JPH11509193A

JPH11509193A - 細胞傷害を増強するための細胞周期動力学の動的遅延方法

Info

Publication number: JPH11509193A
Application number: JP9504545A
Authority: JP
Inventors: エム．グリムリー，フィリップ; メータ，スニル
Original assignee: ヘンリーエム．ジャクソンファウンデーションフォーザアドバンスメントオブミリタリーメディシン
Priority date: 1995-06-27
Filing date: 1996-06-26
Publication date: 1999-08-17
Also published as: WO1997001344A2; AU6396096A; WO1997001344A3; AU715527B2; CA2225682A1; EP0835111A2

Abstract

(57)【要約】細胞周期を通して標的細胞の進行を遅延させるのに充分であるが停止させない濃度および条件下で、制御薬剤（restraining agent）（ＲＡ）を標的細胞集団に投与し、ＲＡの適用と同時またはその後に標的細胞毒性物質（targeted cytotoxic insult）（ＴＣＩ）を投与することによる、細胞傷害を誘導するための方法。本発明はまた、制御薬剤または標的細胞毒性物質として新規の薬剤を同定し、設計しそして使用するための、かつ既存の薬剤の相乗的組合せを改良するための、微量培養指標システムおよび補助的データ解析法に関する。本発明の実施態様において、ＲＡは、リボヌクレオチド還元酵素インヒビター、ジヒドロ葉酸還元酵素インヒビター、チミジル酸シンターゼインヒビター、ＤＮＡポリメラーゼインヒビター、プロテインキナーゼインヒビターまたはトポイソメラーゼインヒビターであってよい。さらに本発明の実施態様は、ＴＣＩとして、インドールカルバゾール、例えばスタウロスポリン（staurosporine）、Ｋ２５２ａ、ＫＴ５９２６、およびＫＴ５７２０を含む。具体的な実施態様において、ＲＡはチミジンであり、ＴＣＩはスタウロスポリンである。

Description

【発明の詳細な説明】細胞傷害を増強するための細胞周期動力学の動的遅延方法関連出願に対するクロスレファレンス本発明は、1995年６月27日に出願された米国仮出願番号 60/000,546（その全体を参考として本明細書に組み入れる。）に基づく。政府の権利本明細書に記載した発明は、米国政府の目的のためであれば、本発明者らまたは譲受人にロイヤルティーを払うことなく、製造し、実施許諾を受け、使用することができる。発明の分野本発明は、細胞分裂周期のいくつかの部分において標的細胞の運動速度を緩める試薬を投与し、運動が緩められた一部の細胞分裂周期内で作用する細胞毒性試薬を投与することによる、細胞傷害の増強法に関する。本発明方法は、化学療法ならびに他の医療用途および医療以外の用途で使用できる。特定の態様では、デオキシチミジン（ｄＴｈｄ）が、細胞分裂周期の一部を通過する標的細胞の運動速度を緩める試薬であり、スタウロスポリンが細胞毒性試薬である。本発明はまた、微量培養指示薬系（ＭＩＳ）および補助データ分析法を使用して、試薬間の相互作用の程度を測定する方法にも関する。特定の態様では、二変数の順次希釈度で配列した２以上の試薬の細胞増殖に対する影響を示すデータを集め、そのデータを、細胞増殖の参照測定値を用いて予め決められた関係に従って拡張シートで処理し、それらの試薬の相互作用のスペクトルを参照測定値に関してグラフまたは表の形で表すためのデータベースがもたらされる。発明の背景生細胞に対して破壊したり、永久的傷害を与えたりするための薬物または他の試薬の使用は、価値のある正当な多くの目的に役立つ。主な臨床用途は、悪性腫瘍または他の異常な組織増殖を除去するためである。VT DeViTa，Jr.，IN: Canc er，Principles and Practice of Oncology（腫瘍学の原理と実際），第４版、p p．276-292，JB Lippincott Co．Philadelphia(1994)。他の価値ある臨床用途としては、（１）異常免疫反応の薬物制御（K Wilsonら、Rheumatol．21:1674-7(1994); CM Neuweltら、Am．J．Med．98:32-41（1995））；（２）剥離性皮膚病（GD Weinsteinら、J．Am．Acad．Dermatol．28:454-9( 1993)，RJ Van Dooren-Greebeら、Br．J．Dermatol．130:204-10(1994)；（３）ウイルス、ウイルス複製要素またはプリオンによって感染した細胞の死滅（P Ca labresiら、Section XII-Chemotherapy of neoplastic diseases（新形成疾患の化学療法）IN: Goodman および Gelman's The Pharmacologic Basis of Therape utics,第８版、1202-1263(Pergammon Press，New York 1990); S Chouら、Antiv iral chemotherapy（抗ウイルス性化学療法），Chapter 17 IN: Virology，pp． 323-348，BN Fields ら編、Raven Press，New York(1985)；（４）細菌、ミコバクテリア、マイコプラズマ、リケッチア、真菌類、酵母または寄生虫などの感染性物質の全身または局所的除去のための治療（HP Willett，The action of chem otherapeutic agents（化学療法剤の作用），Chapter 10，IN:Zinsser Microbio logy,第17版、pp．234-277，Joklik ら編、Appleton-Century-Crofts，NY(1980) ;V Lorian，Antibiotics in Laboratory Medicine，第３版、Williamsおよび Wi lkins，Baltimore(1991); S Stemberg，Science 266: 1632-1634（1994）；（５）および受胎能制御が挙げられている。生細胞に対して永久的傷害を付与し得る試薬の臨床以外の用途は、農業、園芸または公衆衛生、例えば、特定の殺虫剤または除草剤の塗布において生じる。広範囲の物理的、化学的または生物学的試薬は、生細胞に対して危険であり、組織または器官などの生物系に傷害を与え得る。しかし、多くの場合、傷害は、細胞分裂周期に関連した事象を特に標的とするわけではない。他の場合、細胞傷害は、細胞分裂周期の段階に直接関連して開始され得る。細胞分裂周期のいくつかの部分において作用する、増殖している細胞に生物学的に決定的または不可逆的な傷害を引き起こす細胞毒性試薬は、本明細書で定義する「標的細胞毒性原因」、すなわち「ＴＣＩ」として作用し得る。細胞分裂周期の、所与のＴＣＩが関連作用を開始する部分が、その「標的区間」である。ＴＣＩとして作用し得る公知の試薬は種々あり、天然物質、微生物または他の細胞源の産物、合成または半合成の有機または無機化学化合物、あるいは簡単な無機試薬が挙げられる。ＴＣＩとして作用し得る他の因子も公知であり、細胞の増殖または維持に必須の栄養素の欠如ならびに物理化学的環境における変化が挙げられる。後者の例としては、温度変化、および放射もしくは粒子エネルギー、振動波、または他の種々の物理的力への細胞の暴露が挙げられる。ＴＣＩの細胞毒性効果は、直ちにというわけではないので、細胞分裂周期の一つの期で開始された細胞傷害は、もっと後の期またはその後の細胞周期まで明らかにされないかもしれない。一つの例として、シスプラチン処理では、永久的に損傷を受けた子孫の細胞は、生殖不能であったり、増殖または生存能力の低下を示す可能性がある。M Sorenson，J Natl．Cancer Inst．82:749-55（1990）。すなわち、細胞分裂周期の段階を理解することは、ＴＣＩとして作用し得る試薬をさらに理解する上で有用になる。１．細胞分裂周期増殖している全ての細胞は、そのゲノムＤＮＡを複製し、この遺伝情報と同一のコピーをその子孫に伝えなければならない。この仕事を達成するために、全生物の増殖体細胞（非生殖）および生殖細胞は、反復細胞分裂周期（以降、「細胞周期」または「ＣＣ」と言う）を受ける。各細胞分裂周期が完了すると、細胞の遺伝情報が複製され、親細胞は、等しく分裂した親細胞ＤＮＡを有する二つの娘細胞に分裂する。細胞周期を含む生化学および生物分子プロセスは、とりわけ、酵素依存ＤＮＡ複製、酵素依存リン酸化、シグナルカスケード、転写活性化分子複合体の会合および解離、ならびに細胞膜および細胞骨格などの細胞構造要素のマクロ分子集合体の形成および解離を含む。Ａ．細胞周期段階細胞周期を特徴付けるプロセスは、調節された段階を形成し、細胞周期「エンジン」または「制御システム」の制御下、厳重に秩序に依存して進む。制御システムは、生物分子の「時計」または「発振器」として機能し、「チェツクポイント」での重要な制御を含む。LN Edmunds，Jr.，Ann．NY Acad．Sci．719:77-96( 1994); IA Carreら、J Cell Sci．104:1163-73(1993); BG Gabrielliら、J．Bio l Chem 267:1969-75(1992); A Goldbeter，Proc．Natl．Acad．Sci．(USA)8 8:9107-11(1991); Murray AW および Kirschner MW，Science 246:614-621（198 9）。正常な細胞周期段階では、ＤＮＡ複製の後、有糸分裂および細胞質分裂が続く。一般的には、AW Murray，Nature 359:599-604(1992); B Alberts ら、The cel l-division cycle（細胞分裂周期），IN: Molecular Biology of the Cell,第３版、Garland Publishing Inc.，New York(1994); BA Edgarら、Genes Dev 8:440 -52（1994）を参照。各プロセスが細胞周期中に適切な秩序で機能する一連の分子プロセスは、下流への勢いで細胞を細胞分裂の方向に移動させる。本明細書において、「下流」とは、Alberts（前出）によって定義された細胞周期段階の「下位の位置」を占める事象を意味する。細胞周期段階における秩序依存性は、ＤＮＡの複製が最大の忠実さで進むことを保証するものである。LH Hartwell ら、 Science 246:629-634(1989); PM O'Connor ら、Semin．Cancer Biol．3:409-416 (1992)を参照。真核細胞周期の段階は、機能的に保存された４個の標識に関する（図１）。Ｓ期では、ヌクレオチドが合成され、ＤＮＡが半分保存されて複製され、二重らせんのポリヌクレオチドになる。Ｇ₂期はＤＮＡ合成完了の後に続き、その間にＤＮＡが核タンパク質と会合する。Ｍ期では、核フィラメントが染色体として凝集し、染色体が有糸分裂のために分離する。そして、Ｇ₁期では、細胞が、消耗産物の置換およびＤＮＡ損傷の修復によって、分裂再開の準備をする。Alberts（前出）を参照。Ｓ期に入った細胞は、正常には、Ｇ₂期、Ｍ期および細胞質分裂の完結に付される。Ｂ．細胞周期チェックポイント期から期への変わり目が、細胞周期の主なチェックポイントである。正常な細胞では、それらは、Ｇ₁での決断点（開始点）ならびにＧ₁とＳ（Ｇ₁／Ｓ）およびＧ₂とＭ（Ｇ₂／Ｍ）との間の境界に関連するチェックポイント制御によってしっかり調節される。KA Heichman ら、Cell 79:557-562(1994); P Nurse，Cell 7 9:547-550(1994); AW Murray（前出）；AW Murray ら、Sci．Am．264:56-63(199 1); Hartwell（前出）を参照。サイクリン、サイクリン依存性キナーゼ（ｃｄｋまたはｃｄｃ）および、ｃｄｋまたはｃｄｃサイクリン複合体を調節する一連の補助タンパク質（ｐ１６、ｐ２１、ｐ２７、ｐ４５またはｐ５３など）などの特定のタンパク質の相互作用を制御することにより、細胞周期の連続する期が調節される。T Hunterら、Cell 79:573-582(1994); Heichman（前出）；Nur se（前出）；RW King ら、Cell 79:563-571(1994); LH Tsai ら、Oncogene，8:1 593-602(1993); M Doreeら、FASEB J．8:1114-1121（1991）。さらに、ｐ５３の機能およびＲｂ腫瘍抑制遺伝子産物（ｐＲｂ）のリン酸化も、Ｇ₁／Ｓ遷移と関連する。V karantzaら、Mol．Cell Biol．13:6640-52(1993); ME Ewen ら、Cell 73:487-97(1993); SJ Kuerbitzら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:7491-95(1 992); MB Kastan Cell，71:587-597（1992）。Ｃ．細胞周期動力学細胞集団において、細胞周期の各期の平均時間は、所与の期に細胞が存在する確率に比例する。ある細胞集団の連続した増殖中、子孫細胞の損失、静止または分化が生じないと仮定すると、どの集団、すなわち群に対しても、１回の細胞周期の平均時間は、２倍になる時間（すなわち出発細胞集団が２倍になるのに要した時間、すなわち世代時間）に等しい。LA Perezら、Cancer Res．55:392-398（ 1995）を参照。この概念は、数学的に表すことができる。すなわち、Ｔ_DBLは、現在の集団（Ｎ_P）を最初の集団（Ｎ_O）で割って２倍になる（Ｎ／Ｎ_O＝２）のに要する時間として定義される。Ｔ_DBLは、細胞周期の期における主な期の「分画時間」、すなわち、細胞集団の一部がＧ₁（Ｔ_G1）、Ｓ（Ｔ_S）またはＧ₂＆Ｍ（Ｔ_G2&M）を完了するのに要する時間を決定するための尺度である。理想の群の連続した増殖が、子孫の損失、静止または分化を何ら生じないと仮定すると、細胞周期の各期の分画時間は、その期をある瞬間に循環する細胞集団の画分（Ｆ）、すなわち、Ｆ_G1、Ｆ_SまたはＦ_G2&Mに正比例する。例えば、Ｔ_Sは、Ｔ_S＝Ｆ_SｘＴ_DBLとして計算できる。Albe rts（前出）および Perez（前出）を参照。特に、これは、Ｔ_DBLが連続的な細胞計数またはフローサイトメトリー(AC Beggら、Cytometry 6:620-626(1985)から決定でき、一方、Ｆ_S、Ｆ_G2&MまたはＦ_G1/G0は、フローサイトメトリーから得られるＤＮＡヒストグラムから測定できるので、重要な式である。標準的なフローサイトメトリーでは、核を、ＤＮＡの小さい溝に挿入する染料であるヨウ化プロピジウムで染色する。NM Shapiro，Practical Flow Cytometry ，Alan R Liss，NY(1988)。染料吸光度のヒストグラムによって、種々の量のＤＮＡ／核を有する細胞画分を区別する。すなわち、ＤＮＡの合成工程（Ｓ期）にある細胞またはＤＮＡの複製が完了した細胞（Ｇ₂期およびＭ期）は、ＤＮＡの複製をまだ開始していない細胞（Ｇ₁またはＧ₀期）と区別される。フローサイトメトリーによるＤＮＡヒストグラムは、ほとんどの試験条件下で再現可能であり、正確である。Perez（前出）；J Pierrez ら、Acta Biotheor．40:131-7（1992 ）を参照。ＤＮＡ合成は、ＢｕｄＲの取込みによっても測定される（Begg、前出）。生理学的刺激または周囲の増殖条件における変化が細胞集団の増殖速度を遅くする場合、Ｇ₁期（準備期）に存在する細胞画分は、典型的には、Ｓ期または増殖画分（すなわちＧ₂およびＭ期）における細胞を犠牲にして増加する。そのような変化または異常条件としては、ホルモン、栄養または環境の変化が挙げられる。異常条件が優勢である場合は、Ｇ₁期の細胞が細胞周期から一時的に退いて、「静止」または非活性状態になると考えられる。静止細胞は、通常、Ｇ₀期にあるとされる。R Baserga，Cell Division，Molecular Biology，IN: Encyclope dia of Human Biology 2:253-266(1991); AB Pardee，Science 246:609-613(198 9)。細胞の分化または特殊化法も、細胞がＧ₀に退くことと関係する。末端分化では、細胞周期外、すなわちＧ₀への遷移は不可逆になる。末端で分化した細胞の例としては、成人ニューロン、角質化上皮および随意筋細胞が挙げられる。Ｄ．アポトーシスアポトーシスは、「プログラムされた細胞死」のプロセスを意味する。正常な体細胞の発生中に、特定の器官または組織における細胞集団に対して、組織再編成または萎縮という発生上の進化の一部としての死をプログラムすることができる。JJ Cohen，Avd．Immunol 50:55-85(1991); M Baringa，Science 259:762-3 （1993）を参照。アポトーシスは、細胞周期に固有の生化学または生物分子機構によって内部的に誘発され、その結果、内因性エンドヌクレアーゼ（ＤＮＡを分解する酵素）の活性化を生じ、断片化によってヌクレオソーム間のＤＮＡ鎖の切断およびゲノムＤＮＡの分解を引き起こす。AH Wyllie，Nature 284:555-6(1980 )。成熟組織のアポトーシスは、炎症または若返りなどの正常なプロセスで生じる。M Schmiedら、Am J Pathol 143:446-52（1993）。免疫疾患または悪性疾患における異常なクローン増殖は、正常なアポトーシスの欠損に関係すると考えられる。J Marx，Science 259:760-1(1993)。癌の化学療法の際のアポトーシスおよび／または細胞傷害と細胞周期（チェックポイント制御を含む）との関係は、腫瘍遺伝子学者および分子生物学者の関心の的である。T Shimizu ら、Cancer Res．55:228-231(1995); O'Connor，（前出），(1992)を参照。傷害のある細胞におけるｐ５３の発現は、ＤＮＡ修復またはアポトーシスのいずれかを引き起こし得る種々の生化学経路のコース決定における一つの因子である。E Yonish-Rouach ら、Mol Cell Biol 13:1415-23(1993); DE Fisher，Cell 78:539-542(1994)。細胞活性の増殖からアポトーシスへの変換の下には、細胞分裂周期における相反する信号があると考えられる。Fisher（前出）。細胞周期遷移境界に入る、もしくは横断する細胞、またはＤＮＡの複製もしくは修復過程にある細胞は、最もアポトーシスを受けやすい。ＴＣＩで処理した細胞または新形成細胞では、サイクリン依存性キナーゼなどのチェックポイント制御が解除され得る。この解除は、開始からのＤＮＡ複製または細胞分裂事象およびホメオスタティック秩序依存性を緩め、細胞傷害を強め得る。同上。 11．化学療法における細胞毒性薬の役割癌の化学療法の現在のモデルは、主に、二つのセントラルドグマに基づいている。第一に、臨床的に検出可能な腫瘍細胞塊は、いずれか１つの化学療法薬に対して生物学的にいくらか有意なレベルの耐性を示すかなりの数の細胞を含むに違いない。JH Goldie ら、Cancer Treat Rep．53:1727-1733（1979）。第二に、容認されている Gompertzianモデルによれば、腫瘍細胞の死滅は、活性増殖における細胞画分に関する。LA Norton，Cancer Res．48:7067-71(1988)。悪性疾患に対する化学療法において、ＴＣＩによる治療は、臨床上考慮すべき多くのことを含んでおり、癌を制御するための第一の試みにおいて（導入補助化学療法）、または手術もしくは放射線治療の補助として（補助化学療法）使用できる。DeVita、前出（1994）。局所治療としては、乳癌または卵巣癌などの悪性疾患の広がりを制御するための体腔へのＴＣＩの注入が挙げられている。同上。Ａ．単独薬物化学療法単独薬物誘導における使用目的は、安全性が最高で、耐えられる用量を投与して、最大の癌細胞の死滅または増殖停止を達成することである。しかし、癌患者は、悪性疾患に対する細胞媒介免疫応答を準備する能力が低下しているため、ヒトの体における癌の制御に単独薬物化学療法で十分であることはめったにない。新形成（癌性）集団は異質性であり、耐性細胞の画分は、典型的には死を逃れる。保護機構を有する悪性細胞のサブ集団は、最終的には、最初の感受性の強い細胞の集団に取って代わる。第一の単独薬である葉酸アンタゴニストは、ＤＮＡ生合成を標的とした。VT D eVita，New Engl．J．Med．298:907-910（1978）。Ｓ期に関連するＤＮＡの複製および細胞分裂は共に、化学療法の標的である。ＤＮＡ合成を標的とするＴＣＩの例としては、代謝拮抗物質、アルキル化剤、天然毒素または抗生物質、白金配位錯体および置換尿素が挙げられている。これらの薬物の公知作用は、Calabres i（前出）で説明されている。ＴＣＩとして作用し得る薬物は、細胞周期段階の際に種々の方法で細胞傷害を開始し得る。例えば、ＴＣＩは、酵素を阻害し、基質に対して競合し、分子生合成における転写、翻訳もしくは翻訳後工程を阻害し、転写もしくは翻訳エラーを導入し、分子立体配置の変化を乱し、分子の運搬を阻害し、エネルギー転移分子に対して競合し、巨大分子の重合を妨害し、分子架橋を形成し、ＤＮＡにおいてアルキル化し、もしくは鎖の切断を引き起し、またはＤＮＡらせんに挿入し得る。すなわち、ＴＣＩは、ＲＮＡ転写および翻訳、ＤＮＡ鎖の伸長、複製、修復、超分子の構成もしくは分離、分子の運搬、または巨大分子の分離などの細胞周期過程を損なうと考えられる。あるいは、細胞周期段階の特定のサブセットの完了の成功と関連する多細胞小器官のいずれかを選択的に損なうかもしれない。新形成細胞でのＴＣＩによる選択的傷害の可能な別の様式は、正常には細胞周期段階を制御するサイクリン依存性キナーゼ（ｃｄｋまたはｃｄｃ）などのチェックポイント制御の低下または欠乏である。チェックポイント制御の役割は、秩序依存性を緩める薬物または突然変異の認められる効果によって定義されている。HA Crissman ら、Proc．Natl．Acad．Sci．(USA)88:7580-84(1991);Kastan（前出）；Murray、前出(1992); Hartwell（前出）を参照。正常に循環する細胞の細胞周期は、細胞が引き続きＳ期を通ってＤＮＡ複製を生じるようにするＧ₁決断点（開始点）を通らなければならない。Heichman（前出）。すなわち、開始点の前にＴＣＩに暴露された細胞は、Ｇ₁内での遅れによってＤＮＡ傷害から部分的に保護され得る。このＧ₁の遅れは、腫瘍サプレッサーｐ５３によって媒介され、細胞は、傷害を受けたＤＮＡ鎖を複製前に修復することができる。Kastan（前出）。開始点後のＤＮＡに対する傷害またはＤＮＡ傷害および開始点の迂回は、生物学的に有害であると考えられ（PM O'Connorら、Cancer Res．4776（1994 ））、恐らく、Ｓ期でのＤＮＡ複製が不正になり、その結果、遺伝的不安定および最終的には未熟細胞の死を生じる。Hartwell、前出; Kuerbitz、前出; Shawら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:4496-9(1992); T．Weinert，Semin．Cancer Biol．4:129-140（1993）。真核細胞におけるＳ期を標的とする薬物の作用は、Ｓ期でのＤＮＡ複製の性質により、本質的に複雑である。例えば、複製起点は不連続であり、鎖の伸長は非同時的に進み、複製フォークでの進行は不規則であり得る。CS Newlon，Science 262:1830-31(1993); V Levenson ら、Nucleic Acids Res．