JPH11510598A - シクロデキストリン類を用い安定化した水性ステロイド免疫検定スタンダード - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 生物学的活性を有し、数ヵ月以上の貯蔵中に２から８℃の温度で酸化的分解を受ける傾向があるステロイド化合物の水性溶液は、シクロデキストリンの添加により安定化する。

Description

【発明の詳細な説明】 シクロデキストリン類を用い安定化した 水性ステロイド免疫検定スタンダード 発明の分野 水性の蛋白質含有媒体中のステロイド化合物、特に、酸素による分解を受けや すい生物学的に活性なステロイド化合物は、シクロデキストリン類の添加により 貯蔵安定性が増強される。 発明の背景 生物学的流体、例えば、ヒトの体液中の天然及び合成の生物学的に活性な化合 物の存在または量を分析する広く用いられる方法は、免疫検定法によるものであ る。問題の分析物とこの分析物を認識する抗体との相互作用を測定する。これは 、しばしば、所定の分析物の量を定量する比較的迅速且つあまり費用のかからな い方法を提供する。分析物抗体反応は、種々の技法で測定することができる。一 つの技法は、抗−分析物抗体を固相上に固定し、次いで、既知量の標識した分析 物と分析物を含有すると考えられる試料の両方と反応させる競合測定法である。 試料中の分析物は、次いで、固定化した抗体への結合に対して標識した分析物と 競合する。固定化された抗体により捕獲され た標識の量は、次いで、例えば或る型の逆の様式で、試料中に存在する分析物の 量と関係する。 全ての分析的技法は、標準（スタンダード）との比較を必要とするが、このよ うな比較は、免疫検定法では特に重要である。このような検定に用いる試薬とし ては、反応性を正確には再現できないが、所定の範囲内でのみ再現することので きる生物学的物質が挙げられる。更に、抗体とその分析物との間の免疫学的結合 は、常に制御できるとは限らない微妙な因子により影響されるかもしれない。こ の点で、正確な再現性を得る非常に苛烈な試みは、迅速且つあまり費用のかから ない測定法の目標と一致しない。 従って、免疫検定法の各実験に含まれる一つ以上の標準を提供する実験が発展 した。例えば、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａ ２０をこえる試料を分析することができる。変動性の尺度を提供するためには、 各実験で既知量の分析物を有するいくつかの試料を含むのが一般的である。この ような標準試料は、通常、対照（コントロール）として知られている。 更に、分析器をキャリブレート及び経時的に再キャリブレー トするために、既知量の分析物を有する多数の試料を提供することも一般的なこ とである。このような標準試料を、通常、キャリブレータ（検定物質）と呼ぶ。 キャリブレータおよび対照の両方にとって、その分析物を測定しようとする体 液のそれと類似した挙動を測定において示す希釈剤を用いることは、望ましいこ とであった。例えば、ヒトの血清を分析する場合、キャリブレータおよび対照は 、両方とも、適切に処理した正常なヒト血清で調製することができる。あるいは 、血清と類似した蛋白質含量を有する水性媒体、例えば、ウシ血清アルブミン（ ＢＳＡ）の緩衝化溶液を用いることができる。 ある種の目的の分析物、ステロイド類は、このような緩衝化水性蛋白質含有媒 体中で時間の経過とともに分解する傾向を示す。この傾向は、木炭処理した（ch arcoal stripped）ヒト血清中およびＢＳＡの水性溶液中の両方で観察されてき た。この点で、キャリブレータまたは対照のマトリクスまたは担体としての用途 を意図したヒト血清は、木炭処理して、存在するかもしれない内因性ステロイド を除去する。従って、最初のステロイド含量は、処理血清に秤量した量を単純に 加えることにより正確に調節することが できる。 しかしながら、木炭処理プロセスは、分析物の分解を触媒する更なる金属イオ ンをマトリクス中に導入する。木炭は、取り除くことが非常に困難であり、その 除去には数回の濾過を必要とする。多くの前処理は、非常に収率が悪い。その結 果できたマトリクスは、しばしば非常に高価で、分析物安定性に関してやや予想 不可能で、バイオハザードが生じ、ときどき入手性の問題を受けやすい。 キャリブレータ中のステロイド類の安定性を改善することを示した唯一の他の 方法は、冷凍であった。この方法は、不幸なことには、顧客利便性および、解凍 により形成する（しばしば分界と呼ばれる）微粒子に起因する測定パフォーマン ス上の問題を起こす。 