JPH11510686A - ＴＧＦ−βスーパーファミリーの一本鎖類縁体（モーフォン） - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーに相補的な細胞表面受容体に結合することによって、ＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーをアガナイズまたは模倣するように設計された一本鎖ポリペプチド構成物のファミリーを記述。本発明のモルフォンとよばれる一本鎖構成物は一本鎖の生物学的に活性なサブユニット中に、ＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーと結合するリセプターのリガンド結合表面に相補的な三次タンパク質構造を、相互作用により互いに画定する、フィンガー領域及びヒール領域を含む。またモルフォン構成物の切形のバージョンを記述。ＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーのあらかじめ定められたリセプターに対し結合親和力をもつ一本鎖モルフォンの製法及び用途を記述。

Description

【発明の詳細な説明】 ＴＧＦ−βスーパーファミリーの一本鎖類縁体（モーフォン）発明の背景 本発明は、ここでは「モーフォン」と呼ぶ、一つ又はそれ以上のＴＧＦ−βの スーパーファミリーメンバーの活性を模倣する、一本鎖生合成構成物のデザイン と生産に関する。 ＴＧＦ−βスーパーファミリーは、５つの異なった形態のＴＧＦ−β（Sporn and Roberts（1990）Peptide Growth Factor sand Their Receptors，Sporn and Roberts 編，Springer-Verlag ：ベルリン419-472 頁）、分化因子ｖｇ−１(We eks and Melton（1987）Cell 51: 861-867)、ＤＰＰ−Ｃポリペプチド（Padgett etal．(1987)Nature 325: 81-84）アクチビンやインヒビンのようなホルモン（ Mason et al．(1895)Nature318: 659-663;Mason et al．(1987)Growth Factors 1: 77-88）、ミュラー阻害物質、ＭＩＳ(Cate et al．(1986)Cell 45: 685-698) 、造骨及び形態形成タンパクＯＰ−１(PCT出願US90/05903)、ＯＰ−２(PCT出願U S91/07654)、ＯＰ−３(PCT出願WO94/10202)、ＢＭＰ類(米国特許 4,877,864; 5, 141,905; 5,013,649; 5,116,738; 5,108,922; 5,106,748;及び5,155,058 を参照 ）、発生学的調節タンパクＶＧＲ−１(Lyons et al．(1989)Proc．Natl．Acad． Sci．USA 86: 4554-4558)、そして成長／分化因子であるＧＤＦ−１、ＧＤＦ− ３、ＧＤＦ−９及びドーサリン−１(McPherron et al．(1993)J.Biol．Chem．26 8: 3444-4449; Basler et al．(1993)Cell 73: 687-702)を含む。 ＴＧＦ−βスーパーファミリーのタンパクは、ジスルフィド結合で結合したホ モ又はヘテロな二量体であり、疎水性のシグナル配列を含む大きな前駆体ポリペ プチド鎖として発現され、数百のアミノ酸からなる長く比較的保存性に乏しいＮ 末端のプロ領域を持ち、切断部位、ファミリーメンバー間で異なるＮ末端領域と 、より類似性が高いＣ末端領域からなる成熟ドメインを持つ。このＣ末端領域は 全てのファミリーメンバーの切断を受けた成熟タンパクに存在し、約１００のア ミノ酸を含み、特徴的なシステインのモチーフを有し、６つ又は７つの骨格シス テインが保存されている。成熟領域とプロ領域の間の切断部位はファミリーメン バーによって異なるが、全てのタンパクのＣ末端のシステインのパターンは同一 の型であり、Ｃｙｓ−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘで配列は終了する（Sporn and Roberts(19 90)，前出）。 組換えＴＧＦ−β１は、クローン化されており（Derynck et al．(1985)Natur e 316: 701-705）、チャイニーズハムスターの卵巣細胞で発現されている（Gent ry et al．(1987)Mol．Cell Biol．7: 3418-3427）。さらに組換えヒトＴＧＦ− β２(deMartin et al．(1987)EMBO J．6: 3673 ）そして組換えヒト及びブタＴ ＧＦ−β３もクローン化されている(Derynck et al.(1988)EMBO J.7: 3737-3743 ; Dijke et al．(1988)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85: 4715)。ＣＯＳ細胞に おける成熟ＴＧＦ−β１の発現のレベルは、ＴＧＦ−β１の前駆体のプロ領域に あるシステインをセリンに置き換えることで増加した（Brunner et al．(1989)J ．Biol．Chem．264: 13660-13664）。 ＴＧＦ−βスーパーファミリーの統一した生物学的な特徴は 発生学的なプロセスを調節する機能である。これらの構造的に関連するタンパク は、様々な発生学的な出来事に関連するものとして同定された。例えば、ＴＧＦ −βとインヒビン／アクチビングループは細胞の成長や分化の調節に役割を持つ と思われる。ＭＩＳは哺乳類のオスの胎児の発生の際のミュラー管の退化を引き 起こし、Drosophila decapentaplegic複合体の遺伝子産物であるｄｐｐは適切な 背部−腹部の特化に必要である。同様に、Ｖｇ−１はXenopusの中真皮の誘導に 関与し、Ｖｇｒ−１は発生中の種々のサルの組織で同定されている。ＴＧＦ−β スーパー遺伝子ファミリーの多くのタンパク、すなわちＯＰ−１とＢＭＰ類のサ ブセットは、骨形成の主たる役割を演じている。ＯＰ−１(BMP-7)と他の骨形成 タンパクは組換え技術を利用して生産されており（米国特許5,011,691 とPCT出 願US90/05903）、in vivo で本物の内軟骨の形成を誘導できることが示された。 ＢＭＰ−２は、サル由来のＣＯＳ−１細胞とチャイニーズハムスターの卵巣由来 細胞で組み換え技術を用いて製造されている（Wang et al．(1990)Proc．Natl． Acad．Sci．USA 87: 2220-2224）。 最近、SampathとReddiの骨形成アッセイにて骨形成活性があることが判ったタ ンパクのファミリーが、実際、形態形成性があることが示された。すなわち、成 熟哺乳類で組織形態形成の発生カスケードを誘導することができた（PCT出願US9 2/01968 参照）。特に、これらのタンパクは未分化前駆細胞の増殖を誘導するこ とができ、これらの刺激を受けた前駆細胞の分化を、適当な環境条件下で組織特 異的に誘導することができる。さらに、これらの形態形成原はこれらの分化した 細胞の成長と維持 を持続することができる。これらの形態形成活性は、適当な形態形成が可能な環 境において、当該タンパクに組織形態形成の発生カスケードを開始させ維持させ ることを可能にし、基幹細胞を刺激し、組織特異的に増殖、分化させ、新しい組 織形成を示す現象の進行を誘導する。これらの形態形成活性は、当該タンパクに 、予め刺激を加えて分化の道筋からはずしておいた細胞の「再分化」を誘導する ことができる。適当な環境条件の基で、これらの形態形成原は分化済み細胞の「 再分化」を刺激することができると考えられる。 ＴＧＦ−β２とＯＰ−１の三次、四次構造が、決定されている。ＴＧＦ−β２ とＯＰ−１はたったの３５％しかアミノ酸配列上の類似性がないが、三次、四次 構造は驚くほど似ている。ＴＧＦ−β２とＯＰ−１は両方とも天然では二量体で 、図１Ａに示すように、Ｃ末端の７つのシステイン残基のうち６つが関与する特 徴的な折りたたみパターンを有している。図１Ａは、それぞれのサブユニットの 中で、４つのシステインが結合し、８つの残基よりなる環を形成するように結合 し、さらに付加的な２つのシステイン残基は結び目の様な構造を形成する環を通 過してジスルフィド結合を形成する。７つの保存されたシステインのうち、最も Ｎ末端のシステインを１番とするスキームで番号を付けると、２番と６番のシス テイン残基が結合して８残基の環の一方を閉環し、３番と７番が結合して反対側 の閉環をする。１番と５番の保存システイン残基が環の中央を通過する結合をし ており、結び目の軸を形成する。４番のシステインは他のサブユニットの対応す るシステインと鎖間のジスルフィド結合をする。 ＴＧＦ−β２とＯＰ−１の一量体のサブユニットは３つの主な構造要素とＮ末 端領域からなる。構造上の要素は、５０％以上が以下のタイプの二次構造を有す る隣接するポリペプチド領域からなる、(1)ループ、(2)ら旋、及び(3βシートで ある。さらに、これらの領域においては、Ｎ末端、Ｃ末端の鎖は７オングストロ ーム以上離れていることはない。保存システイン１番と２番の間の残基は逆平行 βシートフィンガーの特徴を持つ構造領域を形成し（図1A）、以下フィンガー１ 領域と呼ぶ(F1)。フィンガー１ペプチドの骨格のリボントレースを図１Ｂに示す 。保存システイン５番と６番の間の残基も逆平行βシートフィンガーの特徴を持 つ構造領域を形成し（図1A）、以下フィンガー２領域と呼ぶ（F2）。フィンガー ２ペプチドの骨格のリボントレースを図１Ｄに示す。βシートフィンガーはアミ ノ酸の一本鎖であり、ベータターンにより自分自身に折れ返るベータ鎖と、いく つかの大きなループよりなり、入る方向の鎖と出る方向の鎖が一つかそれ以上の 逆平行βシート構造を形成する。３つ目の主要な構造領域は、図１Ａに示す保存 システインの３番と４番の間の残基も含み、３つのアルファら旋の特徴を有し、 以下ヒール領域と呼ぶ(H)。図１Ｃにヒールペプチドの骨格のリボントレースを 示す。 一量体構造の構成は左手のそれと似ていて、手のひらの位置が結び目の位置に 相当し、フィンガー１は人指し指と中指に相当し、アルファら旋は手の端に相当 し、フィンガー２は薬指と小指に相当する。Ｎ末端領域（公開された構造では明 確に定義されていない）は、大まかに言って親指の位置に相当すると予想されて いる。 ＴＧＦ−β２とＯＰ−１の二量体では、一方のサブユニットのヒール領域が他 方のサブユニットのフィンガー領域に接し、結合したサブユニットの結び目領域 が当該分子の核をなしている。４番目のシステインは第二鎖の対応する部分とジ スルフィド結合し、鎖を手のひらの中央で結合させている。このようにして形成 された二量体は、上から下方にサブユニット間の二重対象軸に添って見ると、楕 円形分子状（葉巻型）となっている（図2A）。側面から見ると分子は曲がった葉 巻に見える。なぜなら、２つのサブユニットは相互に小さな角度で配置されてい るからである（図2B）。 米国特許第 5,132,405号、第 5,091,513号、及び第 5,258,498号と、ＰＣＴ出 願US88/01737は、ライト鎖、ヘビー鎖の可変部位領域ドメインのＣ末端とＮ末端 を結合させることにより、免疫グロブリンＦｖ領域の構造を模倣する単鎖結合タ ンパクの製造方法を開示している。また、独立に機能するか協奏的に機能する異 なったタンパクのドメインを結合させて多機能タンパクを製造する方法も開示さ れている。米国特許第4,704,692 号、第4,881,175 号、第4,939,666 号、第4,94 6,778 号及び第5,260,203 号は、ペプチドのリンカーの配列を選択して異なった タンパク鎖を結合させて単鎖タンパクを製造する旨のコンピュータに基づいた技 術を開示している。