JPH11509088A

JPH11509088A - 血管内皮増殖因子受容体をコードする遺伝子の転写調節

Info

Publication number: JPH11509088A
Application number: JP9503975A
Authority: JP
Inventors: パターソン−ウィンストン，キャンベル; リー，ム−エン; ヘーバー，エドガー
Original assignee: Harvard University
Current assignee: Harvard University
Priority date: 1995-06-23
Filing date: 1996-06-21
Publication date: 1999-08-17
Also published as: AU723325B2; CA2225460A1; WO1997000957A1; AU6288496A; EP0833907A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、下記ＤＮＡに機能的に連結されているポリペプチドコード配列またはアンチセンス鋳型の内皮細胞特異的転写を指令することができる内皮細胞特異的プロモーター配列を含んでなる実質的に純粋なＤＮＡを特徴とする。本発明はまた、内皮細胞の増殖を抑制または増強する化合物の同定方法を特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】血管内皮増殖因子受容体をコードする遺伝子の転写調節発明の背景本発明は内皮細胞特異的遺伝子転写およびＴＮＦ−αによる転写調節に係る。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は有力で特異的な内皮細胞マイトジェンである (Connolly ら，1989，J．Clin．Invest．84:1470-1478; Leungら，1989，Scienc e 246:1306-1309）。ＶＥＧＦは、その受容体、すなわちキナーゼ−インサートドメイン含有受容体／胎児肝キナーゼ−１（ＫＤＲ／ｆｌｋ−１）およびｆｌｔ１との相互作用を介して、血管内皮細胞の増殖および維持において、また新たな血管の生理学的・病理学的状態における発生において重要な役割を果たす(Aiell o ら，1994，New Engl．J．Med．331:1480-1487; Shweikiら，1992，Nature 359 :843-845; Berkman ら，1993，J．Clin．Invest．91:153-159)。ＶＥＧＦの胚発現のパターンは、血管芽細胞からの内皮細胞の分化および増殖のあらゆる段階における血管の発生にＶＥＧＦが極めて重要であることを示唆している(Jakemanら，1993，Endocrinology 133:848-859; Breier ら，1992，Development 114:521- 532)。多くの可能な血管新生因子の中でＶＥＧＦは、正常な発生において特異的な血管新生機能を示唆する発現、分泌および活性のパターンをもつ唯一のものである(Klagsbrunら，1993，Current Biology 3:699-702)。ＶＥＧＦに対する親和性が高い受容体は内皮細胞にのみ見られ、大血管および微小血管の内皮細胞上で、また静止期および増殖期の内皮細胞においてＶＥＧＦ結合が立証されている(Jakemanら，1993，Endocrinology 133:848-859; Jakeman ら，1992，Clin．Invest．89:244-253)。アフィニティークロスリンキングアッセイおよび競合結合検定法によってＶＥＧＦ受容体の候補としてチロシンキナーゼのＫＤＲ／ｆｌｋ−１およびｆｌｔ１が同定されている(de Vries ら，1992， Science 255:989-991; Millauerら，1993，Cell 72:835-846; Terman ら，1992 ，Biochem．Biophys．Res．Commun．187:1579-1586)。これら２つの受容体チロシンキナーゼは、類似する７つの細胞外免疫グロブリンドメインと、キナーゼインサートによって中断された保存細胞内チロシンキナーゼドメインを含有しており (de Vries ら，1992，Science 255:989-991; Matthews ら，1991，Proc．Natl． Acad．Sci．U.S.A．88:9026-9030; Termanら，1001，Oncogene 6:1677-1683)、またin vivoで内皮細胞によって特異的に発現される(Millauer ら，1993，Cell 72:835-846; Peters ら，1993，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:8915-8919; Qu innら，1993，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:7533-7537; Yamaguchiら，1993 ，Development 118:489498）。発育中のマウスにおけるin situハイブリダイゼーションにより、発生のあらゆる段階の内皮細胞で、また内皮細胞前駆体が最初に現れる血島でＫＤＲ／ｆｌｋ−１が発現されることが立証された(Milauerら， 1993,Cell 72:835-846）。ＫＤＲ／ｆｌｋ−１は発生の最も初期の段階の内皮細胞前駆体のマーカーである(Yamaguchiら，1993，Development 118:489-498)。血管内皮は、血栓症や血栓崩壊を始めとする生理反応、リンパ球やマクロファージのホーミング、免疫応答のモジュレーション、および血管トーヌスの調節にとって極めて重要である。内皮はまた、アテローム性動脈硬化のような血管疾患の病因とも密接に関連している(Ross，1993，Nature 362:801-809)。内皮で発現されるいくつかの遺伝子が特性決定されているが(Collinsら，1991，J．Biol．C hem．266:2466-2473; Iademarco ら，1992，J．Biol．Chem．267:16323-16329; Jahroudiら，1994，Mol．Cell．Biol．14:999-1008; Lee ら，1990，J．Biol．C hem．265:10446-10450)これらの遺伝子の発現は、血管内皮に限定されない（たとえば、フォンビルブラント因子、エンドセリン−１、血管細胞接着分子−１をコードする遺伝子）か、または内皮細胞の特定の亜集団(subpopulation)に限定される（たとえば、内皮−白血球接着分子−１の遺伝子）。発明の概要本発明は、ポリペプチドをコードする配列と機能的に連結されたときにその配列の内皮細胞特異的転写を調節する実質的に純粋なＤＮＡ、すなわちプロモーター配列を特徴とする。本発明のＤＮＡはＫＤＲ／ｆｌｋ−１プロモーターの−２２５から−１６４までのヌクレオチドと実質的に同一の配列、すなわち５′TTGT TGCTCTGGGATGTTCTCTCCTGGGCGACTTGGGGCCCAGCGCAGTCCAGTTGTGTGGG３′（配列番号１）を含有する。「実質的に同一の」とは、少なくとも８０％が基準ＤＮＡ配列と等しいこと、すなわち、基準ＤＮＡ配列の塩基対の２０％までを他の塩基対で置き換える（たとえば、Ｇ−Ｃの代わりに、Ａ−Ｔ、Ｔ−ＡまたはＣ−Ｇとする）ことができるが、そのように変化した配列の転写促進活性は基準配列の活性と同じかそれ以上であることを意味する。またこのＤＮＡは、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１プロモーターの−９５から−７７までのヌクレオチドと実質的に同一の配列、すなわち５′GCTGGCCGCACGGGAGAGC３′（配列番号２）、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１プロモーターの−９５から−６０までのヌクレオチドと実質的に同一の配列、すなわち５′GCTGGCCGCACGGGAGAGCCCCTCCTCCGCCCCGGC３′（配列番号３）、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１プロモーターの＋１０５から＋１２７までのヌクレオチドと実質的に同一の配列、すなわち５′GGATATCCTCTCCTACCGGCAC３′（配列番号４）、またはこれらの組合せを含んでいてもよい。配列は５′から３′に向かって配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４の配向であるのが好ましい。しかし、これらの配列の配向は、内皮細胞特異的転写を促進するものであればいずれも本発明の範囲内である。本ＤＮＡは規定された配列の任意の２つの間、および／またはその一端もしくは両端に非特異的配列を含んでいてもよい。この非特異的配列（すなわち、配列番号１〜４以外の配列、はプロモーター配列全体の８０％までを構成しているのが好ましい。最も好ましいのは、表１（配列番号５）または表２（配列番号６）に示した配列と実質的に等しいものである。本明細書で使用する「実質的に純粋なＤＮＡ」とは、天然の状態では隣接している(flank)配列から分離・精製されたＤＮＡ、すなわち、通常は隣接している配列（たとえば、天然に存在するゲノム中で当該ＤＮＡ断片に隣接する配列）から分離・取出されたＤＮＡ断片をいう。ＫＤＲ／ｆｌｋ−１プロモーターの−２２５から＋２６８までのヌクレオチド（配列番号５、表１）またはＫＤＲ／ｆｌｋ−１プロモーターの−２２５から＋１２７までのヌクレオチド（配列番号６、表２）と実質的に同一の配列を含有する実質的に純粋なＤＮＡであって、ポリペプチドコード配列または当該ＤＮＡが機能的に連結されたアンチセンス鋳型の内皮細胞特異的転写を調節するものも本発明の範囲内である。本発明のＤＮＡは、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１ではないポリペプチドをコードする配列に機能的に連結することができ、その配列の内皮細胞特異的転写を調節するように機能する。そのようなポリペプチドの例としては、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ｐ２１細胞周期インヒビターおよび酸化窒素シンターゼがある。「機能的に連結する」とは、同じＤＮＡ鎖上で下流に位置するポリペプチドコードまたはアンチセンス鋳型に対応するｍＲＮＡの転写を促進することができるということを意味している。また本発明は、本発明のＤＮＡを含有するベクター、このベクターを内皮細胞中に導入することによってポリペプチドを内皮細胞に特異的に発現させる方法、およびそのベクターを含有する内皮細胞も包含する。本発明のベクターは遺伝子療法に用いることができ、たとえば、動脈硬化症の発生を低減または予防することができるポリペプチド（たとえば、平滑筋の増殖を低減させるポリペプチド、たとえばインターフェロン−γや心房性ナトリウム利尿ポリペプチド）を産生させる本発明のベクターを動物の動脈に接触させることを含む動物の動脈硬化症を抑制する方法に用いることができる。さらに本発明はアンチセンス療法を実施するための組成物と方法も包含する。たとえば、本発明は、機能的に連結されたときにアンチセンス鋳型（たとえば、その転写産物がｍＲＮＡから内皮細胞ポリペプチドへの翻訳を抑制するようなアンチセンス鋳型）の内皮細胞特異的転写を調節する配列番号１と実質的に同一の配列をもつ実質的に純粋なＤＮＡを包含する。「アンチセンス鋳型」という用語は、ｍＲＮＡとハイブリダイズするＲＮＡに転写されるＤＮＡを意味する。