JPH11510375A

JPH11510375A - ペプチド−ｍｈｃ複合体を指向するファージディスプレイライブラリーからの組換え抗体

Info

Publication number: JPH11510375A
Application number: JP9504728A
Authority: JP
Inventors: ピーターセジェールアンデルセン; ショレンブウス; ジャンエングバーグ; ラーズフガー; アネッテストリーン
Original assignee: コベンハブンズユニバーサイテッド
Priority date: 1995-06-30
Filing date: 1996-07-01
Publication date: 1999-09-14
Also published as: WO1997002342A1; AU6353596A; EP0835306A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ペプチド-MHC複合体を特異的に認識する抗体または抗体断片を生産する方法に関する。また、医薬品またはスーパー抗原と結合させた本発明に係る抗体および抗体断片にも関する。さらに、本発明は、感染症および自己免疫疾患および癌を予防または治療するための、本発明に係る抗体または抗体断片を含む薬学的組成物、ならびに該疾患の診断のための組成物にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】ペプチド-MHC複合体を指向するファージディスプレイライブラリーからの組換え抗体発明の分野 T細胞受容体によるペプチド-MHC複合体の特異的認識は、特異的免疫応答における重要な反応である。したがって、ペプチド-MHC複合体に対する抗体は、MHC の機能およびT細胞による認識を研究するための有用なツールとなると考えられ、診断および免疫療法における新規な手法につながる可能性がある。しかし、従来のハイブリドーマ技術によってT細胞の特異性を有する抗体または抗体の断片を作製することは困難であることが判明している。本発明は、抗原特異的でかつ T細胞が有するMHCによって制限された特異性を有する組換え抗体および抗体の断片に関する。発明の背景 T細胞およびB細胞は、特異的免疫系における2つの基本的に異なる認識モードを代表する。交代性の選択過程を通じて、T細胞は、抗原提示細胞の表面に存在する自己分子である主要組織適合性遺伝子複合体（MHC）とともに提示された抗原ペプチドを認識する能力を獲得する。これに対して、B細胞は自己のMHCに制限されるようにはならず、B細胞受容体（抗体）は、可溶性であるか膜に結合した形態であるかにかかわらず、標的構造の3次元構造を認識する。 B細胞およびT細胞の能力獲得の様式が明らかに異なることは、T細胞が有するM HCに制限された特異性を有する抗体が生じることが稀であり、従来のB細胞ハイブリドーマ技術を用いてこのような抗体を作製することが困難であった理由の説明となる。従来の手段によって自己のMHCに制限される抗体を作製したとの報告はわずかに散発的にみられるのみであり（Wylieら、1982；van Leeuwenら、1979 ；Froscherら、1986）、他の報告者は自らの試みが失敗したことを報告している（Tamminenら、1987；Rubinら、1989）。さらに最近では2、3種の抗ペプチド-MH C抗体が報告されている（Murphyら、1989；Ducら、1993；Aharoniら、1991）。これまでの難点の分子的基盤は、最近解明されたペプチド-MHCクラスI複合体の構造に示されているように思われる（Fremontら、1992；Maddenら、1993；Young ら、1994 ）。ペプチドはMHCの内部に深く埋め込まれており、ペプチド残基の伸長部は自己のMHC残基と混ざり合ったモザイクとして提示されている（前記参考文献）。驚くべきことに、MHCクラスIと結合したペプチドも100〜300Å²以下であるが外表に面しており、このため直接的な認識に用いることができる（Fremontら、199 2；Youngら、1994）。自己のMHCは、T細胞に対して提示されるペプチド-MHC複合体の表面の大半を占めると考えられている（Fremontら、1992；Davisら、1988）。蛋白質分子を認識する抗体はそのリガンドの約800Å²と結合するため（Davis ら、1990に総説がある）、ペプチド-MHC複合体の抗体認識も、自己のMHCによるものが大部分に占める必要がある。さらに、抗体は自己のMHCに制限されるという理由で選択されることはなく、むしろこのような抗体の特異性が除去またはサイレンス化されること（Nemazeeら、1989）は、ペプチド-MHC複合体に特異的な抗体の作製が困難である理由の説明となる。T細胞は自己のMHCが大部分を占めるリガンドを認識するという同じ問題に直面しており、T細胞に能力を獲得させるために全身の臓器が提供されている。陽性選択および陰性選択の過程によって成熟中の胸腺細胞の大多数は除去され、非自己反応性であるが自己のMHCによって制限された成熟T細胞として循環系に流入するものはそのきわめて一部である（v o Boehmerら、1989）。稀な抗体の特異性の単離という問題に直面した場合、ファージディスプレイ技術の選択能力の高さ（McCaffertyら、1990；Clacksonら、1991；Barbas IIIら、 1991；WinterおよびMilstein、1991における総説、Winterら、1994）は、特に有用である。本技術は、免疫化手順を介して所望の特異性を豊富に有するライブラリー、または極めて大きな多様性およびサイズを有するため、考えられるあらゆるエピトープに対する抗体特異性を有すると考えられるライブラリーのいずれかを用いる（Griffithsら、1994）。選択した免疫化プロトコルが作動したか否かを決定するためには、初期の免疫反応ではμMの範囲の親和性を有する生殖系列の可変遺伝子から産生された抗体が大部分を占め、続いて体細胞過剰変異の増加によってnMの範囲の親和性がもたらされることに注意することが重要である（Fo oteおよびMilstein、1991）。同様に、免疫化に基づくライブラリーから単離されたファージディスプレイ抗体断片の親和性は、一般に自然のままの非免疫化ライブラリーから単離されたものの親和性よりも高い（Marksら、1991；Byeら、1992；Ho ogenboomおよびWinter、1992）。国際公開広報第95/15982号は、ファージディスプレイ技術を用いて、免疫学的に劣性のエピトープ（immunorecessive epitope ）に対して特異的な抗体を作製するための方法に関する。国際公開広報第91/12332号（Kourilskyら）において、病原因子性抗原または細胞障害に特徴的なペプチドと主要組織適合遺伝子複合体（MHC）分子とを含む複合体を特異的に認識する能力を特徴とする制限されたモノクローナル抗体であって、上記のペプチドと非ペプチド特異的ハプロタイプMHC分子とが結合したものを認識する能力を持たないことによって制限される抗体について開示されている。 DE 42 24 542 A1（Hammerling）において、(a)主要組織適合クラスI分子の単離、(b)遺伝子を発現させるための、主要組織適合分子をコードする遺伝子のマウスゲノムへの挿入、(c)主要組織適合クラスI分子のペプチドとの結合、(d)結合された分子による形質転換されたマウスの免疫化、(e)免疫化されたマウスからの脾細胞の単離、および(f)従来の手段によってペプチドを結合させた主要組織適合遺伝子複合体クラスI分子に対するモノクローナル抗体の産生を含む、ペプチド抗原を結合した主要組織適合遺伝子複合体クラスI分子を指向するモノクローナル抗体が産生される可能性のある方法が概説されている。国際公開広報第91/12332号およびDE 42 24 542 A1はいずれも、組換え手段によって制限された抗体を生産することができると考察しているが、その開示内容は推論によるもので漠然としており、当業者がこのような抗体を生産することを可能にするものではない。発明の概要本発明は、ファージディスプレイ技術の使用によって、特定のあらかじめ決定されたペプチド-MHC複合体を認識する抗体および抗体の断片を作製するための方法を提供する。本技術の速度および実現性は、MHCによって制限されたT細胞認識の研究に有用とである考えられ、診断および免疫療法における新規な手法につながる種々の特異的ペプチド-MHC複合体に対する抗体および抗体の断片の生産を現実的なものとする。さらに本発明は、抗原特異的でMHCによって制限された組換え抗体それ自体も含む。発明の詳細な説明本発明の1つの重要な局面は、ファージディスプレイ技術の高い選択能力を利用することによって、あらかじめ決定されたペプチド-MHC複合体を認識する組換え抗体または抗体断片を作製するための方法である。その最も広範な局面において、本発明は、ペプチド-MHC複合体を特異的に認識する抗体または抗体断片を生産する方法であって、 (a) 抗体または抗体断片をコードする少なくとも1つの核酸断片が発現するファージライブラリーの提供、 (b) ペプチド-MHC複合体を特異的に認識する抗体または抗体断片を産生し、上記の発現する少なくとも1つの核酸断片によってコードされる、少なくとも1つのファージの選択、および (c) 該ファージの上記の抗体または抗体断片をコードする少なくとも1つの核酸断片の細胞への導入、および該細胞による発現産物としての、上記のペプチド-M HC複合体を特異的に認識する上記の抗体または抗体断片を産生させることを含む方法に関する。「核酸」という語は、DNAまたはRNAのいずれかとして生じ、1本鎖または2本鎖のいずれかであってもよい、高分子量のポリヌクレオチドを意味する。核酸断片は、「テラファージ（teraphage）」ライブラリー、または以下に詳述する方法で免疫化した動物からの抗体ライブラリーのいずれかによって入手することができる。テラファージライブラリーとは、非常に多くのヒト抗体遺伝子断片を含み、このために目的の抗体または抗体断片をコードする遺伝子断片が存在する可能性が高いと考えられるライブラリーを意味する。このような非常に大規模なライブラリーの例は、例えばウォーターハウス（Waterhouse，P.G.）ら、1993、グリフィス（Griffiths，A.）ら、1994などに記載されている。本手法は、患者の体内に存在するMHC-ペプチド複合体に特異的に反応する1種またはそれ以上の抗体を有する個々の患者に対する治療を実施する予定である場合には、妥当な期間内に上記の個体に特有と考えられるあらかじめ選択されたMHC-ペプチド複合体を指向する特異的な抗体を作製することができるため、非常に有用である。ペプチド-MHC複合体を特異的に認識する抗体または抗体断片を産生する方法の、現時点での好ましい態様には以下の段階が含まれる： (a) ペプチド-MHC複合体によって免疫化された動物からのRNAを単離する段階、 (b) 段階(a)において単離されたRNAを、抗体または抗体断片をコードする核酸が増幅される反応における開始材料として使用することによる、抗体または抗体断片をコードする少なくとも1つの核酸断片の増幅、および上記の核酸断片を発現するファージライブラリーを作製する段階、 (c) ペプチド-MHC複合体を特異的に認識し、上記の増幅された少なくとも1つの核酸断片によってコードされる抗体または抗体断片を産生する少なくとも1つのファージを選択する段階、ならびに (d) 該ファージの上記の抗体または抗体断片をコードしている少なくとも1つの核酸断片の細胞への導入、および上記の細胞による発現産物としての、上記のペプチド-MHC複合体を特異的に認識する上記の抗体または抗体断片を産生させる段階。本手法は、実施例においてFab断片に関して詳細に記載する。本出願書において詳細に記載したpSAN13.4.1が、遺伝子数は約10⁷種と比較的小さなサイズであるがnMの範囲の親和性を有する非常に選択的なライブラリーから単離されたという事実は、免疫化のために用いたマウスが、高親和性抗体を産生することによってHa_255-262-K^k複合体と実際に反応したことを強く示している。したがって、選択された免疫化プロトコールは、Fab14.3.1の産生に重要な因子である可能性が非常に高い。当業者は、実施例に概説された手法と同様の手法、またはウォーターハウス（ Waterhouse，G.P.）らによって記載されたテラファージ技術の使用によるその変法を、その他の抗体断片または抗体全体に関して使用することができることは明白である。