21:3997-4004(1993) 。しかし、ＤＮＡ鎖が全細胞周期段階内の平行なプロセス段階で複製するときですら、ＤＮＡ鎖は、重大な酵素または代謝中間体を共有する(Murray、前出(1992 ); Laskey ら、Science 246:609-613(1989); Nurse（前出）；Heichman、（前出）。細胞周期に関する知見が急速に進んだ際に、癌の化学療法に対する現代の方法が発達した。すなわち、新形成細胞は、細胞周期のＳ期の間に作用する薬物の害を受けやすいことが認められた。Ｓ期をさらに研究するために、代謝拮抗剤を使用して、ＤＮＡの複製能力に影響を及ぼすプリンまたはピリミジンヌクレオチド生合成と関連する酵素を抑制した。これらには、細胞周期のＧ₁／Ｓを通過する標的細胞の進行を阻止するための、ｄＴｈｄまたはヒドロキシ尿素（ＨＵ）などのリボヌクレオチド還元酵素（ＲＮＲ）阻害剤；メトトレキサート（ＭＴＸ）などのジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤；またはアフィジコリン（Ａｐｈ）などのＤＮＡポリメラーゼ阻害剤が含まれていた。G Galavaziら、Exp．Cell Res．41:428- 51(1966); D Thomas ら、Cell 5:57-32(1975); T Ashihara ら、Methods Enzymo l．58:248-262(1979); Levenson（前出）。また、過剰な正常代謝物質ｄＴｈｄは、悪性疾患起源の多くの細胞系または他の増殖細胞におけるＤＮＡ複製を可逆的に阻止し得ることが立証された。D．Kuf e ら、Cancer Treat．Rep．64:1307-1317(1980)。他の研究では、過剰のｄＴｈｄの使用により、ＭＴＸまたはＨＵよりも損傷が少なくなることが見いだされ、ｄＴｈｄを除去すると、細胞が細胞周期の残りを同調進行することができた。HR Zielke ら、Methods in Cell Biology 8:107-12 1(1974); RE Meyn ら、Methods in Cell Biology 9:103-113(1975)。その結果、ｄＴｈｄによる細胞周期の反復同調により、Ｓ期で比較的純粋な細胞集団が生じた。Zielke（前出）。ｄＴｈｄまたはＨＵなどのＲＮＲ阻害剤の単独薬物としての高用量での使用も癌治療において調べた。ｄＴｈｄの使用に関する多くの論文を精密に再吟味した。Ellims、前出; O'Dwyer ら、Cancer Res 47:3911(1987); SO Ooi ら、Experie ntia 49:576-81(1993)を参照。白血病、リンパ腫または固形腫瘍の患者においていくつかの成功例が報告された。DW Kufe ら、Cancer 48:1513-6(1981);A levya ら、J Cancer Res．Clin．Oncol．107:211-216(1984); RL Schilskyら、Cancer Res．46:4184-4188（1986）。ｄＴｈｄの6 mMまでの血液レベルが、経口投与で達成できた。MS Blumenreichら、Cancer Res．44:2203(1984); O'Dwyer、前出。しかし、一般に、ｄＴｈｄの単独薬物化学療法としての使用は、悪性細胞への傷害可能性が限界的であると考えられた。何らかの治療効果を生み出すのに必要な用量では、しばしば毒性副作用を生じた。Ｂ．併用化学療法癌の治療では、悪性細胞を死滅させる宿主免疫機序が典型的には有効でないため、２、３の悪性細胞ですら、その生存は、抗−感染治療においてよりも重大である。従って、外因性の細胞の破滅は、臨床的緩解の延長または治癒の達成において大きな役割を果たす。しかし、通常の化学療法の関係では、細胞の死滅は、一次動力学によって説明される。単独ＴＣＩの用量の増加は、残りの悪性細胞の割合の増加を選択的に害するが、潜在的に悪性のどの細胞をも、宿主を犠牲にすることなく破壊できるわけではない。Calibresi（前出）。数学的には、これは、速い走者と遅い走者とのゼノスのパラドックスに類似している(WL McLaughlin ，Sci．Amer．271:84-89，1994）。 1960年代以来、単独薬物によって可能であるよりもさらに永続性のある臨床応答を生み出すために、薬物を組み合わせることに多くの信頼を置いている。RL C apizziら、Sem．Oncol．4:227-253(1977); DeVitaら、Cancer 35:98-110（1975 ）。DeVita、前出（1994）は、耐えられる毒性により細胞の死滅を最大にし、異質腫瘍集団において害の受けやすさの異なる癌細胞を取扱い範囲とし、耐性の増加を発展させる新形成クローンの発生を防いだり、遅らせるための、薬物の併用という一般的に一致した目的を論じている。 DeVitaはまた、薬物併用の現在の選択におけるいくつかの原則を述べている。 (i)各薬物は、細胞の死滅において、単独薬物として有効であるべきである。 (ii)薬物は、用量強度を最大にさせるために、作用の異なる種類のものを組み合わせるべきである。 (iii)患者の罹患率または死亡率の追加は避けるべきである。 (iv)薬物投与のスケジュールまたは間隔は、最適にすべきである。上述したように、細胞毒性薬物に対する細胞耐性の発生は、ｐ５３または他の細胞周期制御遺伝子における突然変異を含み、細胞周期の秩序依存性またはチェックポイント制御における異常性を伴う可能性がある。CS Morrow ら、Ann．NY Acad．Sci．698:289-312（1993）。多重薬物の適切な選択および高い用量強度の達成は、現在、その耐性の発生を避けるための化学療法プロトコールの設計における重要な問題点として認識されている。化学療法薬物の併用によって細胞傷害を増加させるための手段として細胞周期の調整を目指した努力が行われている。その目的は、悪性細胞を、傷害を最も受けやすいと考えられる細胞周期のＳ期内に保持することであった。HO Kleinら、 Semin．Hematol．11:203-27(1974)を参照。RL Stolfi ら、Pharmac．Ther．49: 43-54(1991)は、これらの方法を「細胞質分裂調整」と名付けた。細胞毒性薬物の連続した適用による共働的死滅を調整するために、細胞集団を細胞周期の特定の点で阻止するためのＭＴＸ、ｄＴｈｄまたはピリミジン類似体のいくつかの使用が試験された。B Bhutanら、Cancer Res．33:888-894(1973); Ellims、前出; SD Hendersonら、Invest．New Drugs 5:142-154(1987); Stolfi （前出）。この方法は、しばしば、細胞周期の「同調」と言われている。Capizz i（前出）。高濃度の代謝拮抗物に暴露した細胞は、細胞分裂周期の段階の限られたサブセット内、典型的にはＧ₁後期またはＳ期初期内の特定の点で抑止される。すなわち、その集団の細胞はほとんど、または全く、この抑止点を越えて前進することができない。従って、この種の効果は、細胞周期の「阻止」または「静的同調」としてより多く記載されている。W Vogel ら、Hum．Genet．45:193-8 （1978）。癌細胞の増殖を細胞分裂周期の操作によって制御するための他の多くの努力は、傷害の標的とされる細胞集団内での細胞周期配分を変えることに向かっていた。他のプロトコールは、Ｇ₀期またはＧ₁期の悪性細胞を刺激して増殖状態にし、こうして、ＤＮＡ複製中に作用する代謝拮抗薬物に対する害の受けやすさが増加するように設計した。HH Eulerら、Ann．Med．Interne．（Paris）145:296-302( 1994); BC Lampkin ら、J.Clin．Invest．50:2204-14(1971); Alama ら、Antica ncer Res．10:853-8（1990）。逆に、他のプロトコールは、正常細胞がＳ期に入るのを妨げ、こうして、正常細胞が代謝拮抗物質によって意図しない傷害を受けることから保護するように設計した。Capizzi（前出）。併用薬物は、追加、共働、または拮抗的効果を有し得る。直観的には、悪性細胞の細胞周期の阻止または静的同調を引き起こす薬物の併用は、一次動力学の問題を回避し、合わせた用量は、宿主を犠牲にすることなく、悪性細胞全てを満たすのに十分なレベルに増加させることができると推定される。悪性細胞集団を、連続したＴＣＩによる害を特に受けやすい限られた細胞周期段階に制限することは、細胞死滅の動力学がより効果の大きい方にシフトし、宿主のＴＣＩへの累積暴露時間を減少させることにより副作用が減少することが期待され得る。しかし、実際の試みでは、細胞周期阻止または静的同調の方法は、思ったほどではなかった。Capizzi（前出）。これは、その手法が本質的に不適当であることによる。細胞周期を阻止する場合、全ての細胞は、細胞周期の特定の部分内にある。細胞周期のこのサブセットが、ＴＣＩが最も効果的な細胞周期のサブセットと完全には重ならない場合、細胞周期阻止は、連続ＴＣＩの共働的作用、または追加作用すら生じるものではない。細胞周期阻止または静的同調は、細胞周期の影響を受けた期が実際に連続ＴＣＩの関連標的間隔を含むときにのみ有利であり得る。連続ＴＣＩの標的間隔は下流に位置して、阻止された、または静的に同調された集団の動的境界内ではないと考えられる。細胞周期阻止または静的同調に影響を及ぼす高濃度の薬物も、単独薬物ＴＣＩとして作用し得るので、いくつかの細胞の死滅または傷害は、連続ＴＣＩの添加の前ですら生じる。事実、連続ＴＣＩが、実際に、より潜在的な致死剤であり、細胞周期阻止の点よりも下流で作用するならば、細胞周期阻止または静的同調は、細胞を連続薬物から実際に保護するであろう。この問題は、ｄＴｈｄを同調剤として高用量で使用した以前の試験で例証された。細胞周期阻止に有効な血液濃度を達成するのに必要なｄＴｈｄの用量（＞3 mM）は、しばしば、患者にとってあまり耐えられない毒性副作用を引き起し、治療効果に関して容認できなかった。一組の試験での明言された目的は、最大に耐え得る用量を運搬することであり、経口投与により、6 mMまでの血液レベルが達成された。Blumenreich（前出）。O'Dwyer（前出）。この濃度範囲は、Ｇ₁期の細胞がＳ期に入るのを妨げる（すなわち、Ｇ₁／Ｓブロック）ためのin vitroでの使用に成功した（JH Kim Biochem Pharmacol 14:1821-9(1965); Littlefield、前出; Kufe、前出）が、患者において悪性細胞増殖の臨床的阻害を誘導する効力は十分には示されなかった。すなわち、二次的毒性は、患者にとって耐えるのが困難であることが分かり、ｄＴｈｄをさらに使用するまでもなく、その使用はもはや支持も報告もされない。Blumenreich（前出）；O'Dwyer（前出）；Ooi（前出）。化学療法での細胞周期阻止または静的同調を行うために化学療法で以前に使用した薬物のほとんどは、恐らく、Ｇ₁期の後期またはＳ期の初期で作用した。Cap izzi（前出）。従って、それらの薬物は、細胞周期段階のより後期、例えばＳ期の後期に始まる作用を有するＴＣＩを増強することは恐らくない。癌の化学療法に対する静的同調への改良法において、多くの研究者らは、特定の薬物の併用計画が in vitro でも in vivoでも、共働致死効果の産生に重要であることに注目した。Capizzi（前出）；Stolfi（前出）。しかし、これらの併用の多くは、使用する薬物の順序、濃度の割合、スケジュールまたは期間に対する明らかな理論的説明もなく、ただ試行錯誤的に試験された。AL Adel ら、Canc er Invest 11:15-24（1993）を参照。臨床用語では、細胞周期阻止を第二の薬物の継続的適用と組み合わせるという治療方法を、「スケジュール依存性増強」（例えば、Capizzi、前出）または「生化学的調整」（FM Muggia ら、Semin．Onco l．(3 Suppl)9:90-3（1992））と言う。細胞周期操作の一つの特定の方法を、「パルス投与化学療法」と言った。RE M oranら、Cancer Treat．Rep．64:81-6（1980）。この特定の方法では、マウスの白血病腫瘍細胞を、マウスのヒドロキシウレア（ＨＵ）による輸液処理中、細胞周期のＳ期で抑止した。ＨＵの輸液終了後、細胞を「開放」して、細胞周期の通過を続けた。ＨＵ輸液終了後に、限られた回数で、実験動物を第二の薬物(Ara-C )の「パルス」により処理した。この方法は、細胞分裂周期の特定の抑止点での阻止が逆方向になり、その結果、細胞が、細胞周期を正常な速度または可能な限り加速された速度で共同して移動する、HR Zielke（前出）および JL Littlefie ld ら、(1974)の阻止法と比較することができる。「パルス投与化学療法」の意図は、細胞が細胞周期を共同して移動しているときの第二の薬物の衝撃を最大にすることである。マウスの平均生存時間を測定した。ＨＵ輸液がちょうど終わった０時間においてAra-C で処理したマウスは、改善された生存を示したが、ＨＵ輸液を停止した後、より遅い時間にAra-C で処理すると、ＨＵの効果は増強されなかった。この細胞周期同調に続いて第二の薬物で処理する手法は、二つの薬物の作用が同時でないことに依るものである。さらに、動物の平均生存時間に関する間接的結果は、腫瘍細胞傷害に対する効果に直接翻訳され得ない。併用化学療法での主な挑戦は、用量、薬物動力学、順序およびスケジュールの多変数に鑑みて、最適の相乗作用を決定することである。二つの薬物に対してすら、最も有効な利用が、各薬物の最適値を単に組み合わせた分析から必ずしも明らかにされるとは限らない。経験的な変数としては、各薬物の用量または効果的濃度、薬物の順序、投与間の間隔、すなわちスケジュール、投与の期間、および治療１クールに対する投与回数が挙げられる。Capizzi（前出）；Adel（前出）を参照。また、MC Berenbaum，Pharmacol．Rev．41:93-141(1989)も参照。組織培養を使用した in vitro 試験または動物モデルでの試験は、臨床に適用する前の提案された併用に対して指針を提供し得る。J Plowman ら、Cancer Res .55:862-7(1995); ME Wallら、Cancer Res．55:753-60(1995); J Higashihara ら、Gynecologic Oncology 48:171-179(1993); Berenbaum（前出）Rev．41:93-1 41(1989); PC Schroy IIIら、Cancer Res．48:3236-3244(1988); RH Shoemaker ら、Cancer Res．45:2145-53(1985); Capizzi（前出）。化学療法剤の in vitro 評価の技術的方法は変化しているが、染色または染料吸収による細胞増殖の阻害の測定は、定量分析法として国立癌研究所で容認されている。Plowman（前出）。標識指数を得るための³Ｈ−チミジンの吸収は、化学療法剤に対する腫瘍細胞感度を分析する別の一般的な方法である。GH Baltuchら、Neurosurgery 33:495-501(1993); IP Haywardら、Int．J．Cell Cloning 10:1 82-9(1992); Schroy（前出）。この方法は、核酸利用プールの大きさまたはチミジンキナーゼ活性の相違により、信頼され得なくしている。同様の方法が、ハロゲン化ピリミジン類似体または Hoechst染料に対する抗体がＳ期の細胞を追跡するフローサイトメトリーの技術によって提供されている。Perez（前出）；JP Pe rras ら、Cytometry 14:441-8(1993); P Ubezio ら、Cytometry 12:119-126(199 1); M Poot ら、Biochem．Pharmacol．41:1903-9(1991)。古典的には、二つの薬物の共働的相互作用は、分別阻害濃度が計算できる一連の用量−応答曲線を使用して評価する。GB Elionら、J．Biol．Chem．208:477-8 8(1954); Berenbaum（前出）；GM Eliopoulos ら、Chapter 13，pp.432-492，IN : Antibiotics in Laboratory Medicine，第３版、V Lorian編。データは、チェッカーボード技術により得ることができる。Lorian（前出）；Howardら、Int．J ．Cell Cloning 10:182-9(1992)を参照。この分析方法は、isobologram として公知である。 isobologram 法に関していくつかの問題点がある。第一に、化学療法で使用する多くの薬物の用量応答曲線が、非常に高い濃度では、非直線になる。第二に、比較したい薬物が、単独使用において、非対称的に効力を示したり、弱かったりすると、比較が不可能である可能性がある。第三に、isobologram から計算した共働係数が細胞毒性の各固定レベルに対して異なる可能性があるので、結果はかなり変わり得る。すなわち、isobologram に対するデータの収集は困難であり、isobologram 法は、実際の効果に対して薬物併用の最適範囲を例証する範囲が限られている。Be renbaum（前出）。この欠点を解決するための努力により、データを三次元の表面構成体として分析することが提案された。WR Grecoら、Cancer Res．50:5318- 27（1990）または他の特定の方法(RC Liら、Antimicrobial Agents & Chemother apy 37:523-531，1993）。しかし、これらの解決法は、結局、isobole データ表示を含む。その問題は、二つの薬物より多くの多変数相互作用を含む治療法に対しては、過度に複雑になる。Ｃ．細胞周期に影響を及ぼす他の細胞毒性薬物化学療法剤の細胞周期事象に対する適用に関する他の最近の努力は、チェックポイント制御の役割(O'Connor、前出(1992))、またはｐ５３遺伝子産物もしくはｐ２１^Walf/CIPIの関連産物の誘導操作によるアポトーシスの調節（WE EI-Deiry ら、Cell 75:817-825(1993)）に焦点が当てられている例えば、タンパク質キナーゼは、新形成において重要な役割を果たしている。過発現は、血液悪性疾患と関連している。GQ Daleyら、Science 247:824-30（19 90）。新形成細胞は、Ｇ₁の通過およびＤＮＡ複製への傾倒のキナーゼ−媒介制御に欠けている可能性がある。癌細胞におけるいくつかの高レベルのタンパク質キナーゼは、Ｓ期を標的とする通常の化学療法剤に対する多薬物耐性と関連している。Baltuch（前出）；JA Posada ら、Cancer Commun．1:285-92(1989); K Ka wamura，Hokkaido Igaku Zasshi 69:354-71(1994)。癌制御におけるタンパク質キナーゼ阻害剤の使用は、いくつかは非常に効力のある毒素であるが、ＤＮＡをアルキル化または架橋させる通常の薬物よりも突然変異誘発性が恐らく小さいので、有望であると思われる。CA O'Brianら、J．Nat l．Cancer Inst．82: 1734-5(1990); S Akinagaら、Cancer Chemother．Pharma col．33:273-80(1994); GK Schwartz ら、J．Natl．Cancer Inst．85:402-7（19 93）。効力のあるタンパク質キナーゼ阻害剤のスタウロスポリン（ＳＴＳＰ）およびいくつかの機能的類似体は、（１）多薬物耐性を逆向きにし、または調整し (KE Sampsonら、J Cell Biochem 52:384-95(1993); CH Versantvoortら、Br．J ．Cancer 68:939046(1993); K Miyamotoら、Cancer Res．53:1555-9(1993); Ｉ Utz ら、Int．J．Cancer 57:104-10(1994))、（２）細胞周期の進行を阻止し（S Bruno ら、Cancer Res．51:470-473(1992); Crissman，前出）、あるいは（３）アポトーシスを誘導することができるので(Bertrandら、Exp．Cell Res．211: 314-321(1994); DW Jarvisら、Cancer Res．54:1707-14(1994))、興味深い。ＳＴＳＰは、Streptomyces staurosporousの産物であり(Meksuriyen DおよびC ordell GA，J of Nat．Products 51:893-899(1988))、タンパク質キナーゼのスペクトルの広い最も効力のある阻害剤の一つである（Tamaoki，Methods Enzym.2 01:340-347(1991)）。タンパク質キナーゼＣおよびチロシンキナーゼに対する作用（CD Smithら、Biochem．Biophys．Res．Comm．156:1250-1256(1988))の他に、ＳＴＳＰは、Ｓ／Ｇ₂遷移に関連するサイクリン依存性キナーゼを阻害し(DM G adbois，Biochem．Biophys．Res．Comm．189:80-85(1993))、細胞周期のＧ₂期における新形成細胞を阻止し得る。本明細書で説明する、ヒト神経膠腫細胞系内の研究（Baltuch（前出）およびP L Kornblith による追加の編集後記ならびに Schwartz（前出）の以前の論文および多薬物耐性に対するその効果の研究を参照）は、ＳＴＳＰが癌の化学療法において効力があることを示している。しかし、ヒトでの臨床実験のデータに対する報告はない。RA Buchholz ら、In Cellular and Molecular Mechanisms in Hy pertension，p.199-204，Plenum Press，NY(1992)および Hypertension 17:91-1 00(1991)によるラットおよびイヌでの研究は、500 mMのヒト血漿レベルが試験可能であると考えられることを示唆している（表＿参照）。しかし、これはまだ確かでない。キナーゼ阻害剤Ｋ２５２Ａ、ＫＴ５７２０およびＫＴ５９２６は、タンパク質キナーゼの阻害に関して種々の範囲の効力を有する。それらは、一連の文献に記載されている。すなわち、WE Payneら、J．Biol Chem．263:7190(1988); RL Ray nor，J．Biol Chem．266:2753(1993); C．Schachteleら、Biophys Biochem Res Comm 115:542(1968); H Kase ら、Biochem Biophys Res Comm 142:436(1987); S Nakanishiら、Mol Pharmacol 37:482(1990); WH Fletcherら、J Biol Chem 261 :5504(1986);および HC Chang ら、J Biol Chem 261:989(1986)である。それらは、臨床的にはまだ試験されていない。Ｄ．化学療法に関する問題点化学療法および他の目的に対するＴＣＩの現在の使用では、いくつかの問題が広く認められている。第一の問題は、非特異性である。ＴＣＩは、選択性が十分ではなく、傷害に対して意図しない細胞の損傷を生じる可能性がある。同上、EM Ross，Chapter 2，p.33-48，薬物動力学：薬物作用の機序および薬物濃度と効果との関係、IN: Goodman and Gilman's The Pharmacologic Basis of Therapeu tics,第８版(AG Gilman ら編、Pergammon Press，New York，1990)を参照。第二の問題は、雑多な害を受けやすいことであり、この場合、死滅を意図した集団における細胞の固有の遺伝子可変性が、絶対かつ特定の死亡率を達成するための努力を無効にし得る。