上記内皮細胞ポリペプチドはＫＤＲ／ｆｌｋ−１が好ましい。たとえば、血管新生に関与するタンパク質であるＫＤＲ／ｆｌｋ−１をコードするｍＲＮＡに結合することによってその翻訳を抑制または低減するアンチセンスＲＮＡ転写物を用いて、動物の腫瘍部位と本発明のＤＮＡとを接触させてその腫瘍部位における血管新生を低減または抑制することによって癌を治療することができる。この方法で他の内皮細胞ポリペプチドの翻訳も低減または抑制することができる。たとえば、細胞周期タンパク質、凝固因子（たとえばフォンビルブラント因子）、および内皮細胞接着因子（たとえば細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）または血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１））の翻訳を低減または抑制することができる。本発明はまた、ある候補化合物が、ＴＮＦ−αダウンレギュレーションＶＥＧＦ受容体（たとえば、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１またはｆｌｔ１）遺伝子発現をモジュレートする能力を測定する方法も特徴とする。この方法では、機能的にリポーター遺伝子に結合したＶＥＧＦ受容体遺伝子のプロモーターを含有する細胞をＴＮＦ−αおよび候補化合物の存在下で培養する。次いで、その候補化合物がＶＥＧＦ受容体遺伝子発現のＴＮＦ−αによるダウンレギュレーションをモジュレートできる能力の尺度として、リポーター遺伝子の発現レベルを測定する。本発明に包含される他の方法では、ある候補化合物がＶＥＧＦにより誘導される内皮細胞増殖のＴＮＦ−αによる抑制をモジュレートできる能力を測定する。この方法では、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ、および候補化合物の存在下で内皮細胞を培養する。その候補化合物がＶＥＧＦにより誘導される内皮細胞増殖のＴＮＦ− αによる抑制をモジュレートできる能力の尺度として、内皮細胞増殖レベルを（たとえば、［メチル−［³Ｈ］チミジンの取込みを測定することによって）決定する。また本発明は、ＶＥＧＦ受容体（たとえば、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１またはｆｌｔ１）遺伝子の内皮細胞内での発現をダウンレギュレートするＴＮＦ−α経路を活性化する非ＴＮＦ−α化合物を患者に投与することを含む、患者における血管新生を抑制する方法も特徴とする。患者における血管新生を抑制するための本発明の別の方法では、ＶＥＧＦ受容体（たとえば、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１またはｆｌｔ１）遺伝子のプロモーター中のＴＮＦ−α応答性エレメントに結合することによってＶＥＧＦ受容体遺伝子の内皮細胞内での発現を抑制するポリペプチドを患者に投与することを含む。さらに本発明は、内皮細胞内においてＶＥＧＦ受容体（たとえば、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１またはｆｌｔ１）遺伝子をダウンレギュレートするＴＮＦ−α経路を抑制する非ＴＮＦ−α化合物を患者に投与することを含む、患者における血管新生を増強する方法も特徴とする。本発明のその他の特徴と利点は、本発明の好ましい態様に関する以下の説明、図面および請求の範囲から明らかとなるであろう。詳細な説明まず図面について説明する。図面図１Ａは、ヒトＫＤＲ／ｆｌｋ−１プロモーターを示す。制限酵素部位はヌクレオチド配列の上に示し、ヌクレオチド配列−７８０〜＋４８７（配列番号７）はヌクレオチド配列の左に番号を付した。転写開始部位は曲がった矢印で示してある。シス作用性エレメントとして可能性のある部分に下線を付した。リボプローブを作成するのに使用したＰｓｔＩ部位には二重の下線を付し、プライマー伸長に用いたオリゴヌクレオチドに対応する配列は矢印の下線を付した。図１Ｂは、マウスＫＤＲ／ｆｌｋ−１プロモーターを示す。制限酵素部位をヌクレオチド配列の上に示す。図１Ａと同様にして、ヌクレオチド配列−２９５〜＋２０５（配列番号８）に番号を付し、可能なシス作用性エレメントを示す。星印はｃＤＮＡの５′端を示す。図２Ａは、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１転写開始部位のプライマー伸長解析の結果を示す電気泳動ゲルの写真である。図１Ａの矢印で下線を付したオリゴヌクレオチドを、ヒト腺静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびＨｅＬａ細胞の全ＲＮＡの２０μ ｇまたはポリＡ⁺ ＨＵＶＥＣＲＮＡおよび酵母ｔＲＮＡの３μｇとハイブリダイズさせた。伸長産物を８％ポリアクリルアミドゲル（レーン１〜４：酵母ｔＲＮＡ、ＨｅＬａ全ＲＮＡ、ＨＵＶＥＣ全ＲＮＡ、およびＨＵＶＥＣポリＡ⁺ ＲＮＡ）で解析した。このプライマー伸長解析の次にプラスミドＤＮＡ鋳型上で（同じオリゴヌクレオチドプライマーを用いて）開始した(primed)Sanger配列決定反応を実施した（レーン５〜８：Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ）。図２Ｂは、リボヌクレアーゼ保護によりＫＤＲ／ｆｌｋ−１遺伝子の転写開始部位をマッピングする戦略を示す概略図である。図２Ｃは、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１転写開始部位のリボヌクレアーゼ保護解析を示す電気泳動ゲルの写真である。ＨＵＶＥＣおよびＨｅＬａ細胞由来の全ＲＮＡまたはポリＡ⁺ ＨＵＶＥＣＲＮＡならびに酵母ｔＲＮＡを、ヒトＫＤＲ／ｆｌｋ −１遺伝子のすぐ５′領域を含む５５９ｂｐの³²Ｐ標識リボプローブと共にインキュベートした。アニーリング産物をＲＮａｓｅで消化した。保護された断片を４％ポリアクリルアミドゲル上で解析した。サイズマーカー（ｂｐ）は、Ｈａｅ IIIで消化したΦＸ１７４ＲＦＤＮＡを放射性標識することによって調製した。図３Ａは、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１プロモーター中の５′欠失部位の位置を示す図である。欠失部位の位置は既知の核タンパク質のコンセンサス配列に関連して示す。図３Ｂは、一連の５′欠失を含有するルシフェラーゼリポーター構築物をウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）中にトランスフェクトすることによってヒトＫＤＲ／ｆｌｋ−１プロモーターを機能解析した結果を示す棒グラフである。いずれの構築物もトランスフェクション効率を補正するためにｐＳＶβｇａｌと共に同時トランスフェクトし、ルシフェラーゼ活性はｐＧＬ２コントロールに対するパーセントとして表わした（平均±ＳＥＭ）。図４Ａは、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１プロモーター中の３′欠失部位の位置を示す図である。欠失部位の位置は既知の核タンパク質のコンセンサス配列に関連して示す。図４Ｂは、ＢＡＥＣ内のＫＤＲ／ｆｌｋ−１プロモーター活性に関する３′欠失の機能解析の結果を示す棒グラフである。ルシフェラーゼ活性はｐＧＬ２コントロールのパーセントとして表わしてある。図５は、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１プロモーター活性に対するＧＡＴＡ部位突然変異の影響を示す棒グラフである。＋１０７位のＧＡＴＡモチーフの突然変異はＫＤＲ／ｆｌｋ−１プロモーターが転写を指令する能力を低下させない。ＢＡＥＣにトランスフェクトしたとき、プラスミドpGL2-225+268は、ＳＶ４０プロモーターおよびエンハンサーを含有するｐＧＬ２コントロールによって指令される発現と同程度にルシフェラーゼ発現を指令した。＋１０７のＧＡＴＡ部分の３ｂｐを変異させてpGF2 GATA-MUTを創製したとき、プロモーター活性に大きな違いはなかった。図６Ａは、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１ＲＮＡ発現が培養内皮細胞に制限されていることを示すノーザンブロット解析の写真である。培養細胞からＲＮＡを抽出し、ヒトＫＤＲ／ｆｌｋ−１ｃＤＮＡプローブを用いてノーザンブロットによって解析した。次の細胞タイプを試験した。ＨＵＶＥＣ（ヒト臍静脈内皮細胞）、ＨＡＳＭＣ（ヒト大動脈平滑筋細胞）、ＨＩＳＭＣ（ヒト腸平滑筋細胞）、繊維芽細胞（ヒト培養繊維芽細胞）、ＲＤ（ヒト胚性横紋筋肉腫細胞）、ＨｅＬａ（ヒト類表皮癌腫細胞）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝癌細胞）、ＭＣＦ７（ヒト乳腺癌細胞）およびＵ９３７（ヒト組織球リンパ腫細胞）。図６Ｂは、各レーンに負荷されたＲＮＡの量を示すために（リボソームＲＮＡを可視化するべく）臭化エチジウムで染色した図６Ａに示したものと同じアガロースゲルの写真である。図７は、ルシフェラーゼアッセイの結果を示す棒グラフである。ＫＤＲ／ｆｌｋ−１プロモーターの高レベルの活性が内皮細胞に特異的であることが判明した。ルシフェラーゼリポーター構築物pGL2-4kb+296を培養細胞にトランスフェクトし、ｐＳＶβｇａｌによる同時トランスフェクションを追跡することによってトランスフェクション効率を評価した。結果はトランスフェクション効率に関して補正し、各細胞タイプについてｐＧＬ２コントロール活性に対するパーセントとして表わしてある。次の細胞タイプを試験した。ＢＡＥＣ（ウシ大動脈内皮細胞）、ＪＥＧ−３（ヒト絨毛腺癌細胞）、Ｓａｏｓ−２（ヒト骨肉腫細胞）、Ａ７ｒ５（ラット胎児平滑筋細胞）、３Ｔ３（マウス繊維芽細胞）およびＨｅＬａ（ヒト類表皮癌腫細胞）。図８は、メチル−［³Ｈ］チミジンの取込み量として測定された、ＶＥＧＦによって誘導されるＨＵＶＥＣの増殖に対するＴＮＦ‐αの影響を示す棒グラフである。図９Ａは、ＨＵＶＥＣにおけるＫＤＲ／ｆｌｋ−１ｍＲＮＡ発現のＴＮＦ‐ αにより誘導されるダウンレギュレーションの経時的ノーザンブロット解析の写真である。時間の点は、図９Ｂに示されているように左から右にかけて０時、１時、２時、３時、６時、１２時、２４時である。図９Ｂは、図９Ａの写真に示したＫＤＲ／ｆｌｋ−１ｍＲＮＡ発現のＴＮＦ ‐αにより誘導されるダウンレギュレーションの経時的結果を示す棒グラフである。図１０Ａは、ＨＵＶＥＣにおけるＫＤＲ／ｆｌｋ−１ｍＲＮＡ発現のＴＮＦ ‐αにより誘導されるダウンレギュレーションの用量‐応答実験のノーザンブロット解析の写真である。図１０Ｂに示されているように、左から右にかけて１ng ／ml、０．１ng／ml、１ng／ml、１０ng／ml、５０ng／ml、１００ng／mlのＴＮＦ−αを使用した。図１０Ｂは、図１０Ａの写真に示したＨＵＶＥＣにおけるＫＤＲ／ｆｌｋ−１ｍＲＮＡ発現のＴＮＦ‐αにより誘導されるダウンレギュレーションの用量‐ 応答実験の結果を示す棒グラフである。図１１は、アクチノマイシンＤ（ＡＣＤ）がＨＵＶＥＣにおいてＫＤＲ／ｆｌｋ−１のＲＮＡレベルに及ぼす影響を示すグラフである。図１２は、それぞれＴＮＦ−αで０時間、１２時間、２４時間処理したＨＵＶＥＣにおけるＫＤＲ／ｆｌｋ−１タンパク質の免疫沈降解析の写真である。ＫＤＲ／ｆｌｋ−１ゲノムクローンの単離と特性決定ヒトおよびマウスのゲノムライブラリーのスクリーニング逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって、ＨＵＶＥＣ全ＲＮＡから５６７ｂｐのヒトＫＤＲ／ｆｌｋ−１ｃＤＮＡ断片を生成した。