ファージディスプレイ技術の使用が好ましいが、単鎖Fv抗体断片提示などの代替的な方法をプラスミド（Cullら、1992）または細胞（Franciscoら、1 993）に対して使用することによって組換えペプチド-MHC特異的抗体を調製することもできると考えられる。本明細書および請求の範囲において、抗体は、特定の抗原に対する結合特異性を示す糖蛋白質である。抗体は一般に分子量約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖蛋白質であり、２本の同一な軽（L）鎖および2本の同一な重（H）鎖からなる。それぞれの軽鎖は単一の共有性ジスルフィド結合によって1本の重鎖と結合するが、重鎖間のジスルフィド結合の数は免疫グロブリンのアイソタイプによってさまざまに異なる。また、それぞれの重鎖および軽鎖は、規則的に配置した同一鎖内のジスルフィド架橋も有する。それぞれの重鎖は一方の端に可変領域（V_H）を有し、それに続いて長い定常領域が存在する。それぞれの軽鎖は一方の端に可変領域（V_L）を有し、もう一方の端に定常領域が存在する。この軽鎖の定常領域は重鎖の第1の定常領域と一直線に並んでおり、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域と一直線に並んでいる。軽鎖および重鎖の可変領域の間には特定のアミノ酸残基が連結部を形成すると考えられている。「可変」という語は、可変領域の特定の部分の配列が抗体間で大きく異なることを意味し、それぞれの特定の抗体とその特定の抗原との結合および特異性に関して用いられる。可変性は、軽鎖および重鎖の可変領域の双方に存在する相補性決定領域（CDR）または超可変領域と呼ばれる3つの区域に集中して認められる。可変領域の中で保存性が比較的高い部分はフレームワーク（FR）と呼ばれる。それぞれの鎖において、個々のCDRはFR領域を介して互いに近接して存在し、その他の鎖のCDRとともに抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabatら、1987を参照）。定常領域は抗体の抗原との結合に直接的には関与しないが、抗体依存的細胞毒性における抗体の関与など、さまざまなエフェクター機能を示す。抗体にパパイン消化を施すと、それぞれが単一の抗原結合部位を有する「Fab 」断片と呼ばれる2つの同一な抗原結合性断片、および残渣物として、容易に結晶化する能力を有することから命名された「Fc」断片が得られる。また、ペプシン処理を行った場合には、2つの抗原結合部位を有し、抗原との架橋能力を保持しているF(ab')₂断片が得られる。「Fv」は、完全な抗原認識および結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、重鎖および軽鎖の可変領域1つずつが非共有結合によって強固に会合した二量体からなる。それぞれの可変領域の3つのCDRが相互作用してV_H-V_L二量体の表面に存在する抗原結合部位を規定するのはまさにこの立体配置による。以上の6つのCDRが集合することにより、抗原に対する結合特異性が抗体に付与される。しかし、単一の可変領域（または抗原に特異的な3つのCDR しか含まない、Fvの半分）すなわちscFvも、結合部位全体と比べると親和性は低いものの、抗原を認識し、それと結合する能力を有する。Fab断片も、軽鎖の定常領域および重鎖の第1の定常領域（CH1）を含む。Fab'断片は、重鎖CH1ドメインのカルボキシ端に、抗体ヒンジ領域に由来する1個またはそれ以上のシステイン残基を含む、若干数の残基が付加されている点がFab断片と異なる。F(ab')₂抗体断片は当初、その中間部にヒンジ領域のシステインを有するFab'断片の対として生じた。あらゆる脊椎動物種からの抗体の「軽鎖」は、その定常領域のアミノ酸配列に基づいてカッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる2つの明確に異なる種類のいずれか1つに当てはめることができる。抗体は、その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて異なる分類のいずれかに当てはめることができ、これにはIgA、I gD、IgE、IgGおよびIgMの５つの主要なクラスがある。これらのいくつかは、IgG -1、IgG-2、IgG-3およびIgG-4、IgA-1およびIgA-2などのサブクラス（アイソタイプ）にさらに細分化される。「抗体および抗体断片」という語は、本明細書および請求の範囲では最も広範な意味に用いられ、単一のモノクローナル抗体、およびそれらがペプチド-MHC複合体を特異的に認識する限りにおいて、そのような抗体の断片（例えば、Fab、F ab'、F(ab')₂、FvおよびscFv）を特にカバーする。したがって、本発明は、抗体断片がFab、Fab'、F(ab')₂、Fv、scFvおよび抗体のその他の抗原結合性配列からなる群より選択される、本発明に係る方法に関する。また、IgMまたはIgG複合体などの本発明の抗体もしくは抗体の断片の複合体も、本発明の範囲に含まれる。本明細書で用いる「モノクローナル抗体」という語は、実質的に均質な抗体の集団、すなわち、自然に生じる可能性のある変異体がわずかな量だけ存在しうることを除けば、集団を構成する個々の抗体が同一であるような集団から入手した抗体を意味する。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原部位を指向する。さらに、それぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を指向する。本明細書におけるモノクローナル抗体は、特に、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体、または特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一もしくは相同であり、鎖の残りの部分が、もう1つの種に由来する抗体、またはもう1つの抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体、ないしは所望の生物学的活性を発揮する範囲にあるそのような抗体の断片における対応する配列と同一もしくは相同である「キメラ型」抗体を含む。「ヒト化」形式の非ヒト（例えばマウス）抗体とは、非ヒト抗体に由来する最小配列を含むキメラ型抗体またはその断片（Fv、Fab、Fab'、F(ab')₂、またはsc Fvなどの、抗体のその他の抗原結合配列）である。大部分において、ヒト化抗体は、受容者の相補性決定領域（CDR）の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種のCDRからの残基（提供者抗体）によって置換されたヒト抗体（受容者抗体）である。場合によっては、ヒト抗体のFvフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、受容者抗体および導入されたCDRもしくはフレームワーク配列のいずれにも認められない残基を含んでもよい。このような改変は、抗体の性能をさらに改良したり最適化したりするために加えられる。一般に、ヒト化抗体は、そのCDR領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト抗体のCDR領域に対応し、そのFR領域のすべてもしくは実質的にすべてがヒト抗体のコンセンサス配列のFR領域であるような、少なくとも1つ、典型的には2つの可変領域の実質的にすべてを含む。最適には、ヒト化抗体は、抗体の定常領域（Fc）の少なくとも1 つの部分も含む。これ以上の詳細については、ウィンター（Winter）およびミルスタイン（Milstein）、1991、またはマウスモノクローナル抗体L243によって認識されるエピトープに対する特異性を有するヒト化抗体およびその生産方法を記載した国際公開公報第94／29451号を参照されたい。ペプチド-MHC複合体を特異的に認識する抗体または抗体の断片を本発明の方法によって生産した場合、当業者は、例えば、本発明の方法によって調整される抗原結合配列、および例えばヒト抗体のコンセンサス配列などのFR領域のほかに、必要に応じて抗体の定常領域の少なくとも一部を含む「ヒト化」抗体などの、上記の抗体または抗体断片の適切な類似体を調製することができると考えられる。上記の「ヒト化」抗体の生産技術に関する概要から明らかなように、変更の可能性は多数存在しており、当業者は特定の抗体の目的に応じた適切な選択を行うことができると思われる。ヒト主要組織適合遺伝子複合体（MHC）は、ヒト白血球抗原（HLA）系とも命名され、子孫で発現される父親の移植抗原を同定する母親の抗血清を用いて最初に特徴が調べられた。HLAタイピングは、当初は臓器および組織の移植、特に腎移植を容易にするために開発された。対立遺伝子として、HLAクラスI対立遺伝子およびHLAクラスII対立遺伝子の2種類が発見されている。最も高い頻度で発現する HLA遺伝子は、ゲノムにおいて最も多型性の高い遺伝子座の1つであり、多型はペプチド結合部位に集中している。検出されている15種のクラスI遺伝子のうち、いわゆる古典的HLAクラスI遺伝子の中核を構成するものは、HLA-A、HLA-BおよびHLA-C座の3種のみである。以上の遺伝子は多型性が高く、事実上すべての有核細胞で発現し、少なくともHLA-A およびHLA-Bについては、細胞内抗原に対するT細胞の反応を制限することが知られている。現在、HLA-A、-Bおよび-C遺伝子については、全体で125種の対立遺伝子が、WHOの命名委貢会（Nomenclature Committee）によってHLA系因子として公式に認められている。 β₂ミクログロブリンと会合し、細胞表面に輸送されてそこで発現するためには、HLAクラスI分子はその特異的なHLA対立形質と結合するペプチドの存在を必要とする。このペプチドは、抗原プロセッシングと呼ばれる過程によって提供される。これまで調べられたペプチドはすべて、単一のアミノ酸または密接に関連した側鎖を有する2、3のアミノ酸のみが検出されている「アンカー部位」を少なくとも2つ含む。このようなアンカーの1つは常にC端末部位に存在する。自然環境では、このペプチドの長さは一般に8〜10残基である（Madden，D.R.、1995）。 HLAクラスII分子は、クラスI分子と構造的に強く関連している。この関連性には、ドメイン構成が含まれ、おそらく抗原結合部位も含まれると考えられる。クラスII分子は、免疫応答の調節に働く特定の細胞種、中でもB細胞、活性化T細胞、樹状細胞および骨髄単球性系列の細胞（マクロファージ）の間の相互作用に主に関与する。クラスII蛋白質は、DR、DQ、およびDPと呼ばれる3種のアイソタイプに区分されている。DRとDQとの間には強い連鎖非平衡が存在し、HLA-B遺伝子との間にもこれがしばしば認められるため、任意の民族的由来を有するある個体における特定のDR対立形質は、DR/DQ/B対立形質の全体としてのセットを示すことが少なくない。「DRハプロタイプ」という語は、この典型的なクラスII（および時にクラスI）対立形質のセットを表現するために用いられる。クラスII分子と結合した状態で認められるペプチドの性状に関する洞察を与える初期のデータから、クラスI分子と結合する例えば13〜17アミノ酸のペプチドと比べて、そのようなペプチドはより長く、制限されていない傾向にあることが示唆される（Madd en、D.R.、1995）。本明細書および請求の範囲において、「ペプチド」という語は、長さが少なくとも2アミノ酸残基で最大では10アミノ酸残基である短いペプチド、およびオリゴペプチド（11〜100アミノ酸残基）をいずれも含むほか、蛋白質（少なくとも１つのペプチド、オリゴペプチド、またはポリペプチドを含む機能的実体であり、グリコシル化もしくは被脂質化、または補欠分子団を含むという化学修飾を受けたものでもよい）も含む。ペプチドの定義には、ヒトを含む動物の体内に存在する自然のままの形態のペプチド／蛋白質のほか、任意の種類の宿主に形質転換をもたらす任意の種類の発現ベクターに含まれる組換え蛋白質またはペプチド、および化学合成されたペプチドも含まれる。「MHC分子」という語は、上記の説明の通りである。「ペプチド-MHC複合体」という語は、特定のMHC分子と結合する能力を有し、それによって特定のペプチド-MHC複合体を形作る能力を有するペプチドを意味する。