JPH11509187A

JPH11509187A - 内皮細胞増殖の調節

Info

Publication number: JPH11509187A
Application number: JP9503976A
Authority: JP
Inventors: アンドリューラスター; フィリップレダー
Original assignee: Harvard University
Current assignee: Harvard University
Priority date: 1995-06-22
Filing date: 1996-06-21
Publication date: 1999-08-17
Also published as: CA2225401A1; WO1997000691A1; EP0841935A1; US5824299A

Abstract

(57)【要約】内皮細胞増殖を制御する方法について開示する。同様に、IP-10およびHSPG受容体に対するPF4の結合を阻害する化合物の検出方法も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】内皮細胞増殖の調節発明の背景本発明の分野は哺乳類における内皮細胞増殖の制御である。 IP-10は、インターフェロンーγおよびリポ多糖類によって誘導される豊富なRN Aとして同定され、10 kDaの分泌蛋白質をコードする。これは、分泌された８〜１０kDa蛋白質の-C-X-C-（またはα）ケモカインファミリーの一員で、-C-X-C- ケモカインファミリーの他の２つのメンバーである血小板因子４（PF4）と31％同一で、インターロイキン８（IL-8）と26％同一である。IP-10発現は、乾癬、貼用薬発疹、遅延型皮膚過敏反応、実験的糸球体腎炎のような炎症疾患、および実験的アレルギー性脳骨髄炎では様々な組織において誘導される。 IP-10は、T細胞および単球の化学誘因物質である可能性があり、T細胞を活性化した内皮細胞に接着させる可能性があるが、後者のインビトロ知見に関してはなお論争が続いている。ケモカイン受容体は雑多で、１つ以上のケモカインと結合することが知られており、様々な白血球が１つ以上のケモカイン受容体を有することが知られており、そのために結合データの解釈が難しくなっている。受容体-リガンド相互作用を明らかにするためには、IL-8 A型およびB型、MIP1α/RAN TES、MCP-1、および赤血球ケモカイン受容体を含むいくつかのケモカイン受容体の最近の分子クローニング、および異種細胞における結合ならびにシグナル伝達の実証が重要であった。今日までにクローニングされたケモカイン受容体は全て、G-蛋白質とカップリングした７つの膜通過スパナーファミリーのメンバーで、雑多な赤血球ケモカイン受容体を例外として（これはダフィー血液群抗原である）、活性化に基づき細胞内カルシウムを一過的に上昇させる。しかし、今日まで、IP-10および同定された最初のケモカインであるPF4を含むいくつかのケモカインについて、シグナル伝達受容体は同定されていない。 PF4は、細胞表面ヘパラン硫酸プロテオグリカン（HSPG）と結合することが示されており、TGF-β・細胞表面HSPGをその受容体複合体の一部として利用する塩基性繊維芽細胞増殖因子（bFGF）およびトランスフォーミング増殖因子（TGF-β ）のような増殖因子と置き換わることによって、実際、腫瘍阻害および止血に関するその生物学的効果を発揮する可能性がある。発明の概要一般に、本発明は哺乳類において内皮細胞増殖を阻害する方法を特徴とする。この阻害は、IP-10ポリペプチドの内皮細胞阻害量を哺乳類に投与することによって、またはIP-10ポリペプチドをコードする核酸を哺乳類に投与することによって達成されうる。例えば、内皮細胞増殖が関与する疾患を治療する（例えば、進行を停止または遅らせる）ために、またはそのような疾患の発生を予防するためにIP-10を投与してもよい。好ましい態様において、哺乳類はヒトである。その他の態様において、IP-10は天然型のIP-10またはIP10-AP融合蛋白質である。その他の多様な好ましい態様において、阻害される内皮細胞は内皮腫（例えば、カポジ肉腫、硬化性内皮細胞肉腫、または血管腫）の細胞である。内皮細胞は、腫瘍の血管新生が可能な内皮細胞であってもよく、その場合、腫瘍形成を補助するために必要な内皮細胞増殖を阻害する方法を用いてもよい。もう一つの態様において、本方法を動脈硬化（例えば、アテローム性動脈硬化症病変）の治療に用いてもよい。第二の面において、本発明は、HSPG受容体に対するIP-10結合を減少させることによって、哺乳類において内皮細胞増殖を増加させる方法を特徴とする。好ましい態様において、外傷性損傷または虚血性損傷（例えば、心筋梗塞、脳血管事故、肺動脈塞栓症、網膜動脈壊死、または急性腎不全）を治療する目的で、内皮細胞増殖を増加させる。もう一つの好ましい態様において、以下の１つ以上の治療的有効量の投与によって、IP-10受容体結合を減少させてもよい：ヘパリン、ヘパラン硫酸、IP-10断片（例えば、IP-10のカルボキシ末端の25個のアミノ酸）、IP-10に特異的に結合する抗体、またはHSPG受容体に特異的に結合する抗体。第三の面において、本発明はケモカイン凝集を予防する方法を提供する。本方法は、それによってケモカインポリペプチド配列がアルカリフォスファターゼポリペプチド配列と共有結合する融合蛋白質の構成を含む。融合蛋白質共有結合は、ケモカイン配列が由来する天然型のケモカイン配列と比較して、融合蛋白質が凝集を減少させるように形成される。アルカリフォスファターゼは、アミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかに結合してもよいが、ケモカインのカルボキシ末端に結合することが好ましい。好ましい態様において、ケモカインはIP-10、R ANTES、MIP-1β、またはPF4であってもよい。関連する面において、本発明は凝集が減少したケモカイン融合蛋白質を特徴とする。第五の面において、本発明は細胞に対するIP-10結合を変化させる化合物を検出する方法を特徴とする。本方法は、試験化合物が存在しない細胞に対するIP10 -APの結合を可能にする条件下で、細胞、IP10-APポリペプチド、および試験すべき化合物を化合させることを含む。次に、アルカリフォスファターゼ活性を測定し、アルカリフォスファターゼ活性が変化すれば、化合物がHPSG受容体に対する IP-10結合を制御していることを示している。好ましい態様において、この化合物の内皮細胞増殖阻害能についてさらに調べる。この目的およびその他の目的のために、本明細書に記載のインビボおよびインビトロアッセイを用いて、ペプチドまたは化合物の内皮細胞増殖の制御能を調べてもよい。好ましくは用いられるアッセイは、実施例において提供されるHUVEC増殖アッセイである。第六の面において、本発明は、IP-10ポリペプチドの治療的有効量またはIP-10 をコードする核酸の投与によって、哺乳類においてFGFを阻害する方法を特徴とする。好ましい態様において、IP-10は血管腫、FGF濃度の増加した新生物（例えば、カポジ肉腫、ケロイド、または増殖性網膜障害）を阻害するために投与される。関連する面において、本発明は、治療的有効量のIP-10ポリペプチドまたはIP- 10コード核酸を投与することによって、TGFβを阻害する方法を特徴とする。好ましい態様において、IP-10は、難治性の繊維性炎症またはTGFβ濃度の増加した新生物と診断された、またはそのリスクを有する哺乳類において、TGFβを阻害するために投与される。一般に、IP-10がポリペプチドとして提供されている場合、それは薬学的に許容される担体において投与してもよく、および／または局所注射、連続注入、または静脈内注射によって投与してもよい。IP-10コード核酸による哺乳類細胞の形質転換によってIP-10が提供される場合、一つの好ましい態様においてウイルスベクターを通じて核酸を提供してもよい。「IP-10遺伝子」とは、IP-10ポリペプチドをコードする遺伝子を意味する。IP -10遺伝子は、図11の（配列番号：６）IP-10配列またはその一部と約50％以上の配列同一性を有するサイトカイン遺伝子である。例えば、遺伝子はヒトまたはマウスIP-10ポリペプチドをコードしてもよい。「ポリペプチド」とは、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）の有無によらず、アミノ酸のいかなる鎖も意味する。「実質的に同一」とは、参照アミノ酸配列または核酸配列に対して少なくとも 50％、好ましくは85％、より好ましくは90％、および最も好ましくは95％相同性を示すポリペプチドまたは核酸を意味する。ポリペプチドに関しては、比較配列の長さは一般に、少なくともアミノ酸16個、好ましくは少なくともアミノ酸20個、より好ましくは少なくともアミノ酸25個、および最も好ましくはアミノ酸35個である。核酸に関して、比較配列の長さは一般に、少なくともヌクレオチド50個、好ましくは少なくともヌクレオチド60個、より好ましくは少なくともヌクレオチド75個、および最も好ましくはヌクレオチド110個である。配列同一性は、典型的には配列分析ソフトウェア（例えば、ジェネティックスコンピューターグループ（Genetics Computer Group）の配列分析ソフトウェアパッケージ（Sequence Analysis Software Package）、ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター、1710 University Avenue，Madison，WI 53705）を用いて測定するのが典型的である。そのようなソフトウェアは、様々な置換、欠失、置換、およびその他の修飾に相同性の程度を割り当てることによって同様の配列に適合させる。保存的置換は、典型的には以下の群内での置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。「実質的に純粋なポリペプチド」とは、それが天然に伴う成分から分離された IP-10ポリペプチド（または本明細書に記載のその他のポリペプチド）を意味する。典型的には、ポリペプチドは、それが本来会合している蛋白質および天然型の有機分子を含まず、重量で少なくとも60％であれば、実質的に純粋である。好ましくは、該調製物は、重量で少なくとも75％、より好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも99％である、IP-10、IP10-AP、または本発明の方法で用いられるもう一つのポリペプチドである。例えば、天然資源（例えば、哺乳類細胞）からの抽出によって；ポリペプチドをコードする組換え核酸の発現によって；または蛋白質の化学合成によって、実質的に純粋なポリペプチドを得てもよい。純度は、適当ないかなる方法、例えば、カラムクロマトグラフィーに記述の方法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC分析によって測定することもできる。蛋白質は、その本来の状態でそれに伴う混入物質から分離された場合に、天然会合成分を実質的に含まない。このように、化学合成された、または天然に由来すべき細胞とは異なる細胞系で生成された蛋白質は、それが天然で会合する成分を実質的に含まない。したがって、実質的に純粋なポリペプチドは、真核生物に由来するポリペプチドを含むが、大腸菌またはその他の原核生物で合成されたポリペプチドも含む。「凝集の減少」とは、生理的pHおよび緊張の条件下での自己凝集の減少を意味する。凝集の減少は受容体結合のような生物活性のアッセイによって測定してもよい。下記の実施例４はそのようなアッセイについて示している。「HSPG受容体」とは、ヘパラン硫酸プロテオグリカンを有する細胞表面部分を意味する。好ましくはHSPG受容体は、IP-10が特異的に結合する部分である。より好ましくはHSPG受容体は、下記の実施例に記載の受容体である。「実質的に純粋なDNA」とは、本発明のDNAが由来する生物の天然型ゲノムにおいて、その遺伝子に隣接する遺伝子を含まないDNAを意味する。したがって、この語は、例えば、ベクター；自己複製プラスミドもしくはウイルス；または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれる組換えDNA；またはその他の配列とは無関係な別個の分子（例えば、cDNA、またはPCRもしくは制限エンドヌクレアーゼ消化によって生成されたゲノムもしくはcDNA断片）として存在する組換えDNAを含む。