この断片を［α‐³²Ｐ］ｄＣＴＰで放射標識し、ベクターλＦｉｘＩＩ(Stratagene，L a Jolla，CA)中のヒト胎盤ゲノムＤＮＡのファージライブラリーをスクリーニングするのに使用した。同様に、ＲＴ−ＰＣＲによってマウス肺全ＲＮＡから４５１ｂｐのマウスＫＤＲ／ｆｌｋ−１ｃＤＮＡを生成し、ベクターλＤａｓｈＩＩ(Stratagene)中のマウス胎盤ゲノムＤＮＡのファージライブラリーをスクリーニングするのに使用した。ハイブリダイズするクローンを各ライブラリーから単離・精製し、標準的手法に従ってファージＤＮＡを調製した。細胞培養およびｍＲＮＡの単離ＢＡＥＣを単離し、１０％ウシ胎児血清(HyClone，Logan，UT)、６００μｇのグルタミン／ml、１００ユニットのペニシリン／mlおよび１００μｇのストレプトマイシン／mlを補充したDulbecco改良Eagle培地(JRH Biosciences，Lenexa，K S)で培養した。３〜５日毎に細胞を継代し、４〜８継代の細胞をトランスフェクション実験に用いた。Ｓａｏｓ−２ヒト骨肉腫細胞（ＡＴＣＣＨＴＢ−８５）、ＨｅＬａヒト類表皮癌腫細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−７９２３）、ＨｅｐＧ２ヒト肝癌細胞（ＡＴＣＣＨＢ−８０６５）、ヒト繊維芽細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ −１６３４）、Ｕ９３７ヒト組織球リンパ腫細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−７９３９）、ＲＤヒト胚性横紋筋肉腫細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−１３６）、ＭＣＦ７ヒト乳腺癌細胞（ＡＴＣＣＨＴＢ−２２）、ＪＥＧ−３ヒト絨毛腺癌細胞（ＡＴＣＣＨＴＢ−３６）、Ａ７ｒ５ラット胎児大動脈平滑筋細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ −１４４４）、およびＮＩＨ３Ｔ３マウス繊維芽細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１６５８）はAmerican Type Culture Collectionから入手した。一次培養ＨＵＶＥＣはClonetics Corp.(San Diego，CA)から入手し、２％ウシ胎児血清(Clonetics) を含有するＥＧＭ培地で増殖した。一次培養ヒト大動脈および腸平滑筋細胞もCl onetics Corp.から入手した。細胞は、平滑筋細胞に用いた培地には２５mMのＨＥＰＥＳ(Sigma，St．Louis，MO)を補充し、ＨＵＶＥＣは２％のウシ胎児血清を含有するＥＧＭ培地で培養した点を除いてすべてＢＡＥＣと同じ条件下で培養した。一次培養細胞を４〜６日毎に継代し、３〜５継代の細胞を解析した。グアニジニウムイソチオシアネート抽出および塩化セシウムによる遠心分離によって、培養細胞の全ＲＮＡを調製した。ＤＮＡ配列決定ヒトおよびマウスのＫＤＲ／ｆｌｋ−１ゲノムファージクローンに由来する制限断片を、標準的な技術を用いてpSP72(Promega，Madison，WI)またはpBluescri pt II SK(Stratagene)にサブクローニングし、SEQUENASE（登録商標）２．０ＤＮＡポリメラーゼ(United States Biochemical，Cleveland，OH)を用いたジデオキシチェインターミネーション法によって、アルカリ変性した二本鎖プラスミド鋳型から配列決定した。ＤＮＡは両方の方向から少なくとも二回配列決定し、ｄＧＴＰとｄＩＴＰの両方の配列決定プロトコルを用いてヒトおよびマウスのＫＤＲ／ｆｌｋ−１遺伝子の高度にＧＣに富む５′側フランキング領域の圧縮人工構造を排除した。配列決定解析はＧＣＧソフトウェアパッケージ(Genetics Comp uter Group，Madison，WI)を用いて実施した。プライマー伸長解析プライマー伸長解析は公知の方法、たとえばFenら，1993，Biochemistry 32:7 932-7938の方法に従って実施した。ヒトＫＤＲ／ｆｌｋ−１ｃＤＮＡ（図１Ａ）の５′端と相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマー（５′CTGTCTAGAGAAGG AGGCGCGGAGGTGGAACT３′、配列番号９）の末端を［γ‐³²Ｐ］ＡＴＰで標識し、２０μｇの各ＲＮＡサンプルとハイブリダイズさせた後、これを逆転写にかけた。伸長産物は８％変性用ポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析した。リボヌクレアーゼ保護アッセイＴ７ＲＮＡポリメラーゼ(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)を用いたα‐³²Ｐ標識アンチセンスＲＮＡのin vitro転写のための鋳型として、ヒトＫＤＲ／ｆｌｋ−１遺伝子の５５９ｂｐのＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断片（図２Ｂ）をpS P72でクローン化した。ゲル精製したリボプローブ（５×１０⁵ cpm）を２０μｇの全ＲＮＡまたは３μｇのポリＡＲＮＡ＋１７μｇの酵母ｔＲＮＡと、２０mM のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４０、４００mMのＮａＣｌ、１mMのＥＤＴＡおよび０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを７５％ホルムアミド中に含有するアニーリングバッファー中において５５℃で１６時間ハイブリダイズさせた。ＲＮＡがアニーリングした後、ハイブリダイズしたＲＮＡを、１０mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５０、３００mMのＮａＣｌ、５mMのＥＤＴＡを含有するバッファー中において、２００ＵのＲＮＡｓｅＴ１(Boehringer Mannheim)および０．３ＵのＲＮＡｓｅＡ(Boehringer Mannheim)により室温で４５分間消化した。次いで、消化生成物をプロテイナーゼＫで処理し、フェノール：クロロホルムで抽出し、４％変性用ポリアクリルアミドゲルで電気泳動させることによって解析した。ノーザン解析培養細胞の全ＲＮＡ（１０μｇ）を１．３％ホルムアルデヒド‐アガロースゲルで分画し、ニトロセルロースフィルターに移した。ヒトＫＤＲ／ｆｌｋ−１ｃＤＮＡプローブをランダムプライミングにより³²Ｐで標識した後、この標識したプローブを用いてフィルターにハイブリダイズさせた。次いでフィルターをKo dak XARフィルム上で−８０℃で１６時間オートラジオグラフィーにかけた。プラスミドプラスミドpGL2 BasicおよびpGL2 Controlはホタルルシフェラーゼ遺伝子(Pro mega)をもっていた。pGL2 Basicはプロモーターをもっていなかったが、pGL2 Co ntrolはＳＶ４０のプロモーターおよびエンハンサーによって駆動されていた。プラスミドpSV73GAL(Promega)はＳＶ４０のプロモーターおよびエンハンサーによって駆動されるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子をもっていた。ヒトＫＤＲ／ｆｌｋ−１の５′側フランキング領域の断片を含有するリポーター構築物をpGL2 Basicに挿入し、５′および３′方向の（転写開始部位からの）断片の長さに従って名前を付けた。たとえば、プラスミドpGL2-4kb+296では、転写開始部位の５′側約−４ｋｂから位置＋２９６まで伸びるヒトＫＤＲ／ｆｌｋ −１プロモーター断片がpGL2 Basicに挿入されていた。精製したファージＤＮＡを、５′のＢａｍＨＩ部位およびＰｖｕＩＩ部位と３′の位置＋２９６にあるＸｈｏＩ部位とを用いて制限消化することによって、プラスミドpGL2-4kb+296およびpGL2-900+296をそれぞれ創製した。プラスミドpGL2-716+268、pGL2-570+268、 pGL2-323+268、pGL2-225+268、pGL2-164+268、pGL2-37+268、pGL2-225+127、pGL 2-225+105、pGL2-225+56、およびpGL2-225+5は、ヒトＫＤＲ／ｆｌｋ−１のＰＣＲによって生成したプロモーター断片から創製した。プラスミドpGL2-116+268、 pGL2-95+268、pGL2-77+268、pGL2-60+268、およびpGL2-12+268は、プラスミドpG L2-164+268中に含まれているプロモーター断片を、エキソヌクレアーゼIII(Phar macia Biotech，Piscataway，NJ)により５′端から消化することによって創製した。プラスミドpGL2 GATA-MUTは、プラスミドpGL2 GATA-MUTではｂｐ＋１０８から＋１１０までが変異していることを除いて、pGL2-225+268と同一であった。すべての構築物を５′端から３′端まで配列決定して配向と配列を確認した。突然変異誘発 Higushi ら，1988，Nucleic Acids Res．16:7351-7367の方法を用いたＰＣＲによって、ヒトＫＤＲ／ｆｌｋ−１の５′フランキング領域の最初のエキソン内に位置する異型ＧＡＴＡ配列の位置指定突然変異誘発を実施した。ヒトＫＤＲ／ｆｌｋ−１の−２２５〜＋２６８ｂｐまでを含有するＤＮＡ断片を鋳型として用いた。一組のミスマッチプライマー５′TCTGGCAGCCTGGTCGTCCTCTCCTA３′（配列番号１０）および５′TAGGAGAGGACGACCAGGCTGCCAGA３′（配列番号１１）ならびに鋳型の両端につながる一組のプライマー５′TGCCTCGAGTTGTTGCTCTGGGATGTT３ ′（配列番号１２）および５′TGTAAGCTTGGGAGCCGGTTCTTTCTC３′（配列番号１３）を用いて配列TGGATATCをTGGTCGTCに変異させた。突然変異させたＰＣＲ断片の配列はジデオキシチェインターミネーション法によって確認した。トランスフェクションＡ７ｒ５細胞を除いてすべての細胞タイプは業界で公知のリン酸カルシウム法によってトランスフェクトした。Ａ７ｒ５細胞はＤＯＴＡＰ(Boehringer Mannhe im)を用い、製造業者の指示通りにしてトランスフェクトした。いずれの場合も、２０μｇの適当なリポーター構築物を２．５μｇのpSVβgalと共にトランスフェクトしてトランスフェクション効率の相違を補正した。トランスフェクションの４８時間後洗剤溶解法(Promega)によって細胞抽出物を調製した。EG&G Autolu mat 953測光器(Gaithersberg，MD)とPromegaルシフェラーゼアッセイ系により、すべてのサンプルについて二度ずつルシフェラーゼ活性を測定した。β‐ガラクトシダーゼ活性は公知の方法、たとえばLee ら，1990，J．Biol．Chem．265:104 46-10450を用いてアッセイした。各サンプルにおけるルシフェラーゼ活性とβ‐ガラクトシダーゼ活性との比を、規格化されたルシフェラーゼ活性の尺度として用いた。この規格化されたルシフェラーゼ活性をpGL2 Controlの活性で除算し、相対ルシフェラーゼ活性として表わした。各構築物を少なくとも六回トランスフェクトし、各構築物のデータを平均±ＳＥＭとして表わす。構築物間の相対ルシフェラーゼ活性を分散の要因解析の後Fisherの最小有意差試験によって比較した。統計的有意差はｐ＜０．０５で許容された。