JPH11507540A - 合成哺乳動物染色体および構築のための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、遺伝子治療、遺伝子発現、およびそれらの使用のためのベクターの分野に関する。具体的には、本発明は、構造的にインタクトな大きな反復単位のDNAであって、特に、アルファサテライトDNAの安定なクローニングに有用なDNAを作製するための方法、および哺乳動物、特にヒトにおける遺伝子発現および遺伝子治療のための合成または人工染色体の開発および使用に関する。本発明は、精製されたDNAの単離セグメントから構築される安定な合成または人工染色体の制御された構築を可能にする。機能的に最小のセグメントは、好ましくは、セントロメアDNA、テロメアDNA、およびゲノムDNAを包含する。この染色体を遺伝子治療のための効果的なベクターとして機能させるために、人工染色体は天然に存在する染色体の必須染色体機能を担う。

Description

【発明の詳細な説明】 合成哺乳動物染色体および構築のための方法 連邦政府の援助による研究および開発の下でなされた発明に関する権利の宣言 本発明の開発の間になされた業績の一部は米国政府基金を利用した。米国政府 は本発明において特定の権利を有する。 発明の分野 本発明は、遺伝子発現および遺伝子治療の分野、ならびにそれらの使用のため の新規ベクターに関する。具体的には、本発明は、特にヒトにおける遺伝子発現 および遺伝子治療のためのベクターとしての合成または人工染色体の開発および 使用に関する。本発明は、単離精製されたDNAからの安定な合成または人工染色 体の制御された構築を可能とする。このDNAに関しては、機能的染色体が細胞で 形成され、染色体外エレメントにおいて維持される。治療DNAが染色体に含まれ る場合、この染色体を遺伝子治療のための効果的なベクターとして機能させるた めに、人工染色体は天然に存在する染色体の必須染色体機能を担う。 発明の背景 遺伝したかまたは獲得した疾患を直すことを目的とする細胞の遺伝子操作を遺 伝子治療という。今日まで、この分野におけるほとんどの臨床研究は、ウイルス 遺伝子治療ベクターの使用に焦点を当ててきた。これらの研究の結果に基づいて 、現行のウイルス遺伝子治療ベクターは厳しい臨床的制限を有することが明らか にされつつある。これらは、免疫原性、細胞変性性、無規則性の遺伝子発現、お よび治療遺伝子のサイズについての制限を含む。これらの理由で、近年、多くの 注目が非ウイルス遺伝子治療ベクターの使用に向けられてきた。 特に、合成哺乳動物染色体は、生細胞に対する種々の遺伝子操作を容易にする ために有用なベクターである。合成哺乳動物染色体の利点は、高い有糸分裂安定 性、規則的かつ調節された遺伝子発現、高クローニング能力、および非免疫原性 を含む。 人工染色体は、最初に、1983年にS．cerevisiae（Murrayら，Nature，305:189 -193(1983)で、および1989年にS．pombe（Hahnenbergerら，Proc．Natl．Acad． Sci．USA 86:577-581(1989)）で構築された。しかし、多くの理由で、同様のベ クターが哺乳動物細胞で作製され得るか否かは明らかではなかった。 第１に、多細胞生物（すなわち、哺乳動物細胞の祖先）は10億年以前に酵母か ら分岐した。生きている生物の間には類似性があるものの、一般に、2つの生物 間の類似性は、逆に、それらの進化的分岐の程度に関連する。明らかに、酵母、 単細胞生物は、複雑な単細胞脊椎動物と生物学的にかなり異なる。 第２に、酵母染色体は哺乳動物染色体よりも数オーダー大きさが小さい。S．c erevisiaeおよびS．pombeにおいては、染色体は、それぞれ、0.2〜2メガベース および3.5〜5.5メガベースの長さである。対照的に、哺乳動物染色体は、約50メ ガベース〜250メガベースのサイズの範囲である。サイズにおいてかなりの差が 存在するので、先験的には、酵母人工染色体に匹敵する構築体が構築し得、そし て哺乳動物細胞にトランスフェクトされ得るか否かは明らかではない。 第３に、酵母染色体は、哺乳動物染色体よりも凝縮していない。これは、哺乳 動物染色体が、このより高いレベルの構造を達成するために、より複雑なクロマ チン相互作用に依存することを意味する。哺乳動物染色体の複雑な構造（DNA構 造および高次元のクロマチン構造の両方）は、人工染色体が哺乳動物細胞におい て作製され得るか否かの疑問を投げかける。 第４に、酵母染色体は哺乳動物セントロメアよりも複雑性がかなり低い。S．c erevisiaeでは、例えば、セントロメアは125bp配列よりなる。S．pombeでは、セ ントロメアは14kb配列エレメントの約2〜3コピー、およびコア領域によって分け られた逆方向反復（約7kb）から構成される。対照的に、ヒトセントロメアは高 度に反復するアルファサテライトDNAの数100キロベース〜数メガベースよりなる 。さらに、哺乳動物セントロメアでは、S．pombeで見出されているような中央コ ア領域または逆方向反復の証拠は存在しない。従って、酵母セントロメアとは異 なり、哺乳動物セントロメアは極度に大きく、そして反復性である。 第５に、酵母セントロメアは、哺乳動物セントロメアよりもはるかに少ない紡 錘体付着物しか有さない（Bloom，Cell 73:621-624(1993)）。S．cerevisiaeは 、例えば、セントロメアに付着した１つの微小管を有する。S．pombeでは、１つ のセントロメアあたり２〜４の微小管が付着したものが存在する。他方、ヒトで は、各染色体のセントロメアに付着した数ダースの微小管が存在する（Bloom，C ell, 73:621-624(1993)）。これは、酵母セントロメアと比較して、哺乳動物セ ントロメアの複雑性をさらに示す。 まとめると、これらの差異は著しく、そして酵母での結果が哺乳動物に当ては められ得ることを合理的に予測され得ることを示唆しない。 正常な哺乳動物染色体は、約50〜240メガベースのサイズ範囲の連続する直鎖 状DNAからなる。これらの遺伝的単位が各細胞分裂において信頼性高く複製され 、そして分離されるためには、それらは少なくとも3つのタイプの機能的エレメ ント：テロメア、複製起点およびセントロメアを含有しなければならない。 哺乳動物におけるテロメアは、反復配列（TTAGGG）_nよりなり、そして染色体 末端の複製および安定化に必要であると考えられる。複製起点は、細胞周期のＳ 期の間、染色体DNAの効率的かつ制御された複製に必要である。哺乳動物複製起 点は配列レベルではよく特徴付けされていないが、それらは哺乳動物DNAで比較 的豊富であると信じられている。最後に、セントロメアは、有糸分裂の間に個々 の染色分体が２つの娘細胞に分離するのに必要であり、各娘細胞が各染色体の１ つの、および唯一のコピーを受け取ることを確実にする。複製起点と同様に、セ ントロメアは配列レベルでは明らかにされていない。アルファサテライトDNAは 、重要なセントロメア成分であり得る（Haafら，Cell 70:681-696(1992); Larin ら，Hum．Mol．Genet．3:689-695(1994); Willard，Trends in Genet．6:410-41 5(1990)）。しかし、明らかにアルファサテライトDNAを欠く有糸分裂的に安定な 異常染色体誘導体の事例が存在する（Callenら，Am．J．Med．Henet．43:709-71 9(1992); Crollaら，J．Med．Genet．29:699-703(1992); Voullaireら，Am. J． Hum．Genet．52:1153-1163(1993); Blennowら，Am．J．Hum．Genet．54:877-853 (1994); Ohashiら，Am．J．Henet．55:1202-1208(1994)）。従って、現時点では 、哺乳動物セントロメアの組成はあまり理解されないままある。 他の者は哺乳動物細胞における「人工」染色体を生成したことを主張している が、誰も外因性DNAのみを含有する人工的染色体を生成していない。これら従来 の各事例では、研究者は現存の染色体を改変してより小さくしたか（「ペア−ダ ウン」(pare-down)アプローチ）、あるいは彼らは、外因性DNAを現存の染色体に 組み込み、次いで、これを破壊して予め存在する染色体からの内因性配列を含有 する染色体フラグメントを生成させたか（「フラグメント」アプローチ）のいず れかであった。本発明においては、外因性DNA配列がヒト細胞に導入され、そし て内因性染色体へ組み込まれることなく安定な合成染色体を形成する。 ペア−ダウンアプローチにおいては、3つの特定のストラテジーが使用されて きた：（1）異常な組換えを介するテロメア指向性切形(Barnett，M.A.ら，Nucle ic Acids Res．21:27-36(1993); Farr，C．J.ら，EMBO J．14:5444-54(1995))（ 2）相同組換えを介するアルファサテライト標的化テロメア挿入／切形(Brown，K ．E.ら，Hum．Mol．Genet．3:1227-37(1994))（3）二動原体染色体の形成／破壊 (Hadlaczky，G.，Mammalian Artificial Chromosomes，米国特許第5,288,625号( 1994))。 Barnettら(Nucleic Acids Res．21:27-36(1993))、Farrら(EMBO J．14:5444-5 4(1995))、およびBrownら(Hum Mol．Genet．3:1227-37(1994))は、テロメアDNA および選択マーカーを哺乳動物細胞にトランスフェクトすることによって内因性 染色体をフラグメント化する方法を記載している。それぞれの場合で、元の染色 体より小さい切形染色体が作製されている。得られた切形染色体は内因性セント ロメアを含む大量の内因性染色体配列を含有した。従って、これらの染色体は新 たに形成されなかった。 Hadlaczky(Mammalian Artificial Chromosomes，米国特許第5,288,625号(1994 ))は、二動原体染色体破壊事象の結果として形成された染色体を増やすために使 用され得る細胞株を記載している。選択マーカーを除く全ての配列は、元の十分 に機能的な二動原体染色体に由来するものであった。従って、これらのいわゆる 「人工」染色体は新たに作製されなかった。 「フラグメント化」アプローチにおいては、Haafら(Cell 70:681-696(1992)) およびPraznovskyら(Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:11042-11046(1991))は、 トランスフェクトされたDNAを内因性染色体に組み込むことによって染色体 フラグメントを生成する方法を記載している。トランスフェクション後、組み込 まれたDNA配列は増幅され（コピー数の増加）、そしていくつかのクローンでは 、内因性染色体の一部が破壊して、染色体外に存在するフラグメントを生成する 。両文献においては、取り込まれトランスフェクトされたDNAは内因性染色体お よび染色体外フラグメントに広く見出され得る。 Haafら(Cell 70:681-696(1992))の実験において、ヒトアルファサテライトDNA およびネオマイシン耐性遺伝子がアフリカミドリザル細胞に同時トランスフェク トされた。他の外因性DNAはいずれのトランスフェクションにおいても含まれな かった。各トランスフェクションクローンにおいて、DNAは内因性染色体に組み 込まれることが見出された。染色体外フラグメントを含有することが見出された １つのクローンにおいて、トランスフェクトされたアルファサテライトDNAは、 組み込み後、大量に増幅した。著者らは、サザンブロットおよび蛍光インサイチ ュハイブリダイゼーションに基づいて、アフリカミドリザル配列がトランスフェ クトされたDNAとともに同時増幅し、そしてアルファサテライトDNAにおいて散在 していると結論した。増幅されたアルファサテライトを含有する染色体のさらな る特徴付けにおいて、「トランスフェクトされた染色体領域の数、サイズおよび 染色体位置（テロメア染色体、介在染色体、またはセントロメア染色体）は、3 〜31細胞株の集団内において細胞間で変化し、このことがトランスフェクト配列 の不安定性を示唆する」ことが見出された。最後に、増幅されたアルファサテラ イトDNAを含有する染色体の有糸分裂挙動の分析は、後期ブリッジの高発生を明 らかし、染色体が二動原体染色体（または、多セントロメア染色体）であること を示唆した。従って、後期ブリッジ構造の高発生と関連する高度の観察された構 造不安定性は、組み込み／増幅／破壊事象からもたらされる染色体フラグメント の考え方と合致する。最後に、組み込まれ、増幅されなかったアルファサテライ トDNAを含有するクローンにおいて、染色体外フラグメントが観察されず、増幅 がこの方法における染色体フラグメント化工程のために重要であることをされに 示唆したことも注目に値する。 Praznovskyら(Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:11042-11046(1991))は、非セ ントロメアヒトDNAフラグメント（後に、McGillら(Hum．Mol．Genet．1:749- 751(1992))およびCooperら(Hum．Mol．Genet．1:753-754(1992))によってヒト染 色体9qterにマップされることが示された）を内因性染色体に組み込むことによ って染色体フラグメントを生成させた。Haafの実験と同様に、組み込まれたトラ ンスフェクトされたDNAは十分に増幅され、そしてマウスゲノム配列と共に分散 されていることが判明した。著者らは、トランスフェクトされたDNAの組み込み ／増幅の結果、二動原体染色体が形成され、次いで、これは破壊されて染色体フ ラグメントを生成することを示唆している。染色体フラグメントの分析は、明ら かに、染色体フラグメントが組み込まれた増幅されたDNAを含有するマウス染色 体に由来したことを示す。 HaafらおよびPraznovskyらによる実験の間には多数の重要な類似性がある。第 １に、両者はトランスフェクトされたDNAが内因性染色体に組み込まれたことを 示す。第２に、両者は、組み込みの後に、トランスフェクトされたDNAが十分に 増幅されたことを示す。第３に、内因性DNA（レシピエント細胞由来のトランス フェクトされていない染色体配列）は増幅された配列全体に分散していることが 見出された。第４に、増幅されたトランスフェクトされた配列を含有する内因性 染色体は、CREST抗血清で染色された。第５に、増幅されたトランスフェクトさ れた配列を含有する内因性染色体は、有糸分裂の間に二動原体染色体と同様に挙 動した。最後に、増幅されたトランスフェクトされた配列を含有する内因性染色 体は構造不安定性を示した。従って、Praznovskyらによる非常に多数の重要な類 似性および実証された染色体フラグメント化は、これらの両実験における染色体 組み込み／増幅／破壊機構を示す。 アルファサテライトDNAの哺乳動物染色体へのトランスフェクションおよび組 み込みが増幅の非存在下で染色体外フラグメントを作製するのに十分ではないと いうさらなる証拠が、Larinら(Hum．Mol．Genet．3:689-95(1994))によって得ら れた。これらの実験においては、選択マーカーに連結されたアルファサテライト DNAがヒト細胞にトランスフェクトされた。すべての薬剤耐性クローンにおいて 、アルファサテライトDNAは内因性染色体に組み込まれた。これらの組み込みは セントロメア様構造（すなわち、一次収縮、CREST抗血清染色、および後期の間 のラギング染色体）を形成したが、いずれのクローンにおいても染色体外フラ グメントは観察されなかった。これらの実験はトランスフェクトされたアルファ サテライトDNAは含有するが、内因性セントロメアを含有しない染色体を有する クローンを提供しなかったので、形成されたセントロメア様構造が染色体分離を 促進し得るか否かを決定する信頼性のある方法は存在しない。 各「ペアド−ダウン（pared-down）」染色体は予め存在する染色体から作製さ れたので、そして、「フラグメント化」染色体の各々はDNAを予め存在する染色 体に組み込むことによって作製されたので、これらの参考文献はトランスフェク トされた裸のDNAからいかにして新たに染色体を作製するかについてのガイダン スを提供しない。 さらに、それらを作製するのに使用されるこれらの染色体およびアプローチは 、いくつかの理由で遺伝子治療ベクターとしての厳しい制限を有する。第１に、 それらを作製するために使用される方法は、細胞培養物において染色体を作製す るためにのみ使用され得る。破壊事象は極端に稀でありそして／または予測でき ない構造を有する染色体を生じるので、これらの方法は親細胞における直接的使 用に適合しない。さらに、フラグメント化アプローチにおける増幅された配列の 不安定性は、次に、細胞性形質転換およびガンに導き得るゲノム再配置の危険の ために、患者での使用に適さない。 それゆえ、患者の細胞に直接的に導入され得る規定された構造を有する予め作 製された染色体ベクター、特に、内因性染色体への組み込みおよび続いての増幅 に依存しないベクターが存在すれば、そして、細胞における構築物の構造がトラ ンスフェクション前のその構造と実質的に同一であれば、非常に望ましい。 第２に、ペアド−ダウン染色体および染色体フラグメントは規定されない内因 性配列からなり、そして機能的に重要である配列を同定するためのガイダンスを 提供しない。 それゆえ、規定された配列からなるベクターおよび他の機能的に重要な配列が 迅速に同定されることを可能にするこれらの規定された合成染色体を生成する方 法を提供することは非常に望ましい。 第３に、ペアド−ダウンおよびフラグメント化アプローチによって生成された 染色体は、現在利用可能な技術を用いて実質的に精製され得ない。従って、他の 哺乳動物染色体を送達することなく、これらのペアド−ダウン染色体を哺乳動物 細胞に送達することは困難である。 それゆえ、細胞に導入され得、そして機能的染色体を形成し得る実質的に精製 された遺伝子操作されたDNAを提供することは非常に望ましい。 第４に、これらのペアド−ダウン染色体および染色体フラグメントは、現在ま でのところ、裸のDNAとして単離され、そして細胞に再導入されていないので、 任意の内因性DNAが細胞に導入されて、（宿主染色体にまず組み込まれることな く）新たに機能的染色体を生成し得るのかは全く明らかでなかった。 それゆえ、精製されたDNAを哺乳動物細胞に導入することによって、新たに作 製される人工哺乳動物染色体を提供することは非常に望ましい。 最後に、新たなDNA配列（例えば、治療遺伝子）をペアド−ダウン染色体およ び染色体フラグメントに付加することは非常に困難である。 それゆえ、新たなDNA配列をベクター上に配置することが直接的かつ効果的で ある、インビトロで作製されるベクターを提供することは非常に望ましい。 Sunら(Nature Genetics 8:33-41(1994))は、ヒト細胞で使用されるように設計 されたウイルス−ベースのベクター系を記載している。このベクターは「ヒト人 工エピソーム染色体」として記載されている。しかし、このベクターはEBNA-1（ 毒性かつ免疫原性のウイルスタンパク質）の存在に依存している。さらに、この ベクターは天然の哺乳動物染色体複製起点ではなくウイルスの複製起点に依存し ている。さらに、「染色体」は機能的なセントロメアDNAもテロメアDNAも含有せ ず、そして有糸分裂の間に機能的キネトコアを形成しない。その結果、このよう なベクターは制御された様式では分離されない。