また、別のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAも含まれる。「形質転換細胞」とは、その中に（またはその祖先の中に）組換えDNA技法を用いて本明細書に記載のポリペプチド（例えば、IP-10またはIP10-APポリペプチド）を（本明細書で用いられるように）コードするDNA分子を導入された細胞を意味する。「発現されるよう配置される」とは、DNA分子が配列の転写および翻訳を指向するDNA配列に隣接して位置することを意味する（すなわち、例えばIP-10ポリペプチド、組換え蛋白質またはRNA分子の生成を容易にする）。「融合蛋白質」とは、その有無について解析しうる蛋白質の機能的部分を含むハイブリッドポリペプチドを意味する；そのような部分は、アルカリフォスファターゼ、β-グルクロニダーゼ（GUS）、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコール・トランスアセチラーゼ（CAT）、およびβ-ガラクトシダーゼを含むが、これに限定しない。好ましくはその部分は、アルカリフォスファターゼ蛋白質の機能的断片を含む。「IP10-AP」は、IP-10ポリペプチドとアルカリフォスファターゼ（AP）ポリペプチド双方からのアミノ酸配列を含む融合蛋白質を意味する。好ましくは融合蛋白質は、AP生物活性とIP-10生物活性の双方を有する。最も好ましくは融合蛋白質は、図３Aおよび図３Bに記述の蛋白質である。「生物活性」とは、インビボおよびインビトロの双方において、天然型の蛋白質に起因してもよい活性を意味する。例えば、IP-10は、HSPG受容体への結合、内皮細胞増殖阻害、および腫瘍形成阻害を含む生物活性を有する。「プロモーター」とは、転写を指向するのに十分な最小の配列を意味する。細胞型特異的、組織特異的または外部シグナルもしくは薬剤によって誘発可能となるよう、プロモーター依存的遺伝子発現を調節可能にするために十分なプロモーター要素も本発明に含まれる；そのような要素は天然の遺伝子の５'または３'領域に位置してもよい。「機能的に結合した」とは、適当な分子（例えば、転写活性化蛋白質）が調節配列に結合している場合、遺伝子発現を起こさせるように遺伝子および調節配列が連結されることを意味する。「導入遺伝子」とは、技巧によって細胞内に挿入され、その細胞から発生する生物のゲノムの一部となる、いかなる断片のDNAも意味する。そのような導入遺伝子は、トランスジェニック生物に対して一部または完全にヘテロ接合（すなわち異物）である遺伝子を含めてもよく、または生物の内因性遺伝子と相同または同一である遺伝子を表してもよい。「トランスジェニック」とは、技巧によって細胞内に挿入されたDNA配列を含み、その細胞から発生する生物のゲノムの一部となる、いかなる細胞をも意味する。本明細書で用いられるように、トランスジェニック生物は一般にトランスジェニック植物であり、技巧によりDNA（導入遺伝子）が核またはプラスチドゲノムの中に挿入される。「保存領域」とは、２つ以上のIP-10ファミリーメンバーの間に少なくとも30 ％、好ましくは50％、および最も好ましくは70％のアミノ酸配列同一性を示す６個以上の連続したいかなる区切りのアミノ酸も意味する。「形質転換」とは、細胞内に外来分子を導入するいかなる方法も意味する。例えば、タングステンまたは金粒子のような速度駆動微小推進体、電気穿孔、ウイルス挿入、またはリポソーム輸送を用いて分子を導入してもよい。速度駆動法は、ヘリウム駆動、空気駆動、および火薬駆動技法を含むが、これに限定しない、圧バーストに由来する。バイオリスティック形質転換は、広く多様な細胞タイプ、ならびに細胞内小器官（例えば、葉緑素およびミトコンドリア）、細菌、酵母、真菌、藻類、および動物組織を含むがこれに限定されない完全な組織の形質転換またはトランスフェクションに適用してもよい。「精製抗体」とは、蛋白質およびそれが天然に会合する天然型の有機分子を含まない、重量で少なくとも60％である抗体を意味する。好ましくは該調製物は、重量で少なくとも75％、より好ましくは90％、最も好ましくは99％の抗体、例えばIP-10特異的抗体である。精製IP-10抗体は、例えば、組換えによって産生されたIP-10蛋白質または保存モチーフペプチドおよび標準技法を用いて、アフィニティークロマトグラフィーによって得てもよい。「特異的に結合する抗体」とは、IP-10蛋白質またはHSPG受容体を認識して結合するが、IP-10蛋白質および／またはHSPG受容体を本来含む試料、例えば、生物試料中のその他の分子を実質的に認識せず結合しない抗体を意味する。「HSPG受容体に特異的に結合する」とは、HSPG受容体を認識して結合するが、本来HSPG受容体を含む試料、例えば生物試料中のその他の分子を実質的に認識せず結合しないポリペプチドまたはその他の化合物を意味する。好ましくは、HSPG 受容体に結合するポリペプチドまたはその他の化合物は、１μM Kd以下であり、より好ましくは100 nMであり、さらに好ましくは25 nMであり、最も好ましくは1 00 nMである。「内皮細胞」とは、内皮の細胞を意味する。例えば、血管リンパ管および心臓内壁の扁平細胞は内皮細胞である。好ましくは、内皮腫はカポジ肉腫または血管腫である。「内皮症」とは、内皮細胞の増殖を意味する。「内皮腫」とは、正常な細胞分割制御から外れた内皮細胞を意味する。この定義には、トランスフォームした内皮細胞および不死化した内皮細胞が含まれる。好ましくは、内皮腫はカポジ肉腫または血管腫である。「内皮細胞増殖の阻害」とは、処置した内皮細胞の増殖の程度におけるいかなる減少をも意味する。新生物および動脈硬化の臨床状況では、いかなる減少も治療的に有用であると認識される。減少は、IP-10で処置していない細胞と比較して、好ましくは20％、より好ましくは50％、最も好ましくは95％である。「内皮細胞増殖の増力」とは、処置した内皮細胞の増殖の程度におけるいかなる増加をも意味する。心筋梗塞、外傷性損傷、および虚血の臨床状況では、いかなる増加も治療的に有用であると認識される。増加は、IP-10で処置していない細胞と比較して、好ましくは50％、より好ましくは２倍、最も好ましくは５倍の増加である。本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および請求の範囲から明らかとなると思われる。詳細な説明まず、図面について説明する。図面図1Aおよび1Bは大腸菌rIP-10の発現および精製を示す。図1AはrIP-10の逆層HP LC精製を示す。曲がった矢印はA214クロマトグラム上でのIP-10の位置を示す。図1Bはボルトン-ハンター試薬で125I標識を行ったrhIP-10の12.5% SDS-PAGE(トリス／トリシン)解析を示す。レーン１は¹²⁵I標識したPeproTechのヒトIP-10（N EN/ Dupont）であり、レーン２は図1Aで示されている６つのhisのタグをつけたh IP-1 0である。Kdaでの分子量マーカーがゲルの右に示されている。図2A〜2CはJ558L細胞から分泌された組み換えIP-10の精製を示す。図2Aは逆層 HPLCにより解析される、ヒトIP-10cDNA発現構築体を遺伝子導入したJ558L細胞から集められた血清を含まない条件の培地の、ヘパリンセファロースアフィニティークロマトグラフィーである。上のパネル-規定のNaCl濃度でヘパリンセファロースカラムから段階的に溶出された画分の、クーマシー染色された12.5% SDS-PA GE(トリス／トリシン)。下のパネル-アフィニティー精製されたウサギ抗hIP-10 抗体で染色された同等なゲルのイムノブロット。Ｌ−細胞抽出液、Ｐ−カラム前、Ｆ-カラムフロースルー。番号１、２、３は番号の上に指示されたNaCl濃度で集められた連続的な分画を示す。図2Bはヘパリンセファロースカラムからの1M N aCl溶出物の逆層HPLCプロファイルを示す。図2Cは図2Bで示されたHPLC分画の12. 5% SDS-PAGEを示す。上のパネル-クーマシー染色されたゲル、下のパネル-アフィニティー精製されたウサギ抗血清を用いたイムノブロット。点線矢印は増加するアセトニトリル濃度の方向を示す。棒線矢印はモノマーのIP-10の位置を示す。Kdaでの分子量マーカーがゲルの右に示されている。図2Bの曲がった矢印は図2 Cで示されるHPLC分画のイムノブロットにより決定されたIP-10のピークを示す。図3Aおよび3Bはアルカリフォスファターゼ融合蛋白質（IP10-AP）を示す。図3 Aは哺乳類発現ベクターAPtagの模式図である。図3Bは、図3Aのベクターを遺伝子導入したNIH-3T3細胞からの条件培地をアルカリフォスファターゼに対するモノクローナル抗体を用いて免疫沈殿し、10% SDS-PAGEにかけ、ウサギ抗マウスIP-1 0抗体でイムノブロットしたときの結果である。図4Aおよび4Bは、IP10-AP結合が特異的で飽和可能で、PF4およびヘパリンにより競合されることを示す。図4AはA20 B細胞へのIP10-APの結合を示す。各点において、特異的結合＝（全結合）−（非特異的結合）。図4Bは濃度依存的な阻害を示す。データは結合％＝（競合体の存在下での結合マイナス非特異的結合）/（競合体の非存在下での結合マイナス非特異的結合）Ｘ１００として示されている。図５はIP10-APが細胞表面のIP-10の凝集を阻害することを示す。図6Aおよび6BはIP-10がケモカインに応答するTHP-1細胞系に結合することを示す。図6Aは特異的な結合を示す。様々な競合体の存在下、107 THP-1またはHL60 細胞が15 nMのIP10-APと２時間４℃でインキュベートされた：（なし）；ヒト（h ）およびマウス（m）のIP-10；MIP-1aおよびMIP-1b（THP-1細胞のみ）。細胞はH BSS結合緩衝液で５回洗浄し、細胞に結合するアルカリフォスファターゼ活性について解析した。図6Bはカルシウム流動性を示す。THP-1細胞にFura-2をロードし、連続的に撹拌しながら、３７℃で分光学的な手法により解析した。THP-1細胞に指示された組み換えヒトケモカインを添加することが、矢印により描かれている。すべてのケモカインは２度目のIP-10の添加が100 nMになるように加えられることを除き、最終濃度が10nMとなるように添加された。図７はA20細胞に対するIP10-AP結合のグリコサミノグリカン阻害を示す。107 A20細胞は、15 nMのmIP10-APと、指示された濃度のヘパリン（H）、硫酸ヘパラン（HS）、硫酸コンドロイチンB（CSB）、および硫酸コンドロイチンA（CSA）の存在下で２時間氷上でインキュベートした。細胞はその後洗浄し、結合したIP10 -APについて解析した。図8Aおよび8Bは、IP-10結合部位が、ヘパリナーゼ、塩、トリプシンに感受性であることを示す。図8Aは、106 Balb/c-3T3細胞が、競合体の非存在下（なし）、1mMのmIP-10の存在下、または100mg/mlのヘパリン存在下で、15 nMのmIP10-AP または等量のkit-Apと２時間４℃でインキュベートしたときの結果を示す。図8B は107細胞を室温で５分、0.25%のトリプシン/1mM EDTAでトリプシン処理し、その後15 nMのmIP10-APと２時間４℃でインキュベートし、HBSS結合緩衝液で５回洗浄し、結合したアルカリフォスファターゼ活性をアッセイしたときの結果を示す。結合は同数の非トリプシン処理細胞と並列して決定された。SVECはSV40でトランスフォームした、マウスの内皮細胞系である。図９は、IP10-APが野生型のCHO（K1）細胞と結合するが、硫酸ヘパランの欠損変異CHO細胞（677および803）とは結合しないことを示す。図10Aおよび10Bは、IP-10が内皮細胞の増殖−ヘパリンに拮抗する効果−を阻害することを示す。図10Aは、指示された濃度のhIP-10またはhPF4、5ng/mlのbFG F、および10% FBSの存在下、ヒト臍帯血管内皮細胞（HUVEC's）を96ウェルのプレートに３つずつ同様にまいたときの結果を示す。各ウェルへの[³H]チミジンの取り込み量を３日後に決定した。図10Bは6 X 103のHUVECを、bFGF含有培地、および指示された濃度のヘパリン単独、またはヘパリンに5mg/ml IP-10もしくは10 mg/ml PF4を加えたものとともに、３日間プレートにまいておき、この時間内に取り込まれた[³H]チミジン量を決定したときの結果である。図１１はヒトIP-10ポリペプチド（配列番号：５）および核酸配列（配列番号：６）を示す。I ．導入 IP-10の特質を研究する上での主な問題のひとつは、他のケモカインと同様に（Lodi,P.J.ら、1994、Science 263:1762〜1767；Mantel，C.ら、1993、Proc．