Calabresi（前出）を参照。第三の問題は、耐性の獲得であり、ＴＣＩによる傷害を意図した細胞のいくつかの画分が、生理学的もしくは代謝的適応または遺伝子の突然変異により、ＴＣＩに対する耐性を獲得する。同上。単独または多重の臨床化学療法では、非特異的「副作用」が有害で耐えられなくなる可能性があり、その結果、かなりの患者の罹患率を生じる。M Pirisiら、 New Engl．J．Med．330:1279(1994); SM Grunbergら、New Engl．J．Med．329:1 790-1796(1993); O'Dwyer（前出）を参照。臨床薬物療法では、細胞毒性薬物の選択性または「治療指数」を増加させることが有益であると考えられる。Gilman （前出）。すなわち、治療薬物投与における治療薬物の開発または改善という重要な目的は、特定の細胞毒性効果、例えば、指定した細胞集団の意図した死滅または傷害の、宿主罹患率または環境破壊を生じる非特異的副作用に対する比を増加させるための努力を含む。さらに、効力がもっと大きい薬剤の開発も必要である。癌の化学療法の大きな制限は、ＴＣＩなどの有効な抗癌剤の用量が、耐えられない副作用により、用量−応答曲線の高端に増大させることができないことであると認識されている。DeVita、前出（1994）。また、現在の問題点は、設計した組み合わせから一つ薬物を省くと、その薬物には敏感であるが、他の薬物に対しては耐性がある細胞系によって過増殖する可能性があることである。別の問題点は、有効な薬物を最大強度よりも少なく使用すると、薬物併用プロトコールの目的が損なわれ得ることである。ＴＣＩの治療効果の増加は、一次誘導または補助的化学療法の両方で有益である(R Arriagada ら、New Engl．J．Med．329:1848-52(1993); WC Wood ら、New Engl．J.Med．33:1253-9(1994))。緩解後化学療法に対しては、RJ Mayerら、New Engl．J．Med．331:896-903(1994); 高用量化学療法および続く自己造血救援に対しては、WP Peters ら、J．Clin．Oncol．11:1132-43(1993); AM Marmont，Lu pus 2:151-6(1993);移植を意図した組織からの悪性細胞の体外除去に対しては、 F．Sieber および M．Sieber Blum 46:2072-6(1986); F．Linら、Cancer Res．5 2:5282-90(1992); または、体腔における転移腫瘍の縮小に対しては、MEL van d er Burgら、New Engl．J．Med．332:629-34(1995);R．Arnold，Eur．J．Clin．I nvest．20 Suppl 1:S82-S90(1990)。従って、当技術分野においては、第二の薬物の標的細胞に対する毒性効果を最大にし、非標的細胞に対する毒性効果は最少にするように第一の薬物が細胞周期を調整する、投薬法の新規組み合わせを含む、細胞死滅剤の新規組み合わせが要求されている。当技術分野におけるこの要求は、癌の化学療法の領域において特に重大である。図面の簡単な説明図１は、細胞分裂周期ならびに関連する主なサイクリン、サイクリンキナーゼおよび他の調節タンパク質の図表である。図２は、ＴＣＩの標的区間を通過する細胞の移り変わりを表す棒グラフ（Ａ）およびＲＡの存在下での標的区間を通過する細胞の遅い移り変わりを表し、結果として「細胞の積み重ね」を生じる棒グラフ（Ｂ）を示す。図３は、ＲＡの操作上の特徴により薬物濃度を同定して、参照箇所の細胞周期における位置を決定するためのアルゴリズムを示す。図４は、ヒト前単球リンパ腫細胞のほぼ一倍加時間の24時間中に、ｄＴｈｄの 40 %阻害濃度が2 mMを超えたことを示すＭＴＴアッセイの結果を示す。図５は、ヒト前単球リンパ腫細胞の細胞周期動力学が種々の濃度のｄＴｈｄ処理によりどのように変化するかを示すフローサイトメトリー分析の結果を示す。特に図５Ａは、3 mMのｄＴｈｄまで濃度を増加させて示し、図５Ｂは、ＩＣ₄₀より十分下の濃度を示す。図６は、ヒト前単球リンパ腫細胞に対してＨＵの濃度を増加させた用量応答曲線を示す。この図は、ＨＵに対するＩＣ₄₀が3 mMを超えていることを示す。図７は、ＨＵの濃度を変化させて処理したヒト前単球リンパ腫細胞のフローサイトメトリー分析を示す。図８は、＞0.5 mMのｄＴｈｄで処理したヒト前単球リンパ腫細胞から抽出したＤＮＡの断片化を示すＤＮＡゲル電気泳動実験の結果を示す。図９は、細胞周期の進行に対するｄＴｈｄの影響を示す一連のフローサイトメトリーＤＮＡヒストグラム（ａ〜ｃ）およびリン酸化状態を示すｐＲｂ運動性に対するイムノブロット（ｄ）である。図１０は、ＲＡおよびＴＣＩを共働的にマッチングするためのアルゴリズムである。図１１は、Ｓ期の事象に関する化学療法剤の作用を示す図である。図１２は、微量培養指示薬系に対する試薬の二変数順次２倍希釈によるマルチウェル微量培養プレートの構成を示す図である。図１３は、ヒト前単球リンパ腫細胞に対するｄＴｈｄおよびＳＴＳＰの相互作用の影響を試験することによる、ＭＩＳアッセイのデジタル化した反射率画像を示す。図１４は、本発明を行うことができるデータ処理システムを示す。図１５は、ｄＴｈｄの順次２倍希釈に対して確認された結果および加算結果を直線グラフとしてプロットした、ｄＴｈｄおよびＳＴＳＰによるＭＴＴ試験の結果を示す。図１６は、ｄＴｈｄの順次２倍希釈に対して確認された結果と加算結果との相違としてグラフ化した、マルチウェル微量培養プレートにおけるｄＴｈｄおよびＳＴＳＰによるＭＴＴ試験の結果を示す。図１７は、ヒト前単球リンパ腫細胞に対するｄＴｈｄおよびＳＴＳＰの相互作用の影響を試験することによる、ＬＤＨアッセイのデジタル化した反射率画像を示す。図１８は、ＬＤＨアッセイで測定した、ｄＴｈｄおよびＳＴＳＰの濃度を変化させて処理したヒト前単球リンパ腫細胞のＯ／Ｓプロットを示す。図１９は、ＭＴＴおよびＬＤＨアッセイの比較し得る直線性を示す、グラフおよびデジタル化した反射率画像を示す。図２０は、遅延増殖アッセイでの影響を示す、ｄＴｈｄおよびスタウロスポリンの濃度を変化させて処理したヒト前単球リンパ腫細胞に対する累積増殖曲線を示す。図２１は、遅延増殖アッセイにおけるｄＴｈｄおよびＳＴＳＰの濃度を変化させて処理したＨＰＬＣに対する集団の減少％を示すグラフである。図２２は、ＴＣＩをその標的区間において同定するためのアルゴリズムを示す。図２３は、ｄＴｈｄおよび／またはＳＴＳＰに暴露したヒト前単球リンパ腫細胞からの抽出物におけるＤＮＡ断片化のラダーパターンを示すＤＮＡゲル電気泳動の結果を示す。図２４は、ＳＴＳＰで処理したヒト前単球リンパ腫細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示し、細胞周期のＧ₂およびＭ期における蓄積を示す。図２５は、ｄＵＴＰで標識したヒト前単球リンパ腫細胞の分析結果を示す一連の二変数フローサイトメトリーＤＮＡヒストグラム（Ａ〜Ｉ）である。パネルＡは未処理の対照細胞であり、パネルＢおよびＣはｄＴｈｄで処理した細胞であり、パネルＤはＳＴＳＰのみで処理した細胞であり、パネルＥはＳＴＳＰの前にｄＴｈｄで処理した細胞であり、パネルＦはＫＴ５９２６のみで処理した細胞であり、パネルＧはＫＴ５９２６およびｄＴｈｄで処理した細胞であり、パネルＨはＫＴ２５２ａのみで処理した細胞であり、パネルＩはＫ２５２ａおよびｄＴｈｄで処理した細胞を示す。図２６は、細胞周期に対する動的遅延の影響を示す図である。図２７は、ｄＴｈｄおよびＳＴＳＰの添加の前にＴＰＡとともにインキュベートしたヒト前単球リンパ腫細胞から抽出したＤＮＡのＤＮＡゲル電気泳動実験の結果を示す。図２８は、ｄＣｙｔの存在下でｄＴｈｄおよびＳＴＳＰに暴露したヒト前単球リンパ腫細胞から抽出したＤＮＡの断片化の減少を示す、ＤＮＡゲル電気泳動実験の結果を示す。図２９は、ＳＴＳＰおよびブレオマイシンの濃度を変化させて処理したヒト前単球リンパ腫細胞の示差Ｏ／Ｓプロットを示す。図３０は、ｄＴｈｄのみ、ＲＡと種々のインドールカルバゾール、およびＴＣＩをｄＴｈｄと組み合わせて処理した後にヒト前単球リンパ腫細胞から抽出したＤＮＡのＤＮＡゲル電気泳動の結果を示す。図３１は、共働的マッチングであることが分かっている組み合わせに基づいた、指示した濃度のｄＴｈｄおよび／またはＳＴＳＰで処理したＨＰＬＣのコロニー数を示す棒グラフである。図３２は、種々の濃度のＡｐｈおよびＳＴＳＰで処理したＣ３３Ａ細胞の示差Ｏ／Ｓプロットを示す。図３３は、種々の濃度のＵ９３７細胞で処理したＣ３３Ａ細胞の示差Ｏ／Ｓプロットを示す。図３４は、種々の濃度のｄＴｈｄおよびＳＴＳＰで処理した Jurkat 細胞の示差Ｏ／Ｓプロットを示す。図３５は、種々の濃度のＨＵおよびＳＴＳＰで処理した Raji 細胞の示差Ｏ／Ｓプロットを示す。図３６は、細胞のＧ₂期からＭ期への移動の調節における決定的因子としてのｐ３４^CDC2の脱リン酸化を示す図である。図３７Ａは、ｐ３４^CDC2のリン酸化に対するＳＴＳＰおよび±ＡＴＡの影響を示すイムノブロットである。図３７Ｂは、ヒストンタンパク質（Ｈ１）をリン酸化する能力によって共に示されるように、ＳＴＳＰがｃｄｃ２の機能的活性を誘導したことを示すイムノブロットである。図３７Ｃは、ｃ−ｍｙｃ発現に対するＳＴＳＰおよび±ＡＴＡの影響を示すイムノブロットである。図３８は、ＭＡＰキナーゼであるＪＮＫ（Ａ）およびＥＲＫ（Ｂ）に対するＳＴＳＰおよび±ｄＴｈｄの影響を示すイムノブロットである。発明の要約本発明は、細胞死滅剤の新規の改良された組合せ、および標的集団に細胞傷害を及ぼす薬剤の相乗的組合せを同定し、評価し、そして投与するための新規方法に対する当該分野のニーズを満足する。本発明は、細胞周期を通して標的細胞の進行を遅延させるのに充分であるが停止（arrest）させない濃度および条件下で、制御薬剤（restraining agent）（ＲＡ）を標的細胞集団に投与し、ＲＡの適用と同時またはその後に標的細胞毒性物質（targeted cytotoxic insult）（ＴＣＩ）を投与することによる、細胞傷害を誘導するための改良法を提供する。本発明はまた、制御薬剤または標的細胞毒性物質として新規の薬剤を同定し、設計しそして使用するための、かつ既存の薬剤の相乗的組合せを改良するための、微量培養指標システムおよび補助的データ解析法に関する。本発明の実施態様において、ＲＡは、リボヌクレオチド還元酵素インヒビター、ジヒドロ葉酸還元酵素インヒビター、チミジル酸シンターゼインヒビター、ＤＮＡポリメラーゼインヒビター、プロテインキナーゼインヒビターまたはトポイソメラーゼインヒビターであってよい。さらに本発明の実施態様は、ＴＣＩとして、インドールカルバゾール、例えばスタウロスポリン（staurosporine）、Ｋ２５２ａ、ＫＴ５９２６、およびＫＴ５７２０を含む。具体的な実施態様において、ＲＡはチミジンであり、ＴＣＩはスタウロスポリンである。別の具体的な実施態様において、ＲＡはブロモデオキシウリジンであり、ＴＣＩはスタウロスポリンである。他の具体的な実施態様は、実施例に開示される。具体的な応用において、本発明の細胞傷害の誘導法は、ガン患者の治療法である。本発明の方法はまた、マラリアの治療に応用できる。本発明は、ガンまたは免疫系の疾患の従来の化学療法または放射線療法を改良することができ、ＲＡまたはＴＣＩの選択的送達方法の基礎を提供し、ＲＡまたはＴＣＩとしての特異的アンチセンス分子の新しい応用、遺伝子トランスフェクション療法と組合せたＲＡまたはＴＣＩの使用、および放射線療法または他の物理的細胞死滅法と組合せたＲＡまたはＴＣＩの利用を可能にする。本発明はまた、抗真菌または抗微生物治療法においてウイルスまたは感染性核酸に感染した細胞の早期破壊に利用でき、ある寄生体感染の侵入の根絶を助けるのに使用することができる。本発明の他の目的および利点は、以下の説明に記載される。本発明の開示の一部である添付の図面と表は、本発明の説明とともに本発明の原理を説明する。発明の詳な説明本発明は、制御薬剤（ＲＡ）および標的細胞毒性物質（ＴＣＩ）を同定しおよび／または投与することによる細胞傷害を増強する方法に関する。制御薬剤とは、細胞周期を通して標的細胞集団の下流への進行を遅延させるが停止させない条件下で投与される薬剤を意味する。すなわち、ＲＡの役割は、傷害が決定した細胞で動的遅延（dynamic retardation）を与えることである。動的遅延の概念は、細胞周期の主要な原理にある。まず、細胞周期のプロセスは、プロセスの連結したサブセットに分離される（「フレーズに分離されたプロセス（phrased processes）」）。プロセスのフレーズへの分離は、一連の制御抑制による細胞周期の前進運動傾向（forward momentum）中のブレーキ点に由来する。後者は、Harwell および Weinert（前述）（１９８９）およびNurse（前述）の記載したＳＴＡＲＴおよびチェックポイント制御を含む。フレーズに分離されたプロセスの開始点は、細胞周期の乱れ時、または細胞周期制御性調節を変化させる特定の突然変異を有する細胞でのみに検出される。例えば、Beachら、C urrent Communications in Molecular Biology，pp．1-211、コールドスプリングラボラトリー（Cold Spring Laboratory）（１９８８）を参照されたい。第２に、「フレーズに分離されたプロセス」は、物理化学的には「秩序依存性連続体」として挙動し、すなわち、制御チェックポイントがいったん除かれると（フレーズの開始）、連続的プロセスが将棋倒しのように順序正しく、次の制御チェックポイントに達する（フレーズの終了）まで活性化される。最後に各セットのフレーズに分離されたプロセスについて、運動傾向の変化が、生化学的反応、生体分子カスケード、または巨大分子の立体配置変化のような連結複合体を介して伝達される。ＲＡによる動的遅延の開始は、細胞周期階層のサブセットの運動傾向の陰性の変化（減速）である。ＲＡがまず細胞周期を介する運動傾向を抑制するように作用する細胞周期階層内の点は、その参照点（reference point）である。ＲＡは、その参照点から下流に生化学的反応の物理化学的平衡のシフトを引き起こす。すなわち、ＲＡは、細胞周期階層のサブセットのプロセスの減速を開始させる。動的遅延は、１つまたはそれ以上のフレーズに分離されたプロセスを介するこの減速の下流への伝搬である。ＲＡにより減速される細胞周期の部分は、遅延の場（ retardation field）である。ＲＡは細胞周期の種々の点で作用する。フレーズに分離されたプロセスが重複する細胞周期の部分（例えば、Ｓ期）では、ＲＡは異なる時期にまたは複数の参照点でその作用を示す。ＴＣＩとして作用する薬剤は、参照点の後および細胞周期の特定の部分（標的期間（target interval）として知られている）で細胞傷害を開始する。標的期間は、細胞傷害の開始を引き起こすＴＣＩとの相互作用に影響を受けやすいフレーズに分離されたプロセスからなる遅延の場のサブセットである。ＲＡは細胞周期を介して運動を遅延させるため、標的細胞集団の細胞が標的期間内に局在化され、そのため標的集団があるＴＣＩの作用を受ける程度を増加させる。標的集団中の細胞の細胞周期が遅延の場および遅延の場内の標的期間を横断する確率は、動的遅延の結果として増加する。この確率を図２に模式的に示し、細胞周期旋回待避（cell-cycle stacking）として理解される。細胞周期旋回待避は、細胞周期階層の異なる位置の細胞を分離する区間の相対的「圧縮」を示す。有用な類似は、混雑した空港の空域に入っているジェット機の旋回待避である。動的遅延は、ＴＣＩによる生化学的傷害を増強し、標的細胞が標的期間を横断する確率を増加させる。相乗的一致（synergistic match）とは相乗的に作用して、動的遅延の結果として細胞傷害を与えるかまたは細胞増殖を遅延させるＲＡとＴＣＩとして作用する２つまたはそれ以上の薬剤のセットを意味する。ＴＣＩの標的期間は、相乗的一致が成功するためには参照点の下流に存在しなければならない。ＲＡとＴＣＩの相乗的一致は、ＴＣＩの効果的な強さまたは強度および標的期間の間のＴＣＩの関連するプロセス相互作用の機能的持続に比例する、有効傷害暴露（efective damaging exposure）（ＥＤＥ）またはＴＣＩの有害作用を増加する。ＲＡが適用された後、細胞は動的遅延の間に細胞周期内を自由に動き続ける。サイクリング集団中で、これは選択されたＴＣＩにより傷害される予定の細胞のすべてが、関係のある標的期間中に循環していく可能性を確実にすることを助ける。前述した条件で、これらは、ＲＡとＴＣＩの相乗的一致の可能性を作り出す状況である。本発明の実施に使用されるＲＡの強さまたは強度は、ＲＡが作用する点で細胞周期を通して標的細胞の運動を遅延させるのに充分であるが停止させない。この意味で、細胞分裂サイクルの停止または「静的同期（static synchronization）」を引き起こすことが知られている薬剤または因子は、適切に低下した強さでまたは適切に限定された期間で、ＲＡの役割で機能する可能性を有する。ＲＡの最適の強さまたは強度は、以下に詳述されるように特定の治療について実験的に決定することができる。制御薬剤は、細胞周期を乱すための微生物または他の細胞起源の天然の生成物、一連の合成若しくは半合成化合物またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有してもよい。トランスフェクションされた遺伝子は、細胞周期動態を制御する遺伝子の直接のモジュレーターとして役立つであろう。原理的には、細胞周期の運動傾向を抑制する複数の薬剤は、機能性ＲＡとして組合せて使用されるであろう。複数の薬剤は、同時にまたは作用のカスケードとして作用してもよい。環境的欠乏(environmental deprivation)または物理的変化は制御薬剤として作用し得る。欠乏には、細胞増殖に必須の栄養因子または物質の不足が含まれる。物理的変化には、外部の温度変化または、放射エネルギーもしくは粒子エネルギー、振動波または他の機械的力への細胞の暴露が含まれる。しかし、細胞周期中の集団の推移を止めるすべての薬剤が、ＲＡの能力中で機能する可能性を有するわけではないことを明らかにするべきである。例えば、チェックポイント制御の脱制御は、細胞周期を中止させるかまたは細胞周期の一部を短絡させる（例えば、Powell SNら、Cancer Res 55:1643-48(1995)；Fan Sら、Cancer Res:1649-54(1995)）が、この種の事象は、予定されている生化学的プロセスの物理化学的動態をＲＡの方法で、必ずしも変化させないであろう。ＲＡの機能的特徴の同定図３は、ある薬剤がＲＡとして作用する濃度の同定、および薬物の参照点の決定のための一般的アルゴリズムを示す。第１段階は、特定の細胞（すなわち、標的集団）の集団倍加時間（Ｔ_DBL）を測定することである。標的集団には、増殖している細胞、または傷害される集団でＤＮＡ修復を受けている細胞が含まれる。これらには例えば、新生細胞、増生細胞、ウイルス感染細胞、寄生体感染細胞、自由に生活している寄生体もしくは真菌が含まれる。この第１段階は、一連の手動のまたは自動の細胞数測定またはフローサイトメトリーにより行われる。あるいはこれは、組織培養の分野で当業者に公知の他の方法（例えば、放射性アイソトープ摂取、色素発色性代謝、または色素染色により測定される総ＤＮＡ、新しいＤＮＡ合成、総タンパク質または細胞量）により行われる。Ｔ_DBLは、ＲＡの増殖阻害作用を測定するための時間枠を提供する。第２段階は、Ｔ_DBLに対して増殖阻害を示す、標的集団の用量応答のグラフを作成することである。一般にＲＡは、Ｔ_DBLで阻害濃度の４０％（ＩＣ₄₀）未満の強さまたは強度で相乗作用を最大にする。阻害濃度は、未処理対照の増殖と比較した増殖阻害に関連する。すなわち、あるＲＡのＩＣ₄₀は、処理された細胞がＴ_DBLで未処理対照より４０％少ない増殖を示す濃度である。Ｔ_DBLは一定の基準として用いるのにおそらく最も簡単であるが、もし一貫して使用することができるなら、Ｔ_DBLより短い便利な時間間隔を使用してもよい。一般に、有用なデータを得るためには、その間隔は少なくともＴ_DBLの５０％より大きくあるべきである。第２段階は、実施例１に示すように行われる。図４は、細胞分裂の１つのサイクルの平均時間の間のヒト悪性細胞の集団の増殖阻害に対する、ＲＡとしての使用に好適な薬剤（デオキシチミジン（ｄＴｈｄ））の漸進性の濃度の関係を示す。図４の１つの細胞株で示すように、ほぼ１集団倍加時間の間に、約２mMの濃度範囲でｄＴｈｄの４０％阻害濃度が存在した。実施例２は、第３段階を示す：例えば５つの等しい分裂のＴ_DBLの間に、例えばＩＣ_{20、30、40、50}で試験される薬剤の異なる濃度を使用するフローサイトメトリー解析を行う。実際は、例えばパイロットデータ、以前の経験、または科学的文献から結果が予測される時には、より少ない数の解析または濃度を使用してもよい。図５に示すフローサイトメトリーの結果は、細胞周期が遅延されるＩＣの決定を可能にする（アルゴリズムの第４ａ段階）。第４ａ段階は、ｄＴｈｄで特によく示される。図５に示すように、ＩＣ₄₁より小さいｄＴｈｄの濃度は、細胞周期動態を遅延させるのに充分である。さらに図５は、Ｓ期（Ｆ_s）内に存在する細胞集団の比率が、１mM未満の濃度のｄＴｈｄで極度に増加していることを示す。原理的には、細胞周期Ｓ期またはＧ₂とＭ期（Ｒ_G2&M）に対するこれらの劇的な作用は、細胞の停止または静止性捕捉によるＳ期またはＧ₂とＭ期の静的拡張、あるいは各生存細胞が各期（すなわち、Ｔ_sまたはＴ_G2&Mの実際の上昇）を移動するのに必要な時間の実際の上昇により説明される。図５に示すように、これらの細胞はＳ期への流入を続け、Ｇ₂およびＭ期への移行は４０時間まで持続した。これらの作用は、ｄＴｈｄのより高濃度で起きた細胞周期停止または静的同期と対比して、細胞周期の動的遅延として解釈された。（実施例７は、このような動的遅延のさらなる支持を提供する。図９を参照）。すなわち、これらの段階は、適切な濃度範囲のｄＴｈｄは、本発明の制御薬剤であることを示している（第５ａ段階）。細胞周期停止または静的同期を引き起こすことが知られているいかなる薬剤も、細胞周期を停止させるのに必要なレベルより低い濃度または強度で使用される時、ＲＡの役割で機能する可能性を有する。ＲＡとして作用するいかなる薬剤の濃度もが細胞周期停止を引き起こす時、停止の場は、ＲＡの参照点であると考えることができる。この意味で、細胞周期停止は、ＲＡとしての任意の薬剤の制限性有効強度である。実施例３は、第４ｂ段階（細胞周期が停止される阻害濃度の決定）を示す。過剰のｄＴｈｄは、後期Ｇ₁期または前期Ｓ期の細胞周期停止の可逆的手段として使用されている。Zielke、前述；Kufe、前述、Krek W，DeCaprio JA，Methods E nzymol．254:114-124 1995。樹立されたヒトリンパ腫細胞株での細胞周期停止の以前の経験（Grimley PMら、Cancer Res 144:3480-88(1984)；Hulanicka Bら、C ancer Res．37:2105-2113(1977)）に基づき、本発明者は、ヒト前単球性リンパ腫細胞（Ｕ９３７）を２４時間までの間隔で３mMのｄＴｈｄに暴露させ、細胞周期の動的変化を解析した。図５は、３mMdＴｈｄで処理した細胞は、Ｇ₁期からＳ期への移行中に８時間と１６時間で滞留させられ、その結果Ｓ期およびＧ₂＆Ｍ（Ｆ_S＆Ｆ_G2&M）中の細胞の比率は安定するかまたは低下した。この知見は、ｄＴｈｄが細胞を、細胞周期のＧ₁からＳ期への移行のすぐ近傍で停止させるという従来の報告と一致した。W Vogelら、Hum．Genet．45:193-8(1978)。すなわち、ｄＴｈｄの参照点は、細胞周期のＧ₁／Ｓ境界であると推定できる（第５ｂ段階）。