JPH11510382A - トランスケトラーゼ関連蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、トランスケトラーゼ関連蛋白質、かかる蛋白質をコードするＤＮＡおよびかかる蛋白質の製造方法に関する。また、本発明は、ＤＮＡおよび蛋白質および該蛋白質に対する抗体の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 トランスケトラーゼ関連蛋白質 本発明は、トランスケトラーゼ関連蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡおよ びその調製方法に関する。また、本発明は、該ＤＮＡおよび蛋白質の使用ならび に該蛋白質に対する抗体に関する。 トランスケトラーゼは、解糖を伴うペントースリン酸経路に共役したチアミン 依存性酵素である。ペントースリン酸経路は、糖リン酸およびＮＡＤＰＨを提供 する。トランスケトラーゼは、種々の代謝条件下でのＮＡＤＰＨの提供を保証す るために過剰の糖リン酸を解糖に導く。ＮＡＤＰＨは、脳におけるグルタチオン の維持に必須である。 チアミン欠乏症は、脚気およびヴェルニッケ−コルサコフ症候群等の神経学的 疾患を伴う。脚気は、急性心不全に現れるが、ヴェルニッケ−コルサコフ症候群 は、急性脳症その後の短期間の記憶の慢性損傷として現れる。 研究は、チアミン欠乏症が前記疾患の原因でないという事実に言及している。 また、変異したトランスケトラーゼは、例えば、ヴェルニッケ−コルサコフ症候 群に罹った患者等のこれらの疾患に罹った患者に存在していない。従って、前記 疾患の原因は、現在まで知られていない。 従って、本発明の目的は、チアミン欠乏症を伴う神経学的疾患、具体的には脚 気およびヴェルニッケ−コルサコフ症候群を、その原因に関して研究することが 可能なおよび任意に治療が可能な製品を提供することにある。 本発明によれば、このことは、請求の範囲に定義された主題により達成される 。 従って、本発明の主題は、トランスケトラーゼ関連蛋白質、少なくとも図１の アミノ酸配列または１個以上のアミノ酸がそれとは異なるアミノ酸配列を含む蛋 白質に関する。 本発明は、動物、具体的には哺乳類、より具体的にはヒトにおいて、トランス ケトラーゼ、任意にトランスケトラーゼ活性に関してホモロジーを有する蛋白質 が存在するが、通常の条件下でのハイブリダイゼーションによりＤＮＡレベルで トランスケトラーゼとは異なるという出願人の発見に基づく。かかる蛋白質は、 少なくとも図１のアミノ酸配列または１個以上のアミノ酸がそれとは異なるアミ ノ酸配列を含む。また、該蛋白質は、例えば、脳および心臓等の種々の組織で異 なる型で存在している。 前記蛋白質は、本発明において「トランスケトラーゼ関連蛋白質」（ＴＶＰ） と称する。 好ましい態様において、（ＴＶＰ）は、図２のアミノ酸配列を含む。かかる（ ＴＶＰ）は、動物、具体的には哺乳類、より具体的にはヒトの脳に特に見出され る。 さらに好ましい態様において、（ＴＶＰ）は、図３のアミノ酸配列を含む。か かる（ＴＶＰ）は、動物、具体的には哺乳類、より具体的にはヒトの心臓に特に 見出される。 本発明のさらなる主題は、（ＴＶＰ）をコードする核酸に関する。それは、Ｒ ＮＡまたはＤＮＡであってもよい。後者は、例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮ Ａであってもよい。下記： （ａ）図１のＤＮＡまたは１個以上の塩基対がそれとは異なるＤＮＡ、 （ｂ）（ａ）のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ、または （ｃ）縮重した遺伝コードを介して（ａ）または（ｂ）のＤＮＡと関連するＤＮ Ａ を含むＤＮＡが好ましい。 「ハイブリダイズするＤＮＡ」という用語は、通常の条件下、具体的にはＤＮ Ａの融点の２０℃以下で（ａ）のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡをいう。 