最後に、このベクターは、内因 性染色体とは異なって、細胞当たり50〜100コピーの範囲である増大したコピー 数で細胞内に存在する。哺乳動物染色体を規定するためのこれらの基準に基づき 、このベクターは、それが無関係の機構によって異なる特性および機能を有する ので、「ヒト人工染色体」と適切に称され得ない。 従って、インビトロで操作され得、そして細胞へのトランスフェクションに際 して、機能的染色体構造をとり、かつ制御された様式で遺伝子発現を指向するDN Aから作製された全合成または人工染色体に対する明らかな要望が依然として存 在する。 大きく、高度に反復性のDNAをクローニングする能力は、ヒト人工ミクロ染色 体、および遺伝子治療ビヒクルの開発および構築に向けての重要な工程である。 さらに、微生物における反復DNAの安定なクローニングは哺乳動物染色体の高分 解性物理的地図を作成するために重要である。 外来DNAの微生物におけるクローニングおよび増殖を容易にするために、種々 のクローニング系が開発された。プラスミド、バクテリオファージおよび酵母人 工染色体（YAC）が成功して使用されて多くの哺乳動物DNA配列がクローニングさ れている。しかし、いくつかのタイプの反復DNAはこれらのベクター中で構造的 に不安定であるようである（Schalkwykら，Curr．Opin．Biotechnol．6(1):37-4 3(1995))；Brutlag，D.ら，Cell．10:509-519(1977)）。この結果、物理的ゲノ ム地図にギャップが生じ、そして高度に反復性の哺乳動物セントロメアDNAを増 殖させる手段としてのこれらのベクターの使用を排除する。 細菌人工染色体（BAC）が構築されて、E．collにおける大きなDNAフラグメン トのクローニングが可能となった(O'Connerら，Science 244(4910):1307-12(198 9)；Shizuyaら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89(18): 8794-7(1992); Hosodaら ，Nucleic Acids Res．18(13):3863-9(1990))。この系は少なくとも300 kbまで の哺乳動物DNAを安定に増殖させ得るようであるが、比較的少数の独立した哺乳 動物DNAフラグメントのみが分析されている Shizuyaら，Proc．Nato．Acad. Sci ．USA 89(18):8794-7(1992))。さらに、BACベクターにおいて構造的安定性につ いて試験された少数のフラグメントは、各フラグメントに存在する配列のタイプ に関して十分には特徴付けられていない。従って、これらのフラグメントが反復 DNAエレメントを含有するかは知られていない。特に、制限部位およびサザン分 析に基づいて、これらのフラグメントがアルファサテライトDNAを含有しないこ とは明らかである。 多くの哺乳動物DNA配列は酵母人工染色体（YAC）において構造的に安定である ようであり、そしてなお同様の長さの特定の反復エレメントは構造的に安定では ない(Neilら，Nucleic Acids Res．18(6):1421-8(1990))。YAC系に由来するDNA 特性の知識は、従って、反復単位の大きな整列が、非反復DNAからなる同様のサ イズのDNAが安定である条件下でさえ、本来不安定であることを示唆する。従っ て、BACベクターにおけるアルファサテライトDNAにおいて見出されるような反復 単位の大きな（100 kbを超える）整列の構造的安定性は、いかなる合理的確実性 を有しても予測し得ない。さらに、たとえいくつかのアルファサテライト整列が BACベクターにおいて構造的に安定であっても、直感的には、セントロメア機能 を促進するに十分にサイズおよび配列組成の整列がこのベクターにおいて安定に 増殖され得るかは明らかではない。 引用される技術とは対照的に、本発明のいくつかの実施態様は、患者の細胞に 直接的に導入され得る規定された構造および組成を有する予め作製された染色体 ベクターを記載する。本発明で記載されるベクターは内因性染色体への組み込み およびその後の増幅に依存しないので、細胞中での構築物の構造はトランスフェ クション前のその構造と実質的に同一である。 引用される技術とは対照的に、本発明で記載されるベクターは、規定された配 列からなる。さらに、これらの合成染色体を生成するために使用される方法は、 他の機能的に重要な配列が迅速に同定されることを可能にする。 引用される技術とは対照的に、本発明をもって、本発明者らは、人工哺乳動物 染色体が、精製したDNAを哺乳動物細胞に導入することによって新たに作製され 得ることを最初に実証する。 引用される技術とは対照的に、本発明で記載されるベクターはインビトロで作 製されるので、新たなDNA配列をベクター上に配置することは直接的かつ効率的 である。 発明の要旨 本発明の目的は、反復DNA、特にアルファサテライトDNAの均一またはハイブリ ッド合成整列の構築方法を記載することである。本発明のさらなる目的は、反復 DNA、特に天然に存在するかまたは合成のアルファサテライト整列をクローニン グし、増殖させ、そして安定に組換え産生する方法を記載することにある。 従って、本発明は、大きな反復DNA配列を安定にクローニングする方法、前記 整列を含有するベクター、およびこのようなベクターで形質転換した宿主に関す る。 本発明者らは、長さが736kbまでの大量の精製されたインタクトなアルファサ テライト整列を産生する方法を開発した。テロメアDNAおよびヒトゲノムDNA配列 と共にこれらの整列をヒト細胞にトランスフェクトすることによって、選択の非 存在下で高い程度の有糸分裂安定性を示すいくつかの全合成ヒト染色体が産生さ れた。 それによって人工哺乳動物染色体を生成しようとする試みがなされた以前のア プローチとは異なり、このアプローチは既存の内因性染色体の改変に依存しない 。さらに、これは内因性染色体内の複数の組み込み事象を生じない。これらの染 色体は染色体外で形成され、そして維持され、従って、内因性染色体への組み込 みは回避される。 比較的高頻度の合成染色体形成および染色体形成に伴う他のゲノム再配置の欠 如は、本発明者らによって作製された合成染色体が異種遺伝子発現および遺伝子 治療用の効果的なベクターとして使用されることを可能にする。 従って、本発明は、単離精製されたDNA単独によって、合成または人工染色体 が細胞において新たに（精製DNAから）産生され、そして染色体外エレメントと して産生されそして維持されるという本発明者らの知見に基づいている。この染 色体は、それが、丁度、天然に存在する染色体が遺伝されるように、選択圧なし に分裂中の哺乳動物細胞において組み込まれていない構築物として安定に維持さ れる点で、天然の哺乳動物染色体の必須な機能を保持する。直鎖状染色体につい ては、これはセントロメア、テロメア、および複製起点の機能を示す。 従って、本発明は、合成または人工哺乳動物染色体に関する。この染色体は単 離精製されたDNAから産生される。この単離精製されたDNAは哺乳動物細胞にトラ ンスフェクトされる。内因性染色体に組み込まれることなく、それは機能的染色 体を形成する。この染色体は、インサイチュで内因性の天然に存在する染色体に 由来しない。出発材料は単離精製されたセントロメアDNAおよび組み込みなしで 染色体形成を可能にするDNAである。直鎖状染色体については、テロメアDNAが含 まれる。好ましい実施態様において、組み込みなしで染色体形成を可能にするDN Aは（生物の天然に存在するゲノム由来の）ゲノムDNAである。 従って、人工哺乳動物直鎖状染色体は、好ましくは、本質的にセントロメアDN A、テロメアDNA、およびゲノムDNAを含む。１つの実施態様において、人工染色 体は環状染色体である。この場合、テロメアDNAは存在しない。なぜなら、染色 体末端を複製する必要がないからである。 ゲノムDNAは、制限酵素消化フラグメント、ゲノムDNAの機械的剪断によって生 じたフラグメント、またはインビトロで合成された合成フラグメントであるサブ ゲノムDNAフラグメントである。ゲノムDNA出発材料（すなわち、トランスフェク トされたもの）は、異種フラグメント（例えば、制限消化物）の混合物であり得 るが、またはクローニングされたフラグメント（同種）であり得る。 セントロメアDNAはキネトコア形成を指向または支持し、それにより適切な染 色体分離を可能とするDNAを含む。免疫蛍光または免疫電子顕微鏡によって示さ れるように、活性で機能的なセントロメアにおけるセントロメアDNAは、有糸分 裂の間にCENP-Eと会合している。「会合」とは、セントロメアDNAおよびCENP-E が蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（FISH）および免疫蛍光によって共 に局在化される（co-localize）ことを意味する。 テロメアDNAは、テロメア機能を提供する、すなわち直鎖状DNA分子の末端を複 製するTTAGGGのタンデム反復を含む。テロメアDNAは、直鎖状染色体が所望され る場合に使用される、任意の成分として含まれる。これは、本明細書では、用語 「テロメア性」／「テロメア」を括弧に入れることによって示される。 トランスフェクションの前に、DNAを裸にし、１つ以上のDNA凝縮剤で凝縮させ 得るか、または１つ以上のDNA結合タンパク質によって被覆し得る。 本発明はまた、哺乳動物細胞に前記の単離精製されたDNAを導入するプロセス によって産生された人工哺乳動物染色体に関する。好ましい実施態様においては 、このプロセスは、本質的にセントロメアDNA、テロメアDNA、およびゲノムDNA を含むDNAを使用する。 種々のフラグメントを別々にトランスフェクトし得るか、または１つ以上のフ ラグメントをトランスフェクションの前に連結し得る。従って、セントロメア（ テロメア）DNAおよびゲノムDNAは別々に導入されるか（連結されない）、または １つ以上の単離精製されたDNAは互いに連結される。 本発明はまた、人工哺乳動物染色体を含む哺乳動物細胞および人工哺乳動物染 色体を含む組成物に関する。 本発明はまた、前記の単離精製されたDNAに関し、これは、哺乳動物細胞に導 入された場合に人工哺乳動物染色体を形成する。好ましい実施態様において、単 離精製されたDNAは本質的にセントロメアDNA、テロメアDNA、およびゲノムDNAを 含む。 本発明はまた、精製DNAを含む哺乳動物細胞および精製DNAを含む組成物に関す る。 本発明はまた、精製DNAを含むベクターに関する。 本発明はまた、このベクターを含む哺乳動物細胞およびこのベクターを含む組 成物に関する。 本発明はまた、１つ以上の前記のDNAを組み合わせるプロセスによって産生さ れた前記の単離精製されたDNAに関する。好ましい実施態様において、このDNAは ：（1） セントロメアDNA、（2）テロメアDNA、（3）ゲノムDNAを含む。このDNA は非連結であり得るか、または１つ以上が互いに連結され得る。 本発明はまた、哺乳動物細胞に前記精製DNAを導入することによって人工哺乳 動物染色体を作製する方法に関する。 本発明はまた、人工染色体を形成し得るDNAを作製する方法に関し、この方法 はインビトロで前記のDNAを組み合わせる工程を包含する。 本発明はまた、精製DNAを哺乳動物細胞に導入し、そして染色体を複製させる ことによって、哺乳動物細胞において人工染色体を増殖させる方法に関する。 好ましい実施態様において、本発明はまた、異種遺伝子を人工哺乳動物染色体 から発現させることによって、哺乳動物においてその遺伝子を発現させる方法に 関する。 従って、本発明はまた、目的の遺伝子が発現されるように、所望の遺伝子を人 工染色体に含ませることによって、所望の遺伝子産物を提供する方法に関する。 好ましい実施態様において、本発明は、染色体を含有する哺乳動物に対する治療 的効果が存在するように、異種治療的DNAを人工哺乳動物染色体に含ませること による、遺伝子治療の方法を提供する。 本発明の好ましい実施態様において、セントロメアDNAはアルファサテライトD NAである。 本発明の好ましい実施態様において、人工哺乳動物染色体はヒトDNA配列に全 体が由来し、そしてヒト細胞において機能的である。 図面の簡単な説明 図１は、本発明の方法の模式図である。数字「１〜16」は直鎖状整列にタンデ ムに配置された、アルファサテライトDNAの１〜16コピーの（約171bpの）モノマ ー単位を表す。「Ｘ」は、所望のサイズへのその拡大の間に整列を有するベクタ ーの骨格における所望の制限酵素部位を表す。 図２は組換え％（50世代後）および整列サイズ（kb）の相関のグラフ表示であ る。 図３。アルファサテライトDNAの大きな頭−尾タンデム整列を産生するための 方法。pVJ104-Yα16をBamHIおよびSfiIで直鎖状化し、そしてパルスドフィール ドゲル電気泳動（PFGE）によって精製した。同様に、pBac-Yα16をBamHIおよびB glIIで直鎖状化し、そしてアルファサテライト整列をPFGEによって精製した。Ａ ）精製された整列をリガーゼ、BamHIおよびBglIIの存在下で一緒にインキュベー トした。BamHIおよびBglIIは相補的／アイソシゾマー突出であるので、（頭−尾 連結の場合と同様に）BamHI/BglII連結を生じる事象は、両部位を破壊する。従 って、頭−尾連結はBamHIおよびBglIIによる切断に対して耐性である。対照的に 、頭−頭、または尾−尾連結事象は、それぞれ、BamHIまたはBglII部位を再生す る。BamHIおよびBglIIが存在するので、これらの連結産物は、切断されてそれら の構成モノマー（または頭−尾マルチマー）を生じる。リガーゼの量を制御する ことによって、インキュベーション時間、およびDNAの濃度、頭−尾産物の長さ は必要に応じて変化され得る。Ｂ）連結後、この産物をPFGEによって分析した。 レーン１、分子量標準品（NEBL Midrange II マーカー）；レーン２、BamHIおよ びBglIIの存在下で４時間連結したYα16（BamHI/BglIIフラグメント）、レーン ３、BamHI/BglIIの存在下で12時間連結したYα16（BamHI/BglIIフラグメント） ；レーン４、BamHIおよびBglIIの存在下でモック連結したYα16（BamHI/Bgl IIフラグメント）；レーン５、制限酵素なしで12時間連結したVK75（BssHIIフラ グメント）；レーン６、BssHIIの存在下で12時間連結したVK75（BssHIIフラグメ ント）；レーン７、モック連結したVK75（BssHIIフラグメント）。連結産物の分 子量を左側に示す。註：これらの試料を同一ゲルで泳動したが、レーン４と５と の間のいくつかの無関係なレーンを除去した。 図４。合成染色体を作製するためのストラテジー 図５。蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（FISH）によるクローン22− 7および22−13由来の合成染色体の分析。細胞を回収し、スライドガラス上に滴 下し、そして実験手順（本明細書の実施例を参照のこと）に記載のようにＹアル ファサテライトDNAにハイブリダイズさせる。ビオチン化プローブを、テキサス レッドアビジンを用いて検出し、そしてビオチン化抗−アビジンおよびテキサス レッドアビジンの２層を用いて増幅した。Ａ）クローン22−7由来の中期塗布物 のDAPI画像。Ｂ）トリプルキューブフィルター（triple cube filter）を用いて アルファサテライトプローブを可視化した以外はＡ）と同じ。Ｃ）クローン22− 13由来の中期塗布物のDAPI画像。Ｄ）トリプルキューブフィルターを用いてアル ファサテライトプローブを可視化した以外はＣ）と同じ。各々の場合において、 合成染色体を白矢印で示す。 図６。FISHによるクローン22−6および23−1由来の合成染色体の分析。細胞を 回収し、スライドガラス上に滴下し、そして実験手順に記載のようにＹアルファ サテライトDNA（クローン22−6）または17アルファサテライトDNA（クローン23 −1）にハイブリダイズさせた。ビオチン化プローブを、テキサスレッドアビジ ンを用いて検出し、そしてビオチン化抗−アビジンおよびテキサスレッドアビジ ンの２層を用いて増幅した。Ａ）クローン22−6由来の中期塗抹物のDAPI画像。 Ｂ）トリプルキューブフィルターを用いてアルファサテライトプローブを可視化 した以外はＡ）と同じ。Ｃ）クローン23−1由来の中期塗抹物のDAPI画像。Ｄ） トリプルキューブフィルターを用いてアルファサテライトプローブを可視化した 以外はＣ）と同じ。各々の場合において、合成染色体を白矢印で示す。Ｄ）にお いて、黄色矢印は組み込み部位におけるＣ群染色体の位置を示す。 図７。FISHによるクローン22−11および17−15由来の合成染色体の分析。細胞 を回収し、スライドガラス上に滴下し、そして実験手順に記載のようにＹアルフ ァサテライトDNA（クローン22−11）または17アルファサテライトDNA（クローン 17−15）にハイブリダイズさせた。ビオチン化プローブを、テキサスレッドアビ ジンを用いて検出し、そしてビオチン化抗−アビジンおよびテキサスレッドアビ ジンの２層を用いて増幅した。Ａ）クローン22−11由来の中期塗抹物のDAPI画像 。Ｂ）トリプルキューブフィルターを用いてアルファサテライトプローブを可視 化した以外はＡ）と同じ。Ｃ）クローン17−15由来の中期塗抹物のDAPI画像。Ｄ ）トリプルキューブフィルターを用いてアルファサテライトプローブを可視化し た以外はＣ）と同じ。各々の場合において、合成染色体を白矢印で示す。 図８。合成染色体を含有するクローンに存在するトランスフェクトされたアル ファサテライトDNAの量の測定。Ａ）実験手順に記載のように、全ゲノムDNAを回 収し、消化し、そして電気泳動した。レーン１、ＨＴ1080；レーン２、クローン 22−6；レーン３、クローン22−7；レーン４、クローン22−11；レーン５、クロ ーン22−13；レーン６、クローン23−1。Ｂ）合成ＹアルファサテライトDNAの概 算された量を各クローンについて示す。註：クローン23−1を17アルファサテラ イトDNAでトランスフェクトし、それゆえ、合成ＹアルファサテライトDNAを含有 しない。 図９。CENP-Eは有糸分裂の間に合成染色体と会合している。免疫蛍光を、実験 手順に記載のように合成染色体含有クローンから回収した中期染色体に対して行 った。Ａ）クローン22−11由来のDAPI−染色染色体。Ｂ）抗CENP-E抗体の位置を トリプルキューブフィルターを用いて可視化する以外はＡ）と同じ。Ｃ）クロー ン23−1由来のDAPI−染色染色体。Ｄ）抗CENP-E抗体の位置をトリプルキューブ フィルターを用いて可視化する以外はＣ）と同じ。各々の場合において、合成染 色体を白矢印で示す。 図10。選択の非存在下における70日間の増殖の後のクローン22−11のX-Galプ レート染色。本明細書における実験手順に記載のように細胞を回収し、そして染 色した。Ａ）ＨＴ1080 Ｂ）クローン22−11。HT1080ではなくクローン22−11に おける青色細胞の存在は、β-geoがこれらの細胞中でなお発現されていることを 示す。 好ましい実施態様の詳細な説明 本発明者らは、機能的哺乳動物染色体を、哺乳動物細胞に導入された精製DNA から構築し得ることを見出した。種々の適用のためにこれらの染色体を用いるこ とにはいくつかの利点がある。 第１に、それらは形成されそして自律的に複製されるので、それらは宿主ゲノ ムへの挿入によって挿入変異誘発を生じない。 第２に、導入ベクターの大きなサイズ（メガベース範囲）のために、全てのそ の調節エレメントを含めた大きな遺伝子の全体のレパートリーを収容する能力が ある。これ自体がメガベースのDNAを含み得る。 第３に、いくつかの遺伝子疾患は１より多い遺伝子の欠損の結果であるので、 哺乳動物人工染色体の大きなサイズのために、１より多い遺伝子を収容し得る。 