同じ方法を使用して、ＲＡとしての使用についてＨＵを評価し、実施例４に記載する。図６に示すように、ほぼ１集団倍加の間、ＨＵのＩＣ₄₀は２mMを越えた。ｄＴｈｄの場合のように、ＨＵ＜ＩＣ₄₀の濃度は細胞周期動態を遅延させるのに充分であった。図７に示し実施例５に記載するように、ヒト悪性細胞の集団のＨＵ処理は、細胞周期移行時間を増加させた。すなわち、ＩＣ₄₀より低い濃度範囲で適用されたリボヌクレオチド還元酵素のインヒビターであるＨＵは、増殖している悪性細胞のＴ_Sを上昇させ、本発明のＲＡである。前述のように、細胞周期停止または静的同期を引き起こすことが知られている薬剤はすべて、適切に低下した強さでまたは適切に限定された時間で、ＲＡの役割中で機能する可能性を有する。同じ意味で、過剰の濃度では、ＲＡとして機能できる薬剤は、アポトーシスまたは他のＤＮＡ関連傷害を引き起こし、従ってＲＡとしてよりＴＣＩとして挙動するかも知れない。例えば、ＨＵにより細胞周期が停止するＩＣ_%は、漸進的に増加する濃度で測定した。図７は、高濃度のＨＵの長期的作用および１６時間を越える暴露は、動的遅延に明瞭には関連していなかったことを示す。ＨＵのこれらの濃度は、細胞をＳ期で滞留させた（すなわち、停止させた）のみでなく、これらを死滅させた。すなわち、高濃度のＨＵはＴＣＩとして作用した。動的遅延に関連するレベルを越える過剰のｄＴｈｄはまた、悪性ヒト細胞においてアポトーシスを引き起こした。実施例６は、２４時間の過剰のｄＴｈｄからアポトーシスが誘導されることを証明する。図８は、アポトーシスのＤＮＡ断片化に典型的な電気泳動はしご（ladder）パターンを示すＤＮＡゲルを示す。すなわち、リボヌクレオチド還元酵素のこれらのインヒビターの低濃度及び高濃度の作用の差、並びに比較的低濃度で処理した細胞のＴ_sの増加のフローサイトメトリーの証拠は、Ｓ期中の前進運動傾向の減速が、ＲＡとして作用する各薬剤がＴＣＩによる細胞傷害を増強するプロセスに関与することを示した。増殖停止により細胞は有効に死滅させられるため、本発明においてＲＡとして機能する薬剤のいくつかは、化学療法目的の単一の薬剤（例えば、ｄＴｈｄおよびＨＵ）として使用されていることは驚くべきことではない。これは、本発明においてＴＣＩとＲＡとの区別は機能的であり、単に特定の物質または因子の化学的構造または物性に基づくものではないという点を強調している。ある治療法において動的遅延のためのＲＡに適切な機能的薬剤の強さと持続の範囲は、各特定の標的細胞型およびＴＣＩについて決定される。本発明の具体的な実施態様において、ＲＡとして作用するｄＴｈｄは、Ｇ₁／Ｓ移行に近い参照点で細胞分裂サイクル中の標的細胞集団の進行を遅延させた。例えば、実施例でさらに詳述されるように、集団の世代時間に対して約ＩＣ₄〜約ＩＣ₄₀のｄＴｈｄの濃度は、ＲＡとして使用することができる。本発明の特に好適な実施態様では、ＲＡとして約ＩＣ₆〜約ＩＣ₃₀の濃度を使用できる。本発明のと好適な実施態様では、ＲＡとして約ＩＣ₁₀〜約ＩＣ₂₅のｄＴｈｄの濃度を使用する。本発明の別の実施態様において、ＲＡは、Ｓ期またはＳ／Ｇ₂移行の近くの参照点で細胞分裂サイクル中の標的細胞集団の進行を遅延させる。表１は、作用することが知られているかまたは疑われる細胞周期の部分に従って分類した、ＲＡとして作用するいくつかの薬剤を示す。本発明の実施により決定される可能な二次的参照点は示してない。表１に示すＲＡの多くは、例えばシグマケミカル社（Sigma Chemical Co.）（セントルイス、ミズーリ州）、またはカルビオケム（Calbiochem）（サンジエゴ、カリホルニア州）から販売されている。最近トリミドックス（Trimidox）が合成された（T．Szekeresら、Cancer Chemother Pharmacol 34:63-66(1994)）。ＨＡＧ−ＩＱは、G．Weckbeckerら、J．Natl．Cancer Inst．80:491-96(1988)に記載のように合成される。ＲＡは当業者に公知の種々の方法で、標的細胞に適用されるかまたは投与される。例えば本発明の種々の実施態様において、ＲＡはin vitroで投与することができる。in vitroの試験は例えば、特定の細胞株について種々の強さまたは期間にＲＡとＴＣＩ剤の間の相乗作用を迅速に樹立するために行われる。in vitroの場では、ＲＡは、標準的生物学的緩衝液（例えば、ＲＰＭＩ１６４０）で適切に希釈して標的細胞に添加される。in vivo の場では、ＲＡは、固体、半固体、液体または気体の形で種々の経路により送達される。ＲＡは、経口、粘膜、局所、静脈内、鞘内、筋肉内、皮下、膀胱内、胸膜腔内、骨盤内、子宮内、鼻腔内、腹腔内、尿管内もしくは眼内経路で、または蓄積注射、もしくはエアゾル、そして単独でまたは適切な他の生物学的担体とともに導入される。ＲＡは、リガンドまたは抗体のような他の物質または分子の成分としてあるいはこれらとともに、またはリポソームまたはマイクロカプセルのような担体により送達される。ＲＡは、迅速なもしくは持続的放出をするように、または複数回の間欠的投与量で送達することができる。さらに、ＲＡの送達は、遺伝子もしくは核酸トランスフェクション、細胞膜への酵素挿入、またはウイルス感染、あるいはＲＡとして作用する薬剤の移動または代謝に寄与するかまたは薬剤がＲＡとして作用することを制御する（優勢陰性制御を含む）他の任意の薬剤により促進される。本発明の開示により、当業者は、患者のニーズや反応ならびに当該分野で公知の他の要因により、ＲＡの最も有効な投与経路を決定することができる。標的細胞毒性物質（Targeted Cytoxic Insult）前述のように、細胞毒性薬剤とは、医用、治療用または他のどのような目的であっても、生きている細胞の増殖に傷害を与えるかまたはこれを阻害する、任意の分類の物質または状況である。この定義において、ＴＣＩは、アポトーシスを引き起こすか、または細胞周期階層の標的期間中に生物学的に重い傷害を引き起こす細胞毒性物質である。種々のＴＣＩが本明細書において使用可能であるが、ＴＣＩの標的期間は、ＲＡにより減速される細胞周期の部分に対応する。ＴＣＩにより引き起こされる傷害は、可逆性、永続性、致死下、または致死的である。多くの実際的応用において、異常な細胞の「完全な死滅」による致死的傷害が好ましい。しかし薬剤の送達、薬物動態因子、および許容される副作用の生物学的限界などの実際の応用上の問題が、致死下である有効な投与量を支配する。しかし、ＴＣＩによる限定されたかまたは可逆的生物学的傷害は、宿主の免疫系が、傷害を受けたかまたは異常な細胞を標的とし、優先的に死滅させ、そして除去することができる時、特に有効である。ＴＣＩは、種々の方法で標的細胞の増殖を傷害するかまたは遅延させる。表２は、少なくとも１つの標的期間の予測される位置により分類されるいくつかのＴＣＩを示す。標的期間の推定は、一部は本発明者が行なった試験（例えば、実施例１２を参照）、および当業者に公知の化学的文献中に存在する作用の公知のまたは推定される機序に基づく。適切に送達される時、ＴＣＩは特定の生化学的プロセスに独立した傷害を与えうる。しかし、過剰の強さまたは強度で適用される時、ほとんどすべてのＴＣＩは、一時的生化学的または分子的プロセスに無関係の予測外の細胞傷害を与え、一次副作用を増強しうる。従ってＴＣＩを適用する主要な目的は、最適強さまたは強度でその作用を細胞の適切な亜集団（すなわち、標的集団）に向けさせることである。従って、ＴＣＩにより与えられる傷害について特定の細胞集団を識別したターゲティングが、非常に有利である。識別したターゲティングは、まず限定された制御条件を与えるのに必要なＲＡの、そして次にＴＣＩの、薬剤選択または設計の適切な方策により達成されうる。識別したターゲティングはまた、標的集団への最適な薬剤送達方策により達成されうる。ＴＣＩは、特に適切な生物学的緩衝液で希釈後有効濃度を設定する前臨床試験のために、in vitroで標的細胞に適用できる。in vivo の場では、ＴＣＩは、固体、半固体、液体または気体の形態で種々の経路により送達される。ＴＣＩは、経口、粘膜、局所、静脈内、鞘内、筋肉内、皮下、膀胱内、胸膜腔内、骨盤内、子宮内、鼻腔内、腹腔内、尿管内もしくは眼内経路で、または蓄積注射、もしくはエアゾル、および単独または適切な他の生物学的担体とともに導入することができる。ＴＣＩは、リガンドまたは抗体のような他の物質もしくは分子の成分としてもしくはこれらとともに、またはリポソームもしくはマイクロカプセルのような担体により送達される。ＴＣＩは、迅速にもしくは持続的に放出するように、または複数回の間欠的投与で送達することができる。さらに、ＴＣＩの送達は、遺伝子もしくは核酸トランスフェクション、細胞膜への酵素挿入、またはウイルス感染、またはＴＣＩとして作用する薬剤の輸送または代謝に寄与するかまたは薬剤がＴＣＩとして作用することを調節する（ドミナントネガティブ調節を含む）他の任意の作用または薬剤により促進されうる。ＲＡと同様に、当業者は、通常の技術を使用して適切な投与経路を決定することができるであろう。受容体もしくはリガンドのターゲティング、またはリポソームもしくは抗体担体を使用する技術を含む、薬剤（ＲＡまたはＴＣＩ）送達の特殊な手段は、ヒトまたは他の多細胞宿主中の適切な細胞亜集団への重要なターゲティングを促進（ RC Juliano，Ann NY Acad．Sci．507:89-103(1987)）し、従って本発明に包含される。さらに本発明の実施は、悪性細胞または感染細胞にターゲティングされるＲＡおよび／またはＴＣＩの好ましくない作用から、感受性のある正常な細胞、組織または臓器を保護するための特定のアンタゴニストも含みうる。例えば、アクラルビシン（aclarubicin）、心臓保護剤ＣＲＦ−１８７、またはクロロキン（chloroquine）は、エトポシド（etoposide）の細胞毒性に拮抗する（PB Jense n，Cancer Res．54:2959-2963(1994)）ＴＣＩは、ＲＡの添加と同時にまたはその後に標的細胞に添加することができる。本発明の好適な実施態様において、ＴＣＩはＲＡ添加の０〜８時間後に添加される。特に好適な実施態様において、ＴＣＩはＲＡ添加の４〜６時間後に添加される。しかし、ＴＣＩが添加される正確な時間は、使用されるＲＡとＴＣＩの性質および標的細胞集団の特性などの正確な治療条件に依存する。ＴＣＩの有効細胞毒性濃度（ＥＣ）は、ＲＡと組合せた時、状況に応じて標的細胞を傷害するか、その増殖を阻害するか、またはこれを死滅させるのに充分な量のＴＣＩである。本発明の好適な実施態様において、ＴＣＩを、ＲＡを投与する前、後、または同時に、標的細胞を傷害するかまたはその増殖を阻害するのに充分な量で標的細胞に投与する。本発明の別の実施態様において、ＴＣＩを標的細胞を死滅させるのに充分な量で、ＲＡを投与する前、後または同時に添加する。例えば、ＳＴＳＰを、ＩＣ₁₀〜ＩＣ₆₀の量で加える。本発明の好適な実施態様において、ＳＴＳＰを、ＩＣ₁₅〜ＩＣ₅₀の量で加える。本発明の特に好適な実施態様において、ＳＴＳＰを、ＩＣ₂₀〜ＩＣ₃₅の量で加える。他の薬剤の量は、後述されるように実験的に決定される。ＲＡとＴＣＩの相乗的一致ＲＡとＴＣＩの相乗的一致の合理的な選択は、本明細書に記載の動的遅延の原理に応じて行われる。本明細書で提供される測定系および補助データ解析もまた、相乗的一致の選択の指針として使用される。ＲＡとＴＣＩの間の相乗的一致の実施は、試験法を組合せて使用する：（１）増殖している細胞の生長に及ぼす、較正された連続的強さのＲＡ候補の作用のパイロット試験；（２）連続的な時点での増殖細胞集団の細胞周期の乱れと再平衡化に及ぼす推定のＲＡの作用のパイロット試験；（３）増殖している細胞の生長に及ぼす、較正された連続的強さのＴＣＩ候補の作用のパイロット試験；（４）増殖細胞集団の細胞周期の特定の部分における推定のＴＣＩの作用のパイロット試験；（５）傷害を受ける予定の増殖している細胞集団の細胞に傷害を及ぼすのに、種々の適用間隔での、および異なるレベルの絶対的および相対的強さでの、確立されたＲＡと証明されたＴＣＩの相乗作用の系統的試験。図１０は、ＲＡとＴＣＩの相乗的一致の選出を示す流れ図である。記載されるように、第１段階は、標的集団に適したＲＡ特性を有する薬剤の選出である。第２段階は、ＲＡ参照点の下流に標的区間を有するＴＣＩ候補の選出である。ＴＣＩは、表２に示す分類に従って相補的なクラスから選出される。選出は、大量の既存の薬学的、生化学的または分子生物学的データ（例えば、図１１に部分的に記載したようなもの）に基づく。本発明の方法は、ＴＣＩとして試験するために薬剤が選出されるための、さらなる基礎を与える。in vitro の微量培養指標システムは生物学的相乗作用を識別し定量する図１０の第３段階は、培養した真核細胞を用いるin vitro微量培養指標システム（ＭＩＳ）による、ＲＡとＴＣＩ候補の相乗的一致についての試験を含む。ＭＩＳは、２つのパラメータが固定倍数により変化する（複数のウェルのプレートでのＲＡとＴＣＩの二変数連続的希釈物（ＢＶＳＤ））一連の測定である。各二変数の組合せについて、その細胞傷害に関連する作用は、比色的または他の測定可能な指標により定量される。実施例８は、ＲＡとして作用するｄＴｈｄ、およびＴＣＩとして作用するＳＴＳＰの、系統的な一連の試験を示す。この試験は、増殖阻害または細胞死滅の尺度を与えるために、比色測定法を用いて悪性細胞への生物学的傷害を定量するが、当業者に公知の多くの他の測定法てもよい。この測定法に使用するには、ＲＡ＝ＩＣ₄₀およびＴＣＩ＝ＩＣ_>50の最高濃度が推奨される。新しいアルゴリズムを用いるＭＩＳデータの解析本発明の別の面は、観察された結果を推測値の合計と比較して、薬剤の相乗作用を測定するためにＭＩＳデータを解析する方法を含む（Berenbaum MC，Pharm Rev 41:93-141(1989)を参照されたい）。簡単に説明すると、各データ点の推測値の合計は、各々単独の結果を単純に加えた場合は、各濃度における各薬剤の組合せについての予測値である。比色値またはこれに匹敵するデータは、表３に示すように入力されているボーランドクアトロプロ４（Borlおよび Quattro Pro4 ）のような任意のリレーショナルスプレッドシートに取り込まれる。このデータプロセッサーは、ＲＡとＴＣＩを含有するウェルの結果を、入力されているセルに示すあらかじめ決められた関係に従って、薬剤を含有しないウェルの結果と各薬剤を単独で含有するウェルの結果から得られる推測の結果と比較して、解析する。図１４は、前記した方法を実施するための典型的なコンピューターシステム１４００を示す。データは、ディスクドライブ１４１５を介してディスク１４１０から、またはマウス１４２５が有りまたは無しでキーボード１４２０から入力できる。プロセッサー１４３０は、スプレッドシートプログラムを実施し、結果はモニター１４４０に表示されるだろう。データプロセッサーは、各ウェルで観察される増殖阻害または細胞毒性作用と、ＴＣＩとＲＡの作用の推測値の合計で予測される作用との比を反映する、組合せ結果比（ＣＲＲ）を表の形式で示す。例えば、表４は、ｄＴｈｄとＳＴＳＰの二変数の強さの組合せについての増殖阻害パーセント（％を有するカラム）と組合せ結果比（散在しているカラム）のプリントアウトである。表４は、表３Ａ〜Ｅに示す式を、実施例８で作成したデータに応用して作成した。ＣＲＲが１に等しい時、相加作用が観察され（すなわち、推測上ゼロの相互作用）；ＣＲＲが＞１の時、相乗作用が観察され、＜１の時は拮抗作用が観察される。従って表４において、例えば２５nMのＳＴＳＰと０．１９mMのｄＴｈｄについて相乗作用が観察される（ＩＣ₇₄でＣＲＲ１．７）。ＲＡとＴＣＩの治療用処方の作成時には、相乗作用の程度と細胞枯渇または傷害の量の両方が考慮される。さらに、表３Ａ〜Ｇに示す式を用いてデータプロセッサーは、各濃度のＴＣＩについて、ＲＡ濃度の関数としての観察された結果（「Ｏ」）を１つのグラフに、ＲＡ濃度の関数としての推定の合計（「Ｓ］）結果を別のグラフに示す、２つの重なったプロットとしてグラフで結果を示す（「Ｏ／Ｓ」プロット）。例えば、図１５は、ｄＴｈｄとＳＴＳＰの強さの２つの組合せについてのＯ／Ｓプロットを示す。図１５に示す各グラフにおいて、ＯとＳのプロットの最大の差は、約０．１mMのｄＴｈｄで起きる。表３Ａ〜Ｈに示す式を応用して、データプロセッサーは各濃度のＴＣＩについて、ＲＡ濃度の関数としてのＯとＳの差を、重なったプロットで示すこともできる（微分Ｏ／Ｓプロット）。図１６は、種々の強さのｄＴｈｄとＳＴＳＰの組合せについての微分Ｏ／Ｓプロットを示す。ある濃度のＴＣＩにおけるＲＡの最大の相乗作用濃度は、放物線最大値に沿って存在する。逆に、ある濃度のＴＣＩについてＲＡの最大の拮抗的濃度は、下向きの放物線の最大値に沿って存在する。拮抗的相互作用は、細胞傷害を増強するのに直接関係はないが、例えば傷害から細胞を保護するなどの他の面で有用であるかも知れない。推定値の合計が１００％の細胞毒性では、これらの濃度組合せについての解析は不正確になるため、これらの実験を漸進的に短い暴露期間で繰り返し行うことが好ましい。さらに、ＣＲＲ表は微分Ｏ／ＳプロットとＯ／Ｓプロットのすべての情報を含有するが、データの傾向を正確には示さない。従って、ＣＲＲ単独で具体的な相乗的相互作用範囲と最適の相乗的一致を得るには、妥当な範囲を越えるデータの外挿と、異なる濃度範囲で各薬剤を試験する多くの追加のプレートが必要かもしれない。要約すると、ＭＩＳと補助データ解析法は以下を提供する：（ｉ）各ウェルのＣＲＲの表から特定のＲＡとＴＣＩが相互作用しうる機能的範囲の推定値；（ii ）ＲＡの連続的濃度に対する、観察された結果および合計結果の線グラフをプロットすることによるＴＣＩの可能な有用な濃度のグラフによる比較；および（ii i）観察された結果と合計結果の差の線グラフをプロットすることによる、二変数相乗作用最大値または範囲（Ｓ_MAX）のグラフによる表示。ＭＩＳとデータ解析結果の解釈と証明ｄＴｈｄとＳＴＳＰの相乗的一致を示す本発明の実施例（例えば、実施例８）において、増殖阻害の測定法を使用した。これらの測定法の組合せについて、組合せ細胞傷害作用は充分に迅速であり、単なる増殖阻害ではなく処理された細胞の枯渇（死滅）が推定された。しかし一般に、増殖阻害は、増殖阻害の１回の測定における細胞枯渇からは完全には評価できない。また増殖阻害は、ＤＮＡ傷害薬剤による細胞の構造的傷害と必ずしも同義ではない従ってこれらの測定の結果は、細胞傷害について他の指標を測定することにより補足されうる（例えば、組織培養上清への乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出についての比色測定）。ＬＤＨの放出は、細胞膜傷害いついての有用な指標であると考えられる（Li L および Lau BHS，In Vitro Cell Devel Biol 29A;531-536 (1993)；Mitchell DBら、J．Tissue Cult．Meth．6:113(1980)を参照されたい。（実施例９を参照））。このタイプの測定法で補助データ解析工程を行う場合、増殖阻害パーセントの代わりに細胞傷害の絶対量がＣＲＲに示される。相乗的一致が細胞死滅を引き起こすというさらなる保証は、試験完了時の細胞量（Ｎ）と開始時の細胞量（Ｎ₀）の比から得ることができる。この比は、連続的測定法から得ることがーできる。この比（Ｎ／Ｎ₀）はまた、表３Ａ〜Ｃ、Ｊ〜Ｍに示すようにスプレッドシートを埋めることにより、ＲＡ濃度の関数としてグラフで示される。この比が、１未満の場合標的集団における細胞の真の喪失を反映する。別の表示は、集団喪失のパーセントとして（１−Ｎ／Ｎ₀）１未満の比を示す。このパーセントはまた、表３Ａ〜Ｃ、Ｊ〜Ｎに示すようにスプレッドシートを埋めることにより、ＲＡ濃度の関数としてグラフで示される。実施例８および９に示すＭＴＴとＬＤＨ法は、１８時間の間にＵ９３７細胞の増殖または傷害に及ぼす作用を検出し、１平均世代時間未満であった。ＳＴＳＰが与える傷害は、この時間間隔でｄＴｈｄにより増強されたが、以後の世代の子孫に及ぼす遅延作用も、臨床化学療法では重要である。本発明の１つの面は、ｄＴｈｄで処理した細胞においてＤＮＡ傷害に及ぼすＳＴＳＰの迅速な作用が、少なくとも４８時間細胞増殖阻害に影響を与えたことを示す、実施例８に示すようなＭＩＳに基づく「遅延増殖測定法」である。実施例１０は、このような遅延増殖測定法を示す。得られた結果は、増殖阻害についてＭＴＴ測定法による実施例８、およびＬＤＨ放出による実施例９に示すＳＴＳＰのｄＴｈｄ処理増強は、標的集団において永続的に増殖抑制を引き起こすことを証明した。さらに図２０と２１に示すように、それ自身洗浄により可逆性である、低濃度のＳＴＳＰとｄＴｈｄの作用は、薬剤を相乗的一致中で組合せると、不可逆性になる。ＣＲＲデータと比較すると、累積増殖グラフはよりはっきり示している。本発明の実施における実験結果を解釈するのに、スプレッドシート形式およびグラフ解析は、イソボログラム（isobologram）解析と比較して、迅速、容易、かつ効率的である。結果は再現性が高く、ＲＡとＴＣＩの組合せの最適の相乗作用範囲を与える。さらにこの解析は時間がかからず、特殊な実験設計は必要でなく、薬剤の１つが他の薬剤より毒性が低くても解析できる。図１０の第４段階は、相乗的一致を最適化するためのＴ_DBL内の試験スケジュール化した増加を推奨する。この段階で、ＲＡとＴＣＩの同時投与について、および各試験スケジュールの遅延の一定の増加後に第２の薬剤が投与される段階的時差適用について、ＭＩＳとデータ解析を行う。適用の順序を変更してもよい。例えばＴＣＩを最初に投与し次にＲＡを投与するか、またはその逆でもよい。実施例１１は、ＳＴＳＰによる細胞傷害の増強におけるｄＴｈｄの作用が、スケジュール依存性であることを示す（表７を参照）。従って、ＭＩＳと補助データ解析は、ＲＡとＴＣＩの送達の最適時間を推定するために使用できる。ＴＣＩとしての薬剤または薬剤濃度を同定するためのＭＩＳの使用ＲＡとの相乗的一致で機能するために、およびＳまたはＧ₂期の標的期間を決定するために、適切な強さと持続時間で未知の薬剤またはＴＣＩ候補の同定結果を図２２に示す。ＳＴＳＰを用いる例は、ＲＡに相補的なＴＣＩを同定し、うまく適用するための原型を示す。図２２を参照すると、Ｔ_DBLを決定する第１段階およびＴ_DBLでの用量／増殖阻害グラフを決定する第２段階は、ＲＡを同定する第１段階と平行する（実施例１を参照）。次の段階は、候補薬剤が単独で増殖する細胞集団を傷害し、細胞周期中の標的期間の位置を特定できるか否かを評価する。多くのＴＣＩ（例えば、高濃度のｄＴｈｄまたはＳＴＳＰ）は、単一の薬剤として使用される時ＤＮＡ断片化を引き起こす。ＤＮＡ傷害と標的期間の関係の評価は、理想的には、実施例２に示す細胞周期解析ための従来のフローサイトメトリーおよび実施例６に示すＤＮＡゲル電気泳動を含む。実施例１２は、実施例１０に示す集団喪失の割合の測定を用いてＴＣＩ候補により開始されるＤＮＡ傷害を評価する方法を示す。さらに実施例１２は、ＤＮＡゲル電気泳動とフローサイトメトリーの両方により確認される、ＴＣＩの標的期間の特定化を示す。ＲＡとＴＣＩの相互作用Ｓ期では、真核生物のＤＮＡ鎖の複製は、複数の異なる時点で始まる。しかし複製の階層は、重要な酵素または代謝中間体を共有する（Murray AW および Ki rschner MW，Science 246:614-621(1989)；Laskeyら、Science 246:609-613(198 9)）。従ってＳ期に動的遅延を開始することにより作用するＲＡは、複数の参照点で作用を示す可能性が高い。例として図２６は、ＲＡの参照点およびＴＣＩの標的期間の相対的階層の位置の動的遅延と重要性の基本原理を示す。図２６（ｂとｃ）において、ＲＡはＳ期に作用することが示され、矢印は、細胞周期におけるＲＡの可能な異なる参照点を示す。得られる遅延の場（それぞれ、「ＲＦ１と「ＲＦ２」）は、Ｓ期の異なる位置のずれであり、Ｓ期移行時間の局所的増加を反映する。