発明の概要 本発明は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの単鎖構成物のファミリー（以下「 モーフォン」と呼ぶ）であり、一つ又はそれ以上のスーパーファミリーのメンバ ーの生理的効果を模倣する ものを提供する。特に、本発明のモーフォンの構造は、ＴＧＦ−βスーパーファ ミリーと特異的に結合する天然の細胞表面の受容体に選択的に結合し、モーフォ ンが結合するとＴＧＦ−βスーパーファミリーが受容体に結合した場合に起こる のと同じ現象のカスケードが開始する。 モーフォンの構造は天然のＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーのそれとは 、単鎖タンパクである点が異なり、宿主細胞の単一のＤＮＡから選択的に発現さ れるものである。天然のＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーは二量体構造 であり、一量体のサブユニットは非共有結合的相互作用又は一つかそれ以上のジ スルフィド結合で結合している。ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーは一 量体では活性を持たない。これとは対象的に、モーフォンの構造は、機能的一量 体サブユニットからなるので、天然の二量体より安定であると考えられており、 還元的条件下では特に安定であると考えられている。さらにモーフォン構成物は 、天然の二量体に比べて有意に小さな分子量を有するので、天然のスーパーファ ミリーメンバーに比べて、拡散と体内からの消失が早いと考えられる。 モーフォン構成物は、ここで開示される原理に従い、ヌクレオチドの組み合わ せやＤＮＡの制限酵素断片の結合により合成ＤＮＡを製造することで製造できる 。このようなＤＮＡで適当なタンパク発現用の細胞を形質転換し、コードされた タンパクを発現し、必要ならフォールディングを行い精製する。特定の構成物は in vitroで作用薬活性を測定できる。モーフォン候補構成物の三次構造は、本明 細書で開示する原理に支援されながら、部位特異的／ヌクレオチド配列特異的な 変異により、繰り 返し改善し結合能を調整できる。ここでいう、本明細書で開示する原理は、コン ピュータによるタンパク構造モデリングや、最近開発された対象分子の特定の性 質を改善／調節する論理的化合物デザイン技術である。既知のファージディスプ レイや他のヌクレオチド発現システムは多量の候補化合物同時に作成することに 利用できる。次に、候補構成物のプールは、結合特異性のスクリーニングにかけ ることができる。例えば、表面が固定化された受容体よりなるクロマトグラフィ ーカラム、選択のための塩の勾配による溶出、高結合能の候補の濃縮、特定の候 補がスーパーファミリーと同様の作用薬活性を有するかを見るin vitro測定であ る。有用な構成物を同定した後、商業的に有用な量の構成物を発現する細胞株の 製造を行い、実験室用、ひいては治療に有用な医薬品に供する。また、好ましい 単鎖構成物が一度同定され、上記の組換えＤＮＡ技術で分析されれば、標準的な ペプチド合成手段で製造することもできる。 現在では、単鎖アミノ酸構成物のデザイン、製造、試験方法が発見されている 。適切なフォールディングがなされると、フィンガー１領域、フィンガー２領域 、ヒール領域が決定され、合わせて、リガンドが結合するＴＧＦ−βスーパーフ ァミリーメンバーの受容体の表面に相互作用的に相補となる四次構造を生じる。 これらの構成物は、受容体に結合することでＴＧＦ−βスーパーファミリーメン バーの作用薬活性を示す。重要な事項の一つは、本構成物は細胞の分化と組織の 形態形成を開始させることである。例えば、骨形成のように、細胞を形質転換し て新組織の形成を進める。本構成物は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバー のアミノ酸配列を十分に複製するアミノ酸配 列を含み、それらは当該メンバー族の受容体に特異的に結合する。 本発明の全てのモーフォン構成物は、有用性のために必要な3つの領域を決定 するアミノ酸配列、すなわちフィンガー１、フィンガー２、そしてヒール領域、 さらにこれらの領域を結合し個々が適正な位置にあるよう維持し空間中での相対 的位置と方向を維持するするリンカー配列よりなる。当該フィンガー、ヒール領 域の配列は、ここで示されているどの既知のＴＧＦ−βスーパーファミリーメン バーの各々フィンガー、ヒール領域から複製してもよい。さらに、当該フィンガ ー、ヒール領域の配列は、以下に開示する原理に基づき今後発見される本スーパ ーファミリーの新しいメンバーのアミノ酸配列から選択してもよい。 フィンガー、ヒールそしてリンカー配列はアミノ酸の置換により変更してもよ い。例えば、Smith et al．(1990)proc．Natl．Acad．Sci．USA 87: 118-122に 開示される原理に基づき選択されたアミノ酸残基を利用することができ、本開示 は参照すことにより本明細書に援用する。Smith等は、図１０に示すアミノ酸階 級組織に類似したアミノ酸のクラスの階級組織を開示しており、これは、全体の コンフォーメーションの変化を最小にし、タンパクの不活性化が起きないような 理論的なアミノ酸の置換を行なうのに利用される。どの場合でも天然のものと７ ０％しか類似性のない、好ましくは８０％の類似性がある、特に好ましくは９０ ％の類似性がある多くの合成フィンガー１、フィンガー２、ヒール領域が活性の あるモーフォン構成物の生産に利用できる。さらに、ここに開示されているよう に、天然 のＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーのフィンガー、ヒール領域を削った形 になっているため、本構成物のサイズは減少している。そのために生ずる構造上 の変化は以下に開示するリンカーを用いて補正されている。 ここで述べるリンカーの配列は、フィンガー、ヒール領域の空間的な位置関係 を一量体サブユニットの中で結合させ、維持している。リンカー配列は、特に、 ３−１３のアミノ酸からなり、例えばシステイン構造モチーフ、即ちシステイン のパターンと結び目構造（システイン１、２、３、５、６、そして７とそれぞれ の空間での結合関係）を維持しており、これはスーパーファミリーのメンバーの 四次構造の特徴であり、維持に必須であると考えられている。以下に、適当なリ ンカー配列の選択方法について述べる。 より具体的には、本発明は機能的モーフォン構成物で、１つのフィンガー１、 １つのフィンガー２、そして１つのヒール領域が、例えば３−１３アミノ酸のペ プチドのリンカーにより結合したもので、さらにフィンガー１領域の配列がが開 始するところのシステインの上流に任意のＮ末端配列を有するものを提供する。 本発明の単鎖モーフォン構成物では、フィンガー１、フィンガー２、そしてヒー ル領域が合わせて、リガンドが結合する、ＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバ ー受容体構造の表面に相補的な構造を決定し、また、その構造はＴＧＦ−βスー パーファミリーのメンバーの配列の複製として十分で、当該構成物は当該受容体 に選択的に結合する。フィンガー１領域をＦ１、フィンガー２領域をＦ２、ヒー ル領域をＨと命名すると、このような構成物は以下の構成物の一つの形をとるこ とができ る。このような構成物は以下の構成物の一つの形をとることができる。 Ｆ１−リンカー−Ｆ２−リンカー−Ｈ； Ｆ１−リンカー−Ｈ−リンカー−Ｆ２； Ｆ２−リンカー−Ｆ１−リンカー−Ｈ； Ｆ２−リンカー−Ｈ−リンカー−Ｆ１； Ｈ−リンカー−Ｆ１−リンカー−Ｆ２；そして Ｈ−リンカー−Ｆ２−リンカー−Ｆ１； フィンガー１、フィンガー２、ヒール領域とＮ末端配列の一般及び特異的配列 については以下に開示する。 さらに本発明は、本発明のモーフォンをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡで形質 転換した細胞株、当該形質転換細胞を培養後に精製してモーフォンを製造する方 法も含む。 本発明やその種々の目的や特徴については、以下に示す図、記述、配列表、請 求項を参照することでさらに理解を深めることができる。図の簡潔な説明 図１Ａは、簡略化した線図で、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーの単 体の構造を示すのに有用である。説明に関しては、前記の発明の背景を参照され たい。図１Ｂ、１Ｃ及び１Ｄは、ある一つの角度から見たフィンガー１、フィン ガー２、ヒール領域からなる各々典型型的な二次構造の骨格のリボントレースで ある。 図２Ａ及び２Ｂは立体的ペプチド骨格リボントレースで、ＴＧＦ−βスーパー ファミリーのメンバータンパクの二量体の一 般的な三次元の形を表している。Ａ）「上」から見た図（サブユニット間の２重 対象軸を下に見て）で、ら旋状のヒール領域の軸は紙面と平行で、フィンガー１ とフィンガー２領域の軸は垂直である。Ｂ）側面から見た図で、サブユニット間 の２重対象軸は紙面上にあり、ヒールの軸は一般に水平で、フィンガーの軸は一 般に垂直である。モーフォンのデザインの中での空間的関係に関して理解を深め るために、ウォールアイド立体中の立アルファ炭素トレース図は大変有用である 。 図３Ａと３Ｂは、天然のＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーと本発明のモ ーフォン構造をそれぞれ示している。 図４Ａと４Ｂは、立体ペプチド骨格のリボントレース図であり、分子又はモー フォン構成物の半分を、それぞれ上から見たもの（図2の規定と同じ）と側面か ら見たものである。 図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃは、アミノ酸の一文字表記により、現在知られているＴ ＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーのフィンガー１、ヒール、フィンガー２ の類似性と整列比較を示した表である。ここに示されているアミノ酸は、それぞ れヒトＴＧＦ−β１からＴＧＦ−β５（TGF-ベータサブグループ）、ｄｐｐ、Ｖ ｇ−１、Ｖｇｒ−１、６０Ａ（米国出願08/271,556を参照）からなるＶｇ／ｄｐ ｐサブグループ、ＢＭＰ−２Ａ（文献ではBMP-2 としても知られている）、ドー サリン、ＢＭＰ−２Ｂ（文献ではBMP-4 としても知られている）、ＢＭＰ−３、 ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＯＰ−１（文献ではBMP-7 としても知られている）、 ＯＰ−２（PCT 出願US91/07635及び米国特許5,266,608 ）、ＯＰ−３（米国出願 US07/971,091）、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−３及びＧＤＦ−９からなるＧＤＦサブグ ループ、 インヒビンアルファとインヒビンベータＡとインヒビンベータＢからなるインヒ ビンサブグループである。ダッシュ（−）は隣接するアミノ酸間のペプチド結合 である。各サブグループのコンセンサス配列のパターンを各サブグループの下に 示した。 図６は、アミノ酸配列の一文字表記による表で、大文字でアミノ酸の標準一文 字表記を示してあり、下付きのアミノ酸表記は、当該位置で有用なアミノ酸のグ ループを示す。なお、ここで用いた下付きのアミノ酸表記は、図１０に示すパタ ーン決定キーテーブルに従い示されるアミノ酸である。図６は、本発明の生合成 構成物のフィンガー１、ヒール、フィンガー２領域の好ましい配列のパターンを 示す。ダッシュ(-)は隣接するアミノ酸どうしのペプチド結合を示す。 