第４に、この染色体は安定であり、従って、多くの細胞分裂にわって治療的恩 恵を提供し得る。 第５に、染色体は非免疫原性である。 従って、本発明の方法は、DNAの構造的にインタクトな高度に反復性の領域を 産生するための微生物における方法を提供し、これは、人工染色体の構築におい て利用される。規定された長さ、組成、方向および位相（phasing）の整列が可 能である。「適切な位相」とは、整列における任意の所定の高次反復の正確な長 さおよび方向が、整列の構築により天然に生じる配列におけるそれから変化され ず、そしてまた、反復単位の連結部において非反復DNAが存在しないことを意味 する。例えば、アルフォイド配列については、高次反復単位の長さおよび方向は 天然に存在する高次反復と正確に同じであり、そして制限部位を作製するために 改変された塩基を除いて、高次反復の連結部に存在する非アルフォイド配列は存 在しない。 従って、DNAの反復タンデム整列をクローニングするための方法が提供され、 ここで、第１のDNA単位が、DNA単位の反対の末端が相補的であるが非アイソシゾ マー制限部位を含有するように調製される。このDNAをベクターに連結し、そし てこのベクターを制限部位の１つにおいて直鎖状化する。次いで、工程（ａ）に おけるように調製された第２のDNA単位を第１の単位とタンデムに連結して、方 向付けられた反復整列を形成する。この整列を宿主細胞、特に細菌宿主細胞に形 質転換し、そしてこの整列を含有する安定なクローンを選択する。ベクター直鎖 状化で出発し、これらの工程を所望の整列サイズに到達するまで繰り返す。 本発明の方向付けられたクローニングスキームを図１に示し、ここで、アルフ ァサテライトDNA高次反復のクローニングが例証される。図に示すように、本発 明の方法は「ビルドアップ(build-up)」アプローチを利用し、ここで、より短い 単位、好ましくは高次反復を一緒に加えて、反復単位のより長いタンデム整列を 作製する。この単位を、規定された方向を生じる様式で互いに加え、これは、２ つの異なる制限部位（各反復単位の各末端におけるもの）によって確立される。 好ましくは、タンデム整列の基礎である反復単位、特に高次反復単位は、相補的 であるが非アイソシゾマーの制限部位を反対の末端に含む。このような末端は、 ポリメラーゼ連鎖反応のような方法を用いて単位中に設計され得る。本発明の方 法においては、相補的末端によって、相補的突出末端および平滑末端の両方を含 めることが意図される。 好ましい実施態様において、DNA整列はアルフォイドDNAである。実施例１に示 すように、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、相補的制限部位（BamHIおよびBglII ）がヒト第17染色体からの高次レジスターのアルファサテライト反復の反対の末 端で作製されるように、単一の2.7kb DNAアルフォイド単位（実際の長さ2.712 k b）を増幅し得る。高次反復の末端は、相補的制限部位が各反復の反対の末端に 生じるように、ポリメラーゼ連鎖反応媒介性部位特異的変異誘発を用いて改変し 得る。次いで、改変された高次反復をミニ−ＦクローニングベクターpBAC108L（ Shizuya,H.ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:8794-8797(1992)、本明細書中 に参考として援用される）にクローニングする。これらの相補的制限部位を、非 相補的な隣接する制限部位と共に使用して、単一の改変された高次反復に由来す るアルファサテライトDNAの合成整列に直接的にクローニングする（図３）。合 成整列は、第17染色体、Ｙ染色体、または他の染色体に由来するようなアルフォ イドDNAを含む、任意の高次アルフォイド反復から作製され得る。さらに、両方 の染色体由来の高次反復からなるハイブリッド整列が調製され得る。好ましい 実施態様において、DNAはヒトDNAである。 200〜215 kbまでの整列は，本発明のベクターおよび宿主において安定である 。１つの実施態様において、長さが87 kb〜215 kbの整列が構築される。好まし い実施態様において、長さが少なくとも100 kbの整列が構築される。高度に好ま しい実施態様において、長さが少なくとも140 kb、特に少なくとも174 kbの整列 が構築され；174 kbの整列は機能的アルファサテライト整列の最小の公知の観察 された長さを超える。 このような部位を作製するに有用な相補的であるが非アイソシゾマーの制限酵 素の例としては：SalIおよびXhoI；MunIおよびEcoRI；AflIIIおよびNcoI/StyI（ アイソシゾマー：いずれもが非アイソシゾマーパートナーのためのパートナーで あり得る）；NheIおよびXbaIおよびStyI/AvrII（アイソシゾマー）およびSpeI（ 任意の組合せ）；ClaIおよびBstBIおよびAccI（任意の組合せ）；MluI/AflIII（ アイソシゾマー）およびBssHIIおよびAscI；ならびにNotIおよびEagIが挙げられ る。BclIは、BamHIおよびBglIIの両方の相補的／非アイソシゾマーである。 次いで、増幅されたDNAを、例えば、（1）BamHIおよびSfiI、または（2）BglI IおよびSfiIを用いて消化する。例えば、ゲル電気泳動のような、このようなDNA を分離し得る物理的方法を用いる、消化されたDNA中のバンドの分離後に、１つ の消化物由来のDNAバンドを切り出し、そして他の消化物から切り出されたDNAバ ンドに連結させる。前記の例においては、BglIIおよびBamHIは適合性突出を生じ 、そしてSfiIは特定の方向でのみ再連結し得る非対称突出を生じるので、これら の部位に隣接するDNAをベクターDNAに連結して、頭−尾様式で整列したタンデム ダイマーを作製する。次いで、このDNAを微生物に形質転換し得る。 このストラテジーの第２の変形において、BamHIおよびBglIIが、平滑切断制限 酵素に置換され得る。例えば、それぞれBamHIおよびBglIIが、SmaIおよびEcoRV に置換され得る。次いで、消化およびフラグメント単離を前記のように行う。平 滑および相補的/非アイソシゾマーの両方の変形に共通したこのストラテジーの 重要な特徴は、整列の生理学的位相が、必要であれば、正確に維持され得ること である。使用され得るさらなる平滑切断物の例としては、SspI、StuI、ScaI、Pm lI、PvuII、Ecl136II、NaeI、EheI、HincII、HpaI、SnaBI、NruI、FspI、DraI、 MscI、Bst1071、AluI、 Asp700/XmnI、AviIII、brPII、Bst1107、Eco47III、DpnI、HaeIII、HindII、amI 、MluMI、MvnI、RsaI、SwaI、Bsh1236I、Eco72I、PalIおよびSrfIが挙げられる 。 微生物DNA中に合成アルファサテライトの大きなタンデム整列を含有するクロ ーニングされたプラスミドの構造的安定性は、実施例2に記載した単純増殖およ び希釈実験を用いて測定し得る。例えば、構造的安定性は、50世代の継代および 続いての構造的一体性のためのプラスミドDNAの分析によって測定し得る。プラ スミドの構造は、制限分析およびアガロースゲル電気泳動によって分析し得る。 これらのクローンでほとんどまたは全く組換えは観察されず、これは、方向性ク ローニングスキームを用いて、（pBAC108Ｌベクターのような）ミニ-Ｆクローニ ングベクターおよび適当なE.coli宿主中に合成アルファサテライト整列を構築し 、増殖し得ることを示す。 本発明の方法を用いて、任意の所望の反復性DNA単位を構築し得る。例えば、 任意の真核生物染色体、特にヒトDNAからのアルファサテライトDNAもクローニン グし得る。高度に反復性のDNAの大きなタンデム整列の他の例は、免疫グロブリ ンDNA遺伝子座、ヘテロクロマチン反復の領域、およびテロメアを含む。 本発明の方向性クローニング法は、内因性（非修飾）整列をクローニングする 場合に必要な、多形制限部位の存在を必要としない。たとえ存在する場合でも、 これらの部位は整列の正確なサイズの制御を許容しない。さらに、本発明の方法 で使用されるような単一の高次反復（図1参照）、および続いてのそのサイズの ２倍化によって、全整列の正確な配列が知られる。なぜなら、元の高次反復の配 列は既知であるからである。 例えば、内因性アルファサテライト整列のような内因的整列をクローニングす る場合、所定の整列の正確な組成を信頼し得ない。特に、非反復性DNAによる整 列の分断は、E.coliにおける安定性に有意な影響を有し得る。さらに、遺伝子治 療用のベクターとして適切であるためには、このような治療のレシピエントに提 供されるべきベクターの正確な配列を知らなければならない。本発明の方法は、 その心配を取り除き、そして既知の反復配列から有用な整列を新たに構築するの に好都合なように、当業者が天然アルファサテライト整列の配列決定を回避し得 る。 構造的に発散した高次オーダー反復は、一般に、より相同な整列に対してE.co liにおける構造的安定性の増加を示す。従って、本発明の方法に従って相同合成 整列を利用することによって、ベクター中の反復DNAの最小安定性の正確な測定 が得られ得る。 ベクターが安定に維持される任意の所望の細菌宿主を宿主として使用し得る。 特に、E.coliは、BACベクターおよびBAC系を利用する場合に有用である。 （1）合成アルファサテライト整列をヒトまたは他の哺乳動物細胞株にトラン スフェクトすることによって；（2）ランダムにクローニングしたヒトDNAまたは 特異的DNAフラグメントと組み合わせて合成アルファサテライト整列をヒトまた は他の哺乳動物細胞株にトランスフェクトすることによって；（3）アルファサ テライト含有エピソームDNAの有糸分裂安定性を増強するテロメアDNA、マトリッ クス付着領域および／または他の染色体遺伝子座のような非連結特異的染色体成 分と共に合成アルファサテライト整列をヒトまたは他の哺乳動物細胞株に同時ト ランスフェクトすることによって、合成アルファサテライト整列を合成ヒト染色 体の構築で利用し得る。不安定な形態が経時的に失われるので、非連結形態にお けるこれらの成分の同時トランスフェクションは、トランスフェクトされた細胞 株が無限数の構造的順列を構築することを可能とし、保持されるべき最も有糸分 裂的に安定な形態を可能とする。標準的な方法および手法を利用して、安定なコ ンフォメーションを連続的に収集し得る。選択圧の非存在下で有糸分裂安定性を 示す構築物を単離し、続いて遺伝子、リボザイムまたはアンチセンス転写物のよ うな1以上の治療的に有用なものを含有する遺伝子治療ベクターの調製で利用し 得る。 従って、実質的に本発明は、セントロメア、ゲノムおよび必要に応じてテロメ アDNAよりなる合成または人工哺乳動物染色体に関する。別の実施態様において 、人工染色体は環状染色体である。この場合、テロメアDNAは染色体末端を複製 するのに必要でないので存在しない。この染色体は、最小で、哺乳動物細胞にお ける必須染色体機能を提供するDNA配列を有する。 ゲノムDNAは、制限酵素消化フラグメント、機械的に剪断したフラグメント、 およびインビトロで合成したDNAのフラグメントよりなる群から選択されるサブ ゲノムDNAフラグメントである。染色体のゲノムDNA成分はサブゲノムフラグメン ト（例えば、制限酵素消化物）の混合物、またはクローニングされたフラグメン ト由来であり得る。 ゲノムDNAの機能は２倍である。このDNAは遺伝子産物を発現するか、または遺 伝子産物の発現を引き起こし（例えば、調節機能を有することによって）、そし てこのDNAは、精製されたDNAの細胞中の内因性染色体への組込みなしで、細胞中 で精製されたDNAからの人工染色体の形成を許容する。この人工染色体はまた、 セントロメアDNAおよび必要に応じて、テロメアDNAを含有する。ゲノムDNAは任 意の生物に由来するものであり得、そして任意のサイズであり得る。 合成哺乳動物染色体の成分を形成するゲノムDNAは、細胞が由来し、染色体が 複製する哺乳動物以外の哺乳動物供給源から由来するものであり得る。例えば、 マウスゲノムDNAをヒト細胞に提供し得、ヒトゲノムDNAを他の哺乳動物の細胞に 供し得る。さらに、それはセントロメアまたはテロメアの供給源とは異なる供給 源からのものであり得る。 なおさらに、本明細書で例示されるゲノムDNAの機能は、原核細胞生物を含む 任意の生物のゲノムDNAによって、およびインビトロで合成されそして天然に存 在する配列に対応しない、天然に存在する配列に部分的に相同であるかまたは完 全に非相同なDNAによって潜在的に実行され得る。 セントロメアDNAは、セントロメア形成を指向するかまたは支持するDNAを実質 的に含み、そしてそれにより、適切な染色体分離を可能とする。この活性で、機 能的なセントロメアDNAは、免疫蛍光または免疫電子顕微鏡によって示されるよ うに有糸分裂の間にCENP-Eと会合する。「会合」は、セントロメアDNAおよびCEN P-EがFISHおよび免疫蛍光により同時に局在化されることを意味する。 本発明の好ましい実施態様において、セントロメアDNAはアルファサテライトD NAである。しかし、任意の機能的セントロメアDNA、および特に反復性DNAが、本 明細書に記載される方法によって可能となり、そして人工染色体を作製するのに 有用である。 本発明者らは、大きなアルファサテライト整列を生産するインビトロ法を作製 した。以前は、200kbより大きい構造的にインタクトなアルファサテライトDNAを 、 哺乳動物細胞のトランスフェクションに必要な量にて精製するのに利用すること を可能にする方法はなかった。これらの方法を用いることによって、制御された 量のアルファサテライトDNAをインビトロで生産し得る。本明細書に記載される ように、リガーゼの量、インキュベーション時間、およびDNAの濃度を経験的に 制御することによって、最終産物の長さを必要に応じて変化させ得る。 しかし、本発明はアルファサテライトDNAに由来するセントロメアDNAに限定さ れない。本発明によって作製されるこのインビトロ法は、本明細書に記載される ような機能を任意のセントロメアDNAに適用し得、特に反復性DNAに適用し得る。 さらに、全アルファサテライト反復は、セントロメア形成に必要ではない。従 って、セントロメアDNAはまた、アルファサテライト誘導体およびアナログ、例 えば、アルファサテライトまたは関連サテライトDNAにおけるサブモノマー領域 を含み得る。 タンパク質結合部位を表すアルフォイドモノマー内のサブ領域を共に連結して 、より小さい反復単位よりなる機能的なセントロメアを生成し得る。この実施態 様の機能はマウス-ヒトハイブリッドからのデータによって示される。 ネズミ種M．musculusにおいて、マイナーサテライトDNAはCENP-Bボックスを含 有し、そしてアルファサテライトDNAの機能的等価物であるようである。興味深 いことには、M．musculusにおいて、マイナーサテライト反復単位は120bpに過ぎ ず、CENP-Eボックスの外側のアルファサテライトDNAに相同な見掛けの配列を有 しない。反復サイズおよび配列の相違にもかかわらず、ヒト染色体はマウス／ヒ トハイブリッドで効果的に分離される。これは、セントロメア反復単位のサイズ および配列がセントロメア機能を破壊することなく変化し得ることを示す。 ネズミ種M．caroliは、マイナーサテライトDNAを欠陥するようである（Kiplin gら，Mol．Cell．Biol．15:5009-4020(1995)）。この種において、機能的アルフ ァサテライト等価物は、CENP-Eボックスを含有する79bpサテライト配列であるよ うである（79bp配列に対して97％相同であるが、CENP-Eボックスを欠く60bp配列 がまた存在する）。M．musculusとM．caroliとの間の交差において、両種由来の 染色体は同一細胞内で通常は分離する。これは、マイナーサテライトおよび79bp サテライト配列の両方が、有糸分裂の間に同一の紡錘体によって認識されるこ とを示す。従って、異なるセントロメア反復サイズは機能的であり得る。 アルファサテライト、マイナーサテライト、および79bpサテライト反復は異な るサイズであり、かつ機能的であるので、絶対的な反復サイズそれ自体はセント ロメアDNAの機能の決定要素ではない。さらに、これらのセントロメア反復の間 には限定された配列相同性しかないので、タンパク質結合性部位を表す反復内の サブ領域は重要な機能的成分であるようである。 従って、本発明の1つの実施態様において、セントロメアDNAはアルファサテラ イトDNA内のサブ領域を含有する。好ましい実施態様において、セントロメアDNA は、配列5’aTTCGttggAaaCGGGa 3’（配列番号1）によって規定された、タンデ ムに連結されたCENP-Bボックスよりなる。ここで、大文字／太字で示される塩基 はCENP-B結合で最も重要であり、小文字で示された塩基は他の塩基で置換し得る 。 他の実施態様において、他の種由来のアルフォイド等価物をセントロメアDNA に対して用いる。ヒトおよび他の哺乳動物染色体は、種間体細胞ハイブリッドに よって示されるように、他の種由来の細胞において効率的に分離することが示さ れている。これらのハイブリッドの例は、マウスxヒト、ハムスターxヒト、ラッ トxヒト、ハムスターxマウス、ラットxマウス、およびニワトリxヒトを含む。ニ ワトリ細胞において分離するヒト染色体の能力(Dieken，E.ら，Nature Genet．1 2:174-182(1996))は、ヒトセントロメアDNAがまた非哺乳動物種（例えば、鳥類 ）で機能することを示す。 交雑種ハイブリッドからの観察に基づいて、1つの種由来の染色体は他の種に おいて機能することが明らかである。従って、アルファサテライトDNAの代わり に、またはそれと組み合わせて、他の哺乳動物（および鳥類）由来のセントロメ ア反復を用いて、合成染色体をヒト細胞中で生産し得る。逆に、アルファサテラ イトDNAを、他の哺乳動物（鳥類）種におけるセントロメアDNAの供給源として使 用し得る。 従って、本発明のさらなる実施態様において、ゲノム（テロメア）DNAは、M.m usculusのマイナーサテライトDNA、Mus caroliの79bpサテライトDNA、または他 の哺乳動物由来の類似の配列と共に細胞にトランスフェクトされる。別の実施熊 様において、テロメアDNAおよびゲノムDNAを、鳥類細胞由来のセントロメアDNA と共に細胞にトランスフェクトする。 本質的には、有糸分裂の間にCENP-Eと会合するセントロメアDNAは、宿主細胞 に対する異種のセントロメア配列の使用および他の合成染色体成分の使用を含む 本発明のこの局面において具体化される。染色体におけるセントロメア配列が有 糸分裂の間にCENP-Eと会合する限りは、ゲノム配列およびテロメア配列とは無関 係に、そしてそのため特異的セントロメア配列とは無関係に、哺乳動物細胞に対 して機能的な染色体が得られることが予測される。 テロメアDNAは、テロメア機能を保持する任意のDNA配列（任意の所望の種由来 の）に由来し得る。哺乳動物および他の脊椎動物において、染色体末端において 最も豊富でかつ保存された配列はTTAGGGであり、これは2〜20キロベースの長さ の整列を形成する。ヒトテロメアDNAは約5キロベースの反復TTAGGGからなり、こ の配列の小さいストレッチは、哺乳動物細胞への直鎖状分子の導入後のテロメア 形成を促すのに十分である(Juxley，C．Gene Ther．1:7-12(1994))。単純な(TTA GGG)_n整列は、人工染色体によって必要とされるテロメア機能を提供するのに十 分である。従って、このテロメアDNAはヘキサマーTTAGGGのタンデムな整列を含 む。