−９３（１９９４））をこの試験のクローニングベクターとして使用した。図１３参照。ベクターは更に形質転換植物の選択に用いるカナマイシン耐性遺伝子も含む。使用した細菌株はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＬＢＡ４４０４と大腸菌株ＭＭ２９４（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）である。低分子量形態の２−５ＡシンテターゼをコードするヒトｃＤＮＡはＢ．Ｒ．Ｇ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ博士（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）とＤｉｒｋＧｅｗｅｒｔ博士（Ｌｏｎｄｏｎ，英国）の寄贈品であり、ヒトＲＮアーゼＬのｃＤＮＡはＺｈｏｕ，Ａ．ら：Ｃｅｌｌ，７２：７５３−７６５（１９９３）に既に報告されている。植物組織培地ＭｕｒａｓｈｉｇｅとＳｋｏｏｇのレディミックス（ＭＳ培地）はＳｉｇｍａＣｏ．製品である。約２５℃の培養室で３％スクロースを補充した０．８％アガロース培地（ＭＳＯ培地）をプラスチック箱に入れ、約１６時間の明サイクルと約８時間の暗サイクルからなるサイクル下にＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍｃｖ．Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ３８の種子を滅菌培養した。２−５ＡシンテターゼのヒトｃＤＮＡのＸｂａＩ−ＣｌａＩフラグメントをｐＡＭ９４３のＸｂａＩ、ＣｌａＩ部位に指向的にクローニングした。図１３Ｃ参照。ＲＮアーゼＬのヒトｃＤＮＡをｐＡＭ９４３のＨｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローニングし、センス方向のｃＤＮＡをもつ組換えプラスミドを選択した。図１３Ｄ参照。Ａｎ，Ｇ．ら：ＢｉｎａｒｙＶｅｃｔｏｒｓ，Ｉｎ：ＳＢＳｅｌｖｉｎ，ＲＡＳｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔとＤＰＳＶｅｒｍａ（編），ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＭａｎｕａｌ，ＭａｒｔｉｎｕｓＮｉｊｈｏｆｆ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ，オランダ，ｐｐ．Ａ−３：１− １９（１９８８）に記載されているように、プラスミドを大腸菌ＭＭ２９４株で培養した後、ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＬＢＡ４４０４に導入した。ｐＡＭ９４３：シンテターゼ又はｐＡＭ９４３：２−５Ａ依存性ＲＮアーゼのいずれかで形質転換したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞を、テトラサイクリン（５μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（１０μｇ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地で培養した。タバコ葉盤をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−葉盤同時培養法に従って形質転換した。Ａｎ，Ｇ．ら：ＢｉｎａｒｙＶｅｃｔｏｒｓ，Ｉｎ：ＳＢＳｅｌｖｉｎ，ＲＡＳｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔとＤＰＳＶｅｒｍａ（編），ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＭａｎｕａｌ，ＭａｒｔｉｎｕｓＮｉｊｈｏｆｆ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ，オランダ，ｐｐ．Ａ−３：１−１９（１９８８）参照。葉盤をＭＳＯ培地で十分に洗浄し、パラフィルムで覆ったペトリ皿にＢＡＰ（ベンジルアミノプリン）（０．５ｍｇ／ｌ）、カナマイシン（２００μｇ／ｍｌ）、カルベニシリン（２００μｇ／ｍｌ）及びセフォタキシム（２００μｇ／ｍｌ）を含むＭＳＯ固体寒天選択及び苗条再生培地を入れ、２５℃の培養室で拡散光下にインキュベートした。再生した小植物をＭＳＯ固体寒天選択及び無ホルモン培地に移し、その後のｃＤＮＡの存在をモニターした。サザンブロットに備え、Ｒｏｂｅｒｔ，Ｓ．Ｏ．ら：ＥｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆＤＮＡｆｒｏｍｐｌａｎｔｔｉｓｓｕｅｓ，Ｉｎ：ＳＢＧｅｌｖｉｎ，ＲＡＳｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔとＤＰＳＶｅｒｍａ（編），ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＭａｎｕａｌ，ＭａｒｔｉｎｕｓＮｉｊｈｏｆｆ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ，オランダ，ｐｐ．Ａ６：１−１０（１９８８）に記載されているように対照及び形質転換植物の葉からＤＮＡを調製した。ＨｉｎｄＩＩＩの消化後、ＤＮＡフラグメントを１％アガロースゲル中で分離し、Ｎｙｔｒａｎ膜（Ｓｃｈｅｉｌｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）に移した。ノーザンブロットに備え、ＲＮＡ−Ｓｔａｔｅ６０試薬（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ，Ｂ．Ｉｎｃ．）を使用して葉から全ＲＮＡを抽出した。グリオキサールで処理したＲＮＡをアガロースゲル中で分画し、Ｎｙｔｒａｎフィルターに移した。