図２および図３のＤＮＡが特に好ましい。図２のＤＮＡは、動物、具体的には 哺乳類、より具体的にはヒトの脳に特に存在する（ＴＶＰ）をコードする。図３ のＤＮＡは、動物、具体的には哺乳類、より具体的にはヒトの心臓に特に存在す る（ＴＶＰ）をコードする。図２のＤＮＡは、１９９５年５月２３日に、ＪＦＣ ３１７としてＤＳＭ９９９４のもとにＤＳＭ(Deutsche Sammlung von Mikroorga nismen und Zellkulturen)に寄託された。 本発明のＤＮＡは、以下ｃＤＮＡの型で記載する。それは、本発明に該当する すべてのＤＮＡの見本である。 本発明のｃＤＮＡの調製のためには、クローンがヒトゲノムのＸｑ２８領域を 含むｑ１Ｚ(Dietrich，A．ら、Nucleic Acids Res．19,（1991）2567-2572 を参 照）等のコスミドライブラリーを基礎として使用することが好ましい。かかるク ローンをフィルター膜に固定し、脳、筋肉、肝臓、心臓等のブタ組織のｍＲＮＡ から逆転写により得られた標識ｃＤＮＡプールとハイブリダイズさせる（Coy，J ．F.ら、Mammalian Genome 5，(1994)，131-137 を参照）。ｃＤＮＡプールとの ハイブリダイゼーションシグナルを有するこれらのクローンを、胎児脳組織およ び／または心臓組織等のヒトｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用する 。この目的のためには、ｃＤＮＡライブラリーλ−Ｚａｐ、ストラタジーン社、 カタログ番号９３６２０６が特に好ましい。本発明のｃＤＮＡが得られる。 本発明のｃＤＮＡは、ベクターおよび発現ベクターそれぞれに存在してもよい 。当業者であれは、それらの例に精通している。大腸菌の発現ベクターの場合、 例えば、ｐＧＥＭＥＸ、ｐＵＣ誘導体、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＥＴ３ｂおよびｐＱ Ｅ−８であり、後者が好ましい。酵母における発現に対しては、例えば、ｐＹ１ ００およびＹｃｐａｄ１が挙げられ、動物細胞における発現に対しては、例えば 、ｐＫＣＲ、ｐＥＦＢＯＳ、ｃＤＭ８およびｐＣＥＶ４が挙げられる。昆虫細胞 における発現に対しては、バキュロウイルス発現ベクターｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ −Ａが特に好ましい。 当業者は、発現ベクターに存在する本発明のｃＤＮＡを発現させるために好適 な細胞を公知である。かかる細胞の例としては、大腸菌株ＨＢ１０１、ＤＨ１、 χ１７７６、ＪＭ１０１、ＪＭ１０９、ＢＬ２１およびＳＧ１３００９が挙げら れ、後者が好ましく、酵母株サッカロミセス セレビシエ、動物細胞Ｌ、３Ｔ３ 、ＦＭ３Ａ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＶｅｒｏおよびＨｅＬａならびに昆虫細胞ｓｆ９ が挙げられる。 当業者は、本発明のｃＤＮＡを発現ベクターに挿入するべき方法を知っている 。また、当業者であれば、本発明のｃＤＮＡが融合蛋白質の型で発現できるよう に、他の蛋白質およびペプチドそれぞれをコードするＤＮＡと組み合わせてこの ＤＮＡを挿入できるという事実にも精通している。 さらに、当業者であれば、形質転換細胞およびトランスフェクトした細胞の培 養条件それぞれを知っている。また、当業者であれば、本発明のｃＤＮＡにより 発現した蛋白質の単離方法と精製方法にも精通している。従って、融合蛋白質で あってもよいかかる蛋白質も、本発明の主題を表す。 本発明の別の主題は、前記蛋白質および融合蛋白質それぞれに対する抗体に関 する。かかる抗体は、常法により調製することができる。それは、ポリクローナ ルまたはモノクローナルそれぞれであってもよい。その調製のために、前記（融 合）蛋白質またはその断片で、動物、ポリクローナル抗体に対しては具体的には ウサギまたはニワトリおよびモノクローナル抗体に対してはマウスを免疫するこ とが好ましい。