ＲＡＩの参照点（図２６（ｂ））は、Ｇ₁／Ｓ境界に近く、ＲＡIIの参照点はＳ／Ｇ₂境界により近いことが示される。すなわち早期Ｓ期の標的期間（「Ａ」）は、ＲＡＩの遅延の場に含まれ、後期Ｓ期のさらに下流の標的期間（「Ｂ」）は含まれない。これに対してＲＡIIの参照点（図２６（ｃ））は、早期Ｓ期標的期間（「Ａ」）の下流に位置することが示される。従って、後の標的期間（「Ｂ」）のみが、遅延の場に含まれるのかも知れない。図２６は、実際の事象を単純化したものである。真核生物細胞周期のいくつかの部分（特に、Ｓ期）で、巨大分子の複製または他の重要な生化学的または生物分子学的プロセスは、異なる位置で同時に起きる。すなわち、Ｓ期の動的遅延は、あるＲＡが複数の参照点に作用を及ぼす可能性を仮定している。その結果、遅延の場はまた同時に異なる位置で存在し、種々のＴＣＩに対して異なる感受性を有する複数の標的期間の部分を含むかも知れない。ＲＡの上流に遅延の場が形成される可能性は、理論的に排除されない。前述のように、動的遅延はまた、細胞周期のある部分での活動を必要とし、サイクリングしていない細胞では起きない。ＴＰＡを用いる実験で、強制的にＧ₁ ／Ｇ₀期に入れられた細胞または最終分化状態の細胞は、ＴＣＩの存在下の動的遅延に関連した傷害作用を受けなかった。これは、ＤＮＡゲル解析で明白であった。（実施例１３と図２７を参照）。この保護作用もまた、ＭＩＳ測定法で観察された。ｄＴｈｄの前でなくＳＴＳＰとともにＴＰＡを添加すると、ＴＰＡ前処理より有意に有効性が低かった。この結果により、ＴＰＡによるＳＴＳＰの直接の生化学的阻害を排除した。従って結果は、Ｓ期の動力学的変化に関連するｄＴｈｄの物理化学的作用に一致した。ＳＴＳＰ細胞のｄＴｈｄによる増強はｄＴｈｄのＲＮＲの阻害による実施例１２に示すように、ＳＴＳＰはＳ期のアポトーシスを誘導し、Ｇ₁／Ｓで作用するｄＴｈｄは強力なＲＡとして作用できることが証明された。Ｕ９３７細胞の細胞周期でＧ₁期からＳ期への以降（図５）をほとんど完全に停止させたｄＴｈｄ濃度（≧３mM）は、連続的細胞周期進行を可能にした対数的に低いｄＴｈｄ濃度よりＳＴＳＰとの相乗作用は小さかった。ｄＴｈｄ摂取と代謝プールのサイズは、時間に関連する因子であるが、ｄＴｈｄによるＳＴＳＰの増強は、単純な代謝的競合で予測される化学量論には明らかに基づかない。ピリミジン生合成に関与する酵素（特に、ＲＮＲとデオキシシチジリックデアミナーゼ）は、すべての型の生細胞におけるＤＮＡ合成の開始に関与している（ Elledge、前述）。ＲＮＲの生物活性を有するＲ２サブユニットは、共役した鉄中心とチロシル遊離ラジカルを有する。ＲＮＲまたはＲＮＲの活性サブユニットのメッセンジャーＲＮＡの転写は、哺乳動物細胞のＳ期に増加する（同上；Bjor klund Sら、Biochem 29:5452-58(1990)）。過剰のｄＴｈｄは、代謝フィードバック阻害によりＲＮＲとデオキシシチジリックデアミナーゼを阻害する（Xu YZ ら、Biochem Pharmacol 44:1819-27(1992)およびEllims PH，Cancer Chemother Pharmacl 10:1-6(1982)）。ｄＴｈｄの特殊な作用は、デオキシチミジン５’− 三リン酸（ｄＴＴＰ）の細胞内蓄積、リボヌクレオチド還元酵素（ＲＮＲ）とデオキシシチジリックデアミナーゼのフィードバック阻害、およびその結果としてのデオキシシチジン５’−三リン酸（ｄＣＴＰ）の細胞内プールの枯渇が原因であるとされた（Elledge、前述；Xu、前述；およびEllims、前述）。過剰のｄＴｈｄまたはＢｒｄＵのこの作用は、等モル量のデオキシシチジン（ｄＣｙｔ）により弱められる（Kimら、Biochem Pharmacol 14:1821-9(1965)；Hulanicka、前述）。本研究において、ｄＴｈｄによるＳＴＳＰの増強におけるＲＮＲ阻害の役割は、ｄＴｈｄの前または同時にｄＣｙｔを加えることにより証明された。これは、ＳＴＳＰによるＤＮＡ断片化の増強におけるｄＴｈｄの作用を有意に低下させた（実施例１４、図２８）。他の薬剤によるＲＮＲの阻害もまたＳＴＳＰを増強するさらなる公知のＲＮＲインヒビターを、ＲＡとして作用しＳＴＳＰを増強する能力について比較した。これらには、ヌクレオシド二リン酸基質の還元も阻害するｄＡｄｅとｄＧｕｏ、およびチロシル遊離ラジカルを捕捉してＲＮＲを直接不活性化する物質であるＨＵがある（JW Yarbo，Semin Oncol 19:1-10(1992)）。ハロゲン化ピリミジン類似体であるブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）は、Ｓ期延長作用ならびにＳＴＳＰ増強に及ぼす作用についてもｄＴｈｄとほとんど同様に作用した。さらなる実験で、ＢｒｄＵは、ｄＴｈｄと同様のＳ期の減速を引き起こした。これは、総ＤＮＡのＰＩ染色とＢｒｄＵに対するフルオレセイン標識抗体を使用する二変数フローサイトメトリーにより証明された。ＲＡとして有効な各薬剤は、ＩＣ₄₀より低い濃度範囲で作用した（ｄＴｈｄの結果と似ている）。過剰のｄＴｈｄと同様に、他のＲＮＲインヒビターの各々は、充分に高い濃度で単独で使用した時、細胞周期停止を引き起こし、アポトーシスを誘導した。ＳＴＳＰを一貫して増強するのに有効なＲＮＲの濃度は、直接的な増殖阻害に最も活性のある濃度より最高７倍低かった。低い濃度で使用した各ＲＮＲインヒビターは、ＳＴＳＰによる細胞傷害を増強する点においてｄＴｈｄと同様であった。表８は、ＲＡとしてのこれらの薬剤の試験結果のリストを示す。このような試験についてのＣＲＲデータは、表９〜１２に記載されている。ｄＴｈｄ，ＢｒｄＵおよびＨＵの具体的な例において、ＳＴＳＰを増強するＲＡ濃度は、細胞周期停止を引き起こした濃度より少なくとも１ログ(log)低かった。ＲＮＲインヒビターの存在下でのＳＴＳＰによる細胞傷害の増強は、化学量論では説明できず、また公知の代謝経路または分子的相互作用によっては説明できない。確かにＳＴＳＰと関連化合物およびＲＮＡのインヒビターは明らかに異なる基質を有する酵素および細胞周期階層中の一時的機能に作用する。ターゲティングされた酵素が、共通の代謝中間体の生合成、ヌクレオチドの生合成、またはＤＮＡの複製もしくは修復に協同的に関与していることは知られていない。フローサイトメトリー解析は、試験した各追加のＲＮＲインヒビターの作用中に、かつＳＴＳＰ増強に有用な濃度範囲でＳ期の延長が発生することを証明した。ＲＡが細胞周期運動傾向の遅延を誘導し、ＴＣＩ活性を増強する具体的な機序は、すべての組合せについて充分に理解されていない。しかしＨＵの作用については、複製中のＤＮＡのアイソトープ標識と二次元ゲルマッピングの組合せに基づいて、ＨＵが、ＲＮＲの阻害によりＤＮＡへの放射能標識ｄＴｈｄの取り込みを最大に阻害した時でもＤＮＡ鎖の開始または伸長を完全には妨害せず、複製フォークで引き続き分子的作用を可能にすることが証明された（V．Levensonら、N ucleic Acids Res．21:3997-4004(1993)）。これらのデータは、ＤＮＡ巨大分子の複製または修復のプロセスの間に、そうでなければほんの一時的に起きるであろう感受性の物理化学的または立体配置状態を延長させ、Ｓ期の動的遅延に一致する。速度論的観点から、密接に関連した説明は、動的遅延が生化学的平衡をシフトさせ、一過性中間生成物とＴＣＩの間の相互作用を加速するのであろうというものである。これらの理論的説明は本発明の使用または実施に必須ではないが、これらは、細胞周期階層が「フレーズに分離されたプロセス」からなるという理論に本質的に一致する。これらは、相乗的一致の予測を補助するかまたは無用な一致を排除しうる、事象の実用的一次近似として作用する。ＲＮＲインヒビター以外の群のＲＡの選択は、ｄＴｈｄを用いる最初の観察と、高濃度で使用した時細胞周期を停止させうることが知られている他の化学療法剤についての一般的知識から得られる（図１１を参照）。GPV Reddy およびA Pa rdee，Proc．Natl Acad．Sci．77:3312-16(1980)は、核酸代謝に関与する酵素とＤＮＡ鎖複製に必要なポリメラーゼの密接な機能的関係を提唱し、デオキシヌクレオチド合成と「レプリターゼ」（replitase）と呼ばれる重合複合体の存在が証明されている（Plucinsk TMら、Mol．Pharmacol．38:114-20(1990)）。例えば、ＲＮＲインヒビターの使用時にチミジレートシンターゼ活性の交差阻害が報告され、例えば特にアフィジコリン（aphidicolin）（Aph）および１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン（通称、シタラビン（cytarabine）、シトシンアラビノシドまたはａｒａ−Ｃ）は、ＤＮＡ合成に関与するポリメラーゼを阻害することがよく知られている（C．Sessaら、J．Natl．Cancer Inst．83:1160-4(1991)）。ａｒａ−Ｃの作用はＤＮＡの複製においてｄＣｙｔの代用物になりえ他の作用も有するため、その作用は複雑である（M．Tanakaら、Jpn．J．Cancer Res．76: 729-735(1985)）。これらの考慮点に基づき、ジヒドロ葉酸還元酵素インヒビター（ＭＴＸ）；チミジレートシンターゼインヒビター（フロクスウリジン（flox uridine））；およびＤＮＡポリメラーゼαの２つのインヒビター（Ａｐｈとａｒａ−Ｃ）を、一般的に図１０と実施例８に記載のアルゴリズムに従って、ＴＣＩとしてのＳＴＳＰとともにＲＡとして試験するために選択した。ＩＣ₄₀未満の濃度で試験した各薬剤は、Ｕ９３７細胞中のＳＴＳＰによるＤＮＡ傷害をうまく増強した。これらの各薬剤のＣＲＲを、表１３〜１６に示す。さらに、低濃度のＳＴＳＰをＲＡとして、ＴＣＩとしての以下の薬剤とともに試験した：ブレオマイシン；マイトマイシンＣ；シスプラチン（ＣＤＤＰ）；エトポシド；およびダウノルビシン。これらの試験のＣＲＲは、表１７〜２１に示す。さらに、図２９は、ＳＴＳＰとブレオマイシンの組合せのＯ／Ｓ微分プロットを示す。本明細書に記載されるようにすでに同定されたＲＡを使用して、他の化学療法剤を、表３３に示す組合せで試験した。これらの組合せのＣＲＲを表９〜３２に示す。さらに、図３０は、ＤＮＡラダー(ladder)形成により証明されるように、ＳＴＳＰ以外のインドールカルバゾールとｄＴｈｄとの相乗的相互作用を示すＤＮＡゲルである。異なるＴＣＩ（ＳＴＳＰ、ＫＴ５９２６、およびシスプラチン）を用いると、ｄＴｈｄのＳ_MAXは非常によく似ていた。標的細胞タイプの役割本発明の方法を、患者（例えば、ガン患者または感染症患者）の治療に使用する時、ＲＡとＴＣＩ候補は、ガン細胞または感染細胞への傷害は最大にし、正常な細胞への傷害を最小にするように選択すべきである。ＭＩＳと補助データ解析法の組合せは、臨床的化学療法または放射線治療を個別に使用する柔軟性を与える。さらに指標細胞として樹立したガン細胞株または患者のガン細胞の直接の培養物を使用するin vitro試験は、特定の患者の特定の新生物の治療パラメータを個別化する、比較的迅速で臨床的に焦点の合った試験手段を提供する。本発明は、化学療法に耐性であると思われる悪性細胞の治療に最も有望であるかも知れない。化学療法に対する悪性細胞のこのような耐性はしばしば、ｐ５３遺伝子の欠失または突然変異が関係している（Rouach E.ら、Mol Cell Biol 13: 1415-23(1993)；Fisher、前述；Lowe、前述；Lotem、前述；Fan、前述）。米国では免疫不全状態の患者で大細胞リンパ腫の発生が増加しており、ｐ５３の突然変異または欠損が、化学療法または放射線療法に対する耐性と関連付けられている。本発明の多くの実施態様において試験されたＵ９３７細胞は、Calabresse C .ら（Biophys Biochem Res Commun 201:266-83(1994)）により報告されているように、ｐ５３が欠如していた。このことは、匹敵する免疫ブロット法とオンコジーンサイエンシーズ（Oncogene Sciences）から得られたｐ５３に対する汎親和性の抗体を使用して、本発明者により確認された。従ってＵ９３７細胞は、組織球（大細胞）悪性リンパ腫起源であるため（Sundstrom、前述）およびｐ５３に対して陰性（Calabresse、前述、を参照）であるため、ＲＡおよびＴＣＩとして薬剤を試験するのに有用であった。ｄＴｈｄとＳＴＳＰの相乗的一致では、Ｕ９３７細胞の有効な死滅が起きた。このような有効な死滅を支持する遅延増殖測定法結果（実施例１０）は、クローン原性（実施例１５、図３１）およびガン原性（実施例１６、表３４）測定法で確認された。さらに、相乗的一致は、ｐ５３遺伝子の発現においてホモ接合性異常を有することが報告されている別の細胞株（ＨＬ６０）でも有効であった（Calabresse C .ら、Biophys Biochem Res Commun 201:266-8(1994)を参照されたい）。プロテインキナーゼインヒビターは、あるものは、進化した薬剤耐性機構を有する新生物細胞を傷害することができ（Sampson、前述；Versantvoort、前述；Hiyamoto 、前述；utz、前述）、ＤＮＡに対する突然変異誘発性傷害はアルキル化剤と比較すると小さいため、ヒトの化学療法にとって興味深い。本発明は、最適の結果を達成することを目的とした技術により送達される、ＴＣＩの傷害作用を増強し、耐性細胞株で特に有効なＲＡとＴＣＩの戦略的組合せを同定することにより薬剤耐性機構を進化させた悪性細胞の示すジレンマの回避を助けることができる。ＴＣＩ作用の強化はまた、骨髄移植（ここでは、患者または体外組織は、悪性細胞の駆逐のためにより厳しい治療を受ける）を含む悪性腫瘍の治療に有用である。動的遅延の作用は、表３６に示すヒト悪性腫瘍から進行した多くの他の組織培養株で観察された。上皮起源の悪性細胞株に及ぼすＲＡとしてのＡｐｈおよびＴＣＩとしてのＳＴＳＰの作用を、図３２に示す。この細胞株（Ｃ３３Ａ）は、ヒト子宮頚癌に由来し（Auersperg Nら、J Natl．Cancer Inst 32:135-148(1964) ）、ｐ５３については陰性である（Shivastrava、前述）。種々の細胞株で試験して証明される有用な結果は、特定の相乗的一致と細胞集団についてＲＡのＳ_MAXがいったん確立されると、同じ範囲のＲＡ濃度が、その特定のＲＡに相補的なクラスで他のＴＣＩでうまく作用したというものである。すなわち、異なる集団の悪性細胞についてＩＣ₄₀とＳ_MAXの両方で差が観察されたため、Ｓ_MAXの条件は各特定の集団の細胞について確立する必要がある。図３２に示すＯ／Ｓ微分プロットは、ＳＴＳＰ処理されたヒト子宮頚癌細胞（Ｃ３３Ａ）に及ぼすＡｐｈの作用を示し、これは図３３に示すＳＴＳＰ処理されたヒト前単球性リンパ腫細胞（Ｕ９３７）に及ぼす作用と比較できる。図３４に示すＯ／Ｓ微分プロットは、ＳＴＳＰ処理されたJurkat白血病性Ｔ細胞に及ぼすｄＴＨｄの作用を示し、これは図１５に示すＳＴＳＰ処理されたヒト前単球性リンパ腫細胞（Ｕ９３７）に及ぼす作用と比較できる。図３５に示すＯ／Ｓ微分プロットは、ＳＴＳＰ処理されたＲａｊｉ細胞に及ぼすＨＵの作用を示す。これらの例および他の例は、表３３に挙げられており、ＭＴＴ測定法から得られた関連する組合せ結果比を表３８〜４２に示す。表８に示すＲＮＲインヒビターの試験は、薬剤がヒト前単球性リンパ腫細胞（Ｕ９３７）の増殖に関してＩＣ₄₀未満の範囲で使用した時ＲＡとして作用する初期の証拠を提供した。表３７は、ｄＴｈｄまたはＡｐｈの一方とＳＴＳＰを含む相乗的一致を有するいくつかの異なる細胞株についてのＩＣ₄₀とＳ_MAXの同様の関係を示す。これらの結果はまた、ＲＡの機能的濃度で作用する薬剤の選択性の差は、相乗的一致のためにＲＡと相補的なＴＣＩの適切な選択による特定の悪性細胞集団に傷害を向けるのに利用できることを示す証拠を提供する。この応用されたアプローチは、治療された宿主中の特定の正常なまたは悪性細胞集団の化学療法感受性の差の実際的情報に基づいていなければならない。デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）の細胞への取り込みおよび代謝は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）が介在する。すなわち、ある細胞集団中のｄＴｈｄのＲＡ作用は、Ｔｋ⁺表現型に依存する。いくつかの新生物細胞株はＴｋが欠失しており、従って過剰のｄＴｈｄに対して比較的耐性である。これは、バーキットリンパ腫細胞株Ｒａｊｉの試験で例示された：Ｕ９３７細胞中の＞１mMのＩＣ₄₀に比較して、ｄＴｈｄについてのＩＣ₄₀は＞４mMであった。ｄＴｈｄがＲＡとして作用するのに必要な比較的高濃度では許容できない副作用を引き起こすかも知れないため、ＲＡとしてｄＴｈｄを用いるＲａｊｉ細胞の特徴を有するヒト悪性リンパ腫の臨床的治療は問題である。このタイプの輸送酵素欠乏を解決するには、拡散によって細胞に入る別のＲＮＲインヒビター（例えば、ＨＵ）を代用する（ Yarbo、前述を参照されたい）。図３５は、ＨＵがＲａｊｉ細胞中でＳＴＳＰと相乗的一致を生成することを示す。動的遅延はまた、悪性の上皮起源の細胞に対するＳＴＳＰの傷害を増強するのに有効であった。例として、ヒト子宮頚癌由来でありｐ５３については陰性（Sh ivastrava、前述）である細胞株Ｃ３３Ａ、およびヒト乳癌由来の細胞株ＺＲ− ７５−１がある（Engel，Cancer Res．38:3352-3364，4327-4339(1978)）。Ｃ３３Ａ細胞およびＺＲ−７５−１細胞は、懸濁液中よりマイクロウェルの表面上で増殖し、細胞が傷害を受けると細胞が基質から離れる。従って、着した細胞の染色物としてクリスタルバイオレットを使用するＭＩＳ測定法は、有益であり、ある場合にはＭＴＴより好ましい。（Grおよびo SAら、Skin Pharmacol 6:135-14 7(1993)を参照されたい）。原理的には、動的遅延の作用に感受性の細胞は任意のタイプであってもよく、真核生物、原核生物および始原細菌でも；有機性、自由生活性、寄生性、または動物もしくは植物の生体宿主で増殖、または人工の環境中で増殖してもよい。本発明は、種々のサイズの生体宿主または人工の環境中で正常な、異常な、非定型、新生物の、または感染細胞の集団に送達するために較正されるＴＣＩの傷害作用を増加させることが期待される。すなわち、本発明は、生きている細胞の全集団または全植物、動物、または他の生きている生物、または動物界もしくは植物界の任意の生物内の生きている細胞の別個の集団もしくはクローン、または自由生活性の細胞の集団もしくはクローン、または限定された環境内で感染された細胞の集団またはクローンに与える傷害を増強してもよい。ＲＡとＴＣＩの送達の臨床的方策医用治療目的のＴＣＩの適用には、その傷害作用が患者の適切な細胞集団に加えられることが必要である。副作用は宿主の生存をおびやかし重症の疾患を引き起こすことがあるため、特定の細胞集団を特定したターゲティングは非常に有利である。データ解析と組合せたin vitroＭＩＳ系は、相乗的一致の同定のための生きている宿主の代用物を提供する。完全な宿主へのＲＡを送達するにあたって比較的単純な方策は、比較的多量の選択された薬剤を使用する。血液レベルは、ＴＣＩの導入の適切な点を決定するために間隔を置いて追跡される（O'Dwyer、前述；Schilsky RLら、Cancer Res 4 6:4184-88(1986)；Donehower RC，Hydroxyurea、Chabner BA（編）、Pharmacolo gic Principles of Cancer Treatment，pp．269-75、フィラデルフィア、ペンシルバニア州、Saunders(1982)中；Sessa、前述）。このアプローチでは、ＲＡの初期レベルは、最適相乗作用範囲を越えることがある。ＲＡの細胞毒性が小さく長期間作用し、ＴＣＩは細胞毒性が強く短期間作用の場合は、この系は最大の臨床的利点を与える。１つのこのようなシナリオでは、ＲＡは経口投与されるかまたは蓄積注射により送達され、ＴＣＩは、ＭＩＳにより規定する数時間の間に静脈内に注射または潅流される。ＲＡの血液レベルは、適切にスケジュールされた複数回の投与法を含む、薬物動態に影響を与える補助的方法により行うことができる。しかし臨床治験によるデータの各々には、薬剤投与量をより正確に較正し予期できない毒性を見つけるための動物試験を含む他のタイプの前臨床試験が必要である（AF Gazdarら、J．Natl．Cancer Inst．82:117-24(1990)；BA Chabner，J. Natl．Cancer Inst．82:1083-85(1990)；MR Boyd，Cancer，Principles および Practice of Oncology Update中，pp．1-12，DeVitaら（編）、Vol．３；リピンコット（Lipincott）、フィラデルフィア（1989））。投与量は、量、または数、重量、表面積または宿主の血液量に関して較正した。「薬物動態排除方策」は、ＲＡとしてｄＴｈｄ（Ｓchilsky、前述）、ＨＵ（D onehower、前述）、またはＡｐｈ（Sessa、前述）で有効に機能するであろう。連続的静脈内潅流によりｄＴｈｄまたはＨＵの有意な血液および脳脊髄液レベルが達成されており、このレベルは数日間持続できる（Blumenreich MSら、Cancer Res 44:2203-07(1984)；Ｓchilsky、前述）。ＨＵの主要な利点は、これは経口摂取後容易に吸収され、血中レベルは２〜４時間でピークに達することである（ Donehower、前述）。これはまた、脳脊髄液中に分散する。Ａｐｈが連続的潅流により投与されると、最小の毒性でピーク血漿レベルの３μg/mlが達成される（ Sessa、前述）。ＲＡとＴＣＩの投与のタイミングと経路の最終的選択は、特定の生物系における各薬剤の吸収または代謝の具体的な薬物動態特性に依存する。ヒト宿主から取り出した組織中の細胞周期の動力学的変化を評価するための直接法には、ＤＮＡ特異的標識物およびフローサイトメトリーを用いる（Riccardi A.ら、Europ．J．Cancer 27:882-7(1991);Mitsuhashiら、Cancer 70:2540-6，1 992；Raza A.ら、Arch Pathol．Lab．Med 115:873-9(1991)；Spyratos Fら、Can cer 69:470-5(1992)；Kuo S-H および Luh K-T，Acta Cytol．37:355-7(1993) ；Am J Surg Pathol 17:1003-10(1993)）。しかし本発明の主要な利点は、たとえＲＡとＴＣＩの同時適用でも、ある程度の相乗作用を達成するのにそのような知識は必須ではないということである。生きている宿主の体では、薬剤の異化または排除は徐々に行われなければならない。すなわち、薬剤の最適血中レベルは、薬物動態学的な排除のある時点で達する。本発明の方法の主要な利点は、有効な相乗作用の薬剤の濃度範囲は、本明細書で示すＳ_MAXで示すように、比較的広く、この間にＴＣＩの作用が最大になる標的期間が厳密に制限されないことである。ＭＴＴにより以前に証明されたように相乗的一致でＲＡとして機能することがわかった多くの薬剤濃度は、ヒトまたは動物の治験で単一の化学療法剤として使用されてきた。これらの薬剤のいくつかのは、ＭＴＴにより示されるようにＳ_MA _X を達成するのに充分である範囲を越える血漿レベルを与えるかまたは与えると推定される投与範囲で試験されている。さらにこれらの薬剤の多くは、特に本発明により可能になったより低い投与量では、治療的使用で安全であろう。表３５に、従来の科学的または医学的文献に報告されている関連データの例を挙げる（ Blumenreich、前述；Belt RJら、Cancer 46:455(1980)；Allegra CJら、Cancer Chemotherapy Principles および Practice中，pp．