N atl．Acad．Sci．USA 90:2232〜2236）生理学的なpHおよび浸透張度において、I P-10が自己凝集することであった。この凝集により特異的かつ飽和しうるIP-10 の細胞結合部位を同定することが阻害されていた。この問題を克服するために、すでに本発明者らは、細胞に結合する能力は保持しているが、生理学的な緩衝液中で凝集しないような、IP-10とアルカリフォスファターゼの融合蛋白質を生成している。この融合蛋白質を用いて、本発明者らはIP-10が細胞表面の硫酸ヘパランプロテオグリカン（HSPG）受容体にKdが25 nMで結合することを示した。この受容体がHSPGの受容体であるという結論は、細胞のIP-10結合がヘパリンおよび硫酸ヘパランにより阻害され、ヘパリナーゼおよびトリプシン処理により排除され、細胞表面HSPGを発現しない変異CHO細胞では結合が起こらないという観察に基づいている。 IP-10のHSPG受容体への結合は特異的な相互作用である。PF4およびある種のグリコサミノグリカンのみが細胞へのIP-10結合と競合する。ヘパリンおよび硫酸ヘパランはIP-10結合部位と競合するという点では同等の能力があるが、硫酸コンドロイチンBは少なくとも100倍その能力が弱く、硫酸コンドロイチンAではこれらの部位に競合することができない。さらに、PF4はIP-10の細胞への結合と競合する点ではヘパリンと能力的に同じであるが、IL-8、RANTES、MIP-1a、MIP-1b 、およびMCP-1はIP-10に対して実質的に阻害効果がない。IL-8はヘパリンに結合し、IP-10との相同性ではPF4とほとんど同様なのだが（26% 対 31%）、IP-10の細胞のHSPG部位に対しては効率よく競合しない。興味深いことに、本発明者らは、ヒトおよびマウスIP-10が、マウスIP10-APおよびヒトIP10-APと細胞への結合を競合することを見いだしており、このことからこれらの種の間では結合特異性に差がないことが示唆される（マウスおよびヒトのIP-10は相互置換可能に用いられうる）。IP10-AP結合を競合する上で、重量を基盤としたときにIP-10がPF4またはヘパリンのいずれかよりも能力が低いこともまた驚くべきことである。この知見は効果的なモル濃度を低下させるIP-10凝集形成と矛盾しない。凝集はまた、IP10-AP が細胞に結合するのに比較して、IP-10が可溶性ヘパリンに結合するときに見いだされる４倍低いKd値を説明しうる。モノマーの融合蛋白質IP-10が細胞に結合するので、IP-10の凝集はHSPG受容体への結合には必要ではない。自己凝集を阻害するのに融合蛋白質を使用するという本発明者らのアプローチは、他のケモカインに対しても使用できる。本発明者らは、IP-10が内皮細胞の増殖を誘導するbFGFを阻害することも示してきた。さらに、ヘパリンはこうした阻害に拮抗し、IP-10の抗増殖効果がこの同じHSPG受容体を通じて仲介されることを示唆している。PF4およびIP-10が共有する特異的なHSPG部位は、これらの受容体複合体の一部としてHSPGを利用する他のサイトカインの機能をこうした分子が調節するような、生理学的に関連する部位であるかもしれない。例えば、PF4はbFGF（Sato，Y.ら、1990、Biochemical & Biophysical Research Communications 172:595〜600）およびTGFb（Whitson， R.H.ら、1991、Journal of Cellular Biochemistry 47:31〜42）の両方の細胞への結合を阻害できる。実際、このことから、PF4およびIP-10が抗増殖効果を発揮するメカニズムであるかもしれず、ケモカインが多数の多様な細胞系に対して有する増殖制御という特質を説明することができる。本発明者らの結果はIP-10に対してもう一つ受容体がある可能性を排除するものではない。しかしながら、本発明者らは、仮にIP-10が末梢血のＴ細胞に対して化学走化性があることが報告されているにせよ（Taub，D.D.ら、1993、Journa l Experimental Medicine 177:1809〜1814）、ヒト末梢リンパ球上にIP-10結合部位を検出できなかった。さらに、本発明者らはIP-10に特異的に結合する細胞においてカルシウム流動を検出できなかった。とはいえ、IP-10をアルカリフォスファターゼに融合することにより、本発明者らがシグナルとなる受容体と相互作用するIP-10の能力を破壊してしまい、一方特異的なHSPG結合部位と相互作用する能力を維持している、という可能性が形式的には残されている。これは可能性はあるとはいえ、非ケモカインではあるにせよ、他のアルカリフォスファターゼ融合蛋白質（例えばヒトおよびマウスIL4（Morrison，B.W.およびP．Leder、1992、Journal of Biological Chemistry 267:11957〜11963）、kit（Flanagan，J.G.およびP ．Leder、1990、Cell 63:185〜194）およびFGFR（Ornitz，D.M.ら、1992、Molec ular & Cellular Biology 12:240〜247）では、特異的な細胞表面の受容体またはリガンドと相互作用する能力を維持している。ヘパリンおよび細胞表面のHSPGのひとつの別の役割は、シグナル受容体鎖に対しサイトカインのシグナリングを増幅することにある。例えば、チロシンキナーゼ受容体FGFRIを通じてのFGFシグナリングでは、可溶型または細胞表面結合型いずれかのHSPGが必要とされる。HSPG受容体であるベータグリカンも、TGFbシグナリングに関与している。ベータグリカンは、シグナリング受容体のセリン/トレオニンキナーゼサブユニットに対して、高親和性を有する３者複合体を形成しつつ、直接的にTGFbを提示する（Lopez-Casillas，F.ら、1993、Cell 73:1435〜14 44）。ヘパリンおよび硫酸ヘパリンは、IL８に対する好中球応答を増強することが示されてきており（Webb，L.M.ら、1993、Proc．Natl Acad Sci U.S.A．90:71 58〜7162）、MIP1bがＴ細胞接着を誘導する能力を増強する(Tanaka，Y.ら、1993 、Nature 361:79〜82)。この増強の機構は検討されたことはないが、実は、細胞表面のHSPGまたは可溶性ヘパリンが、７回膜を貫通する受容体に対してケモカインが結合し、シグナルを送るのに実際に必要とされるのかどうかは不明である。クローン化したケモカイン受容体を遺伝子導入した野生型、およびHSPG欠失CHO 細胞のリガンド結合およびシグナリング特質を比較することによって、この問いには実験的にアプローチがなされうる。ケモカインはヘパリンに結合することが知られており、内皮細胞の分布において免疫反応性のあるMIP1bを見い出した研究から、ケモカインが細胞表面のHSPG に結合することが提案されてきた(Tanaka，Y.ら、1993、Nature 361:79〜82)。本発明者ら自身に仰合することなく、以下の理論が提出される。細胞表面上のHS PGは液層からケモカインを捕捉し、ケモカインの勾配を固定化し確立したものとし、それにより循環している白血球に提示されうることができ、おそらくは化学的走化性またはハポタキシス（hapotaxis）に対する基質として機能する（Rot，A. 、1992、Immunology Today 13:291〜294）。ケモカイン-HSPGの相互作用の特異性は、白血球の帰還（homing）を制御し、白血球を炎症部位に補充するための役割を演じているかもしれない。異なる組織にある内皮細胞上の特定のHSPGの特異的な発現を通じて、または特定の炎症刺激により特定のHSPGの誘導を通じて、こうしたことはなされうる。与えられた微小環境においてある一組のケモカインのみに対する親和性をもつHSPGの発現によって、その微小環境で循環している白血球に提示されるためにこれらのケモカインのみが捕捉されるようにすることになろう。従って、局所的に発現または誘導したHSPGに対する親和性を有するこれらケモカインによって、循環している白血球に対するシグナルをより効果的に伝えることができるようになろう。この仮説はケモカインに対して探求されたものではなく、生物学的応答を指令するHSPG-リガンドの特異性の概念はFGFファミリーに対して確立されてきた（Nurcombe，V.ら、1993、Science 260:103〜106）。 IP-10の構成的な発現は胸腺および脾臓でみられ、高レベルの発現が様々な炎症条件で見られる。それゆえ、IP-10が受容体複合体としてHSPGを使用する他のサイトカインの機能を調節することにより、免疫および炎症応答を制御するという役割を有する可能性がある。IP-10およびPF-4は共におそらくは免疫学的、炎症、および/または脈管の静的な（angiostatic）機構を通じて、腫瘍の増殖を阻害することが示されている（参照として本明細書に組み入れられる、USSN 第07/ 935,587号、1992年８月26日提出、USSN 第08/217,016号、1994年３月23日提出、 Luster，A.D.およびP．Leder、1993、Journal of Experimental Medicine 178:1 057〜1065; Sharpe，R.J.ら、1990、Journal of the National Cancer Institut e 82:848〜853をみよ）。PF4は実際、抗腫瘍薬剤として臨床試験がおこなわれている。予備実験では本発明者らは、腫瘍移植部位にIP-10を注入すると抗腫瘍効果があることを示した。IP-10またはPF4の腫瘍への薬学的輸送を考慮すると、抗腫瘍応答で一部のエフェクター機構でありうる内皮および炎症細胞上ばかりではなく、腫瘍細胞そのものの上でもHSPG受容体が発現されうることが考えにのぼるはずである。II ．内皮細胞の増殖を阻害するためのIP-10の使用上記で言及し下記に示すように（例えば、実施例９参照）、IP-10は内皮細胞の増殖を阻害する。従って、IP-10はこのような細胞増殖を阻害するために、ポリペプチドとして直接的に、または遺伝子導入した核酸を通じて投与されうる。例えば、内皮腫はIP-10の投与により治療されうる。特に、カポシ肉腫および血管腫の進行は内皮組織の増殖速度を下げるIP-10の用量を投与することにより、阻害されうる。IP-10はまた一般的に、腫瘍増殖に必要な血管新生を阻害するために使用されうる（たとえば、肉腫において）。IP-10はまた、動脈硬化症で起こる内皮細胞の増殖を阻害するためにも使用されうる。内皮腫に伴う血管形成阻害に加え、IP-10が別の種類の腫瘍生成に必要な血管形成を防ぎ、停止させ、または遅延させるために投与されうる。例えば、IP-10 は肉腫の血管形成阻害のために投与されうる。内皮細胞の増殖程度を変化させることはインビボのマトリゲル（matrigel）アッセイ（Passanitiaら、Methods in Laboratory Investigation 67:519(1992)）、または内皮細胞管形成アッセイ（Cid，M.ら、J．Clinical Invest．91:977(19 93)）；細胞移動アッセイ（Pepperら、J.Cell Physiol．153:129(1992)）；もしくは細胞増殖アッセイ（下記参照）を用いたインビトロで決定されうる。 IP-10ポリペプチドおよび類似体のカポシ肉腫治療における効果はβFGFマウスモデルを用いてアッセイされうる（Ensoliら、Nature、371:674(1994)）III ．内皮細胞の増殖を増加させるためのIP-10の使用内皮細胞増殖を阻害するIP-10の役割のおかげで、IP-10の機能を阻害することにより内皮細胞の増殖を増加させる方法が提供される。導管化を増幅させることは、導管化を失って苦しんだり、または組織が血液量増加を必要とするといった人に対しては特に有益である。例えば外傷性傷害または局所貧血性傷害（例えば心筋梗塞、大脳血管事故、肺塞栓、網膜動脈壊死、または腎臓衰弱）では、IP-1 0の阻害剤の投与が有益となろう。好ましくは、IP-10の阻害剤はIP-10のHSPG受容体への結合を低下させたり防いだりする阻害剤である。例えば、ヘパリンの投与は通常内因性のIP-10により引き起こされる内皮細胞増殖の阻害を防ぐために使用されうる。硫酸ヘパランもまたこの目的で投与されうる。IP-10に対する抗体またはHSPG受容体も使用されうる。受容体に結合するがIP-10の他の生物学的活性を欠くIP-10断片はIP-10機能を阻害するために使用されうる。好ましくは、カルボキシ断片が使用され、より好ましくは天然に存在するIP-10ポリペプチドの最後の２５アミノ酸が使用される。