動物のさらなる「ブースター」は、同じ（融合）蛋白質またはそ の断片で行なってもよい。次いで、動物血清および卵黄それぞれからポリクロー ナル抗体が得られる。モノクローナル抗体に関しては、動物の脾臓細胞をミエロ ーマ細胞と融合させる。 本発明は、脚気およびヴェルニッケ−コルサコフ症候群等のチアミン欠乏症を 伴う神経学的疾患の原因を研究することを可能にする。（ＴＶＰ）は、本発明の 抗体によりヒトの体液中で検出可能である。（ＴＶＰ）と前記疾患の発生および 形成との関連性が確立され得る。また、この蛋白質に対する自己抗体は、本発明 の（ＴＶＰ）により検出可能である。両検出は、常法、具体的にはウエスタンブ ロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降法または免疫蛍光法により行なうことが可能であ る。さらに、（ＴＶＰ）をコードする遺伝子の発現は、本発明の核酸、具体的に はＤＮＡおよびそれから派生するプライマーにより検出可能である。この検出は 、常法、具体的にはサザンブロットで行なうことができる。 なお、本発明は、ヒトにおける（ＴＶＰ）の存在のためのおよび存在に対する 対策をとるために適する。本発明の抗体により、ヒトにおいて（ＴＶＰ）を抑制 することができる。他方、ヒトにおける（ＴＶＰ）の量は、本発明の（ＴＶＰ） により、具体的には、トランスフェリンまたはＢＳＡ等の身体により外来性とは みなされない蛋白質への連結後増加させることができる。同様のことが、本発明 の核酸により、具体的には、脳、心臓等のある種の組織で誘導可能なプロモータ ーにより制御可能で、発現後にこれらの組織で（ＴＶＰ）の提供を生ずるＤＮＡ により同様に達成することも可能である。また、本発明の核酸、具体的にはＤＮ Ａは、（ＴＶＰ）を抑制するためにも使用することができる。この目的のために 、例えば、（ＴＶＰ）をコードする遺伝子の発現抑制のためのアンチセンスオリ ゴヌクレオチドを調製する基礎として、核酸を使用する。 従って、本発明は、チアミン欠乏症、具体的には脚気およびヴェルニッケ−コ ルサコフ症候群を伴う神経学的疾患の診断上の検出および治療上の検出に多大に 寄与する。図面の簡単な説明 ： 図１は、本発明の（ＴＶＰ）の塩基配列およびそれから派生するアミノ酸配列 を示し、 図２は、本発明の脳特異的（ＴＶＰ）の塩基配列およびそれから派生するアミ ノ酸配列（矢印は図１の（ＴＶＰ）の位置を示す）を示し、ならびに 図３は、本発明の心臓特異的（ＴＶＰ）の塩基配列およびそれから派生するア ミノ酸配列（矢印は図１の（ＴＶＰ）の位置を示す）を示す。 本発明を以下の実施例により説明する。実施例１：本発明の（ＴＶＰ）の調製および精製 本発明の（ＴＶＰ）の調製のために、図２および図３のＤＮＡそれぞれを鋳型 として使用した。ＰＣＲ法を行なった。図２のＤＮＡに関する限り、以下のプラ イマー対を使用した： ５’−ＣＡＧＡＧＡＴＣＴＡＴＧＡＧＧＴＡＣＡＡＧＣＡＧＴＣＡＧ−３’およ び ５’−ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＴＴＡＧＴＴＣＡＧＣＡＡＣＡＴＧＣ−３’。 図３のＤＮＡに関する限り、以下のプライマー対を使用した： ５’−ＣＡＧＡＧＡＴＣＴＡＴＧＴＧＧＣＧＴＡＴＣＣＡＴＧＣ−３’および ５’−ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＴＴＡＧＴＴＣＡＧＣＡＡＣＡＴＧＣ−３’。 ＰＣＲバッチとＰＣＲ条件は、それぞれ以下のとおりであった：ＰＣＲバッチ 鋳型ＤＮＡ（図１） ：１μｌ＝１ｎｇ Ｐｆｕポリメラーゼ １０ｘ緩衝液 ：１０μｌ＝１ｘ ＤＭＳＯ ：１０μｌ＝１０％ ｄＮＴＰｓ ：１μｌ＝各２００μＭ オリゴヌクレオチド、各１．５μｌ ：３μｌ＝各１５０ｎｇ Ｈ₂Ｏ再蒸留したもの ：合計９９μｌＰＣＲ条件 − ９２℃、５分 − １μｌのＰｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン社）の添加＝２．