ヒトおよびマウスのＫＤＲ／ｆｌｋ−１ゲノムクローンの単離と特性決定ヒト胎盤ファージライブラリーのヒトＫＤＲ／ｆｌｋ−１ｃＤＮＡプローブによる最初のスクリーニングによって陽性クローンが得られ、これを制限酵素ＤＮＡマッピング、サブクローニングおよび配列決定によって検査した。プロモーターと最初のエキソンの７８０ｂｐ配列を図１Ａに示す。同様に、マウスＫＤＲ／ｆｌｋ−ＩｃＤＮＡプローブを用いてマウス胎盤ファージライブラリーをスクリーニングし、ひとつのクローンを同定して特性決定した。マウスＫＤＲ／ｆｌｋ −１プロモーターの配列を図１Ｂに示す。ヒトＫＤＲ／ｆｌｋ−１の転写開始部位の同定ヒトＫＤＲ／ｆｌｋ−１遺伝子の転写開始部位を同定するために、＋２１２〜＋２４３ｂｐまでに相当する相補的オリゴヌクレオチドプローブ（図１Ａで矢印の下線を付した）を用いてプライマー伸長を実施した。ＨＵＶＥＣおよびＨｅＬａ細胞の全ＲＮＡならびにＨＵＶＥＣのポリＡＲＮＡについてプライマー伸長を実施した。遺伝子転写は内皮細胞でのみ開始されることが判明した（図２Ａ）。翻訳開始部位、すなわちメチオニン開始コドンの５′側３０３ｂｐに位置するヌクレオチドに対応する単一の転写開始部位が同定された。このヌクレオチドを＋１とした。この転写開始部位を配列ＣＣＣＴＧＣＡＣＴＧＡ（配列番号１４）中で太字にして強調して示す（図１Ａおよび２Ａ参照）。この位置の５′ＣＡ３′ ヌクレオチド対は転写開始に関して最も良く見られる部位である。このプライマー伸長研究の結果を確認するために、位置＋１４６から伸びる５５９ｂｐのゲノムＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断片（図２Ｂ、このＰｓｔＩ部位は図１Ａで二重の下線を付した）から生成したアンチセンスリボプローブを用いてリボヌクレアーゼ保護解析を実施した。このプローブを、ＨＵＶＥＣポリＡＲＮＡおよびＨＵＶＥＣ全ＲＮＡと共に、ＨｅＬａ細胞の全ＲＮＡは非存在下で、インキュベーションしたところ、３′ＰｓｔＩ部位とプライマー伸長で同定された転写開始部位との間の距離に相当する長さの単一の断片が保護された（図２Ｃ）。ＴＡＴＡコンセンサス配列がないにもかかわらず、ヒトＫＤＲ／ｆｌｋ−１遺伝子の転写は翻訳開始コドンの５′側３０３ｂｐに位置する単一の部位（図１Ａ、曲がった矢印）から始まることが判明した。シス作用性配列の同定ヒトＫＤＲ／ｆｌｋ−１遺伝子の５′フランキング配列はＧ残基とＣ残基に富む領域を含有しており、転写開始部位の近くのＴＡＴＡボックスとＣＣＡＡＴボックスを欠いている（図１Ａ）。この５′フランキング配列と転写因子データベース(Transcription Factors Database)内の配列と比較したところ、ヒトＫＤＲ／ｆｌｋ−１のヌクレオチド−１２４と−３９との間に位置する一連の５つのＳｐ１部位が明らかになった。２つのＡＰ−２コンセンサス部位が−９５および− ６８の位置にあり、２つの逆方向ＮＦκＢ結合エレメントがＳｐ１部位の間にある−１３０と−８３の位置にある。２つの異型ＧＡＴＡコンセンサス配列（いずれもＧＧＡＴＡＴ）がＫＤＲ／ｆｌｋ−１プロモーター中に存在しているが、ひとつは−７５９の位置に、もうひとつは最初のエキソンの非翻訳部分内の＋１０７の位置にある。加えて、多数のＣＡＮＮＴＧエレメントがプロモーター内の一５９１，−１７５、＋７１、および＋１８４の位置にある。このＣＡＮＮＴＧエレメントにはＥ−ｂｏｘ結合タンパク質が結合することができる。角質細胞内で優先的に発現する遺伝子の中に保存されている配列ＡＡＡＣＣＡＡＡがヒトＫＤＲ／ｆｌｋ−１の−５０８の位置に存在する。ヒトとマウスのＫＤＲ／ｆｌｋ−１プロモーターを比較して核タンパク質で保存されているコンセンサス配列を同定した（図１Ｂ）。２種間で保存されているエレメントとしては、報告されたマウスｃＤＮＡ配列の５′端に対して−２４４と−１２４の位置にある２つのＳｐ１部位、−１６８と−１４８の位置にある２つのＡＰ−２部位、−１５３の位置にある非逆方向ＮＦκＢ部位、および−１９５の位置にある角質細胞エレメントＡＡＡＣＣＡＡＡがある。異型のＧＡＴＡエレメント（ＧＧＡＴＡＡ）がマウスプロモーターの最初のエキソンの非翻訳部分内で＋１８の位置にあり、異型のＧＡＴＡエレメント（ＧＧＡＴＡＴ）がヒトプロモーター内に同様に位置している。また、ＣＡＮＮＴＧ配列が、ヒトプロモーターの−１７５の位置にあるＣＡＮＮＴＧエレメントの位置に類似するマウスＫＤＲ／ｆｌｋ−１の位置−２５７にあるプロモーターのＧとＣに富む配列の１２ｂｐ５′側に存在する。これらのエレメントの種にまたがった保存は、これらの調節エレメントが機能上の意義をもっていることを示唆している。ヒトＫＤＲ／ｆｌｋ−１プロモーターの欠失解析内皮細胞におけるＫＤＲ／ｆｌｋ−１の基底発現にとって重要なＤＮＡエレメントを同定するために、プロモーター領域に順次の５′欠失を含む一連のルシフェラーゼリポータープラスミドを構築した（図３Ａおよび３Ｂ）。pGL2 Basic中のこれらのプラスミド構築物を（トランスフェクション効率の相違を補正するために）pSVβgalと共にＢＡＥＣにトランスフェクトし、ルシフェラーゼ活性をＳＶ４０プロモーター／エンハンサーによって駆動されるpGL2 Controlベクターの活性に対して規格化した。−４ｋｂ〜＋２９６ｂｐにまたがっている最長のヒトＫＤＲ／ｆｌｋ−１ゲノム断片の活性は強力なＳＶ４０プロモーター／エンハンサーの活性と類似しており、内皮細胞における高レベルのＫＤＲ／ｆｌｋ−１ｍＲＮＡ発現と一致している。同様なレベルの活性が、１５．５ｋｂの５′フランキング配列を含有する構築物で生じた。−４ｋｂ〜−２２５ｂｐから順次５′欠失させたものは、プロモーター活性が有意に変化することなく、この領域のエレメントがＫＤＲ／ｆｌｋ−１プロモーターの基底活性に重要ではないことを示している。−２２５〜−１６４ｂｐの間から配列を欠失させると、ＫＤＲ／ｆｌｋ −１プロモーター活性は、完全なプロモーター断片の活性の６３％にまで大幅に低下した（ｐ＜０．０５）。これらのデータは、この領域に正の調節エレメントが存在することを示している。ＡＰ−２部位をひとつとＮＦκＢ部位をひとつ含有する配列である−９５〜−７７ｂｐの間から欠失させると、さらに活性が大きく低下してpGL2-4kb+296の活性の２０％にまでなった。（ｐ＜０．０５）。オーバーラップするＡＰ−２／Ｓｐ１部位を含有する領域である−７７〜−６０からさらに塩基対を欠失させると、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１プロモーター活性は大きく低下してpGL2-4kb+296の５％未満であった（ｐ＜０．０５）。このように、５′ 欠失解析により、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１プロモーター中の多くの正の調節エレメントがこの遺伝子の高レベル発現に必要であることが判明した。上記欠失解析は、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１遺伝子の５′フランキング領域内の３つの配列が内皮細胞における発現に重要なエレメントを含有していることを示している。ヒトＫＤＲ／ｆｌｋ−１遺伝子中のこれら３つの正の調節エレメント内に位置するＳｐ１、ＡＰ−２、ＮＦκＢ、およびＥ−ｂｏｘタンパク質に対して可能な結合部位はまた、マウスの５′フランキング配列中にも存在しており、したがってこれらが機能的な結合ドメインであることを示唆している。ＡＰ−２は内皮細胞遺伝子調節において立証された役割を果たすことなく発生上調節されるトランス作用性因子である(Mitchell ら，1991，Genes & Dev．5:105-119)。ＮＦ κＢは内皮細胞において血管細胞接着分子−１および組織因子の誘導可能な発現をトランス活性化する(Iademarco，1992，J．Biol．Chem．267:16323-16329; Mo ll ら，1995，J．Biol．Chem．270:3849-3857)と考えられ、組織特異的遺伝子調節のメディエーターであることが知られている(Lenardo ら，1989，Cell 58:22 7-229）。Ｅ−ｂｏｘモチーフに結合する核タンパク質にはトランス作用性因子の基本的なヘリックス−ループ−ヘリックスファミリーが包含される。Ｅ−ｂｏｘ結合性タンパク質は内皮細胞遺伝子発現と明らかに関連してはいないが、このファミリーのメンバーは骨格筋およびＢリンパ球を含めて多くの細胞タイプの適格な成熟化にとって極めて重要である(Buskin ら，1989，Mol．Cell．Bio．9:26 27-2640; Murre ら，1989，Cell 58:537-544)。ヒトＫＤＲ／ｆｌｋ−１の最初のエキソン内の配列が基底発現にとって重要であるかどうかを決定するために、完全なプロモーター活性を保有している最小の構築物であるベクターpGL2-225+268から３′を欠失させた一連の構築物を作成した（図４Ａおよび４Ｂ）。＋１０５〜＋１２７ｂｐにわたる断片（配列番号４）の欠失によりプロモーター活性が５倍低下した（ｐ＜０．０５）が、これはこの領域に正の調節エレメントが存在していることを示している。ヒトＫＤＲ／ｆｌｋ−１の＋１０５〜＋１２７ｂｐ間に位置する異型ＧＡＴＡ部位の機能上の重要性も検査した。断片−２２５〜＋２６８内のＧＡＴＡモチーフの３つの塩基対をＰＣＲによってＧＴＣＧに変異させて変異体ｐＧＬ２ＧＡＴＡ−ＭＵＴを創製した。ＧＡＴＡモチーフ中のこれらの塩基対の変異により、エンドセリン−１遺伝子プロモーターにおけるＧＡＴＡ−２結合活性が失われる。対照的に、天然のpGL2-225+268プロモーター構築物と比較して、突然変異させた異型ＧＡＴＡ配列を含有するpGL2 GATA-MUT構築物を有するＢＡＥＣではプロモーター活性が大きく低下することはなかった（ｐ＜０．０５、図５）。 GATAタンパク質ファミリーの4種の亜鉛フィンガー含有転写因子は、コンセンサス配列(A/T)GATA(A/G)に結合し、多くの細胞系譜において細胞型特異的遺伝子発現を調節する(Orkin，1992，Blood 80:575:581)。これらの中でも、GATA-2は、内皮細胞の遺伝子発現に最も密接に関連している。GATA-2は、エエンドセリン −１遺伝子発現のエンハンサーとして機能し、内皮細胞へのフォンビルブラント因子の発現を制限するように作用する。ヒトKDR/flk-1 の５′側フランキング領域は、-759位および+107位に２つの潜在的なGATA結合配列を有することがわかった。-759位に位置するエレメントの欠失は、内皮細胞におけるKDR/flk-1の発現に何の影響も及ぼさなかった。+107位にある潜在的なGATAエレメントは、現在では強力な正の調節エレメントとして同定されている第1エクソンの領域に位置する（配列番号４）。このGATA結合配列（GGATAT）は、エンドセリン−１およびビルブラント因子のGATA結合配列およびコンセンサスGATA配列(A/T)GATA(A/G)とは異なるが、このデータは、そのGATA結合配列が、+105〜+127の領域における機能性モチーフであることを示唆する。その理由は、フォンビルブランド因子遺伝子中の機能性GATA部位が同様に第1エクソンに位置すること、および同じようなGAT AエレメントがマウスKDR/flk-1遺伝子の第1エクソンに見出されることによる。このエレメントにおける３kbの突然変異（GATA→GTCG）は、エンドセリン−１プロモーターにおけるでGATAシス作用性エレメントのトランス活性化を阻害することが観察されているが、この突然変異は、KDR/flk-1プロモーター活性に対して著しい効果を全く有さないことがわかった（図５）。