IV ．FGFおよびTFGβを阻害するIP-10の投与 FGFおよびTGFβはHSPG受容体と結合することがしられている。従って、IP-10 はこれら蛋白質により結合される受容体を阻害するために投与されうる。例えば、IP-10はTGFβにより制御されることが知られているような未決定の炎症および線維状の事象および新生物増殖事象におけるTGFβの機能を阻害するために処方されうる。同様に、IP-10は小児血管腫、カポジ肉腫、ケロイドおよび（糖尿病性網膜傷害および水晶体後方の繊維増殖症のような）増殖性網膜傷害といった状況でFGFを阻害するために投与されうる。V ．IP-10ポリペプチドの治療上の投与クローン化された遺伝子の利用性として、実質的に純粋なIP-10ポリペプチドが標準的な手法を用いて多量に産生されうる(下記、およびScopes，R．Protein Purification: Principles and Practice（蛋白質精製：原理と実際）1982 Spri nger-Verlag，NY参照)。従って、本発明のもう一つの様相は許容される希釈物、単体もしくは賦形剤、および/または単位投薬量の形態でIP-10ポリペプチドを含む調剤物である。内皮腫を有するような、またはさもなくば内皮細胞の増殖低下が望ましいような患者にポリペプチドを投与するための適切な処方または組成物を提供するために、従来の薬学的実施がおこなわれうる。上記に言及したように、実質的に純粋なポリペプチドの調製物とは、細胞内で自然にあるような蛋白質が実質的にない（例えばIP-10を治療上組成物に処方するために必要とされる程度まで）ような調製物である。 IP-10蛋白質の断片または類似体もまた上記に説明したやり方で患者に投与されうる。この目的で有益な断片または類似体は、上記に説明されていることを含み、内皮細胞分化が推奨されうる患者の治療のために有益である。患者の治療上の処置に有益であるような断片および類似体は、他の部分の下記の実施例で提供されるアッセイを使用して決定される。 IP-10ポリペプチドはまた、IP-10ポリペプチドをリガンドまたは受容体蛋白質に融合させたものからなる融合蛋白質、またはその断片であって、IP-10が望ましいように輸送される細胞上の受容体または受容体リガンドと結合するのに十分であるものという形態で患者に投与されうる。本明細書に説明されているIP10-A P融合体はまた、治療上の用量を送るのに凝集低下が必要とされるか望ましいときに使用されうる。 IP-10リガンド融合ポリペプチドは、適切なベクターにコードされる融合体を精製するよう、分子生物学の標準的な手法を用いて産生されうる（Sambrookら、 Molecular Cloning: A Laboratory Manual（分子クローニング、実験室マニュアル）、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York(1989)）。このような遺伝子融合構築物の有益性は他の部分では上記に実験的な手法で、および下記に実施例で説明されている手法を用いて決定されうる。本発明は融合ポリペプチドのみのタイプを単独または薬学的に許容される担体中、投与することを含む。従って、本発明の処方は例えば、非経口投与、静脈内、皮下、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、眼、心室内、膜嚢内、脊髄内、腔内、腹膜内、鼻腔内、エアロゾルまたは経口投与により適用されうる。治療上の処方は液体溶液または懸濁液の形態である。経口投与にたいしては処方は錠剤またはカプセルの形態であってもよく、鼻腔内への処方に対しては粉末、鼻滴またはエアロゾルの形態であってもよい。処方を作るために当業者によく知られる方法は、例えば、「Remington's Phar maceutical Sciences（レミントン薬科学）」に見られるはずである。非経口投与の処方には例えば、賦形剤滅菌水または塩液、ポリエチレングリコールのようなポリアルキレングリコール、野菜由来の脂、または水素と化合させたナフタレンが含まれうる。生物学的に交換可能で、生物分解可能なラクタイドポリマー、ラクタイド／グリコリドのコポリマー、またはポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンの小ポリマーが存在する因子の放出を制御するために使用されうる。他の潜在的に有益な非経口の因子に対する輸送システムとしては、エチレン-ビニルアセテートのコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、埋め込み可能な注入システムおよびリポソームが含まれる。吸入に対する処方には賦形剤例えばラクトース、または例えばポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル、グリココレートおよびデオキシコレートを含む水溶液、または鼻滴液の形態では投与のために油性の溶液であってもよく、または鼻腔内に適用されるためにゲルのようであってもよい。VI ．ウイルスベクターでのIP-10の治療的投与以下の例は本発明を記述するものであるが、限定するものではない。レトロウイルスベクター、または治療的輸送に対し有益な細胞に対する適切なトロピズムを有する、アデノウイルスベクターのようなその他のウイルスベクターは、IL-10ポリペプチドに対する遺伝子導入輸送システムとして用いられうる。一般的に知られるこの目的のための多くのベクターが説明されてきている（Mi ller，Human Gene Therapy（ヒト遺伝子治療）15〜14(1990)；Friedman Science 244:1275〜1281(1989)；EglitisおよびAnderson、BioTechniques 6:608〜614(1 988)；TolstoshevおよびAnderson、Current Opinion In Biotechnology 1:55〜6 1(1990)；Sharp；The Lancet 337:1277〜1278(1991)；Cornettaら、Nucleic Aci d Research and Molecular Biology 36:311〜322(1987)；Anderso、Science 226 :401〜409(1984)；Moen、Blood Cells 17:407〜416(1991)、ならびにMillerおよびRosman、Biotechniques 7:980〜990(1989)）。レトロウイルスベクターは特によく開発され、臨床的な場で使用されてきている(Rosenbergら、N．Engl．J．Me d323:370(1990)）。この目的に有益であるようなレトロウイルスベクター構築物、パッケージングする細胞系、および輸送システムは以下のもののひとつまたはその組み合わせを含むが、それに限定されるものではない：モロニーマウス白血病ウイルスベクター種；自己不活化ベクター；二重コピーベクター；選択マーカーベクターおよび自殺機構ベクターである。IP-10輸送のモロニー白血病レトロウイルスシステムは、非自系治療の自系のために使用されうる造血細胞に対してIP-10蛋白質輸送が標的とするので、特に有益である。 IP-10ポリペプチドの断片または誘導体も、レトロウイルス遺伝子導入治療または別の適切なウイルスベクターシステムにより投与されうる。断片または誘導体は上記に説明されているように定義される。IP-10の有益な断片または誘導体は、上記に説明されているように、遺伝子治療ベクターの完全なIP-10をコードしている遺伝子に代えて、これら断片または誘導体をコードする核酸を挿入することにより投与される。このような構築物は、とりわけ上記に説明されているウイルス感染性におけるIP-10の効果を試験する方法を用いて試験が行われる。VII ．IP-10をコードする核酸の治療的輸送のためのウイルスを用いない方法適切なプロモーターの制御下で、患者のゲノムDNAへの挿入のため、または自律性複製のために必要な適切な配列を含む、IP-10またはその断片をコードする核酸は、以下の遺伝子導入技術を用いて患者に投与されうる：マイクロインジェクション（Wolffら、Science 247:1465(1990)）；リン酸カルシウム導入法（Gra hamおよびVan der Eb、Virology 52:456(1973)；Wiglerら、Cell 14:725(1978) ；Felgnerら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:7413(1987)；リポフェクション（Felgnerら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:7413(1987)；Onoら、Neuroscien ce Lett 117:259(1990)；Brighamら、Am．J．Med．Sci．298:178(1989)；Staubi ngerおよびPapahadjopoulos、Meth．Enz．101:512(1983)；アシアロロソヌコイド-ポリリジン結合体（WuおよびWu、J．Biol．Chem．263:14621(1988)；Wuら、J ．Biol．Chem．264:16985(1989)；バイオリスティック遺伝子導入（biolistic t ransformation）；およびエレクトロポレーション（Neumnnら、EMBO J．7:841(1 980)）。これらの参考文献は参照として本明細書に組み入れられる。VIII ．ケモカイン凝集を防ぐためのアルカリフォスファターゼ融合体の使用本発明者らは、IP-10にアルカリフォスファターゼアミノ酸配列を融合させた者が蛋白質の凝集を防ぎ、さもなくばこの凝集により受容体-リガンド相互作用を検出する能力が阻害されることを示した。AP配列の添加にもかかわらず、IP-1 0はHSPG受容体結合能力および内皮細胞増殖阻止能力を維持していた。この技術は（これとともに提供される組み換えDNA方法を含め）凝集することが知られている他のケモカインに対して、凝集を防ぐAP融合体を作製するために使用されうる。例えば、PF4、RANTES、およびMIP-1βはカルボキシ、またはアミノ末端のいずれかで、APポリペプチド配列に共有結合で結合されうる。全体のケモカイン配列が使用されうる一方、両端に欠損が導入されうることもまた評価されうる。与えられた融合体の有益性は、結合アッセイでAP活性をアッセイし、融合体の一部であるケモカインの生物学的な活性に対する他の知られているアッセイを用いることにより確実なものとされうる。例えば、白血球の化学走化性およびCa²⁺流動（下記参照）が測定されうる。IX ．HSPG受容体を結合する化合物の検出 IP10-AP融合体は、HSPG受容体を有する細胞と組み合わせて、受容体結合部位に対してIP-10と競合することのできる化合物を検出するために使用されうる。このような化合物が内在性のIP-10が結合することを阻害することにより、IP-10 が調節している内皮細胞増殖を増大させるために使用されうることも、評価されるであろう。または、競合する化合物はIP-10の機能を合成的にまねたものとして使用されうる。IP-10の機能を増大または阻害させる化合物もまた、治療的に投与されたIP-10の効果を調節するために用いられうる。競合的結合を検出するために、以下の実施例に提供されるアッセイを使用してもよいし、受容体-リガンド-結合およびアルカリフォスファターゼ活性をアッセイするために知られている他の方法を使用してもよい。 HSPG受容体を結合することが決定されている化合物は、本明細書で提供され当業者に知られるいかなる数のアッセイをもちいても、IP-10および/またはPF4生物学的活性を阻害または増大させる能力に対して特性を決定されてもよい。以下の実施例は説明のために提供されているが、本発明を限定させるためのものではない。X ．実施例１．実験的手順材料。ヘパリンはHepar Inc.、Franklin、OHから得た。硫酸ヘパリン、硫酸コンドロイチンA、硫酸コンドロイチンB、ヘパリナーゼＩ、ヘパリナーゼIII（ヘパリチナーゼＩ）はシグマ社(Sigma)から得た（カタログ番号はそれぞれH-7541 、C-0914、C-2431、H-2519、およびH-889）。組み換え（r）ヒトIL-8はGenzyme から購入し、ヒトrMIP-1a、MIP-1b、RANTES、およびMCP-1はPeproTechから購入されうる。ヒトrPF4はRepligenにより供給された。細胞系および細胞培養。以下の例外をのぞき、細胞系はAmerican Type Cultur e Collectionから得た。