５ユニット − パラフィンの添加ＰＣＲ ９２℃ １分 ５８℃ １分 １サイクル ７２℃ １０分 ９２℃ １分 ５８℃ １分 ３９サイクル ７２℃ ２分 ７２℃ １０分 １サイクル 増幅したＤＮＡは、Ｂｇ１IIとＨｉｎｄIII それぞれで切断し、Ｂｇ１IIとＨ ｉｎｄIII で切断した発現ベクターｐＱＥ−８（Diagen社）に挿入した。発現プ ラスミドｐＱ／ＴＶＰ−Ｇ（ｐＱ／ＴＶＰ−Ｈ）が得られた。かかるプラスミド は、６個のヒスチジン残基（Ｎ末端パートナー）および本発明の図２（図３）の （ＴＶＰ）（Ｃ末端パートナー）を含む融合蛋白質をコードする。ｐＱ／ＴＶＰ −Ｇ（ｐＱ／ＴＶＰ−Ｈ）を用いて、大腸菌ＳＧ１３００９（Gottesman，S．ら 、J．Bacteriol．148，(1981)，265-273を参照）を形質転換した。該細菌を、１ ００μｇ／ｍｌのアンピシリンと２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢブロ ス中で培養し、６０μＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（Ｉ ＰＴＧ）で４時間誘導した。細菌の溶菌は、６Ｍの塩酸グアニジンの添加により 達成された。その後、クロマトグラフィー材料の製造業者（Diagen社）の指示に より８Ｍの尿素存在下で、溶菌液を用いてクロマトグラフィー（Ｎｉ−ＮＴＡ樹 脂）を行なった。結合した融合蛋白質を、ｐＨ３．５を有する緩衝液で溶出した 。中和後、融合蛋白質を１８％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、 クーマシーブルーで染色した（Thomas，J．O．とKornberg，R．D.，J．Mol．Bio l．149(1975)，709-733を参照）。 本発明の（融合）蛋白質が高度に精製された型で調製できることが示された。実施例２：本発明の抗体の調製と検出 本発明の実施例１の融合蛋白質を、１８％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気 泳動に供した。４Ｍの酢酸ナトリウムでゲルを染色後、約５９（１６．５）ｋＤ のバンドをゲルから切り出し、リン酸緩衝塩溶液中でインキュベートした。ゲル 片を沈澱させた後、上清の蛋白質濃度を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳 動その後のクーマシーブルー染色により測定した。以下のように、ゲルで精製し た融合蛋白質で動物を免疫した。ウサギにおけるポリクローナル抗体のための免疫プロトコール ０．７ｍｌのＰＢＳならびにそれぞれ０．７ｍｌのフロイントの完全アジュバ ントおよびフロイントの不完全アジュバント中の３５μｇのゲルで精製した融合 蛋白質を、１回の免疫に使用した。 ０日目 ：１回目の免疫（フロイントの完全アジュバント） １４日目：２回目の免疫（フロイントの不完全アジュバント；ｉｃＦＡ） ２８日目：３回目の免疫（ｉｃＦＡ） ５６日目：４回目の免疫（ｉｃＦＡ） ８０日目：死亡するまで出血。 イムノブロットでウサギ血清を試験した。この目的のために、本発明の実施例 １の融合蛋白質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、ニトロセルロ ースフィルターに転写した（Khyse-Andersen，J.，J．Biochem．Biophys．Meth. 10，(1984)，203-209を参照）。ボック(Bock，C.-T.)ら、Virus Genes 8，(199 4)，215-229に記載のように、ウエスタンブロット分析を行なった。この目的の ために、ニトロセルロースフィルターを、一次抗体と３７℃で１時間インキュベ ートした。この抗体は、ウサギ血清（ＰＢＳ中１：１００００）であった。ＰＢ Ｓを用いる数回の洗浄工程の後、該ニトロセルロースフィルターを二次抗体とイ ンキュベートした。