したがって、欠失分析および突然変異誘発の研究からは、ヒト・プロモーター中の上記２つのGATA配列の、内皮細胞における高レベル活性における機能的役割は支持されない。これらの観察から、ヒトのKDR/flk-1遺伝子の発現にはGATAタンパク質以外の転写因子が必要であることが示唆される。 KDR/flk-1プロモーターにより誘発される高レベルの発現は内皮細胞に特異的である KDR/flk-1発現はin vivoでは内皮細胞にかぎられているが、だからといって、必ずしも培養下ではその発現が内皮細胞に限定されるであろう、ということにはならない。或る組織培養系が、KDR/flk-1遺伝子の細胞型特異的調節の研究に好適であるか否かを調べるために、培養下で種々の細胞から抽出されたRNAのノーザン分析を行った。KDR/flk-1のメッセージはHUVECでは検出されたが、初代培養細胞（ヒト大動脈および腸平滑筋細胞および繊維芽細胞）またはヒト細胞系（RD 、HeLa、HepG2、MCF7、およびU937）では検出されなかった（図６Aおよび６Bを参照）。同様に、KDR/flk-1メッセージは、HeLa、A7r5または３T3細胞ではRT-PC Rによって検出されなかった。したがって、組織培養下でのKDR/flk-1メッセージの発現は、in vivoにおいてと同様に、内皮細胞に限られると思われる。 KDR/flk-1遺伝子の５′側フランキング配列が、培養細胞において内皮細胞特異的発現を付与するできるか否かを調べるために、ｐGL2-4kb+296（4kb以上のヒトKDR/flk-1 の５′側フランキング配列を含有し、かつ、第１エクソンの非翻訳部分の大部分を含有する）を、培養下で種々の細胞型にトランスフェクトした（図７）。PGL2-4kb+296プロモーター断片によって駆動されるリポーター遺伝子の発現は、強力なSV40プロモーター／エンハンサーによって駆動されるものと類似していた。しかし、JEG-3、Saos-2、A7r5、３T3、およびHeLa細胞では、pGL2-4k b+296プロモーターによって駆動される発現は著しく低い。このことから、これらのプロモーター配列による高レベルの発現の誘発が、内皮細胞に特異的であることが実証される。同じような発現パターンが、15.5kbのKDR/flk-1 ５′側フランキング配列を含有するリポーター・プラスミドを用いて観察された。これらのデータは、内皮細胞におけるKDR/flk-1プロモーターの活性が上記の強力なSV40プロモーター／エンハンサーの活性と類似していること、および、この高レベルの活性は内皮細胞に特異的であり、他の細胞型での活性は著しく低いことを示す。KDR/flk-1遺伝子を発現しない細胞型のin vitroでの一過性トランスフェクション・アッセイにおいて、低いが検出可能なプロモーター活性が観察された。したがって、上記15.5kbの５′側フランキング領域の外側にある他のサイレンサー・エレメントは、内皮細胞以外の細胞においてプロモーター活性を完全に阻止するのに必要でありうる。あるいはまた、正常なクロマチン構造に関してのプロモーターの状況が遺伝子の正確な調節にとって重要であるかもしれない。上記の結果から、KDR/flk-1の組織特異性の調節には、既知で広範に分布する核因子と他の未確定のエレメントとの複雑な相互作用が含まれることが示唆される。TNF- αはKDR/flk-1およびflt1の発現をダウンレギュレートする細胞培養およびｍＲＮＡの単離初代培養HUVECおよびHEECをClonetics Corp.(San Diego，CA)から入手し、ゼラチンでコートした組織培養プレートに入れた、20%ウシ胎児血清（Hyclone，Loga n，UT）、30mgの内皮細胞増殖物質（ECGS，Collaborative Biomedical，Bedford ，MA）、25mgのヘパリン、600(g/mlのグルタミン、100ユニット/mlのペニシリン、および100(g/mlのストレプトマイシンを補足したM199培地で増殖させた。ウシ大動脈内皮細胞(BAEC)を単離し、10%のウシ胎児血清を補足したダルベッコの改良イーグル培地（JRH Bioschiences，Lenexa，KS）で培養した。初代培養細胞を４〜６日毎に継代し、初代培養から３〜６代目の細胞について実験を行った。これらの細胞を密集するまで増殖させた後、それらを無血清(serum-deprived)培地（5%ウシ胎児血清を補足し、ECGSを含有しないM199培地）に入れた。組換えヒト TNF-α（Genzyme，Cambridge，MA）をアリコートに分け、使用するまで-80℃で保存した。培養細胞からの全ＲＮＡは、グアニジウムイソチオシアネート抽出および塩化セシウムによる遠心分離によって調製した（Sambrookら、1989，Molecu lar Cloning: A Laboratory Manual，第2版、Cold Spring Harbor Laboratory P ress，Cold Spring Harbor，New York）。ノーザン分析ＲＮＡブロットは記載のようにしてハイブリダイズした（Liら、1995，J．Biol ．Chem．270:308-312）。培養細胞からの全ＲＮＡ（10(g)を1.3%ホルムアルデヒド−アガロースゲル上で分画し、ニトロセルロース・フィルターに移した。ｃＤＮＡプローブは、ランダム・プライミングによって³²Ｐで標識し、上記フィルターにハイブリダイズするのに用いた。次いでフィルターを洗浄し、コダック（Ko dak)XARフィルム上で４〜８時間にわたって-80℃でオートラジオグラフィーに供した。フィルターは、５０％ホルムアルデヒド溶液中で80℃で放射活性プローブを外し、末端標識した18SリボゾームＲＮＡオリゴヌクレオチドで再度ハイブリダイスして、ローディングのための補正を行った。フィルターをスキャンし、Im ageQuantソフトウエアで処理するPhosphorlmager（Molecular Dynamics，Sunnyv ale，CA)で放射活性を測定した。ＲＮＡローディングにおける差を補正するために、上記ｃＤＮＡプローブにハイブリダイズするＲＮＡサンプルの各々についてのシグナル強度を、１８ＳリボゾームＲＮＡプローブにハイブリダイズするサンプルの各々についてのシグナル強度で除した。プラスミド 567bpのヒトKDR/flk-1 のｃDNA断片を、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT- PCR）（Sambrookら，1989，Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第2版，C old Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York）により、先述したようにして（Pattersonら，1995，J．Biol．Chem．270:2311-23118）、ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)の完全ＲＮＡから作製した。このヒトflt1のＣＤＮＡクローンは、寛大にも、Timothy Quinn博士（University of California，S an Francisco）より提供していただいた。核ラン・オン(nuclear run-on)分析密集したHUVECをビヒクル（対照）またはTNF-α（１ng/ml）のいずれかで18時間にわたって処理した。続いて、Perrellaら（Perrellaら、1994，J.Biol．Chem． 269:14595-14600）に記載されているようにして、これらの細胞を溶解し、核を単離した。核懸濁液（200(l)を、CTP、ATPおよびGTPの各0.5mMおよび20(Ciの³² Ｐ標識UTP（3000 Ci/mmol，DuPont/NEN，Boston，MA)と一緒にインキュベートした。サンプルをフェノール／クロロホルムで抽出し、沈殿させ、ハイブリダイゼーション緩衝液に同じカウント／分／mlで再懸濁した（15ｘ１０⁶カウント／分／ml）。ニトロセルロース・フィルター上にドット・ブロットした変性プローブ（１(g)を、そのサンプルと、40℃で４日間にわたってホルムアミドの存在下でハイブリダイズした。KDR/flk-1およびβ−アクチン遺伝子に対するｃＤＮＡをプローブとして用いた。これらのフィルターをスキャンし、ImageQuantソフトウエアで処理するPhosphorlmageで放射活性を測定した。KDR/flk-1プローブにハイブリダイズしているサンプルの量を、β−アクチン・プローブにハイブリダイズしているサンプルの量で除し、補正した密度を、対照からの変化（％）として報告した。免疫沈降密集した単層になっているHUVECを、２４時間にわたって血清除去し、所定の時間にわたってTNF-α（1ng/ml）またはビヒクルで処理した。これらの細胞を³⁵ S−メチオニン（100(Ci/ml、DuPont/NEN)と一緒に2時間にわたってインキュベートし、RIPA緩衝液中で４℃で10分間にわたって溶解した。不溶性画分を沈殿させた後、タンパク質抽出物をプロテインＡセファロース（0.1(g/(1，Pharmacia Bi otech，Piscataway，NJ）で１時間にわたって４℃で前洗浄し、続いて遠心分離し、上清を回収した。全部の細胞溶菌液中のタンパク質濃度を、改変ローリー法 (midified Lowry Procedur; DCプロテインアッセイ; BioRad，Melville，NY)により測定し、サンプルのSDS-ポリアクリルアミドゲル分画および続いて行われるクーマシー・ブルー染色により確認した。タンパク質のサンプル（500(g)を、免疫沈降緩衝液（50mM Tris-Cl,pH8.0、150mM NaCl、0.1% SDS、１NP40、0.5%ソジウムデオキシコレート、２mM EDTA、0.5mM DTT、0.02% アジ化ナトリウム）＋４ mg/ml BSAで１（g/(lに希釈し、４℃で１時間にわたって穏やかに振盪した。特異的な抗体を50(g/(lの濃度になるように添加し、サンプルを４℃で1.5時間にわたって振盪した。プロテインＡセファロース（10(g)を添加し、振盪を1.5時間にわたって継続した。遠心分離により抗原−抗体−プロテインＡセファロース結合体を取り出し、免疫沈降緩衝液で４回洗浄した。この結合体をLaemmli緩衝液中で100℃で５分間にわたって変性し、７％SDS-ポリアクリルアミドゲル上でサイズ分画し、次いで、減圧乾燥し、オートラジオグラフィーに供した。オートラジオグラムは、Howtek Scanmaster 3+（Hudson，NH）により、Adobe Photoshop 3. 0を用いてスキャンし、Scion Image 1.55を用いて、免疫沈降したタンパク質を定量した。［³Ｈ］チミジンの取込みゼラチンでコートした24穴組織培養プレート中でほぼ密集するまで増殖させたHU VECから血清除去し、ビヒクルまたはTNF-α（１ng/ml）で12時間にわたって前処理した後で、組換えヒトVEGF(10ng/ml、Collaborative)またはビヒクルを添加した。細胞をVEGFで24時間にわたって処理し、VEGF処理の最後の３時間の間にメチルー［³Ｈ］チミジン（DuPont/NEN）で１（Ci/mlで標識した。標識した後、細胞をリン酸緩衝液で洗浄し、冷却した10％トリクロロ酢酸中に固定し、95％エタノールで洗浄した。取り込まれた［³Ｈ］チミジンを0.2Ｍ NaOHに抽出し、液体シンチレーション・カウンターで測定した。値は、２つの別個の実験からの6個のウエルの平均値±SEMとして表した。統計学的分析適切である場合、画像分析および［³Ｈ］チミジン取込みからのデータは、平均値±SEMとして表した。