上記の内容から、問題となる抗体の作製または選択のために用いられる特定のペプチドおよびMHC分子に関して適切な変更を加えることにより、本発明の方法によって、多数の異なる抗体を生産することができることは明らかである。「ペプチド-MHC複合体を特異的に認識する」という語は、平衡解離定数K_Dが10^-7 〜10^-10Mの範囲で、抗体がペプチド-MHC複合体と結合する能力を有することを意味する。本発明の方法によって産生される抗体またはその断片の平衡解離定数 K_Dは例えば表面プラスモン共鳴の使用によってpSAN13.4.1の速度論的結合分析を詳細に記載した実施例3において概説した方法などの、当業者によって選択される任意の適切な方法によって決定することができる。本発明の方法における重要な段階は、ペプチド-MHC複合体を特異的に認識する抗体または抗体断片を発現しているファージを選択することである。現在の好ましい態様において、この選択は、ペプチド-MHC複合体を発現している細胞を、ファージライブラリーとともにインキュベートすること、および／またはファージライブラリーをペプチド-MHC複合体を結合させたビーズとともにインキュベートすることによって実施される。さらに一般的な意味では、この選択は、抗体または抗体断片を発現しているファージのライブラリーをペプチド-MHC複合体を共通因子として載せた交代性マトリックス上にパニング（panning）することによって実施される。好ましい態様において、この交代性マトリックスは、ペプチド-M HC複合体を発現している細胞、およびペプチド-MHC複合体を結合させたビーズである。または、イムノチューブ（NUNC）またはラテックスビーズなどの2つの異なるプラスチック表面を、選択したMHC／ペプチド複合体による被覆を施したマトリックスとして使用してもよい。さらに、パニングを1回実施するたびに、結合したファージを溶出して大腸菌などの細胞内で増幅させ、選択的には、上記のペプチドとの複合体を形成しているMHC分子を発現している細胞に対する結合をF ACSによって分析することが好適である。本手法が成功をもたらす1つの重要な理由は、極めて大規模な抗体ライブラリーを効率的および短時間内にスクリーニングすることを可能とする、組換え抗体作製のためのファージディスプレイ技術の選択能力にあると考えられる。さらに、1種の特定のペプチドを豊富に含む精製されたMHC分子を、免疫化および選択手順において用いた。本明細書の実施例に記載した手順を用いた場合には、選択されたMHC分子の約80％が所望のペプチドと結合する、すなわちMHC分子1モル当たり特異的ペプチド0.8モルが結合すると算出されている。この含量の高さは、免疫化およびその後のパニングの成功のためにも重要な因子と考えられ、このため、MHC分子の含量を例えば約90％、約95％、またはさらに約98％もしくは約99％、すなわち実質的に100％が特異的ペプチド-MHC結合体となるまでさらに高めることは好都合であると考えられる。テラファージ技術の使用によって免疫化の段階を回避する場合には、特定の1つのペプチドを豊富に含む精製されたMHC分子を用いることが、選択手順を成功に導く上ではるかに重要であると考えられる。しかし、所望のペプチドの含有量が例えば約20％、30％、50％、66％または75％と低いような選択されたMHC分子では有益な結果を得られないという可能性は低い。本発明の方法はさらに、所望のペプチド-MHC複合体を特異的に認識する抗体または抗体断片を生産するために、抗体または抗体断片をコードする核酸を適切な細胞に導入する段階を含む。この細胞は、大腸菌などの細菌をはじめとする微生物、酵母、原生動物、および真菌などの多細胞生物に由来する細胞、昆虫細胞、植物細胞、哺乳類細胞もしくは細胞系からなる群より選択される。または、組織特異的プロモーターの制御下において抗体断片を産生するトランスジェニック動物を作製するために、抗体のScFv断片をコードするDNAを胚幹細胞に導入することもできる（Logan、1993）。用いる生物体の種類にかかわらず、抗体または抗体の断片をコードする核酸を含むDNA断片は、直接または適したベクターを用いるかのいずれかの方法で生物体または細胞に導入される。続いて、所望の抗体または抗体の断片を産生する細胞を、ベクターおよび細胞に適した条件下における産生能のレベルに基づいて選択する。選択した細胞は、さらに増殖させることにより、所望の抗体または抗体断片の極めて重要で連続的な供給源となる。適切と考えられる場合には、抗体または抗体断片をコードするDNA断片をクローニングし、そのヌクレオチド配列を決定することができる。続いて、必要に応じて当業者は、例えばCDR領域における部位特異的突然変異誘発またはランダム変異誘発などの従来の技法を用いて、最初に決定されたヌクレオチド配列を有する抗体と同一の特異性を有するが、熱力学的特性（k_a、k_d、K_Dなど）が異なる、新規な抗体またはその断片をコードする核酸を調製することができる。このような新規な抗体の選択には、本質的には本来の抗体に関して概説したものと同じ選択手順を用いる必要がある。同様の様式で、選択手順に適宜修正を加えるならば、別のペプチド-MHC複合体に対する結合特異性を有する遺伝的に操作された抗体を調製することもできる。好ましい態様において、本発明は、上記の抗体断片をコードする核酸が、ブダペスト条約の規定に従って1995年6月28日に有限会社ドイツ微生物・細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH）（DSM）に寄託番号DSM10070として寄託されたプラスミドpSAN13.4.1によってコードされる方法に関する。したがって、本発明の1つの重要な態様は、宿主となる生物体または細胞系の内部で複製する能力を有する発現ベクター内に含まれた本発明の制限された抗体または抗体断片をコードする、DNA断片またはその類似体もしくはサブシークエンスに関する。このベクターは特に、プラスミド、ファージ、コスミド、ミニ染色体、またはウイルスでありうる。本発明の1つの興味深い態様において、このベクターは、宿主細胞に導入された際に、宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターであってもよい。もう1つの局面において、本発明は、本発明の方法によって調製されるペプチド-MHC複合体を特異的に認識する抗体または抗体断片に関する。特に、本発明は、ペプチド-MHC複合体を特異的に認識する、グリコシル化されていない抗体または抗体断片を包含する。このような抗体または抗体断片は、その抗体または抗体断片をコードするプラスミドが大腸菌内で発現した際に産生されるものでもよい。本発明の範囲に含まれるものに、抗生物質、細胞障害性製剤および抗悪性腫瘍製剤からなる群より選択される薬学的製剤などの薬学的製剤と結合させた、本発明に係る抗体または抗体断片がある。または、抗体または抗体断片を、Tリンパ球を活性化する能力を有する、細菌性スーパー抗原ブドウ球菌エンテロトキシン A（SEA）（Dohlstein M.ら、1994）などのスーパー抗原と結合させてもよい。抗体によって認識される細胞にスーパー抗原性を付与し、それによって、以下に詳細を記載した通りに腫瘍増殖または自己免疫性疾患を抑制するようにT細胞を誘発させることもできる。もう1つの手法では、抗体または抗体断片を、補体を活性化する能力を有する炭水化物重合体と結合させ、それによって、抗体または抗体断片によって認識されるペプチド-MHC複合体を発現している所望の細胞に対するターゲティングを行う。ある目的のためには、抗体は、特定のペプチド-MHC複合体を特異的に認識する 1つの結合部位、および、例えば細胞障害性T細胞上のエピトープまたは薬学的製剤などのもう１つの抗原エピトープを特異的に認識するもう1つの部位を含む二機能性抗体であれば好都合であると考えられる。二機能性抗体は、2つの関連した抗体を産生する2つのモノクローナル細胞系同士のハイブリッド、または2つの抗体の断片の化学結合によって産生することができる。「結合部位」という語は、抗体分子の可変領域に存在する抗原認識構造を意味すると解釈される。二機能性抗体を用いると、試料中のペプチド-MHC複合体の検出のための、および薬学的製剤、生物学的活性分子もしくはもう1つの抗原の、その試薬が最大の効果を発揮する部位へのターゲティングを行うための特殊な手順が可能となる。 1つの好都合な態様においては、二機能性抗体が反応するもう一方の抗原は、細胞障害性T細胞の分化抗原などのエフェクター細胞である（Staertzら、1985； van Ravenswaay-Claasenら、1993；Fangerら、1989を参照）。ハイブリッド抗体が反応する薬学的製剤は、好ましくは、細胞障害性製剤、抗生物質または抗悪性腫瘍製剤からなる群より選択される（CollarおよびKaplan、1984を参照）。臨床的には、本発明の抗体および抗体の断片の使用により、T細胞の反応を操作するための新たな方法を考案することができる。細胞内に位置するウイルス、細菌または寄生虫は、一般にMHCクラスI分子によって提示され、抗体よりもむしろ細胞障害性T細胞によって認識される。MHCクラスI分子との複合体の形で提示されるペプチドに対して特異的な抗体を毒素と結合させ、T細胞による除去が失敗したウイルス感染細胞などを除去するT細胞の反応を模倣するために使用することができると考えられる。このような手法が有用と考えられる疾患の一例はHI Vである。このような抗体は、T細胞リガンドに対する補体性溶解を指向することもでき、免疫療法に関する別の新規な手法を示唆するものである。抗体のイディオタイプ（抗原結合）構造は抗原性であり、このため、このイディオタイプ構造を指向する特異的な抗体を作り出すことができる。イディオタイプに対して作製された抗体は、抗イディオタイプ抗体と呼ばれる。このような抗体は、本来の抗原の構造を模したものである可能性があり、したがって本来の抗原と同じ機能を有することがある。このような抗体は、機能、有用性および性質の一部または全体に関して本来の抗体の代わりとなる能力を有する。したがって、本発明の範囲には、本発明に係る抗体断片を指向する抗イディオタイプ抗体も含まれる。また、抗体は、抗原のエピトープと反応する抗体の部位を指向する抗体である、抗イディオタイプ抗体を指向する抗-抗イディオタイプ抗体であってもよい。抗イディオタイプ抗体は、当業者に周知の方法によって調製することができる。また、上記の抗イディオタイプ抗体を指向する抗-抗イディオタイプ抗体も本発明の範囲に含まれる。したがって、本発明は、ウイルス、細菌および寄生虫からなる群より選択される細胞内に存在する病原体を撲滅するための、本発明に係る抗体または抗体断片と薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物も提供する。上記の薬学的組成物は、ペプチド-MHC複合体を特異的に認識するモノクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体の混合物、または異なる複数のペプチド-MHC複合体を認識する抗体の混合物を含んでいてもよい。特定のHLA遺伝型を有する個体では、極めて広範な種類の疾患に対する罹患性が選択的に高まることが明らかになっている。今日ではHLA遺伝型との関連が判明している疾患は30種以上に上り、HLA領域に位置することがマッピングによって判明した発現遺伝子は35〜50種以上に達する。HLAクラスIおよびクラスII分子は、抗原性ペプチドと結合し、それをそれぞれCD8+およびCD4+T細胞に提示することにより機能する。このため、その他の対立形質が結合しない特定の抗原ペプチドと結合することにより、HLA対立形質が、分子レベルで自己免疫疾患に対する罹患性をもたらしている可能性は非常に高い。これに関する詳しい情報は、Fu ggerら、1995を参照されたい。または、抗ペプチド-MHC抗体によって、自己免疫につながる不適切な免疫性T 細胞の反応が阻害される可能性もある（Akahoriら、1991）。MHCが多くの自己免疫疾患における明らかなリスク因子であることは、自己MHCに制限された疾患誘発性の自己抗原が単一または複数存在することを示す。それが事実であれば、このようなリガンドを指向する抗体断片は、インビボでの自己免疫性のT細胞の反応に対する強力な阻害因子になると考えられる。