図７Ａ、７Ｂ及び７Ｃは、それぞれ大、中、小ペプチドを一文字表記したもの で、２４（大）、２０（中）また１２（小）のアミノ酸よりなり、これらは本発 明のモーフォン構成物に有用なフィンガー１領域を削った形のものである。さら に、図７Ａ、７Ｂ及び７Ｃは、フィンガー１領域の特定の位置において有用な特 定のアミノ酸残基（標準一文字アミノ酸表記に従った上付きの文字）又はアミノ 酸残基のグループ（図１０に記載の原理に基づいた下付きの文字）である。 図７Ｄ、７Ｅ、７Ｆそして７Ｇは立体のペプチド骨格のリボントレース図で、 それぞれ、ＴＧＦ−β２の全フィンガー１領域、大フィンガー１配列、中フィン ガー１配列、小フィンガー１配列を決定する。図７Ｅ、７Ｆ及び７Ｇにおける立 体のリボントレース図は、それぞれ、図７Ａ、７Ｂ及び７Ｃに示すＴＧＦ−β２ ペプチド配列に対応する。 図８Ａ、８Ｂ及び８Ｃは、本発明のモーフォン構成物を構成するのに有用なヒ ール領域を削った形の大、中、小ペプチドの一文字表記である。「大」配列は、 １４アミノ酸（例えばインヒビンアルファ）から１８アミノ酸（例えばインヒビ ンベータＡ）からなる。「中」ペプチドは１１から１５アミノ酸からなり、「小 」ペプチドは６から９アミノ酸からなる。ヒール領域又はその削れた形のものの 特定の位置に存在することが有用である、特定のアミノ酸残基（アミノ酸の標準 一文字表記に従った上付き文字）を指定するかアミノ酸残基のグループ（図10） に記載の原理に従った下付きの文字）を指定することで、各サブグループのパタ ーン配列が与えられる。 図８Ｄ、８Ｅ、８Ｆ及び８Ｇも立体のペプチド骨格のリボントレース図であり 、それぞれ、ＴＧＦ−β２の全ヒール領域、大ヒール配列、中ヒール配列、小ヒ ール配列を示す。図８Ｅ、８Ｆ及び８Ｇにおける立体のリボントレース図は、そ れぞれ、図８Ａ、８Ｂ及び８Ｃ示すＴＧＦ−β２ペプチド配列に対応する。 図９Ａ、９Ｂ及び９Ｃは、本発明のモーフォン構成物を構成するのに有用なフ ィンガー２領域を削った形のものである大、中、小ペプチドの一文字表記である 。「大」配列は、１６アミノ酸（例えばTGF−βサブグループのメンバー）から １８アミノ酸（例えばドーサリン）からなる。「中」ペプチドは１２から１４ア ミノ酸からなり、「小」ペプチドは８から１２アミノ酸からなる。フィンガー２ 領域又はその削れた形のものの特定の位置に存在することが有用である特定のア ミノ酸残基（アミノ酸の標準一文字表記に従った上付き文字）を指定するか、又 は アミノ酸残基のグループ（図10に記載の原理に従った下付きの文字）を指定する ことで、各サブグループのパターン配列が開示されている。 図９Ｄ、９Ｅ、９Ｆ及び９Ｇも立体のペプチド骨格のリボントレース図であり 、それぞれ、ＴＧＦ−β２の全フィンガー２領域、大フィンガー２配列、中フィ ンガー２配列、小フィンガー２配列を示す。図９Ｅ、9F及び９Ｇにおける立体の リボントレース図は、それぞれ、図９Ａ、９Ｂ及び９Ｃに示すＴＧＦ−β２ペプ チド配列に対応する。 図１０は、SmithとSmith（1990）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87: 118-122に 従って作成したパターン決定表である。 図１１は、天然ＯＰ−１の一量体（OP-1/BMP-7で示された）と、ＯＰ−１モー フォンに対応するアミノ酸配列の整列解析をした結果を一文字表記で示したもの である。参考のため、天然のＯＰ−１とＯＰ−１モーフォンの配列をフィンガー １、ヒール、フィンガー２領域に分けて示した。これら３つのドメインを結合す る追加のリンカーをリンカー１、リンカー２として示す。 図に関するさらなる特徴は、以下の記述により、単鎖の形態形成原とモーフォ ンの構造、製造方法、活性測定方法、使用方法、及び構成物の例示について開示 する。発明の詳細な説明 本発明は、天然のＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーに相補的な細胞表 面受容体に、in vivoでもin vitroでも、特異的に結合するＴＧＦ−βスーパー ファミリーのメンバーに基 づいた単鎖モーフォン構成物のファミリーを提供する。本単鎖モーフォン構成物 は、受容体に結合することでＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーの薬活性 を模倣する。 ここに開示される本発明は、文献のデータから推測したものと本発明者らと共 同研究者が産み出したデータの組み合わせに基づくものである。本発明者は、既 知のＴＧＦ−βスーパーファミリーの配列と構造の類似性を研究し、特定のスー パーファミリーのメンバーの削れた形のものや変異を導入したものを観察し、活 性を比較し、天然では別々のタンパクのドメインを結合させ生物学的に活性のあ る単鎖タンパクのデザイン、製造方法、ペプチドの使用法に関する知識を深めた 。ＴＧＦ−β２及びＯＰ−１の構造上の特徴 本発明の生合成により作られる単鎖構成物のデザインは、ＴＧＦ−β２とＯＰ −１の三次、四次構造に基づいて設計したことで促進された。ＴＧＦ−β２とＯ Ｐ−１のアミノ酸配列はたったの３６％の相同性しか示さず、またＴＧＦ−β２ とＯＰ−１が異なった生理活性を有することも考え合わせると、両分子の三次、 四次構造が実質的に同じであることは驚くべきことである。 ＴＧＦ―β２又はＯＰ−１のサブユニットは、特徴的な折りたたみパターンを を持っており、図１Ａに示すとおり、Ｃ末端の７つのシステイン残基のうち６つ が関与する。簡単に述べると、各サブユニットの４つのシステイン残基は２つの ジスルフィド結合を形成し、合わせて８残基の環を形成し、さらに、２つのシス テイン残基が結び目様の構造の環を貫くようにジスルフィド結合を形成している 。７つの保存されたシステインのう ち、最もＮ末端のシステインを１番とするスキームで番号を付けると、１番と２ 番と６番のシステイン残基が結合して８残基の環の一方を閉環し、３番と７番が 結合して反対側の閉環をする。１番と５番の保存システイン残基が環の中央を通 過する結合をしており、結び目の核を形成する。アミノ酸配列の整列解析パター ンによると、この構造上のモチーフはＴＧＦ−βスーパーファミリー間で保存さ れていると示唆されている。４番のシステインは半保存的であり、他のサブユニ ットの対応するシステインと鎖間のジスルフィド結合（ICDB）をする。 ＴＧＦ−β２とＯＰ−１の一量体のサブユニットは３つの主な構造要素とN末 端領域からなる。構造上の要素は、５０％以上が以下のタイプの二次構造を有す る隣接するポリペプチド領域からなる(1)ループ、(2)ら旋、そして(3)βシート である。さらに、それぞれの構造領域を決定する基準は、入る方向（Ｎ末端）と 出ていく方向（Ｃ末端）のペプチド鎖はかなり近く、７オングストローム以上離 れていることはないことでる。 図１Ａに示すとおり、保存システイン１番と２番の間のアミノ酸配列は、逆平 行βシートフィンガーの特徴を持つ構造領域を形成し、以下フィンガー１領域と 呼ぶ。同様に、保存システイン５番と６番の間の残基も逆平行βシートフィンガ ーの特徴を持つ構造領域を形成し、以下フィンガー２領域と呼ぶ。βシートフィ ンガーはアミノ酸の一本鎖であり、βターンにより自分自身に折れ返るベータ鎖 と、いくつかの大きなループよりなり、入る方向の鎖と出る方向の鎖が一つかそ れ以上の逆平行βシート構造を形成する。３つ目の主要な構造領域は、図１Ａに 示す保存システインの３番と４番の間の残基も含み、３つのア ルファら旋の特徴を有し、以下ヒール領域と呼ぶ。一量体構造の構成は左手のそ れに似ていて、手のひらの位置が結び目の位置に相当し、フィンガー１は人指し 指と中指に相当し、アルファヘリックスは手の端に相当し、フィンガー２は薬指 と小指に相当する。Ｎ末端領域はＴＧＦ−βスーパーファミリーの中で保存され ていないが、大まかに言って親指の位置に相当すると予想されている。 ＴＧＦ−β２一量体の主要な３つの独立した構造要素のアルファ炭素骨格の、 一方向から見たリボントレースを図１Ｂ−１Ｄに示す。特に、第一逆平行βシー ト部分からなるフィンガー１領域を図１Ｂに例示し、３つのアルファら旋ターン 部分からなるヒール領域を図１Ｃに例示し、第二および第三の逆平行βシート部 分を図１Ｄに例示する。 図２は、構造的に活性のあるＴＧＦ−β２の二量体のペプチド骨格の立体リボ ントレース図である。二量体中の二つの一量体サブユニットは対象な位置関係に あり、一方のサブユニットのヒール領域が他方のサブユニットのフィンガー領域 に接し、結合したサブユニットの結び目領域が当該分子の核をなしている。４番 目のシステインは第二鎖の対応する部分とジスルフィド結合し鎖を手のひらの中 央で結合させている。このようにして形成された二量体は、上から下方にサブユ ニット間の二重対象軸に添って見ると楕円形分子状（葉巻型）となっている（図 2A）。側面から見ると分子は曲がった葉巻に見える。なぜならば、二つのサブユ ニットは相互に小さな角度で配置されているからである（図2B）。 図２に示すように、構造上の各々の要素、２２、２２’、２ ３、２３’、２４、２４’、２５、２５’、２６そして２６’は、合わせて二量 体中の天然一量体サブユニットを決定する。ここで２２、２３、２４、２５及び ２６は一つのサブユニットにより決定され、２２’、２３’、２４’、２５’及 び２６’はもう一つのつのサブユニットに帰属する。特に２２と２２’は、Ｎ末 端領域を示し、２３と２３’はフィンガー１領域を示し、２４と２４’はヒール 領域を示し、２５と２５’はフィンガー２領域を示し、２６と２６’は結び目様 の構造を形成するそれぞれのサブユニットの保存システインの１番と５番の間の ジスルフィド結合を示す。図２を見ると、片方のサブユニットのヒール領域は他 方のものと相互作用していることが判る。例えば、２４とフィンガー１とフィン ガー２領域、また例えば、それぞれ他方のサブユニットから離れているが相互に 作用し合う２３’と２５’である。これらの３つの要素は相互に協力して、相互 作用が可能な構造、またリガンドが結合する相互作用可能な表面に相補的な構造 を決定する。本発明の生合成的単鎖構成物（モーフォン） 前述のとおり、モーフォンの構造は天然のＴＧＦ−βスーパーファミリーメン バーのそれとは、単鎖タンパクである点が異なり、宿主細胞の単一のＤＮＡから 選択的に発現されるものである。天然のＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバ ーは二量体構造であり、一量体のサブユニットは非極性結合的相互作用又は一つ かそれ以上のジスルフィド結合で結合している。ＴＧＦ−βスーパーファミリー のメンバーは二量体でのみ活性を持つ。これとは対象的に、モーフォンは、一量 体サブユニットのみで活性を持ち、一つのサブユニットは、通常は天然の二量体 では一方のサブユニットに帰属する二つのフィンガー領域と、通常は天然の二量 体では他方のサブユニットに帰属するヒール領域からなる。従って、本発明の生 合成的に作られた構成物は天然の形態形成原の二量体より安定であると考えられ ており、還元的条件下では特に安定であると考えられている。さらに、生合成的 に作られたモーフォン構成物は、天然の生物学的に活性のあるＴＧＦ−βスーパ ーファミリーメンバーより有意に小さな分子量を有するので、天然のスーパーフ ァミリーメンバーに比べて、拡散と体内からの消失が早いと考えられる。 機能的に活性のあるＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーとモーフォンの 違いを模式的に図３に示した。例えば、図３はＴＧＦ−βスーパーファミリーの メンバーの二量体を示しているが、ここで、一つのサブユニットはフィンガー１ (33)、フィンガー２（35）、ヒール領域（34）を決定しており、また、結び目領 域（36）は完全に塗りつぶしたモチーフで示されており、他のサブユニットは、 フィンガー１(33')、フィンガー２(35')、ヒール領域(34')を決定しており、結 び目領域（36'）は点のモチーフで示している。