複数の処理群の統計学的分析は、平方偏差の階乗分析( factorial analysis)、および続いて行われるフィッシャーの最下位差分検定法( least significant difference test)によって行った。統計学的有意性はｐ＜0. 05で認めた。 VEGF誘発内皮細胞増殖に対するTNF-αの効果 TNF-αは、ウシ大動脈内皮細胞に対する酸性および塩基性の繊維芽細胞生長因子のマイトジェン作用を鈍化することが以前に実証されている（Frater-Schrode rら、1987，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:5277-5281）。TNF-αがさらに、ヒト内皮細胞に対するVEGFの増殖効果も阻止するか否かを調べるために、HUVECをヒト組換えVEGFで刺激した後で、ＤＮＡ合成用マーカーとしての［³Ｈ］チミジン取込みを測定した。無血清HUVECでは、TNF-α単独によりFrater-Schroderらが用いたのと同様の濃度で前処理することにより（Frater-Schroderら、1987，Pro c．Natl．Acad．Sci．USA84:5277-5281）、［³Ｈ］チミジンの取込みは、ビヒクルで前処理したHUVECと比較してわずかに低下した（図８）。対照の細胞と比較して、VEGF処理単独では、先に実証されているように（Connollyら，1989，J.Cl in．Invest．84:1470-1478）、HUVECにおける［³Ｈ］チミジンの取込みは2. 3倍へと大きく促進された。しかし、TNF-αによるHUVECの前処理は、ＤＮＡ合成におけるVEGAの効果を全体的に破壊する。これらの結果から、TNF-αがHUVECのV EGFへの増殖応答を阻止することが実証される。 HUVEC におけるTNF-αによるVEGF受容体ｍRNAのダウンレギュレーション 5.7kbのKDR/flk-１ｍRNAはHUVEC内に構成的に発現される(Pattersonら．，199 5,J.Biol.Chem.270:2311-23118)。また7.0kbのflt1ｍRNAは培養中のHUVECにより豊富に発現される。HUVECをTNF-α(10ng/ml)で処理すると、両受容体(KDR/flk-1 およびflt1)のｍRNAが減少した。この減少は6時間以内に明らかとなり、24時間処理後には、KDR/flk-1およびflt1はそれぞれ0時での値の23％および33％となった(図9A及び図9B)。この作用がTNF-αのみによるものであり、血清の欠乏によるものではないということが、血清欠乏下で24時間ビヒクルとのみ処理した対照サンプルと比較して示された。すなわち、血清の欠乏のみでは実際にKDR/flk-1およびflt1のどちらのメッセージもわずかに誘導された。これら2つの受容体のダウンレギュレーションがTNF-αにより誘導されるｍRNA産生の一般的な減少によるものであるという可能性を除外するために、同様のブロットをヒトヘパリン結合上皮増殖因子様因子(HB-EGF)プローブとハイブリダイズさせた。これらの条件下で、TNF-αはHB-EGFメッセージの2相的な増加を誘導した。この結果は以前の実験の結果と一致する（Yoshizumiら.,1992，J.Biol.Chem.267(14):9467-9469）。TNF-αの作用は静脈起源の内皮細胞に特異的なものではないことを示すために、ヒト大動脈内皮細胞(HEAC)を用いて同様の実験を行なった。HEACにおいても両受容体についてそのメッセージが同様に激しく減少することがわかった。KDR/fl k-1のメッセージはまたウシ大動脈内皮細胞においてもTNF-αにより減少し、これによりTNF-αの作用が種特異的でないことが分かる。 TNF-αはまたKDR/flk-1およびflt1のメッセージをその投与量に依存する形で減少させた(図10Aおよび図10B)。1ng/mlという少量のTNF-αが両受容体のｍRNA をほぼ最大レベルまで阻害し、またKDR/flk-1はHUVECにおいてTNF-αの作用に対しflt1より僅かに感受性が高い。従って、TNF-αはヒト内皮細胞において時間および投与量依存的にVEGF受容体KDR/flk-1およびflt1のｍRNAを特異的にダウンレギュレートする。 TNF- αはKDR/flk-１の転写率を低下させるが、KDR/flk-1の半減期には何の影響も及ぼさない。 TNF-αがｍRNAの分解率を上げることによりKDR/flk-１ｍRNAの定常状態レベルに影響を与えているかどうかを調べるために、KDR/flk-１ｍRNAをアクチノマイシンD（ACD;5μg/ml）の存在下で測定した。KDR/flk-１ｍRNAの半減期はTNF-α 非存在下で1.9時間であり、TNF-α存在下でわずかに2.6時間まで延長した(図11) 。同様の実験において、flt1のｍRNA半減期はHUVECにおいてはTNF-αにより減少しないことが分かった。従って、HUVECにおけるKDR/flk-1およびflt1のｍRNAレベルでのTNF-α誘導による減少はｍRNAの安定性の低下によるものではない。 TNF-αの存在下もしくは非存在下でのKDR/flk-1遺伝子の転写率を測定するために、またこの値を構成的に発現されたβ-アクチン遺伝子の転写率と比較するために、核のラン-オン(run-on)実験を行なった。TNF-αはKDR/flk-1遺伝子の転写率(Phosphorlmager装置で測定)を基準線の40％まで低下させたが、β-アクチンの転写には何の影響も及ぼさなかった。従って、KDR/flk-１ｍRNAのTNF-α誘導による減少はHUVECにおける遺伝子転写率の低下によるものであり、ｍRNAの安定性の変化によるものではない。TNF- αによるKDR/flk-１ｍRNAの減少はそのタンパク質の合成に依存する。 KDR/flk-１ｍRNAの減少にはタンパク質合成が必要かどうかをタンパク質合成阻害剤アニソマイシンを用いて試験した。HUVECにおいて95％以上([³H]ロイシンの取り込みにより測定)のタンパク質合成を阻害する濃度の５倍濃いアニソマイシン濃度(50μmol)を使用した。アニソマイシンのみではこの投与量ではKDR/flk -1発現にほとんど影響を及ぼさなかった。しかし、アニソマイシンによる前処理はKDR/flk-1発現に対するTNF-αの効力を顕著に鈍らせ(29％対65％、ｐ＜0.05) 、HUVECにおいてKDR/flk-1に対するTNF-αの作用は少なくとも一部は新たなタンパク質合成に依存することを示した。これらの結果は、シクロヘキシミドもTNF- αの効力を同様に阻害したので、使用するタンパク質合成阻害剤に左右されるものではなかった。本研究はまた、TNF-αのflt1発現に対する作用も同様にHUVEC においてはタンパク質合成依存的であることを示す。TNF- αはHUVECにおいて新たなKDR/flk-1タンパク質合成を低下させる。 HUVECでの免疫反応性KDR/flk-1タンパク質の産生を確かめるために、およびKD R/flk-１ｍRNAの減少がタンパク質合成の低下に付随するものかどうかを決定するために³⁵Ｓ標識HUVEC溶解物の免疫沈降を行なった。ウサギ抗ヒトKDR/flk-1抗体(Santa Cruz SC-xxx)はKDR/flk-1タンパク質がNIH3T3またはCOS7細胞で発現され、それから免疫沈降されたときのその全長に等しい、約205kDaの分子量を有する単一種の物質を免疫沈降した(Quinnら.,1993,Proc.Natl．Acad.Sci.USA 90(16 ):7533-7537;Millauerら.,1994,Nature 367(6463):576-579)。同じ大きさの物質種が、異なるKDR/flk-1エピトープに対する抗体(Santa Cruz SC-xxy)によって検出されたが、同じようにして転写因子Ｓｐ1に対して誘導したウサギ抗体では検出されず、これはこの相互作用の特異性を示している。HUVECをTNF-αで12時間処理すると、³⁵Ｓ標識KDR/flk-1タンパク質レベルが僅かに(＜40％)、しかし再現可能に上昇するが、このことはTNF-αがKDR/flk-1を翻訳または翻訳後のレベルでも調節するという興味深い可能性を生じさせる。24時間のTNF-α処理後、³⁵ Ｓ標識KDR/flk-1タンパク質レベルは対照のレベルの18％まで減少し、これによりTNF-αに誘導されるKDR/flk-１ｍRNAの減少はKDR/flk-1タンパク質発現における同様の低下に付随することが確認された(図12)。使用本発明のＤＮＡはそれが機能的に結合されているＤＮＡ配列の内皮細胞特異的な転写を促進する。これらのプロモーター配列は内皮細胞に特異的な遺伝子の発現を指令する、または阻害するのに有用である。本発明は実施例1および2で後述するような、動脈硬化といった血管の疾病、並びに癌、例えば固形腫瘍のような非血管性の疾病、リウマチ様関節炎のような炎症性の疾病および糖尿病性網膜症への新規の治療的アプローチの基礎を提供する。本発明はまた次の化合物を同定する方法を提供する。すなわち、(1)VEGF受容体(例えばKDR/flk-1またはflt1)遺伝子発現のTNF-αによるダウンレギュレーション（実施例3、後述）をモジュレートする、または(2)VEGF誘導内皮細胞増殖の TNF-αによる阻害をモジュレートする（実施例4）、化合物である。VEGF受容体遺伝子の発現のTNF-αによるダウンレギュレーションを増強する、またはVEGF誘導内皮細胞増殖においてTNF-αによる阻害を促進することが判明した化合物は、血管新生を阻害する方法に使用できる。また同時にTNF-αによるKDR/flk-1のダウンレギュレーションを増強するかまたはTNF-αによるVEGF誘導内皮細胞増殖の阻害を促進することが判明した化合物は、血管新生を促進する方法、例えば創傷の治癒(例えば骨折、火傷、糖尿病性潰瘍、外傷もしくは手術上の傷の治療)を促進する方法、または末梢血管の疾病、動脈硬化、脳血管疾患、低酸素性組織障害(例えば心臓組織の低酸素障害)、慢性的な皮膚疾患のような糖尿病性病因、または心臓血管の疾患を治療する方法に使用できる。これらの化合物はまた一過性の虚血発作、血管移植手術、バルーン血管形成、凍傷、壊疽、または循環血不良(poo r circulation)といった状態を有する、もしくは有していた患者の治療に使用できる。実施例5に記載するように、TNF-αによるダウンレギュレーションに必要なKDR/flk-1遺伝子のシス作用性配列の同定によりこれらの症状のさらなる治療法の基礎が提供される。実施例１：遺伝子治療本発明は血管性疾患の遺伝子治療処置に使用できる。本発明のＤＮＡは単独で、または血管壁の細胞、すなわち内皮細胞中で異種遺伝子(例えばKDR/flk-1以外のタンパク質をコードする遺伝子)を発現するベクターの一部として、動脈硬化のような血管性疾患の遺伝子治療に使用できる。このＤＮＡまたは対象物のポリペプチドをコードする配列を含むベクターを内皮細胞に導入すると、この内皮細胞が対象物のポリペプチドを産生する。例えば、t-PAをコードする配列(Pennica ら．,1982,Nature301:214)、p21細胞周期インヒビター(El-Deiryら.,199 3,Cell 75:817-823)、または酸化窒素シンターゼ(Bredtら.,1990,Nature 347: 768-770 )は本発明の内皮細胞特異的プロモーター配列に機能的に結合し、内皮細胞において発現され得る。例えば、血栓溶解剤は血管内(例えば異所凝血塊により閉塞した血管内)で血管内皮細胞により発現させるために、内皮細胞特異的プロモーター配列の制御下で発現させることができる。他の異種タンパク質、例えば平滑筋細胞の増殖を阻害するタンパク質、例えばインターフェロン-γおよび心房性ナトリウム尿排泄増加ポリペプチドは内皮細胞に特異的に発現し、これらの治療用ペプチドを動脈硬化病変または動脈硬化病変となる危険性のある部位(例えば傷ついた血管)へ確実に送達し得る。