ブロック抗体の作製には、疾患誘発性のT細胞エピトープおよび制限性のMHCに関する知識が必要であるが、そのような必要条件は今後満たされると考えられる（Tischら、1993；Kaufmanら、1993；Michaekssonら、1994；WurcherpfennigおよびStrominger、1995）。したがって、さらなる態様において、本発明は、本発明に係る抗体または抗体断片および薬学的に許容される賦形剤を含む、不適切なT細胞反応をブロックするための薬学的組成物に関する。特に、本発明は、悪性腫瘍の発症に関する高リスク群に属することが確立された後の予防、および悪性腫瘍の治療もしくは再発の予防に用いるための、本発明に係る抗体または抗体断片および薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物に関する。この薬学的組成物は、当業者に周知の方法によって製剤化することができる。本発明のもう1つの局面は、自己免疫性疾患の治療または再発の予防のための、本発明に係る抗体または抗体断片および薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物に関する。さらなる局面において、本発明は、HLAクラスI関連疾患（強直性脊髄炎、ライター病、乾癬性脊椎炎、特発性ヘモクロマトーシス、尋常性乾癬およびベーチェット病）およびHLAクラスII関連疾患（慢性関節リウマチ、少関節型若年性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン病、IDDM、アジソン病、グレーブズ病、橋本病、小児脂肪便症、原発性胆汁性肝硬変、尋常性天疱瘡、後天性表皮水疱症、ホジキン病、子宮頸部扁平上皮癌、多発性硬化症、視神経炎、ナルコレプシー、重症筋無力症、グッドパスチャー症候群および円形脱毛症）からなる群より選択される疾患の予防または治療のための、本発明に係る薬学的組成物の使用に関する。さらに、本発明は、補体性溶解を指向することによって、ウイルス、細菌および寄生虫からなる群より選択される細胞内の病原体を撲滅するための、本発明に係る薬学的組成物の使用に関する。特定のペプチド-MHC結合物を指向する抗体は、体内の細胞表面上におけるこのようなペプチド-MHC複合体の存在を検出するために用いることもできる。ペプチド-MHC複合体を作製するための必要条件は、細胞が問題のMHCを発現すること、およびそれが問題のペプチドを産生する能力を有することである。前者は細胞種、および細胞が種々のサイトカインによって刺激されているか否かに依存する。一般にすべての体細胞はMHCクラスI分子を発現するが、MHCクラスIIを発現するのはより限定された一群の免疫細胞（樹状細胞、B細胞など）である。刺激誘発性のMHC発現の例としては、マクロファージ上にγ-インターフェロンによって誘発されるMHCクラスIIの発現を挙げることができる。また、後者は、細胞が利用することができる蛋白質の貯蔵量、および抗原分解のための細胞機構に依存する。一般に、抗原プロセッシングにより、変異した自己蛋白質および感染性因子に由来する蛋白質抗原を含むすべての細胞内蛋白質から、短いペプチド断片が生じる。したがって、MHC分子は、すべての自己および外来性の蛋白質抗原に由来するペプチドと結合し、それを提示する。 T細胞の通常の機能は、外来性化合物を攻撃し、自己化合物を無視するために、体内の細胞によって提示されたペプチド-MHC複合体の自己同一性を吟味することである。ペプチド-MHC複合体の自己同一性を認識する能力を有する抗体は、これと同じ自己-非自己の区別を行う能力を有すると考えられる。このような抗体は、T細胞と比べて以下のようないくつかの利点を有すると考えられる：抗体の方が調製および標識が容易である、輸送および貯蔵が容易である、より高感度で強力な解析を可能とする高い親和性を有すると考えられる、さまざまな非生理学的緩衝液中での検査が可能である。ペプチド-MHCに特異的な抗体を用いることにより、変異した自己蛋白質（変異した癌遺伝子など）または外来性の感染性因子（ウイルスなど）に由来する蛋白質の有無を、それが細胞内に起因するか細胞外に起因するかによらず検出することが可能となる。特に、通常であれば抗体による検出から免れると思われる、細胞内に起因する抗原も、このような「T細胞様の」抗体を用いて検出することができる。このように、ペプチド-MHC特異的抗体は、以下に限定されない一例として挙げると、変異した癌遺伝子を有する腫瘍細胞、またはウイルスを有する感染細胞を同定することができるため、診断薬としての可能性を有する。その検出は、関心対象の細胞の検出、定量化、特徴分析および精製を可能とする蛍光活性化細胞選別装置（FACS、Becton Dickinson社のFACS Starなど）によって実施することができる。また、関心対象の細胞の大量細胞選別および精製を行うために、ペプチド-MHC特異的抗体を磁気粒子と接着させることもできる。大量処理能を有する高感度検出を行うためには、ペプチド-MHC特異的抗体を標識した上で（例えばビオチンなどにより）、マイクロタイター用プレートに直接結合させた抗原を用いる、またはもう1つの抗体を介する（後者はサンドイッチ法として知られる）固相酵素免疫検定法（ELISA）を実施するとよい。血液または生検によって入手した組織（生組織または固定組織）からの細胞の検査も可能である。最近、MHCは細胞から離脱して血流に移行しうることが実証されている（Puppoら、1995を参照）。可溶性MHCは0.5〜25μg／mlまでの濃度で存在することが報告されている。この濃度は、炎症部位の周辺では局所的に上昇する。実験により、このようなペプチド-MHC複合体はW6/32エピトープを保持していることが示されている（W6/32は抗MHCクラスIモノクローナル抗体である。A TCC HB95）。このエピトープは、β₂ミクログロブリンおよびペプチドの双方がM HCクラスIと適切に結合することに依存する。したがって、このような可溶性のM HC分子はペプチド-MHC複合体を代表しており、循環している可溶性のペプチド-M HC複合体は体内の細胞内蛋白質代謝の全体にわたる刻印（imprint）を運んでいると結論することが可能である。このような特異性は、単に血液試料を採取し、検出のためにペプチド-MHC特異的抗体を用いるELISAを実施することによって評価することができる。これは血液試料を用いて細胞内代謝の評価を可能とする手法であるため、大きな診断的意味を有すると考えられる。このように、ペプチド特異的であり、MHCによって制限された組換え抗体は、その可溶性、高い親和性および安定性が、T細胞または組換え可溶性T細胞受容体の使用を行わない条件（例えば、免疫沈降、免疫組織化学検査など）下において T細胞エピトープの存在を検出するために非常に適していることから、科学的にも臨床的にも有用であると考えられる。したがって、抗原提示過程の間に特定の事象が起こる機序および部位に関する疑問にも直接的に取り組むことが可能となり、抗原提示細胞上のT細胞エピトープの発現の可視化および定量化も可能になると考えられる。臨床的には、ペプチド／MHCに特異性を有する抗体は、T細胞による認識のために通常保持されている変異または細胞内感染は抗体にも利用可能であると考えられることから、診断において有用であると考えられる。したがって、抗体（または抗体断片）の使用による特定のT細胞エピトープの検出に関する診断用キットは、本発明において記載した特異性を有する抗体が利用可能であることに依存する。本発明は、本発明に係る抗体もしくは抗体断片、抗イディオタイプ抗体または抗-抗イディオタイプ抗体を含むペプチド-MHC複合体の存在を検出するための診断的組成物を提供する。特に、本発明は、ウイルス、細菌および寄生虫からなる群より選択される細胞内の病原体を検出するための診断的組成物、ならびに悪性腫瘍の検出のための診断的組成物に関する。T細胞によって認識されるさまざまなヒト腫瘍抗原が知られており、それらは本発明の抗体または抗体断片の使用による特異的な免疫療法のために有用な標的になると考えられる。また、本発明は、自己免疫性疾患の存在を検出するための診断的組成物、および個体を悪性腫瘍または自己免疫疾患の発症に関する高リスク群に割り当てるための診断的組成物にも関する。図面の説明図1．バイオパニングによるファージの選択免疫グロブリンのFab断片を発現しているファージのライブラリーを、Ha_255-2 ₆₂ -MHC複合体を唯一の共通因子として有する交代性マトリックス上にパニングした。第1および第3のパニングは、Ha_255-262を結合したRMA-S-K^k細胞に対して実施し、第2および第4のパニングは、精製したHa_255-262-K^k複合体による被覆を施したビーズ（Interfacial Dynamics、Oregon）に対して実施した。それぞれのパニングを終えるたびに結合したファージを溶出し、大腸菌内で増幅させた後、K^k による遺伝子導入を施してペプチドを結合させたRMA-S細胞に対する結合性をFAC Sによって分析した。ペプチドは、Ha_255-262（塗りつぶしていないバー）または NP_50-57（塗りつぶしたバー）である。黒矢印は背景信号のレベルを示す。平均蛍光強度＝MFI。図2．Fab13.4.1の精製および結合特性 (A)精製し、還元したFab13.4.1を、ポリアクリルアミド-SDSゲル電気泳動の後に銀染色法を用いて検出することによって分析した。 (B)精製されたFab13.4.1の、Ha_255-262/K^k（○）、NP_50-57/K^k（●）、K^k（△）またはHa_255-262（▲）による被覆を施したラテックスビーズに対する結合性に関するFACS分析。内在するペプチドを結合させた精製H-2K^b分子に関する検査も実施したが、Fab13.4.1との結合は全く認められなかった（結果は図示せず）。被覆したラテックスビーズを、種々の濃度のFab13.4.1とともにインキュベートし、FITC標識ウサギ抗マウスIgG（DAKO、Denmark）を検出用抗体として用いるFACS によって分析した。 (C)結合に関する競合。Ha_255-262/K^kによる被覆を施したラテックスビーズを3nM のFab13.4.1、およびさまざまな濃度の可溶性Ha_255-262/K^k複合体（○）、NP₅₀-₅₇ /K^k複合体（●）、K^k（△）またはHa_255-262（▲）による被覆を施したラテックスビーズとともにインキュベートした後、図2Bと同じ方法でFACS分析を行った。図3．BIAコア（BIAcore）測定の結果 Ha_255-262-K^kおよびNP_50-57-K^k複合体の、固定した(A)Fab13.4.1または(B)H10 0-27R55（抗K^k）との結合性に関するBIAコアセンサーグラム（BIAcore sensorgr am）。複合体を500nMの濃度に希釈し、固定した抗体の上に３分間置いた。(C)Ha_255-262 -K^kのFab13.4.1との結合に関する速度論的結合曲線。さまざまな濃度の複合体を3分間の会合相および6分間の解離相に適用させた。実際の濃度はセンサーグラムに表示される。結合曲線はすべて共鳴単位（RU）の経時的推移として表示した。図4．ペプチド特異的でMHCによって制限されたT細胞反応の特異的抑制 RMA-S-K^k細胞を、最適量以下の用量のHa_255-262またはNP_50-57とともに26℃で一晩インキュベートした。ペプチドが結合したRMA-S-K^k細胞を、さまざまな用量の Fab13.4.1の存在下において、Ha_255-262特異的なT細胞ハイブリドーマとともに同時培養した。対照として、NP_50-57特異的なT細胞ハイブリドーマを、最大用量（390nM）のFab13.4.1の存在下（黒いバー）または非存在下（白いバー）において同時培養した（挿入図）。用いた最適量以下の用量は、HK8.3-6F8（●）への提示のためのHa_255-262では6μM、HK8.3-5H3（●）への提示のためのHa_255-262 では0.3μM、HK9.5-24への提示のためのNP_50-57では0.3μM、HK9.5-162への提示のためのNP_50-57では3μMとした。図5．エピトープ特異的選択に関するパニングの結果精製したK^kと、Ha_255-262（図5A）またはNP_50-57（図5B）との複合体を作製し、実施例1aに記載した方法でプラスチック表面上に被覆した。この図は、連続的に行ったパニングの結果として、Fabファージライブラリー内に、K^k/Ha_255-262 複合体に対する特異的を有するFabファージが（K^k-NP_50-57複合体に対するものとは異なり）比較的豊富に存在することを示している。