図３Ｂはモーフォン構成物で、 フィンガー１(33')、フィンガー２(35')、ヒール領域（34）を決定するが、点の モチーフで示されるフィンガー１とフィンガー２の領域は通常ＴＧＦ−βスーパ ーファミリーのメンバーの二量体の一つのサブユニットに由来し、また、完全に 塗りつぶされたモチーフで示されるように、ヒール領域は通常ＴＧＦ−βスーパ ーファミリーのメンバーの他のサブユニットに由来する。モーフォンの構成物で は、フィンガーとヒール領域は二つのポリペプチドリンカーで結合されている（ 38と39）。 本発明のモーフォン構成物は、１つのフィンガー１、１つのフィンガー２、そ して１つのヒールが、例えば３−１３アミノ酸のペプチドのリンカーにより結合 したもので、さらにフィンガー１領域の配列が開始するところのシステインの上 流に任意のＮ末端配列を有するものである。フィンガー１領域をＦ１、フィンガ ー２をＦ２、ヒールをＨと命名すると、このような構成物は、例えば以下の構成 物の一つの形をとることができる。 Ｆ１−リンカー−Ｆ２−リンカー−Ｈ； Ｆ１−リンカー−Ｈ−リンカー−Ｆ２； Ｆ２−リンカー−Ｆ１−リンカー−Ｈ； Ｆ２−リンカー−Ｈ−リンカー−Ｆ１； Ｈ−リンカー−Ｆ１−リンカー−Ｆ２；そして Ｈ−リンカー−Ｆ２−リンカー−Ｆ１； 図４は、モーフォン構成物の一例のペプチド骨格の立体のリボントレース図で ある。ここで図４Ａと４Ｂは、それぞれ、モーフォンを上と側面から見た景色で 、図２で述べたのと同じ条件である。各々のモーフォンの例示の構成要素は４２ 、４３、４４、４５、４６、４７、４８及び４９とラベルされている。ラベル４ ２はＮ末端領域を示し、ラベル４３はフィンガー１領域を示し、ラベル４４はヒ ール領域を示し、ラベル４５はフィンガー２領域を示し、ラベル４６と４７はフ ィンガーとヒール領域を結合するリンカーを示し、ラベル４８と４９はジスルフ ィド結合を示す。この図において、４８番のジスルフィド結合は、フィンガー１ 領域のＮ末端部分とフィンガー２領域のＮ末端部分を結合し、４９番のジスルフ ィド結合はフィンガー１領域のＣ末端部分とフィンガー２領域のＣ末端部分を結 合する。 理論に拘束されるわけではないが、フィンガーとヒールの要素の間の疎水的相 互作用が各々のモーフォンの四次構造を安定化していると考えられる。さらに、 操作したジスルフィド結合も同様にモーフォン構成物の折れ曲がった構造を安定 化していると考えられる。熟練した技術者であれば、本構成物をデザインする際 に、ジスルフィド結合の正確な位置を演繹的に決定する必要はないと考えられる 。なぜなら、以下に述べるように、至適安定性を持つものやと活性を有する形態 形成原構成物は従来のスクリーニング方法で分離できるからである。 フィンガーとヒール領域を決定するアミノ酸配列はどの既知のＴＧＦ−βスー パーファミリーのメンバーのフィンガーやヒール領域から複写してもよい。さら に、本発明のモーフォン構成物は、天然のＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバ ーのフィンガー、ヒール領域を削った形になっているため、サイズは減少してい る。そのために生ずる構造上の変化は、以下に示すリンカーを用いて補っている 。ここで述べた、削れた形のモーフォン構成物を以後「ミニモーフォン」と呼ぶ 。I ．フィンガーとヒール領域の選択 前述のとおり、フィンガーとヒール領域を決定するアミノ酸配列は、ここで述 べるいかなる既知のＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーのフィンガーやヒ ール領域から複写してもよいし、今後発見される新しいスーパーファミリーのメ ンバーから複写してもよい。 図５は、最近同定されたＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーのアミノ酸配 列でフィンガー１(図5A)、ヒール(図5B)、そしてフィンガー２（図5C）領域にあ てはめて整列解析した結 果を要約したものである。配列は、保存されたアミノ酸配列や二次構造を有する アミノ酸配列領域に対してでなく、最もループ構造を定義すると知られているア ミノ酸配列に対して整列解析した場合のギャップに関して最適化するコンピュー ターのアルゴリズムに従った。例えば、可能ならβシートで定義されるフィンガ ー１とフィンガー２領域、又は、アルファら旋で定義されるヒール領域のアミノ 酸配列に全くギャップを導入しないで解析することが挙げられる。ダッシュ（− ）は、隣接するアミノ酸どうしのペプチド結合を示す。各サブグループのコンセ ンサス配列を各サブグループの下に記した。 ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー各々のアミノ酸配列が整列解析され た後、その配列は、モーフォン構成物の全体の四次構造を変えることなく、他の アミノ酸又は他のアミノ酸のグループと置換できるアミノ酸残基を特定する目的 のアミノ酸配列整列解析パターンの作成に用いる。そのようなフィンガーやヒー ルの特定の位置に存在することで有用と考えられるアミノ酸又は他のアミノ酸の グループは、図１０に示すアミノ酸の階級パターン構造を取り込んだコンピュー タアルゴリズムにより決定する。 簡潔に述べると、当該アルゴリズムは４つのレベルの解析を実施する。レベル Ｉでは、アミノ酸配列の中の特定の位置のアミノ酸の存在確率が７５％以上であ るかどうかを判定する。例えば、アミノ酸配列の中のある特定の位置で、もしグ リシン残基が１０回のうち８回存在するのであれば、グリシンが当該位置のアミ ノ酸に指定される。もし、試験する位置が全てギャップであれば、ギャップを表 す文字である(-)が当該位置に指定 され、さもなければ、もし少なくとも一つのギャップが存在すれば、「ｚ」（ど の残基でもギャップでもよい）が当該位置に指定される。もし、特定の位置に７ ５％の確率で存在するアミノ酸がなければアルゴリズムはレベルII解析へと進む 。 レベルIIでは、パターンセット、ａ、ｂ、ｄ、ｌ、ｋ、ｏ、ｎ、ｉそしてｈが 定義され、ここでｌ、ｋ、そしてｏは同じアミノ酸残基を持ち合う。次に、アル ゴリズムは７５％以上のアミノ酸残基がアミノ酸配列の特定位置で、前記のパタ ーンのどれかを満足するかどうかを決定する。しかし、パターンｌとｋは同じア ミノ酸、特にアスパラギン酸を持ち合っているので、両方が同時に満たされるこ ともあり得る。同様に、パターンｋとｏも、同じアミノ酸、特にグルタミン酸を 持ち合っているので、両方が同時に指定されることもあり得る。もし、ｋとｏの 指定が同時に行なわれたら、パターンｑ（レベルIII）が当該位置に指定される 。アミノ酸配列の特定の位置をレベルIIパターンも、レベルIIIパターン、ｍと ｑのどちらも満足しないのであれば、アルゴリズムはレベルIIIの解析へと進む 。 レベルIIIは、パターンセットｃ、ｅ、ｍ、ｑ、ｐ及びｊを定義し、ここでｍ 、ｑ、そしてｐは同一のアミノ酸を持ち合う。しかし、パターンｑはレベルIII 解析では検定されない。パターンｍとｐは同じアミノ酸、特にグルタミン酸を持 ち合っているので、両方が同時に満足することもあり得る。もし、ｍとｐの指定 が同時に行われたら、パターンｒ（レベルIV）が当該位置に指定される。もし、 整列解析を実施したアミノ酸配列の中の既選択位置のアミノ酸の７５％がレベル IIIのパターンを満足するのであれば、レベルIIIパターンが当該位置に指定され る。も し、レベルIIIパターンが当該位置に指定されないのであれば、アルゴリズムは レベルIIIの解析へと進む。 レベルIVは、二つの重なり合わないパターン、ｆとｒよりなる。もしアミノ酸 配列の中の特定位置のアミノ酸の７５％がレベルIVのパターンを満足するのであ れば、そのパターンが当該位置に指定される。もしレベルIVパターンが当該位置 に指定されないのであれば、アルゴリズムはどのアミノ酸でもよい（レベルＶ） ことを示すｘを指定する。 図１０では、レベルＩは上付き文字で、天然に存在する２０のアミノ酸の一文 字表記で示されている。レベルII―IVは、下付き文字で、前出のSmith et al.の とおりのアミノ酸階級に基づいたアミノ酸のグループを定義する。図５から図９ のアミノ酸配列は前述のコンピューターアルゴリズムにより整列解析したもので ある。 もし、ある技術者が、最近同定されたＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバ ーに基づきモーフォン構成物を製造しようとすると、当該技術者は、図５に記載 のアミノ酸配列を用いて、本発明のモーフォン構成物の製造に有用なフィンガー １とフィンガー２とヒール領域を提供することができる。今後、ＴＧＦ−βスー パーファミリーのメンバーが発見された場合に、新しく発見されたメンバーのア ミノ酸配列は、図５に記載の配列と共に、手動又はコンピューターアルゴリズム のどちらかの手法で整列解析にかけられ、本発明の実用化に有用なヒールとフィ ンガー領域を定義する。 下記の表１は、我々が図５−９に記載した配列の整列解析パターンを作成した のに用いた、個々のＴＧＦ−βスーパーファ ミリーのメンバーのアミノ酸配列を記述する文献を要約したものである。 特に、本発明の実用化に有用であるフィンガー１領域を定義するアミノ酸配列 は、本明細書で示されたどのＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーの完全な フィンガー１領域から直接複製して来てもよい。有用なフィンガー１領域には下 記のものが挙げられるが、下記のものに限定されるわけではない。 TGF-β1 配列番号 1 残基 2から29、 TGF-β2 配列番号 2 残基 2から29、 TGF-β3 配列番号 3 残基 2から29、 TGF-β4 配列番号 4 残基 2から29、 TGF-β5 配列番号 5 残基 2から29、 dpp 配列番号 6 残基 2から29、 Vg-1 配列番号 7 残基 2から29、 Vgr-1 配列番号 8 残基 2から29、 60A 配列番号 9 残基 2から29、 BMP-2A 配列番号 10 残基 2から29、 BMP-3 配列番号 11 残基 2から29、 TGF-β4 配列番号 4 残基 65 から94、 TGF-β5 配列番号 5 残基 65 から94、 dpp 配列番号 6 残基 68 から98、 Vg-1 配列番号 7 残基 68 から98、 Vgr-1 配列番号 8 残基 68 から98、 60A 配列番号 9 残基 68 から98、 BMP-2A 配列番号 10 残基 67 から97、 BMP-3 配列番号 11 残基 69 から99、 BMP-4 配列番号 12 残基 67 から97 BMP-5 配列番号 13 残基 68 から98、 BMP-6 配列番号 14 残基 68 から98、 Dorsalin 配列番号 15 残基 68 から99、 OP-1 配列番号 16 残基 68 から98、 OP-2 配列番号 17 残基 68 から98、 OP-3 配列番号 18 残基 68 から98、 GDF-1 配列番号 19 残基 73 から103 GDF-3 配列番号 20 残基 67 から97、 GDF-9 配列番号 21 残基 68 から98、 Inhibin α 配列番号 22 残基 68 から101、 nhibin βA 配列番号 23 残基 72 から102 及び Inhibin βB 配列番号 24 残基 71 から101 さらに構成物のサイズは、天然のＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーのフ ィンガー、ヒール領域を削った形になっているために、有意に減少していると考 えれれる。そのために生ずる構造上の変化は以下に示すリンカーを用いて補って いる。