本発明の内皮細胞特異的プロモーター配列は末梢血管の疾病または冠動脈疾患などの疾患を治療するために血管新生を促進する遺伝子治療にも使用できる(Isn erら.,1995,Circulation 91:2687-2692)。例えば、本発明のＤＮＡを血管新生を促進する細胞増殖因子(例えばVEGF、酸性繊維芽細胞増殖因子、または塩基性繊維芽細胞増殖因子)をコードする配列に機能的に連結させることができる。本発明によると、本発明のＤＮＡは転写されるべきコード配列に十分に近接して位置しており、このため内皮細胞におけるポリペプチドの直接発現を指令するように機能する。例えば、配列番号1,2および3は転写開始部位の5'側に位置するのが好ましく、配列番号４は転写開始部位の3'側に位置するのが好ましい。しかし、これらの配列は内皮細胞特異的プロモーター活性が保持される限りは転写開始部位に対して任意の位置にあってよい。実施例２：アンチセンス治療本発明のＤＮＡはまたアンチセンス治療にも使用できる。アンチセンス治療は動物、例えばヒト患者に本発明の内皮細胞特異的プロモーター配列を含有するＤＮＡを投与して行われ、このプロモーター配列はＤＮＡ配列、すなわち(転写されてアンチセンスＲＮＡとなる)アンチセンス鋳型に機能的に連結されている。該アンチセンスＲＮＡは特定のｍRNA配列の一部に相補的となるように設計された短い(一般的には10以上のヌクレオチド、好ましくは14以上で、100までまたはそれ以上のヌクレオチドからなる)ヌクレオチド配列でありうる。このアンチセンス鋳型は本発明のプロモーター配列より下流に位置するのが好ましい。ポリＡテイルは典型的にはアンチセンス配列の末端に位置してこの配列の終結のシグナルとなる。アンチセンス技術に関する標準的な方法はMelaniら(Cancer Res．51: 2897-2901,1991)により記載されている。ＤＮＡ配列がアンチセンスＲＮＡに転写された後、該アンチセンスＲＮＡは細胞内でその標的となるｍRNA分子に結合してその翻訳を阻害し、該ｍRNAでコードされるタンパク質の発現をダウンレギュレートする。例えば、KDR/flk-１ｍRNAに一部または全体的に相補的なアンチセンス配列(Termanら.,1991,Oncogene 6:1677-1683)は、KDR/flk-1の発現を阻害し、次いで血管新生も阻害するだろう。こうしたアンチセンス治療は癌の治療に使用することが可能で、特に固形腫瘍部位、並びに血管新生により引き起こされる、もしくは血管新生により悪化する他の病理的症状(例えばリウマチ性関節炎のような炎症性疾患、および糖尿病性網膜症)における血管新生を阻害するために使用できる。他の内皮細胞タンパク質の発現もまた同様の方法で阻害され得る。例えば、本発明のＤＮＡを以下の内皮細胞タンパク質(すなわち細胞周期タンパク質(内皮細胞の増殖を阻害することで血管新生も阻害する)；フォンウィルブラント因子のような凝固因子；並びにＩＣＡＭ-1およびＶＣＡＭ-1といった内皮細胞接着因子 (Bennettら.,1994,Ｊ．Immunol.152:3530-3540)の発現を阻害し得るアンチセンスＲＮＡに転写される、アンチセンス鋳型に機能的に連結できる。遺伝子治療またはアンチセンス治療のために、標準的なベクターおよび／または遺伝子送達系を用いて、本発明のＤＮＡを動物、例えば患者の標的細胞中に導入することができる。適切な遺伝子送達系はリポソーム、受容体媒介送達系、裸ＤＮＡ、並びにヘルペスウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ-随伴ウイルスなどのウイルスベクターを含み得る。遺伝子治療またはアンチセンス治療のために体内の特定の部位へ核酸を送達するには、Williamsら(199 1,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:2726-2729)によって記載されるようなバイオリスティック(biolistic)送達系を使用することができる。単離ＤＮＡを用いて細胞をトランスフェクトする一般的な方法は、当分子生物学分野における当業者に公知である。動脈硬化の進行を阻止するかもしくは軽減させるための、または血管新生を阻止するための遺伝子治療もしくはアンチセンス治療は本発明のＤＮＡを患者に直接投与することにより、またはex vivoで本発明のＤＮＡを用いて内皮細胞をトランスフェクトし、このトランスフェクトした細胞を患者に投与することにより行なうことができる。ＤＮＡまたはトランスフェクトした細胞を製剤学的に許容可能な担体と共に投与しても良い。製剤学的に許容可能な担体は動物に投与するのに適した生物学的に適合性のビヒクル、例えば生理食塩水である。治療に有効な量とは、処置した動物において医学的に所望の結果をもたらし得る本発明のＤＮＡの量を指す。医学分野で公知のように、いずれの患者への投与量も患者の体重、体表面積、年齢、投与されるべき特定の化合物、性別、投与時間および投与経路、罹病時の健康状態、および他の同時に投与される薬剤を含む、多くの因子に左右される。投与量は様々であるが、ＤＮＡの静脈内投与に好適な投与量はＤＮＡ分子およそ10⁶〜1 0²²コピーである。本発明の組成物は局所的に、または全身に投与され得る。投与は一般に非経口的に(例えば静脈内投与)行われるが、例えば内部もしくは外部標的部位へのバイオリスティック送達により、または動脈内の部位へのカテーテルによりＤＮＡを直接的に標的部位に投与してもよい。実施例３：ＶＥＧＦ受容体（ＫＤＲ／ｆｌｋ−１またはｆｌｔ１）遺伝子の発現のＴＮＦ−αによるダウンレギュレーションをモジュレートする化合物の同定上述したように、ＴＮＦ−αは、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１及びｆｌｔ１遺伝子（各々ＶＥＧＦ受容体をコードする）の発現をダウンレギュレートする。従って、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１またはｆｌｔ１の発現のＴＮＦ−αによるダウンレギュレーションを増強することは、内皮細胞の増殖を低下させ、その結果、血管新生等のプロセスを抑制するのに有効である。逆に、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１またはｆｌｔ１の発現のＴＮＦ−αによるダウンレギュレーションを抑制することは、血管新生を促進するために内皮細胞の増殖を増加させるのに有効であり、傷の治癒を促進するのに望ましく、また、末梢血管疾患の治療にとって望ましいと思われる。内皮細胞の増殖のモジュレーションは、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１またはｆｌｔ１の発現のＴＮＦ−αによる抑制を阻止または増強する化合物を投与することにより達成できる。そのような化合物は、合理的な薬剤設計からランダムな化合物のスクリーニングまで様々な方法により同定することが可能である。後者の方法を実施するための簡単でなお且つ迅速なアッセイが利用可能であるため、後者の方法が好ましい。この分析に対しては、小さい有機分子が望ましい候補化合物である。これは、多くの場合においてこれらの分子が原形質膜を通過できるためであり、その結果ＫＤＲ／ｆｌｋ−１またはｆｌｔ１遺伝子の細胞内発現のＴＮＦ−α によるダウンレギュレーションをモジュレートできる可能性を有するからである。ＫＤＲ／ｆｌｋ−１またはｆｌｔ１のＴＮＦ−αによるダウンレギュレーションをモジュレートする能力について、小さな膜透過性有機分子を以下のようにスクリーニングする。ＫＤＲ／ｆｌｋ−１またはｆｌｔ１を発現している細胞（例えば、HUVEC）をＴＮＦ−α及び候補化合物の存在下にて培養する。（リポーター遺伝子に機能的に連結されたＫＤＲ／ｆｌｋ−１（またはｆｌｔ１）プロモーターを含む細胞も、このプロモーターがＴＮＦ−αの不在下にて細胞内で活性であるという条件で、この方法に使用できる。）これらの細胞におけるＫＤＲ／ｆｌｋ−１（またはｆｌｔ１）の発現レベル（例えば、ノーザンブロット分析（先の記載を参照）、ＲＮアーゼプロテクション分析、または他の標準的な方法にて測定）を、候補化合物は用いないが、ＴＮＦ−αの存在下にて培養した細胞における発現レベルと比較する。ＫＤＲ／ｆｌｋ−１（またはｆｌｔ１）の発現が増加すれば、ＫＤＲ／ｆｌｋ −１（またはｆｌｔ１）の発現のＴＮＦ−αによるダウンレギュレーションを阻止する化合物が同定されたことになる。上述したように、このような化合物は、傷の治癒を促進させるために用いることができるだけでなく、内皮細胞の増殖または血管新生の増強が望まれる症状（例えば、末梢血管疾患）の治療にも用いることができる。血管新生が望まれる特定の症状の一つは、心臓血流の中断を伴うものである。このような状況下では、心臓組織に対する損傷を防御すると思われる自然の血管新生プロセスがＴＮＦ−αによって妨げられることがある。ＫＤＲ／ｆｌｋ−１（またはｆｌｔ１）の発現が低下すれば、ＫＤＲ／ｆｌｋ −１の発現のＴＮＦ−αによるダウンレギュレーションを増強する化合物が同定されたことになる。このような化合物は、内皮細胞の増殖低下または血管新生の低下が望まれる症状の治療に用いることができる。例えば、このような化合物で治療することにより、腫瘍の増殖を抑制することができる。所望の効果（即ち、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１またはｆｌｔ１の発現のＴＮＦ−αによるダウンレギュレーションの増強または抑制）を有すると同定された化合物を、当業者に公知の適切な内皮細胞増殖モデル及び血管新生モデルにおいてさらに試験することができる。本発明の方法を用いて同定された治療用化合物を、個々の化合物に対して適切な任意の方法（例えば、経口、静注、非経口、経皮、経粘膜）で患者に投与してもよいし、化合物の効果が望まれる部位またはその近傍へ手術または埋め込みにより（例えば、生体適合性かつ再吸収性の固体または半固体マトリックスの形状に化合物を成形して）投与してもよい。例えば、充分な量の化合物を吸収させて血管新生を局所的に増加させるべく皮膚へ直接塗布できる軟膏や経皮パッチを使用してもよい。この方法は、皮膚の傷に適用するのに最も一般的である。化合物を含む軟膏は局所的に塗布でき、新しい血管の形成を局所的に誘導することによって、その領域の酸素添加を向上させ、傷の治癒を早める。治療量は、各化合物に対して具体的に決定されるが、多くの場合０．００１〜１００．０mg/kg体重の範囲で投与するか、あるいは当業者によって臨床上適切であると見なされた範囲で投与する。実施例４：ＶＥＧＦにより誘導される内皮細胞の増殖に及ぼすＴＮＦ−αの効果をモジュレートする化合物の同定上述したように、ＴＮＦ−αはＶＥＧＦにより誘導される内皮細胞の増殖を抑制する（例えば、図８及びこれに対応する本文参照）。従って、ＶＥＧＦにより誘導される内皮細胞の増殖に及ぼすＴＮＦ−αの効果をモジュレートする化合物を、血管新生等の内皮細胞の増殖に関連する症状の治療に使用することができる。このような化合物は、上述の方法を用いて同定できる。例えば、候補化合物の存在下または不在下にてＶＥＧＦ及びＴＮＦ−αと共に内皮細胞を培養し、候補化合物が内皮細胞の増殖に影響を与えるかどうかを、例えば、[³H]チミジンの取り込みをモニターすることで測定することにより、判定できる。上述したように、所望の効果（即ち、ＶＥＧＦにより誘導される内皮細胞の増殖のＴＮＦ−αによる抑制を増強または抑制する効果）を有することが判明した化合物を、当業者に公知の適切な内皮細胞増殖モデル及び血管新生モデルにおいてさらに試験することができる。