図5Aは、（K^k/Ha_255-262ライブラリーの場合には）3回のパニングの後に個別に選択された20種のクローンのうち18種が抗原（K^k/Ha_255-262）と結合し、20種のクローンのうち16種でこの結合がペプチド特異的であったことを示す。（すなわち、20種のクローンのうち2種は、ペプチド非特異的な様式でK^k/Ha_255-262と結合した）図5Bは、（K^k/NP_50-57ライブラリーの場合には）3回のパニングの後に個別に選択された20種のクローンのうち7種が抗原（K_k/NP_50-57）と結合し、この20種のクローンの中で結合がペプチド特異的であったのは1種であったことを示す。実施例方法： MHCの精製： K^kの産生には、以前に記載されている通り（Olsenら、1994）に、AKR由来のリンパ腫細胞であるRDM-4を用いた。約1×10¹⁰個の細胞を溶解緩衝液（PBS中に1％ Nonidet P-40、25mMヨードアセトアミド、1mM PMSF（SIGMA、カタログ番号P-76 26）、5mMオルソバナジン酸ナトリウムを含む）100ml中に再懸濁し、室温で10分間インキュベートした。溶解物を遠心処理によって清浄化した後に-80℃で保存し、使用の前に+4℃で一晩インキュベートすることによって解凍した。溶解物にはミリポアフィルター（Millipore filter）（孔径8〜0.45μ）によるフィルター処理を何回か行い、抗K^kモノクローナル抗体11.4.1（TIB95、American Type C ulture Collection、ATCCから入手した）を用いるアフィニティクロマトグラフィーによってK^k分子を精製した。アフィニティカラムは、製造者（Pharmacia）の記載に従って、11.4.1と活性化臭化シアンセファデックス（Sephadex）マトリックスを共有結合させることによって調製した。溶解物をカラムに数回通した後、(i)0.1％SDS、0.5％Nonidet P-40および0.02％アジ化ナトリウムを含むカラムの20倍の容積のPBS、(ii)0.05％Nonidet P-40および0.1％アジ化ナトリウムを含むカラムの20倍の容積のPBS、および(iii)0.1％アジ化ナトリウムを含むカラムの20倍の容積のPBSで十分に洗浄した。結合したK^k分子を、カラムの5倍の容積（50ml）の溶出緩衝液（0.05Mジエタノールアミン、0.15M NaCl、0.1％アジ化ナトリウム、 0.1％デオキシコール酸ナトリウム、pH11）によって溶出させ、溶出した結合材料をpH6.3の2M Tris-HCl、0.1％アジ化ナトリウム溶液2.5mlによって直ちに中和した。溶出液はコロジオンバッグ（Satorius、カタログ番号13200E）を用いる真空透析によって濃縮した。溶出液の容積が約0.5mlに達した時点で、1％オクチルグリコシド（Sigma）および0.1％アジ化ナトリウムを含むPBS10mlを添加し、最終容積が1mlとなるまで真空透析を続けた。K^kの蛋白質濃度はSDS-PAGEおよびBCA アッセイによって評価した。ヒトβ2-ミクログロブリンは、尿毒症患者の尿から入手し、均一となるようにゲル濾過および等電点電気泳動によって精製した（Stryhnら、1994）。ペプチドの合成：インフルエンザウイルス由来の核蛋白質ペプチド（NP_50-57、1文字コード：SD YEGRLI）および赤血球凝集素ペプチド（Ha255-262＝FESTGNLI）を、標準的なFMO C保護戦略を用いて、RaMPS合成装置（Dupon）によって徒手的に合成した。ペプチド-MHCクラスI複合体の作製： 15μMの界面活性剤に溶解してアフィニティ精製を施したMHCクラスI分子を、4 4μMのNP_50-57またはHa_255-262ペプチドとともに、5μMヒトβ2-ミクログロブリンの存在下において、18℃で30〜48時間インキュベートした。この反応混合物は、PBS（0.14M NaCl／0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液）中に1mM PMSF（Sigma、P-7 626）、8mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）（BDH、10093）、1.2mM 1.10フェナントロリン（Sigma、P-9375）、69μMペプスタチンA（Sigma、P-4625）、128μM Na-p-トシル-L-リジンクロロメチルケトン（TLCK）（Sigma，T-7254）、135μM Na-p-トシル-L-フェニルアラニンクロロメチルケトン（TPCK）（Sigma、T-4376 ）および1mM N-エチルマレイミド（NEM）（Sigma、E-3876）を含む。反応混合物における界面活性剤の最終濃度はNP-40 0.05％であり、ほぼ完全なペプチド交換が生じるように、このPBSにクエン酸緩衝液を添加してpH5.5に調節した。非結合型のペプチドは、以前に記載されている通りに（Olsenら、1994）、セファデックス（Sephadex）G25スパンカラムクロマトグラフィーによって除去した。精製したMHC-ペプチド複合体のラテックスビーズへの固定：ペプチド-MHC複合体は上記の方法に従って作製した。低い活性剤濃度（PBS中に0.05％Nonidet P-40を含む）を用いるスピンカラムクロマトグラフィーを実施した。低濃度活性剤緩衝液中にて、複合体を1.5×10⁷個の硫化ラテックスビーズ（5μ径、Interfacial Dynamics Corporation、バッチ番号436）と混合し、軽く振盪しながら+4℃で一晩インキュベートした。ビーズの残る部分は、1％牛血清アルブミンPBS溶液によってブロックした。ビーズを1回洗浄した後、FACS緩衝液（1％BSA、PBS、0.1％アジ化ナトリウム）1ml中に再懸濁し、パニングまたはFAC S分析のいずれかに用いた。このビーズ標本は+4℃では約1週間安定であった。 MHC-ペプチド複合体の細胞上における作製： RMA-S.K^k細胞系（W．Ortiz-Navaretteによって寄贈された）は、ペプチドを細胞質からペプチド-MHC複合体が形成される部位である小胞体に運ぶペプチド輸送体を欠失しているため、MHCクラスI分子のプロセッシングに障害がある。高濃度のペプチドを含む培地中でこの細胞を増殖させることにより、K^kをほぼすべての表面に発現させることが可能となる。この作用はペプチドの結果であるため、大部分のK^k分子は細胞表面上に付加されたペプチドと複合体を形成すると考えられる。このため、ペプチドを結合させたRMA-S.K^k細胞は、その表面上に所望のペプチド-MHC複合体のみを発現する。0.1mMのペプチドを含む増殖培地5ml中に細胞10⁷ 個を加え、26℃で一晩インキュベートすることによって、細胞表面上に複合体が形成される。細胞は遠心処理によって採取し、1回洗浄した後、増殖培地1ml中に再懸濁する。免疫化：同系交配したBALB/kマウスに、1ヒト単位のBCG（M．tuberculosis bovis、The State Serum Institute）の腹腔内投与によって免疫化を施した。Ha_255-262との複合体を形成したK^k0.5mgを、0.05％Nonidet P-40を含む0.1μMリン酸緩衝液（pH 7.5）中にてPPD（The State Serum Instituteによって供給された）1mgと混合し、全容積が0.5mlとなるようにした。同じ容積のグルタールアルデヒド溶液（0 .2％グルタールアルデヒド、0.1mM NaHPO₄、0.05％Nonidet P-40、pH7.5）を添加し、混合物に往復振盪を加えながら4℃に2日間置いた。この混合物にPBS 12.3 ml、6mg／mlのAl(OH)₃ 6.7mlを添加し、混合物を十分に混合した後に免疫化に用いた。BCG初回刺激の3週間後に、マウスに抗原混合物0.5mlによる免疫化を2回実施した。免疫化は2週間の間隔をおいて皮下注射によって実施した。2回目の免疫化を行った10日後に脾臓を採取した。免疫グロブリン融合蛋白質を発現しているファージライブラリーの作成：チャーグウィン（Chirgwin）ら、1979の方法に従って、2回の免疫化を受けたマウスから採取した脾臓から全RNAを単離した。スーパースクリプトプラス（Sup er script Plus）（Gibco BRL）逆転写酵素を用いて、混合物を42℃で1時間インキュベートする反応において、第1鎖のcDNAにオリゴ-dT_n=18を付加した。転写酵素を熱失活させた後、cDNAテンプレートにエタノール沈殿処理を施し、VH、FdおよびL鎖遺伝子の一次PCR増幅のために用いた。以下に使用したプライマーの詳細は、プラム（Φrum）ら、1993に記載されている。PCR反応は、dNTP（0.2mM）、製造者（Cetus）によって供給された反応緩衝液、プライマーおよびcDNAを含む溶液100μl中にて実施した。VH反応にはMVH1〜25、およびMJH1〜4プライマーのそれぞれ5pmoleを含めた。Fd反応にはMVH1〜25、ならびにMCHγ1、γ2Aおよびγ 2Bプライマーのそれぞれ6.7pmoleを含めた。L鎖反応にはMVK1〜25、およびMCKプライマー20pmoleを含めた。反応混合物の上層に鉱油を載せ、94℃に2分間保った。続いてスーパータク（Supertaq）（HT Biotechnology）またはアンプリタク（ Amplitaq）（Cetus）1.5Uを添加し、混合物に反応サイクル（94℃1分間、55℃1 分間、72℃2分間）を30回施した後、72℃で10分間インキュベートした。ジェネクリーン（GeneClean）（Bio101，Inc）手順との併用により、一次PCR増幅産物をアガロースゲル電気泳動によって精製した。 VH遺伝子とCH1-LINK-Dとの集合化：反応液100μlは、上記の緩衝液およびdNTP、ならびに精製されたFd遺伝子断片5ng、精製されたCH1-LINK-D 20ng、FabTAG．BA CK 1〜2（それぞれ25pmole）、およびFabLINK.FORW．50pmoleを含めた。Fd遺伝子とLINK-Dとの集合化：反応液100μlは、上記の緩衝液およびdNTP、ならびに精製されたFd遺伝子断片5ng、精製されたLINK-D 2ng、FabTAG.BACK 1〜2（それぞれ2 5pmole）、およびFabLINK.FORW．50pmoleを含めた。L鎖遺伝子とLINK-Dとの集合化：反応液100μlは、上記の緩衝液およびdNTP、ならびに精製されたL鎖遺伝子5 ng、精製されたLINK-D 2ng、およびFabLINK.BACKおよびFabTAG.FOR.をそれぞれ5 0pmole含めた。加熱サイクルのプログラムは上記の通りに開始し、25サイクル（それぞれ94℃2分間、55℃1分間、72℃2分間）を実施して、集合化産物をゲル精製した。最終集合物：上記の緩衝液およびdNTP、ならびに精製されたVH-CH1-LINK-D断片5 ngまたは精製されたFd-LINK-D断片5ngを含む反応液100μlを、精製されたL鎖-LI NK-D断片5ngおよびASSEMBLY-1プライマー20pmoleと混合した。加熱サイクルプログラムは上記の通りに開始し、25サイクル（それぞれ94℃1.5分間、69℃1分間、 72℃2分間）を実施して、集合化産物をゲル精製した。最終集合反応物からのDNA断片を、DNA1μg当たり10UのNotIを用いて37℃で2時間消化した。フェノール抽出およびエタノール沈殿の後、DNAをSfiI緩衝液中に溶解し、DNA1μg当たり10Uの酵素を用いて50℃で2時間、油層下にてインキュベートした。ジェネクリーン手順を用いてDNAを精製し、ジェネクリーンによって精製されたNotIおよびSfiI切断pFAB5cに連結した。連結反応液20μlは、消化されたベクター0.5μgおよび挿入用DNA0.5μgを含み、これにT₄-DNAリガーゼ（Ame rsham）1.5Uを添加した後に15℃で一晩インキュベートした。続いて、連結混合物をフェノール抽出およびエタノール沈殿によって精製した後、水20μl中に再懸濁した。25μF、2.5kVおよび200オームに設定したバイオラッド（Bio-Rad）社製大腸菌パルサーセット（E.Coli pulser set）を用いる電気穿孔法により、そのうち2μlを大腸菌TOP 10F'細胞（British Biotechnology）に導入した。パルスを加えた直後に、新たに調製したSOC培地（Sambrookら、1989）1mlを添加し、細胞を37℃で1時間振盪した。