テロメアDNAは、直鎖状染色体の形成が望まれる場合に含まれる。 テロメア、セントロメアおよび複製起点は、Huxley，C.ら，Biotechnol．12:5 86-590(1994)に議論されている。 本発明はまた、本明細書に記載するように、セントロメア、ゲノム、および必 要に応じてテロメアDNAを実質的に含む精製DNA分子を指向する。 1つの実施態様において、精製DNAは裸のDNAである。 別の実施態様において、精製された裸のDNAはDNAを凝縮する1以上の薬剤で凝 縮される。トランスフェクションに前に精製DNAを縮合させて、剪断に対して安 定化させることが有利であり得る。トランスフェクションに前に精製セントロメ ア（テロメア）およびゲノムDNAを凝縮させることによって、トランスフェクシ ョンの間の操作からの構造的損傷に対してより耐性とさせ得る。従って、本発明 の1の実施熊様において、精製セントロメア（テロメア）およびゲノムDNAを、ト ランスフェクションに前に1以上のDNA凝縮剤で凝縮させる。この点において、ポ リカチオンは高分子量DNAを物理的に凝縮させ、そしてそれを機械的剪断から保 護することが示されている(Kovaicら，Nucleic Acids Res.，23:39999-4000(199 5)；WidomおよびBaldwin，J．Mol．Biol．144:431-453(1980); WidomおよびBald win，Biopolymers 22:1595-1620(1983))。従って、さらなる実施態様において、 精製DNAをポリカチオン化合物で凝縮させる。ポリカチオン化合物の例は、ポリ リジン、ポリアルギニン、スペルミジン、スペルミン、およびヘキサアミンコバ ルトナトリウムを含む。 別の実施態様において、本発明は、タンパク質でDNAをプレコートすることを 含む。ヒストン、非ヒストン染色体タンパク質、テロメア結合タンパク質、およ び／またはセントロメア結合タンパク質のようなDNA結合タンパク質でDNAをプレ コートするのが有利であり得る。このプレコートはいくつかの望ましい結果を有 すると期待される。第１に、高分子量DNAを剪断から保護するであろうDNAの凝縮 が生じる。第２に、DNAに結合することからヌクレアーゼを阻止することによっ て、トランスフェクトされたDNAのヌクレアーゼ分解を阻害する。第３に、上記 に列挙された各タンパク質が核局所化シグナルを含有するので、プレコートされ たDNAはトランスフェクションに続いてより効果的にDNAに侵入し得る。トランス フェクションに前にセントロメア（テロメア）DNAおよびゲノムDNAをDNA結合タ ンパク質でプレコートすることによって、本発明者らはトランスフェクションお よび合成染色体形成の効力が増大すると期待する。 従って、本発明の別の実施態様において、精製セントロメア（テロメア）DNA およびゲノムDNAはトランスフェクションに前にDNA結合タンパク質でコートされ る。DNA結合タンパク質の例はヒストン、非ヒストン染色体タンパク質、転写因 子、セントロメア結合タンパク質、およびテロメア結合タンパク質を含む。 DNA結合タンパク質をまたDNAに対するそれらの親和性によって同定し、そして 精製し得る。例えば、DNA結合はフィルターハイブリダイゼーション実験で明ら かとなる。ここで、タンパク質（通常は、検出を容易とするために標識される） をフィルターに固定化したDNAに結合させるか、またはその逆も同様に、DNA結合 部位（通常は標識される）を、固定されたタンパク質上のフィルターに結合させ る。このような結合の配列特異性および親和性は、DNA保護アッセイおよびゲル 遅延アッセイで明らかとされる。このようなタンパク質の精製は、配列特異的DN Aアフィニティークロマトグラフィー技術（例えば、このドメインが結合するDNA で誘導体化した樹脂を有するカラムクロマトグラフィー）を利用して行い得る。 DNA結合タンパク質のタンパク分解を用いて、DNA結合能力を保有するドメインを 明らかにし得る。 従って、本発明は、哺乳動物細胞を本明細書中に記載される精製DNAでトラン スフェクトするプロセス、およびこの細胞がインビボで完全にDNAを再構築する ことを許容するプロセスによって生産された人工哺乳動物染色体を指向する。 従って、本発明は、哺乳動物細胞を精製された裸のDNAでトランスフェクトす るプロセスによって生産された人工哺乳動物染色体に指向され、本明細書中に記 載されるように、このDNAは実質的にセントロメアDNA（テロメアDNA）およびゲ ノムDNAを含む。 従って、本発明はまた、哺乳動物細胞を精製された凝縮DNAでトランスフェク トするプロセスによって生産された人工染色体に関し、本明細書中に記載される ように、このDNAは実質的にセントロメアDNA（テロメアDNA）およびゲノムDNAを 含む。 従って、本発明はまた、精製されたコートDNAを哺乳動物細胞に導入するプロ セスによって生産された人工哺乳動物染色体に関し、本明細書中に記載されるよ うに、このDNAは実質的にセントロメア（テロメアDNA）およびゲノムDNAを含む 。 本発明はまた、本明細書中に記載されるように、インビトロで精製ゲノムDNA （テロメアDNA）を組み合わせるプロセスによって作製された精製DNAに関する。 本発明はまた、本明細書中に記載されるように、インビトロでた精製セントロ メアDNA（テロメアDNA）とゲノムDNAを組み合わせるプロセスによって作製され た、精製された凝縮DNAに関する。あるいは、個々のDNA成分を予め凝縮し、そし て次いで、組み合わせ得る。 本発明はまた、本明細書中に記載されるように、インビトロで単離精製された セントロメアDNA（テロメアDNA）とゲノムDNAを組み合わせるプロセス、およびD NA結合タンパク質を添加するプロセスによって作製された、精製されたコートDN Aに関する。あるいは、個々のDNA成分をプレコートし、そして次いで、組み合わ せ得る。 上述の精製DNAは、非連結セントロメア（テロメア）DNAおよびゲノムDNAより なるものであり得る。あるいは、上述の精製DNAはまた、1以上のこれらのDNAが 互いに連結されたセントロメア（テロメア）DNAおよびゲノムDNAよりなるもので あり得る。 本発明はまた、上述の精製DNAを含む組成物に関する。この組成物は、DNAの細 胞への侵入を容易にする成分を含み得る。人工染色体の形成のために、この組成 物はDNAの哺乳動物細胞への取り込みを容易にし得る。あるいは、この組成物はD NAを含有するベクターの増殖のために使用される細胞へのDNAの取り込みを容易 にする成分を含み得る。 本発明はまた、上述のDNAを含有するベクターに関する。このベクターはDNAを 増殖するために、すなわち、哺乳動物細胞へそれらを導入するに前に上述の配列 を増幅し、そして人工染色体を形成するために使用し得る。 従って、本発明はまた、上述のDNAを含有するベクターを含む組成物をに関し 得る。 本発明はまた、上述のベクターを含有する細胞に関する。 本発明はまた、人工染色体を含有する哺乳動物細胞に関する。 本発明はまた、上述の精製DNAを含有する哺乳動物細胞に関する。 任意の哺乳動物細胞が本発明により包含されるが、本発明の好ましい実施態様 において、この哺乳動物細胞はヒト細胞である。 本発明の好ましい実施態様において、セントロメアDNAはヒトアルファサテラ イトDNAである。しかし、アルファサテライトDNAは任意の霊長類に由来するもの であり得ることが理解される。さらに、本発明は、非霊長類哺乳類由来のセント ロメアDNAを含み、ここで、このセントロメアDNAは有糸分裂の間にCENP-Eと会合 する。それが由来する生物とは無関係に、有糸分裂の間にCENP-Eと会合する任意 のセントロメアDNA、および特に反復性DNAは、本発明の人工哺乳動物染色体のた めの機能的なセントロメア配列を提供することが期待される。従って、ヒト細胞 で機能する人工哺乳動物染色体は、例えば、非ヒト哺乳動物からではなくヒト由 来の、および鳥類のような非哺乳動物種からのセントロメア配列さえも含有し得 る。CENP-Eと会合する任意の反復性DNAも潜在的に有用である。従って、本明細 書中に教示された方法に従って、任意のセントロメア配列を、哺乳動物人工染色 体の成分としての機能について試験し得る。 本発明の特定の開示された実施態様において、セントロメアDNAはアルファサ テライト整列の大きなストレッチ、反復テロメア配列(TTAGGG)_nよりなるセグメ ント、および制限酵素NotIでの消化により産生されたランダムなゲノムフラグメ ントを含む。好ましい実施態様において、この制限酵素消化は、ヒトゲノムDNA のNotI消化によって生じたフラグメントの範囲の切片のDNA、好ましくは10kb〜3 mbの範囲の切片のDNAを消化する。これは、BamHI、BglI、SalI、XhoI、NotI、Sf iI、PmeIおよびAscIを含むが、これらに限定されない。 精製DNAを哺乳動物細胞に導入する場合、このDNAは機能的な合成または人工染 色体を形成する。この染色体は天然に存在する哺乳動物染色体の特徴を有する。 この染色体は低コピー数、通常細胞当たり1コピーで細胞に存在する。染色体は 直鎖状であって、テロメア配列を含有する。CENP-Eは、有糸分裂の間に人工染色 体と会合し、機能的なセントロメアの形成を示す。この染色体は選択の非存在下 で有糸分裂的に安定である。染色体は検出不可能な取り込み頻度で、経時的に、 構造的に安定である。染色体は1以上の転写的に活性な遺伝子を含有する。従っ て、これらの染色体は天然に存在する染色体に由来せず、インビトロで単離精製 されたDNA配列から出発して構築される。 従って、本発明はまた、人工哺乳動物染色体を作製するための方法に関し、こ の方法は上述の哺乳動物細胞に精製DNAを導入することを含む。 このDNAを、当業者に公知の任意の多くの方法によって哺乳動物細胞に導入し 得る。これらは、限定されるものではないが、エレクトロポレーション、リン酸 カルシウム沈殿、リポフェクション、DEAEデキストラン、リポソーム、レポータ ー媒介エンドサイトーシス、および粒子送達を含む。染色体またはDNAをまた用 いて、卵、胚またはエクスビボもしくはインビトロ細胞にマイクロインジェクシ ョンし得る。当業者に公知の適切な導入技術を用いて、細胞を、染色体または本 明細書中に記載されたDNAでトランスフェクトし得る。本発明の好ましい実施態 様において、精製DNAの哺乳動物細胞への導入はリポフェクションによる。 従って、精製DNAは、哺乳動物細胞をトランスフェクトするのに有用であり、 このトランスフェクションの結果、トランスフェクトされたDNA由来の細胞中で 人工染色体が形成される。 このDNAは、非哺乳動物細胞において別々に増殖し得るか、または1以上の成分 を共に連結し得る。従って、本発明はまた、増殖のためのベクターに連結された 精製DNAを指向する。このようなベクターは当業者に周知であり、pBac108L、P1 、pACYC184、pUC19、pBR322、YACおよびコスミドを含むが、これらに限定されな い。 本発明はまた、人工または合成染色体を含有する哺乳動物細胞に関する。本発 明は任意の哺乳動物染色体または哺乳動物細胞に関する。全ての哺乳動物が含ま れるが、好ましい実施態様はヒトである。従って、本発明の好ましい実施態様は 、合成ヒト染色体を含有するヒト細胞を含む。 DNAおよび染色体は、特に、遺伝子治療および他の目的のための発現ベクター で使用するために開発された。従って、本発明の好ましい実施態様において、精 製DNAは、実質的に、例えば、治療薬剤として、所望の遺伝子産物の発現に有用 な1以上のDNA配列よりなる。従って、このDNAを人工染色体に含ませることによ って、発現可能なDNAを細胞に導入する方法を指向する。DNAは調節し得、構造的 であり得、遺伝子産物などとして発現され得る。好ましい実施態様において、DN Aは遺伝子産物を提供する。哺乳動物細胞にトランスフェクトする場合、トラン スフェクションに後に形成される人工染色体は、これらのDNA配列を保有し、そ してそれを発現する。 組換えDNA技術は、所望の生物学的物質の生産のために、過去20年間にわたっ て次第に増加して使用されてきた。種々の医学的に重要なヒト遺伝子産物をコー ドするDNA配列がクローニングされている。これらは、インスリン、プラスミノ ーゲンアクチベーター、α1抗トリプシン、および凝固因子を含む。しかし、本 発明は、任意のおよび全ての所望の医学的および／または生物学的に重要な遺伝 子産物の発現を含む。 一旦細胞に入ると、異種遺伝子産物は機能的遺伝子産物を産生するレベルにて 選択の組織で発現される。一般的なコンセンサスは、ほとんどのトランスフェク トされた遺伝子の正しい組織−特異的発現が達成可能なことである。正しい組織 特異性のためには、細胞への導入および人工染色体の形成前に、目的のDNA配列 のクローニングで使用される全てのベクター配列を除去することが重要であり得 る。従って、天然に存在する配列がそれらの天然に存在する配置で存在し、そし て組織特異性が確保されるように、制御された様式で目的の異種遺伝子を人工染 色体に導入し得る。 合成染色体をヒト幹細胞または骨髄細胞へ導入し得る。他の適用は当業者に明 らかである。 ベクターを培養中の細胞または動物もしくはヒト患者の組織へ導入するための 種々の方法が開発されている。ベクターを哺乳動物および他の動物細胞へ導入す る方法は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE−デキストラン技術、 マイクロインジェクション、リポソーム媒介技術、カチオン脂質ベース技術、ポ リブレンを用いるトランスフェクション、プロトプラスト融合技術、エレクトロ ポレーション等を含む。これらの技術は当業者に周知であり、そして多くの容易 に利用できる刊行物記載され、そして広く総説されている。いくつかの技術が、 Tramscription and Translation，A Practical Approach，Hames，B.D．& Higgi ns，S.J.編，IRL Press，Ocford(1984)（これはそれらの関連する教示のために 、本明細書中に参考として援用される）に総説されており、Molecular Cloning ，第2版，Maniatisら，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Ha rbor，NY(1989)（これはそれらの関連する教示のために、本明細書中に参考とし て援用される）に総説される。 発明の詳細な説明において、参照を、分子生物学の当業者に公知の種々の方法 論のために作製した。参照を作製するためのこのような公知の方法論を記載する 刊行物および他の資料を、関連する教示のために、本明細書中に参考として援用 する。 組換えDNA技術の一般的原理を記載する標準的な参照は、Maniatis，T.ら，Mol ecular Cloning: A Laboratory Manual，第2版．Cold Spring Harbor Laborator y，Cold Spring Harbor，NY(1989)である。 定義 組換えDNA技術に関する全ての用語は、当該分野で認識される様式において使 用され、そして当業者に明らかである。 用語「Ｙアルファサテライト」および「Ｙα」は、相互交換的に使用され、ヒ トＹ染色体に由来するアルファサテライトDNAをいう。 用語「17アルファサテライト」および「17α」は、相互交換的に使用され、ヒ ト第17染色体に由来するアルファサテライトDNAをいう。 アルファサテライトDNAは、ヒト染色体に存在するタンデムな反復DNAであり、 約170bpの基本的なモノマー反復を含む。この小反復は、ヒト染色体の1以上の群 に対して特異的であることが示されている、高次単位に組織化される。 用語「セントロメア」は、凝縮され、そして減数分裂または有糸分裂の間の紡 錘体の結合部位である、染色体の領域を意味する。減数分裂および有糸分裂の間 に染色体の適切な分離が必要であり、従って、これは人工染色体の必須の成分で ある。セントロメアDNAは、セントロメア形成を指向するかまたは支持し、そし てそれにより、適当な染色体分離を可能とするDNAよりなる。免疫蛍光または免 疫電子顕微鏡によって示されるような、活性で、機能的な、セントロメアにおけ るセントロメアDNAは、有糸分裂の間にCENP-Eと会合する。「会合」とは、セン トロメアDNAおよびCEPN-EがFISHおよび免疫蛍光によって同時に局在化されるこ とを意味する。 「必須染色体機能」は、明細書および上述の発明の背景で議論される。これら は、実験的な選択圧なくしての有糸分裂安定性、実質的に1：1の分離、自動複製 、すなわちセントロメア、テロメア、および複製機能の起点を含む。 用語「機能的等価物」は、異なるDNAまたはタンパク質配列から生じるが、同 一の生物学的機能を提供する遺伝子機能を示す。 用語「遺伝子産物」は、DNA、RNA、タンパク質またはペプチドを示す。 用語「ゲノムDNA」は、1以上のクローニングされたフラグメントまたは制限消 化由来のフラグメントまたは配列および大きさの他の混合物、例えば、機械的に 剪断されたDNA、またはインビトロで合成されたDNAを含む。DNAは、（例えば、 クローニングされたフラグメントを使用した場合、または精製染色体由来のDNA を消化した場合のような）同一染色体、または（例えば、ゲノム制限消化をトラ ンスフェクションのために使用した場合のような）異なる染色体に由来し得る。 用語「ゲノム」は、生物のゲノムで天然で見い出されるDNAをいう。しかし、 本発明者らはまた、このゲノムDNAの機能が他の供給源、例えば、天然で見い出 し得ない配列を有する合成DNA由来のDNAによってもたらされ得ることを認識する 。従って、本明細書中で使用されるように、「ゲノム」DNAはまた、本明細書中 に記載されるセントロメア（テロメア）DNAと共に細胞に導入されるDNAをいうた めに総括的に使用される。このDNAは遺伝子産物を発現するか、または遺伝子産 物の発現を引き起こし、そして精製DNAを細胞中の内因性染色体へ取り込むこと なく、細胞における精製DNAからの染色体形成を可能とする。従って、このDNAは 、必要な発現可能配列および上述の機能を含む限り、合成または任意の生物に由 来するものであり得る。 従って、セントロメアDNAに加えて、本発明に含まれる人工染色体は、遺伝子 産物を発現し、または遺伝子産物の発現を引き起こし、細胞中の内因性染色体へ の精製DNAの取り込みなくして精製DNAからの染色体の形成を可能とするDNA配列 を実質的に含有する。染色体機能（例えば、非取り込み）を提供するように機能 し、配列を発現する配列は同一の配列であり得る。従って、発現可能な配列がま た他の機能を提供することは本発明の範囲内のものである。あるいは、染色体機 能および発現機能を提供する配列は異なる発明であり得、そして異なる供給源に 由来し得る。 特別に開示された実施態様において、ゲノムDNAはNotI制限消化に由来する。 従って、好ましい実施態様において、内因性染色体への精製DNAの取り込みなく して精製DNAからの染色体の形成を可能とするDNAは、全ゲノムDNAをNotIの認識 部位（8ヌクレオチド）を有する制限酵素で消化することによって生じた制限フ ラグメントに由来する。しかし、NotIおよび匹敵する酵素によって生じたものよ りも小さい、天然に生じるゲノムDNAの制限フラグメントおよび他のフラグメン トを用いることは、十分に本発明の範囲内である。例えば、本発明者らは、前期 機能を維持している間にDNAの大きさを減少させることを考えている。従って、 高度に好ましい実施態様において、このDNAは、目的の1以上の遺伝子の発現を提 供するために、および内因性染色体への精製DNAの予めの取り込みなくして精製D NAからの染色体の形成を可能とする機能を提供するために必要なDNAのみを含有 するように削減する。 