SV40で形質転換したマウス内皮細胞系SVEC（O'Connell ，K.A.およびM．Edidin、1990、Journal of Immunology 144:521〜525）はA．Li chitman博士、Brigham and Women's Hospital、Boston、MAから入手し；さらにC H O K1、803および677細胞はJ．Esko博士、University of Alabama、Birmingham、 Alaから入手した。803および677細胞系は変異体CHO細胞であり、硫酸ヘパラン（ HS）合成を欠損しており、CHO-K1という親株の野生型CHO細胞から由来する（Esk o，J.D.、1992、Adv Exp Med Biol 97〜106）。変異体803は5%〜10%の残存HSおよび標準レベルの約半分の硫酸コンドロイチンを産生する。変異体677はHSを合成せず、３倍硫酸コンドロイチンを過剰発現し、その結果硫酸化されたグリコサミングリカンの全量が677および野生型細胞に匹敵するようになっている。変異体677は硫酸ヘパラン鎖のポリマー化に必要とされる酵素であるN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼおよびグルクロノシルトランスフェラーゼの両方を欠いている（Lidholt，K.ら、1992、Proceedings of the National Academy o f Sciences of the United States of America．89:2267〜2271）。ヒト末梢血リンパ球およびナイロンウールに吸着しない白血球はRobert Finberg、Dana Far ber Cancer Institute、Boston、MAにより快く提供された。白血球は10%胎児ウシ血清（FBS）（Sigma）を添加したRPMIで増殖させ、線維芽細胞系およびSVEC細胞は10%富養化子ウシ血清（Sigma）を添加したDMEM（Sigma）で増殖させ、ヒト臍帯血管内皮細胞（HUVEC's）（Clonetech）は10%熱不活化FBSおよび5ng/ml塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）（R&D Systems，Minneapolis、MN）M199（Gibco ）で増殖させ、野生型および変異体CHO細胞は10%FBSを添加したHamOs F12培地（ Gibco）で増殖させた。すべての培地には50U/mlのペニシリン、50mg/mlのストレプトマイシンおよび2mMのL-グルタミンを添加し、さらにマウス白血球系では57m Mの2-メルカプトエタノールを添加した。すべての細胞は37℃および5%CO₂で維持した。骨髄細胞は（Celada,A.ら、1984、Journal of Experimental Medicine 16 0:55〜74）に説明されているように、病原体を持たないメスのFVBマウスの大腿骨から回収したもので、マクロファージを得るために30%L-細胞条件培地（M-CSF の供給源）および20%FBSで２週間維持するか、肥満細胞を得るために50%WEHI条件培地（IL-3の供給源）で４週間維持した（Razin,E.ら、1984、Journal of Imm unology 132: 1479〜1486）。蛋白質の発現および精製。推定上の成熟N末端のIle（塩基番号129）ではじまり、C末端のPro（塩基番号359）で終結する組み換えマウスIP-10（2）、および成熟 N末端のVal（塩基番号132）ではじまり、C末端のPro（塩基番号363）で終結する組み換えヒトIP-10（Luster，A.D.ら、1985 Nature 315:672〜676）はマウスIP- 10（Luster，A.D.およびP.Leder、1993、Journal of Experimental Medicine 17 8:1057〜1065）およびヒトIP-10（Luster，A.D.ら、1985 Nature 315:672〜676 ）のcDNAをそれぞれ鋳型として用いたPCRにより設計され、QiaexpressベクターであるpQE12およびpQE8（QiagenInc.、Chatsworth、CA）のBamHI部位に組み込み、その後大腸菌株M15を形質転換した。pQE12でのIP-10の発現は６つのヒスチジンのカルボキシ末端のタグを含む融合蛋白質を結果として生じ、pQE8でのIP-10 の発現はアミノ末端の６つのヒスチジンタグを含む融合蛋白質を結果として生じる。さらに、両方のベクターはまた、hisタグのついた蛋白質のアミノ末端にMet -Arg-Gly-Serの添加を結果として生じる。rIP-10はショ糖を通して封入体を沈殿させ、4Mグアニジン塩酸で封入体を可溶化し、ニッケルアガロース（Qiagen Inc .、Chatsworth、CA）上でアフィニティークロマトグラフィーにかけ、逆相HPLC （Waters）によって精製された。HPLCはC18 Vydacカラム（2.2cm I.D.）上で、9 .5 ml/minの流速で、214nmと277nmの吸光度をモニターしながら行われた。カラムは増加するアセトニトリル濃度の直線勾配で溶出された。特定の条件としては 5分間5%のB、30分以上5〜50%のB、15分以上50〜90%のB、およびその後15分間95% のB、であり、ここでBは80%アセトニトリル/0.054%トリフルオロ酢酸であり、水中0.06%トリフルオロ酢酸であるAが残りのパーセンテージであった。本明細書に報告されている研究では、HPLC精製および凍結乾燥に引き続いて、IP-10はPBSに溶解された；しかしながら、水に溶解されるとIP-10はより溶けやすく、凝集しにくいことがわかった。精製蛋白質の濃度は、標準としてウシ血清アルブミンとウシガンマグロブリンとともに、ブラッドフォードアッセイ（Bio-Rad Laborato ries、Melville、NY）で決定された。二つの真核細胞発現システムがヒトIP-10 を発現するために使用された：J558Lプラズマ細胞腫細胞にトランスフェクトされたマウスモロニーウイルスLTRを基礎としたベクター（Luster，A.D.およびP.L eder、1993、Journal of Experimental Medicine 178:1057〜1065）、およびジヒドロフォレートレダクターゼ耐性プラスミドであるpJOD-S（Barsoum，J.、199 0、DNA and Cell Biology 9:293〜300）を二重DHFR欠損変異CHO系であるDG44（C hasin,L.、1986、Somati c Cell Molecular Genetics 12:555〜666）にトランスフェクトしたものである。完全なヒトIP-10コード配列、ヒトIP-10cDNAの5’PstI-ClaI断片（塩基番号1 〜384）はDNAポリメラーゼのKlenow断片で処理したMoLTR-SV40 I/pA発現ベクターのEcoRI部位に平滑末端連結反応がおこなわれた。 J558Lプラズマ細胞腫細胞の遺伝子導入はエレクトロポレーションによりおこなわれた（Potter，H.ら、1984、Proceedings of the National Academy of Sci ences of the United States of America 81:7161〜7165）。20mgの線状にしたM oLTR-IP10発現ベクタープラスミドDNAおよび1 mgの線状にしたネオマイシン耐性プラスミドpSV7Neoが5X10⁶細胞にトランスフェクトするために使用された。RPMI 培地で４８時間後に、細胞は遠心され0.8mg/mlのG418（100%抗生物質活性に対して計算されたとき；ゲネチシン、GIBCO）を含む選択培地に再懸濁され、限界希釈法によりクローン化するために、９６ウェルプレートに連続的な希釈をしながらプレートにまいた。ひとつのウェルから由来するG418耐性細胞が増殖させ、選択培地での限界希釈法による２度目のクローニングが、クローン性を確実なものとするために行われた。ひとつのクローン4B6は、固相ELISA法（Luster，A.D.およびP.Leder、1993、Journal of Experimental Medicine 178:1057〜1065）により決定された場合、IP-10を約20ng/ml発現しているが、分泌型IP-10の供給源として選択された。高レベルのIP-10分泌を得ようとするため、一段階のメトトレキセート選択を利用して第二の真核細胞発現システムが使用された。この目的のためには、ヒト IP-10の完全なコード領域配列が平滑末端連結反応により哺乳類発現ベクターpJO D-SのSal I部位に組み込まれた。AatIIで線形化した200mgの発現プラスミドpJOD -IP10、および200mgの超音波処理されたサケ精子DNAがDHFRをもたないCHOクローンDG44に対し、（Barsoum,J.、1990、DNA and Cell Biology 9:293〜300）に説明されているようにエレクトロポレーションが行われた。0.5mMのメトトレキセート（Sigma）での一段増幅が10％の透析したFBS、およびリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチド（Gibco）を含まないMEM-aで行われた。個々のクローンは輪での分離により１４日の選択後で選ばれ、増殖された。当初２５クローンがノーザンブロットおよびウサギ抗IP-10抗血清を用いたイムノブロットによりIP- 10の発現レベルがアッセイされた。クローン12D3G4は（ELISAにより引き続き決定されたとき）〜10ng/mlのIP-10を発現しており、分泌型IP-10の供給源として選択された。血清を含まない培地で生育された遺伝子導入細胞からの条件培地（J558LのためにはNutridoma、Boehringer Mannheim、CHO細胞のためにはCHO-S-SFM、GIBC O）が集められ、ヘパリンセファロースカラム（Pharmacia）を通した。NaCl勾配での段階溶出に引き続き、各分画の一部がSDS-PAGEおよびアフィニティー精製したウサギ抗IP-10抗体を用いたウェスタンブロッティングにより解析された（Lus ter，A.D.およびJ.V．Ravetch、1987、Journal of Experimental Medicine 166: 1084〜1097）。IP-10の免疫反応性物質を含む分画が、その後すでに説明したアセトニトリル勾配を用いた逆相HPLCにより精製された。HPLC分画はその後、低分子量領域での高分解能をもつトリス/トリシン緩衝液システム（Schagger,H.およびJ.G．von、1987、Analytical Biochemistry 166:368〜379）を用いた12.5%SDS ポリアクリルアミドゲル上でのSDS-PAGEによって解析され、その後クーマシー染色またはウサギ抗ヒトIP-10抗血清を用いたウェスタンブロッティングを行った（下記参照）。J558LおよびCHOから精製されたIP-10はSDS-PAGE上で同じように観察された。抗体調製：免疫を行うために、ヒトおよびマウスIP-10の両方が、ニッケル-アガロースクロマトグラフィーカラムからの溶出物が変性SDS-ポリアクリルアミドゲル上で分離されたことを除き、上記に説明されたように大腸菌から精製された。IP-10を含むゲル領域が切り出され、初回免疫のためには完全Freundアジュバント、引き続く免疫化のためには不完全Freundアジュバントで乳剤化した。約20 0mgのカルボキシ末端タグをつけた蛋白質(IP-10-(His)-6)が３匹の８週齢メスニュージーランド白ウサギのそれぞれに注射された。IP-10の本来のN-およびC-末端を認識する抗体を確実に産生するために、ウサギは一月の間隔で、ウサギあたり100mgのアミノ末端タグをつけた蛋白質((His)6-IP-10)で２度ブースターにかけた。２度目のブースターの１０日後、３匹のウサギから採血され、血清が単離され、一部がアフィニティー精製のためにまとめて保存された。抗血清のアフィニティー精製は（Luster，A.D.およびJ.V．Ravetch、1987、Journal of Experim ental Medicine 166:1084〜1097）に説明されているように、CNBrで活性化したセファロースビーズ（Pharmacia）に結合したhisタグをつけたrIP-10を用いて行われた。 rIP-10の放射性同位元素標識。大腸菌から精製されたIP-10が業者の説明書に従って¹²⁵IのBolton and Hunter試薬で標識され、取り込まれなかった¹²⁵IBolto n and Hunter試薬はNAP-5カラム（Pharmacia）で除去された。