マルチプライムＤＮＡ標識キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してｃＤＮＡを³²Ｐ標識し、プローブとして使用した。Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｒ．Ｈ．ら：Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆａｎｔｉ−ｖｉｒａｌｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ：Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ２’，５’−ｏｌｉｇｏａｄｅｎｙｌａｔｅａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎ：ＭＪＣｌｅｍｅｎｓ，ＡＧＭｏｒｒｉｓ，Ｇｅａｒｉｎｇ，ＡＦＨ（編），ＬｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓａｎｄＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ｐｐ．１４９−１９３，Ｏｘｆｏｒｄ：ＩＲＬＰｒｅｓｓ（１９８７）に記載されているように、トランスジェニックタバコ植物の葉で発現される２−５Ａシンテターゼを活性化アフィニティーマトリックス、ポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）−セルロース上で単離した。ＡＴＰと共にインキュベートすると、競合結合アッセイで測定される２−５Ａが合成され、インキュベーションで生じた未標識２−５Ａはニトロセルロースディスク上でマウス肝ＲＮアーゼＬとの結合に関して放射性標識２ −５Ａ類似体と競合する。Ｋｎｉｇｈｔ，Ｍ．ら：Ｎａｔｕｒｅ，２８８：１８９−１９２（１９８０）参照。競合剤として加えた既知量の未標識２−５Ａから標準曲線を作成した。葉の抽出物中のＲＮアーゼＬレベルを測定するために、紫外光下で臭素置換³² Ｐ標識２−５Ａプローブ（Ａ２’ｐ）₂（ｂｒ⁸Ａ２’ｐ）₂Ａ３’−［³²Ｐ］ＣｐとＲＮアーゼＬの架橋を行った。Ｎｏｌａｎ−Ｓｏｒｄｅｎ，Ｎ．Ｌ．ら：ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ，１８４：２９８−３０４（１９９０）参照。Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｒ．Ｈ．ら：Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆａｎｔｉ−ｖｉｒａｌｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ：Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ２’ ，５’−ｏｌｉｇｏａｄｅｎｙｌａｔｅａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎ：ＭＪＣｌｅｍｅｎｓ，ＡＧＭｏｒｒｉｓ，Ｇｅａｒｉｎｇ，ＡＦＨ（編），ＬｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓａｎｄＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ｐｐ．１４９−１９３，Ｏｘｆｏｒｄ：ＩＲＬＰｒｅｓｓ（１９８７）に記載されているように、対照及びトランスジェニック植物からの葉とヒト乳癌細胞系ＭＣＦ７の抽出物を調製した。未標識ｐ₃（Ａ２’ｐ）₂Ａ（１００ｎＭ）の存在下及び不在下でアッセイを行った。混合物に氷上で約１時間紫外光を照射し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド（１０％）ゲル上でタンパク質を分離し、乾燥したゲルを使用してＸ線フィルムを感光させた。対照植物とトランスジェニック植物からの葉を切り取り、室温で蛍光下に約７時間葉柄から２−５Ａ［１μＭｐ₃（Ａ２’ｐ）₃Ａ］を取り込ませた。全ＲＮＡを調製し、これを使用してノーザンブロットを行った。ブロット中のＲＮＡを³² Ｐ標識ヒト１８ＳｒＲＮＡｃＤＮＡプローブにハイブリダイズさせた（ｃＤＮＡはＪｏｈｎＴｈａｄｅｎ博士，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅから入手）。２−５Ａシンテターゼ又はＲＮアーゼＬを発現するトランスジェニック植物を温度制御下の温室で培養した。タバコ腐食（etch）ウイルス（ＴＥＶ、重症株ＡＴＣＣ＃ＰＶ６９）及びタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ、普通株）を夫々全身感染させたタバコの葉から新たに調製した抽出物の１：５００又は１：５０００希釈液を６週齢の植物に接種した。全身感染させた上部葉のウイルス力価を接種から２１日後にＥＬＩＳＡにより測定した。ＴＭＶコートタンパク質（ＣＰ）又はＴＥＶ円筒封入タンパク質（ＣＩ）に対するウサギポリクローナル抗体を使用した。ＴＭＶＣＰ又はＴＥＶＣＩタンパク質を使用して標準曲線を作成した。トランスジェニックタバコ植物を作製するために、小型のヒト２−５ＡシンテターゼとヒトＲＮアーゼＬのｃＤＮＡを植物発現プラスミドｐＡＭ９４３に個々にサブクローニングした。図１３参照（Ｍｉｔｒａ，Ａ．ら：ＰｌａｎｔＭｏｌＢｉｏｌ，２６：８５−９３（１９９４））。このベクターで、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターに融合したクロレラウイルスのアデニルメチルトランスフェラーゼ（ＡＭＴ）から構成されるビパーチィクルプロモーターにより挿入ｃＤＮＡの転写を誘導した（図１３）。カナマイシン選択後に２種のｃＤＮＡのいずれかを含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍで別々に形質転換した葉盤から植物が再生された。