これらのDNAの供給源は同一である必要はない。従って、発現配列は1つの生物 に由来し得、そして染色体機能を提供する配列は他の生物に由来し得る。さらに 、1つのまたは両方の配列をインビトロで合成し得、そして天然に存在する配列 に対応する必要はない。この点において、配列は厳格に「ゲノム性」である必要 はない。配列に関する唯一の制限は、それらが前記の機能を提供することである 。 用語「異種」は、細胞に人工的な哺乳動物染色体が導入される細胞において天 然に存在するゲノムで見いだされないDNA配列を示す。あるいは、もし配列が見 い出されるならば、さらなるコピーは「異種」であると考えられる。なぜならば 、それらは天然に存在するゲノムで形成されるもので見い出されないからである 。前記のように、異種DNAは、同時に所望の発現配列であって、「ゲノムDNA」で あり得る。「発現可能」DNAは、それ自体発現され得ないが、別のDNA配列（異種 または内因性）の発現を行うかまたは引き起こし得る。これは、DNAが例えば調 節性である場合である。 「高次反復」とは、それ自体がより小さい（モノマー）反復単位からなる反復 単位を意味する。アルファサテライト整列の基本的組織単位は、約171bpのアル フォイドモノマーである。モノマーは、染色体特異的な高次の反復単位に組織化 され、これはまた、タンデム反復的である。所与の高次反復における構成モノマ ーの数は、２（例えば、ヒト染色体１において）から30（ヒトＹ染色体）を超え るまで変化する。構成モノマーは、約60％から実質的に配列同一性まで相互に種 々の程度の相同性を呈する。しかしながら、高次反復は、ほとんどの所与のアル フォイド整列を通じて高度の相同性を保有する。 用語「哺乳動物染色体」は、哺乳動物細胞において染色体として機能するDNA 分子またはゲノム単位を意味する。 用語「裸のDNA」は、通常は天然に存在する染色体と会合する生物学的（染色 体または細胞）成分、例えば、ヒストン、非ヒストン染色体タンパク質、RNA、 転写因子、トポイソメラーゼ、スカフォールド（scaffold）タンパク質、セント ロメア結合性タンパク質、およびテロメア結合性タンパク質のいずれとも会合し ないDNAを意味する。このようなDNAは、細胞から単離され、非DNA染色体成分か ら精製され得る。あるいは、このDNAはインビトロで合成することができる。 「天然に存在する」なる用語は、天然で存在し、実験的に誘導されない事象を 示す。 複製起点は、DNA合成の開始の部位を示す。 用語「単離された」は、細胞から取り出されたDNAをいう。用語「精製された 」は、細胞の非DNA成分から実質的に完全に分離された単離DNA、またはインビト ロで合成され、そしてDNAからの染色体の構築を干渉する、合成に使用される物 質から実質的に完全に分離されたDNAをいう。精製DNAはまた、天然で会合するDN A配列から単離されたDNA配列であり得る。 レプリコンは、DNAが複製され、そして定義により複製起点を含有するゲノム のセグメントである。 語句「天然の哺乳動物染色体の全ての機能を保有する」は、染色体が、実験的 な選択圧の非存在下で、組み込まれない構築体として哺乳動物細胞の分裂におい て安定に維持されることを意味し、少なくともセントロメア、テロメア（直鎖状 染色体について）の、複製機能の起点、および遺伝子発現を示す。 用語「有糸分裂的に安定」は、合成または人工の染色体が、（薬剤選択等のよ うな）実験的選択圧の非存在下における10世代後の細胞の少なくとも50％におい て存在すること、最も好ましくは、30世代の後、それが細胞の少なくとも10％に おいて存在すること；好ましくは、合成染色体が時間の99％を超えて1：1分離を 呈することを示す。 「安定に形質転換された」とは、反復単位を含有するクローニングされたDNA 整列が、（174kb整列で）世代当たり0.6％未満の組換え頻度、および（130kbで ）0.2％未満の組換え頻度で、少なくとも50世代の増殖の間、微生物宿主細胞で 増殖され得ることを意味する。130kbより小さい整列は、本発明の方法によって クローニングした場合に組換えをほとんどまたは全く呈しない。 用語、「合成」または「人工」を、交換的に使用する。「合成」または「人工 染色体」は、必須の染色体機能を有する構築物であるが、天然に存在しない。そ れは、精製DNAを細胞に導入することによって作製される。染色体は全体的にト ランスフェクトされたDNAよりなるので、合成または人工といわれる。人工また は合成の染色体は、天然に存在しない立体配置であることが判明した。 用語「トランスフェクトする」は、核酸の細胞への導入を示す。このように導 入された核酸は、導入された配列、物理的立体配置、またはコピー数において、 細胞内で、天然ではない。 テロメアは、テロメラーゼと呼ばれるリボ核タンパク質酵素によって合成され る単純な反復DNAを含む染色体の末端を示す。その機能は、直鎖状DNA分子の末端 を複製することである。 分子がポリペプチドをコードする配列、および適切な宿主環境にて、タンパク 質産物においてDNAに含有される遺伝情報を転写、プロセシングおよび翻訳する 能力を提供する発現制御配列を含有する場合、およびこのような発現の制御配列 がポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結される場合、DN Aまたは遺伝子のような核酸分子はポリペプチドまたは遺伝子産物を発現する。 しかしながら、本明細書に記載するように、遺伝子産物は、ポリペプチド遺伝子 産物に限定される必要はなく、RNAを含み得る。さらに、発現ベクターとして使 用した場合に人工的な哺乳動物染色体によって修正され得る遺伝子欠陥は、遺伝 子発現をさらに行うようにシスにて働く欠陥であり得る。 作動可能な連結は、調節DNA配列および発現されることを望むDNA配列が遺伝子 発現を可能にするような方法で結合される連結である。遺伝子発現に必要な調節 領域の正確な性質は生物間で変化するが、一般には、プロモーター領域、TATAボ ックス、CAP配列、CAAT配列等のような転写および翻訳の開始に関与する5'非コ ード配列を含む。所望ならば、タンパク質をコードする遺伝子配列の3'側の非コ ード領域は前記の方法によって得ることができる。この領域は、停止およびポリ アデニル化のようなその転写停止調節領域のために保持され得る。従って、天然 では、タンパク質をコードするDNA配列に隣接する3'領域を保持することによっ て、転写停止シグナルを提供し得る。転写停止シグナルが発現宿主細胞で満足ゆ くように機能しない場合、宿主細胞における3'領域は置換され得る。 以下の実施例は、本発明を記載する実施態様に限定するものではなく、発明が 実施され得る特定の方法を具体的に記載するために提示する。 実施例 実施例１ 第17染色体アルファサテライトベクターの構築 BACベクターを用いて、E.coliにおけるアルファサテライトDNAをクローニング し増殖させるために、種々のサイズの一連のタンデムアルファサテライト整列を 構築した。 ヒト第17染色体からの高次のアルファサテライト反復の構造は従来に記載され ている（WayeおよびWillard，Mol．Cell．Biol．6(9):3156-3165(1986)。ヒト第 17染色体の支配的な高次反復は、長さが2.7kbであり、EcoRI部位に隣接した16の アルフォイドモノマーからなる。ヒト第17染色体またはヒトＹ染色体に由来する アルファ・サテライトDNAの区別される構造単位、高次反復を、ヒトゲノムDNAを 制限酵素EcoRIで消化することによってプラスミドクローニングベクターpACYC18 4（New England Biolabs）にクローニングした。クローニングされた高次反復の ヌクレオチド配列をDNA配列分析によって確認した。 ポリメラーゼ鎖反応（PCR）を用いて、相補的な制限部位（BamHIおよびBglII ）が高次レジスターの反対の末端で作製されるように、単一の2.7kb高次反復モ ノマーを増幅した。高次反復の正確な長さは維持された。このフラグメントを増 幅するのに使用したプライマー対は VB100-5’...gggcgggagatctcagaaaattctttgggatgattgagttg（配列番号２）、 および VB101-5’...gggcgggatcccttctgtcttctttttataggaagttattt（配列番号３）で あった。 増幅フラグメントをBamHIで消化し、挿入DNAをゲル精製し、そして予めBamHI およびHpaIで消化しゲル精製したベクターDNAに連結することによって、改変さ れた高次反復をBACベクターpBAC108L（Bruce Birren，California Institute of Technology，Pasadena，CAからの贈物）にクローニングした。得られたプラス ミドをpBAC-17αlとした。 アルファサテライトDNAの合成ダイマーを構築するために、pBAC-17αlのアリ コートを、別々に、（1）BamHI＋SfiIまたは（2）BglII＋SfiIのいずれかで消化 した。ゲル電気泳動後、BglII/SfiI消化物由来の2.7kbアルファサテライトバン ドを切り出し、切り出したpBAC-17αl BamHI/SfiIフラグメントに連結した。Bgl IIおよびBamHIは適合性の突出を生じるので、SfiIは非対称突出を生じ、これは 特定の向きで、2.7kbフラグメントをベクターDNAに連結し得るのみで、頭−尾様 式で配置したタンデムダイマーを生じる。連結産物を、エレクトロポレーション によって細菌株DH10Bに形質転換した。制限分析によってクローンを分析し、第1 7染色体アルファサテライトのタンデム配置の改変ダイマーを含有するものをpBA C-17α2と命名した（図１）。このストラテジーを繰り返し、４、８、16、32、4 8または64の高次のアルファサテライト反復からなる延長されたアルファサテラ イト整列を作製した。同様の戦略を利用して、Ｙ染色体のような他のヒト染色体 からの高次反復の合成整列を構築した。 174kbのアルファサテライトDNAを含有するBACベクターの構築は、現在までにE .coliでクローニングされ、増殖されるDNAのこのクラスの最大量を表す。従来の 実験は、コスミドを用い、E.coliで約40kbを成功裏にクローニングしている(Wil lardら，Prog．Clin．Biol．Res．318:9-18(1989))。他のものは、中程度のコピ ー数のプラスミドを用いて、約171bpアルフォイドモノマーから40kbのサイズ範 囲の整列をクローニングした(WayeおよびWillard，Nucleic Acids Res．15(18): 7549-69(1987))。当該分野で報告されている研究において、E.coliにおける増殖 の間の高頻度の組換えが、最大のアルフォイド整列を含有するプラスミドで観察 された。対照的に、pBAC-17α64の増殖の間に、プラスミド精製の標準的な方法 を利用して、組換え産物が観察された証拠はほとんどない。微生物におけるアル ファサテライトDNAの構造的な不安定性がこれらのクローニングベクターの環境 で示されているので、pBAC-17α64の増殖を、ゲル電気泳動を利用して、明らか に再配置された整列の存在について分析した。このアッセイによって、再配置プ ラスミドの有意なレベルの存在は検出できなかった。 実施例２ E.coliにおけるクローニングされた反復性DNAの安定性のアッセイ E.coliでの増殖に続いて、実施例１からの合成アルファサテライト整列におけ る高レベルの組換えおよび／または欠失が観察された証拠はないが、比較的高レ ベルで組換えが起こる可能性があった。しかし、多数の異なる欠失産物は、いず れか１つの産物の検出を妨げた。従って、高感度アッセイを利用するこれらの構 築物の組換え率を決定した。さらに、より大きな整列は、より小さいものよりも 安定が低いと予測されるので、いくつかの異なるサイズの構築物を調べた。これ らの構築物の安定性を以下で調べた。 安定性アッセイを、pBAC108Lにクローニングされている３つの異なるアルファ サテライト整列サイズを用いて行った。これらの構築物、pBAC-17α32、pBAC-17 α48、およびpBAC-17α64は、各々、アルファサテライトDNAの87kb、130kbおよ び174kbを含有する。E.coli株DH10B（GIBCO BRL）への形質転換（エレクトロポ レーション）に続き、単一クローンを拾い、分析した。組換えプロセス自体はDN A再配置に導き得る可能性があるので、制限消化および電気泳動により判断され るように、全長の構築物を圧倒的に含有する唯一のクローンをグリセロールスト ックとして保存した。 安定性アッセイを開始するために、各構築物のグリセロールストックからのE. coli細胞を、12.5μg/mlクロラムフェニコールを含有するLBプレートに画線培養 した。得られたコロニーの８個を拾い、12.5μg/mlクロラムフェニコールを含有 する５mlのLBに飽和するまで個々に増殖させた（約20世代）。次いで、各クロー ンからのプラスミドDNAを精製し、BamHIで消化し、パルスフィールドゲル電気泳 動によって分離した。いずれかの全長プラスミドを含有するクローンは、単一細 胞の段階で全長プラスミドを有すると言われた。いずれかの検出可能な全長プラ スミドを含有しないクローンは、再画線培養に先立って組換え事象の結果である と言われ（すなわち、グリセロールストックの生成の間に起こった再配置）、そ してこれを排除した。いくつかの全長プラスミドを含有するクローンのうち、10 個の培養物をランダムに拾い、12.5μg/mlクロラムフェニコールを含有する新鮮 LBに1/100万に希釈し、飽和するまで増殖させた（約30世代）。単一細胞からこ の最終飽和培養物まで、約50世代の増殖が起こった。 これらの50世代の間に再配置したプラスミドのパーセントを測定するために、 各飽和培養物を、12.5μg/mlクロラムフェニコールを含有するLBプレートに画線 培養した。次いで、個々のコロニーを、12.5μg/mlクロラムフェニコールを含有 する1.5ml LB中で飽和するまで増殖させた。増殖後、DNAを精製し、そして制限 消化（BamHI）およびPFGEによって分析した。検出可能な全長プラスミドを含有 する任意のクローンを、50世代の実験の間に再配置しないとスコア取りした。逆 に、いずれかの検出可能全長プラスミドを含有しない任意のクローンを、50世代 の実験の間に再配置したとスコア取りした。各構築物について世代当たりの平均 再配置頻度を計算するために、再配置クローンの分率を50世代後に決定した。１ からこの値を引いたものは、（50世代後の）非再配置クローンの分率に等しい。 １世代後に再配置したクローンの分率は、１から50世代後の非再配置クローンの 分率の50乗根を引いたものである。これは以下の式で要約される： Ｘ＝1−（1−Ｙ）^1/50 ［Ｘは世代当たりの再配置するクローンの分率であって、Ｙは50世代の増殖後の 再配置クローンの分率である］。 このストラテジーを用い、３つのアルファサテライト含有構築物の組換え頻度 を決定した。50世代の増殖の後、pBAC-17α32クローンの０％が切形形態に組み 換えられた。組換物を、各々、8.5％（ｎ＝59）および25％（ｎ＝84）のレベル でpBAC-17α48およびpBAC-17α64について検出した。これは、pBAC-17α48につ いて0.18％、pBAC-17α64について0.57％の世代当たりの組換え頻度に相当した 。従って、この組換え頻度は、はるかに低いアルフォイドDNA（例えば、40kb） を含有し、そしてより少数の世代（例えば、30世代）の間、増殖させた他のクロ ーニングベクターについて報告されたものよりも有意に低かった。 結果は、サイズが少なくとも174kbまでのアルファサテライト整列が、本発明 の方法においてBACベクターを用いて、E.coliにおいて安定に増殖され得ること を示す。174kbおよび130kbの整列は、各々、世代当たり0.57％および0.18％の頻 度で組換えられた。従って、例としてpBAC-17α64を用いて、単一細胞からの50 世代の増殖後に、約1,000力価の飽和細菌培養物を単一細胞から生成させること ができ、そして平均して、少なくとも75％の細胞は、全長pBAC-17α64を含有す る。この程度の再配置は、遺伝子治療で用いるアルファサテライト含有ヒト人工 染色体の大規模な生産のための予測される許容範囲内にある。 pBAC108LにおけるアルファサテライトDNA再配置の頻度を測定するに加えて、 このベクターにおける、高度に反復性のアルファサテライト整列のサイズとその 安定性との間の相関が確立された。前記決定の組換え頻度に基づき、BACベクタ ーにおける同種アルファサテライトDNAの最小上方サイズ限界の見積もり（50世 代後に50％の全長クローンは許容されると仮定する）は、200および215kbの間で あると控えめに見積もられた（図２）。これは、コンピュータープログラムCrik et Graphを用いて外挿によって決定した。データにフィットし、そして前記の見 積もりよりも大きな見積もりを生じる他の系が見出されるので、これはアルフォ イド能力の最小見積もりである。この相関から、200〜215kb整列および細菌株DB 10Bにおける増殖を用いる場合、50％を超えるプラスミドが50世代後に全長であ ると見積もられる。この上方サイズの数字は、特殊化された組換え欠損細菌株と 組み合わせて、BACベクターを利用することによって延長され得る。さらに、こ の見積もりは、最大に同種の整列に基づく。特定の天然アルファサテライト整列 を含む種々の整列の安定性は、この見積もりを超えるはずである。 本明細書に記載する実験は、E.coliにおける50kbよりも大きいアルファサテラ イト整列の最初の安定なクローニングおよび増殖を表す。従来には、アルファサ テライトDNAは、コスミドを用いて、E.coliでクローニングされている(Haafら， Cell 70(4):681-96(1992))。これらの整列の比較的小さいサイズ（40kbと同等か またはそれ未満）に加えて、これらの整列の一体性および安定性は分析されなか った。アルファサテライトDNAはまた、YACを用いてクローニングされている(Nei lら，Nucleic Acids Res．18(6):1421-8(1990))。これらの研究において、アル ファサテライト整列の不安定性が注目されており、そしてアガロースゲル精製の ようなさらなる操作が、全長整列を主に含有する調製物を得るのに必要であった 。さらに、アルファサテライトDNAを増殖させるためにYACを用いるある種の不利 がある。恐らくは、これらのうち最も重要なものは、YACのトポロジーに関する 。一般に、YACは直鎖状DNA分子であり、従って、単純なアルカリ溶解精製法を用 いて、汚染酵母の染色体からアルファサテライト構築物を精製することはできな い。その代わり、パルスドフィールドゲル電気泳動、スケールアップできない分 離方法を用いなければならない。最後に、YACの直鎖状トポロジーは、精製 の間、それらを剪断に対して特に感受性にする。ここに、アルファサテライト含 有BACを集め、そして実質的な剪断を伴うことなく、E.coli染色体DNAから精製し 得ることが示された。 従来の研究は、アルファサテライトDNAが機能的なヒトセントロメアの重要な 成分であることを示唆する。天然に存在するアルファサテライト整列は、長さが 230kbから数メガベースのサイズで変化する(OakeyおよびTyler，Genomics 7(3): 325-30(1990))；(WevrickおよびWillard，Proc．Natl．Acad．Sci．USA86(23):9 394-8(1989))。