このBolton and H unter試薬はIP-10が¹²⁵Iで化学的に修飾がなされやすいチロシンを含まないので、IP-10を放射線同位元素標識することが選択された。放射線同位元素標識されたIP-10(特異的活性154ng/mCi)は、Garth Brown博士（NEN/Dupont）がPeproTech のIP-10をBolton and Hunter法で放射性同位元素標識し、その後逆相HPLCにより精製しており、これも提供された。 IP-10-AP融合蛋白質の産生。ヒトおよびマウスIP-10は、IP-10に対するヒトおよびマウスcDNAをAPtagベクターに組み込むことにより、可溶性融合蛋白質として、胎盤アルカリフォスファターゼ（AP）の分泌型とともに発現された）Flanag an，J.G.およびP．Leder、1990、Cell 63:185〜194）。これは、ヒトIP-10のためには5'プライマーCGCAAGCTTCGGGAGACATTCCTCAATTGC（配列番号：１）および3' プライマーCGCGGATCCAGGAGATCTTTTAGACATTTC（配列番号：２）を用いて、マウス IP-10のためには5'プライマーACAGATCTAAGCGCTTCATCCACCGCTGA（配列番号：３）および3'プライマーGCGAGATCTAGGAGCCCTTTTAGACCTTTT（配列番号：４）、および鋳型としてはそれぞれヒトおよびマウスIP-10のcDNAを用いてのPCRにより行われた。ヒトPCR産物はHindIIIおよびBamHIで、マウスPCR産物はBglIIで消化した後、APtagベクターのそれぞれHindIII/BglIIおよびBglII部位に連結された。これは結果として、本来のシグナル配列、およびヒトIP-10に対してはGly-Ser-Ser-G ly、およびマウスIP-10に対してはArg-Ser-Ser-Glyという４アミノ酸リンカーを通じて分泌型アルカリフォスファターゼ（SEAP）とフレームを合わせて融合した全成熟蛋白質を含むような融合蛋白質を生じた。 SalIで線形とされたIP-10-APtagプラスミドによってリン酸カルシウム法により、NIH3T3細胞に対して選択マーカーpSV7neoとともに共遺伝子導入が行われた。96ウェルプレート（6.4mm/well）中で0.4 mg/mlのG418（Gibco）を用いて選択をした後に、約１００個の独立したクローンが分泌アルカリファスファターゼ活性に対して選択した。このアッセイはバックグラウンドとなる細胞のフォスファターゼ活性を不活化するために65℃で10分上清50mlを熱処理し、すべて２Ｘの保存溶液（SEAP緩衝液）として調製したIMジエタノールアミン（pH9.8）、0.5mM MgCl2 、10mM L-ホモアルギニン（フォスファターゼ阻害剤）、および12mMのp-ニトロフェニルリン酸（Sigma）とインキュベートした後Vmaxキネティックマイクロプレートリーダー（Molecular Devices）上でA405を測定することにより行われた。最高発現量のNIH-3T3クローンである、マウスIP-10-APに対しての18.G5およびヒトIP-10-APに対しての17.G2はそれぞれ1000mOD/ml/minおよび800 mOD/ml/min を産生していたが、これらが本明細書で説明されている実験に使用された。SEAP を融合していないものを発現する対照であるNIH-3T3クローンでは、プラスミドp BC12/CMV/SEAPを遺伝子導入することにより産生された。蛋白質の特異的活性を決定するために、上清のIP10-APの濃度は、定量的免疫沈降（下記参照）、引き続くSDS-PAGEのクーマシーブルー染色、およびウシ血清アルブミン標準希釈物に比較してのクーマシー染色の強度を比較することにより概算した。免疫沈降の効率を決定するために、初期の試料のアルカリフォスファターゼ活性量、および２度の引き続く免疫沈降の後残存する活性が決定され、10 0%未満の効率の免疫沈降に対して計算するための補正因子として使用された。結果としてマウスIP10-APの特異的活性に対して、IL-4AP(100mOD/min/ng)に対して決定された特異的活性と同様な30mOD/min/ngであると見積もられた。免疫沈降およびイムノブロッティング。 mIP10-APを分泌するNIH-3T3クローンである18.G5から条件培地１mlが集められ、1000xgで遠心され、プロテアーゼ阻害剤（Boehringer Mannheim Biochemicals，Indianapolis、IN）が以下の濃度で上清に加えられた：ロイペプチン（0.3ng/ml）、アプロチニン（10ng/ml）、P MSF（20ng/ml）、およびペプスタチン（0.8ng/ml）。上清はその後10,000xgで３０分間４℃で遠心され、その後プロテインAセファロース（PAS）（Pharmacia）の1:1スラリー50mlと４時間４℃で前もって清澄となるようにした。PASはその後エッペンドルフチューブ中10,000xgで遠心し、CNBrで活性化されたセファロース（Pharmacia）に結合した胎盤アルカリフォスファターゼに対するモノクローナル抗体（Medix Biotech、カタログ番号A-018-02）の1:1スラリー５０mlが上清に加えられ、２時間４℃おいた。ビーズは10,000xgで10分間遠心することにより回収され、もうひとつの50mlのMab-セファロースビーズの1:1スラリーを加え、さらに２時間４℃でインキュベートすることにより第二免疫沈降反応が行われた。免疫沈降物はその後1 mlのRIPA緩衝液（0.15M NaCl、1% NP40、0.1%SDS、0.5%デオキシコレート、0.05Mトリス、pH8.0）で３回洗浄され、その後0.3M 2-ME、4% SDSを含む試料緩衝液50mlが３分間煮沸された。20mlがLaemelliの7%SDS-ポリアクリルアミドゲル上で解析され、クーマシー染色強度がウシ血清アルブミンの希釈系列に比較された。イムノブロッティングのために、ゲルはセミドライトランスブロッター（Owl Scientific、Woburn、MA）でイモビロンＰ膜（Millipore、Bedford、MA）に移され、3%無脂肪ドライミルク/3%ヤギ血清（Sigma）/PBSでブロックされ、10,000倍に希釈されたアフィニティー精製されたウサギ抗IP-10抗血清と２時間室温でインキュベートした。膜はその後PBS/0.1% ツイーン20で２回、各１０分間、RIPA 緩衝液で１回、１０分間、PBS/0.1% ツイーン20で２回、１０分間洗浄し、その後PBS中3%無脂肪ドライミルク/3%ヤギ血清中、室温で１時間20,000倍に希釈したパーオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギIgG（Jackson ImmunoResearch Labs、West G rove、PA、カタログ番号111-035-003）とインキュベートした。膜はその後上記に説明されているように洗浄され、ECLケミルミネセンスキット（Amersham）を用いて像を得た。結合アッセイ。非付着細胞に対しては、10⁷細胞を氷冷結合緩衝液（HBSS/10mM Hepes/0.1% BSA）で１回洗浄し、全量100mlの氷冷結合緩衝液中、指示された濃度のIP10-APおよび競合体と再懸濁した。結合はときおり混ぜながら氷中２時間行った。細胞は４℃での繰り返しの遠心により、氷冷結合緩衝液で５回洗浄された。AP活性を結合している細胞は、細胞を100mlの10 mMトリス（pH8.0）/1%トリトンX-100で溶解し、６５℃で１０分細胞のアルカリフォスファターゼを不活性化するために熱処理し、その後14,000xgで１０分間遠心を行った。その後可溶性抽出液50mlが室温で96ウェルプレート中、50mlの2x SEAP緩衝液と混合され、比色定量産物がA405でのキネティックプレートリーダーでアッセイされた。結合部位を多数有する付着細胞にたいしては、結合は６ウェルのクラスタープレートで決定された。細胞は氷冷緩衝液で２回洗浄し、揺り子台上低温室で、全量500ml の氷冷結合緩衝液中、指示された濃度のIP10-APおよび競合体と２時間再懸濁した。細胞は結合緩衝液で６回洗浄され、100mlの10 mMトリス（pH8.0）/1%トリトンX-100 で溶解され、かきとられてエッペンドルフチューブに移され、その後上記に説明されているようにアッセイされた。非特異的な結合は２つの方法のうちひとつを用いて決定された。平衡定数の計算には、各濃度のIP10-APで10mM rIP-10を加え、平行して上記に説明されているのと全く同じ結合実験をすることにより非特異的結合が決定された。特異的な結合は全体の結合からバックグラウンドを引くことにより決定された。特異的結合のデータはマッキントッシュコンピュータ上カレイダグラフプログラムを用いて、結合等式B=(Bmax x F)/(Kd + F)（ここでBは結合したリガンドであり、Fは結合していないリガンド）を用いて解析された。別の実験では非特異的な結合は、等量の非融合SEAPまたは交差種のIL4-AP（ヒト IL4はマウスの細胞に結合せず、マウスIL4はヒト細胞に結合しない）を加え、平行して上記に説明されているのと全く同じ結合実験をすることにより決定された。トランスフェクトされた細胞の条件培地に見いだされる濃度よりも高い濃度で IP10-APを得るために、トランスフェクトした細胞は１４日間血清のないDMEMで維持され、条件培地は限外濾過（Amicon、Beverly、MA）によって100倍濃縮された。細胞への¹²⁵I-IP10結合は、結合したIP-10を有する細胞ペレットがガンマカウンターで測定されたことを除いては、本質的にはIP10-AP結合に対して上記で説明されたように行われた。ヘパリナーゼおよびトリプシン処理。付着細胞に対しては、10⁶細胞が血清を含まないDMEMと１回洗浄され、その後500mlの血清を含まないDMEM中、2.5U/mlのヘパリナーゼIまたは0.2U/mlのヘパリナーゼIII（ヘパリチナーゼ）と共に、３７℃で5%CO₂と１時間インキュベートされた（Bashkin，P.ら、1989、Biochemist ry 28:1737〜1743）。非付着細胞に対しては、10⁷細胞が血清を含まないRPMIと１回洗浄され、100mlのRPMIプラス上記に指示された濃度のヘパリナーゼIおよび IIに再懸濁された。酵素処理に引き続いて、付着細胞は5mlの結合緩衝液で４回洗浄され、非付着細胞は10mlの結合緩衝液で２回洗浄され、その後上記に説明されているようにIP10-AP結合に対してアッセイが行われた。接着細胞のコンフルエントの単層培養物（〜10⁷細胞）がカルシウムとマグネシウムを含まないHBSS で１回洗浄され、0.25%トリプシン/0.02%EDTA（JRH Biosciences、Lexena、KA）と５分間３７ ℃で５％CO2でインキュベートされた。酵素処理に引き続いて細胞は10mlのDMEM/ 10%FBSで洗浄され、10mlの結合緩衝液で洗浄され、その後100mlの結合緩衝液に再懸濁されて上記に説明されているIP10-AP結合に対してアッセイが行われた。内皮細胞増殖アッセイ。ヒト臍帯血管内皮細胞（HUVECO）は継代数17〜30の間で日常的に使用された。細胞増殖は過去に説明されているように（Maione，T.E. ら、1990、Science 247:77〜79）DNAの中への[3H]チミジンの取込みにより決定された。簡潔に記せば、rhIP-10およびrhPF4が、M199/10% FBS/5ng/ml FBS中で生育している96ウェルプレートにまかれたHUVECs（6 x 10³細胞/ウェル）に加えられた。３日後ウェルあたりのDNAの中へ取り込まれた[3H]チミジン量が決定された。試料は３回づつ試験が行われた。カルシウム流動。THP-1、A20細胞およびEL4細胞は2%FBSおよび5mg/mlのFura2- am（Molecular Probes）（ジメチルスルフォキシド中1mg/mlの保存液から希釈した）を含むRPMI1640中で、2 x 10⁶細胞/mlとなるように再懸濁した。THP-1細胞は１時間、A20およびEL4細胞は３０分、３７℃でインキュベートされ、その後14 5mM NaCl、4mM KCl、1mM NaH2PO4、0.8 mM MgCl2、1.8 mM CaCl2、10 mMグルコース、および25 mM HEPES（pH 7.4）で３回洗浄した。細胞はこの緩衝液で10⁶細胞/mlとなるように再懸濁され、2mlの試料が細胞内カルシウムを測定するために、Perkin-Elmer LS-5B蛍光度計にかけられた。