完全ゲノムＤＮＡを植物から単離し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化してサザンブロットを行い、ｃＤＮＡの組込みが行われたことを確認した。形質転換植物は発現寸法の２−５ＡシンテターゼｃＤＮＡ又はＲＮアーゼＬｃＤＮＡの存在を示すが、対照植物は陰性である。夫々図２７Ａ及び２８参照。２−５ＡシンテターゼｃＤＮＡがトランスジェニック植物に転写されることを立証するために、これらの植物から単離した全ＲＮＡでノーザンブロットを行った。図２７Ｂ参照。シンテターゼ発現植物では約２．５ｋｂの主要転写物が明白に検出された。図２７Ｂ中、レーン２及び３は代表的植物に相当する。対照植物では交差ハイブリダイズするＲＮＡ種は検出されなかった。図２７Ｂ、レーン１参照。これらの植物に２−５Ａシンテターゼ活性が存在するか否かを調べるために、葉の粗抽出物で酵素アッセイを行った。下表Ｖ参照。活性化アフィニティーマトリックス、ポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）−セルロース上で２−５Ａシンテターゼを単離した。例えば、Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｒ．Ｈ．ら：Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆａｎｔｉ−ｖｉｒａｌｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ：Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ −ｒｅｇｕｌａｔｅｄ２’，５’−ｏｌｉｇｏａｄｅｎｙｌａｔｅａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎ：ＭＪＣｌｅｍｅｎｓ，ＡＧＭｏｒｒｓ，Ｇｅａｒｉｎｇ，ＡＦＨ（編），ＬｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓａｎｄＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ｐｐ．１４９−１９３，Ｏｘｆｏｒｄ：ＩＲＬＰｒｅｓｓ（１９８７）参照。ＡＴＰからの２−５Ａオリゴマーの生成を高特異的放射性結合アッセイで測定した（Ｋｎｉｇｈｔ，Ｍ．ら：Ｎａｔｕｒｅ，２８８：１８９−１９２（１９８０））。その結果、有意な２−５Ａシンテターゼ活性はトランスジェニック植物でしか検出されなかった。表Ｖ参照。臭素置換³²Ｐ標識２−５Ａプローブを使用してＲＮアーゼＬの発現を検出した。Ｎｏｌａｎ−Ｓｏｒｄｅｎ，Ｎ．Ｌ．ら：ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ，１８４：２９８−３０４（１９９０）参照。ＵＶ光を使用して２−５ＡプローブとＲＮアーゼＬの共有架橋を行った。Ｎｏｌａｎ−Ｓｏｒｄｅｎ，Ｎ．Ｌ．ら：ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ，１８４：２９８−３０４（１９９０）参照。８３．５ｋＤａＲＮアーゼＬはトランスジェニック植物ではっきり検出されたが、対照植物では検出されなかった。図２９参照。植物抽出物を過剰の未標識２−５Ａと共にインキュベートすることにより、ＲＮアーゼＬに対する２−５Ａプローブの結合の特異性を立証した。図２９参照。未標識２−５Ａと２−５Ａプローブ間の競合により、ＲＮアーゼＬを放射性標識することはできなかった。比較のために、ヒトＭＣＦ−７細胞からのＲＮアーゼＬを示す。図２９、レーン１３及び１４参照。２−５Ａの取り込みをモニターするために、葉柄の基部で葉を切り取った後、³² Ｐ標識２−５Ａプローブの溶液に明光下に室温で約３時間入れておいた。葉柄を更に切り取り、葉身からオートラジオグラムを作成した。葉脈を通って葉身の全部分に向かう２−５Ａプローブの取り込みと転流が容易に分かる（ここではデータは示さず）。切り取った葉に未標識２−５Ａ、ｐ₃Ａ（２’ｐ５’Ａ）₃（１ μＭ）を７時間取り込ませた後に、無傷の葉におけるＲＮアーゼＬの触媒活性を測定した。全ＲＮＡを抽出し、ノーザンブロットを行った後、１８ＳｒＲＮＡに対する³²Ｐ標識ｃＤＮＡでプローブした。その結果、２−５ＡはＲＮアーゼＬを発現する植物では１８ＳｒＲＮＡから別個の分解物への分解を誘導するが、対照植物では誘導しなかった。図３０参照。ＲＮアーゼＬの活性化により哺乳動物細胞で１８ＳｒＲＮＡの同様の分解が誘導されることは過去の研究にも報告されている。Ｗｒｅｓｃｈｎｅｒ，Ｄ．Ｈ．ら：ＮｕｃｌＡｃｉｄｓＲｅｓ，９：１５７１−１５８１（１９８１）参照。これらの結果は、ヒト２−５ＡシンテターゼとＲＮアーゼＬの両者が植物で機能的に活性なタンパク質として発現され得ることを立証していると思われる。ウイルス耐性をモニターするために、ＴＥＶを感染させた葉とＴＭＶを感染させた葉から調製した希釈抽出物を使用して、対照及びトランスジェニック植物からの個々の葉に接種した。対照及びトランスジェニックの両者の全接種植物は１週間以内に典型的な症状を示し、全身ウイルス感染を示した。接種から２１日後に精製ウイルスから作成した標準曲線を使用してＥＬＩＳＡによりウイルス濃度を測定した。これらの実験からの代表的なデータを下表ＶＩに示す。結果は対照植物に比較してトランスジェニック植物のウイルス収率に有意差がないことを示している。＊ウイルス量は生きた組織１ｇ当たりのウイルス抗原μｇとして表す。各植物から３枚の葉の最小値を定量した。ＥＬＩＳＡを２回繰り返し、各試料を２回ずつ定量した。対照：ベクター単独で形質転換した植物の葉のウイルスアッセイ。水で濯いだ直後にＥＬＩＳＡを行った接種葉の抽出物から構成されるゼロ時点の試料はこれらのアッセイでＴＥＶ及びＴＭＶについて夫々０．８及び１．４の値を与える。本実施例ＩＩＩでは、２−５Ａ結合（図２９参照）又は２−５Ａ依存性リボヌクレアーゼ活性（図３０参照）により測定した場合に、対照Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ植物の葉では２−５Ａシンテターゼ活性（表Ｖ）もＲＮアーゼＬ活性も検出できなかった。