図 ７、図８及び図９は、それぞれ、フィンガー１、ヒール、及びフィンガー２ドメ インの、好ましい削れた形のペプチドを示している。フィンガーとヒール領域の 削れた形のペプチドは、それぞれ、大ペプチド（通常約25アミノ酸の長さ）、中 ペプチド（通常約20アミノ酸の長さ）、又は小ペプチド（通常約16アミノ酸の長 さ）、と定義される。前記の大、中、小のフィンガーとヒール領域ペプチドは好 ましくは追加の残基を含む。例えばＮ末端のｃｙｓ又はｓｅｒ−ｃｙｓ、そして Ｃ末端のｃｙｓ又はｃｙｓ−ｓｅｒであり、これらは構造を安定化させるための ジスルフィド結合を本構成物に導入するためである。追加のＮ末端、Ｃ末端のセ リン残基は本構成物の水溶性を増強するが、セリン以外の極性アミノ酸残基でも 同様に、ペプチドの溶解性増強に利用できると考えられる。 特に、図７は、個々のＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーにおいて、フ ィンガー１大ペプチド（図7A）、フィンガー１中ペプチド（図7B）、フィンガー １小ペプチド（図7C）に好ましいアミノ酸配列を一文字表記で示している。以下 に詳細に述べる各サブグループのコンセンサス配列パターンは、各サブグループ の下に示した。このパターンにおいて、上付き文字は、保存されたアミノ酸の標 準一文字表記であり、上付き文字の「Ｘ」は当該位置には天然アミノ酸なら何で もよいことを示すものである。下付き文字は、図１０で示したパターン決定表に 基づいたアミノ酸のグループで、当該位置に導入しても本モーフォン構成物の構 造に影響しないものである。 図７Ｄは、全フィンガー１領域の立体のアルファ炭素のトレースを示す。図７ Ｅ、７Ｆ及び７Ｇは、それぞれ、フィンガー １の大、中、小ペプチドの立体のアルファ炭素のトレースを示す。図７Ｄでは、 ７２、７３及び７４と記された線は、それぞれ、環化されてフィンガー１領域の 大、中、小ペプチドを形成する環化アルファ炭素を通り抜けている。「’」のつ いた番号が記されている線は、環化したアルファ炭素を通り抜け、図７Ｄの同様 に番号が付された「’」が付いていない番号の線に対応する。図７Ｄ−７Ｇから 明らかなように、フィンガー１の要素の全体のサイズをちじめても、フィンガー １領域の構造の特徴は維持される。 本発明の実用化に有用であるフィンガー１大ペプチドは、本明細書で示された 、いかなるＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーに帰属するフィンガー１配 列から選択してもよい。本発明の実用化に有用なフィンガー１大ペプチドには下 記ものを含む。 TGF-β1 配列番号 1 残基 5から28、 TGF-β2 配列番号 2 残基 5から28、 TGF-β3 配列番号 3 残基 5から28、 TGF-β4 配列番号 4 残基 5から28、 TGF-β5 配列番号 5 残基 5から28、 dpp 配列番号 6 残基 5から28、 Vg-1 配列番号 7 残基 5から28、 Vgr-1 配列番号 8 残基 5から28、 60A 配列番号 9 残基 5から28、 BMP-2A 配列番号 10 残基 5から28、 BMP-3 配列番号 11 残基 5から28、 BMP-4 配列番号 12 残基 5から28 BMP-5 配列番号 13 残基 5から28、 BMP-6 配列番号 14 残基 5から28、 Dorsalin 配列番号 15 残基 5から28、 OP-1 配列番号 16 残基 5から28、 OP-2 配列番号 17 残基 5から28、 OP-3 配列番号 18 残基 5から28、 GDF-1 配列番号 19 残基 5から28、 GDF-3 配列番号 20 残基 5から28、 GDF-9 配列番号 21 残基 5から28、 Inhibin α 配列番号 22 残基 5から28、 Inhibin βA 配列番号 23 残基 5から28 及び Inhibin βB 配列番号 24 残基 5から28 さらに、本発明の実用化に有用であるフィンガー１中ペプチドは、本明細書で 示されたどのＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーに帰属するフィンガー１ 配列から選択してもよい。本発明の実用化に有用なフィンガー１中ペプチドには 下記のものを含む。 TGF-β1 配列番号 1 残基 7から26、 TGF-β2 配列番号 2 残基 7から26、 TGF-β3 配列番号 3 残基 7から26、 TGF-β4 配列番号 4 残基 7から26、 TGF-β5 配列番号 5 残基 7から26、 dpp 配列番号 6 残基 7から26、 Vg-1 配列番号 7 残基 7から26、 Vgr-1 配列番号 8 残基 7から26、 60A 配列番号 9 残基 7から26、 BMP-2A 配列番号 10 残基 7から26、 BMP-3 配列番号 11 残基 7から26、 BMP-4 配列番号 12 残基 7から26 BMP-5 配列番号 13 残基 7から26、 BMP-6 配列番号 14 残基 7から26、 Dorsalin 配列番号 15 残基 7から26、 OP-1 配列番号 16 残基 7から26、 OP-2 配列番号 17 残基 7から26、 OP-3 配列番号 18 残基 7から26、 GDF-1 配列番号 19 残基 7から26、 GDF-3 配列番号 20 残基 7から26、 GDF-9 配列番号 21 残基 7から26、 Inhibin α 配列番号 22 残基 7から26、 Inhibin βA 配列番号 23 残基 7から26 及び Inhibin βB 配列番号 24 残基 7から26 さらに、本発明の実用化に有用であるフィンガー１小ペプチドは、本明細書で 示された、いかなるＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーに帰属するフィン ガー１配列から選択してもよい。本発明の実用化に有用なフィンガー１小ペプチ ドには下記のものを含む。 TGF-β1 配列番号 1 残基 11 から22、 TGF-β2 配列番号 2 残基 11 から22、 TGF-β3 配列番号 3 残基 11 から22、 TGF-β4 配列番号 4 残基 11 から22、 TGF-β5 配列番号 5 残基 11 から22、 dpp 配列番号 6 残基 11 から22、 Vg-1 配列番号 7 残基 11 から22、 Vgr-1 配列番号 8 残基 11 から22、 60A 配列番号 9 残基 11 から22、 BMP-2A 配列番号 10 残基 11 から22、 BMP-3 配列番号 11 残基 11 から22、 BMP-4 配列番号 12 残基 11 から22 BMP-5 配列番号 13 残基 11 から22、 BMP-6 配列番号 14 残基 11 から22、 Dorsalin 配列番号 15 残基 11 から22、 OP-1 配列番号 16 残基 11 から22、 OP-2 配列番号 17 残基 11 から22、 OP-3 配列番号 18 残基 11 から22、 GDF-1 配列番号 19 残基 11 から22、 GDF-3 配列番号 20 残基 11 から22、 GDF-9 配列番号 21 残基 11 から22、 Inhibin α 配列番号 22 残基 11 から22、 Inhibin βA 配列番号 23 残基 11 から22 及び Inhibin βB 配列番号 24 残基 11 から22 ＴＧＦ−βサブグループ、ｖｇ／ｄｐｐグループ、ＧＤＦサブグループ、イン ヒビンサブグループにおける、大、中、小のサブグループのペプチドのパターン を、図７Ａ、７Ｂ及び７Ｃにそれぞれ示すが、これらも同様に、本発明の実用化 に利用できる。 図８には、個々のＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーにおいて、ヒール 大ペプチド（図8A）、ヒール中ペプチド（図8B）、ヒール小ペプチド（図8C）に 好ましいアミノ酸配列を一文字表記で示している。各サブグループのコンセンサ ス配列パターンは、各サブグループの下に示した。このパターンにおいて、上付 き文字は、保存されたアミノ酸の標準一文字表記であり、上付きき文字の「ｘ」 は当該位置には天然アミノ酸なら何でもよいことを示す。下付きき文字の「ｚ」 は当該位置には天然アミノ酸又はペプチド結合なら何でもよいことを示す。他の 下付き文字は、図１０で示したパターン決定表に基づいたアミノ酸のグループで 、予め選択した位置に導入しても本モーフォン構成物の構造に影響しないもので ある。 図８Ｄは、全ヒール領域の立体のアルファ炭素のトレースを示す。図８Ｅ、８ Ｆ及び８Ｇは、それぞれ、ヒール領域の大、中、小ペプチドの立体のアルファ炭 素のトレースを示す。図８Ｄでは、８２、８３及び８４と記された線は、それぞ れ、環化されてヒール領域の大、中、小ペプチドを形成する環化アルファ炭素を 通り抜けている。「’」のついた番号が記されている線は、環化したアルファ炭 素を通り抜け、図８Ｄの同様に番号が付された「’」がついていない番号の線に 対応する。図８Ｄ−８Ｇから明らかなように、ヒールの要素の全体のサイズを縮 じめてもヒール領域の構造の特徴は維持される。 本発明の実用化に有用であるヒール大ペプチドは、本明細書で示されたどのＴ ＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーに帰属するヒール配列から選択してもよ い。本発明の実用化に有用なヒール大ペプチドには下記ものを含む。 TGF-β1 配列番号 1 残基 46 から61、 TGF-β2 配列番号 2 残基 46 から61、 TGF-β3 配列番号 3 残基 46 から61、 TGF-β4 配列番号 4 残基 46 から61、 TGF-β5 配列番号 5 残基 46 から61、 dpp 配列番号 6 残基 49 から64、 Vg-1 配列番号 7 残基 49 から64、 Vgr-1 配列番号 8 残基 49 から64、 60A 配列番号 9 残基 49 から64、 BMP-2A 配列番号 10 残基 49 から63、 BMP-3 配列番号 11 残基 49 から65、 BMP-4 配列番号 12 残基 49 から63 BMP-5 配列番号 13 残基 49 から64、 BMP-6 配列番号 14 残基 49 から64、 Dorsalin 配列番号 15 残基 49 から64、 OP-1 配列番号 16 残基 49 から64、 OP-2 配列番号 17 残基 49 から64、 OP-3 配列番号 18 残基 49 から64、 GDF-1 配列番号 19 残基 53 から69、 GDF-3 配列番号 20 残基 49 から63、 GDF-9 配列番号 21 残基 49 から64、 Inhibin α 配列番号 22 残基 51 から64、 Inhibin βA 配列番号 23 残基 51 から68 及び Inhibin βB 配列番号 24 残基 51 から67 さらに、本発明の実用化に有用であるヒール中ペプチドは、 本明細書で示された、どのＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーに帰属する ヒール配列から選択してもよい。本発明の実用化に有用なヒール中ペプチドには 下記のものを含む。 