励起および放射波長はそれぞれ39 9nmおよび510nmである。最大および最小のカルシウム-Fura2蛍光が、それぞれ１％トリトンX-100、および100mMトリス（pH8.0）プラス100mM EGTAを用いて測定された。２．rIP-10 の精製大腸菌で発現されたrIP-10の精製ヒトおよびマウスIP-10がN-またはC-末端に６つのヒスチジンを有する、タグをつけられた組み換え（r）蛋白質として生成された。N-およびC-末端にhisのタグを有するIP-10は両方とも、６つのヒスチジンのタグが受容体の結合および生物学的な活性を阻害し、またはrIP-10に対する抗体に提示されるときに、潜在的に重要なエピトープを覆いかぶせてしまう可能性を最小とするために生成された。IP -10は（不溶性の組み換え蛋白質を含んだ）封入体のショ糖をとおしての沈降させ、4Mグアニジン塩酸で封入体を可溶化し、ニッケルアガロースでアフィニティークロマトグラフィーを行うことにより精製され、結合分画はC-18Vydacカラムにかけられ、その後アセトニトリル勾配で逆相HPLCが溶出された（図1A）。IP-1 0のピークに肩がみられるけれども、このピークを通じての分画のSDS-PAGE解析では均質な蛋白質であることが示された。IP-10はその後125I Bolton and Hunte r試薬で放射性同位元素標識され、還元SDS-PAGEにかけられた（図1B）。これらの精製条件下で、IP-10はマルチマーに凝集するようである。図1Bに示されている曝露において、モノマーおよびダイマーが明らかである；しかし、さらに長い曝露時間で大量をのせたクーマシー染色ゲルでは、高次のマルチマーがみられる。これらのマルチマーはアフィニティー精製されたウサギ抗IP-10抗血清と反応し、還元およびスフフィドリルの不可逆的なアルキル化に影響されない。IP-10 の非融合型（Dupont/NEN）が同じような挙動を示すので（図1B）、この凝集は6 つのヒスチジンタグの結果ではない。 J558Lプラズマ細胞腫およびCHO細胞から分泌されるrIP-10の精製大腸菌から精製されたIP-10が凝集したので、真核細胞から精製され、変性と再生を受けなかったIP-10も凝集するのかどうかを決定することには関心がある。完全なIP-10cDNAはそれゆえ２つの発現ベクターであるMoLTR/SV40 I/pAおよび pJOD-Sに組み込まれ、その後それぞれJ558LおよびCHO細胞に安定に遺伝子導入がなされた。IP-10は固相ELISAにより判断したとき、両方の安定に遺伝し導入された細胞系から等量に分泌されており、同様な電気泳動移動度のプロファイルを示した。IP-10は条件培地から、ヘパリンセファロースアフィニティーカラムクロマトグラフィー、引き続き逆相HPLCにより精製が行われた（図2A〜2C）。この精製ではIP-10が生理的なNaCl濃度でヘパリンセファロースに結合し、0.5Mおよび1 .0Mの間で溶出されてくることが示される（図2A）。ヘパリンセファロースカラムからの1M溶出物は逆相HPLC解析にかけられた（図2B）。増大するアセトニトリルの勾配で溶出された分画はSDS-PAGEにより解析され、アフィニティー精製された抗IP-10抗血清でイムノブロットが行われた（図2C）。免疫反応性を有するIP- 10を含む分画は図2Bのクロマトグラムに矢印で示されている。真核細胞から分泌精製されたIP-10もまたこの精製および電気泳動条件下で凝集した（図2A、2C）。それゆえ、大腸菌で合成された物質の凝集は細菌産物に特異なわけではなく、この分子の特質を反映している。その上、大腸菌およびJ558Lが産生したIP-10は同じ逆相 HPLC溶出プロファイルを持っており（図1aのクロマトグラム上の曲がった矢印の位置と図2bのクロマトグラム上の曲がった矢印の位置を比較せよ）、同じ特質を有することが示唆される。３．細胞へのIP10-AP結合は特異的でかつ飽和可能であり、PF4に競合する。大腸菌で産生された放射線同位元素標識されたrIP-10が溶液および細胞表面上（下記参照）で凝集されるので、特異的で飽和しうるIP-10の結合部位を同定することは不可能であった。この問題を克服するために、IP-10は、哺乳類細胞に導入されたときに、N-末端のIP-10エピトープを介して細胞に結合し、C-末端のアルカリフォスファターの尾の部分を介して酵素学的にアッセイが行われるような非凝集型のモノマー融合蛋白質の分泌が起こるような、アルカリフォスファターゼ融合遺伝子として発現された（図3Aおよび3B）。マウスおよびヒトのIP-10 は両方ともAPtagベクターにくみこまれ、最初は結合研究に使用された。APtagベクターはモロニーマウス白血病ウイルスLTRからの高レベル転写制御領域、ラットインシュリン遺伝子からの3'スプライスおよびポリアデニル化シグナル、およびヒト胎盤アルカリフォスファターゼ遺伝子のあるドメインを持っている。クローニング部位へのマウスIP-10cDNAの挿入によりIP10-アルカリフォスファターゼ融合遺伝子が結果として生成した（図3A）。種特異性がなく、マウス融合蛋白質が非特異的な結合が少なかったので、本明細書で示したデータはすべてマウスのIP10-APアルカリフォスファターゼ融合蛋白質（IP10-AP）を用いた。IP10-APの特異的活性は条件培地1ml中のアルカリフォスファターゼ活性量を決定し、その後アルカリフォスファターゼに特異的なMa bを用いて定量的な免疫沈降を行うことによりIP10-AP蛋白質の量を見積もることにより見積もられた。 IP10-APを用いて、本発明者らはIP-10が様々な細胞に対して特異的に結合し、 A20 B細胞上ではKd=25nMで結合する事（図4A；10⁷のA20 B細胞が増大する濃度の MIP10-APとインキュベートされ、非特異的な結合は過剰な非標識の溶液中のIP-1 0の存在下、各IP10-APの濃度で結合アッセイをおこなうことにより決定された）を示すことができた。10 mMの組み換えマウスまたはヒトIP-10により、A20 B細胞およびEL4 T細胞上では IP10-AP結合は100%阻害された；しかしながら、他のケモカインがA20 B細胞およびEL4 T細胞に対しIP10-APの結合と競合する能力を試験されたときには、hPF4のみがmIP10-AP結合を100%阻害することができた。〜 100倍モル過剰なhIL-8、hMIP-1a、hMIP-1b、およびhRANTESは実質的に効果がなかったが、hMCP-1は部分的に競合した。hMCP-1は１回の実験では部分的に競合したので、本発明者らはmIP-10、hPF4およびhMCP-1と比較する用量阻害実験を行った（図4B；10⁷のA20 B細胞が、指示された濃度の非標識組み換えケモカインまたはヘパリン存在下２時間で４℃でIS IP10-AP Mとインキュベートされ、細胞はその後洗浄され、結合したIP10-APがアッセイされた）。非特異的な結合がマウスA 20細胞に結合したヒトIL4-APまたは分泌されたAPの量により決定され、通常全結合の1%以下であった。この実験においては、hPF4、mIP-10およびヘパリン（下記参照）が細胞に対して用量依存的な様式でIP10-AP結合と競合することができるのだが、hMCP-1は100mg/mlでさえもmIP10-AP結合に対して効果がなかった（〜10 mMまたは〜600倍モル過剰）。二つの実験の間の食い違いはhMCP-1の供給源での変化に関連し得た（GenentechからPeproTech）。言及すべきものとして、IP-10 を産生する大腸菌を用いての阻害曲線は右方向にシフトしており、これはおそらくIP-10溶液の効果的なモル数がrIP-10の凝集により期待されるよりも低くなっていたためである。４．IP10-AP は細胞上でのIP-10の凝集を阻害する。 IP10-AP融合蛋白質のアルカリフォスファターゼ尾部が細胞表面にあるIP-10の凝集を阻害していたかどうかをテストするために、A20 B細胞が増加する濃度の1 0nM非標識のhIP-10またはIP10-APのいずれか一方の存在下、¹²⁵I-hIP10（NEN/Du pont）と2〜4時間４℃でインキュベートされた。細胞はその後、結合緩衝液で５回洗浄し、細胞に吸着した¹²⁴I-hIP10に対してアッセイを行った。図５にみられるように、非標識の競合体hIP-10の添加によって、細胞に¹²⁵I-hIP10はより多く結合するようになる一方、IP10-APの添加では細胞そのものへの¹²⁵I-hIP10の結合と競合することができた。従って、増加する非標識非融合IP-10の存在下、細胞への¹²⁵I-IP10の結合増加は、細胞表面のIP-10の凝集の結果である可能性が高い。５．IP-10 結合はカルシウム流動を誘導しないほとんどのサイトカインが特異的な細胞表面受容体を有する細胞で一過性のカルシウム流動を誘導することが報告されてきているので、本発明者らはA20 B細胞およびEL4 T細胞でIP-10がカルシウムを流動させる能力について試験をおこなった。A20またはEL4細胞系では、A20 B細胞系が膜に結合したIgGと抗IgG2b Mab との架橋に引き続き、カルシウム流動が起こるにもかかわらず、mIP-10を産生する組み換え大腸菌（またはJ558L）またはmIP10-APに応答してカルシウムの流動が起こることはなかった。本発明者らはまた、IP-10刺激に対するTHP-1細胞系の応答を試験した。THP-1細胞は（A20またはEL4細胞系よりは低いレベルではあるが）、IP-10を特異的に結合することのできる単核細胞系であり、様々なケモカインに対してカルシウム流動をおこすことが報告されてきた。図６Aに示されているデータは、mIP10-APのTHP-1細胞への結合は過剰のヒトまたはマウスのIP-10 により阻害されうるが、hMIP1aまたはhMIP1bでは阻害がおこらないことを示している。さらにHL60細胞はmIP10-APを結合せず、陰性対照として含まれていた。図 6Bに見られるように、Fura-2をのせたTHP-1細胞はhMCP-1、hRANTESおよびhMIP1a での刺激に対しては一過性のカルシウム流動を示すことができたが、hIP-10の添加に対してはカルシウム流動を起こすことはできなかった。さらにhIP-10は引き続くhMCP-1またはhRANTESの刺激に対してTHP-1細胞を脱感受性にすることができなかった。対照的に、hMIP1aは引き続くhRANTESまたはhMCP-1の剌激に対してTHP -1細胞を脱感受性にした。さらに、IL-8のシグナルトランスダクションを増加させる分子であるヘパリンおよび硫酸ヘパラン（100ng/ml）（Webb，L.M.ら、1993 、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．90:7158〜7162）はIP-10をシグナルにさせなかった。６．IP-10 結合のグリコサミノグリカン阻害ヘパリンおよび硫酸ヘパランは濃度依存的な様態で細胞へのIP10-AP結合を完全に阻害することができた（図７）。硫酸コンドロイチンB（硫酸ダーマトラン）もA20 B細胞へのIP10-AP結合を阻害することができたが、ヘパリンまたは硫酸ヘパランよりは高い濃度であった。対照的に硫酸コンドロイチンAは1mg/mlという濃度-ヘパリンおよび硫酸ヘパランにより完全に阻害が起こる濃度の１００倍濃度ですらIP10-AP結合に対して効果がなかった。実際、ヘパリンの阻害曲線はほとんどP F4の阻害曲線にかさなっていた（図４B）。７．IP-10 の結合部位の細胞内分布表１は多くの異なる細胞種における細胞内分布およびおよそのIP-10結合部位の密度を示す複数回の実験の結果をまとめたものである。IP-10結合部位は内皮細胞、および線維芽細胞のような付着細胞においてより多くの数が存在する。さらに、BMマクロファージ、U937、THP-1、またはHL60細胞をIFNγで前処置しても、これらの細胞でIP-10結合部位は誘導されなかった。さらに、胸腺細胞を抗CD3 Mab（2C11）２４時間処理して活性化しても、IP-10結合部位の増加は最小であった（〜２倍）。その他の細胞でみられるように、しかしながら、休息期または活性期の胸腺細胞へのIP-10の結合はヘパリンまたは硫酸ヘパランにより阻害され、もし細胞がヘパリナーゼで処理されたならば結合は完全に失われた。分画していないヒト末梢血白血球は細胞がナイロンウールを通してあると失われるわずかなIP-10結合があり、マクロファージまたはB細胞上に結合部位が位置しているが、末梢血T細胞上にはないことが示される。検出不可、とはバックグラウンドの結合以上に有為な結合がみられなかったことを示す。