従って、通常の現場条件下で拡大した貯蔵安定性を示すステロイド免疫検定法 用キャリブレータおよび対照溶液の必要性が存する。特に、約２から８℃の温度 で長期間貯蔵した場合に著しく分解しないこのような溶液の必要性が存する。こ のような溶液は、特に、６ヵ月以上安定であることが望ましい。 免疫検定法に関する他の問題は、分析物の回収率問題である。 回収率は、典型的には、実測した濃度／実際の濃度×１００％と等しいと定義さ れる。不運なことには、ステロイド類を含有する緩衝化した無蛋白質溶液は、典 型的には、しばしば２００％以上もの倍数に匹敵する過度の回収率データを示す 。このことから、蛋白質を含有するマトリクスから離れるのは不本意であった。 従って、更には、許容することのできる回収率データ、特に約１００％に等しい 回収率を示す免疫検定法に用いるステロイド類用安定化対照溶液の必要性も当業 界に存する。 発明の目的 従って、本発明の目的は、免疫検定法に用いるステロイド類の長期貯蔵性およ び安定性を提供することである。 本発明の他の目的は、ステロイド免疫検定法用キャリブレータおよび対照溶液 中にシクロデキストリンを用いることである。 本発明の更なる目的は、シクロデキストリンを用いた生物学的に活性なステロ イド化合物の安定化である。 他の目的は、約２から８℃の範囲の温度で数ヵ月間貯蔵安定性を示すステロイ ド免疫検定法用キャリブレータおよび対照溶液を提供することである。 本発明の更に別の目的は、ステロイドの回収率データに不利 に影響しない成分を用いる免疫検定法用ステロイド類の長期貯蔵のための手段を 提供することである。 発明の簡単な説明 ステロイド化合物を、シクロデキストリン類の添加により更に貯蔵安定にする 。本発明の一部として特に好ましいものは、水性溶液中で酸化による分解を受け やすくヒト体液の免疫検定法の標準化に好適である生物学的に活性なステロイド 化合物である。特に興味のあるステロイド類としては、例えば、エストラジオー ルおよびプロゲステロンのような天然に存在するホルモンステロイド類が挙げら れる。問題の水性媒体は、約６から９のｐＨに緩衝化してもよい。特に興味のあ る溶液としては、約２．５×１０^-11から１．０×１０^-7ｇ／ｍｌのステロイド 濃度および約０．１ｍＭを超える、好ましくは約０．２から２５ｍＭのシクロデ キストリン濃度を有するものが挙げられる。 シクロデキストリン類で安定化した、ステロイドキャリブレータおよび対照溶 液を用いた免疫検定法の回収率データも卓越している。 図の簡単な説明 図１は、プロゲステロン回収に対するアルファ、ベータおよ びガンマシクロデキストリンの影響のグラフである。 図２は、種々のマトリクスにおけるベーターシクロデキストリン回収の影響の グラフである。 図３は、エストラジオール測定におけるスパイク回収に対するベーターシクロ デキストリン濃度の影響のグラフである。 図４Ａは、血清および、ベーターシクロデキストリンを含有する種々のマトリ クス中のプロゲステロンの５６℃での安定性のグラフである。 図４Ｂは、血清および、ベーターシクロデキストリンを含有する種々のマトリ クス中のプロゲステロンの４５℃での安定性のグラフである。 図４Ｃは、血清および、ベーターシクロデキストリンを含有する種々のマトリ クス中のプロゲステロンの３７℃での安定性のグラフである。 図５Ａは、２−８℃で貯蔵したキャリブレータを用いて測定した冷凍パネルの プロゲステロン濃度（０−３５ｎｇ／ｍｌ）のグラフである。 図５Ｂは、２−８℃で貯蔵したキャリブレータを用いて測定した冷凍パネルの プロゲステロン濃度（０−７ｎｇ／ｍｌ）の ｙ軸を拡大したグラフである。 図６は、ベータ−シクロデキストリン含有および非含有のPlasma Diagnostic Base中のプロゲステロンの３７℃での安定性のグラフである。 発明の詳細な説明 本発明の用途に好適なステロイド類は、例えば、ステロール類、および胆汁酸 、多数のホルモン、ジギタリス化合物のような特定の天然の薬物ならびに特定の ビタミンの前駆体を含む、１７個の炭素原子を骨格として有する多数の天然に存 在する脂溶性有機化合物のいずれか一つ以上である。 本発明に関して特に興味のあるものは、ヒトにおいて生物学的活性を示し、生 物学的流体のような水性媒体中で酸化的分解を受ける傾向があるステロイド類で ある。これらのステロイド類は、免疫検定法の標的であり得、その結果としてこ のような測定法の標準として用い得る。