TGF-β1 配列番号 1 残基 49 から61、 TGF-β2 配列番号 2 残基 49 から61、 TGF-β3 配列番号 3 残基 49 から61、 TGF-β4 配列番号 4 残基 49 から61、 TGF-β5 配列番号 5 残基 49 から61、 dpp 配列番号 6 残基 52 から64、 Vg-1 配列番号 7 残基 52 から64、 Vgr-1 配列番号 8 残基 52 から64、 60A 配列番号 9 残基 52 から64、 BMP-2A 配列番号 10 残基 52 から63、 BMP-3 配列番号 11 残基 52 から65、 BMP-4 配列番号 12 残基 52 から63 BMP-5 配列番号 13 残基 52 から64、 BMP-6 配列番号 14 残基 52 から64、 Dorsalin 配列番号 15 残基 52 から64、 OP-1 配列番号 16 残基 52 から64、 OP-2 配列番号 17 残基 52 から64、 OP-3 配列番号 18 残基 52 から64、 GDF-1 配列番号 19 残基 56 から69、 GDF-3 配列番号 20 残基 52 から63、 GDF-9 配列番号 21 残基 52 から64、 Inhibin α 配列番号 22 残基 54 から64、 Inhibin βA 配列番号 23 残基 54 から68 及び Inhibin βB 配列番号 24 残基 54 から67 さらに、本発明の実用化に有用であるヒール小ペプチドは、本明細書で示され た、どのTGF-ベータスーパーファミリーのメンバーに帰属するヒール配列から選 択しても良い。本発明の実用化に有用なヒール小ペプチドには下記のものを含む ； TGF-β1 配列番号 1 残基 53 から59、 TGF-β2 配列番号 2 残基 53 から59、 TGF-β3 配列番号 3 残基 53 から59、 TGF-β4 配列番号 4 残基 53 から59、 TGF-β5 配列番号 5 残基 53 から59、 dpp 配列番号 6 残基 56 から62、 Vg-1 配列番号 7 残基 56 から62、 Vgr-1 配列番号 8 残基 56 から62、 60A 配列番号 9 残基 56 から62、 BMP-2A 配列番号 10 残基 56 から61、 BMP-3 配列番号 11 残基 56 から63、 BMP-4 配列番号 12 残基 56 から61 BMP-5 配列番号 13 残基 56 から62、 BMP-6 配列番号 14 残基 56 から62、 Dorsalin 配列番号 15 残基 56 から62、 OP-1 配列番号 16 残基 56 から62、 OP-2 配列番号 17 残基 56 から62、 OP-3 配列番号 18 残基 56 から62、 GDF-1 配列番号 19 残基 60 から67、 GDF-3 配列番号 20 残基 56 から61、 GDF-9 配列番号 21 残基 56 から62、 Inhibin α 配列番号 22 残基 58 から62、 Inhibin βA 配列番号 23 残基 58 から66 及び Inhibin βB 配列番号 24 残基 58 から65 TGF-ベータサブグループ、vg/dppブグループ、GDFサブグループ、インヒビン サブグループにおける、ヒール大、中、小のサブグループのペプチドのパターン を、図8A，8B，そして8Cにそれぞれ示すが、これらも同様に、本発明の実用化に 利用できる。 図9は、個々のTGF-ベータスーパーファミリーのメンバーにおいて、フィンガ ー2大ペプチド（図9A）、フィンガー2中ペプチド（図9B）、フィンガー2小ペプ チド（図9C）に好ましいアミノ酸配列を一文字表記で示している。各サブグルー プのコンセンサス配列パターンは、各サブグループの下に示した。このパターン において、上付き文字は保存されたアミノ酸の標準一文字表記であり、上付きき 文字の「X」は当該位置には天然アミノ酸なら何でも良いことを示す。下付きき 文字の「z」は当該位置には天然アミノ酸若しくはペプチド結合なら何でも良い ことを示す。他の下付き文字は、図10で示したパターン決定表に基づいたアミノ 酸のグループで、予め選択した位置に導入しても本モーフォン構成物の構造に影 響しないものである。 図9Dは、全フィンガー2領域の立体のアルファ炭素のトレースを示す。図9E，9 F，そして9Gはそれぞれ、フィンガー2領域の大、中、小ペプチドの立体のアルフ ァ炭素のトレースを示す。図9Dでは、92，93そして94と記された線はそれぞれ、 環化され てフィンガー2領域の大、中、小ペプチドを形成する環化アルファ炭素を通り抜 けている。「'」のついた番号が記されている線は、環化したアルファ炭素を通 り抜け、図9Dの同様に番号が付された「'」がついていない番号の線に対応する 。図9D-9Gから明らかなように、フィンガー2の要素の全体のサイズを縮じめても フィンガー2領域の構造の特徴は維持される。 本発明の実用化に有用である環化されてフィンガー2大ペプチドは、本明細書 で示された、どのTGF-ベータスーパーファミリーのメンバーに帰属するフィンガ ー2配列から選択しても良い。本発明の実用化に有用なフィンガー2大ペプチドに は下記のものがあり、例えば以下のものを含む； TGF-β1 配列番号 1 残基 72 から87、 TGF-β2 配列番号 2 残基 72 から87、 TGF-β3 配列番号 3 残基 72 から87、 TGF-β4 配列番号 4 残基 72 から87、 TGF-β5 配列番号 5 残基 72 から87、 dpp 配列番号 6 残基 75 から91、 Vg-1 配列番号 7 残基 75 から91、 Vgr-1 配列番号 8 残基 75 から91、 60A 配列番号 9 残基 75 から91、 BMP-2A 配列番号 10 残基 74 から90、 BMP-3 配列番号 11 残基 76 から92、 BMP-4 配列番号 12 残基 74 から90 BMP-5 配列番号 13 残基 75 から91、 BMP-6 配列番号 14 残基 75 から91、 Dorsalin 配列番号 15 残基 75 から92、 OP-1 配列番号 16 残基 75 から91、 OP-2 配列番号 17 残基 75 から91、 OP-3 配列番号 18 残基 75 から91、 GDF-1 配列番号 19 残基 80 から96、 GDF-3 配列番号 20 残基 74 から90、 GDF-9 配列番号 21 残基 75 から91、 Inhibin α 配列番号 22 残基 77 から94、 Inhibin βA 配列番号 23 残基 79 から95 及び Inhibin βB 配列番号 24 残基 78 から94 さらに、本発明の実用化に有用であるフィンガー２中ペプチドは、本明細書で 示された、どのTGF-ベータスーパーファミリーのメンバーに帰属するフィンガー 2配列から選択しても良い。本発明の実用化に有用なフィンガー2中ペプチドには 下記のものがあり、例えば以下のものを含む； TGF-β1 配列番号 1 残基 74 から85、 TGF-β2 配列番号 2 残基 74 から85、 TGF-β3 配列番号 3 残基 74 から85、 TGF-β4 配列番号 4 残基 74 から85、 TGF-β5 配列番号 5 残基 74 から85、 dpp 配列番号 6 残基 77 から89、 Vg-1 配列番号 7 残基 77 から89、 Vgr-1 配列番号 8 残基 77 から89、 60A 配列番号 9 残基 77 から89、 BMP-2A 配列番号 10 残基 76 から88、 BMP-3 配列番号 11 残基 78 から90、 BMP-4 配列番号 12 残基 76 から88 BMP-5 配列番号 13 残基 77 から89、 BMP-6 配列番号 14 残基 77 から89、 Dorsalin 配列番号 15 残基 77 から90、 OP-1 配列番号 16 残基 77 から89、 OP-2 配列番号 17 残基 77 から89、 OP-3 配列番号 18 残基 77 から89、 GDF-1 配列番号 19 残基 82 から94、 GDF-3 配列番号 20 残基 76 から88、 GDF-9 配列番号 21 残基 77 から89、 Inhibin α 配列番号 22 残基 79 から92、 Inhibin βA 配列番号 23 残基 81 から93 及び Inhibin βB 配列番号 24 残基 80 から92 さらに、本発明の実用化に有用であるフィンガー2小ペプチドは、本明細書で 示された、どのTGF-ベータスーパーファミリーのメンバーに帰属するフィンガー 2配列から選択しても良い。本発明の実用化に有用なフィンガー2小ペプチドには 下記のものがあり、例えば以下のものを含む； TGF-β1 配列番号 1 残基 76 から83、 TGF-β2 配列番号 2 残基 76 から83、 TGF-β3 配列番号 3 残基 76 から83、 TGF-β4 配列番号 4 残基 76 から83、 TGF-β5 配列番号 5 残基 76 から83、 dpp 配列番号 6 残基 79 から87、 Vg-1 配列番号 7 残基 79 から87、 Vgr-1 配列番号 8 残基 79 から87、 60A 配列番号 9 残基 79 から87、 BMP-2A 配列番号 10 残基 78 から86、 BMP-3 配列番号 11 残基 80 から88、 BMP-4 配列番号 12 残基 78 から86 BMP-5 配列番号 13 残基 79 から87、 BMP-6 配列番号 14 残基 79 から87、 Dorsalin 配列番号 15 残基 79 から88、 OP-1 配列番号 16 残基 79 から87、 P-2 配列番号 17 残基 79 から87、 OP-3 配列番号 18 残基 79 から87、 GDF-1 配列番号 19 残基 84 から92、 GDF-3 配列番号 20 残基 78 から86、 GDF-9 配列番号 21 残基 79 から87、 Inhibin α 配列番号 22 残基 81 から90、 Inhibin βA 配列番号 23 残基 83 から91 及び Inhibin βB 配列番号 24 残基 82 から90 TGF-ベータサブグループ、vg/dppブグループ、GDFサブグループ、インヒビン サブグループにおける、フィンガー2大、中、小のサブグループのペプチドのパ ターンを、図9A，9B，そして9Cにそれぞれ示すが、これらも同様に、本発明の実 用化に利用できる。 さらに、フィンガーとヒール領域のアミノ酸配列はそれぞれ、特に、前出のSm ith et al．(1990)に開示されている原理に従い選択された置換残基を用いて、 アミノ酸置換により変えるこ とができると考えられる。簡単に述べると、Smith et al.は図10に要約したもの と同様のアミノ酸クラスの階級を開示しており、これは、理論的にアミノ酸を他 のものと置換し、同時に、当該タンパクが不活性化してしまうような全体の構造 の歪みを最小限にすることに利用できる。どの場合でも、多くの第一フィンガー 、第二フィンガー、ヒール領域で、天然の領域と70％しか類似性を持たないもの 、好ましくは80％、さらに好ましくは少なくとも90％の類似性をもつものがモー フォン構成物の製造に利用できる。 図5-9には、前出のSmith et al．(1990)に記載の原理に従って導き出された、 フィンガーとヒール領域の各々の位置において好ましいアミノ酸を示すアミノ酸 配列のパターンをも示してある。これらのパターンは、TGF-ベータ；Vg/dpp；GD F；そしてインヒビンスブグループパターンとして言及されている。各サブグル ープのフィンガー1、ヒール、フィンガー2の配列パターンを定義するアミノ酸配 列は、それぞれ、図5A、 5B,そして5Cに示してある。さらに、全TGF-ベータ、g/ ddp、GDF、そしてインヒビンのサブグループのパターンを定義するアミノ酸配列 は、それぞれ、配列認識番号25，26、27、そして28として、配列表に示す。 本分野に熟練した人間であれば、図5A、 5B,そして5Cに開示し、図6に要約し た、各サブグループの好ましいアミノ酸配列パターンを利用して、フィンガー1 、ヒール、フィンガー2要素の特定の位置に導入できる別のアミノ酸を決定でき る。上付き文字は保存されたアミノ酸の標準一文字表記であり、合わせて、フィ ンガーとヒール領域の構造と機能の要素を決定すると考 えられている。図5と6の上付き文字の「X」は当該位置には天然アミノ酸なら何 でも良いことを示す。