全ライブラリーのサイズの推計値を得るために、これを連続的に希釈して、LB-アンピシリン平板培地に播いた。VHおよびL鎖遺伝子のライブラリーは1.6×10⁷種のクローンを含み、FdおよびL鎖遺伝子のライブラリーは6×10⁶種のクローンを含んでいた。形質転換用混合物それぞれ1mlを、アンピシリン100μg／ml、テトラサイクリン8μg／ml、および1％グルコースを含む2×TY培地40mlに移した。OD₆₀₀が1〜2に達するまで、培養物を振盪下にて37 ℃でインキュベートした。ライブラリーの一定量をグリセリン添加試料として、-80℃で保存した。ライブラリーに対する重複感染：2×TY 200ml、アンピシリン100μg／mlおよびテトラサイクリン8μg／mlを含む容量2lのフラスコに、形質転換細胞10⁹個を植え付け、37℃、250rpmで振盪した。OD₆₀₀が0.5となった時点で、ヘルパーファージR408（Stratagene）を50の倍数になるように添加し、37℃で20分間置いて感染を進行させた。続いて細胞にイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG ）を、最終濃度が0.1mMになるように添加し、振盪（250rpm）下における室温でのインキュベーションを一晩続けた。細胞をベレット化し、プラム（Φrum）ら、1993およびエングバーグ（Engberg）ら、1995の記載に従って、PEG沈殿によってファージの上清を濃縮した。パニングによる抗原結合物の選択：細胞に対するパニング：上記の方法により、K^kをトランスフェクションさせたRM A-S細胞（RMA-S.K^k）にHa_255-262を結合させたものを調製した。細胞80μlをファージライブラリー20μl（約10¹¹cfu）と混合し、軽く振盪しなかがら室温で3 時間インキュベートした。細胞を増殖培地で3回洗浄し、トリプシン（Worthingt on）1mg／mlによる処置を37℃で1時間行うことによって、結合したファージを溶出させた。遠心処理によって細胞を除去し、OD₆₀₀が0.8〜1.0の範囲にある、指数関数的に増殖している大腸菌TOP10F'細胞（British Biotechnology）400μlを含むバイアル中に上清を移した。以下の重複感染は前段落に記載した通りに実施した。ビーズに対するパニング：精製されたHa_255-262-K^k複合体を被覆したラテックスビーズ1×10⁶個を、1％BSAを含むPBS緩衝液中にてファージライブラリー20μl（約10¹¹cfu）と混合し、軽く浸透しながら+4℃で3時間インキュベートした。遠心処理によってビーズを沈殿させ、3回洗浄した。最後の洗浄の後に、ビーズをグリシン溶出緩衝液（0.1M 塩酸グリシン、0.1％BSA、pH2.2）100μl中に再懸濁することによって結合したファージを溶出させ、室温に10分間放置した。遠心処理によってビーズを除去し、2M Tris-base 8μlを加えて上清を中和した。この混合物を、指数関数的に増殖している細胞400μlを含むバイアルに移し、上記の方法に従って重複感染を実施した。 FACS分析： FACS分析は、Fab-ファージと、ペプチドによるパルス刺激を受けたRMA-S.K^k細胞との結合の評価、またはFab断片と、ビーズ上に固定したさまざまなペプチド- MHC複合体との結合の検出を目的として実施した。細胞を用いるFACS分析：ペプチドによるパルス刺激を施したRMA-S.K^k細胞10⁵個を、FACS緩衝液（1％牛血清アルブミン（BSA）、PBS、0.1％アジ化ナトリウム） 100μl中にある約4×10⁹cfuのFabファージ、またはFab13.4.1と混合し、氷上にて2時間インキュベートした後、FACS緩衝液で3回洗浄した。検出抗体はFITC標識を施したヤギ抗-ファージまたはウサギ抗M13-ファージ血清（いずれもDAKO、Den mark）とし、FACS緩衝液中に1：100に希釈して用いた。試料は氷上で30分間インキュベートした。非結合型の抗体を洗浄によって除去し、残った細胞を1％ホルムアルデヒドを含むFACS緩衝液200μl中に再懸濁して、FACSによって分析した。ビーズを用いるFACS分析：精製したさまざまな濃度のFab13.4.1断片を、ペプチド-MHC複合体による被覆を施したビーズ10⁵個と混合した。氷上で2時間インキュベートした後にビーズを3回洗浄し、続いて、FACS緩衝液中に1：50に希釈したFI TC標識ウサギ抗マウスIgG血清（DAKO、Denmark）とともに30分間インキュベートした。試料には上記と同じ方法でさらに処理を施した。 FACSのデータは、ファクスキャン（FACScan）（Becton Dickinson Immunocyto metry）を用いて記録した。それぞれの分析に関して3つのパラメーターを得た： (i)前方散乱光、(ii)側方散乱光、および(iii)フルオレセインの蛍光放射（515 〜545nm）。前方散乱光の閾値は、細胞またはビーズの破砕片を除外するように設定した。10⁴個のビーズまたは細胞に関するデータを収集し、ライシスII（Lys is II）（登録商標）ソフトウエア（Becton Dickinson Immunocytometry）を用いて分析した。選択されたクローンからの可溶性Fab断片の生産および精製： pSAN13.4.1のFab断片を調製するために、Fabをコードするカセットを、軽鎖の C端末の遺伝子III要素（Engbergら、1995）の位置にHis₆-taqを付加する発現ベクターに移行させた。この新たな構築物を用いて、以下の通りにFab断片を調製した：2×TY 500ml、アンピシリン100μg／mlおよびテトラサイクリン8μg／ml をそれぞれ含む容量21のフラスコ2本に、形質転換細胞10mlを植え付け、37℃で2 50rpmの振盪を加えた。OD₆₀₀が0.5となった時点で、最終濃度が1mMとなるようにIPTGを添加し、振盪（250rpm）下でのインキュベーションを室温で4時間続けた。氷冷したTES緩衝液（200mM Tris-HCl、5mM EDTA（エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム二水和物）、500mMショ糖、pH8.0）10ml中に細胞を再懸濁することにより、ペリプラスムの蛋白質を単離した。5分後に1：4 TES緩衝液15mlを添加し、混合物を氷上で30分間インキュベートした。遠心処理によって細胞残渣物を除去し、 MES緩衝液（10mM 2-[N-モルホリノ]エタンスルホン酸（SIGMA、カタログ番号M-8 2-50）、20mM NaH₂PO₄、pH5.6）41に対してペリプラスム分画を4℃で一晩透析した。ペリプラスム分画をABxマトリックス（J.T．Baker Research Products）に通過させ、保持された材料を、勾配化したpH7.0の0.5M NaH₂PO₄を用いて溶出した。Fab断片は固定化金属イオンクロマトグラフィー（IMAC）によってさらに精製した。ABx精製物のFab陽性分画を、5回濃縮した緩衝保存液を用いてIMAC緩衝液A（PBS、0.5M NaCl）に適合させ、カラムの5倍の容積の0.1M CuSO₄をあらかじめ通した後に緩衝液Aを用いてカラム平衡化を施したキレート性Superose HR 10/ 2カラム（Pharmacia Biosystems）にかけた。結合した蛋白質を、イミダゾール緩衝液（IMAC緩衝液A、0.5M イミダゾール）による勾配（0〜0.5M）を用いて溶出した。精製されたFab断片の量を、SDS-PAGEおよびBCAアッセイによって評価した。すべての精製はハイロード（High Load）（登録商標）システム（Pharmacia Biosystems）上にて実施した。クラスIに制限されたマウスT細胞ハイブリドーマの作製、および細胞障害性T細胞の解析：クラスIによって制限されたマウスT細胞ハイブリドーマである、HK9.5-24およびHK9.5-162（NP_50-57特異的であり、K^kによる制限を受ける（Stryhnら、1994））ならびにHK8.3-5H3およびHK8.3-6F8（Ha_255-262特異的であり、K^kによる制限を受ける（Stryhnら、1994））の作製および特異性はすでに記載されている。 K^kをトランスフェクションさせたRMA-S細胞系であるRMA-S.K^k（Stryhnら、199 4）を、Ha_255-262またはNP_50-57とともに26℃で一晩インキュベートした。インキュベートした後、細胞を十分に洗浄し、さまざまな濃度のFab13.4.1を含む培地中に再懸濁した。T細胞ハイブリドーマ細胞10⁵個を、付加処理を受けたRMA-S. K^k細胞10⁵個とともに、全容量を250μlとして37℃で24時間インキュベートし、カプラー（Kappler）ら、1981に従って、IL-2の放出に関する上清の検査を行った。 BIAコア（BIAcore）分析：形成された複合体（すなわち、K^kの活性結合部位）の濃度を測定するために、既知の比活性を有する微量の¹²⁵I標識NP_50-57を添加し、G-25スパンカラムクロマトグラフィーによって複合体の形成を測定した(2)。精製したFab13.4.1を20μ g／mlとなるように10mM酢酸緩衝液中に希釈し、製造者（Pharmacia、Sweden）の推奨に従い、標準的なアミン結合化学反応によってBIAcoreチップのデキストラン表面に結合させた。チップと結合したFab断片の量は、1000RUをわずかに下回る値に保たれていた。精製され、定量化されたペプチド／MHC複合体を測定用チャンバーに投入し、大量輸送の限界によって速度論的指標の算出に干渉が及ぶことを避けるために、流速は10μl／分に設定した。すべての測定は0.1％NP-40を含むPBS中にて22℃で行った。 T細胞ハイブリドーマに対する刺激、T細胞受容体の特異性 Ha_255-262/K^k特異的T細胞ハイブリドーマの精細な特異性を評価するために、インビトロ刺激アッセイを用いた（21）。抗原提示細胞にはRMA-K^k（K^kを遺伝子導入した胸腺腫）を用いた。96穴のマイクロタイタープレートに、1ウェル当たり1×10⁵個のRMA-K^k細胞を、Ha_255-262特異的でK^kによって制限されたハイブリドーマであるHK8.3-5H3またはHK8.3-6F8 1×10⁵個とともに植え付けた。さまざまな濃度のHa_255-262ペプチドまたはその類似代替物を添加し、10％FCSを加えた RPMI₁₆₄₀中において、5％CO₂を含む加湿大気下で、培養物を37℃で24時間インキュベートした。上清を回収し、カプラー（Kappler）ら（26）によって最初に記載された方法に従い、IL-2依存的細胞系であるHT-2を1ウェル当たり4000個用いることによってIL-2の含量を評価した。100単位／mlのIL-2を入手するために必要なペプチドの濃度を決定した。組換えpSAN13.4.1抗体の特異性特定のHa_255-262-K^k複合体を作製し、精製した上で、最適値以下である1ウェル当たり10pg（10nM）の濃度で、マキシソープ（Maxisorp）96穴平底マイクロタイタープレート（Nunc、Denmark）に被覆を施した。続いて、2％スキムミルクを含むPBS緩衝液によってプレートをブロックした後、繊維状ファージのpIIIの端に位置する融合蛋白質として発現しているpSAN13.4.1に曝露させた。プレートを洗浄し、抗ファージ抗体（Pharmacia、Uppsala）を結合させたHRPに曝露させ、洗浄した後に、ELISA判読装置によって490nmで画像化および判読を行った。pSAN13 .4.1の精細な特異性を評価するために、段階的な濃度の類似体-K^k複合体（K^kの飽和を得るために類似体450μMを用いて作製したもの）を、pSAN13.4.1ファージを加える前に競合因子としてあらかじめ添加した。50％阻害を得るために必要な競合因子複合体の濃度（IC₅₀）を決定した。IC₅₀が低値であるほど、pSAN13.4.1 の類似体-K^k複合体に対する結合性は高い。実施例1 ペプチド特異的でMHCによって制限された抗体の作製および選択精製されたマウスMHCクラスIであるK^kと、K^kによって制限されたインフルエンザウイルス由来のペプチドであるヘマグルチニン（Ha_255-262）との複合体を、方法に関する項で記載した通りに作製した。