このような標準は、免疫検定法を行おう としている生物学的流体、例えば体液と類似した媒体中の測定物に対する比較(r eference)ステロイドを提供するために、代表的には、水性媒体を用いる。これ らのステロイド類の中には、天然に存在するホルモン性ステロイド類があり、特 に興味のあるものは、正常な生物学的水準が女性ホルモンのように変動するもの である。この群の中に含まれるものは、プロゲステロン、エストロンおよびエス トラジオールである。興味のある他のステロイドとしては、コルチゾールおよび テストステロンが挙げられる。免疫検定法に用いる更に他のステロイド類は、当 業者等には自明であり、従って、それらも本発明の範囲内に入る。 トウモロコシの副産物としてのシクロデキストリン類は、免疫検定法に好適な 水性条件下で前述のステロイド類を安定化するのに非常に好ましい。特に好まし いものは、ベータ−、ガンマ−および改質したベータ−シクロデキストリンであ る。当業者等は、改質したベータ−シクロデキストリンが２−ヒドロキシ−プロ ピルベータ−シクロデキストリンであると認識するであろう。前述の化合物の中 で、ベータ−シクロデキストリンは、特に好ましい。 通常のシクロデキストリン類、特にβ−シクロデキストリン分子の環構造は、 熱塩基性溶液中での安定性、ほとんどの有機酸及びいくつかのアルファアミラー ゼ類による加水分解に対する抵抗性、酵母発酵およびベータアミラーゼ加水分解 に対する 完全な抵抗性、ならびに３００℃の著しく高い分解温度等の、類似した分子量の 範囲の非環式炭水化物のそれとは異なる性質を付与する。分子配列およびその配 列と関係した性質は、前述のシクロデキストリン類、特にβ−シクロデキストリ ンにユニークな特性：取り込まれる分子をそれらの中に包接し、保護し、その性 質のいくつかを変化さえさせる包接複合体を形成する能力を与える。β−シクロ デキストリンの疎水性内部は、例えば、ステロイド分子がその実際の構造を変化 させることなく複合化のために入っていくことができるようなものである。従っ て、β−シクロデキストリン分子は、ステロイド類のための長期貯蔵メカニズム を提供し、免疫検定法に用いられる準備ができた時にステロイド類は、その物理 的構造をそのまま現わす。これが、おそらく、β−シクロデキストリンが本発明 の用途に特に好ましいシクロデキストリンである一つの理由である。 本発明の一部してのシクロデキストリン類は、水性媒体、特に実質的に蛋白質 を含まない水性媒体中に含まれるのが非常に好ましい。免疫検定法の標準は、血 清のようなヒトの体液の挙動と類似した又はそれをまねた媒体中に含まれること がしばしば望ましいかもしれないが、ある場合には、測定しようとする ヒトの体液のそれと劇的に異なる蛋白質含量を用いることが必要である。これは 、体液の他の特徴の調整を可能にする。 水性媒体は、実質的にフィブリノーゲンを含まないことが好ましい。従って、 血漿以外の媒体を用いることが、より望ましい。この点で、微粒子を形成する成 分を含有する媒体を避けることも好ましい。 蛋白質に基づく媒体を用いるいくぶん好ましくない態様において、蛋白質濃度 は、血清では約５０ｍｇ／ｍｌが典型的であることから、約１０から３００ｍｇ ／ｍｌまたは約１から３０％の範囲であることが望ましい。２．５から２５％の 濃度範囲が更に好ましく、約２．５から５％が特に好ましい。この蛋白質含量は 、例えば正常なヒト血清中に自然に存在してもよいし、又はウシ血清アルブミン （ＢＳＡ）の水性溶液容量当たりの重量で５％になるように加えてもよい。次に 木炭処理されるPlasma Diagnostic Base(PDB)のような商業的に入手可能な製剤 も、Sera Sub(TM)と同様に用いることができる。 いずれの蛋白質溶液も実質的に内因性ステロイドがないことが好ましい。従っ て、蛋白質溶液が正常なヒトの血清である必要があるならば、木炭処理して天然 に存在するステロイド類を 除去することが最も好ましい。他方、商業的に入手可能なステロイド非含有の木 炭処理をしていないＢＳＡのような、他の技法によりステロイド類が除去されて いる蛋白質製剤を、ある場合には用いることができる。これらの中には、有機相 を用いた洗浄により得られるものがある。木炭処理は、鉄のような望ましくない 遷移金属に寄与するかもしれないと考えられる。蛋白質それ自体が、しばしば、 望ましくない遷移金属源であるかもしれないと考えられる。蛋白質は金属と複合 化して、遷移金属を含まない蛋白質を得ることを困難にすることが公知である。 