しかしながら、最近の研究は、140kbもの小さいアルファサテラ イトDNAがヒト細胞においてセントロメア機能を付与するのに十分であることを 示唆する(Brownら，Human Molecular Genetics 3(8):1227-1237(1994))。本明細 書に記載するアルファサテライト整列は、機能的ヒトセントロメアのアルファサ テライト要件を満足するのに十分に大きさであるアルファサテライト整列の大規 模で安定な生産を可能とする最初のものである。これらの構築物は合成ヒト染色 体の骨格として作用し得る。 実施例３ Ｙ染色体アルファサテライトベクターの構築 ヒト男性Ｙ染色体細胞株GM07033由来のDNAを用いる以外は、構築は実施例１と 同様であった：正常男性細胞株由来DNAは、いずれも同等である。ヒトＹ染色体 についての支配的な高次アルフォイド反復は、長さが5.7kbであり、隣接するEco RI部位によって区別される。Ｙ染色体アルフォイド整列からの5.7kbの高次反復 を、標準的なE.coliクローニングベクターpACYC184（New England Biolabs）に クローニングした。次いで、PCRを用いて高次反復の末端を改変して、一方の末 端にBamHI部位および他の末端にBglII部位を作製し、存在するEcoRI部位を置き 換えた。改変された高次反復を、前記のようにpBAC108Lクローニングベクターに クローニングした。 実施例４ ハイブリッドアルファサテライトベクターの構築 ヒト第17染色体およびヒトＹ染色体の双方由来のアルフォイドDNAを用いる以 外は、構築は実施例１と同様であった。２つのタイプの整列を構築した。一方の 整列は単純な交互反復であり、ここで、第17染色体のアルフォイドDNAの１つの 高次反復単位は、Ｙ染色体アルフォイドDNAからの１つの高次反復単位と交差し た。構築した第２のタイプの整列は、アルフォイドDNAの第17染色体の高次反復 のダイマー単位とアルフォイドDNAのＹ染色体反復の１つの単位とを交互にした 。それぞれの場合において、前記の例を用いるのと同様に、各染色体に由来する 高次反復の正しい位相性は合成ハイブリッドの接合で保持された。 実施例５ 人工的な哺乳動物染色体の構築 実験手法 DNA構築物の記載 標準的な分子生物学技術を用いて、明細書に記載する全てのプラスミドを構築 した(Sambrook，J.ら編，「Molecular Cloning」，Cold Spring Harbor Laborator y Press(1989))。Ｙ染色体および第17染色体からのアルファサテライト高次反復 のクローニングは従来に記載されている(Wolfe，J.ら，J．Mol．Biol．182:477- 485(1985); Van Bokkelen，G.B.ら，「Method for Stably Cloning Large Repeat ing Units of DNA」、米国特許出願（1995）;Waye & Willard，Mol．Cell．Biol ．6:3156-65(1986))。適切な制限部位の作製を介する方向性クローニングによっ て、順次、より大きなアルファサテライト整列がプラスミドpBAC108Lで作製され ている（反復性配列の大きなタンデム整列のクローニングの教示について、参考 として本明細書中に援用されるVan Bokkelen，G.B.ら，「Method for Stably Clo ning Large Repeating Units of DNA」、1995年6月７日出願の米国特許出願第08 ／487,989号）。 実験で使用したプラスミド pBAC108Lは、従来に記載されている（Shizuya，H.ら，Proc．Natl．Acad．Sci , USA 89:8794-7(1992)）。pVJ105は、ポリリンカー中のさらなる制限部位、な らびにCMV即時型遺伝子プロモーターとSV40ポリアデニル化シグナル(Seed，B., Nature 329:840-2(1987); Seed & Aruffo，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:336 5-9(1987))，β-geoオープンリーディングフレーム(MacGregor，G.R.ら，Develo pment 121:1487-96(1995))、およびUMS転写停止配列(Heard，J.M.ら，Mol．Cell ．Blol．7:2425-34(1987); McGeady，M.L.ら，DNA 5:289-98(1986); Salier & K urachi，Biotechniques 7:30-1(1989))とからなるβ-geo発現単位を含有するpBA C108Lの改変体である。pBACYα16（92kbのＹアルファサテライト）は、pBAC108L 内にヘッドーテイルでクローニングされた16個の同一の高次反復からなる。pBAC 17α32（87kbの17アルファサテライト）は、ヘッドーテイルでpBAC108L内にクロ ーニングされた32個の同一の高次反復からなる。pVJ105-Yα16を、pBAC108Lから のアルファサテライト整列をpVJ105にクローニングすることにより作製した。Ba mHIおよびSfiIでの直鎖状化に続き、β-geo発現の方向はアルファサテライト整 列に向かう。pVJ105-17α32を、pBAC17α32からのアルファサテライト整列をpVJ 105にクローニングすることにより作製した。前記の直鎖状化に続き、β-geo転 写の方向はアルファサテライト整列に向かう。全てのプラスミドをアルカリ溶解 （Sambrook，J.ら編，「Molecular Cloning」，Cold Spring Harbor Laboratory P ress(1989)）によって精製し、その後、アガロースゲル精製した。 多量体化による＞100kbアルファサテライト整列の作製 Ｙアルファサテライト整列を作製するために、pVJ105 Yα16をBamHIおよびSfi Iで消化し、パルスドフィールドゲル電気泳動（PFGE）によってゲル精製した。 ｐBACYα16をBamHIおよびBaglIIで消化し、前記のPFGEにより92kbのアルファサ テライトフラグメントをゲル精製することによって、さらなるアルファサテライ トDNAを調製した。バンドの単離後、アガロースバンドを、10mM Tris（pH7.5） 、100mM NaCl.10mM MgCl₂中で平衡化させ、次いで、65℃で５分間融解した。次 いで、２つのフラグメントを５：１（pBACYα16アルファサテライトフラグメン ト：pVJ105-Yα16フラグメント）のモル比で合わせた。ATP（１mM最終）およびT 4リガーゼ（５単位）を添加し、そして反応を、BamHI（40単位）およびBglII（4 0単位）の存在下で37℃で４時間インキュベートした。βアガラーゼ（３単位） を添加し、 反応物を37℃で１時間インキュベートした。次いで、HT1080細胞へのトランスフ エクションに先立って、反応を１時間氷上に置いた。17アルファサテライトDNA について延長されたアルファサテライト整列を作製するために、前記手法を、pV J105-Yα16およびpBAC17α32に代えて、それぞれ、pVJ105-17α21およびpBAC17 α32とともに用いた。 高分子量ヒトゲノムDNAの調製 HT1080細胞を含有する４つの150mmプレートをコンフルエンスになるまで増殖 させ、トリプシン／EDTAでプレートから取り除き、そして100ml PBSで洗浄した 。高分子量DNAを、低ゲル化温度アガロースプラグ中で集めた(Sambrook，J.ら編 ，「Molecular Cloning」，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))。約１ μgのヒトゲノムDNAをNotIで消化した。消化後、NotIを、反応物を70℃に５分間 加熱することにより不活化した。トランスフェクションに先立って、アガロース プラグを３単位のβ−アガラーゼで消化した。 テロメアDNAの調製 ヒトテロメアDNAを、プライマー42a（5'ＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴ ＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ3'：配列番号４）および42b（5 'ＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡ ＡＣＣＣ3'：配列番号５）（Ijdo，J.W.ら，Nucleic Acids Res．19:4780(1991) ）を用いるPCRにより生成させた。各PCR反応は、1×PCR緩衝液(Gibco BRI)中に 、250ngの42aおよび42b、５単位のTaqポリメラーゼ、250μM dNTP、3.3mM MgCl₂ を含有した。PCR反応を、以下の温度プロフィール：20秒間の95℃、20秒間の40 ℃、２分間の72℃を用い、Perkin Elmer 9600サーマルサイクラーで35サイクル 行った。PCR後、各反応物をアガロースゲル電気泳動に付して、サイズが１kbを 超えるテロメアDNAを精製した。このDNAをゲルから切り出し、製造業者(Promega ，WI)の指示に従ってMagic Prepカラムを用いてアガロースから精製した。 ヒト細胞のトランスフェクション トランスフェクションに先立ち、pVJ105 Yα16およびpVJ105 17α32をBamHIお よびSfiIで消化し；pBac Yα16およびpBac Yα32をBamHIおよびBglIIで消化した 。次いで、PFGEによってDNAを精製し、10mM Tris（pH7.5）、100mM NaClに対し て平衡化し、そしてテロメアDNAおよび／またはNotI消化のヒトゲノムDNAを合わ せた。いくつかの場合、アルファサテライト整列を、図３に記載した方向性連結 アプローチを用いて延長させた。 各トランスフェクションについてのDNA成分を合わせ、穏やかに混合した。ト ランスフェクションは、pVJ105 Yα16（0.5〜1μg）、pVJ105 17α32（0.5〜1μ g）、またはpVJ105 VK75（0.5〜1μg）を含有した。示す場合、トランスフェク ションはまた、精製されたYα16整列（0.5〜1μg）、17α32整列（0.5〜1μg） テロメアDNA（75〜250ng）、ヒトゲノムDNA（1〜3μg）および／またはVK75フラ グメント（0.5〜2μg）を含有した。１mlの無血清α-MEM培地(Media Tech)を添 加した。次いで、7.5μlのリポフェクチンを添加し、溶液を室温で５分間インキ ュベートした。DNA：リポフェクチン混合物を、製造業者(Gibco BRL)の指示に従 って、2×10⁶のHT1080細胞に添加した。16時間の37℃でのインキュベーションの 後、DNA：リポフェクチン溶液を取り出し、そして完全培地を細胞に添加した。 トランスフェクションの36時間後、細胞をトリプシン／EDTAを用いてウェルから 取り出し、300μg/ml G418を補充した完全培地を含有する100mmプレートに移し た。選択の第７日に、培地を、300μl/ml G418を補充した新鮮な完全培地と取り 替えた。選択の12日後、個々のコロニーを滅菌クローニングリングを用いて単離 し、24ウェルプレートに置いた。次いで、各トランスフェクションからの個々の クローンを、選択下で100mmプレートに拡大した。各培養の一部をさらなる分析 のために凍結し、他方、大部分をFISHによる分析のために集めた。 細胞培養 HT1080細胞を、15％ウシ胎児血清(Hyclone)、ペニシリン／ストレプトマイシ ン、およびゲンタマイシンを補充したαMEM培地(Gibco/BRL，Bethesda，MD)中で 増殖させた。本実験で用いたHT1080のサブクローンは、テトラプロイドであった 。 プレート染色 合成染色体を含有する細胞を、10％コンフルエンスで６ウェルプレート中で平 板培養した。トランスフェクトしていないHT1080細胞を、同様に平板培養し、陰 性コントロールとして使用した。細胞が70％コンフルエンスに到達すると、培地 を取り出し、そして細胞を２ml PBSで洗浄した。PBSを除いた後、１mlの固定溶 液（PBS中、２％ホルムアルデヒド、0.2％グルタルアルデヒド）を各ウェルに添 加し、そしてプレートを室温で４分間インキュベートした。固定溶液を除き、細 胞を２ml PBSで直ちに洗浄した。最後に、PBS洗液を除き、１mlの染色溶液（PBS 中、５mMフェリシアン酸カリウム、５mMフェロシアン酸カリウム、５mM MgCl₂、 および１μg/μl X-Gal）を各ウェルに添加し、そしてプレートを12時間37℃で インキュベートした。細胞をPBSで洗浄し、そして光学顕微鏡および組み合わせ た画像化装置(Oncor，Gaithersburg，MD)を用いて画像化した。 蛍光インサイチュハイブリダイゼーション HT1080を100mm組織培養プレートで増殖させ、FISHのために集め、公表された 手法(Verma，R & Babu，A.，Human Chromosomes，Principles and Techniques， 第２版，McGraw-Hill，Inc．(1995))に従い、スライド上に固定した。合成染色 体および内因性染色体上のアルファサテライト配列を検出するために、染色体特 異的アルファサテライトプローブを、製造業者（Oncor，Gaithesburg，MD）の指 示に従って使用した。 合成染色体を含有するクローンにおける合成ＹアルファサテライトDNA内容物 の測定 ゲノムDNAを、公表された手法（Sambrook，J.ら編，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harnor，NY(1989))に従い、HT 1080細胞およびクローン22-6、22-7、22-11、22-13、および23-1から集めた。次 いで、各クローンからの約10μg DNAを、EcoRI（50単位）およびPstI（50単位） を用いて、37℃で一晩消化した。次いで、サンプルを、0.8％アガロースゲ ルを介して電気泳動を行い、Nytran膜に移し、そして25％ホルムアミド／10％デ キストラン／0.5％ SDS／0.5Ｍ NaCl／200μg/mlサケ精子DNA中で、65℃で一晩 、１kb Ｙアルファサテライトプローブにハイブリダイズさせた。EcoRIおよびPs tIは共に、内因性Ｙアルファサテライト高次反復を一回切断して、4kbおよび1.7 kbのバンドを与えた。しかしながら、合成Ｙアルファサテライト整列を生じるた めに使用した方法のため、EcoRIは合成高次反復を切断しない。その結果、合成 整列のEcoRIおよびPstIの消化により、5.7kbバンドが得られる。本発明者らは、 内因性Ｙアルファサテライト整列が１mbの長さであることを知っているので、本 発明者らは、4.0kbバンド（内因性整列）に対する5.7kbバンド（合成整列）の比 を決定することによって、合成染色体を含有する細胞中の合成アルファサテライ トDNAの量を測定し得る。1.7kbバンドは考慮する必要がない。なぜなら、それは 、これらのハイブリダイゼーション条件下でプローブとハイブリダイズしないか らである。しかしながら、これらのクローンのほとんどが、２つのＹ染色体（な ぜならば、それらはテトラプロイドだからである）およびただ１つの合成染色体 を含有することを考慮するのは重要である。これに対する１つの例外は、１つの Ｙ染色体を含有し、そしてジプロイドのようであるクローン22-13である。従っ て、クローン22-6、22-7、および22-11については、細胞当たりの合成アルファ サテライトDNAは、以下の式により評価される： クローン22−13については、以下の式を用いた： 免疫蛍光 抗−CENP免疫蛍光は公表された手法(Sullivan & Schwartz，Hum．Mol．Genet. 4:2189-2197(1995))に従って行った。略言すれば、HT1080細胞をほぼ80％コン フルエンスまで組織培養プレート中で増殖させた。次いで、コルセミドを40ng/m lの最終濃度まで添加し、細胞を37℃で75分インキュベートした。培地を注意深 く取り出し、3〜5分間のトリプシン／EDTAでのインキュベーションによって細胞 をプレートから遊離させた。トリプシンを中和するために、完全な培地を細胞に 添加し、得られた細胞懸濁液を血球計を用いて計数し、Jouan CT422遠心機にて1 000rpmで回転させた。上清を捨て、低張溶液（25mM KCl、 0.27％クエン酸ナト リウム）をゆっくりと添加することによって、細胞を0.6×10⁵細胞／mlで懸濁さ せた。細胞を室温にて12分間、低張溶液中でインキュベートした。次いで、500 μｌを細胞漏斗(cytofunnel)に添加し、Shandon Cytospli 3遠心機中、1900ｒｐ ｍにて10分間回転させた。次いで、スライドを10mMトリスｐＨ7.7、120mM KCl 、20mM NaCl、0.1％トリトンＸ−100中で12分間インキュベートした。希釈した 抗体（50μｌ、1mMトリエタノールアミン、25mM NaCl、0.2mM EDTA、0.5％トリ トンＸ−100、0.1％BSA中1／1000）を各スライドに添加し、プラスチック製カバ ーグラスを細胞の上に置いた。37℃での30分間のインキュベーションの後、カバ ーガラスを外し、KB（10mMトリスｐＨ7.7、150mM NaCl、0.1％BSA）を含有するC oplinジャー中でスライドを3×2分洗浄した。FITC−標識抗ウサギIgを添加し（K B中1／100の50μｌ）、プラスチック製カバーグラスを細胞上に置いた。37℃に おける30分間のインキュベーションの後、スライドをKBを含有するCoplinジャー 中、3×2分洗浄した。観察する前に、スライドをDAPI 10μl(アンティフェィド 中2μg/ml）で逆染色した。蛍光顕微鏡および画像システム(Oncor，Gaithersbur g，MD)を用いて画像を収集した。 有糸分裂安定性経過 クローニングに続き、細胞を2つの100mmプレートに拡大し、300μg/mlG418の 存在下で増殖させた。80％コンフルエンスにおいて、各クローンにつき1つのプ レートを、前記したプロトコルを用いてFISH分析のために収穫した。これらの細 胞は時間経過の0時点として働く。他のプレートを1／16を100mmプレートに分け 、G418を欠く完全培地中でコンフルエンスまで増殖させた。培養がコンフルエン スに到達するや否や、細胞を1／16に分け、G418を欠く完全培地で増殖させた。 こ のプロセスを表2に示したサイクルで繰り返した。種々の時点で、培養物の一部 をFISHのために収穫し、トランスフェクトしたアルファサテライト（17αまたは Ｙα）の存在につき分析した。延ばした各無傷染色体につき、Ｙアルファサテラ イト（または17アルファサテライト）シグナルの数および染色体位置を測定した 。 結果 哺乳動物セントロメアは、アルファサテライトと呼ばれる反復性DNAの大きな ブロックよりなると考えられる完全な染色体エレメントである。哺乳動物セント ロメア構造の解明を阻害し、人工ヒト染色体の開発を防止する主要障害の1つはD NAのこのクラスの大きなセグメントをクローニングできないことであった。最近 、長さがほぼ175kbまでのアルファサテライトDNAのクローニング方法および大規 模生産が開発されている（Van Bokkelen，G.B.ら,表題「Method for Stably Clon ing Large Repeating Units or DNA」、1995年6月7日出願の米国特許出順第08／4 87,989号）。同様に重要なことには、方向性クローニング戦略の使用は、公知の 組成物および構造のある種のアルファサテライト整列を可能にする。 