Ｄｅｖａｓｈらもタバコ植物で２−５Ａと結合できるタンパク質が存在しないことを報告している。Ｄｅｖａｓｈ，Ｙ．ら：ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２５９：３４８２−３４８６（１９８４）参照。ヒト２−５ＡシンテターゼｃＤＮＡ又はＲＮアーゼＬｃＤＮＡでプローブしたサザン及びノーザンブロットも陰性であった。図２７及び２８参照。これらの結果は、ＮｉｃｏｔｉａｎａｇｌｕｔｉｎｏｓａとＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍｃｖ．ｘａｎｔｈｉ−ｎｃに２−５Ａシンテターゼ活性又は２−５Ａ結合活性（ＲＮアーゼＬの尺度）が存在しないことを示しているＣａｙｌｅｙ，Ｐ．Ｊ．ら：ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ，１０８：１２４３−１２５０（１９８２）の報告を裏付けていると思われる。更に、対照、ＴＭＶ感染、インターフェロン処理又はポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）処理植物でも２−５Ａシンテターゼと２−５Ａは検出されなかった。Ｃａｙｌｅｙ，Ｐ．Ｊ．ら：ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ，１０８：１２４３− １２５０（１９８２）参照。２−５Ａ経路の存在を確実に証明するには、［ｐ_x Ａ（２’ｐ５’Ａ）_y（式中、ｘ＝１〜３、ｙ≧２）として定義されるような］２−５Ａを合成することが可能な酵素と、２−５Ａにより活性化されるまで休眠しているリボヌクレアーゼ活性との両者が最低限必要である。植物のこれらの最低基準を満たす報告は未だなされていない。従って、植物にはいずれかの２−５Ａ系が存在するが、高等脊椎動物とは非常に異なるため、検出に至っていないか、又は植物に２−５Ａ系は存在しない。これについては、２−５Ａと実質的に異なるオリゴアデニルレートがタバコ植物で検出されており（Ｄｅｖａｓｈ，Ｙ．ら：ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２５９：３４８２−３４８６（１９８４））、２’，５’−オリゴアデニレートは植物無細胞タンパク質合成（Ｔｒｕｖｅ，Ｅ．ら：ＡｒｃｈＶｉｒｏｌ，９Ｓ：４１−５０（１９９４））、ＴＭＶ複製（Ｄｅｖａｓｈ，Ｙ．ら：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１６：１４１５−１４１６（１９８２）；Ｄｅｖａｓｈ，Ｙ．ら：ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２５９：３４８２−３４８６（１９８４）；及びＤｅｖａｃｈ，Ｙ．ら：ＭｅｔｈＥｎｚ，１１９：７５９−７６１（１９８６））を阻害すること又は植物でサイトカイン活性及びストレスタンパク質を誘導すること（Ｋｕｌａｅｖａ，Ｏ．Ｎ．ら：ＰｌａｎｔＭｏｌＢｉｏｌ，２０：３８３−３９３（１９９２））が報告されている。別々のトランスジェニック植物でヒト２−５Ａシンテターゼ及びＲＮアーゼＬを発現させた。植物ゲノムへのｃＤＮＡの安定な導入はサザンブロットで確認され（図２７Ａ及び２８参照）、ノーザンブロッティングと機能的酵素アッセイにより発現を測定した。ＲＮアーゼＬの発現は８３ｋＤａ標識タンパク質を産生する特異的２−５Ａ結合アッセイ（図２９参照）と無傷の葉におけるｒＲＮＡの２ −５Ａ依存性分解（図３０参照）の両者により得られた。２−５Ａを加えないとＲＮアーゼＬ⁺植物でｒＲＮＡ分解が起こらず、活性化が生じるまで酵素がその休眠状態にあることを示した。これらの知見は更に植物に２−５Ａ自体が存在しないことも示唆しており、他の報告を裏付けている。例えばＣａｙｌｅｙ，Ｐ．Ｊ．ら：ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ，１０８：１２４３−１２５０（１９８２）；及びＤｅｖａｓｈ，Ｙ．ら：ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２５９：３４８２−３４８６（１９８４）参照。これらの知見は、完全機能的２−５Ａ系即ちＲＮアーゼＬと２−５Ａシンテターゼを植物に導入する実現可能性を裏付けていると思われる。実施例ＩＶ参照。全トランスジェニック植物は良好に成長して花をつけると思われる。２−５Ａシンテターゼの活性化には配列特異性なしにｄｓＲＮＡ構造が必要であり、多くの種類のウイルスは複製サイクル中にｄｓＲＮＡを産生するので、２−５ＡシンテターゼとＲＮアーゼＬの同時発現は、植物ウイルスに対して広範囲の防御を提供すると考えられる。実施例ＩＶ参照。既にＴｒｕｖｅ，Ｅ．ら：Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１：１０４８−１０５２（１９９３）；及びＴｒｕｖｅ，Ｅ．ら：ＡｒｃｈＶｉｒｏｌ，９Ｓ：４１−５０（１９９４）は、ラット２−５Ａシンテターゼ単独（即ちＲＮアーゼＬの同時発現を伴わない）を植物で発現させて所定の抗ウイルス活性を得たと報告している。他方、本実施例ＩＩＩでは、２−５Ａシンテターゼ単独又はＲＮアーゼＬ単独を発現するタバコ植物ではＴＭＶ又はＴＥＶ複製の阻害は観察されない（表ＶＩ参照）。本実施例ＩＩＩの結果は、機能的２−５Ａ系には２−５ＡシンテターゼとＲＮアーゼＬの両者が必要であるという本願の確信に一致する。実施例ＩＶカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（Ｓａｎｄｅｒｓ，Ｐ．ら：Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１５：１５３４（１９８７）参照）とクロレラウイルスアデニンメチルトランスフェラーゼ遺伝子プロモーター（Ｍｉｔｒａ，Ａ．ら：ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏ．，２６：８５（１９９４）参照）から夫々誘導した２−５ＡシンテターゼとＲＮアーゼＬｃＤＮＡの両者を含むバイナリ植物形質転換／発現ベクター（ＨｏｅｋｅｍａＡ．ら：Ｎａｔｕｒｅ，３０３：１７９（１９８３））ｐＡＭ２２８０を構築した。低分子量種のヒト２−５Ａシンテターゼ及びヒトＲＮアーゼＬを夫々コードする元のプラスミドｐＢａｂｅ．Ｅ１．６Ｓ（Ｂ．Ｒ．Ｇ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄの寄贈品）及びｐＺＣ５（Ｚｈｏｕ，Ａ．ら：Ｃｅｌｌ（７２）：７５３（１９９３））のコーディング領域を使用してバイナリ植物形質転換／発現ベクターｐＡＭ２２００を構築した。このバイナリプラスミドはＴ− ＤＮＡ遺伝子ノパリンシンテターゼプロモーターにより誘導されるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ植物選択マーカー遺伝子を含む。Ｍｉｔｒａ，Ａ．ら：Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１５：２９４（１９８９）。このプラスミドを使用し、無菌培養したタバコ苗条のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに媒介される形質転換によりトランスジェニックタバコ植物を作製した。Ｈｏｒｓｃｈ，Ｒ．ら：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７：１２２９（１９８５）。約３００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＭＳプレート上で形質転換タバコ植物を選択した。Ｍｕｒａｓｉｇｈｅ，Ｆ．ら：Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．，１５：４７３（１９６２）参照。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ同時培養法を用いて幼タバコ苗条（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ，ｐｅｔｉｔＨａｖａｎａＳＲ−１）（Ｍａｌｉｇａ，Ｐ．ら：ＰｌａｎｔＳｃｉ．Ｌｅｔ．，４４：７８（１９７８））を形質転換した。Ｈｏｒｓｃｈ，Ｒ．ら：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７−１２２９（１９８５）。ヒト２ −５Ａ系ｃＤＮＡはトランスジェニックタバコ植物の形質転換頻度又は正常成長及び発生に効果がないと考えられる。一次形質転換株を成熟まで成長させ、自家授粉させた。全株が生存可能な種子を生産すると考えられる。カナマイシン耐性Ｒ１苗条を温室で培養し、トランス遺伝子発現及びウイルス耐性を分析した。トランスジェニック植物のサザンブロット分析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．ら：Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３（１９８５））によると、全カナマイシン耐性植物は無傷の未修飾インサートを含む（図２２Ａ参照）と考えられ、植物染色体へのトランス遺伝子の適切な組み込みを示す。植物ＤＮＡへのプラスミドＤＮＡの組み込みをサザンブロット分析により測定した。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．ら：Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３（１９８５）。生きた植物組織５ｇを使用してＤＮＡを調製した。Ｇｕｉｌｌｅｍａｕｔ，Ｐ．ら：ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｔｒ．，１０：６０（１９９２）参照。要約すると、植物組織を液体窒素中で粉砕し、抽出用緩衝液（約１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ約４．８）、約５０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ約８．０）、約５００ｍＭＮａＣｌ、約２％−ＰＶＰ−４０の混合物をｐＨ約５．５に調整した後、ＳＤＳ約１．４％までとシステイン約１０ｍＭまでを加えたもの）中で融解した後、約６５℃で約２０分間インキュベートし、次いで遠心分離した。約３Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ約４．８）約０．５容量を上清に加え、混合物を約０℃で約１時間インキュベートした。ＤＮＡをエタノール沈殿により回収し、ＴＨＥに溶解した後、塩化セシウム勾配中で一晩遠心分離した。ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、１％アガロースゲル上で分離した後、製造業者の指示に従ってＺｅｔａプローブ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移した。ヒト２−５Ａシンテターゼ及びＲＮアーゼＬｃＤＮＡを鋳型として使用して、ランダムに標識したＤＮＡプローブ（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｐ．，ら：Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３２：６（１９８３））と膜をハイブリダイズした。トランスジェニックタバコ植物における２−５ＡシンテターゼとＲＮアーゼＬｃＤＮＡの発現を測定するために、１５個の個々に形質転換した植物から全ＲＮＡを調製した。Ｌｏｇｅｍａｎｎ，Ｊ．ら：ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ．，１６３：１６（１９８７）参照。ＲＮＡ抽出用緩衝液は約８Ｍ塩化グアニジニウム、約２０ｍＭＭＥＳ、約２０ｍＭＥＤＴＡ及び約５０ｍＭＢ−メルカプトエタノール（ｐＨ約７．０）を含むものとした。