必ずしも必要ではないが、水性媒体は、ヒトの体液のそれと同様のｐＨを有す ることが好ましい。水性媒体は、約６から９のｐＨを有することが特に好ましく 、７から８．５のｐＨが更に好ましい。水性媒体のｐＨは、通常ＴＲＩＳとして 知られるトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンのような、生物学的物質に用 いる、一般的緩衝剤のいずれかで容易に調整される。例として、０．１Ｍ濃度の ＴＲＩＳを用いることができる。当業者等は、これまで詳細に示さなかった濃度 範囲に従って他の緩衝剤を手に入れることができる。 問題の水性溶液のステロイド濃度は、ヒトの体液測定におい て遭遇するステロイド濃度の範囲にわたるべきである。代表的には、種々のステ ロイド類は、ｍｌ当たり約５ピコグラムからｍｌ当たり１００ナノグラムのレベ ルで測定する。特に興味があるのは、ｍｌ当たり約５×１０^-11から４×１０^-8 グラムの濃度である。 本発明の一部としてのシクロデキストリン類は、水性ステロイド溶液の酸化的 分解を阻止するのに効果的な量で用いるべきである。約０．１ｍＭの過剰量でそ れらを用いることが好ましく、約０．２から２５ｍＭの量でそれらを用いること が特に好ましい。少なくとも約１ｍＭのシクロデキストリン濃度を用いることが 特に有利である。約２５ｍＭ過剰のシクロデキストリン濃度を用いることは、限 られた有利性があると考えられる。しかしながら、費用を除いては、より高濃度 を用いるのにさほど不利益性があるとは考えられない。 本発明に用いるシクロデキストリンの特に好ましい濃度は、約２ｍＭから６ｍ Ｍの範囲であり、好ましくは約２．５ｍＭから５ｍＭである。多数の態様におい て、ステロイド調製物を安定化させるために約２．４ｍＭから約２．７ｍＭのシ クロデキストリンを用いることが特に望ましい。前述の濃度は、非常に しばしばステロイド特異的であり、従って、当業者等は、それら自身の特定の要 件に最も適した他の濃度を発見することができ、用いる特定のステロイドに依存 していくぶん変化させることができる。非常にしばしば、用いるシクロデキスト リンの非常に好ましい量は、本明細書で更に考察するように、ステロイドの１０ ０％回収を可能にするものである。 本発明の一部として用いるシクロデキストリンの濃度は、免疫検定法で問題と する特定のステロイドの回収データを損なうべきではない。対応するキャリブレ ータ溶液に用いるシクロデキストリンの特定の濃度に基づいてステロイドが約１ ００％回収されることは、きわめて好ましい。ベータ−およびガンマ−シクロデ キストリンは、ステロイドの１００％回収を可能にし、従って、更に、ステロイ ドを貯蔵する蛋白質含有マトリクスの必要性を緩和する。蛋白質は、ステロイド の分解に寄与することから、しばしば、この媒体を用いない明白な有利性が存す る。しかしながら、蛋白質に基づく媒体は、多くの場合、尚も、許容することの できる又は卓越でさえある回収データを示すことができる。 シクロデキストリン類、特にβ−シクロデキストリンにより 達成される酸化的分解の阻止は、種々の時間高温で水性ステロイド溶液にストレ スをかけ、免疫検定法により検出可能なステロイド含量の損失を観察することに より容易に評価することができる。高温試験により得られた結果は、低温で保た れたステロイド溶液の長期安定性を予測させる。 免疫検定法用のステロイド標準は、代表的には、２から８℃の温度で維持され 、好ましいことには約６ヵ月以上の安定性を有する、即ち、６ヵ月以内には著し い分解を示さない。標準は、免疫検定法で約１０パーセント未満のシグナル損失 を示すことが特に望ましく、好ましくは約５パーセント未満、更に好ましくは約 １パーセント未満である。 このような安定性は、約３７℃以上で例えば２から５週間にわたる熱老化から 容易に抜け出すことができる。４週間で約１０％未満の損失を示す組成物は、約 ６ヵ月以上安定性を有すると予想される。約２．５週後に約５％の損失を示す組 成物には同様の結果を期待することができる。 以下の実施例は、本発明を具体的に説明するものであり、請求の範囲で明確に するような本発明の範囲を制限するものと解釈すべきものではない。当業者は、 本発明の概念を応用するこ とのできる多数の他の装置および使用法を思いつくことができると考えられる。 ル測定を実施した。７５マイクロリットル（７５μｌ）の血清試料を、３５μｌ の５アルファジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）緩衝液、抗−エストラジオール 抗体で被覆した５０μｌの を３５℃で２７．