図5と6の下付き文字の「z」は当該位置にはギャップか天 然アミノ酸なら何でも良いことを示す。下付き文字は、図10で示したパターン決 定表に基づいたアミノ酸のグループで、当該位置において有用であるアミノ酸で ある。 図5-9に示したアミノ酸配列サブグループパターンに従うと、例えば、熟練し た技術者であれば、適応可能な場合、破壊的なタンパク構造の立体化学的変化を 誘導することなく、あるアミノ酸を他に置換できることを予想できる。例えば、 図5Aでは、TGF-ベータサブグループパターンの12番の残基は、リジン残基（K ） またはグルタミン残基（Q ）が当該位置にあってもその結果できる構造に影響を 与えないと考えられる。従って、12番の位置の配列パターンは「n」を含み、こ こには、図10に従いリジンとグルタミンによりなるグループから一つのアミノ酸 を選択できる。従って、合成によって得られたフィンガー1、フィンガー2、そし てヒール領域のアミノ酸配列で、70％の類似性、好ましくは80％、さらに好まし くは最低90％の類似性を持つものが本発明の活性のある構成物の製造に利用でき ると考えられる。 これらの原理に基づき、図6 と6 に示すTGF-ベータ、g/ddp、GDF、そしてイン ヒビンのサブグルプパターンに帰属するアミノ酸配列パターンから出発して、合 成モーフォン構成物をデザインすることができると考えられる。さらに、本明細 書に記載の原理に援助され、従来の組換えDNA技術を用い、既選択アミノ酸を他 のものと置換することができ、その結果のタンパク構 成物を、作用薬活性若しくは拮抗薬活性若しくはそれらの組み合わせの試験で評 価することができる。 TGF-ベータのサブグループのパターンである配列認識番号25番は、今日までに 同定された TGF-ベータ1、TGF-ベータ2、TGF-ベータ3、TGF-ベータ4、そしてTG F-ベータ5を含む、TGF-ベータサブグループのメンバー間で共通する類似性を示 している。下記に示す一般配列は、保存されているアミノ酸（標準3文字表記） と、配列の置換可能な位置にあり、図10に記載の規則によって定義された、置換 可能なアミノ酸（Xaa）の両方を含む。 TGF- ベータのサブグループのパターン 各々のXaaは、以下に定義された特定のアミノ酸の一つ若しくはそれ以上から なるグループから、独立に選択でき、各Xaaは以下のとおり： Vg/dppのサブグループのパターンである配列認識番号26番は、今日までに同定 された dpp，vg-1，vgr-1，60A，BMP-2A(BMP-2),ドーサリン、BMP-2B(BMP-4)， BMP-3，BMP-5，BMP-5，OP-1(BMP-7)，OP-2,そしてOP-3を含む、Vg/dppサブグル ープのメンバー間で共通する類似性を示している。下記に示す一般配列は、保存 されているアミノ酸（標準3文字表記）と、配列の置換可能な位置にあり、図10 に記載の規則によって定義された、換可能なアミノ酸（Xaa）の両方を含む。 Vgg/dpp サブグループのパターン 各々のXaaは、以下に定義された特定のアミノ酸の一つ若しくはそれ以上から なるグループから、独立に選択でき、各Xaaは以下のとおり： GDFのサブグループのパターンである配列認識番号27番は、今日までに同定さ れた GDF-1，GDF-3，そしてGDF-9を含む、GDFサブグループのメンバー間で共通 する類似性を示している。下記に示す一般配列は、保存されているアミノ酸（標 準3文字 表記）と、配列の置換可能な位置にあり、図10に記載の規則によって定義された 、換可能なアミノ酸（Xaa）の両方を含む。 GDF サブグループのパターン 各々のXaaは、以下に定義された特定のアミノ酸の一つ若しくはそれ以上から なるグループから、独立に選択でき、各Xaaは以下のとおり： インヒビンのサブグループのパターンである配列番号28番は、今日までに同定 されたインヒビン-アルファ、インヒビン-ベータ-A、そしてインヒビン-ベータ- Bを含む、インヒビンサブグループのメンバー間で共通する類似性を示している 。下記に示す一般配列は、保存されているアミノ酸（標準3文字表記）と、配列 の置換可能な位置にあり、図10に記載の規則によって定義された、置換可能なア ミノ酸（Xaa）の両方を含む。 インヒビンサブグループのパターン 各々のXaaは、以下に定義された特定のアミノ酸の一つ若しくはそれ以上から なるグループから、独立に選択でき、各Xaaは以下のとおり： II．ポリペプチドリンカーの考慮 モーフォン構成物では、フィンガーとヒール領域の空間的関係を結合、維持す るポリペプチドリンカーが、システインの構造上のモチーフの維持を助けている 。構造上のモチーフとは即ち、TGF-ベータスーパーファミリーのメンバーの各サ ブユニットの四次構造を特徴づけ、維持すると考えられているシステインのパタ ーンと結び目構造である。 ポリペプチドリンカーは好ましくは2-20、より好ましくは約3-13アミノ酸の長 さであると考えられる。当該ポリペプチドリ できるのに十分な長さを有しているべきで、これは、通常のTGF-ベータスーパー ファミリーのメンバーが結合できる受容隊に結合できることで定義される。ポリ ペプチドリンカーの特定アミノ酸の組成は種々あるが、好ましくはシステイン残 基は避けるべきである。リンカー配列の中にシイステイン残基があると、結び目 構造を決定するシステイン残基とジスルフィド結合を形成し、構造上のシステイ ンのモチーフに影響すると考えられるからである。各々リンカーのアミノ酸配列 は以下の事由が全部若しくは一部の理由となり決定される；１）鋳型となるフィ ンガーとヒール領域の末端に通常存在するアミノ酸配列である；２）ンピュータ ーのアルゴリズムにより推定された関連しないアミノ酸配列で、モーフォン構成 物の空間的関係に影響することなくフィンガーとヒール領域の末端を結合するの に十分なもの；３）Gly4SerやSer4Glyのような5量体の繰り返しの全部若しくは 一部；４）以上の組み合わせ。 従って、技術者は、例えば、ベータターン鋳型となる分子で、通常フィンガー とヒール領域を結合するであろうアミノ酸配列をであるベータターンのようなア ミノ酸配列を単純に選ぶことが出きる。一方で、上記の原理に基づいて適当なヒ ールとフィンガー領域を選択した後、技術者は種々の市販のコンピューターを基 本としたアルゴリズムを利用して、フィンガーとヒール領域を結合することがで きる適当なリンカーを推定することができる。最近の市販の好ましいプログラム は、CONGEN（Bruccoleri et al．(1987)Biopolymers 26: 137）及びTWEAK（Shen k in et al．(1987)Biopolymers 26: 2053-2085）を含むが、これらに限定され る訳ではなく、また、これらの開示は参照うる ことにより本明細書に援用する。最近の市販の好ましいソフトウェアーパッケー ジには、Biosys，Incの製品であるINSIGHTII，HOMOLOGY,そしてDISCOVEを含むが 、これらに限定されるものではない。適当なリンカー配列を作るためのコンピュ ーターを基本とした他のプログラムは米国特許第4,704,692 号、第4,881，175号 、第 4,939,666号、第4,946，778号、及び第5,260,203号に開示されており、こ れらは参照するとこにより本明細書に援用する。前述のプログラムとソフトウェ アーパッケジがあれば、技術者はタンパク構造データベースから既存アミノ酸配 列を決定することができ、分子シミュレーションやｓ熱力学的計算方を利用して 、N末端とC末端と命名した二つのポリペプチド鎖の間を結合するアミノ酸配列を 構成することができる。さらに、前述の通り、技術者は単純に、適当なフィンガ ーとヒール領域を、Gly4Ser やSer4Gly のような5量体の繰り返しの全部若しく は一部一つのアミノ酸配列で結合することができる。このような繰り返しは、単 鎖抗体結合部位の構築に使われ成功を収めている。Gly4Ser やSer4Gly のような 5 量体の繰り返しのデザイン、製造、試験そして使用方法に関しては、米国特許 第 5,132,405号、第 5,091,513号、及び第5,258,498 号とＰＣＴ出願番号US8801 737 号に開示されており、参照 することにより本明細書に援用する。 合成モーフォンは、N 末端、C 末端、ポリペプチドリンカーを経由して第二の 機能タンパクのドメインに結合し、多機能タンパク構成物とすることもできる。 例えば、一つのモーフォン構成物は追加のポリペプチドリンカーにより、標的を 定めるために単鎖抗体若しくはケモカイン、ホルモントキシン、他の生 理活性機能タンパク質の結合部位に結合させるこおが可能である。このようなリ ンカーを用いた多機能タンパク質の構築については、米国特許第5,132,405 号及 び第5,091,513 号を参照。III ．モーフォンのデザインと生産 上記の如く、本発明の生合成構成物は、当業者のは公知で、完全に文書化され ている従来の組換えＤＮＡ方法により生産されるのが好ましい。 例えば構成物は合成ＤＮＡ分子を作成するのに合成核酸配列を集めて、及び／ 又はＤＮＡ制限酵素で分解したフラグメントを結合して生産することができる。 ＤＮＡ分子は、それから、例えば発現プラスミドのような発現媒体に結合し、例 えば大腸菌のような適当な宿主にトランスフェクトする。そして、ＤＮＡ分子に コードされたタンパク質が発現され、精製され、必要であれば折りたたまれ鋳型 ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーに結合親和性を有する受容体との結合 活性をin vitroで測定し、次に生合成構成物が鋳型スーパーファミリーのメンバ ーの活性を疑似するかどうかを測定する。 別の方法では、合成ＤＮＡ合成物のライブラリーは、同時に例えば、予め選択 された領域の核酸組成物と異なる合成核酸配列を集めて調製することができる。 特定のＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーを基本にしたモーフォン構成物 の生産の間に、そのようなスーパーファミリーのメンバーの適当なフィンガーと ヒール領域を当業者であれば選択することができることが意図されている（例え ば図５ー９を参照）。一度フィンガ ーとヒール領域が選択されると、この領域をコードする合成ＤＮＡを当業者は作 成することができ、引き続き、ポリペプチドリンカーをコードするリンカー配列 を結合することができる。例えば、複数の異なるリンカー配列をコードするＤＮ Ａ分子が適当な制限部位と反応条件の賢明な選択により、フィンガーとヒール配 列ををコードするＤＮＡ分子を含むライゲーション反応に加えるのであれば、当 業者は、ＤＮＡ構成物の各々がフィンガーとヒール領域をコードするが異なるリ ンカー配列により結合されているＤＮＡ構成物のライブラリーを作ることができ る。できたＤＮＡはその後適切な発現媒体、すなわちファージディスプレーライ ブラリーの調製に有用なプラスミドにライゲートし、宿主細胞にトランスフェク トし、合成ＤＮＡにコードされたポリペプチドを一群の候補化合物を作るために 発現させる。一群の候補化合物が、次に、予め選択された受容体（レセプター） に結合親和性、及び／又は選択制を有するリード化合物を同定するためにスクリ ーニングされる。 スクリーニングは表面にレセプターが固定されているクロマトグラフィーカラ ムに候補化合物を含有する溶液を通過させることにより行なうことができる。そ して、所望の結合特異性を有するリード化合物は、塩勾配（グラージェント）、 及び／又は鋳型ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーの濃度勾配による方法 で溶出される。次に、リード化合物をコードする核酸配列が単離され、特徴づけ られる。