ＲＮＡ試料のアリコートをホルムアルデヒドゲル上で分離し、Ｚｅｔａプローブ膜に移し、サザンブロットと同様にＤＮＡフラグメントでプローブした。ノーザンブロット分析によると、トランスジェニックタバコ植物の大半は２− ５ＡシンテターゼとＲＮアーゼＬの両者のｍＲＮＡを産生すると考えられるが、２−５Ａシンテターゼ又はＲＮアーゼＬｍＲＮＡの一方のみを発現するものも少しあると考えられる。図２２Ｂ参照。ヒトＲＮアーゼに対するモノクローナル抗体でウェスタンブロットをプローブすることにより、トランスジェニックタバコにおけるＲＮアーゼＬタンパク質の発現をモニターした。Ｄｏｎｇ，Ｂ．ら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１４１５３（１９９４）。形質転換植物組織を液体窒素中で粉砕し、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）約１５μｇの存在下にタンパク質抽出用緩衝液（約０．５Ｍスクロース、約０．１％アスコルビン酸、約０．１％システイン−ＨＣｌ、約０．０１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ約７．５）（Ｍｉｔｒａ，Ａ．ら：Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１５：２９４（１９８９））中で融解させることにより、完全細胞タンパク質抽出物を調製した。ホモジネートを約４℃で約１４，０００×ｇで約３０分間遠心分離し、可溶性タンパク質を含む上清を回収し、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（Ａｍｉｃｏｎ）濃縮機を使用して濃縮した。抽出物中のタンパク質濃度をブラッドフォード法により定量した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．：Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７２：２４８（１９７６）。標準として組換えＲＮアーゼＬタンパク質約２００ｎｇと共に、全タンパク質約２００μｇを含む抽出物を１２．５％アクリルアミドゲル（Ｌａｍｅｌｌｉ，Ｕ．Ｋ．：Ｎａｔｕｒｅ，２２７：６８０（１９７０））上で分離した。Ｂｉｏ−Ｒａｄトランスブロット装置を約２５０ｍＡで約１時間使用し、分画したタンパク質をニトロセルロース膜に移した。膜をブロッキング溶液（Ｔｒｉｓ緩衝塩類中約５％脱脂粉乳）に浸漬し、約２８℃で約１時間インキュベートした。次いで膜を洗浄し、ヒトＲＮアーゼＬ抗原に対して調製したマウスモノクローナル抗体の約１：５０００希釈液と共にインキュベートした。Ｄｏｎｇ，Ｂ．ら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１４１５３（１９９４）。抗体と共にインキュベーション後、膜を温和な撹拌下にビオチン化ヤギ抗マウス抗体溶液に約２８℃で約１時間浸した。膜を洗浄し、ストレプトアビジン−ビオチン化アルカリホスファターゼ複合体中で約１時間インキュベートした後、紫色のバンドが現れるまで呈色溶液に浸漬した。ＲＮアーゼＬｍＲＮＡを発現するトランスジェニック植物はヌクレアーゼタンパク質も発現した。図２３参照。シンテターゼとヌクレアーゼｃＤＮＡの両者を含む植物（図２３、レーンＴ３〜Ｔ５）とヌクレアーゼｃＤＮＡのみを含む植物（図２３、レーンＴ２）で産生されるＲＮアーゼＬは真性ヒト組換えＲＮアーゼＬと同時泳動した（図２３、レーンＲＮ）。Ｄｏｎｇ，Ｂ．ら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１４１５３（１９９４）。イムノブロットはトランスジェニック植物からのタンパク質抽出物で約８０ｋＤａの単一タンパク質バンドを示すと思われる。対照植物抽出物中のタンパク質は抗ＲＮアーゼＬ抗体と反応しないと思われ（図２３、レーンＴＣ）、タバコ植物がＲＮアーゼＬ同族体をもたないという本願の確信を裏付けた。切り取って２−５Ａを注入した葉では１８ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の２−５Ａに誘導される分解により、トランスジェニックタバコ植物におけるＲＮアーゼＬの機能的発現が検出された。図２４参照。トランスジェニック葉に約２．５μＭｐ₃Ａ（２’ｐ５’Ａ）₃を注入し、全ＲＮＡが調製される前に約３時間インキュベートした。ノーザンブロット上の全ＲＮＡを１８ＳｒＲＮＡに対する放射性標識ｃＤＮＡ（ＪｏｈｎＴｈａｄｅｎ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅの寄贈品）でプローブすることにより、ｒＲＮＡの分解を立証した。２−５Ａを注入すると、２−５ＡシンテターゼとＲＮアーゼＬの両者（図２４、レーン６）又はＲＮアーゼＬのみ（図２４、レーン５）を発現するトランスジェニック植物でしかｒＲＮＡの分解は生じず、ベクター単独で形質転換した対照植物（図２４、レーン１）又は２−５Ａシンテターゼのみを発現する植物（図２４、レーン３）では分解しないと思われる。更に、ＲＮアーゼＬを発現する植物は、対照、非トランスジェニック植物に存在しない特異的２−５Ａ結合活性をもつと考えられる。従って、トランスジェニック植物にヒトＲＮアーゼＬｃＤＮＡを導入すると、機能的ＲＮアーゼＬ酵素が産生されることが意外にも判明した。２−５Ａシンテターゼがトランスジェニックタバコ植物に存在するか否かを調べるために、酵素の機能的アッセイを行った。トランスジェニック植物の抽出物における２−５Ａシンテターゼ活性を２−５Ａの機能的アッセイにより測定した。約０．５％（ｖ／ｖ）Ｎｏｎ−ｉｄｅｔＰ−４０、約９０ｍＭＫＣｌ、約５ｍＭ酢酸マグネシウム、約２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ約７．５）、約５ｍＭ２−メルカプトエタノール及び約１０μｇ／ｍｌロイペプチンを含有するＮＰ４０溶解用緩衝液中で葉をホモジナイズすることにより、植物抽出物を調製した。