５分間インキュベートした。ＤＨＴ緩衝液は、２μｇ／ｍｌの ５−アルファジヒドロテストステロン、０.７５％（ｗ／ｖ）のサポニン、０． ５Ｍのグリシン、０．２５ｍＭのクエン酸ナトリウムおよび０．１２％のメチル イソチアゾリノンから成り、全てはｐＨ４．５であった。抗−エストラジオール 抗体で被覆した微粒子（０．００５−０．０２％固形分）を、０．１Ｍのビス− （２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ− Ｔｒｉｓ）、０．１Ｍの塩化ナトリウム、１３．６％の蔗糖、０．１％のアジ化 ナトリウムおよび０．２ｍｇ／ｍｌの正常なラビットＩｇＧから成る全 ０．３ＭのＮａＣｌ、０．１ＭのＴＲＩＳ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノ メタン）、０．１％のアジ化ナトリウムから 試薬（ＤＨＴ緩衝液、ラビット抗−エストラジオール抗体で被覆した微粒子、エ ストロゲン結合物および燐酸メチルウンベリ Park，ILから商業的に入手可能であり、ＵＳ ５，３４２，７６０、ＥＰ−Ａ− ２８８ ７９３およびFiore等，Clin．Chem．34/9:1726-1732，1988に述べられ ており、それらの全てを参照より本明細書に含めるものとする。 １７５マイクロリットル（１７５μｌ）の反応混合物を、Ｉ 上に位置している。微粒子は、ファイバーマトリクスにより捕獲され、溶液は、 吸収パッドにより吸収された。微粒子を、 （６０μｌ）のステロイド−アルカリホスファターゼ結合物を マトリクスに加え、３７℃で１２秒間インキュベートし、次い アルカリホスファターゼ）は、０．１ＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、０．５Ｍの塩化ナ トリウム、１％カゼイン、１ｍＭの塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛、０ ．１％のアジ化物から成る全てｐＨ６．５の結合緩衝液中に存在する。 ０．１Ｍの２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール緩衝液（ｐＨ９）中の 燐酸４−メチルウンベリフェロンの１．２ｍＭ溶液の６５マイクロリットル（６ ５μｌ）をマトリクスに加え、４メチルウンベリフェロン形成率を蛍光反射率に より測定した。光源として水銀アーク灯を用いる蛍光分析計を具備した 34/9:1726-1732，1988に述べられているように。その内容を、参照により本明細 書に含めるものとする）。 以下の改変を除いては実施例１のエストラジオール測定と同 カートリッジでプロゲステロン測定を実施した。 ３０マイクロリットル（３０μｌ）の血清試料を、５０μｌ の抗−プロゲステロン／アルカリホスファターゼ結合物試薬、 ３５℃で１０．２分間インキュベートした。抗−フルオレセイン抗体で被覆した 微粒子５１μｌ、５０μｌのビハプテン試 ーションを３５℃で１０．２分間継続した。１８０マイクロリ リッジのファイバーマトリクスに移した。複合体を、次いで、 した。燐酸４−メチルウンベリフェロンの添加および４メチルウンベリフェロン 形成率の定量化は、実施例１で述べた通りであった。 抗−プロゲステロン抗体／アルカリホスファターゼ結合物試薬は、子ウシ腸ア ルカリホスファターゼ（Ｂoehringer Mannheim,ドイツから入手可能）およびモ ノクローナル抗−プロゲステロン抗体（Surrey大学,英国）を用いて調製した。 このホスファターゼを、イミノチオラン（Ｔｒａｕｔの試薬）で改質し、この２ つの蛋白質をマレイミド／スクシンイミド異種二官能性リンカーで結合した。結 合物試薬は、１００ｍＭのＴＲＩＳ ｐＨ７．５、５００ｍＭの塩化ナトリウム、０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウ ム、１％（ｗ／ｖ）カゼイン、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛、 および０．５ｍｇ／ｍｌのヒツジ血清を含有する。結合物の代表的作用濃度は、 抗体に関して約０．３μｇ／ｍｌである。 抗−フルオレセイン微粒子試薬を、カルボキシルで改質したラテックス微粒子 （Seradyne，Indianapolis，INから入手可能）およびモノクローナル抗フルオレ セイン抗体（Abbott）を用いて調製した。