110-153、Chabner BA および Collins JM編、ジェイ・ビー・リピンコット社（JB Lipincott Co.）、フィラデルフィア（1990）；Sessa、前述；Calabressi、前述；Buchholz、前述）。表３５に示す血漿レベルは、ヒトで測定したおよび公表された値、または犬の報告された投与量および血液量から推定した値である。本発明において、ＲＮＲインヒビターとＳＴＳＰまたはＫ２５２Ａとの観察された相互作用、およびＳＴＳＰとシスプラチンまたはアルキル化剤との相互作用は、ＳＴＳＰと同族体の有意に新しい化学療法的利用または開発を示す。ＳＴＳＰと同族体または類似体は抗新生物剤と考えられている（Schwartz、前述）が、臨床的利用は制限されてきた。本発明は、これらの使用と開発を可能にするだろう。本発明は、各感染性生物がヒト細胞の細胞周期よりはるかに短い場合、微生物または寄生体感染を制御するのに使用できる。すなわち、限定された制御条件およびＴＣＩの短い適用でさえ、臨床的に意義があるかも知れない。実施例１７と２２を参照されたい。本発明はまた、除草剤、殺虫剤、または複雑な生物の死滅を目的とする農業、農業または家畜の害虫の駆除、動物および植物界の任意のメンバーを含む生きている単細胞または多細胞生物の選択的中毒に有用であり、またはマイコプラズマ、ウイルス、プリオンまたは他の感染性物質で感染された細胞が可能であろう。本発明の他の具体的な実施態様において、ＲＡがａｒａ−Ｃである時、ＴＣＩはｄＧｕｏではない。他の実施態様において、ＲＡがｄＴＨｄまたはＢｒｄＵである時、ＴＣＩはａｒａ−Ｃではない。さらに別の実施態様において、ＲＡがｄＧｕｏである時、ＴＣＩはカンプトテシン（camptothecin）ではない；ＲＡがａｒａ−Ｃである時、ＴＣＩはシスプラチンではない；およびＲＡがジピリダモールである時、ＴＣＩはシスプラチンではない。本発明のさらなる実施態様において、ＲＡがブリオスタチン（bryostatin）である時、ＴＣＩはシスプラチンではない；ＲＡがクエルセチン（quercetin）である時、ＴＣＩはシスプラチンではない；ＲＡがＳＴＳＰである時、ＴＣＩはシスプラチンではない；およびＲＡがタモキシフェンである時、ＴＣＩはシスプラチンではない。以下の使用も企図される：（１）人体または自己移植またはヘテロ移植のために取り出された組織中の新生物細胞を根絶するための化学療法または放射線エネルギー療法における使用；（２）異常に破壊的な免疫細胞クローンの過剰の増殖（移植片対宿主の反応）を制御するための免疫療法または移植医学における使用；（３）生殖系列または受胎組織の破壊を含む受精能制御における使用；（４）医学的抗微生物療法、抗ウイルス、抗細菌または抗真菌剤による全身性使用；（５）医学的抗マラリアまたは他の抗寄生体化学療法；（６）微生物感染による細胞または臓器培養物のin vitro汚染を防止するための方法；（７）骨髄の自己移植前の新生物細胞の死滅；（８）非新生物であるが機能的に異常な細胞クローン（例えば、過剰に増殖している免疫細胞（自己免疫疾患）および乾癬表皮細胞）の破壊；（９）ＲＡまたはＴＣＩとして適用されうる新しいクラスの薬剤の合成または同定の誘発、既存薬剤の新しい利用法の誘発；および（１０）生化学的臓器切除（例えば、胸腺摘出または前立腺摘出）の実施。体細胞周期中のＴＣＩ作用を増強するために設計される方策は、完全またなまたは減数分裂を受けている生殖系統の細胞で同様の作用を示し、その結果使用される方法は原理的に受精能制御または不妊化に応用できる。以下の実施例は本発明の種々の面を例示する。実施例１本例は、１サイクルの細胞分裂の平均時間内に漸進的に上昇する濃度のｄＴｈｄと、ヒト悪性細胞の集団の増殖阻害との関係を示す。もともとアメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）（ＣＲＬ１５９３）から得られ、後にＦＤＡ（ベセスダ、メリーランド州）のK．Zoon 博士が増殖させたヒト前単球性リンパ腫細胞（Ｕ９３７）（「Ｕ９３７細胞」）のマイクロ培養物を、組織培養増殖培地（ＲＰＭＩ１６４０に１０％Nurserumと抗生物質を加えたもの）中で連続２倍希釈したｄＴｈｄを含有する複数ウェルプレート中に準備した。ウェルあたりの培地の容量は１００μ lであり、ウェルあたりの細胞数は約１×１０⁵個であった。プレートを３７℃で２４時間インキュベートした。色素、３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニル −テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を、代謝的に活性な細胞の発色指示薬として使用した。生存細胞は、色素を代謝し、還元ホルマザン生成物（青色）を蓄積し、これは比色のために可溶化される（Mossman，T,J．Immunol．Methods 5:55- 63(1983)；Li L および Lau BHS，In Vito Cell Dev．Biol．29A:531-536(1993 )）。ＭＴＴ測定法は、増殖阻害または集団死滅を測定するのに有用であるとして確立されている（Plowman、前述）。ＭＴＴ法は、懸濁増殖で試験される細胞には理想的であり、単層として増殖している一部の細胞にも利用することができる。これは、臨床的化学療法で使用される薬剤のin vivo 生物活性とよく相関し、化学療法での使用を目的とした薬剤の臨床的応用のための細胞感受性の適切な指示薬であることが証明されている（Alley、前述；Hofs、前述；Wilson JKら、 Br．J．Cancer 62:189-94(1990)；Plowman、前述）。リン酸緩衝化生理食塩水中の３０μlの０．５％ＭＴＴを、適切な時間に各マイクロ培養物に加えた。３７℃で３時間インキュベートした後、０．０１ＮＨＣｌを有する１０％ＳＤＳ水溶液１２０μlを加えて、ホルマザン生成物を放出させ溶解した。これは、３７℃でプレートを一晩インキュベートして行なった。プレートを軌道振盪器上においてマイクロウェル内容物を５分間注意深く混合後、セレス（Ceres）ＵＶ９００ＨＤＩマイクロウェルプレートリーダー（バイオテックインスツルメンツ社（Biotek Instruments Inc.）、ウィヌースキー（Winoo ski）、バーモント州０５４０４−０９９８）を用いて５７０nmで分光学的に吸光度を測定した。細胞以外のすべての試薬を含有するブランクウェルに対して吸光度データを標準化し、半自動的に集めた。単層中で増殖している細胞についての別の方法は、細胞タンパク質に対しクリスタルバイオレット（ＣＶ）染色を使用する。傷害を受けた細胞は基質から離れ、その結果、細胞が枯渇しているかまたは細胞増殖が阻害されるウェルは、対照に比べて比較的弱く染色される。この方法ではマイクロウェルに接着する細胞は、ウェル培地に４％ホルムアルデヒドを２５μl加えることにより固定される。室温で３０分後、接着した細胞を洗浄し、０．５％のクリスタルバイオレット溶液で１５分染色した。過剰の染色を、静かな水洗を繰り返して洗浄し、プレートを暗所で一晩乾燥した。各ウェルに５０％エタノールを１００μl添加後、プレートをミニ軌道（Miniorbital）シェーカー上で低速で２０分攪拌した。その４０〜６０分後、各ウェルの吸光度をＥＬＩＳＡリーダーで５７０nmで測定した。実施例１１参照。この方法は、生存細胞がプラスチックに接着する時有効である（Grおよびo SAら、Skin Pharmacol 6:137-47(1993)を参照）。図４は、上昇する濃度のｄＴｈｄによる処理の関数としてのＵ９３７細胞の増殖阻害のパーセントのプロットを示す。実施例２本例は、ＩＣ₄₀以下の一連の濃度のｄＴｈｄに暴露したＵ９３７細胞のフローサイトメトリー解析を示す。フローサイトメトリー解析は、コールターエピックスシステム（Coulter Epics System）（コウルター社（Coulter Corp）（ヒアレア（Hialeah）、フロリダ州）から購入）を用いて行なった。細胞を０．１％トリトンＸ−１００（または０．６％ＮＰ−４０）を含有する緩衝液中で破砕し、核を０．０５％ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色した（Shapiro NM，Practica l Flow Cytometry，マン・アール・リス（Man R Liss）、ニューヨーク州’（１９８８）；Nicoletti Iら、J．Immunol Methods 139:271-9(1991)を参照されたい。）連続的な時点で累進濃度のｄＴｈｄを用いて、１０，０００個の核の解析を行なった。６７５±１0nmでＰＩ蛍光放出のヒストグラムを用いて、標的集団の細胞周期画分を区別した。結果を図５に示す。細胞周期の各期の細胞の比率を、完全なＤＮＡ構造を有するこれらの細胞の画分としてＸ軸の上の積み重ね棒で示す。各試料の欠損したＤＮＡを有する細胞の画分を、総細胞数のパーセントとしてＸ軸の下に示す。欠損したＤＮＡを有する細胞はアポトーティック（apopto tic）であると仮定する（Crompton STら、Biophys．Biochem．Res．Comm．183:5 32-537(1992)）。図５の各積み重ね棒は、記載の処理時間で各記載のｄＴｈｄ濃度について解析した、＞１０，０００細胞の集団試料の細胞周期分布を示す。実施例３本例は、細胞周期階層中のヒトリンパ腫細胞の滞留または静的同期と、漸進的に上昇する濃度のｄＴｈｄの関係を証明するために、２４時間までの間隔で３mM までのｄＴｈｄまで暴露したＵ９３７細胞のフローサイトメトリー解析を示す。フローサイトメトリー解析は実施例２に記載のようにして行なった。結果は実施例２から図５のプロットＡで示す。実施例４本例は、漸進的に上昇する濃度のＨＵと、１サイクルの細胞分裂の平均時間の間のＵ９３７細胞の集団の増殖阻害の関係を示す。ＭＴＴ測定法は実施例１に記載のように行なったが、試験した薬剤はＨＵである。図６に示す結果は、ＨＵのＩＣ₄₀が２mMを越えることを示した。実施例５本例は、ＨＵ処理が細胞周期の移行時間を延長させることをフローサイトメトリー解析により示す。Ｕ９３７細胞を、ＩＣ₄₀以下の濃度範囲に暴露し、８、１６、および２４時間の間隔でフローサイトメトリーの試料を採取した。フローサイトメトリー解析は、実施例２に記載のようにして行なった。実施例７に示すように、０．１２５〜１mM ＨＵの範囲では、処理した細胞は１６時間までＳ期に入り続け、２０％未満の細胞がＤＮＡ欠損になった。最低濃度の０．１３mM ＨＵで、拡大したＳ期からＧ₂およびＭ期への最小の集団の移動の証拠があった。これは、ｄＴｈｄで処理した細胞で図４にも示すような、Ｓ期の動的遅延に一致した。ＨＵ＞１mMの濃度では、図７（２４時間の２mMの積み重ね棒を参照）に示すように、欠損したＤＮＡを有する細胞の大幅な増加が明らかになった。これは、悪性細胞がＳ期に移行するのに伴う、高濃度のＨＵによる大きな細胞傷害を反映した。ＩＣ₄₀以下の範囲で使用すると、ＲＮＲインヒビターｄＡｄｅとＤＧｕｏを用いた時に。低濃度のＨＵで得られたものと同様の細胞周期変化が得られた。適切な濃度では、これらのＲＮＲインヒビター薬剤はＲＡとして機能した。実施例６本例は、過剰のｄＴｈｄが悪性ヒト細胞中でアポトーシスを引き起こすことを示す。以前の研究（例えば、Lockshin Aら、Cancer Res 44:2534-2349(1984)；Peter son APら、Basic Life Sci 31:313-34(1985)）から、ヒトリンパ腫細胞培養物中で＞１mMのｄＴｈｄのある程度の傷害作用が示された。しかし、ｄＴｈｄは細胞周期停止を引き起こすことが知られており、現在その目的に使用されているため、Ｇ₁からＳ期への移行するヒト悪性リンパ腫細胞のヒト増殖阻害および静的同期に及ぼすサイトカインインターフェロンの作用を模倣するために、「疑似対照」として３mMのｄＴｈｄを使用した（Grimley、前述、Krek WおよびDeCaprio JA ,Methods Enzymol 1995;254:114-24(1995)を参照されたい）。これらの試験中、予想外にも、３mMのｄＴｈｄ自身に引き起こされた細胞周期停止に、顕著なＤＮＡ断片化が伴った。Ｕ９３７細胞の試料を、一連の濃度のｄＴｈｄに２４時間暴露した。トリス１０mM、ＥＤＴＡ１０mM、ＳＤＳ０．５％およびプロテイナーゼＫ２００μ g/mlを含有するＴＥ緩衝液中で５０℃で２時間、細胞試料を溶解して、これらのＤＮＡを単離した。タンパク質を１ＭのＮａＣｌ溶液で沈殿させ、２，５００× ｇで４０℃で３０分遠心分離した。ＤＮＡｓｅを含まないＲＮａｓｅ（２５μg/ ml）を上清に加え、３７℃で３０分インキュベートした。上清中のＤＮＡの分光学的定量は、２６０nmで吸光度を測定して行なった。等量のＤＮＡを含有するように調整した容量を、４０％（w/v）ショ糖、０．１ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．５％（w/v）ラウリル硫酸ナトリウムおよび０．０５％（w/v）ブロモフェノールブルーのローディング緩衝液と混合した。試料を適用して、１．２％アガロースゲルのレーンを分離し、水平の装置（BRL,ベセスダ、メリーランド州）でＴＥ緩衝液を用いて５ボルト／cmで３時間電気泳動した。分離したＤＮＡのバンドを臭化エチジウムで染色し、ＵＶ光(Fotodyne Inc.)で撮影した。図８は、写真結果のネガ像であり、ｄＴｈｄで処理した細胞中に低分子量のオリゴヌクレオチドの複数のバンドを示している（像の囲った部分）。最も低分子量（約１８０塩基対）は、シグマケミカル社（Sigma Chemical Co.）の標準的１２３塩基対ラダー（カタログ＃Ｄ５０４２）で測定した。示した結果は、アポトーシスのＤＮＡ巨大分子の断片化に特徴的な古典的な「ＤＮＡラダー」である（Tomei、前述；Obeid、前述；Gold、前述を参照されたい）。実施例７本例は、低濃度のｄＴｈｄがＳ期を遅延させるＲＡとして作用することを示す。全細胞抽出物（Ｕ９３７細胞）をＳＤＳ２×試料緩衝液（１００mMトリス− 塩酸（ｐＨ６．８）、２００mM ＤＴＴおよび４％ドデシル硫酸ナトリウム）中で調製し、５分間沸騰させた。タンパク質濃度を測定し、レーンあたり１００μ gのタンパク質試料を７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）に適用した。分離したタンパク質をイモビロン−Ｐ（ミリポア（Millipore）に移し、抗ｐＲｂモノクローナル抗体（サンタクルツ（Santa Cruz、ＩＦ８）と化学発光法（アマシャムイーシーエル（Amersham ECL））でｐＲｂを局在化させた。フローサイトメトリーのための試料を調製し、実施例２に記載のようにしてフローサイトメトリーを行なった。図９は、ｄＴｈｄの低濃度および高濃度での作用と対応する。０．２mMのｄＴｈｄは連続的細胞移動を可能にしたが、３mMのｄＴｈｄはＧ₁／Ｓで細胞周期進行を停止させた。フローサイトメトリー（図８ａ〜ｃ）試料は：（ａ）未処理対照；（ｂ）０．２mMのｄＴｈｄで４時間処理した細胞であり、Ｆ_Sは低下しているが、細胞分布は均一であることを示し、または（ｃ）３mMのｄＴｈｄで処理した細胞であり、早期Ｓ期に谷（矢印の位置）があるＦ_sの漸進性の欠損を示す（いずれもＧ₁／Ｓ期の停止を示す）。これらの知見は、ｄＴｈｄ低濃度のＳ期移行の動的遅延に一致した。免疫ブロット（ｄ）は、ｐＲｂのタンパク質の移動度の差を示し、具体的には対照試料または０．２mMのｄＴｈｄで４または１１時間処理した試料と比較して、３mMのｄＴｈｄで４または１１時間処理した試料ではｐＲｂ^P（低リン酸化型）の蓄積を示す。ｐＲｂのリン酸化は、Ｇ₁からＳ期への細胞周期の進行に必須である（Wiman K G FASEB J 7:841-5(1993)）。低リン酸化状態では、ｐＲｂはＳ期（図１を参照）の開始に必要な転写活性化因子Ｅ₂Ｆを放出しない。従って、低リン酸化ｐＲｂ^PはＧ₁期に関連し、リン酸化ｐＲｂ^PPPはＳ期移行に関連している。Ｓ期遅延に関連することがフローサイトメトリーにより示される比較的低濃度の０．２mM のｄＴｈｄでは、ｐＲｂのリン酸化は、対照細胞と比較してあまり阻害されているようではなかった。これに対して、Ｇ₁／Ｓ期の停止に関連することがフローサイトメトリーにより示されるより高濃度の３mMのｄＴｈｄでは、ｐＲｂのリン酸化は阻害された。実施例８本例は、ｄＴｈｄとＳＴＳＰの生物学的相互作用がどのように、in vitro微量培養指標システムにより定量されるかを示す。組織培養品質（コーニング（Corningp）またはコスター（Costar））の平底の９６ウェルプレートを、連続的混合を行うために容量が調節可能なマルチチャネルピペッター（例えば、コスター（Costar）またはライニン（Rainin））を使用して、試験した各薬剤の連続２倍希釈物（ＲＡとＴＣＩ）を準備した。これを図１２に示す。各プレートの２つの行と２つの列は単一の薬剤対照（ＲＡまたはＴＣＩ）として取っておき、下の右の角の４つのウェルは無処理細胞対照として取っておき、左の上の角の１つのウェルは試薬のみのブランクとして取っておいた。各プレートで、全部で５９ウェルが２つの薬剤の組合せ、２つの連続希釈物を含有した。薬剤を２つの別々のプレートまたは一連のウェル中で連続的に混合して連続希釈し、次に一緒にしてから、ウェルあたり約１×１０⁵細胞を与えるように計算した懸濁液中の一定の容量と密度のＵ９３７細胞に加えた。この実施例では、ｄＴｈｄ濃度とＳＴＳＰに対する比は、横もしくは縦の列に沿って２倍のステップで変化させた。すなわち、左上から右下への対角線の軸は一定の比を示し、左下から右上への対角線の軸は、ＴＣＩ／ＲＡの４倍の増加する比を示す。存在する時は、ＲＡとＴＣＩの最大の相乗作用がこの対角線に沿って見られた。ｄＴｈｄの連続的濃度の範囲は３mM〜０．０１mMであり、ＳＴＳＰの連続的濃度の範囲は１００nM〜３nMであった。ｄＴｈｄの連続希釈液を分注後、細胞を加えた。細胞をマイクロウェルあたり約１０×１０⁴細胞で分注して、以後の比色測定法で細胞傷害の検出の最適の感度を与えるようにした。プレートを３７℃で４時間インキュベート後、ＳＴＳＰの連続希釈液を加えた。培地の最終容量は１００μl／ウェルであった。プレートをさらに３７℃で全部で１８〜２４時間続けてインキュベートし、ヒトインキュベートした。色素ＭＴＴを、残存および代謝活性のある細胞の発色指示薬として使用した（実施例１に記載）。図１３は、マキントッシュクアドラ８００でAdobe photoshopソフトウェアを用いてScanmaker2（マイクロテック（Microtek））で捕え、Aldus Persuasion 3 .0に移して標識付けと３００dpiで印刷したＢＶＳＤの本例で使用した実際のプレートのデジタル化反射像を示す。このＭＴＴ測定法では、標準化した吸光度データを、セレス（Ceres）ＵＶ９００ＨＤＩプレートリーダー（（バイオテックインスツルメンツ社（Biotek Instruments Inc.）、ウィヌースキー（Winooski ）、バーモント州０５４０４−０９９８））を用いて各マイクロ培養ウェルから半自動的に集め、セレス（Ceres）９００プログラムのＥＩＡファイルに保存し、コンマで区切ったフォーマットでフロッピーディスクに写し、スプレッドシートプログラム（ボーランドクアトロプロ４（Borlおよび Quattro Pro 4））に入れてデータの操作をした。表４は、取り入れたＭＴＴデータを表３Ａ〜Ｅに示すアルゴリズムを使用して表型にしたものを示す。表４は、未処理の対照細胞のマイクロ培養物中の平均吸光度（マイクロプレートの右下の４つのウェルの平均値、図１２を参照）と比較した細胞増殖の阻害パーセント（％を有するカラム）に、数学的に変換したｄＴｈｄとＳＴＳＰのデータを示す。実施例９本例は、ＭＴＴ測定法で定量した細胞枯渇または増殖阻害と、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）放出測定法で定量した細胞傷害との一致を示す。実施例８のＭＴＴ測定法の意義を確認するために、結果をＭＴＴとＬＤＨの放出について二重測定法で比較した。ＭＩＳの構成は実施例８に記載のものと同じであった。各マイクロ培養物から上清に放出されたＬＤＨの相対活性を、共役酵素測定法（Deckerら、J．Immunol Methods 15:61(1988)（ここでは、発色原２−（ｐ−イオドフェニル）−３−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウムクロリド（ＩＮＴ）が、ジアホラーゼの存在下でＮＡＤＨにより赤色ＩＮＴ−ホルマザン生成物に変換される）により検出した。この方法では、インキュベート後および測定時に５０μlの新鮮な培地を各マイクロ培養物に加えてから測定を行い、全９６ウェルプレート中のマイクロ培養物をベクトンディッキンソン（Becton Dickinson）冷却卓上遠心分離機でプレートキャリアーを用いて４００×Ｇで１０分間、同時に沈殿させた。次に、各マイクロウェルからの５０μlの試料を注意深く取り、清潔な９６ウェルプレートの対応するウェルに移した。ＬＤＨ活性は、CytoTox96アッセイ（プロメガ社（Pro mega Corp.）、マジソン、ウィスコンシン州５３７１１）を用いて、製造業者の説明書に従って定量した。各マイクロウェルの総ＬＤＨを測定する試験では、１０μlの溶解試薬（CytoTox96アッセイキットから）を、細胞と培地を有する固定１００μl容量に加えてから、以下の工程を行なった。ＵＶ９００ＨＤ１プレートリーダーを使用。ＬＤＨ活性は、冷却した試料中で少なくとも５日間安定であった。図１７は、ＬＤＨプレートのデジタル化した反射像（実施例８、図１２に記載のように捕捉した）を示す。表５は、本明細書に記載されたように行なったＬＤＨ測定法のＣＲＲを示す。このＣＲＲは、表３Ａ〜Ｃ、ＯおよびＰに示す式を用いて作成した。図１８は、１つの濃度のＳＴＳＰについて表５に示すデータについてのＯ／Ｓプロットである。これらの式は、前記で使用した％阻害と比較して正数が得られる測定法において有用である。図１９は、試験プレート中の２〜１４×１０⁴／細胞からのＵ９３７細胞数の関数としての、ＭＴＴとＬＤＨ測定法の対応する直線性と正確度を示す。特に後者の目的のために、各マイクロ培養物中のすべての細胞を、プロメガ（Promega）溶解試薬で溶解してから、比色測定を行なった。実施例１０本例は、標的集団の１つの平均倍加時間を越えて延長した細胞死滅に及ぼすｄＴｈｄとＳＴＳＰの相乗的一致の作用を証明するための遅延増殖測定法を示す。一定時間（正確には実施例８に記載した通り）１つまたは複数の薬剤で処理したマイクロ培養物を洗浄した。沈降した細胞を乱さないように、ウェル容量の７５％を取り、培地を加えて１／５希釈物を得た。さらに３回洗浄し、細胞を沈降させ、薬剤の元々の濃度が＜５％となるように培地の５０％を交換した。次に、洗浄後４８時間目に生存または増殖している細胞の代謝性（未処理対照を含む）を、ＭＴＴ法により測定した（総経過時間７０時間）。ＣＲＲを表６に示す。遅延増殖測定法の補助として、実験の初めの量（Ｎ₀＝元々の量）を定量するために、「即時プレート」を使用した。「即時プレート」は、図１２に示す通常の「試験プレート」と平行して調製した。これは、５０μlの各増殖培地、および通常の「試験プレート」に移したものと同じ５０μlの細胞のアリコートを充填した１列のカラムのみが必要であった。即時プレートは、ＭＴＴ測定を完了するために試験プレートに使用した時間と同じ時間（すなわち、３時間）３７℃でインキュベートした。図２０は、ｄＴｈｄ濃度の関数としてのＳＴＳＰの種々の濃度中のＵ９３７細胞の増殖のプロットである。７０時間目の平均最終量をＮとすると、各データ点は、Ｎ／Ｎ₀の関数としてのｄＴｈｄ処理細胞の平均量の比を表す。