全細胞溶解物を約４℃で約１０，０００×ｇで約１０分間遠心分離し、上清を集めてタンパク質濃度を測定した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．ら：Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７２：２４８（１９７６）参照。ボルテックスミキシングにより細胞を破壊する以外は同一方法を使用し、インターフェロン（約２００単位／ｍｌのヒトインターフェロンαで約１８時間）で処理したヒトＨｅＬａ細胞の抽出物を調製した。各アッセイ約２００μｇの（タンパク質）抽出物を使用し、約２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ約７．５）、約５０ｍＭＫＣｌ、約５ｍＭ酢酸マグネシウム、約４ｍＭ塩化マグネシウム、約５ｍＭ２−メルカプトエタノール、約１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、約２ｍＭＡＴＰ、約２０μ ｇ／ｍｌポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）約６５μｌを含むＮＰ４０溶解用緩衝液を加えて６５μｌとし、約３０℃で約２４時間アッセイすることにより２−５Ａシンテターゼアッセイを実施した。反応を終了し、反応混合物を１００℃まで５分間加熱した後に１０，０００×ｇで１０分間遠心分離することにより、タンパク質を変性して取り出した。上清を取り出し、ｓｐｅｅｄ−ｖａｃ（Ｓａｖａｎｔ）で２０μｌまで濃縮した。次に２−５Ａを２−５Ａ依存性リボヌクレアーゼＬアッセイにより定量した。Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｒ．Ｈ．：Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４４−４５０（１９８５）に記載されているように調製した約０．２ｍＭポリ（Ｕ）−（³²Ｐ）−ｐＣｐを含む緩衝液（約９０ｍＭＫＣｌ、約１０ｍＭ酢酸マグネシウム、約２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ約７．５）、約８ｍＭ２−メルカプトエタノール及び約１０μｇ／ｍｌロイペプチン）中で、濃縮上清（約５及び約１０μｌ／植物）又は真性２−５Ａ（ｐＡ（２’ｐ５’Ａ）₃ ）の希釈液を約２５μｌの最終容量で組換えヒトＲＮアーゼＬ（ＤｏｎｇＢ．ら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１４１５３（１９９４））約１μｇと共に約３０℃で約２時間インキュベートした。反応停止用緩衝液約７．５μｌを加えて反応を終了し、約５分間煮沸し、短時間遠心分離し、約３μｌを約６％ポリアクリルアミド／尿素ゲルにロードした。電気泳動後、Ｘ線フィルムをゲルに感光させた。ＡＴＰと２−５Ａシンテターゼの活性剤であるポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）を含む緩衝液中で葉の抽出物をインキュベートした。Ｈｏｖａｎｅｓｓｉａｎ，Ａ．Ｇ．ら：Ｎａｔｕｒｅ，２６８：５３７（１９７７）；及びＭａｒｉｅ，Ｉ．ら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：９９３３（１９９２）。反応混合物からタンパク質を取り出した後、トランスフェクトした昆虫細胞から単離した組換えヒトＲＮアーゼＬを活性化する能力により２−５Ａをアッセイした。ＤｏｎｇＢ．ら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１４１５３（１９９４）及び図２５参照。比較のために、真性２−５Ａ（ｐＡ（２’ｐ５’Ａ）₃）をＲＮアーゼＬと共にインキュベートすると、別個のポリ（Ｕ）分解物が生じた（図２５、レーン１〜７参照）。ヒト２−５ＡシンテターゼとＲＮアーゼＬの両者（図２５、レーン８〜１１）又は２−５Ａシンテターゼ単独のトランスジェニック植物の抽出物は機能的２−５Ａを産生すると考えられる。真性２−５Ａ（図２５、レーン１〜７）とインターフェロンで処理したヒトＨｅＬａ細胞からの２−５Ａシンテターゼアッセイ（図２５、レーン１６、１７）でも同一のポリ（Ｕ）分解物が観察された。これらの結果は、トランスジェニックタバコ植物における機能的２−５Ａシンテターゼの産生を立証するものであると思われる。他方、ベクター単独で形質転換した対照植物の抽出物は、特定ポリ（Ｕ）分解物が存在しない（図２５、レーン１２〜１５）ことから明らかなように、２−５Ａを産生しないと思われ、２−５Ａシンテターゼがタバコに存在しないという確信を裏付ける。Ｃａｙｌｅｙら：Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１０８：１２４３（１９８２）参照。ウイルス耐性をモニターするために、３種の異なる型の植物ウイルス即ちポチウイルス群の１員であるタバコ腐食ウイルス（ＴＥＶ）、タバモウイルス群の１員であるＴＭＶ及びブロモウイルス群の１員であるアルファルファモザイクウイルス（ＡＩＭＶ）を手作業で葉に接種した。Ｒ．Ｅ．Ｆ．Ｍａｔｔｈｅｗｓ，ＰｌａｎｔＶｉｒｏｌｏｇｙ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＩｎｃ．，ＮＹ，１９９１参照。トランスジェニック植物を温室で培養した。これらの植物の葉を葉柄で切断し、湿した濾紙を敷いたペトリ皿に入れた。葉をペトリ皿にインキュベーション期間保持し、良好な生理的条件に保った。ＴＥＶ（重症株）ＡＴＣＣ＃ＰＶ６９、ＴＭＶ（普通株）及びＡＩＭＶ（Ｎｅｂｒａｓｋａ株）を夫々全身感染させたタバコの葉から新たに調製した抽出物の１：２００、１：１０００及び１：１５０希釈液を葉に接種した。６個の対照植物の全６個には接種時に夫々１：１０，０００、１：１００，０００及び１：１５，０００に希釈したｓａｐを全身感染させた。ウイルスと共にインキュベーション後、葉を水で濯ぎ、ペトリ皿を延伸パラフィルムで密閉し、約２２℃のインキュベーターに約１８時間の明光条件下で約７日間置いた。