抗体を、１−エチル−３−（３−ジメ チルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）を用いて微粒子に共有結合に より結合させた。微粒子試薬は、１５０ｍＭのＴＲＩＳ ｐＨ７．２、２００ｍ Ｍの塩化ナトリウム、１３．６％（ｗ／ｖ）の蔗糖、０．１％（ｗ／ｖ）のアジ 化ナトリウム、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（ＴＭ）２０、および０．１ｍｇ ／ｍｌのマウスＩｇＧを含有する。微粒子の代表的作用濃度は、約０．０２％ラ テックス固形分である。 ビハプテン試薬は、１００ｍＭのＴＲＩＳ ｐＨ７．５、５００ｍＭの塩化ナ トリウム、０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム、１％（ｗ／ｖ）カゼイン、１ ｍＭの塩化マグネシウム、 および０．１ｍＭの亜鉛を含有する緩衝液中にプロゲステロン−１１アルファ− ヘミスクシナート−５−（アミノアセトアミド）フルオレセインを含有する。ビ ハプテンの代表的作用濃度は、５ｎＭである。 カートリッジでプロゲステロン測定を実施した。 ４２マイクロリットル（４２μｌ）の血清試料を、７６μｌの抗−プロゲステ ロン／アルカリホスファターゼ結合物試薬、 定用緩衝液６８μｌと混合した。反応混合物を３１℃で１０分間インキュベート した。１２０μｌの反応物を、次いで、実施例２から得た微粒子およびビハプテ ン試薬の両方を等量含有する試薬９５μｌに加えた。３１℃で９．２分間インキ ュベーションを継続した。１３５マイクロリットル（１３５μｌ）の反 浄し、５０μｌの燐酸４−メチルウンベリフェロンを加え、４ メチルウンベリフェロン形成率を定量化した。 抗−プロゲステロン抗体／アルカリホスファターゼ結合物試薬を、組み換えア ルカリホスファアターゼ（Abbott）を用いたことを除いては実施例２で述べた通 りに調製した。結合試薬は、１５０ｍＭのＴＲＩＳ ｐＨ６．２、２００ｍＭの 塩化ナトリウム、１８％（ｗ／ｖ）の蔗糖、０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリ ウム、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（ＴＭ）２０、および０．１ｍｇ／ｍｌの マウスＩｇＧを含有する緩衝液中に実施例２で述べたものと同様の微粒子および ビハプテンを含有する。 テロン測定における回収率の調整 プロゲステロンの回収率に対するシクロデキストリンの影響を、図１にまとめ た実験で調査した。プロゲステロンを、最終濃度４ｎｇ／ｍｌになるように血清 および種々のシクロデキストリン溶液に加えた。シクロデキストリン溶液は、１ ００ｍＭのＴＲＩＳ ｐＨ８中に０−１０ｍＭのアルファ、ベータ（３つのロッ ト、２つの販売会社）、またはガンマシクロデキストリンを含有した（シクロデ キストリンは、Sigma Chemical Co.， St．Louis，MO and ICN，Irvine，CAから入手可能である）。 （実施例２）でプロゲステロン測定法を用いて測定した。血清試料中のプロゲス テロン（４．０８ｎｇ／ｍｌ）の観察された濃度は、１００％の回収率を表す。 ベータおよびガンマシクロデキストリン試料からのプロゲステロンの回収率は、 ２０から１９０％までばらついた（回収率＝測定値／４．０８×１００％）。こ の実験に基づくと、２．７ｍＭのベータシクロデキストリンまたは１．３ｍＭの ガンマシクロデキストリンの溶液は、血清で観察されたそれと同等の回収率を示 すであろう。アルファシクロデキストリンは、この研究で調査したシクロデキス トリン濃度にわたってはプロゲステロン回収率に顕著に影響しない。 測定における種々の合成マトリクスでの回収率の調整 種々の合成キャリブレータマトリクスにおけるプロゲステロンの回収に対する シクロデキストリンの影響を、図２にまとめた実験で調査した。プロゲステロン を、最終濃度２０ｎｇ／ｍｌになるように血清および、０−１０ｍＭのベータシ クロデキストリンを含有する種々の合成キャリブレータマトリクスに加 えた。合成マトリクスは、２．５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ Miles Pentex，Kankakee，ILから入手可能）およびＳｅｒａＳｕｂ ＴＭ（Crea tive Scientific Technology，Inc，Great Neck，NYから入手可能）を含有する １００ｍＭのＴＲＩＳ ｐＨ８を含有した。