この抗体は、ＰＢＳ中、アルカリホスファターゼ結合モノク ローナルヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体(Dianova社)(１：５０００)であった。３７℃ で３０分のインキュベーションを行なった後、ＰＢＳを用いる数回の洗浄工程、 次いで、発色溶液（３６μＭ ５’−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホス フェート、４００μＭニトロブルーテトラゾリウム、１００ｍＭ ｔｒｉｓ−Ｈ Ｃｌ、ｐＨ９．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂）を用いて、室 温でバンドが見えるまでアルカリホスファターゼ検出反応を行なった。 本発明のポリクローナル抗体を調製できることが示された。ニワトリにおけるポリクローナル抗体のための免疫プロトコール ０．８ｍｌのＰＢＳならびにそれぞれ０．８ｍｌのフロイントの完全アジュバ ントおよびフロイントの不完全アジュバント中の４０μｇのゲルで精製した融合 蛋白質を、１回の免疫に使用した。 ０日目 ：１回目の免疫（フロイントの完全アジュバント） ２８日目：２回目の免疫（フロイントの不完全アジュバント；ｉｃＦＡ） ５０日目：３回目の免疫（ｉｃＦＡ）。 卵黄から抗体を抽出し、ウエスタンブロットで試験した。本発明のポリクロー ナル抗体が検出された。マウスにおけるモノクローナル抗体のための免疫プロトコール ０．２５ｍｌのＰＢＳならびにそれぞれ０．２５ｍｌのフロイントの完全アジ ュバントおよびフロイントの不完全アジュバント中の１２μｇのゲルで精製した 融合蛋白質を、１回の免疫に使用した。４回目の免疫では、融合蛋白質を０．５ ｍｌ（アジュバントなし）に溶解した。 ０日目 ：１回目の免疫（フロイントの完全アジュバント） ２８日目：２回目の免疫（フロイントの不完全アジュバント；ｉｃＦＡ） ５６日目：３回目の免疫（ｉｃＦＡ） ８４日目：４回目の免疫（ＰＢＳ） ８７日目：融合。 ハイブリドーマの上清を、ウエスタンブロットで試験した。本発明のモノクロ ーナル抗体が検出された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 9/10 9/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．蛋白質が、少なくとも図１のアミノ酸配列または１個以上のアミノ酸がそれ とは異なるアミノ酸配列を含有してなるトランスケトラーゼ関連蛋白質。 ２．図２のアミノ酸配列を含有してなることを特徴とする請求項１記載の蛋白質 。 ３．図３のアミノ酸配列を含有してなることを特徴とする請求項１記載の蛋白質 。 ４．請求項１記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。 ５．ＤＮＡが、 （ａ）図１のＤＮＡまたは１個以上の塩基対がそれとは異なるＤＮＡ、 （ｂ）（ａ）のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ、または （ｃ）縮重した遺伝コードを介して（ａ）または（ｂ）のＤＮＡと関連するＤＮ Ａ を含有してなる請求項４記載のＤＮＡ。 ６．図２のＤＮＡである請求項４または５記載のＤＮＡ。 ７．図３のＤＮＡである請求項４または５記載のＤＮＡ。 ８．請求項４〜７いずれか記載のＤＮＡを含有してなる発現プラスミド。 ９．請求項８記載の発現プラスミドを含む形質転換体。 １０．好適な条件下での請求項９記載の形質転換体の培養工程を含む、請求項１ 〜３いずれか記載の蛋白質の調製方法。 １１．請求項１〜３いずれか記載の蛋白質に対する抗体。 １２．診断および／または治療のための試薬としての請求項１〜３いずれか記載 の蛋白質の使用。 １３．診断および／または治療のための試薬としての請求項４〜７いずれか記載 のＤＮＡの使用。 １４．診断および／または治療のための試薬としての請求項１１記載の抗体の使 用。