２−５ＡシンテターゼとＲＮアーゼＬの両者又はいずれか一方のみのタンパク質を発現する合計４８個カナマイシン耐性Ｒ１子孫植物からの葉を試験した。代表的な植物からの合成写真を図２６に示す。両方のタンパク質を発現する植物の感染は局所病斑を誘発する（図２６、パネルａ、ｃ、ｅ）が、一方のタンパク質のみを発現する植物（図２６、パネルｇ、ｈ）又は対照植物（図２６、パネルｂ、ｄ、ｆ）は典型的な全身感染を生じる。本来、ＴＥＶとＡＩＭＶはタバコ植物に局所病斑を生じないと考えられる。Ｒ．Ｅ．Ｆ．Ｍａｔｔｈｅｗｓ，ＰｌａｎｔＶｉｒｏｌｏｇｙ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＩｎｃ．，ＮＹ，１９９１参照。ＴＭＶはＮ又はＮ’遺伝子を含むタバコ植物で局所病斑を生じると考えられる。Ｓｅｌａ，Ｉ．ら：Ａｄｖ．ＶｉｒｕｓＲｅｓ．，２４：１７７（１９８１）。他方、使用するタバコ変種（ＳＲ−１）はＮ遺伝子を含まないので、ＴＭＶの全身宿主ではない。種々のウイルスにより生じる病斑は形態学的に顕著である。更に、ＡＩＭＶにより生じる病斑はＴＥＶ及びＴＭＶよりも小さい。トランスジェニック植物における病斑は約４８時間以内に迅速に現れるが、高感受性対照植物（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ，ｖａｒＳａｍｓｕｎＮＮ及びＸａｎｔｈｉｎｃ）のＴＭＶ病斑は約７２時間後でないと現れない。接種材料の濃度と局所病斑の数の間には直接相関があると思われる。トランスジェニック植物に病斑が形成されるのは、ウイルスｄｓＲＮＡが２− ５Ａシンテターゼを活性化し、その結果としてＲＮアーゼＬによるＲＮＡ分解を生じるためであると考えられる。植物における２−５Ａ系の活性化は、ウイルスゲノムＲＮＡにおける長い二次構造又はウイルス複製中に形成される２本鎖複製中間体により達成され得る。接種した３種のウイルスのいずれでも、ウイルス特異抗体を用いたＥＬＩＳＡでは病斑間の葉組織にウイルスは検出されなかった。ヒト２−５Ａ系を発現するトランスジェニックタバコ植物中のウイルスが改変又は変異していないことを確かめるために、単一病斑からウイルスを回収し、対照植物に再接種した。回収した３種のウイルスは対照植物では典型的な症状と全身感染を生じた。従って、機能的２−５Ａ系を発現するトランスジェニック植物は最初にウイルス感染を受けた少数の細胞を選択的に死滅させ、病斑を形成すると考えられる。即ち、インターフェロンで調節した２−５Ａ系はウイルスに対する防御として細胞自殺を誘導すると考えられる。本発明は当然、本発明の精神および本質的特徴から離れることなく、本明細書中に記載した態様以外の具体的態様において実施してもよい。例えば、本明細書に開示したヌクレオチド配列を他のヌクレオチド配列と組み合わせて、トランスジェニック植物を形成するために植物のゲノム内に導入するための異種ヌクレオチド配列を生成することができる。従って、本実施態様は、全ての意味において例示的なもので限定的なものではないとみなすべきであり、添付する請求の範囲の意味および均等の範囲内に入る全ての変更が本明細書中に含まれることが意図される。本発明を説明してきたが、以下のものを請求の範囲に記載する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．その細胞の全てが；ａ）２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅと同一または均等の活性を有するアミノ酸配列をコードする第１の外因性ヌクレオチド配列；ｂ）２−５Ａシンテターゼと同一または均等の活性を有するアミノ酸配列をコードする第２の外因性ヌクレオチド配列；を含む、トランスジェニック植物であって、上記第１および第２の外因性ヌクレオチド配列を含まない同様の植物よりもウイルス感染に対してより耐性が大きいトランスジェニック植物。２．上記トランスジェニック植物がタバコ植物である、請求の範囲第１項記載のトランスジェニック植物。３．上記トランスジェニック植物が、上記第１および第２の外因性ヌクレオチド配列を含まない同様のタバコ植物よりも、タバコモザイクウイルス、タバコ腐食ウイルスおよびアルファルファモザイクウイルスに対する耐性が大きい、請求の範囲第２項記載のトランスジェニック植物。４．上記トランスジェニック植物が、野菜、果実、穀物、樹木、花、草、雑草、および低木トランスジェニック植物から成る群から選択される、請求の範囲第１項記載のトランスジェニック植物。５．上記第１の外因性ヌクレオチド配列が表１の１−２２２３として指定されたヌクレオチド、または２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの完全または部分コード配列を含むこのヌクレオチド配列の任意の部分を含み、上記第２の外因性ヌクレオチド配列が図２０の１−１６５０として指定されたヌクレオチド、または２−５Ａシンテターゼの二本鎖ＲＮＡ結合ドメイン上に２−５Ａシンテターゼの完全または部分コード配列を含むこのヌクレオチド配列の任意の部分を含む、請求の範囲第１項記載のトランスジェニック植物。６．上記第１の外因性ヌクレオチド配列が表２の１−２０３７として指定されたヌクレオチド、または２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅの完全または部分コード配列を含むこのヌクレオチド配列の任意の部分を含み、上記第２の外因性ヌクレオチド配列が図２０の１−１６５０として指定されたヌクレオチド、または２−５Ａシンテターゼの二本鎖ＲＮＡ結合ドメイン上に２−５Ａシンテターゼの完全または部分コード配列を含むこのヌクレオチド配列の任意の部分を含む、請求の範囲第１項記載のトランスジェニック植物。７．上記第１および第２の外因性ヌクレオチド配列がｐＡＭ２２００ベクターを介して上記植物に導入される、請求の範囲第１項記載のトランスジェニック植物。８．植物が機能的２−５Ａ系を発現するように植物に移入するための植物内への導入用ベクターであって、ｐＡＭ２２００である上記ベクター。