これらの試料の見掛けのプロゲ 測定法を用いて測定した。２０ｎｇ／ｍｌのプロゲステロンの観察された濃度は 、１００％の回収率を表す。シクロデキストリン試料からのプロゲステロンの回 収率は、２０から３３０％までばらついた（回収率＝測定値／２０×１００％） 。１００％の回収率を達成するのに必要なシクロデキストリン濃度は、蛋白質を 含有しないマトリクス(１００ｍＭのＴＲＩＳ ｐＨ８、ＳｅｒａＳｕｂ ＴＭ ）と非常に類似している。蛋白質の存在下でのプロゲステロンの１００％回収に は、より低濃度のシクロデキストリンを必要とする。回収率の変化に対する蛋白 質およびシクロデキストリンの影響は、付加的である。高濃度の蛋白質（＞１２ ％）では、１００％回収にシクロデキストリンを必要としない（データは示さず ）。 ール測定における回収率の調整 エストラジオールの回収に対するシクロデキストリンの影響を、図３にまとめ た実験で調査した。エストラジオールを、最終濃度１ｎｇ／ｍｌになるように血 清および、０−１０ｍＭのベータシクロデキストリンを含有する１００ｍＭのＴ ＲＩＳ ｐＨ８溶液に加えた。これらの試料の見掛けのエストラジオー いて測定した。２種のエストラジオール測定フォーマットを、図３において調査 した。これらのフォーマットは、微粒子試薬中で用いるラビット抗−エストラジ オール源（ラビット５８３またはラビット５８１、Abbott）が異なった。シクロ デキストリン試料からのエストラジオールの回収率は、５から３３０％までばら ついた（回収率＝測定値（シクロデキストリン）／測定値（血清）ｘ１００％） 。この実験に基づくと、約１．５から１．７５ｍＭのベータシクロデキストリン 溶液は、血清で観察されたのと同等の回収率を示すであろう。 プロゲステロン測定におけるβ−シクロデキストリンによるプロゲステロンの安 定化 プロゲステロンの安定性に対するベータシクロデキストリンの影響を、図４Ａ −Ｃにまとめた実験で調査した。プロゲステロンを、最終濃度４ｎｇ／ｍｌにな るように血清および、２．５ｍＭのベータシクロデキストリンを含有する２つの 合成キャリブレータマトリクスに加えた。合成マトリクスは、１００ｍＭのＴＲ ＩＳ ｐＨ８およびＳｅｒａＳｕｂ（ＴＭ）であった。これらの試料を一部とり 、１７日間に至るまで５６、４５、３７または−２０℃でインキュベートした。 指示された時点で、 （実施例２）でプロゲステロン測定法を用いて測定した。これらの実験では、試 験の一部として行った同じ測定法に０ｎｇ／ｍｌの血清試料を含めた。熱ストレ スをかけた又は冷凍した試 ら得たシグナルで割り、前にこの測定法のために開発した置換曲線［比率（キャ リブレータ）／比率（０ｎｇ／ｍｌ）対濃度］上に結果をプロットすることによ り、各試験試料の濃度を決定した。損失パーセントは、冷凍およびストレス条件 間の差異を冷凍アリコートで得られた濃度で割ることにより決定する。結果は、 損失パーセント、即ち［（冷凍したもの−ストレスをか けたもの）／冷凍したもの］×１００％として示す。 シクロデキストリンを含有する試料で観察された損失パーセントは、血清で観 察されたそれよりも著しく少ない。５６℃では、９８％のプロゲステロンを血清 試料から失ったが、一方、ＴＲＩＳおよびＳｅｒａＳｕｂ ＴＭ試料は、実質的 に損失を示さなかった。 シクロデキストリン試料の組成を、これらの試料が血清のそれと同等の回収を 示すように設計した。このような条件下では過回収、可溶性および、容器壁への ステロイドの付着に関する問題があることから、これらの実験において、シクロ デキストリンを含有しない０．１ＭのＴＲＩＳまたはＳｅｒａＳｕｂ ＴＭの対 照としての使用は不適当であった。 測定におけるβ−シクロデキストリンによるプロゲステロンの安定化 プロゲステロンの長期安定性に対するベータシクロデキストリンの影響を、図 ５ＡおよびＢにまとめた実験で調査した。ベータシクロデキストリンキャリブレ ータを、１００ｍＭのＴＲＩＳ ｐＨ８中に０、０．７、２．０、７．０、２０ 、および ４０ｎｇ／ｍｌで調製し、２−８℃で貯蔵した。血清に基づくパネルを、プロゲ ステロンが安定である条件で、約１．３（低）、６（中）、および２２（高）ｎ ｇ／ｍｌで調製し、次いで、冷凍した。指示された時点で、これらのパネルのプ ロゲステロン 用いて貯蔵したキャリブレータで測定した。図５Ａおよび５Ｂのデータは、パネ ル濃度が時間中に一定のままであることを示す。