バックグラウンドの結合は細胞に対する交差種のIL4-APまたは分泌AP結合のどちらかを用いて決定した。細胞当たりの部位の数はIP10-APに対して見積もられた特異的な活性を用いることにより決定された（30 mOD/min、ngあたり）。８．細胞へのIP-10の結合は細胞表面の硫酸ヘパランプロテオグリカン（HSPG ）に依存しているヘパリンおよび硫酸ヘパランは細胞へのIP10-AP結合を阻害し、IP10-AP結合部位は付着細胞系でより高い数が見いだされるので、本発明者らはこの結合部位が塩およびヘパリナーゼに感受性であるかどうかをテストした。図8Aは線維芽細胞でのIP10-AP結合部位がまたヘパリンおよび過剰なIP-10により競合されるものであり、ヘパリナーゼ処理および1M NaCl洗浄に感受性であることを示している。H aselと表示した試料では血清のない培地でヘパリナーゼと３７℃で３０分間処理され、結合アッセイに先立ち完全培地で洗浄された。結合にひきつづき、すべての細胞がHBSSで５回洗浄された；1M NaClと表示された試料は、1M NaClに合わせられたHBSSでさらに１分間洗浄を受けた。結合したアルカリ性フォスファターゼ活性はその後酵素学的に決定された。Balb/c 3T3細胞のヘパリナーゼI処理によりIP10-APの結合部位の〜75%が酵素学的に除去され、一方kitリガンドに対するk it-AP結合には影響がない。ヘパリナーゼIIIもまたNIH3T3細胞上のIP10-AP結合部位の〜84％を除去する。これはまたA20 B細胞上の結合部位に対しても正しく、この場合ヘパリナーゼIおよびIIIはそれぞれ100%および75%を除去する。さらに、結合とHBSSでの洗浄に引き続き、1M NaClに合わせられたHBSSでの１分間の洗浄はBalb/c-3T3からすべてのIP10-APを除去するが、この同じ細胞からKit-AP は50%しか除去しない。 IP-10結合部位はまた、試験した３つの細胞系、NIH-3T3、Balb/c-3T3、および SVEC - マウスの内皮細胞系でのトリプシン消化に対しても感受性であった（図8 B）。IP-10結合が細胞表面の硫酸ヘパランに依存しているというさらなる証明は、グリコサミノグリカン生合成に必要な酵素での変異によりHSPGを欠損している２つのCHO変異体を用いた研究からきている。10mMの非標識mIP10または指示されたヘパリン濃度の存在下、15 nMのIP10-APと共に10⁶個の細胞が２時間４℃でインキュベートされた。単層培養物はその後HBSS結合緩衝液で５回洗浄され、結合したIP10-APの量が決定された。図９に見られるように、IP10-APは野生型の親CHO 系K1に結合するが、677と803のどちらの変異系にも結合しない。さらに、可溶性の硫酸ヘパランは変異体への結合を回復しないが、実際のところ濃度依存的な様式で、IP10-APを野生型CHO細胞に結合することを阻害する。９．IP-10 はヒト臍帯血管内皮細胞（HUVEC）増殖を阻害する PF4はA20 B細胞およびNIH 3T3細胞を含め、試験を行ったいくつかの細胞系への結合について、IP-10と競合することができ、PF4はbFGFが内皮細胞の増殖を誘導するのを阻害することが知られているので、HUVECの増殖におけるIP-10の効果がテストされた（図10A）。PF4では、IC50は100〜200 nMであるが、それと同様I P-10は150 nM（1.5mg/ml）でHUVECの増殖をほぼ最大に阻害する。しかしながら、PF4に比較すると100%の阻害に達するためには少なくとも5倍多くのIP-10が必要であり、再び、その効果的なモルを下げる高濃度での凝集にIP-10の性質が反映しているのかもしれない。準最大濃度のPF4およびIP-10による阻害は増加性のものである。PF4の場合にそうであるように、外来性のヘパリンの濃度増大により増殖に対するIP-10の阻害効果が逆転するのだが、これはPF4の阻害効果で起こることと全く同じである（図10B）。可溶性ヘパリンに対してIP-10およびPF4のそれぞれの結合親和性を比較すると、Kd値は10^-7Mで同一であることが示される。HUVECの増殖のPF4の阻害を起こさなくするようなPF4に対する中和抗体は、IP- 10の増殖阻止に影響がなかった。 PF4およびIP-10はHUVECにおいてアポトーシスを誘導しないが、増殖抑止を起こす。PF4またはIP-10について、増殖をこれらケモカインにより抑止しているHU VECからこれらが洗い除かれ（ヘパリン5U/mlの添加による）、bFGFを含む新鮮な培地が培養物に加え戻されると、細胞増殖は回復する。その他の態様別の態様では、本発明はIP-10ポリペプチド（図１１、配列番号：５５）に実質的に類似しているいかなる蛋白質をも含む；このような類似体は対立遺伝子の多様性ばかりでなく、他の実質的に純粋な自然界に存在している哺乳類のIP-10 蛋白質を含む；自然変異体；誘導変異体；厳格さの高い条件または厳格さの低い条件で、図２および７のIP-10配列にハイブリダイズするようなDNAをコードする蛋白質（例、少なくとも４０塩基の長さのプローブで、40℃の2X SSCで洗浄すること）；およびIP-10ポリペプチドに対する抗血清により特異的に結合するようなポリペプチドまたは蛋白質で、特にIP-10蛋白質の活性部位またはMax結合領域に対する抗血清によるもの。この用語にはIP-10断片を含むキメラポリペプチドをも含んでいる。本発明はさらに自然界に存在するIP-10ポリペプチドの類似体を含む。類似体はアミノ酸配列の相違、翻訳後修飾、またはその両方によって自然界に存在する IP-10蛋白質とは異なっていてもよい。本発明の類似体は一般的に少なくとも70% 、より好ましくは80%、さらにより好ましくは90%、および最も好ましくは95%または99%であってさえも、自然界に存在するIP-10配列のすべてまたは一部と相同性を示すものとなろう。比較配列の長さは少なくとも８アミノ酸残基であり、好ましくは少なくとも24アミノ酸残基であり、さらに好ましくは35アミノ酸残基以上となろう。修飾にはポリペプチドのインビボおよびインビトロでの化学誘導体化、例えばアセチル化、カルボキシル化、リン酸化、またはグリコシル化を含む；このような修飾はポリペプチド合成中またはプロセシング中または単離された修飾酵素での引き続く処理中に起こりうる。類似体はまた１次配列で改変することにより、自然界に存在しているIP-10ポリペプチドとは異なっていてもよい。これらには自然におよび誘導（例えば、Sambrook、FritschおよびManiatis、Mol ecular Cloning: A Laboratory Manual（分子クローニング：実験室マニュアル）（第２版）、CSH Press、1989、参照として本明細書に組み入れられる；あるいはAusubelら、上記、参照として本明細書に組み入れられる、に説明されているような、放射線照射、またはエタンメチルサルフェートへの曝露、または部位特異的変異導入により、ランダムな変異導入から生じる）を行う両方での遺伝的多様性を含む。環状化したペプチド分子、およびL-アミノ酸以外の残基、例えば D-アミノ酸、または自然界に存在しないもしくは合成のアミノ酸、例えばβもしくはγアミノ酸、を含む類似体もまた含まれる。全長のポリペプチドに加えて、本発明はまたIP-10のポリペプチド断片をも含む。本明細書で使用されているとき、用語「断片」は少なくとも１０個の隣接するアミノ酸を意味し、好ましくは少なくとも３０個の隣接するアミノ酸を意味し、より好ましくは少なくとも５０個の隣接するアミノ酸を意味し、最も好ましくは少なくとも６０から８０個の隣接するアミノ酸を意味する。IP-10の断片は当業者により知られる方法により産生されうるか、または通常の蛋白質プロセシングから生じうる（例えば、そのままのポリペプチドから生物学的活性に必要とされないアミノ酸の除去、または代替mRNAスプライシングまたは他の蛋白質プロセシング事象によるアミノ酸の除去）。本発明に従う好ましい断片または類似体は生物学的活性を示すものである（例えば、本明細書でアッセイしたような哺乳類細胞分裂阻害能力）。好ましくは、 IP-10ポリペプチド、断片、または類似体は自然界に存在するIP-10ポリペプチド全長の生物学的活性に対して、少なくとも10%、より好ましくは30%、および最も好ましくは70%またはそれ以上の活性を示す。その他の態様は以下の請求の範囲内である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 39/395 ＡＥＤＣ０７Ｋ 14/52 Ｃ０７Ｋ 14/52 Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ６１Ｋ 37/02 ＡＢＸＧ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ

Claims

【特許請求の範囲】１．IP-10ポリペプチドの内皮細胞阻害量、またはIP-10ポリペプチドをコードし哺乳類において発現されるよう配置された核酸を哺乳類に投与することを含む、哺乳類において内皮細胞の増殖を阻害する方法。２．内皮細胞が内皮腫の細胞である、請求項１記載の方法。３．内皮腫がカポジ肉腫または硬化性内皮肉腫である、請求項２記載の方法。４．内皮腫が血管腫である、請求項２記載の方法。５．阻害が動脈硬化の治療のためである、請求項１記載の方法。６．ポリペプチドが薬学的に許容される担体中に存在する、請求項１記載の方法。７．投与が局所注射または持続放出によるものである、請求項１記載の方法。８．核酸がウイルスベクターの一部である、請求項１記載の方法。９．HSPG受容体へのIP-10ポリペプチドの結合を減少させることを含む、哺乳類において内皮細胞増殖を増加させる方法。 10．減少が外傷性損傷または虚血性損傷の治療のためのものである、請求項１記載の方法。 11．減少が、心筋梗塞、肺動脈塞栓症、網膜動脈壊死、または急性腎不全の治療のためのものである、請求項10記載の方法。 12．減少が、ヘパリンの治療的有効量の投与によるものである、請求項９記載の方法。 13．減少が、天然型IP-10のカルボキシ末端の25個のアミノ酸の治療的有効量の投与によるか、IP-10に特異的に結合する抗体の治療的有効量の投与によるか、またはHSPG受容体に特異的に結合する抗体の治療的有効量の投与によるものである、請求項９記載の方法。 14．ケモカインをアルカリフォスファターゼポリペプチド配列に融合させることを含む、ケモカイン凝集を防止する方法。 15．ケモカイン配列が由来する天然型のケモカインと比較して、融合蛋白質の凝集が減少している、アルカリフォスファターゼポリペプチド配列に共有結合したケモカインポリペプチド配列を含む融合蛋白質。 16．ケモカインが、IP-10、RANTES、MIP-1β、またはPF4である、請求項14記載の方法。 17．化合物が存在しない細胞へIP10-APを結合させるような条件下で、細胞、I P10-APポリペプチド、および該化合物を結合させ、アルカリフォスファターゼ活性を測定することを含む、該活性の変化により増殖阻害化合物が存在することが示される、細胞へのIP-10結合を変化させる化合物を同定する方法。 18．IP-10ポリペプチドの治療的有効量を投与することを含む、またはIP-10核酸を治療的に投与することを含む、哺乳類においてFGFを阻害する方法。 19．哺乳類が、血管腫、新生物、FGF濃度の増加した該新生物、カポジ肉腫、ケロイド、または増殖性網膜障害を有するものである、請求項18記載の方法。 20．IP-10ポリペプチドの治療的有効量またはIP-10核酸を投与することを含む、TGFβを阻害する方法。 21．哺乳類が、炎症、繊維症、またはTGFβの濃度が増加している新生物を有する、請求項20記載の方法。 22．哺乳類において内皮細胞増殖を阻害するために用いられるIP-10ポリペプチド。 23．内皮細胞増殖を阻害するために用いられるIP-10ポリペプチドをコードする核酸。 24．内皮細胞増殖を阻害するための医薬品の製造を目的とする、IP-10ポリペプチドまたはIP-10ポリペプチドをコードする核酸の使用。 25．内皮細胞が、肉腫または内皮腫である、請求項24記載の使用。 26．肉腫が、カポジ肉腫または硬化性内皮細胞肉腫である、請求項24記載の使用。 27．内皮腫が血管腫である、請求項26記載の使用。 28．阻害が動脈硬化の治療のためのものである、請求項24記載の使用。 29．阻害が、HSPG受容体へのIP-10ポリペプチド結合の減少によるものである、請求項24記載の使用。 30．哺乳類におけるFGFまたはTGFβの阻害のための医薬品の製造を目的とする、IP-10ポリペプチドまたはIP-10コード核酸の使用。