免疫化のために、ツベルクリンペプチド由来精製蛋白質（PPD）を精製した複合体と結合させ、B細胞免疫原としての K^kには主として耐容性を有するが、T細胞免疫原としてのPPDには高い反応性を示す、カルメット・ゲラン菌（Bacille-Calmette-Guerin）（BCG）による初回刺激を受けたH-2^k（BALB/k）マウスの免疫化のために用いた。自己のMHCによって制限されたエピトープを指向する抗体反応を得やすくするために同系動物を選択し、効率の高さから、ラハマン（Lachmann）ら、1978によって最初に記載されたBCG-PPD免疫化法を選択した。免疫化の10日後に脾臓の全m RNAを単離し、逆転写によってcDNAを作製した。免疫グロブリンのFab断片に対応するcDNA断片をPCR増幅するために特異的な縮退プライマーのセットを用い、続いてこの断片をpFab5cベクター（Φrumら、1993）にクローニングし、繊維状バクテリオファージのマイナーウイルス外被蛋白質pIIIとの融合体として発現させた。最初のライブラリーは2×10⁷種のファージを含み、これをパニング手順に供した後、結合したファージを溶出し、大腸菌内にて再増殖させた。選択手順の効率を高めるために、ファージは、K^kを遺伝子導入したRMA-S細胞（RMA-S.K^k）にH a_255-262によるパルス刺激を施したものに対してパニングし、精製された均質な Ha_255- ₂₆₂ -K^k複合体による被覆を施したラテックスビーズに対するパニングと交代で実施した。パニング戦略の目的は、1回おきのパニングごとにマトリックスを交換し、共通の選択エピトープ、この場合にはHa_255-262-K^kは維持しておくことにある。それぞれの選択ラウンドにおいて再増殖させたファージを2×10¹⁰cfu／mlに調整し、Ha_255-262またはNP_50-57によるパルス刺激を受けたRMA-S.K^k細胞との結合性を、FITC標識抗ファージ抗体を検出抗体として用いるFACS分析によって検討した（比較のために用いたNP_50-57ペプチドもK^kによって制限される）。図1に示した通り、パニングを2×2回交代して実施した後には、Ha_255-262-K^kを認識する Fabファージの含量が段階的に増加することが認められた。パニングを1〜3回実施している間の、NP_50-57によるパルス刺激を受けたRMA-S.K^k細胞（塗りつぶしたバー）との結合の増加は比較的少なく、これは恐らく共通の細胞エピトープとの結合親和性が低いFabファージが増加したことを反映していると考えられる。この集団はビーズに対する4回目および最終のパニングの結果、効率的に除去される。実施例1a 上記の部分で詳しく記載した抗体Fab断片（pSAN13.4.1）に関して記載したものと同様の技法を用いて、pSAN13.4.1と同じ特異性を有するが、親和性はより低い他の抗体（例えばpSAN KHO₄）が単離されている。さらに、NP_50-57ペプチドと複合体を形成したMHC-K^k分子（例えばpSAN KN36）を特異的に認識する抗体Fab断片も単離されている。このうち後者の抗体は、K^k-NP_50-57複合体を開始材料として用いて免疫化したマウスを用いる上記の手順によって作製した抗体Fabライブラリーから単離された。後者の2種の抗体に関しては、交代性のパニング手順の間に用いた手法は、上記のものとは若干異なる：すなわち、選択されたMHC／ペプチド複合体による被覆を施されたプラスチック表面と、同じ複合体を発現している細胞との間で交代させつつ実施する代わりに、Fabファージライブラリー（K^k /Ha_255-262によって免疫化されたマウスから作製した）を、K^k-NP_50-57複合体によって被覆された競合量のラテックスビーズの存在下において、K^k/Ha_255-262 複合体によって被覆されたプラスチック表面に対してパニングした。同様に、K^k -NP_50-57によって免疫化されたマウスから作製したFab-ファージライブラリーを、K^k/Ha_255-257複合体によって被覆されたラテックスビーズの存在下において、 K^k-NP_50-57 によって被覆されたプラスチックに対してパニングした。交代性パニング戦略に対するいくつかの変法は首尾よく使用されうると考えられる。重要なことは、本発明者らの免疫化および交代性パニング手順の適用可能性および一般性がすでに示されているという点である。実施例2 クローンpSAN13.4.1の特異性最終のパニングによって得たファージ集団から個々のファージを単離し、ELIS Aに基づくアッセイを用いて、特異性に関する再スクリーニングを行った。検討した50種のクローンのうち、7種はHa_255-262-K^k複合体と特異的に反応した（データは提示せず）。15種のクローンは、Ha_255-262-K^kおよびNP_50-57-K^k複合体のいずれとも結合し、この2つの複合体が共有しているエピトープを認識する可能性が最も高いと考えられた。残る28種のクローンは、Ha_255-262-K^kおよびNP_50-5 ₇ -K^k複合体のいずれとも結合しなかった。上記の7種のクローンのCDR3重鎖および軽鎖領域に対応するDNA配列を決定したところ、同一であることが判明し（データは提示せず）、これらはすべて単一の生産性の抗体軽鎖／重鎖の組み合わせ事象に由来することが示唆された。クローンの1種であるpSAN13.4.1からの可溶性Fab分子の生産および精製を行い（図2A）、ペプチドとMHCとのさまざまな組み合わせによる被覆を施したラテックス粒子を用いるFACS分析によって特異性について解析した。Fab分子（Fab13.4.1）の特異性は、その反応性がHa_255-262とK^k との間に形成された複合体のみに対して認められ、それぞれの単独物およびNP₅₀ _-57 -K^k複合体は認識しなかったことから、MHCによって制限されたT細胞特異性の明らかな特徴を有していた（図2B）。さらに、Fab13.4.1との結合において、可溶性Ha_255-262-K^k複合体はビーズ上に被覆されたHa_255-262-K^kと競合する能力を有するが、単離されたHa_255-262ペプチドおよび単離されたK^k、ならびにNP_50-57 -K^k複合体にはその能力がないことから実証されたように、この相互作用は飽和的および特異的であった（図2C）。Fab13.4.1とHa_255-262-K^kとの間の相互作用を阻害するためには10〜100nMの可溶性Ha_255-262-K^k複合体が必要であり、このことから、Ha_255-262-K^k複合体に対するFab13.4.1の親和性KDは10〜100nMの間であることが示された。実施例2a MHCクラスI K^kによるHa_255-262エピトープの認識 K^kの特異性を評価するために、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンHa₂₅ _5-262 （FESTGNLI）に由来する、K^kによって制限された細胞障害性T細胞エピトープの個々のアミノ酸を置換したペプチド類似体の完全なセットを合成して検討した。このエピトープの内部のすべての位置に関して、親分子のアミノ酸のそれぞれを１つずつ、別の天然のアミノ酸（システインは除く）と置換した。これらの類似体のK^kとの結合性を生化学的阻害アッセイにおいて検討し（25）、それぞれの置換の影響を-log(IC₅₀(類似体))として表現した（データは提示せず）。驚くべきことに、置換の大半は多少なりともK^kによって許容された。特に、第3、4および6位での置換によってK^kとの結合性はいずれも有意に変化しなかったことから、これらの部位での変異に関してK^kは中立的であると考えられた。144種の置換のうち、結合性が100分の1未満に低下したのはわずか14種（または10％）のみであった。このような有害な置換はすべて、第2および8位に集中しており、それぞれアミノ酸EおよびIに優先的であった。データでは、第8位では結合性が10分の1未満に低下した置換が9種であったのに対して、第2位では6種であったことから、この2つの中でも第8位が最も決定的であることが示唆されている。第1、5および7位に関する置換の影響はこれよりも明確でなく、第1位ではFが優先的と思われ、第5位では荷電性のアミノ酸およびYが不利益をもたらし、第7位ではFおよびLが優先的と考えられた。実施例2b T細胞による、K^kによって制限されたHa_255-262エピトープの認識 MHCクラスIによって制限されたT細胞の反応の精細な特異性を検討するため、H a_255-262特異的でK^kによって制限された2種類のT細胞ハイブリドーマであるHK8. 3-6F8およびHK8.3-5H3を用いるバイオアッセイにおいて、単一アミノ酸のそれぞれを置換した類似体の刺激能力を評価した。このアッセイはK^kとの結合性および T細胞認識の両方に依存的であることに注意する必要がある。それぞれの類似体に対して用量-反応分析を実施し、100U/ml IL-2の反応を誘発するために必要な類似体の濃度を決定するために用いた。最も決定的なペプチド残基は、第1位におけるF（いずれのハイブリドーマとも）、第4位におけるT（いずれのハイブリドーマとも）および第6位におけるN（HK8.3-6F8のみ）であった。以上の位置において、T 細胞の特異性は非常に厳密であり、親分子と同じアミノ酸しか許容されなかった。つまり、いかなる置換においても刺激活性は完全に消失した（第4位のTをSに保存的置換した場合に10分の1の低下であったことを除く）。第3位（いずれのハイブリドーマとも）、第6位（HK8.3-5H3のみ）および第7位（いずれのハイブリドーマとも）については、かなり高度であるが厳密性はより低い特異性が認められた。これらの部位では、大部分は保存的または半保存的である2、3の置換のみが許容された。第5位（いずれのハイブリドーマとも）についてはわずかに不規則性の高い特異性が認められた。なお、最も決定性の低いペプチド残基は、K^kに関してはアンカー部位であり、続いて第8位におけるI（いずれのハイブリドーマとも）および第2位におけるE（いずれのハイブリドーマとも）の順であった。これらの部位では複数の置換が多少なりとも許容され、T細胞刺激活性の損失につながるような置換の多くは、K^kとの結合性の損失によると考えられた。実施例2c pSAN13.4.1抗体によるK^k-Ha_255-262エピトープの認識 pSAN13.4.1は、ペプチド特異的でMHCによって制限されたT細胞特異性を連想させるような様式で、Ha_255-262とK^kとを含む複合体を認識する。この点をさらに調べるために、pSAN13.4.1の固定化Ha_255-262-K^k複合体との結合を阻害するために可溶性の類似体-K^k複合体を用いるバイオケミカルアッセイにおいて、単一アミノ酸のそれぞれを置換した類似体のpSAN13.4.1との結合能を評価した。類似体 -K^k複合体は、K^kの特異性による影響を最小化し、pSAN13.4.1の特異性に焦点を絞るために、ペプチド飽和条件下において作製した。最も決定的な残基は第4位におけるTであり、これは保存的置換であるSとの置換のみが可能であった。2番目に決定的な残基は第7位のLおよび第3位のSであり、大部分は保存的ないし半保存的である一部の置換が許容された（データは提示せず）。これよりも決定性が低かった残基は第1位のFであり、これは大部分は保存的ないし半保存的である10 種の置換において結合性の低下が10分の1に達しなかった。これに対して、さらに決定性の低い残基は第5位におけるGおよび第2位のEであり、これは13〜14種のアミノ酸による置換が可能であった。なお、最も決定性の低かった残基は第8位におけるIであり、これは（Rを除く）他のすべてのアミノ酸と置換可能であった。同一のペプチド-MHC複合体を用いて、Ha_255-262特異的でK^kによって制限された2種類のT細胞、および同じペプチド-MHC複合体に対して特異的なユニークな抗体であるpSANの精細な特異性を同じようにして評価した。その結果、T細胞の特異性とpSAN抗体の特異性との間に著しい類似性があることが明らかとなり、T細胞によって認識されうるペプチド残基の大部分はこの抗体によっても認識されうると考えられた。実施例3 pSAN13.4.1に関する速度論的結合分析表面プラスモン共鳴（すなわち、表面上の屈折率における変化の検出；BIAcor e、Pharmacia、Sweden）を用いて、Fab13.4.1の特異性が確かめられ、相互作用の速度論的指標が決定された。精製したFab13.4.1をBIAcoreセンサーチップ上に固定化し、あらかじめ形成しておいたHa_255-262-K^kまたはNP_50-57-K^k複合体を作用させた。