比Ｎ／Ｎ₀＝１は、元々の量に変化がないことを示す（すなわち、標的集団の増殖無し）。比Ｎ／Ｎ₀＞１は、標的集団の全体的増殖を示す。比Ｎ／Ｎ₀＜１は、全体の集団の喪失（細胞死滅）を示す。図２１は、「即時プレート」で測定した平均の元々の量（Ｎ₀）に対する、ｄＴｈｄ濃度の関数としてのＳＴＳＰの種々の濃度中の細胞集団喪失のプロットである。７０時間目の平均最終量をＮとすると、陽性％は、１−Ｎ／Ｎ₀として表される有効細胞毒性％（ＥＣ_%）を示し、濃度に対するパーセントに変換した。すなわち、Ｎ／Ｎ₀＜１についてのみＥＣが得られた（すなわち、陽性％）。図２１は、処理後７０時間目に、１７５nMのＳＴＳＰで処理した細胞の最大の有効細胞毒性は約８５％であったことを示す。０．１mMのｄＴｈｄの存在下の２５nM のＳＴＳＰ、または０．５mMのｄＴｈｄの存在下の１３nMのＳＴＳＰで同じ結果が得られた。図２０と比較すると、０．１mMのｄＴｈｄ自身は、対照と比較すると細胞増殖について最小の作用を有することを示す。丁度４０％の有効細胞毒性（ＥＣ₄₀）を達成するには、３mMを越えるｄＴｈｄが必要であった。実施例１１本例は、ＴＣＩとしてのＳＴＳＰとＲＡとしてのｄＴｈｄとのスケジュールされた試験を示す。ＭＩＳを実施例８に記載のように行なったが、ｄＴｈｄ処理開始後０〜４時間目に各マイクロ培養ウェルにＳＴＳＰを加えた時結果を比較した。各プレートのＳＴＳＰ処理の総持続時間は同じであった。ｄＴｈｄによるＳ期の動的遅延に一致して、ｄＴｈｄによるＳＴＳＰの増強は、細胞をたまたまゼロ時間（下）よりＳＴＳＰの時間前（上）にｄＴｈｄで４時間処理した時大きかった。ｄＴｈｄ摂取の時間と代謝性プールとの平衡化にかかる時間のは、作用の遅れの説明となるであろう。しかし、濃度＞０．５mMでの作用と比較して、０．０５mM〜０．５mM の範囲のｄＴｈｄでの線形の用量作用関係の一貫した欠如とより大きな活性は、化学量論的代謝性競合によるより動的遅延による増強作用の考え方を支持する。表７は、スケジュール依存性試験の結果である。実施例１２本例は、ＳＴＳＰは細胞周期のＳ期にアポトーシスを誘導することおよびＤＮＡ断片化はｄＴｈｄにより増強されたことを確認する。５０nMのＳＴＳＰで０〜１２時間処理したＵ９３７細胞を、実施例６に記載のＤＮＡゲル電気泳動で解析した。図２３は、５０nMのＳＴＳＰが、Ｕ９３７細胞中８時間である「ラダーパターン」ＤＮＡ断片化を誘導することを示すＤＮＡゲルである。この作用は、より長い時間（データは示していない）またはより高濃度のＳＴＳＰで処理した細胞でより顕著になり、ｄＴｈｄにより増強された。実施例２に記載の標準的フローサイトメトリーを使用して、５０nMのＳＴＳＰで処理したＵ９３７細胞はＧ₂とＭ期に蓄積することが観察された（図２４）。この作用は、処理後４時間から始まって明らかになり、処理後８時間と２４時間に示す。図２４では、細胞周期の各期の細胞の比率は、完全なＤＮＡ構造を有する細胞の割合としてＸ軸の上の積み重ね棒により示され、各試料で欠損したＤＮＡを有する細胞の割合は、Ｘ軸の下に総細胞数のパーセントとして示す。おそらくアポトーシス細胞であるこの画分を、フローサイトメトリーの間の細胞の比較的低下したＰＩ蛍光により定量した（Cromptons、前述を参照）。Ｓ期の細胞が随伴して低下するということは、Ｇ₂とＭ期に観察される細胞の蓄積がＳ期の間に枯渇したより多くの集団の生き残りであるかも知れないことを示している。すなわち、５０nMのＳＴＳＰは、Ｓ期の標的期間でＴＣＩとして挙動した。フローサイトメトリーのより進んだ使用では、末端トランスフェラーゼとホモポリマーテイリング（Gorczyca W.ら、Cancer Res 53:1945-1951(1993)に記載されている）を利用して、核中でＤＮＡ鎖ブレークを検出した。１×１０⁶細胞の試料を、１％緩衝化ホルムアルデヒドで０℃で５分間固定し、ＰＢＳで洗浄し、７０％エタノールに再懸濁し、−２０℃で４８時間保存した。細胞をＰＢＳ中で再水和し、次に１０μlのカコジレート緩衝液と２．５mMのＣｏＣｌ₂に懸濁して、末端トランスフェラーゼ反応のために調製した。ビオチン標識１６−ｄＵＴＰと末端トランスフェラーゼ（ベーリンガーマンハイム（Boehringer-Mannheim）、ＧｍｂＨ）を加えて、それぞれ最終濃度０．５nMと５００単位/ml を得て、３７℃で３０分細胞と反応させた。細胞をＰＢＳですすぎ、０．１％トリトンＸ− １００、５％（w/v）脱脂粉乳、および２．５μg/ml ＦＩＴＣ標識アビジンを含む４×生理食塩水−クエン酸緩衝液（ベーリンガーマンハイム（Boehringer-M annheim）、前述）に再懸濁し、室温で３０分インキュベートした。０．１％トリトンＸ−１００を含有するＰＢＳで細胞を洗浄して、過剰のアビジン−ＦＩＴＣを除去した。ＤＮＡ傷害を有する細胞では、ビオチン標識ｄＵＴＰがアビジン −ＦＩＴＣにより局在化された。アビジンとビオチンは強い結合を形成し、ｄＵＴＰホモポリマーテイリングの程度を明らかにする。図２５は、Ｓ期がＳＴＳＰの標的期間であることを確立するために、ＤＮＡ断片化のための試験とともにフローサイトメトリー細胞周期二変数解析を示す。各ヒストグラムは、細胞ＤＮＡ含量と量の３次元の図を示す。ｘ軸は、矢印の方向に進むに従い、ヨウ化プロピジウム染色により測定した時の細胞あたりの増加するＤＮＡ含量を示す。ｚ軸は、矢印の方向に進むに従い、ＤＮＡ断片化の部位のｄＵＴＰ取り込み（アポトーシスの証拠）の増加する量を示す。細胞あたりのＤＮＡの量は、各細胞の細胞周期位置を反映する。図２５（ａ）は、細胞周期位置の正規分布の未処理Ｕ９３７細胞集団を示す。図２５（ｂ）は、ｄＵＴＰ標識による細胞の出現を示し、これは３mMのｄＴｈｄで１１時間処理後のＤＮＡ断片化を示す。これらの細胞の位置とＳ期のＰＩ染色細胞の減少は、Ｓ期にＤＮＡ傷害が起きたことを示唆する。図２５（ｃおよびｄ）は、細胞がｄＵＴＰでほとんど標識されず、アポトーシスがほとんど無いことを示す。図２５（ｄ）に示すＧ₂／Ｍ期の細胞の大きな増加は、ＳＴＳＰおよび他のインドールカルバゾールに特徴的である。図２５（ｅ）は、０．２ＭのｄＴｈｄで４時間処理し次に２５nMのＳＴＳＰを加えてさらに７時間後の、ｄＵＴＰ標識された細胞の数の顕著な増加を示す。他の２つのインドールカルバゾール（ＫＴ５９２６、図２５（ｆおよびｇ），およびＫ２５２ａ、図２５（ｈおよびｉ））で処理した細胞について同様の結果を示す。すなわち、ｄＴｈｄの存在は、ＳＴＳＰまたは関連するインドールカルバゾール化合物のみにより蓄積されたものと比較して、Ｇ₂とＭ期に細胞の蓄積の劇的な同時低下を伴った。ＤＮＡ傷害はある期に開始され別の期に発現されるため、ＤＮＡラダーパターンが示される時でも、ＤＮＡプローブを有するかまたは有さないフローサイトメトリーは標的期間を規定するのにほとんど必須である（Zakeri ZFら、FASEB J 7 :470-478(1993)；Fisher、前述；Cotter TGら、Anticancer Res 12:773-9(1992) ；Lindenboi MLら、Cancer Res 55:1242-7(1995)）。ＤＮＡ断片化がＤＮＡゲル電気泳動により同定されない時、ヘキスト（Hoechst）色素を使用するような他の方法を用いて、ＤＮＡ傷害の細胞周期位置を解析する（Sun XMら、Analytic B iochem．204:351-356(1992)；Chen U，Immunology 85:366-379(1992)）。実施例１３本例は、細胞周期のＧ₁またはＧ₀期に細胞を滞留させることにより、ＳＴＳＰ誘導アポトーシスのｄＴｈｄによる増強が低下することを示す。１２−０−テトラデカノイル−ホルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）によるヒト前単球性リンパ腫細胞（Ｕ９３７）の処理は、これらがマクロファージ様の分化を受けるようにし、プラスチックの表面に接着させる。Kurcz、前述。この例では、Ｕ９３７細胞を、１０nM ＴＰＡ（Sigma Chemical）を含む懸濁液中で４８時間処理して分化させた。４８時間浮遊し、次に基質に２４時間接着後、Ｓ期（Ｆ_s）の細胞の割合を実施例２に示すフローサイトメトリーで解析したところ、ＴＰＡがこれらの細胞を細胞周期のＧ₁またはＧ₀期に強制的に入れることが判明した。洗浄後細胞を新鮮な増殖培地に入れ、±ｄＴｈｄ（０．１９mM）または±ＳＴＳＰ（２５nM）でさらに７時間処理した。ＤＮＡ抽出とゲル電気泳動を実施例６に記載のように行なった。図２７より、ＴＰＡ分化が、ＳＴＳＰ処理中のＤＮＡ断片化のｄＴｈｄ増強を有意に低下させることが判る。実施例１４本例は、ＳＴＳＰ傷害のｄＴｈｄによる増強が、リボヌクレオチド還元酵素（ＲＮＲ）のｄＴｈｄ阻害によることを示す。本例では、ｄＴｈｄおよび±ＳＴＳＰで処理したＵ９３７細胞の培養物へｄＣｙｔを加えた。ＭＴＴ測定法を実施例８に記載のように行い、ＤＮＡ抽出とゲル電気泳動を実施例６に記載のように行なった。図２８より、試料をＤＣｙｔでも処理した場合には、ｄＴｈｄとＳＴＳＰで処理した試料ではＤＮＡ断片化が低下することが判る。実施例１５本例では、クローン原性測定法により、ＲＡ（ｄＴｈｄ）とＴＣＩ（ＳＴＳＰ）の相乗的一致に細胞を平均世代時間未満の時間暴露すると、ヒト悪性リンパ腫細胞（Ｕ９３７）の標的集団への長期の生物学的傷害が引き起こされることを示す。繁殖能力を有する細胞が生存していれば、細胞毒性薬剤または薬剤混合物により標的細胞集団の排除を確認することができる。軟寒天またはメチルセルロース中のクローン原性測定法は、悪性細胞がしばしばこれらの培地中で増殖しコロニーを形成ことができるため、悪性細胞集団への細胞毒性薬剤の長期の作用を測定するための実用的かつ有用な手段である。悪性細胞の任意の株または集団のコロニー形成効率は、接種数との関係でコロニー数から確立すべきものであり、これは広範囲に変動する。Ｕ９３７細胞の場合、対照実験では、メチルセルロース中で３〜５日間の培養後、少なくとも５０％の効率が得られた。この方法では、ストック細胞懸濁液を新鮮な増殖培地中で調製し（８×１０⁵細胞／ml）、ｄＴｈｄとＳＴＳＰの連続２倍希釈物を実施例８に記載のように二変数連続希釈物中の４０×最終濃度まで作成した。新鮮な増殖培地懸濁させたＵ９３７細胞懸濁液を、ウェルあたり１mlで２４ウェルプレートに分注し、ｄＴｈｄおよび／またはＳＴＳＰを選択された濃度で５０μl指定のウェルに移し、３７℃でインキュベートした（実施例２Ａ、表７と同じプロトコール）。メチルセルロース（ＭＣ）溶液２．１〜２．３％を、ステムセルテクノロジーズ（Stem Cell Technologies）（バンクーバー、ブリチッシュコロンビア）から得て、一連の無菌試験管中で作成した：（ａ）０．４mlのＭＣストック溶液、（ｂ）５０μlのNuSerum、（ｃ）２４ウェルプレートの処理細胞懸濁物からの２×１０⁴細胞（約２５０μl）および（ｄ）完全培地で最終容量を１mlとする（最終細胞密度＝約２×１０⁴細胞）。１８ｇ．針を有するシリンジを用いて、各試料の最終細胞調製物１００μｌを、９６ウェルプレートに３ウェルずつ入れた。すなわち、最終細胞数は約２，０００細胞／ウェルであった。プレートをコロニー形成について毎日観察した。３〜５日目に、コロニーを数え、コロニーにＭＴＴを重層した（２５μl）。３７ ℃で一晩インキュベートし、４％ホルマリン１００μlを加えて、可視化し写真を撮った。図３１に９６時間目のクローン原性測定の結果を示す。有効細胞毒性は、１−Ｃ／Ｃ₀として計算した。ここで、Ｃ＝処理細胞の試料により形成されるコロニーの数であり、Ｃ₀＝同等の未処理細胞により形成されるコロニーの数である。０．１mMのｄＴｈｄまたは２０nMのＳＴＳＰ単独の最大の有効細胞毒性は９６時間で４０〜６０％であったが、細胞を両薬剤の最適の相乗的一致で処理した時ほとんど完全な細胞毒性が観察された。実施例１６この実施例では、腫瘍原性測定法により、ＲＡ（ｄＴｈｄ）とＴＣＩ（ＳＴＳＰ）の相乗的一致に細胞を平均世代時間未満の時間暴露すると、ヒト悪性リンパ腫細胞（Ｕ９３７）の標的集団への長期の生物学的傷害が引き起こされることを示す。ヒト悪性細胞は局所の血漿栄養物質の供給を受け、数週間生存するため、免疫抑制されたマウスのヒト悪性細胞の異種移植片の生物学的挙動は、患者における自然の増殖条件に近似できる。すなわち、接種された細胞は増殖前に潜伏状態で生存し、これはin vitroでは容易に倍化できない。接種サイズは、現実的な時間枠の中で腫瘍増殖を観察するのに重要である。免疫能低下マウスは、異種移植片組織に対して有効な細胞性免疫応答を示さないが、小さい接種物は、有効血管支持を発生させる前に、マクロファージまたはナチュラルキラー細胞により傷害を受ける。予備的実験では、１×１０⁷ヒト悪性リンパ腫細胞（Ｕ９３７）の皮下接種は、無胸腺ヌードマウスで腫瘍原性であることが判明した。腫瘍原性の試験のために、実施例１に記載のように増殖培地を有するプラスチックフラスコ中で培養し２４時間ごとに繰り返し細胞数を計測することにより対数的に増殖しているＵ９３７細胞を試験した：（ａ）ｄＴｈｄ０．２mMを１２時間；（ｂ）ＳＴＳＰ２５nMを８時間；（ｃ）ｄＴｈｄ０．２mMを４時間と次にＳＴＳＰ２５nMを７時間；または（ｄ）処理なし（対照）。処理後細胞を沈降させ、無血清ＲＰＭＩ１６４０に再懸濁させた。各群で平均体重１７ｇの４匹の離乳した無胸腺Ｎｕ／Ｎｕマウスの肩甲下領域の皮下に、１０⁷細胞（生存率＞９０％）を含有するＲＰＭＩ１６４００．１mlを接種した。１４日間、これらの皮下部位の腫瘍の形成を観察した。１つの対照マウスは早く死んだ。１４日目に、すべてのマウスを屠殺し、腫瘍を写真に撮り、腫瘍を注意深く切開し、腫瘍の重さを記録した。腫瘍を組織学的に確認した。ｄＴｈｄとＳＴＳＰを投与したマウスは腫瘍の発生がなかった。表３４に、ｄＴｈｄのみ、ＳＴＳＰのみを投与されたマウス、および薬剤投与のないマウスの腫瘍の平均重量の統計的評価を示す。ｄＴｈｄ／ＳＴＳＰ処理細胞と単一薬剤処理または対照細胞の結果の差は、全て統計的に有意であった。実施例１０、１５および１６の結果と実施例７および８の結果とを比較することにより、ＲＡとＴＣＩの相乗的一致のためのＭＩＳでは、遅延細胞死滅、クローン原性測定または腫瘍原性測定に反映されるように有効な細胞毒性を過小に見積もってしまうことが判る。薬剤の組合せの後者の各範囲内のヒトまたは動物における治療適用の可能性は、ヒト被験者において血漿レベルで６mM ｄＴｈｄまで許され（Blumenreich,前述）、抗高血圧薬としてラットでは７００μg/kg静脈内およびイヌでは１３０μ g/kgまでのＳＴＳＰの動物試験を示す公表されたデータから明らかである。Buch holz RAら,Cellular および Molecular Mechanisms in Hypertension中，p.199 -204,プレヌムプレス（Plenum Press），ニューヨーク州(1991)およびHypertens ion 17:91-100(1991)を参照。さらに表３５を参照。実施例１７本実施例では、酵母または真菌感染症の治療における本発明の使用を説明する：本実施例において、ＨＵまたは他のＲＡのＩＣ₄₀、およびＳＴＳＰまたは他のＴＣＩのＩＣ₅₀を、所定の世代時間、酵母または真菌集団の増殖阻害に関して測定する。一連の９６ウェルプレートに、実施例８に記載したように二変数の濃度のＲＡ（最大濃度＝ＩＣ₄₀）およびＴＣＩ（最大濃度＝ＩＣ₅₀）を含む、適切な液体または半固体の寒天に基づく増殖培地（Lorian，前述中のMcGinnis MRとRin aldi MGを参照）を充填する。各マイクロウェルに、同数の酵母または真菌（１００〜２０００コロニー形成単位／ウェル）を接種する。接種の１６〜９６時間後、３０〜３５℃でインキュベーションして、（１）〜（３）を用いて平行試験を行い、二変数ＲＩおよびＴＣＩ組合せの真菌増殖に及ぼす効果を測定する：（１）液体培地中の可視濁度に注目し、コンピュータ解析のためにディジタル化した透過または反射像を得ること、または（２）ＭＴＴ測定または他の比色測定を行い；そしてデータを回収して結果の比とＯ／Ｓ微分プロットを組合せて解析すること、または（３）コロニー形成。コロニー形成は以下のように記載される。液体培地を含むプレートを軌道振盪器で撹拌し、５〜１０μlの培地を各ウェルから吸引して１：１００まで希釈する。１００μlの食塩水中の各ウェルの内容物を混合し、混合により寒天を浸軟することにより、半固体培地を含むプレートからの試料を得る。次にいずれかのプレートから、０．５mlのアリコートをペトリ皿の半固体培地に載せる；ペトリ皿を３７℃で一晩インキュベートして、標準的微生物学の方法により酵母または真菌のコロニーを各プレート上で計数する。Lorian，前述，pp.53-197。増殖の阻害パーセントは、処理生物により形成されるコロニーの数対未処理対照生物により形成されるコロニーの数の比をとることにより算出する。データアルゴリズムによるデータ解析の結果は、ＲＡのＩＣ₄₀以下の濃度の範囲において、ＴＣＩによるコロニー増殖阻害に及ぼすＲＡの増強作用を示す。実施例１８本実施例では、ウイルスに感染した細胞に対する傷害、およびチミジンキナーゼ（Ｔｋ）またはｐＲｂの変化による選択性を増強するための本発明の使用を説明する。ＤＮＡウイルスに感染した細胞では、ＤＮＡ生合成は動的遅延を受けやすい。このようなウイルスは、ヘルペスウイルスファミリーのメンバーを含む。バーキットリンパ腫由来の多くのヒトの悪性細胞は、エプスタインバーヘルペスウイルス群ウイルスの不完全ゲノムを有しており、内因性チミジンキナーゼ（Ｔｋ）活性に加えてウイルス由来のＴｋを発現することがある。すなわちヘルペスウイルスによる細胞の感染は、ＲＡとして作用するｄＴｈｄを用いる、ウイルス感染細胞へのＴＣＩ傷害の選択的増強に対する強力な手段を提供する。本実施例において、細胞をBerezesky IKら，Exp および Mol Phthol．14:337 -49(1971)により記載された方法によりある株のサイトメガロウイルスで感染させて、９６ウェルプレートに接種する。ｄＴｈｄのＩＣ₄₀を、未感染細胞について測定する。ウイルス感染は、感染巣において目に見えて数日間にわたり進行する：細胞は拡大して、核と細胞質容量の両方が増大して球状になる。感染の０〜２４時間後の時点から開始して、マルチウェルプレート中の細胞を、一連の予定された、ｄＴｈｄ、ＨＵ、またはＡｐｈを含むＲＡ（最大濃度＝ＩＣ₄₀）との二変数の組合せに２〜４時間暴露して、次にＳＴＳＰ（最大濃度＝５０nM）に全期間で２４時間まで暴露する。細胞傷害は、ＬＤＨ、ＭＴＴ、またはクリスタルバイオレット測定のいずれかを用いて評価する。結果を、ｄＴｈｄとＳＴＳＰの二変数の組合せで同様に処理した未感染対照細胞と比較し、データを、実施例８に記載した適切なセットのＣＲＲまたはＯ／Ｓプロットの式を用いて解析する。未感染対照に比較して、感染培養物中の細胞は、ＲＡとＳＴＳＰの各組合せについて一連の時点でＬＤＨ放出の増加により測定される細胞傷害の速度が増大している。関連法において、ヒト悪性リンパ腫細胞を、Bedoya Vら，J．Natl．Cancer In st．41:635-52(1968)により記載されるように、単純ヘルペスウィルスに感染させる。ｄＴｈｄのＩＣ₄₀を、未感染細胞について測定する。感染の０〜２時間後の時点から開始して、ＲＡ（最大ＩＣ₄₀）とＳＴＳＰ（最大５０nM）の二変数組合せによる細胞傷害の増強は、上述のように９６ウェルプレートに適用し、ＭＴＴ，ＬＤＨまたはクリスタルバイオレット法によりデータを解析する。感染培養物中の細胞は、組合せ薬剤処理の一連の時点で細胞傷害の速度が増大している。データの解析とＳ_maxの算出により、ＲＡとしてのｄＴｈｄの作用およびＩＣ₄₀ 未満のｄＴｈｄ濃度の範囲におけるＳＴＳＰが増強することが判る。ヒトの発癌に関係するヒトパピローマウイルスのような発癌性ＤＮＡウイルスに感染した細胞は、ｐＲｂの機能を阻害しうるタンパク質を合成するウイルスの作用により動的に遅延する。Winman KG，FASEB J．7:841-5，1993。ヒト子宮頚癌の発生に先行する細胞のようなウイルスで形質転換した細胞は、特にＳＴＳＰによるアポトーシスの誘導を受けやすいが、これは、これらの細胞がＧ₁／Ｓを通ってＳＴＳＰの標的間隔へ移行できないためである。すなわちこれらは、ＲＡによる動的遅延およびＳＴＳＰによる死滅を選択的に受けやすい。さらに、発癌性ウイルスタンパク質による細胞のトランスフェクションは、ＲＡとしてＳＴＳＰまたは他のＴＣＩの効果と相乗的に作用する。実施例１９本実施例では、ＭＩＳと補足データアルゴリズムが、薬物、または医療において使用される他の薬剤の拮抗相互作用を試験するために使用するできることを示す。薬物相互作用は、医学および薬理学関係の重要な問題である。化学療法において、薬剤拮抗作用は、薬剤作用の特異性を減少させ、副作用を増大させうる。ＴＣＩとしてＳＴＳＰを用いる試験（実施例において細胞周期のＧ₂期に生化学的効果を発揮することが示された）において、本発明者は、Ｓ後期またはＧ₂前期における他の薬剤の作用が、ＲＡとして作用することによりその効果を増強するかどうかを知ろうと試みた。実際、本発明者は、Ｇ₂期で細胞周期に影響を及ぼすことが報告されているカフェイン（Schlegel R; Harris MO; Belinsky GS，J Cell Biochem 57:351-61(1995)）が、強力にＳＴＳＰの作用に拮抗することを発見した。これは、試験したカフェインの濃度が０．１〜２mMであり、カフェインの濃度が３．１〜５０nMの範囲である場合の微分Ｏ／Ｓプロットで証明されている。実施例２０本実施例では、ＭＩＳと補足データアルゴリズムが、薬物、毒性物質または他の環境危険物質の遺伝毒性に関する相乗的相互作用について試験するために使用することができることを示す。表２または図１１に示されるＤＮＡ病変を生成するいくつかの化合物のような、遺伝毒性のある潜在的に危険な薬剤へヒト、動物または植物の生命を環境または医療的に暴露することは、重大な社会的な問題である。ＭＩＳにより、細胞周期に関係するほど強い遺伝毒性効果の可能性を分析するために、代用標的集団として培養細胞を利用することができる。この研究法において、未知の性質を有する化合物の効果は、本明細書に検討されるアルゴリズムにより試験される。細胞周期に関係する効果を有する薬剤は、遺伝毒性の可能性があるが、その逆もあり得る。他方、本来遺伝毒性でない薬剤は、低濃度の明らかに危険のない濃度の別の薬剤と相乗的に一致すると、遺伝毒性になることもある。このタイプの発生は、石油火災または森林火災のような大規模な環境ストレスの事件の余波、または毒性物質が不当な目的で放出される軍事作戦における重要な問題である。本実施例において、試験した薬剤は、通常最小希釈で局所用昆虫忌避剤として適用され、Osimitz TGとGrothaus RH，J Am Mosq Control Assoc; 11:274-8(199 5)の安全性研究の主題であるＤＥＥＴ（Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルアミド）であった。０．５mM以上の濃度で、出願人は、Ｕ９３７細胞、ならびにJurkat Ｔ細胞およびDaudi Ｂ細胞でもアポトーシスの誘導を同定した。ＭＴＴ試験において、約０．０５〜３mMの範囲の予期的ＲＡとしてのｄＴｈｄまたはＨＵの予備試験結果からは、ＤＥＥＴ誘導性アポトーシスの有意な増強は認められなかった。ＭＩＳおよび補足データ解析を用いるこの薬剤および他の薬剤の追加試験はこのように可能である。実施例２１本実施例では、ＭＩＳおよび補足データアルゴリズムが、相乗的一致における使用のためのＴＣＩまたはＲＡとしての放射線源の作用を測定するために使用するできることを示す。ｐ５３発現の役割、および放射線暴露に対する細胞の感受性を測定する際の細胞周期は、多くの研究の主題であった（Kuerbitz SJら，Proc．Natl．Acad．Sci ．USA 89:7491-5 1992を参照のこと）。