この方法を用いて同定した化合物を、実施例３で述べたように患者に投与する。ＶＥＧＦの不在下における内皮細胞の増殖に及ぼすＴＮＦ−αの効果をモジュレートする化合物を同定するために、この方法をＶＥＧＦを添加せずに行うこともできる。実施例５：ＴＮＦ−αによるダウンレギュレーションに必要なＫＤＲ／ｆｌｋ− １遺伝子に含まれるシス作用性エレメントの同定ＴＮＦ−αによるダウンレギュレーションに必要なＫＤＲ／ｆｌｋ−１遺伝子に含まれるシス作用性エレメント（ＴＮＦ−α応答性エレメント）の同定、並びにＴＮＦ−α応答性エレメントと相互作用するトランス作用因子の同定は、血管新生、血管疾患及び傷の治癒等の内皮細胞の増殖に関連する症状をモジュレートする新規な治療法の開発の基礎になると思われる。遺伝子のシス作用性エレメントの同定、並びに対応するトランス作用因子の同定は、当該技術分野において標準的な方法を用いて行う（例えば、Sambrookら， 1989，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Sprin g Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York; Ausubelら編，Cu rrent Protocols in Molecular Biology，Wiley & Sons，New York，1989を参照）。例えば、出発点として、調節因子と結合する可能性のある遺伝子の領域を同定するために、ＤＮＡｓｅＩ高感受性実験を行うことができる。シス作用性エレメント（例えば、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１遺伝子に含まれるＴＮＦ−α応答性エレメント）の正確な配列の同定は、標準的なプロモーター欠失分析を用いて行うことができる。ＫＤＲ／ｆｌｋ−１配列（この配列に機能的に連結されているリポーター遺伝子にＴＮＦ−αによるダウンレギュレーションを付与する）を含む構築物は、トランスフェクトされた細胞においてリポーター遺伝子の発現に及ぼすＴＮＦ−αの影響が低減するまで、５’欠失、３’欠失、及び／またはネステッド欠失(nested deletion)により順次欠失させることができる。上述のようなプロモーター欠失構築物を用いて、この分析を開始することができる。欠失試験により同定したＴＮＦ−α応答性エレメントの正体を確認するために、全長プロモーターの状況下で標準的な方法を用いてこのエレメントに点突然変異を導入することができる。次いでＫＤＲ／ｆｌｋ−１のＴＮＦ−α応答性エレメントを、該エレメントに結合し、そのためＫＤＲ／ｆｌｋ−１のＴＮＦ−αによるダウンレギュレーション経路の構成要素と考えられるトランス作用因子を同定するための道具として用いることができる。タンパク質がこのエレメントに結合するかどうかの判定には、標準的なＤＮＡフットプリント法及び／または朱変性のゲルシフト分析を行うことができる。ＴＮＦ−α応答性エレメントに結合するトランス作用因子を同定するために、該エレメントを標準的なタンパク質精製法においてアフィニティー性試薬として用いるか、あるいは発現ライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして用いることができる。トランス作用因子が同定されたら、例えば、トランス作用因子の結合抑制剤のスクリーニングより開始して、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１遺伝子に含まれるＴＮＦ−α応答性エレメントへの結合のモジュレーションを検討することができる。トランス作用因子またはそれをコートする遺伝子（例えば、遺伝子治療用のベクターに含まれる）を投与することにより、患者におけるＫＤＲ／ｆｌｋ−１発現のＴＮＦ−αによるダウンレギュレーションを増強し、血管新生を抑制することが可能となる。さらに、トランス作用因子の活性型が二量体である場合、その活性を抑制するためにトランス作用因子のドミナントネガティブ突然変異体とすることもできる。さらに、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１遺伝子に含まれるＴＮＦ−α応答性エレメントを同定し、その対応するトランス作用因子を同定する際に、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１のＴＮＦ−αによるダウンレギュレーションの経路に含まれるさらに別の構成要素を同定することができる。これらの構成要素の活性のモジュレーションをさらに検討することにより、内皮細胞の増殖や血管新生をモジュレートする別の薬剤と方法を開発することが可能である。本実施例で記載した方法はｆｌｔ１遺伝子を用いて行うこともできる。その他の態様血管新生を抑制するためのアンチセンス療法の他に、本発明のプロモーター配列に含まれるシス作用性結合部位への転写因子（例えば、AP-2、SP-1及びNFκB ）の結合を抑制することにより、内皮細胞においてＫＤＲ／ｆｌｋ−１を発現させることもできる。例えば、転写因子のドミナントネガティブ突然変異体（例えば、AP-1結合部位へ結合するが転写を活性化できないAP-2のドミナントネガティブ突然変異体）を用いて転写を抑制することができる。あるいは、転写因子の生成をダウンレギュレートする化合物（例えば、AP-2及びNFκBの生成をダウンレギュレートするレチノイン酸またはデキサメタゾン）を投与して、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１の発現を抑制することにより血管新生を抑制することができる。その他の実施態様は次の請求の範囲に含まれるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 48/00 ＡＢＮＣ０７Ｋ 14/71 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｑ 1/02 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＸ // Ｃ０７Ｋ 14/71 ＡＤＵ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＩＬ，ＪＰ，ＭＸ，ＮＯ (72)発明者リー，ム−エンアメリカ合衆国 02159 マサチューセッツ州ニュートン，ナーデルロード, 102 (72)発明者ヘーバー，エドガーアメリカ合衆国 03268 ニューハンプシャー州サリスベリー，サウスロード, ピー．オー．ボックス 161

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号１と実質的に同一の配列を含んでなる実質的に純粋なＤＮＡであって、該ＤＮＡに機能的に連結されているポリペプチドコード配列の内皮細胞特異的転写を調節することを特徴とするＤＮＡ。２．前記ＤＮＡが配列番号２と実質的に同一の配列または配列番号３と実質的に同一の配列をさらに含んでなる、請求項１に記載のＤＮＡ。３．前記ＤＮＡが配列番号４と実質的に同一の配列をさらに含んでなる、請求項１に記載のＤＮＡ。４．前記ＤＮＡが配列番号４と実質的に同一の配列をさらに含んでなる、請求項２に記載のＤＮＡ。５．配列番号６と実質的に同一の配列を含んでなる実質的に純粋なＤＮＡであって、該ＤＮＡに機能的に連結されているポリペプチドコード配列の内皮細胞特異的転写を調節することを特徴とするＤＮＡ。６．配列番号５と実質的に同一の配列を含んでなる実質的に純粋なＤＮＡであって、該ＤＮＡに機能的に連結されているポリペプチドコード配列の内皮細胞特異的転写を調節することを特徴とするＤＮＡ。７．前記ＤＮＡがポリペプチドコード配列に機能的に連結されていて、ポリペプチドコード配列の内皮細胞特異的転写を調節するように機能する、請求項１に記載のＤＮＡ。８．前記ポリペプチドコード配列がＫＤＲ／ｆｌｋ−１をコードするものではない、請求項７に記載のＤＮＡ。９．前記ポリペプチドが組織プラスミノーゲン活性化因子、ｐ２１細胞周期インヒビター、酸化窒素シンターゼ、インターフェロン−γおよび心房性ナトリウム利尿ポリペプチドよりなる群から選択される、請求項８に記載のＤＮＡ。 10．請求項８に記載のＤＮＡを含有するベクター。 11．内皮細胞に請求項10に記載のベクターを導入することを含んでなる、ポリペプチドの内皮細胞特異的発現を指令する方法。 12．請求項10に記載のベクターを含有する内皮細胞。 13．動物の動脈を請求項10に記載のベクターと接触させることを含んでなる動物における動脈硬化症の抑制方法であって、前記ポリペプチドが動脈硬化症の発生を低減または予防することを特徴とする方法。 14．前記ポリペプチドが平滑筋細胞の増殖を低減させる、請求項13に記載の方法。 15．配列番号１と実質的に同一の配列を含んでなる実質的に純粋なＤＮＡであって、該ＤＮＡに機能的に連結されているアンチセンス鋳型の内皮細胞特異的転写を調節することを特徴とするＤＮＡ。 16．前記ＤＮＡがアンチセンス鋳型に機能的に連結されていて、アンチセンス鋳型の内皮細胞特異的転写を調節するように機能する、請求項15に記載のＤＮＡ。 17．アンチセンス鋳型が内皮細胞ポリペプチドをコードするｍＲＮＡと相補的である、請求項16に記載のＤＮＡ。 18．内皮細胞ポリペプチドがＫＤＲ／ｆｌｋ−１である、請求項14に記載のＤＮＡ。 19．内皮細胞ポリペプチドが細胞周期タンパク質、凝固因子および細胞接着因子よりなる群から選択される、請求項17に記載のＤＮＡ。 20．動物の腫瘍部位に請求項18に記載のＤＮＡを接触させることを含んでなる動物における癌の治療方法であって、該ＤＮＡが腫瘍部位における血管新生を低減または抑制することを特徴とする方法。 21．血管内皮細胞増殖因子受容体遺伝子の発現のＴＮＦ−αによるダウンレギュレーションをモジュレートする候補化合物の能力を測定する方法であって、 (a) リポーター遺伝子に機能的に連結された血管内皮細胞増殖因子受容体遺伝子のプロモーターを含有する細胞を用意し、 (b) ＴＮＦ−αと候補化合物の存在下で該細胞を培養し、そして (c) 血管内皮細胞増殖因子受容体遺伝子の発現のＴＮＦ−αによるダウンレギュレーションをモジュレートする候補化合物の能力の尺度として該リポーター遺伝子の発現レベルを測定する、ことを特徴とする方法。 22．ＶＥＧＦにより誘導される内皮細胞増殖のＴＮＦ−αによる抑制をモジュレートする候補化合物の能力を測定する方法であって、 (a) 内皮細胞を用意し、 (b) ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦおよび候補化合物の存在下で該細胞を培養し、そして (c) ＶＥＧＦにより誘導される内皮細胞増殖のＴＮＦ−αによる抑制をモジュレートする候補化合物の能力の尺度として内皮細胞増殖のレベルを測定する、ことを特徴とする方法。 23．患者における血管新生を抑制する方法であって、該患者に、内皮細胞内での血管内皮細胞増殖因子受容体遺伝子の発現をダウンレギュレートするＴＮＦ−α 経路を活性化する非ＴＮＦ−α化合物を投与することを特徴とする方法。 24．患者における血管新生を増強する方法であって、該患者に、内皮細胞内での血管内皮細胞増殖因子受容体遺伝子の発現をダウンレギュレートするＴＮＦ−α 経路を抑制する非ＴＮＦ−α化合物を投与することを特徴とする方法。 25．患者における血管新生を抑制する方法であって、該患者に、血管内皮細胞増殖因子受容体遺伝子のプロモーター中のＴＮＦ−α応答性エレメントに結合することによって内皮細胞内での血管内皮増殖因子受容体遺伝子の発現を抑制するポリペプチドを投与することを特徴とする方法。