精製したFab13.4.1は、20μg／mlとなるようにpH4.5の10mM酢酸緩衝液中に希釈し、製造者（Pharmacia、Sweden）に従い、標準的なアミン結合化学反応によってBIAcoreチップのデキストラン表面と結合させた。あらかじめ形成しておくK^kとペプチドとの複合体は上記の方法と同じようにして作製した。形成された複合体（すなわち、K^kの活性結合部位）の濃度を測定するために、複合体の形成期間中に、既知の比活性を有する微量のヨウ素化したNP_50-57を添加した。G-25スパンカラム上で非結合型のペプチドを分離した後（Stryhnら、1994）、結合型および遊離型の¹²⁵Iの量をγ線計数によって測定し、形成された複合体の濃度を算出した。チップに結合したFab断片の量は1000RUをわずかに下回る値に保たれており、流速を10μl／分に設定し、それにより、大量輸送の限界によって速度論的指標の計算に干渉が及ぶことを避けた。すべての測定は0.1％NP-40およびリン酸緩衝生理食塩水中にて22℃で実施した。図3Aに示した通り、センサーグラムによって、Fab13.4.1がHa_255-262-K^kとは結合するが、NP_50-57-K^kとは結合しないことが示された。対照として、K^k特異的モノクローナル抗体であるH100-27R55（G．Hammerling博士によって提供された）をBIAcoreセンサーチップ上に固定化し、同一のペプチド-K^k標本を作用させた。図 3Bは、H100-27R55がいずれのペプチド-K^k複合体とも同程度に十分に結合することを示しており、チップにとって等量の機能的K^k蛋白質が利用可能であったことを裏づけている。最初の結合相の傾きは、Ha_255-262-K^kの濃度に依存しており（図3C）、これによって本発明者らは会合速度定数K_aが1×10⁴M^-1s^-1であると算出することができた。図3Cのセンサーグラムは、実験上の2つの問題を明らかにした：(i)ブランク注入によって信号が約19RU増加し、ほぼ線形的に減少して会合期間の最終時点では約3RUになったこと、(ii)実験の経過中に基準線が約IRU／分で低下しており、これは固定化されたリガンドが徐々に損失したことを示す。これらの実験的な偏差はいずれも直線的に補間され、それぞれ会合相および全センサーグラムの補正のために用いられた。これらの補正および以下の計算は、デンマークのゲントフテ（Gentofte）にあるハーゲドルン研究所（Hagedorn Research Laboratories）のロン・シムコ（Ron Shymko）が開発した数学モデルを用いて行った。解離および会合の双方の数学的分析のために、それぞれのセンサーグラムからの21のデータポイントを用いた。まず解離相に対して両側指数モデルによるフィッティングを行った。算出されたk_d値は7.3×10^-4ｓ^-1〜3.2×10^-4s^-1の範囲であった。これらの値を用い、結合部位の総数を一定値に保つことにより、2部位モデルを用いて全センサーグラムのフィッティングを行った。これにより、高会合性成分に関するk_a値は1.2×10⁴M^-1ｓ^-1〜0.6×10⁴M^-1s^-1の範囲にあり、その結果得られたK_D 値は53、56、60および51nMといずれも非常に類似していた。低親和性成分に関するパラメーターの解釈は行えなかった。しかし、センサーグラムのデータに対するこの成分の寄与は少なく、会合の終了時点では全信号の3〜18％を占めていた。非結合型リガンドの除去によって解離相は開始され、これを用いて解離速度定数k_dは5.6×10^-4s^-1と決定された（T_1/2では約21分に相当する）。k_dをk_aで割った値として算出される平衡解離定数K_Dは約56nMであり、これは図2Cで認められた阻害範囲とよく相関する。最近、BIAcore分析を用いて、2種類の異なるT細胞受容体の速度論的指標および親和性が発表されている（Corrら、1994；Matsuiら、 1995）。会合速度定数k_aは10³および10⁵M^-1s^-1であり、解離速度定数k_dは0.06および0.2s^-1（T_1/2では12〜27秒に相当する）と報告されており、全体的な平衡解離定数K_Dは10^ー5〜10^-7Mと算出されている。これと比較して、抗体は一般にT細胞とほぼ同じ速度で会合するが、解離は数桁も遅い（Pellequerら、1993）。典型的には、抗体の全体的な親和性は10^-7〜10^-10Mの範囲である。Fab13.4.1の親和性および速度論的指標は、T細胞様の特異性を有するにもかかわらず、抗体に典型的なものであった。実施例4 抗原特異的でMHCによって制限されたT細胞反応の特異的阻害 Fab13.4.1の特異性および親和性を考慮すれば、これはHa_255-262特異的でK^kによって制限されたT細胞ハイブリドーマを阻害するが、異なるペプチド特異性を有するK^kによって制限されたT細胞ハイブリドーマは阻害しないことが予想される。実際に、Fab13.4.1はHa_255-262特異的でK^kによって制限された2種類のT細胞ハイブリドーマであるHK8.3-5H3およびHK8.3-6F8を阻害することができた（図4 ）が、NP_50-57特異的でK^kによって制限された2種類のT細胞ハイブリドーマであるHK9.5-24およびHK9.5-162への影響は何ら認められなかった（図4、挿入部）。したがって、Fab13.4.1は、T細胞ハイブリドーマHK8.3-5H3およびHK8.3-6F8によって認識されるエピトープと空間的またはアロステリック的に関連したHa_255-26 ₂ -K^k依存的エピトープを認識する。Ha_255-262特異的でK^kによって制限された2種類のT細胞ハイブリドーマの阻害を得るために必要なFab13.4.1の濃度は、BIAcor e分析によって測定されたK_Dと近似した値であると予測された。実施例5 抗原特異的でMHCによって制限された抗体のターゲティングのための使用興味深いことに、これらの抗体は、ウイルスまたは変異した癌遺伝子などの細胞内標的を有する細胞（腫瘍細胞）に対して毒素を指向し、それによってそのような細胞を撲滅することにより、キラーT細胞の機能を模倣することができる。これらの抗体は実験動物で産生させることができ、続いて「ヒト化」し、任意のアイソタイプ構築物に移行させて組換え体を大量に産生することができる。また、養子免疫療法のために現在用いられているT細胞に比べて、投与および制御も容易であると考えられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 31/00 ６１７Ａ６１Ｋ 31/00 ６１７Ｅ６２１６２１Ｄ６２５６２５６２９６２９Ａ６２９６３１６３１Ｈ６３１Ｃ６３３６３３６３５６３５６３７６３７Ａ 39/395 39/395 ＬＴＵＣ０７Ｋ 14/74 Ｃ０７Ｋ 14/74 16/00 16/00 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/531 33/531 Ａ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者エングバーグジャンデンマーク国コペンハーゲンオーエイチ．シー．ランビーズゲイド 43 (72)発明者フガーラーズデンマーク国コペンハーゲンオーフレデリックヴイズヴェイ 13 ４ス (72)発明者ストリーンアネッテデンマーク国ブロンショイステンマグレベイ 29

Claims

【特許請求の範囲】１．ペプチド-MHC複合体を特異的に認識する抗体または抗体断片を産生する方法であって、 (a) 抗体または抗体断片をコードする核酸を発現しているファージライブラリーの生産、 (b) ペプチド-MHC複合体を特異的に認識する抗体または抗体断片を発現しているファージの選択、および (c) 該ペプチド-MHC複合体を特異的に認識する抗体または抗体断片を生産するための、該ファージの該抗体または抗体断片をコードする核酸の適切な細胞への導入を含む方法。２．ペプチド-MHC複合体を特異的に認識する抗体または抗体断片を産生する方法であって、 (a) ペプチド-MHC複合体によって免疫化された動物からのRNAの単離、 (b) 抗体または抗体断片をコードする核酸の増幅、および該核酸を発現しているファージライブラリーの生産、 (c) ペプチド-MHC複合体を特異的に認識する抗体または抗体断片を発現しているファージの選択、ならびに (d) 該ペプチド-MHC複合体を特異的に認識する抗体または抗体断片を生産するための、該ファージの該抗体または抗体断片をコードする核酸の適切な細胞への導入を含む方法。３．ペプチド-MHC複合体を特異的に認識する抗体または抗体断片を発現しているファージの選択が、ペプチド-MHC複合体を発現している細胞とファージライブラリーとのインキュベーションによって実施される、請求項1または2記載の方法。４．ペプチド-MHC複合体を特異的に認識する抗体または抗体断片を発現しているファージの選択が、ファージライブラリーとペプチド-MHC複合体を結合させたビーズとのインキュベーションによって実施される、請求項1または2記載の方法。５．ペプチド-MHC複合体を特異的に認識する抗体または抗体断片を発現しているファージの選択が、ペプチド-MHC複合体を共通因子として保持する交代性マトリックス上への、抗体または抗体断片を発現しているファージのライブラリーのパニングによって実施される、請求項3および4記載の方法。６．交代性マトリックスが、ペプチド-MHC複合体を発現している細胞およびペプチド-MHC複合体を結合させたビーズである、請求項5記載の方法。７．特定の１つのペプチドを豊富に含む精製されたMHC分子を使用する、請求項1 〜6のいずれか一項に記載の方法。８．請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法によって調製されたペプチド-MHC複合体を特異的に認識する抗体または抗体断片。９．ペプチド-MHC複合体を特異的に認識する、グリコシル化されていない抗体または抗体断片。 10．抗生物質、細胞障害性製剤および抗悪性腫瘍製剤からなる群より選択される医薬品と結合させた、請求項8または9記載の抗体または抗体断片。 11．Tリンパ球を活性化する能力を有するスーパー抗原と結合しているか、または補体を活性化する能力を有する重合炭水化物と結合している、請求項8または9 記載の抗体または抗体断片。 12．請求項8または9記載の抗体または抗体断片を含むペプチド-MHC複合体の存在を検出するための診断的組成物。 13．個体からの細胞または組織試料と請求項12記載の診断的組成物との接触、および細胞または組織試料において請求項8または9記載の抗体または抗体断片がペプチド-MHC複合体と結合しているか否かの決定を含む、個体におけるペプチド-M HC複合体の存在をインビトロで決定する方法。 14．請求項8〜11のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片と薬学的に許容される賦形剤とを含む、不適切なT細胞反応をブロックするための薬学的組成物。 15．ウイルス、細菌および寄生虫からなる群より選択される細胞内の病原体を撲滅するための、請求項8〜11のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片と薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的組成物。 16．HLAクラスI関連疾患（強直性脊髄炎、ライター病、乾癬性脊椎炎、特発性ヘモクロマトーシス、尋常性乾癬およびベーチェット病）およびHLAクラスII関連疾患（慢性関節リウマチ、少関節型若年性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン病、IDDM、アジソン病、グレーブズ病、橋本病、小児脂肪便症、原発性胆汁性肝硬変、尋常性天疱瘡、後天性表皮水疱症、ホジキン病、子宮頸部扁平上皮癌、多発性硬化症、視神経炎、ナルコレプシー、重症筋無力症、グッドパスチャー症候群、および円形脱毛症）からなる群より選択される疾患の予防または治療のための、請求項14〜16のいずれか一項に記載の薬学的組成物の使用。 17．補体性溶解を指向することによって、ウイルス、細菌および寄生虫からなる群より選択される細胞内の病原体を撲滅するための、請求項14〜16のいずれか一項に記載の薬学的組成物の使用。