２−８℃で貯蔵したキャリブレ ータ中のプロゲステロンの損失があったならば、冷凍したパネル中のプロゲステ ロンの見掛けの濃度は、上向きになったであろう。（注、１６週時点に用いたキ ャリブレータは、冷凍して貯蔵した。他の全ての時点に用いたキャリブレータは 、２−８℃で貯蔵した。）（誤差棒は、２つの標準偏差を表す、ｎ＝各時点で１ ８） 実施例９：蛋白質を含有するマトリクスにおける３７℃での によるプロゲステロンの安定化 蛋白を含有するマトリクス中のプロゲステロンの安定性に対するベータシクロ デキストリンの影響を、図６にまとめた実験で調査した。木炭処理したPlasma D iagnostic Base(PDB， Intergen Co，ニューヨーク)単独、および１．５ｍＭのβ−シクロデキストリン を含有する木炭処理したＰＤＢにプロゲステロンを最終濃度４ｎｇ／ｍｌになる ように加えた。この二番目のマトリクスでは、ＰＤＢを僅かに希釈してプロゲス テロンの回収に対するβ−シクロデキストリンの影響を相殺した。これらの試料 を一部とり、２８日間まで３７または−２０℃でインキュベートした。指示され た時点で、これらの試料の見掛けの テロン測定法を用いて測定した。プロゲステロンの濃度および損失％を算定する のに用いた方法は、実施例７と同じであった。プロゲステロンの損失％は、ＰＤ Ｂ単独よりもβ−シクロデキストリンを含有するＰＤＢが著しく少ない。３７℃ での２８日にわたるインキュベーションで、β−シクロデキストリンを含有しな いＰＤＢの５６％に対して、プロゲステロンの元の濃度の僅かに１３％しか失っ ていない。この実施例は、シクロデキストリン類、特にβ−シクロデキストリン を用いて蛋白質含有媒体中のステロイド配合組成物を安定化することができるこ とを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アイリアーテ，ベイマー・エヌ アメリカ合衆国、イリノイ・60089、バフ アロウ・グロウブ、ウエイドナー・ロー ド・696 (72)発明者 ミツチヤー，レスター・エイ アメリカ合衆国、カンサス・66047、ロー レンス、ケイソルド・ドライブ・1913

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 水性媒体中のステロイドおよびシクロデキストリンを含んで成ることを特 徴とする組成物。 ２． 実質的に蛋白質を含まない水性媒体中の、生物学的に活性なステロイドお よび、ベータ、ガンマおよび改質ベータ−シクロデキストリンから成る群から選 ばれる少なくとも１種のシクロデキストリンを含んで成る組成物。 ３． 実質的に蛋白質を含まない水性マトリクス中の、分解を受けやすい生物学 的に活性なステロイドおよびβ−シクロデキストリンを含んで成る組成物。 ４． 生物学的流体に溶解した、酸素感受性のステロイドおよびβ−シクロデキ ストリンを含んで成る組成物。 ５． 免疫検定法における用途に好適な貯蔵安定性の水性ステロイドキャリブレ ータ溶液であって、 １）酸素分解性の生物学的に活性なステロイド化合物；および ２）β−シクロデキストリンを含んで成ることを特徴とする前記溶液。 ６． 生物学的流体の免疫診断測定法のキャリブレーションに好適な貯蔵安定性 のステロイドを含有する水性溶液であって、 １）少なくとも１種のステロイド化合物；および ２）ベータ−、ガンマ−および改質ベータ−シクロデキストリンから成る 群から選ばれる少なくとも１種のシクロデキストリンを含んで成る前記溶液。 ７． ヒト血清または血漿の免疫診断測定法のキャリブレーションに好適な貯蔵 安定性のステロイドを含有する緩衝化水性溶液であって、 １）酸素分解性の生物学的に活性なステロイド化合物；および ２）β−シクロデキストリンを含んで成る前記溶液。 ８． ステロイドがエストラジオールまたはプロゲステロンである、請求項７の 組成物。 ９． ステロイドがエストラジオールである、請求項８の組成物。 １０． 水性マトリクスが実質的にフィブリノーゲンを含まない、請求項３の組 成物。 １１． 水性マトリクスが血漿以外のものである、請求項３の 組成物。 １２． 更に、ヒト血清およびウシ血清アルブミンから成る群から選ばれる蛋白 質を含んで成る、請求項１の組成物。 １３． 該ヒト血清が木炭処理されている、請求項１２の組成物。 １４． 更に、ヒト血清およびウシ血清アルブミンから成る群から選ばれる蛋白 質を含んで成る、請求項５の組成物。 １５． 該ヒト血清が木炭処理されている、請求項１４の組成物。