裸のトランスフェクトされたアルファサテライトDNAからの機能性セントロメ アの形成を容易にするために、本発明者らは、サイズが175kbを超えるアルファ サテライトDNAをトランスフェクトするのが有利であろうと仮定した。従来には 、哺乳動物細胞にトランスフェクトすべき最大近接アルファサテライト整列は12 0kbであった(Larin，Z.ら，Hum．Mol．Genet．3:689-95(1994))。175kbより大き いアルファサテライトDNAを生産するには、図3Ａに示す方向性連結ストラテジー を使用した。このインビトロ技術は、隣接する中断されていない長さが736kbま でのＹアルファサテライト整列の生産を可能にする（図3Ｂ、レーン2−4）。対 照として、VK75（75kb Bss HIIフラグメント）をBssHIIの存在下および非存在下 で連結した（図3Ｂ、レーン5−7）。BssHII末端は、連結した場合に、BssHII部 位を生じ、BssHIIが連結反応に含まれる場合、マルチマーのラダーを構成モノマ ーまで消化する。同様の結果が、BamHIフラグメントまたはBglIIフラグメントを 用いて行う実験で得られた（データは示さず）。これは、再切断反応が十分であ り、レーン2および3のラダーが頭一尾連結の結果であることを示す。最後に、ア ルファサテライトDNAの別々のファミリーの間の生物学的差異につきテストする ため、第17染色体に由来するアルファサテライトDNAよりなる延長された整列も 形成された（データは示さず）。 本発明者らは、これらの大きい精製されたアルファサテライト整列を利用して 、図4に概説し、実験手法に記載されたストラテジーを用いて合成染色体を生成 させた。これらの染色体成分の各々を同時トランスフェクトすることによって、 本発明者らは、細胞はこれらの要素を組み合わせて機能的染色体を形成するであ ろうと理由付けた。従って、HT1080細胞を、アルファサテライトDNA、テロメアD NA、およびヒトゲノムDNAの種々の組合せでトランスフェクトした。トランスフ ェクションに続き、培養を10−14日間G418選択下においた。次いで、個々のクロ ーンを単離し、選択下で増殖させ、FISH分析のために収穫した。 安定なトランスフェクタントの特徴 表1に示すように、トランスフェクションの大部分からのクローンにおいて、 アルファサテライトDNAを内因性染色体に取り入れた。テロメアDNAを誘導した多 くのトランスフェクションにおいて、染色体切形と関連したアルファサテライト 取り込み事象の高発生も観察された。テロメアDNAを用いて取り込みに続いてヒ ト染色体を効果的に切形できることが従来に観察されている(Barnett，M.A.ら， Nucleic Acids Res．21:27-36(1993); Brown，K.E.ら，Hum．Mol．Genet．3:122 7-37(1994); Farr，C.J.ら，EMBO J．14:5444-54(1995))。ここに、テロメアDNA は、アルファサテライトDNAと共に内因性染色体に明らかに取り込まれ、切形事 象を引き起こす。 しかしながら、トランスフェクションのサブセットからの細胞において、トラ ンスフェクトされたアルファサテライトDNAを含有する合成染色体が観察された （表2、トランスフェクション22および23および図5−7）。これらの陽性トラン スフェクションは2つの点で他のトランスフェクションと異なった。まず、トラ ンスフェクションに先立って、アルファサテライトDNAを、BamHIおよびBglIIの 存在下でインビトロで予め連結させた（図3Ａおよび3Ｂ）。この結果、長さが10 0kb〜736kbの範囲の大きな方向性アルファサテライト整列が得られた。第2に、N otI消化のヒトゲノムDNAがトランスフェクションに含まれた。これらの2つの成 分を含ませることによって、合成染色体形成に必要な必須DNA配列が提供された 。 トランスフェクション22および23からのクローンのFISH分析は、G418耐性クロ ーンのほぼ50％が合成染色体を含有することを明らかとした（表1）。これらの2 つのトランスフェクションからのクローンを含有する5つの合成染色体のうちの4 つにおいて、トランスフェクトされたアルファサテライトDNAは合成染色体での み検出できた（図4−6）。すなわち、トランスフェクトされたＹアルファサテラ イトDNAの場合には、合成染色体およびＹ染色体のみが、FISHによって検出可能 なシグナルを有した。同様に、トランスフェクトされた17アルファサテライトDN Aの場合には、合成染色体および第17染色体のみがFISHによって検出可能な17α シグナルを有した。興味深いことに、合成染色体はトランスフェクション22およ び23双方において形成した。これは、Ｙ染色体および第17染色体からのアルファ サテライトが、共に、合成染色体の形成を容易にし得ることを示す。アルファサ テライトDNAが合成染色体の重要な成分であるというさらなる証拠として、アル ファサテライトFISHシグナルは各合成染色体のほとんどまたは全部を含む。 合成染色体を含有する細胞において、（トランスフェクションで使用する合成 αサテライトDNAとして同一染色体に由来する）アルファサテライトDNAは合成染 色体およびＹ染色体（または17αサテライトがトランスフェクトされる場合には 第17染色体）以外の染色体で検出されたという２つだけの例外がある。まず、ク ローン17−15において、17アルファサテライトDNAは合成染色体、第17染色体、 およびＣ群染色体の端部で検出された（図7ＡおよびＢ）。興味深いことには、 このトランスフェクションは、未連結アルファサテライトおよびテロメアDNAを 含有したが、ヒトゲノムDNAは含有しなかった。1つの可能性は、内因性染色体に 組み入れられたトランスフェクトされたDNAが増幅され、破壊され戻ったという ことである。もし非アルフォイド、非テロメアヒト配列が染色体機能に必要であ れば、合成染色体形成のこのメカニズムは、トランスフェクションにおいてヒト ゲノムDNAの不存在下でさらなるDNAエレメントを供する必要があることに注意す ることは重要である。同時トランスフェクトされたヒトゲノムDNAの不存在下で 合成染色体が形成される1つの場合において、アルファサテライトが内因性染色 体に取り込まれることもまた判明した。これは、ゲノムDNAが合成染色体形成ま たは維持のいくつかの態様に必要であることを示す。第2に、クローン22−11に おいて、合成染色体およびＹ：14染色体転位が共に観察された（図7ＣおよびＤ ）。パルスフィールドゲル電気泳動によって、本発明者らは、Ｙ：14転位が内因 性ＹアルファサテライトDNAを含有するが、合成ＹアルファサテライトDNAを含有 しないことを示した。かくして、合成アルファサテライトDNAはミクロ染色体で 検出可能にすぎず、いずれの内因性染色体においても検出できない。 合成染色体部位の見積もり 合成染色体を含有する細胞に存在するアルファサテライトDNAの量は約350kb〜 2mbの範囲である（図8）。これは、合成および内因性アルファサテライト整列の 間の制限部位多形を利用することによって測定された。サザンブロット上で合成 アルファサテライトバンドの強度を内因性アルファサテライトバンドに対して比 較することによって、内因性アルファサテライトDNAに対する合成アルファサテ ライトDNAの比率を測定し得る。内因性アルファサテライト整列は長さが1mbであ るので(Larinら，Hum．Mol．Genet．3:689-95(1994))、かつＹ染色体のコピー数 （クローン22−6、22−7、および22−11につき2およびクローン22−13につき1） および合成染色体のコピー数は知れているので（表2）、合成アルファサテライ トDNAのキロベースでの量（図7Ｂ）を見積もることができる。 これらの合成染色体の総じてのサイズを見積もるのは困難であるが、ある場合 には、合成染色体は1000×倍拡大の蛍光顕微鏡を用いてわずかに検出し得る。 合成染色体の構造とコピー数 最初の分析では、合成染色体含有細胞の各クローンは極めてわずかな合成染色 体しか持たず、ほとんどの場合、1細胞あたり1つだけだった。このことは、合成 染色体のコピー数が内因性染色体と同様に調節されていることを示す。 コピー数の他にも、合成染色体はさらに2つの特徴を内因性染色体と共有して いる。第1に、それらはテロメア配列を含有する（データの開示なし）。このこ とは、これらの合成染色体が直鎖状であることを示唆している。第2に、中期染 色体では、個々の染色分体が各合成染色体上にはっきりと見える（図6〜7）。こ のことは、合成染色体の全体構造が、内因性染色体と類似していることを示す。 さらに、染色分体は通常、セントロメアで結合しているので、この結果は、合成 染色体が少なくとも1つのセントロメア機能（姉妹染色分体の結合）を遂行しう ることをも示している。 CENP-Eは中期の合成染色体と結合する 合成染色体（ほとんどの場合、単一コピー）が分裂細胞中に存在することは、 機能的セントロメアの生成を示す。このことをさらに調べるため、いくつかの合 成染色体を調べて、CENP-Eが中期のセントロメアに存在するかどうかを決定した 。CENP-Bが機能的セントロメアと非機能的セントロメアの両方に存在することは 既に示されている（Earnshaw，W.C.ら，Chromosoma 98：1-12（1989））。した がって、これをセントロメア活性のマーカーとして使用することはできない。そ のため、一般にCENP-Bを極めて強く認識するCREST抗血清（過去の実験で使用さ れたもの：Haafら、Larinら、およびPraznovskyら（前出））は、セントロメア 活性を評価するにはよい試薬とはいえない。これに対し、CENP-Eは、機能的セン トロメアにのみ存在することが示されている（SullivanおよびSchwartz，Hum．M ol. Genet 4:2189-2197（1995））。したがって、このタンパク質に対するモノ 特異的抗体を、セントロメア活性の評価に使用することができる。 機能的セントロメアの存在と合致して、CENP-Eがクローン22-11と23-1（現在 までに試験した唯一のクローン）中の合成染色体上に存在することがわかった（ 図9）。さらに、合成染色体上のCENP-Eの量は、各内因性染色体のセントロメア に存在する量と類似している。これは興味深い事実である。というのは、CENP-E はセントロメアDNAに直接結合するとは考えられていないので、そのレベルはア ルファサテライトの存在量には依存しないからである。むしろ、これは機能的キ ネトコアが生成しているかどうかにのみ依存する。したがって、中期の合成染色 体上にCENP-Eが存在することは、それらがセントロメア/キネトコア複合体の形 成を指示できる機能的セントロメアを含有することを強く示唆している。 合成染色体は選択の不在下に有糸分裂的に安定である 合成染色体が機能的セントロメアを含有し、分裂細胞中で正しく分離できるこ とを確認するために、合成染色体含有細胞を選択の不在下に所定の期間、増殖さ せた。次に、それらの細胞をFISHで分析することにより、合成染色体を含む細胞 の割合を決定した。選択の不在下に46日（約60細胞世代）後、合成染色体はまだ 大半の細胞に存在していた（表2）。いくつかのクローンでは、合成染色体がま だ100%の細胞に存在していた。このことは、合成染色体が有糸分裂的に安定であ ることを示すので、これらのベクターを用いて分裂細胞をトランスフェクトする ことにより、遺伝子欠損をインビボで補正できるという考えは妥当である。 各合成染色体の分離効率を決定することに加えて、この実験により、我々は、 合成染色体の経時的な構造上の安定性を評価することもできた。各クローンにつ いて50染色体スプレッド（spread）を走査したが、合成染色体が内因性染色体に 組み込んでいるケースは観測されなかった。また、合成染色体が関与するその他 の大きな再編成も観測されなかった。この結果は、有糸分裂安定性が高いことと 共に、これらの合成染色体が内因性ヒト染色体と同じ特徴を数多く持つ独立した 遺伝子単位として振る舞うことを立証している。 合成染色体からの遺伝子発現 本明細書に記述する合成染色体は、体細胞遺伝子療法用の代替ベクターを提供 する。したがって、異種遺伝子がこれらの染色体ベクターから効率よく発現され うるかどうかを決定することが重要である。 実験手順に記述するように、pVJ104-Yα16またはpVJ104-17α32をテロメアDNA およびヒトゲノムDNAと同時にHT1080細胞にトランスフェクトすることにより、 合成染色体を作出した。各トランフェクションでは、β-geo発現単位を少なくと も100kbのアルファサテライトDNAに連結した。トランスフェクション後、細胞内 のアルファサテライトの位置は、β-geo遺伝子の位置と同じである。したがって 、合成染色体クローンでは、クローン17-15を除いて、β-geo遺伝子がもっぱら 合成染色体上に位置する。 各合成染色体含有クローンにおけるβ-geo発現のレベル（したがって合成染色 体からの遺伝子発現の程度）を測定するために、実験手順に記述するX-gal平板 染色法を用いて、細胞をアッセイした。この技術は比較的感度が低い（すなわち β-geo発現が高くなければ検出されない）が、発現レベルとこのマーカー遺伝子 を発現させる細胞の割合のおおまかな近似値を与えた。G418選択なしで70日（約 80細胞分裂）間の培養後、クローン22-11で、少なくとも50%の細胞％が、このア ッセイで検出できるレベルのβ-geoを発現させた（図10）。クローン22-6では、 細胞の約25%が、選択なしで70日後に、検出可能なβ-geo活性を持っていた（デ ータの開示なし）。他のクローンにおける発現は、このアッセイの感度が低く、 かつそれらの細胞におけるβ-geo発現が低いために、評価することができなかっ た。 考察 これらの結果は、裸のDNAを哺乳類細胞にトランスフェクトすることができ、 それらが、内因性染色体に組み込むことなく、機能的な合成染色体を形成しうる ことを示している。これらの合成染色体は、正常な哺乳類染色体の特徴を数多く 持つ。第1に、それらは低コピー数（通常は1細胞あたり1コピー）で細胞中に存 在する。第2に、合成染色体は直鎖状で、テロメア配列を含有するようである。 第3に、有糸分裂の間はCENP-Eが合成染色体に結合しており、このことは、機能 的キネトコアの形成を示す。第4に、これらの合成染色体は選択の不在下に有糸 分裂的に安定である。第5に、これらの合成染色体は転写的に活性な遺伝子を保 持することができる。最後に、これらの合成染色体の構造は経時的に安定で、検 出可能な組込み頻度を持たない。正常なヒト染色体とは異なり、合成染色体は小 さく、容易に操作できるので、種々の染色体状況で異なる遺伝子を発現させるこ とを可能にする。 これらの結果は、736kb長までのアルファサテライト配列（整列）を作成する ためのインビトロ法を示す。これらの効果は、本明細書に記載の合成染色体に必 須成分を提供することに加えて、アルファサテライトが臨床的に有用な量で生産 されうることを立証している。過去には、200kbより大きい構造的に無傷なアル ファサテライトDNAを、哺乳類細胞のトランスフェクションに必要な量で精製で きる方法はなかった。 対照実験として、本発明者らは、不成功に終わったHaafらの過去の実験を再現 して、αサテライトDNAの内因性染色体への同時組込みを伴う染色体を作成した 。これが起こったトランスフェクションは、追加のゲノムDNA配列を欠いた。ゲ ノム配列が無いことから、この染色体は、組み込まれたアルファサテライトDNA を含有する内因性染色体の1つから、切断事象の結果として生成した可能性が極 めて高い。効率が悪く頻度が低いことに加えて、染色体切断機構の結果としてゲ ノム再編成と宿主細胞の悪性形質転換を誘導する危険があるため、このアプロー チは遺伝子治療には有用でない。 要約すると、本発明者らは、大きなアルファサテライト配列、テロメアDNAお よびゲノムDNAを一緒にヒト細胞にトランスフェクトすることにより、有糸分裂 的に安定な合成染色体を作出できることを立証した。これらの成分のそれぞれは 、効率のよい合成染色体形成には必要であると思われるが、アルファサテライト DNAの組込み後のゲノム再編成が、ゲノム（非アルファサテライト、非テロメア ）配列の不在下に、染色体形成を引き起こし得る可能性はある。これに対し、ア ルファサテライトDNAは、これらの合成染色体を生産するために絶対的に必要だ と思われる。ここで、本発明者らは、Y染色体と第17染色体に由来するアルファ サテライトを用いて合成染色体を作成することにより、アルファサテライトDNA の起源が重要でないことを立証した。言い換えれば、任意の染色体から得たアル ファサテライトDNAを使用して、合成染色体を作成することができる。また、ヒ ト染色体が、マウス、ハムスターおよび霊長類を含む種々のハイブリッド中で安 定だとすれば、これら他の種に由来するアルファサテライト様配列を使用して、 本明細書に記述するような合成染色体を作成することもできる。 表1 様々な組み合わせのアルファサテライトDNA、テロメアDNAおよびヒトゲノ ムDNAをヒト細胞にトランスフェクトした結果。Yαと17αは、それぞれY染色体 および第17染色体由来のアルファサテライトの略号である。hgは、Not Iで消化 したヒトゲノムDNAの略号である。TelはテロメアDNAの略号である。VK75はX染色 体由来の75kbフラグメントの略号である。Xは、配列がそのトランスフェクショ ンに含まれたことを示す。XXは、実験手順に記述したように、追加の精製アルフ ァサテライトDNAをそのトランスフェクションに含めたことを示す。（XX）は、 実験手順に記述したように、追加のアルファサテライトDNAを、トランスフェク ションに先立って、b-geo/アルファサテライト構築物に予め連結したことを示す 。 上の記述は特定の好ましい態様に関するものであるが、本発明がそれらに限定 されないことは理解されるだろう。当業者は開示した態様に種々の修飾を施すこ とができ、それらの修飾も本発明の範囲に含まれることが理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ハーリントン，ジョン ジェイ. アメリカ合衆国 オハイオ 44094，ウィ ロウビーヒルズ，パー レーン ナンバー 1108 2260 (72)発明者 ウィラード，ハンティントン エフ. アメリカ合衆国 オハイオ 44106，シェ イカーハイツ，シェイカー ブールバード 22565