低エネルギー（ベータ線）放射線源としてトリチウム化水を用いて、２４時間までの、増殖阻害および％集団ロスに及ぼす放射線の作用についてＭＴＴ測定法を用いて試験を行う。較正した放射活性線量における連続２倍の変化物は、ＲＡまたはＴＣＩとして試験される薬剤の２倍の連続希釈物と一緒にする。データは、実施例８および１０に示される補足解析法により解析する。トリチウム化水は、１００mCi/gmまたは５Ci/gm（デュポン（DuPont））の比活性で得られ、作業用ストック溶液からの連続希釈（１：２５以上）により通常の細胞培養用増殖培地に分注される。ＩＣ₄₀とＥＣ₅₀は、実施例１および実施例１０に示されるように約２４時間でＭＴＴ測定法により求める。必要な活性の具体的な範囲は、線量測定法の計算に基づく。パイロットデータを用いて、Ｕ９３７細胞を、照射装置中でガンマ線に暴露して、２．５〜２０グレイの範囲の累積暴露によりアポトーシスを生成する。必要な同等のトリチウムは、１〜４mCi/ml培地の範囲にあると概算される。パイロットデータより、ベータ線が、ＳまたはＧ₂期の間に標的間隔を有さなければならないことが示唆される。このことは、広く発表された文献からも予想される（例えば、Kuerbitz，前述; Giocanti Nら，Cancer Res 53:21 05-11(1993)を参照）。ｄＴｈｄ、ＨＵ、アフィジコリンまたは他のＲＡの作用は、放射線源に暴露する２〜６時間前に培養細胞にこれを投与し；そして放射線暴露を２４時間まで続けると明らかになる。しかし、細胞内の放射線の二次的作用が、放射線作用の間接的な原因であり、出現に時間を要するならば、放射後のＲＡの投与が有利である可能性がある。したがって、種々の線量の放射線作用および種々の用量のＲＡまたはＴＣＩとしての予期的薬剤は、実際的に試験する必要がある。約２５nMの範囲のＲＡとしてＳＴＳＰを用いたパイロットデータにおいて、我々は、２．５〜１０Gyのガンマ線へのＵ９３７細胞の単回暴露により生成する傷害に及ぼす増強作用を認めた。従ってＳＴＳＰは、ＲＡまたはＴＣＩのいずれかとして試験するための候補である。これらの実験におけるトリチウム化水の使用には、利便性と安全性の問題がある。放射活性水は、ＤＮＡ複製に選択的に組み込まれてバイアスをもたらす他の同位体とは対照的に、ＤＮＡ合成に無関係に細胞に均一に平衡化する。トリチウム化水は、短い範囲で傷害を生成する相対的に低いエネルギーのベータエミッターである。それにもかかわらず、医療において使用される高エネルギーガンマ線により生成するＤＮＡ破壊と類似したＤＮＡ破壊を生成しうる。症状のさらに近い近似は、ガンマ線放射装置、または一連の放射標識ビーズまたはプラテンのような、他の物理装置により達成することができ、その場合、ウェルの列を一定の期間ＢＶＳＤによるＭＩＳの一般法を用いて放射線の線量を徐々に上げて暴露して、実施例８に記載される式を適用することができる。実施例２２本実施例では、熱帯魚マラリア（falciparum malaria）感染症の治療における本発明の使用を示す。マラリアプラスモジウムファルシパルム（malaria plasmodium falciparum）（p．falciparum）は、環→栄養体→シゾント期への４４時間の周期で哺乳動物宿主のヒト赤血球内での分裂により増殖する真核生物である。この寄生虫が、ヒトの肝臓で複製する組織相も存在する。ヒトにおいて、プラスモジウムファルシパルム（p．falciparum）は、その急速で制御されない増殖および大脳の微小血管系の凝血のため、特に危険である。マラリア寄生虫は、ＲＡのクラスＩとして作用しうることが証明されたある種の薬剤に感受性である。マラリア寄生虫について、リボヌクレオチド還元酵素の遺伝子が解析されている。Chakarabartiら，Proc．Natl．Acad．Sci．90:12020- 4(1993)。ＲＮＲを阻害する鉄キレーターに対する感受性が証明されており（Lyt ton SDら，Blood 84:910-15(1994)）、そしてこの寄生虫は、ｄＴｈｄまたはフルオロデオキシウリジンを取り込むことができる。Rathod PKとReshmi S，Antim icro Agents および Chemother．38:476-80(1994); Wright MとTollon Y，J. Cell Physiol．139:346-53(1989)。寄生虫はまた、単一薬剤としてのＳＴＳＰの作用に感受性である。Ward GEら，Exp．Parasitol．79:480-7(1994)。一連の実験において、in vitro法（Milhous WKら，Antimicrob．Agents Chemo ther．27:525-530(1985)）により、プラスモジウムファルシパルム（p．falcipa rum）Ｗ２またはＤ６株で感染したヒトＡ陽性赤血球（ＲＢＣ）（Oduola AMJら，Exper．Parasitol．66:86-95(1988)）を、ＲＢＣ感染の２４時間後急速な増殖段階の間、連続濃度のスタウロスポリン（staurosporine）、ヒドロキシ尿素またはアフィジコリンに暴露した。寄生虫増殖は、寄生虫ＤＮＡ中に組み込まれる³ Ｈ−ヒポキサンチンの取り込みによりモニターした。連続薬剤希釈物を含む９６ウェルプレートにおける放射活性測定に基づき、Ｗ２／Ｄ６株における阻害濃度（ＩＣ₅₀）は、各々、スタウロスポリンの場合で０．１５μM／０．１９μM、ヒドロキシ尿素の場合で２１９μM／１７５．２μM、そしてアフィジコリンの場合で０．１２３μM／０．４０μMであった。これらの結果は、ＴＣＩとしてのＳＴＳＰとＲＡとしてのＨＵまたはＡＰＨの併用が実用的であることを示す。さらなる検討で、寄生虫が感染したＲＢＣ系を用いて、連続希釈した薬剤の組合せのＭＩＳ法を適用する。各ウェルの放射活性の絶対数を、寄生虫感染の程度の指標として使用する（すなわち、数値が高いほど感染が大きい）。このためＲＡとＴＣＩの相乗的作用において、各薬剤単独を用いた結果の合計から予測されるよりも、カウント数は低い。したがってデータ解析に適用されるアルゴリズムは、実施例９においてＬＤＨ放出の解析に使用されたものと同じである。表３Ａ〜Ｃを用いて、ＣＲＲおよびＯ／Ｓプロットの両方が得られる。 in vivo 試験について、１群６〜８匹の体重２５〜３０ｇのいずれかの性別の近交系スイスアルビノ（Swiss Albino）マウスに、プラスモジウムヨエリ（Plas modium yoelii）またはプラスモジウムベルギ（Plasmodium berghii）を感染させる。寄生虫血症の割合が約４０％のときに感染したマウスを屠殺することにより感染を伝染させる：０．５mlの血液を麻酔したマウスの心臓から吸引し、リン酸緩衝化クエン酸ナトリウム抗凝固剤を加えて５mlに希釈し、新たなマウスに腹腔内注射する（０．５mlの希釈試料）。マウスの処理の１つのタイプでは、ＨＵの経口投与を０日目すなわち感染の２４時間後に開始して、１５０μMまでの範囲の血漿濃度を達成する。２〜２４時間後、異なる実験において、７００μg/kgのＳＴＳＰ（Buchholz，前述）を単回用量で静脈内投与する。次いで寄生虫血症を１２時間の間隔で６匹のマウスを群としてモニターする（未処理マウス；ＨＵのみで処理したマウス；ＳＴＳＰのみで処理したマウス；および両方の薬剤で処理したマウス）。マウスの生存を記録し、最初の結果により示されるように処理を反復してもよい。尾静脈からの数滴の血液から薄い塗沫血液を調製する。塗沫をメタノールで固定し、ギムザで染色して、５０油浸視野当たり（１００×）の感染赤血球の数を計数する。寄生虫血症の低下は、ＨＵ／ＳＴＳＰ処理マウスで最大であり、これらのマウスの平均生存時間は、他の群のマウスに比べて増大している。実施例２３本実施例では、機能性ｐ５３を欠失している細胞における複数のＲＡによるアポトーシスを誘導するＴＣＩとしてのＳＴＳＰの成功が、ＳＴＳＰの作用に伴ういくつかの重要な分子的および細胞生物学的変化により説明することができることを示す。本実施例において、ヒト悪性リンパ腫細胞（Ｕ９３７）を、ＳＴＳＰまたはｄＴｈｄとＳＴＳＰの相乗的一致で処理した。ＣＤＣ２およびＭＡＰキナーゼの免疫ブロット分析のために、５×１０⁶細胞の試料をＳＤＳ試料緩衝液に抽出して、実施例４に記載されるように、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロッティングに付した。サイクリン依存性キナーゼｐ３４^cdc2は、シグナルトランスダクションラボラトリーズ（Signal Transduction Laboratories）からの抗体クローン＃１により検出した。ヒストンのリン酸化活性の検出のため、プロテインＡセファロースを用いてモノクローナル抗体（サンタクルーズ（Santa Cruz）、＃１７）によりｐ３４^cdc2を免疫沈降させて、γ³²Ｐ−ＡＴＰ（アマーシャム（Am ersham））の存在下でＨ１基質（ベーリンガーマンハイム（Boehringer Mannhei m））と反応させた。リン酸化生成物を分離して、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離して、Ｘ−Ｏマット（X-Omat）フィルム（コダック（Kodak））を用いてオートラジオグラフィーにより可視化した。ＭＡＰキナーゼは、ファーミンゲン（Pharmingen）（サンジエゴ、カリホルニア州）からのモノクローナル抗体と共に免疫ブロッティングすることにより検出した。酵素活性の測定のために、ＭＡＰキナーゼは、上記のようにｅｒｋ２に対するポリクローナル抗体またはＪＮＫに対するＧＳＴ−ＪＮＫ基質と共に免疫沈降させた。ｅｒｋ２に対する基質は、ミエリン塩基性タンパク質基質であり、ＪＮＫに対する基質は、ＧＳＴ−ＪＮＫ（ファーミンゲン（Pharmingen））であった。プロトオンコジーン産物のｃ− ｍｙｃは、オンコジーンサイエンシーズ（Oncogene Sciences）からの抗体と共に免疫ブロッティングすることにより測定した。全ての上記タンパク質は、アポトーシスを引き起こし、かつｄＴｈｄとの相乗的一致において作用する、ＳＴＳＰの作用に関連して重要であった。図３６より、ｐ−Ｙ−１５およびｐ−Ｔ−１４上のｐ３４^cdc2の脱リン酸化が、Ｇ₂期からＭ期への細胞変化を調節する重要な因子であることが判る。ＭＡＰキナーゼＪｕｎＫ（ＪＮＫ）とＥｒｋ−２の比は、ＳＴＳＰが、ＭＡＰキナーゼＪＮＫおよびＥＲＫ２の活性の均衡を変化させ（Xia Z.ら，Science 270:1326-1331; Xiaら，前述）、タンパク質ｃ−ｍｙｃの発現増大が、Ｓ期の開始と維持において重要な因子である（Eisenman RNとCooper JA，Nature 378: 438-439，1995）という証拠により、アポトーシスの分子的機序に関連して重要であった。アウリントリカルボン酸（aurintricarboxylic acid）（ＡＴＡ）薬剤は、エンドヌクレアーゼおよびアポトーシスのインヒビターとして重要である。図３７Ａは、ｐ３４^cdc2のリン酸化に及ぼすＳＴＳＰおよび±ＡＴＡの作用を示す免疫ブロットである。図３７Ｂは、ＳＴＳＰが、ヒストンタンパク質（Ｈ１）をリン酸化する能力により示されるｃｄｃ２の機能的活性化を誘導したことを示す免疫ブロットである。図３７Ｃは、ｃ−ｍｙｃ発現に及ぼすＳＴＳＰおよび±ＡＴＡの作用を示す免疫ブロットである。図３８は、ＭＡＰキナーゼに及ぼすＳＴＳＰおよび±ｄＴｈｄの作用を示す免疫ブロットである。結果より、ＣＤＣ₂のリン酸化が、ＳＴＳＰ±ｄＴｈｄにより阻害されたが、ｄＴｈｄ単独には阻害されず、そしてＳ期で通常上昇するｃ−ｍｙｃのレベルが、減少したことが判明した。さらに、ｄＴｈｄとＳＴＳＰの相乗的組合せが、顕著に増大したＪｕｎＫおよび低下したＥｒｋ−２ＭＡＰキナーゼ活性に関係していた。このことは、細胞周期制御機序への関連において意味深い。表の説明表１ＡおよびＢ：証明されたかまたは潜在的なＲＡ^*の機能的分類および例。表２：証明されたかまたは潜在的なＴＣＩ^*の機能的分類および例。表３Ａ−Ｐ：実施例８表形式からのＭＩＳ−ＭＴＴ複合結果の計算のための、我々が使用した関係式。表４：実施例８例えばｄＴｈｄとＳＴＳＰについてのＭＴＴデータを組み合わせた結果の比（３つのプレートの％細胞毒性をこの実施例について平均した）。表５：実施例９例えばｄＴｈｄとＳＴＳＰについてのＬＤＨデータを組み合わせた結果の比（３つのプレートの％細胞毒性をこの実施例について平均した）。表６：実施例１０洗浄の４８時間後のＳＴＳＰ細胞傷害のｄＴｈｄ増強を示すＭＴＴデータを組み合わせた結果の比。表７：実施例１１ＳＴＳＰ細胞傷害のｄＴｈｄ増強のスケジュール試験を示すＭＴＴデータを組み合わせた結果の比。表９：ＢｒｄＵとＳＴＳＰに関するＭＴＴデータを組み合わせた結果の比。表１０：ｄＡｄｅとＳＴＳＰに関するＭＴＴデータを組み合わせた結果の比。表１１：ｄＧｕｏとＳＴＳＰに関するＭＴＴデータを組み合わせた結果の比。表１２：ＨＵとＳＴＳＰに関するＭＴＴデータを組み合わせた結果の比。表１３：ＭＴＸとＳＴＳＰに関するＭＴＴデータを組み合わせた結果の比。表１４：フロクスウリジン（floxuridine）（ｆｌｏｘ）とＳＴＳＰに関するＭＴＴデータを組み合わせた結果の比。表１５：ＡｐｈとＳＴＳＰに関するＭＴＴデータを組み合わせた結果の比。表１６：ａｒａ−ＣとＳＴＳＰに関するＭＴＴデータを組み合わせた結果の比。表１７：ＳＴＳＰとブレオマイシンに関するＭＴＴデータを組み合わせた結果の比。表１８：ＳＴＳＰとマイトマイシンＣに関するＭＴＴデータを組み合わせた結果の比。表１９：ＳＴＳＰとシスプラチンに関するＭＴＴデータを組み合わせた結果の比。表２０：ＳＴＳＰとダウノルビシンに関するＭＴＴデータを組み合わせた結果の比。表２１：ＳＴＳＰとエトポシド（etoposide）に関するＭＴＴデータを組み合わせた結果の比。表２２：ｄＴｈｄとＫ２５２ａに関するＭＴＴデータを組み合わせた結果の比。表２３：ｄＴｈｄとＫＴ５９２６に関するＭＴＴデータを組み合わせた結果の比。表２４：ｄＴｈｄとＫＴ５７２０に関するＭＴＴデータを組み合わせた結果の比。表２５：ｄＴｈｄとＡｐｈに関するＭＴＴデータを組み合わせた結果の比。表２６：ｄＴｈｄとａｒａ−Ｃに関するＭＴＴデータを組み合わせた結果の比。表２７：ＨＵとＫ２５２Ａに関するＭＴＴデータを組み合わせた結果の比。表２８：ＨＵとＡｐｈに関するＭＴＴデータを組み合わせた結果の比。表２９：ｄＴｈｄとシスプラチンに関するＭＴＴデータを組み合わせた結果の比。表３０：ＨＵとシスプラチンに関するＭＴＴデータを組み合わせた結果の比。表３１：ＡｐｈとＫ２５２ａに関するＭＴＴデータを組み合わせた結果の比。表３２：エトポシドとダウノルビシンに関するＭＴＴデータを組み合わせた結果の比。表３３：Ｕ９３７細胞における相乗的一致に関するデータの要約。表３４：Ｕ９３７細胞を接種した無胸腺ヌードマウスにおける腫瘍形成。表３５：化学療法において以前に報告された血中レベルに特定のＲＡのＳ_MA _X を関連付ける例表３６：ＳＴＳＰまたは他のＴＣＩの作用を増強するためにｄＴｈｄまたは他のＲＡにより有効に処理したヒト悪性細胞株の特徴。表３７：ＳＴＳＰとの相乗的一致におけるＩＣ₄₀とＳ_MAXの細胞依存性に関する証拠。表３８：ＨＬ−６０細胞におけるｄＴｈｄとＳＴＳＰに関するＭＴＴデータを組み合わせた結果の比。表３９： Jurkat細胞におけるｄＴｈｄとＳＴＳＰに関するＭＴＴデータを組み合わせた結果の比。表４０： Daudi細胞におけるＡｐｈとＳＴＳＰに関するＭＴＴデータを組み合わせた結果の比。表４１：Ｃ３３Ａ細胞におけるＡｐｈとＳＴＳＰに関するＭＴＴデータを組み合わせた結果の比。表４２： Raji細胞におけるＨＵとＳＴＳＰに関するＭＴＴデータを組み合わせた結果の比。＠Ｓ_MAXの範囲は、記載した関連する実施例で確認したものである。＃イヌとヒトの総血液量に基づく最大血漿レベルの推定＠アメリカンタイプカルチャーコレクション(Rockville，MD 20852)のカタログの識別番号

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 31/71 ＡＧＡＡ６１Ｋ 31/71 ＡＧＡ 33/24 33/24 // Ｃ０７Ｄ 475/08 Ｃ０７Ｄ 475/08 Ｃ０７Ｈ 15/26 Ｃ０７Ｈ 15/26 19/073 19/073 19/09 19/09 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）細胞周期を通して標的細胞の進行を遅延させるのに充分であるが停止させない濃度および条件下で、制御薬剤を傷害すべき標的細胞集団に投与し、そして（ｂ）制御薬剤の適用と同時またはその後に標的細胞毒性物質を適用する、ことからなる、細胞傷害の増強方法。２．制御薬剤がリボヌクレオチド還元酵素インヒビターである、請求の範囲第１項記載の方法。３．制御薬剤はＢｒｄＵであり、標的細胞毒性物質がスタウロスポリン、Ｋ２５２Ａ、ＫＴ５７２０、およびＫＴ５９２６よりなる群から選択される、請求の範囲第２項記載の方法。４．制御薬剤がｄＴｈｄであり、標的細胞毒性物質がスタウロスポリン、Ｋ２５２Ａ、ＫＴ５７２０、およびＫＴ５９２６よりなる群から選択される、請求の範囲第２項記載の方法。５．制御薬剤がＨＵであり、標的細胞毒性物質がスタウロスポリン、Ｋ２５２Ａ、ＫＴ５７２０、およびＫＴ５９２６よりなる群から選択される、請求の範囲第２項記載の方法。６．制御薬剤がＤＮＡポリメラーゼインヒビターである、請求の範囲第１項記載の方法。７．ＤＮＡポリメラーゼインヒビターがアフィジコリンである、請求の範囲第６項記載の方法。８．制御薬剤がチミジル酸シンターゼインヒビターである、請求の範囲第１項記載の方法。９．制御薬剤がフッ化ウラシルであり、標的細胞毒性物質がインドールカルバゾールである、請求の範囲第８項記載の方法。１０．制御薬剤がＧ₁／Ｓ移行において細胞周期を減速させる、請求の範囲第１項記載の方法。１１．制御薬剤がジヒドロ葉酸還元酵素インヒビターである、請求の範囲第１項記載の方法。１２．制御薬剤がメトトレキセートであり、標的細胞毒性物質がスタウロスポリン、Ｋ２５２Ａ、ＫＴ５７２０、およびＫＴ５９２６よりなる群から選択されるインドールカルバゾールである、請求の範囲第１１項記載の方法。１３．制御薬剤がＳ期において細胞周期を減速させる、請求の範囲第１項記載の方法。１４．制御薬剤がＳからＧ₂への移行において細胞周期を減速させる、請求の範囲第１項記載の方法。１５．標的細胞毒性物質がインドールカルバゾールである、請求の範囲第１項記載の方法。１６．制御薬剤がインドールカルバゾールであり、標的細胞毒性物質がブレオマイシンである、請求の範囲第１項記載の方法。１７．ガン患者の治療法であって、（ａ）細胞周期を通して標的ガン細胞の進行を遅延させるのに充分であるが停止させない濃度および条件下で、制御薬剤を患者に送達し、そして（ｂ）制御薬剤の適用と同時またはその後に標的ガン細胞を傷害するのに充分な条件下で、標的細胞毒性物質を送達する、ことからなる上記方法。１８．ガン患者の治療法であって、（ａ）患者にとって最適の制御薬剤と標的細胞毒性物質を決定し、（ｂ）患者にとって最適の制御薬剤と標的細胞毒性物質の濃度を決定し、（ｃ）患者に最適濃度で制御薬剤を送達し、そして（ｄ）患者に最適濃度で標的細胞毒性物質を送達する、ことからなる上記方法。１９．ガン患者の治療法であって、（ａ）高濃度で標的細胞毒性物質として作用することができ低濃度で制御薬剤として作用することができる第１の薬剤を、標的ガン細胞を傷害するのに充分な条件下で患者に送達し、（ｂ）第１の薬剤の濃度を、第１の薬剤が制御薬剤として作用するレベルまで低下させ、そして（ｃ）第１の薬剤の濃度が、細胞周期を通して標的細胞の進行を遅延させるのに充分であるが停止させないレベルである時、第２の薬剤を標的ガン細胞を傷害するのに充分な条件下で送達する、ことからなる上記方法。２０．第１の薬剤が放射エネルギーである、請求の範囲第１７、１８または１９項に記載の方法。２１．第２の薬剤が放射エネルギーである、請求の範囲第１７、１８または１９項に記載の方法。２２．感染症患者の治療法であって、（ａ）細胞周期を通して標的感染細胞の進行を遅延させるのに充分であるが停止させない濃度および条件下で、制御薬剤を患者に送達し、そして（ｂ）制御薬剤の適用と同時またはその後に標的感染細胞を傷害するのに充分な条件下で、標的細胞毒性物質を送達する、ことからなる上記方法。２３．感染症患者の治療法であって、（ａ）患者にとって最適の制御薬剤と標的細胞毒性物質を決定し、（ｂ）患者にとって最適の制御薬剤と標的細胞毒性物質の濃度を決定し、（ｃ）患者に最適濃度で制御薬剤を送達し、そして（ｄ）患者に最適濃度で標的細胞毒性物質を送達する、ことからなる上記方法。２４．感染症患者の治療法であって、（ａ）高濃度で標的細胞毒性物質として作用することができ低濃度で制御薬剤として作用することができる第１の薬剤を、標的感染細胞を傷害するのに充分な条件下で患者に送達し、（ｂ）第１の薬剤の濃度を、第１の薬剤が制御薬剤として作用するレベルまで低下させ、そして（ｃ）第１の薬剤の濃度が、細胞周期を通して標的細胞の進行を遅延させるのに充分であるが停止させないレベルである時、第２の薬剤を標的感染細胞を傷害するのに充分な条件下で送達する、ことからなる上記方法。２５．２つの薬剤の間の相乗作用または拮抗作用の決定方法であって、（ａ）二変数の希釈率の２つの薬剤を含有する複数の試験ウェルから、および薬剤を含有しない少なくとも１つの対照ウェルから、および２つの薬剤の各々の１つのみを含有する少なくとも２つの対照ウェルから、のインプットデータをスプレッドシートデータベースに受け取り（ここで、該データは増殖阻害パーセントの定量値である）、（ｂ）試験ウェル中の増殖阻害パーセントを、対照ウェルからのデータから数学的に得られる推測増殖阻害パーセントと比較して、あらかじめ決められた関係に従ってスプレッドシートを処理して、そして（ｃ）複数の試験ウェルからのデータと推測データの間の差をグラフで示す、ことからなる、データプロセッサーにより行われる上記方法。２６．データベースインプットデータが細胞毒性である、請求の範囲第２５項に記載の方法。２７．２つの薬剤の間の相乗作用または拮抗作用の決定するためのデータ処理システムであって、（ａ）二変数の希釈率の２つの薬剤を含有する複数の試験ウェルから、および薬剤を含有しない少なくとも１つの対照ウェルから、および２つの薬剤の各々の１つのみを含有する少なくとも２つの対照ウェルから、のインプットデータをスプレッドシートデータベースに受け取る手段（ここで、該データは増殖阻害パーセントの定量値である）、（ｂ）試験ウェル中の増殖阻害パーセントを、対照ウェルからのデータから数学的に得られる推測増殖阻害パーセントと比較して、あらかじめ決められた関係に従ってスプレッドシートを処理するための、該受け取り手段と結合した手段、そして（ｃ）複数の試験ウェルからのデータと推測データの間の差をグラフで示す、該処理手段と結合した手段からなる、上記システム。２８．データベースインプットデータが細胞毒性である、請求の範囲第２７項に記載の方法。２９．（ａ）データプロセッサーが、二変数の希釈率の２つの薬剤を含有する複数の試験ウェルから、および薬剤を含有しない少なくとも１つの対照ウェルから、および２つの薬剤の各々の１つのみを含有する少なくとも２つの対照ウェルからのインプットデータをスプレッドシートデータベースに受け取るようにする手段（ここで、該データは増殖阻害パーセントの定量値である）、（ｂ）データプロセッサーが、試験ウェル中の増殖阻害パーセントを、対照ウェルからのデータから数学的に得られる推測増殖阻害パーセントと比較して、あらかじめ決められた関係に従ってスプレッドシートを処理するようにするための、該受け取り手段と結合した手段、そして（ｃ）データプロセッサーが、複数の試験ウェルからのデータと推測データの間の差をグラフで示すようにする、該処理手段と結合した手段からなる、製造物品。３０．データベースインプットデータが細胞毒性である、請求の範囲第２９項に記載製造物品。