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．セントロメア、テロメアおよびゲノムDNAを本質的に含む人工哺乳動物類染 色体。 ２．前記ゲノムDNAが制限酵素消化フラグメントおよび機械的に剪断したフラグ メントからなる群より選択されるサブゲノムDNAフラグメントである、セントロ メアDNA、テロメアDNA、およびゲノムDNAを本質的に含む人工哺乳動物染色体。 ３．前記ゲノムDNAが制限酵素消化フラグメントおよび機械的に剪断したフラグ メントからなる群より選択されるサブゲノムDNAフラグメントであり、前記セン トロメアDNAが有糸分裂の間にCENP-Eと会合するDNA配列を含み、そして前記テロ メアDNAが配列TTAGGGのタンデム反復を含む、セントロメアDNA、テロメアDNA、 およびゲノムDNAを本質的に含む人工哺乳動物染色体。 ４．精製されたDNAを用いて哺乳動物細胞をトランスフェクトするプロセスによ り生産される人工哺乳動物染色体であって、該DNAがテロメアDNA、セントロメア DNA、およびゲノムDNAを本質的に含み、ここで、該ゲノムDNAが制限酵素消化フ ラグメントおよび機械的に剪断したフラグメントからなる群より選択されるサブ ゲノムDNAフラグメントである、人工哺乳動物染色体。 ５．精製されたDNAを用いて哺乳動物細胞をトランスフェクトするプロセスによ り生産される人工哺乳動物染色体であって、該DNAがテロメアDNA、セントロメア DNA、およびゲノムDNAを本質的に含み、ここで、該ゲノムDNAが制限酵素消化フ ラグメントおよび機械的に剪断したフラグメントからなる群より選択されるサブ ゲノムDNAフラグメントであり、該セントロメアDNAが有糸分裂の間にCENP-Eと会 合するDNA配列を含み、そして該テロメアDNAが配列TTAGGGのタンデム反復を含む 、人工哺乳動物染色体。 ６．精製された裸のDNAを用いて哺乳動物細胞をトランスフェクトするプロセス により生産される人工哺乳動物染色体であって、該DNAがテロメアDNA、セントロ メアDNA、およびゲノムDNAを本質的に含み、ここで、該ゲノムDNAが制限酵素消 化フラグメントおよび機械的に剪断したフラグメントからなる群より選択される サブゲノムDNAフラグメントである、人工哺乳動物染色体。 ７．精製された裸のDNAを用いて哺乳動物細胞をトランスフェクトするプロセス により生産される人工哺乳動物染色体であって、該DNAがテロメアDNA、セントロ メアDNA、およびゲノムDNAを本質的に含み、ここで、該ゲノムDNAが制限酵素消 化フラグメントおよび機械的に剪断したフラグメントからなる群より選択される サブゲノムDNAフラグメントであり、該セントロメアDNAが有糸分裂の間にCENP-E と会合するDNA配列を含み、そして該テロメアDNAが配列TTAGGGのタンデム反復を 含む、人工哺乳動物染色体。 ８．精製された凝縮DNAを用いて哺乳動物細胞をトランスフェクトするプロセス により生産される人工哺乳動物染色体であって、該DNAがテロメアDNA、セントロ メアDNA、およびゲノムDNAを本質的に含み、ここで、該ゲノムDNAが制限酵素消 化フラグメントおよび機械的に剪断したフラグメントからなる群より選択される サブゲノムDNAフラグメントである、人工哺乳動物染色体。 ９．精製された凝縮DNAを用いて哺乳動物細胞をトランスフェクトするプロセス により生産される人工哺乳動物染色体であって、該DNAがテロメアDNA、セントロ メアDNA、およびゲノムDNAを本質的に含み、ここで、該ゲノムDNAが制限酵素消 化フラグメントおよび機械的に剪断したフラグメントからなる群より選択される サブゲノムDNAフラグメントであり、該セントロメアDNAが有糸分裂の間にCENP-E と会合するDNA配列を含み、そして該テロメアDNAが配列TTAGGGのタンデム反復を 含む、人工哺乳動物染色体。 １０．精製されたコートDNAを哺乳動物細胞中にトランスフェクトするプロセス により生産される人工哺乳動物染色体であって、該DNAがセントロメアDNA、テロ メアDNA、およびゲノムDNAを本質的に含み、ここで、該ゲノムDNAが制限酵素消 化フラグメントおよび機械的に剪断したフラグメントからなる群より選択される サブゲノムDNAフラグメントである、人工哺乳動物染色体。 １１．精製されたコートDNAを哺乳動物細胞中にトランスフェクトするプロセス により生産される人工哺乳動物染色体であって、該DNAがテロメアDNA、セントロ メアDNA、およびゲノムDNAを本質的に含み、ここで、該ゲノムDNAが制限酵素消 化フラグメントおよび機械的に剪断したフラグメントからなる群より選択される サブゲノムDNAフラグメントであり、該セントロメアDNAが有糸分裂の間にCENP-E と会合するDNA配列を含み、そして該テロメアDNAが配列TTAGGGのタンデム反復を 含む、人工哺乳動物染色体。 １２．前記セントロメアDNA、前記テロメアDNA、および前記ゲノムDNAが互いに 連結されていない、請求項４〜１１のいずれかに記載の人工哺乳動物染色体。 １３．１つ以上の前記セントロメアDNA、前記テロメアDNA、および前記ゲノムDN Aが別の１つと連結されている、請求項４〜１１のいずれかの人工哺乳動物染色 体。 １４．請求項１〜１１のいずれかに記載の人工哺乳動物染色体を含む組成物。 １５．前記セントロメアDNAがアルファサテライトDNAを含む、請求項１〜１１の いずれかに記載の人工哺乳動物染色体。 １６．請求項１〜１１のいずれかに記載の人工哺乳動物染色体を含む哺乳動物細 胞。 １７．前記染色体がさらに、該染色体が哺乳動物細胞に導入された場合に、該染 色体から発現されるか、または遺伝子産物の発現を引き起こす異種DNAを含む、 請求項１〜１１のいずれかに記載の人工哺乳動物染色体。 １８．テロメアDNA、セントロメアDNA、およびゲノムDNAを本質的に含む精製さ れたDNAであって、ここで、該ゲノムDNAが制限酵素消化フラグメントおよび機械 的に剪断したフラグメントからなる群より選択されるサブゲノムDNAフラグメン トである、精製されたDNA。 １９．テロメアDNA、セントロメアDNA、およびゲノムDNAを本質的に含む精製さ れたDNAであって、ここで、該ゲノムDNAが制限酵素消化フラグメントおよび機械 的に剪断したフラグメントからなる群より選択されるサブゲノムDNAフラグメン トであり、該セントロメアDNAが有糸分裂の間にCENP-Eと会合するDNA配列を含み 、そして該テロメアDNAが配列TTAGGGのタンデム反復を含む、精製されたDNA。 ２０．テロメアDNA、セントロメアDNA、およびゲノムDNAを本質的に含む精製さ れた裸のDNAであって、ここで、該ゲノムDNAが制限酵素消化フラグメントおよび 機械的に剪断したフラグメントからなる群より選択されるサブゲノムDNAフラグ メントである、精製された裸のDNA。 ２１．テロメアDNA、セントロメアDNA、およびゲノムDNAを本質的に含む精製さ れた裸のDNAであって、ここで、該ゲノムDNAが制限酵素消化フラグメントおよび 機械的に剪断したフラグメントからなる群より選択されるサブゲノムDNAフラグ メントであり、該セントロメアDNAが有糸分裂の間にCENP-Eと会合するDNA配列を 含み、そして該テロメアDNAが配列TTAGGGのタンデム反復を含む、精製された裸 のDNA。 ２２．テロメアDNA、セントロメアDNA、およびゲノムDNAを本質的に含む精製さ れた凝縮DNAであって、ここで、該ゲノムDNAが制限酵素消化フラグメントおよび 機械的に剪断したフラグメントからなる群より選択されるサブゲノムDNAフラグ メントであり、ここで、該DNAがDNA凝縮剤でコートされている、精製された凝縮 DNA。 ２３．テロメアDNA、セントロメアDNA、およびゲノムDNAを本質的に含む精製さ れた凝縮DNAであって、ここで、該ゲノムDNAが制限酵素消化フラグメントおよび 機械的に剪断したフラグメントからなる群より選択されるサブゲノムDNAフラグ メントであり、該セントロメアDNAが有糸分裂の間にCENP-Eと会合するDNA配列を 含み、そして該テロメアDNAが配列TTAGGGのタンデム反復を含み、ここで、該DNA がDNA凝縮剤で結合されている、精製された凝縮DNA。 ２４．テロメアDNA、セントロメアDNA、およびゲノムDNAを本質的に含む精製さ れたコートDNAであって、ここで、該ゲノムDNAが制限酵素消化フラグメントおよ び機械的に剪断したフラグメントからなる群より選択されるサブゲノムDNAフラ グメントであり、ここで、該DNAが１つ以上のDNA結合タンパク質でコートされて いる、精製されたコートDNA。 ２５．テロメアDNA、セントロメアDNA、およびゲノムDNAを本質的に含む精製さ れたコートDNAであって、ここで、該ゲノムDNAが制限酵素消化フラグメントおよ び機械的に剪断したフラグメントからなる群より選択されるサブゲノムDNAフラ グメントであり、該セントロメアDNAが有糸分裂の間にCENP-Eと会合するDNA配列 を含み、そして該テロメアDNAが配列TTAGGGのタンデム反復を含み、ここで、該D NAが１つ以上のDNA結合タンパク質で結合されている、精製されたコートDNA。 ２６．テロメアDNA、セントロメアDNA、およびゲノムDNAをインビトロで組み合 わせるプロセスにより作製される精製されたDNAであって、ここで、該ゲノムDNA が制限酵素消化フラグメントおよび機械的に剪断したフラグメントからなる群よ り選択されるサブゲノムDNAフラグメントである、精製されたDNA。 ２７．テロメアDNA、セントロメアDNA、およびゲノムDNAをインビトロで組み合 わせるプロセスにより作製される精製されたDNAであって、ここで、該ゲノムDNA が制限酵素消化フラグメントおよび機械的に剪断したフラグメントからなる群よ り選択されるサブゲノムDNAフラグメントであり、該セントロメアDNAが有糸分裂 の間にCENP-Eと会合するDNA配列を含み、そして該テロメアDNAが配列TTAGGGのタ ンデム反復を含む、精製されたDNA。 ２８．テロメアDNA、セントロメアDNA、およびゲノムDNAをインビトロで組み合 わせるプロセスにより作製される精製された裸のDNAであって、ここで、該ゲノ ムDNAが制限酵素消化フラグメントおよび機械的に剪断したフラグメントからな る群より選択されるサブゲノムDNAフラグメントである、精製された裸のDNA。 ２９．テロメアDNA、セントロメアDNA、およびゲノムDNAをインビトロで組み合 わせるするプロセスにより作製される精製された裸のDNAであって、ここで、該 ゲノムDNAが制限酵素消化フラグメントおよび機械的に剪断したフラグメントか らなる群より選択されるサブゲノムDNAフラグメントであり、該セントロメアDNA が有糸分裂の間にCENP-Eと会合するDNA配列を含み、そして該テロメアDNAが配列 TTAGGGのタンデム反復を含む、精製された裸のDNA。 ３０．テロメアDNA、セントロメアDNA、およびゲノムDNAをインビトロで組み合 わせるプロセスにより作製される精製された凝縮DNAであって、ここで、該ゲノ ムDNAが制限酵素消化フラグメントおよび機械的に剪断したフラグメントからな る群より選択されるサブゲノムDNAフラグメントであり、ここで、該DNAがDNA凝 縮剤で結合されている、精製された凝縮DNA。 ３１．テロメアDNA、セントロメアDNA、およびゲノムDNAをインビトロで組み合 わせるプロセスにより作製される精製された凝縮DNAであって、ここで、該ゲノ ムDNAが制限酵素消化フラグメントおよび機械的に剪断したフラグメントからな る群より選択されるサブゲノムDNAフラグメントであり、該セントロメアDNAが有 糸分裂の間にCENP-Eと会合するDNA配列を含み、そして該テロメアDNAが配列TTAG GGのタンデム反復を含み、ここで、該DNAがDNA凝縮剤で結合されている、精製さ れた凝縮DNA。 ３２．テロメアDNA、セントロメアDNA、およびゲノムDNAをインビトロで組み合 わせるプロセスにより作製される精製されたコートDNAであって、ここで、該ゲ ノムDNAが制限酵素消化フラグメントおよび機械的に剪断したフラグメントから なる群より選択されるサブゲノムDNAフラグメントであり、ここで、該DNAが１つ 以上のDNA結合タンパク質でコートされている、精製されたコートDNA。 ３３．テロメアDNA、セントロメアDNA、およびゲノムDNAをインビトロで組み合 わせるプロセスにより作製される精製されたコートDNAであって、ここで、該ゲ ムDNAが制限酵素消化フラグメントおよび機械的に剪断したフラグメントからな る群より選択されるサブゲノムDNAフラグメントであり、該セントロメアDNAが有 糸分裂の間にCENP-Eと会合するDNA配列を含み、そして該テロメアDNAが配列TTAG GGのタンデム反復を含み、ここで、該DNAが１つ以上のDNA結合タンパク質でコー トされている、精製されたコートDNA。 ３４．請求項１８〜３３のいずれかに記載のDNAを含む組成物。 ３５．請求項１８〜３３のいずれかに記載の精製されたDNAを含む哺乳動物細胞 。 ３６．前記セントロメアDNA、前記テロメアDNA、および前記ゲノムDNAが互いに 連結されていない、請求項１８〜３３のいずれかに記載の精製されたDNA。 ３７．１つ以上の前記セントロメアDNA、前記テロメアDNAおよび前記ゲノムDNA が互いに連結されている、請求項１８〜３３のいずれかに記載の精製されたDNA 。 ３８．前記セントロメアDNAがアルファサテライトDNAを含む、請求項１８〜３３ のいずれかに記載の精製されたDNA。 ３９．前記DNAがさらに、該DNAが哺乳動物細胞に導入された場合に、該染色体か ら発現されるか、または遺伝子産物の発現を引き起こす異種DNAを含む、請求項 １８〜３３のいずれかに記載の精製されたDNA。 ４０．請求項１８〜３３のいずれかに記載のDNAを含むベクター。 ４１．請求項４０のベクターを含む細胞。 ４２．請求項４０のベクターを含む組成物。 ４３．反復タンデム配列のDNAをクローニングする方法であって、該方法が以下 の工程： (a) 第１のDNA単位を、該DNA単位の反対の末端が相補的ではあるが非アイ ソシゾマー制限部位を含むように調製する工程； (b) 該DNA単位をベクターに連結する工程； (c) 該ベクターを該制限部位の１つで直鎖状化する工程； (d) 工程（a）と同様に調製した第２のDNA単位を、該第１の単位とタンデ ムに連結して、指向的反復配列を形成する工程； (e) 該配列を細菌宿主細胞に形質転換する工程； (f) 該配列を含有する安定なクローンを選択する工程；および、 (g) 工程（c）〜（f）を所望の配列サイズに達するまで繰り返す工程、 を包含する、方法。 ４４．前記DNAがアルファサテライトDNAである、請求項４３に記載の方法。 ４５．前記アルファサテライトDNAの前記配列が100kbを超える長さである、請求 項４４に記載の方法。 ４６．前記アルファサテライトDNAの前記配列が140kbを超える長さである、請求 項４５に記載の方法。 ４７．前記アルファサテライトDNAがヒトアルファサテライトDNAである、請求項 ４４に記載の方法。 ４８．指向的反復DNA配列からなる配列を含むベクターであって、該配列は反復D NA単位を含み、ここで、各DNA単位の両端が相補的ではあるが非アイソシゾマー 制限部位を含有する、ベクター。 ４９．前記DNAがアルファサテライトDNAである、請求項４８に記載のベクター。 ５０．前記アルファサテライトDNAの前記配列が100kbを超える長さである、請求 項４９に記載のベクター。 ５１．前記アルファサテライトDNAの前記配列が140kbを超える長さである、請求 項５０に記載のベクター。 ５２．前記アルファサテライトDNAがヒトアルファサテライトDNAである、請求項 ４７に記載のベクター。 ５３．請求項４７〜５２のいずれかに記載のベクターで安定に形質転換された宿 主細胞。 ５４．前記宿主細胞が原核細胞である、請求項５３に記載の宿主細胞。 ５５．前記原核細胞がE.coliである、請求項５４に記載の宿主細胞。 ５６．人工哺乳動物染色体を作製する方法であって、該方法が請求項１８〜３３ のいずれかに記載の精製されたDNAを哺乳動物細胞に導入する工程を包含する、 方法。 ５７．人工哺乳動物染色体を作製する方法であって、該方法が請求項３４に記載 の組成物Aを哺乳動物細胞に導入する工程を包含する、方法。 ５８．精製されたDNA組成物を作製する方法であって、該方法が、精製されたテ ロメアDNA、セントロメアDNA、およびゲノムDNAをインビトロで組み合わせる工 程を包含し、ここで、該ゲノムDNAが制限酵素消化フラグメントおよび機械的に 剪断したフラグメントからなる群より選択されるサブゲノムDNAフラグメントで ある、方法。 ５９．精製されたDNA組成物を作製する方法であって、該方法が、精製されたテ ロメアDNA、セントロメアDNA、およびゲノムDNAをインビトロで組み合わせる工 程を包含し、ここで、該ゲノムDNAが制限酵素消化フラグメントおよび機械的に 剪断したフラグメントからなる群より選択されるサブゲノムDNAフラグメントで あり、該セントロメアDNAが有糸分裂の間にCENP-Eと会合するDNA配列を含み、そ して該テロメアDNAが配列TTAGGGのタンデム反復を含む、方法。 ６０．精製された裸のDNA組成物を作製する方法であって、該方法が、精製され たテロメアDNA、セントロメアDNA、およびゲノムDNAをインビトロで組み合わせ る工程を包含し、ここで、該ゲノムDNAが制限酵素消化フラグメントおよび機械 的に剪断したフラグメントからなる群より選択されるサブゲノムDNAフラグメン トである、方法。 ６１．精製された裸のDNA組成物を作製する方法であって、該方法が、精製され たテロメアDNA、セントロメアDNA、およびゲノムDNAをインビトロで組み合わせ る工程を包含し、ここで、該ゲノムDNAが制限酵素消化フラグメントおよび機械 的に剪断したフラグメントからなる群より選択されるサブゲノムDNAフラグメン トであり、該セントロメアDNAが有糸分裂の間にCENP-Eと会合するDNA配列を含み 、そして該テロメアDNAが配列TTAGGGのタンデム反復を含む、方法。 ６２．精製された凝縮DNA組成物を作製する方法であって、該方法が、DNA凝縮剤 と精製されたテロメアDNA、セントロメアDNA、およびゲノムDNAとをインビトロ で組み合わせる工程を包含し、ここで、該ゲノムDNAが制限酵素消化フラグメン トおよび機械的に剪断したフラグメントからなる群より選択されるサブゲノムDN Aフラグメントである、方法。 ６３．精製された凝縮DNA組成物を作製する方法であって、該方法が、DNA凝縮剤 と精製されたテロメアDNA、セントロメアDNA、およびゲノムDNAとをインビトロ で組み合わせる工程を包含し、ここで、該ゲノムDNAが制限酵素消化フラグメン トおよび機械的に剪断したフラグメントからなる群より選択されるサブゲノムDN Aフラグメントであり、該セントロメアDNAが有糸分裂の間にCENP-Eと会合するDN A配列を含み、そして該テロメアDNAが配列TTAGGGのタンデム反復を含む、方法。 ６４．精製されたコートDNA組成物を作製する方法であって、該方法が、１つ以 上のDNA結合タンパク質と精製されたテロメアDNA、セントロメアDNA、およびゲ ノムDNAとをインビトロで組み合わせる工程を包含し、ここで、該ゲノムDNAが制 限酵素消化フラグメントおよび機械的に剪断したフラグメントからなる群より選 択されるサブゲノムDNAフラグメントである、方法。 ６５．精製されたコートDNA組成物を作製する方法であって、該方法が、１つ以 上のDNA結合タンパク質と精製されたテロメアDNA、セントロメアDNA、およびゲ ノムDNAとをインビトロで組み合わせる工程を包含し、ここで、該ゲノムDNAが制 限酵素消化フラグメントおよび機械的に剪断したフラグメントからなる群より選 択されるサブゲノムDNAフラグメントであり、該セントロメアDNAが有糸分裂の間 にCENP-Eと会合するDNA配列を含み、そして該テロメアDNAが配列TTAGGGのタンデ ム反復を含む、方法。 ６６．前記セントロメアDNA、前記テロメアDNA、および前記ゲノムDNAが互いに 連結されていない、請求項５６〜６５のいずれかに記載の方法。 ６７．１つ以上の前記セントロメアDNA、前記テロメアDNA、および前記ゲノムDN Aが互いに連結されている、請求項５６〜６５のいずれかに記載の方法。 ６８．哺乳動物細胞内で遺伝子を発現させる方法であって、該方法が請求項１〜 １１のいずれかに記載の人工染色体を含有する哺乳動物細胞を増殖させる工程を 包含し、ここで、該染色体が該遺伝子を含むかまたは該遺伝子を発現させるDNA 配列を含む、方法。 ６９．哺乳動物細胞内で異種遺伝子を発現させる方法であって、該方法が請求項 １８〜３３のいずれかに記載のDNAを含有する哺乳動物細胞を増殖させる工程を 包含し、ここで、該DNAが該遺伝子を含むかまたは該遺伝子を発現させるDNA配列 を含む、方法。 ７０．前記遺伝子発現が前記細胞を含む哺乳動物に治療上の利益を与える、請求 項６８に記載の方法。 ７１．前記遺伝子発現が前記細胞を含む哺乳動物に治療上の利益を与える、請求 項６９に記載の方法。