一度、リード化合物の適当な核酸配列が同定されると、リード化合物は 従来の組換えＤＮＡ技術又はペプチド合成のいずれかにより、特定の構成物が鋳 型ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーの活性を疑似する かどうかを測定するのに十分な量を調製することができる。 本発明のモーフォンをコードするＤＮＡ分子を作成するのにいずれの方法を採 用しても、リード化合物又は他の化合物の３次構造は、結合、及び／又は生物学 的活性を最適化するために、例えば、本明細書で説明されている原理、及びファ ージディスプレイ技術と核酸変異との組み合わせにより調節される。従って当業 者であれば、同時に多数の候補化合物を作り分析することができる。この方法で 作られた精製された化合物について、次に、以下に説明されるアッセーと類似す る従来の in vitro 及び／又はin vivo アッセーを用いてアゴニストかアンタゴ ニスト活性のいずれかをスクリーニングする。Ａ．遺伝子合成 所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを操作、増幅、組換えのプロセスは一 般的に当業者には公知であって、従って、本明細書では詳細については説明され ない。ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー及び同族のレセプターをコード する遺伝子を同定、単離する方法についても、よく理解されており、本明細書及 び他の文献でも説明されている。 簡単には、本明細書で開示されている生合成構成物をコードするＤＮＡの構築 はブラント端や接着端を作るのにＤＮＡの配列特異的切断をする各種の制限酵素 、ＤＮＡリガーゼ、接着端をブラント端に酵素的に付加する技術、短い、又は中 くらいの長さのオリゴヌクレオチドを組み合わせることによる合成ＤＮＡの構築 、ｃＤＮＡ技術、ライブラリーからの適当な核酸配列を増幅するポリマラーゼチ ェーンリアクション(PCR)技術、及びＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー や同族のレセプタ ーの遺伝子を単離するための合成プローブなどを含む公知の技術を用いて達成で きる。発現を達成するのに用いられるいくつかの、及び他の制御配列の名前の細 菌、哺乳類及び昆虫からの各種のプロモーター配列や各種の宿主細胞もまた公知 であり入手できる。従来のトランスフェクション技術、及び等しく従来のＤＮＡ クローン化及びサブクローン化技術も本発明の実施に有用で当業者には公知であ る。プラスミド、動物ウイルスを含むウイルス、及びバクテリオファージなどの 各種のベクターが用いられる。ベクターについては、ファミリーのクローンがベ クターの組換えＤＮＡにうまく組み込まれたかどうかを同定するのに用いること ができる検出可能な形態的な性質をうまくトランスフェクトされた細胞に付与す る各種のマーカー遺伝子を活用することができる。本明細書で開示される生合成 構成物をコードするＤＮＡを得る一つの方法は、従来の自動化オリゴヌクレオチ ド合成機によって作られた合成ＤＮＡを組み合わせ、適当なリガーゼでライゲー ションすることである。例えば、２重鎖になる相補的ＤＮＡフラグメントをライ ゲーションの間の重合を防ぐために末端はリン酸化されないようにしたリン酸ア ミダイト化学を用いて、合成することができる。合成ＤＮＡの一端は特定の制限 酵素エンドヌクレアーゼの作用部位に相当する接着端を残している。相補的ＤＮ Ａフラグメントは合成ＤＮＡ構成物を調製するのにライゲーションされる。 フィンガーとヒール領域１、及びフィンガーとヒール領域２をコードする核酸 鎖を例えば、Sambrook et al（1989）"Molecular Cloning" Coldspring Harbor Laboratories Press，NY、に記載されているコロニーハイブリダイゼーション法 、及び／ 又はInnis et al（1990）"PCR Protocols,A guide to methods and applocation s"，Academic Press.に記載のＰＣＲ増幅法等により核酸ライブラリーより単離 することができる。フィンガーとヒール領域をコードする核酸はその後所望の生 合成一本鎖モーフォン構成物をコードする合成ＤＮＡを作るのに合わせて結合す る。 しかしながら、複数のモーフォンをコードするＤＮＡ構成物のライブラリーは 同時に上記のような標準的な組換えＤＮＡ技術により作ることができることが理 解できる。例えば、熟練した当業者はカセット変異やオリゴヌクレオチド特異的 変異により、例えば、予め特定された位置に異なるＤＮＡ配列を含有する、例え ばリンカー配列をコードするＤＮＡカセットのような一連のＤＮＡ構成物を作る ことができる。できたＤＮＡ構成物のライブラリーは、次に、例えば、ファージ ディスプレイライブラリー（III節を参照）で発現され、特定のレセプターと結 合するいずれのタンパク質も、表面に固定化レセプターを有するクロマトグラフ ィー用カラム（III節を参照）を用いて、親和性により単離することができる。 予め選択されたレセプターに結合する分子が単離されたら、その結合、及びアゴ ニスト的性質を以下のＶ節で議論されている実験的、精製技術を用いて調節する 。Ｂ．タンパク質発現 所望の一本鎖ＤＮＡ構成物が合成されたら、発現ベクターに組み込み、タンパ ク質発現に適当な宿主細胞にトランスフェクトする。有用な前核宿主細胞として は、限定するものではないが、大腸菌及び枯草菌などがある。有用な真核宿主細 胞として は、限定するものではないが、酵母細胞、昆虫細胞、繊維芽細胞３Ｔ３、サル細 胞、ＣＯＳ細胞、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞、ミンク肺上皮細胞、ヒ ト包皮繊維芽細胞、ヒトグリア芽細胞、悪性上皮腫細胞などがある。また、合成 遺伝子はウサギ網状赤血球ライゼート系のような無細胞系で発現することもでき る。 ベクターはさらに転写プロモーター、終止配列、エンハンサー配列、好ましい リポゾーム結合部位配列、好ましいｍＲＮＡリーダー配列、好ましいタンパク質 プロセッシング配列、好ましいタンパク質分泌シグナル配列を含む組換えタンパ ク質の正しい発現を促進する各種の配列も含まれる。所望の遺伝子をコードする ＤＮＡ配列を阻害の可能性のある配列の除去や好ましくない２次構造形成の最小 化芽できるように操作することができる。モーフォンタンパク質は融合タンパク 質としても発現することができる。翻訳後、タンパク質を細胞自身から精製し、 又は培地から回収し、所望のように、特異的なプロテアーゼで分解することがで きる。 例えば遺伝子が大腸菌で発現されるのであれば、適当なベクターにクローン化 する。これは、ＴｒｐやＴａｃ、及び／又はタンパク質ＡのフラグメントＢ(FB) のようなリーダーペプチドをコードする遺伝子のプロモーター配列の下流に工学 的に作られた遺伝子を配置することにより達成することができる。発現の間、で きた融合タンパク質は細胞の細胞質のＲ体に蓄積し、フレンチプレスか、超音波 で細胞を破砕した後収穫される。単離したＲ体をその後、可溶化し発現タンパク 質を折りたたみ、必要であれば多くの他の組換えタンパク質について既に確立さ れた方法でリーダー配列を分解する。 真核細胞での工学的に作られた遺伝子を発現するのには、トランスフェクトさ れやすく、外来遺伝子を再配列しないで安定に維持することができ、効率のよい 転写、翻訳、翻訳後修飾に必要な細胞成分を有する細胞、及び細胞株が必要であ る。さらに、所望の遺伝子を運ぶ適切なベクターも必要である。哺乳動物の細胞 にトランスフェクトするＤＮＡベクターのデザインはKozak コンセンサス配列の ような翻訳効率を高める配列のみならず、適当な転写開始、終止及びエンハンサ ー配列を含む本明細書に説明されているように所望の遺伝子の発現を促進する適 当な配列を含む必要がある。好ましいＤＮＡベクターは、マーカー遺伝子や所望 の遺伝子のコピー数を増幅する手段も含む。有用な細胞を含む哺乳動物の細胞で の外来タンパク質を産生する技術、タンパク質発現促進配列、マーカー遺伝子、 遺伝子増幅法の詳細な解説は Bending（1988）Genetic Engineering 7: 91-127 に記載されている。 特定の哺乳動物細胞での外来遺伝子の発現に有用な最もよく特徴づけられた転 写プロモーターはＳＶ４０アーリープロモーター、アデノウイルスプロモーター (AdMLP)、マウスメタロチオネンーＩ プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV) 、長期繰り返し構造(LTP)、マウス哺乳類腫瘍ウイルス長期繰り返し構造(MMTV-L TR)、ヒトサイトメガロウイルス主要中間ーアーリープロモーター(hCMV)である 。これらの全てのプロモーター配列は、当業者には公知で、市販品として入手で きる。 選択可能なｄｈｆｒ細胞株のＤＨＦＲ遺伝子を利用することは哺乳動物の細胞 系での遺伝子増幅に有用な方法としてよく特 徴づけられている。簡単には、ＤＨＦＲ遺伝子は所望の遺伝子を運ぶベクターに 与えられ、ＤＨＦＲにより代謝される殺細胞性のメトトレキセートの濃度の増加 により、所望の関連する遺伝子のコピー数のみならず、ＤＨＦＲ遺伝子のコピー 数を増幅するようになる。トランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣 細胞株での選択可能な、増幅しうるマーカー遺伝子としてＤＨＦＲは特に当業者 ではよく特徴づけられている。他の有用な、増幅可能なマーカー遺伝子にはアデ ノシンデアミナーゼ(ADA)及びグルタミンシンセターゼ遺伝子が含まれる。 細胞や細胞株の選択は重要で、実験者のニーズに依存する。ＣＯＳ細胞は高レ ベルの一時的な遺伝子発現を提供し、本発明の生合成構成物の早いスクリーニン グには有用な手段である。ＣＯＳ細胞は一般的には所望の遺伝子を運ぶサルウイ ルス(SV-40)ベクターでトランスフェクトされる。トランスフェクトされたＣＯ Ｓ細胞は最後には死亡し、このように長期間の所望のタンパク質産生は抑えられ る。しかしながら、一時的な発現は安定な細胞株の開発に必要な時間のかかるプ ロセスではなく、構成物の結合活性を予備的に測定するのに有用な技術である。 本発明の一本鎖構成物の哺乳動物細胞での発現に有用な各種の細胞、細胞株、 ＤＮＡ配列は当業者によく特徴づけられ容易に入手できる。他のプロモーター、 選択可能なマーカー、遺伝子増幅方法及び細胞も、本発明のタンパク質の発現に 使用することができる。組換えタンパク質のトランスフェクション、発現、及び 精製は当業者にはよく文書化され、当分野の通常の技術を有する人に理解されて いる。哺乳動物細胞での外来遺伝子の発現系に使用される各ステップの各種の技 術的な局面に関す る更なる詳細は、例えば、F．M．Ausubel et al，Corrent Protocols in Molecu lar Biology，John Wiley & Sons，New York(1989)のように、当業者の多数のテ キストや実験マニュアルに書かれている。IV ．結合及び生物学的活性スクリーニング 用いられる細胞の型によるが、モーフォン構成物をコードするＤＮＡは折りた たまれた、又は折りたたまれていないコンフォーメーションを有するモーフォン を産生するように発現させることができる。例えば、モーフォンは、骨髄腫細胞 のような宿主細胞で産生される間に活性型のコンフォーメーションと同時に折り たたまれることが理解できる。しかしながら、大腸菌のように前核生物体での発 現の間にはタンパク質は封入体と呼ばれる、折りたたまれないタンパク質の集合 体を形成する。封入体は一度収穫されると、生物学的に活性なタンパク質コンフ ォーメーションを産生する標準的な変性及び再生条件にin vitroで従う。 どのタンパク質発現、収穫、必要に応じてはフォールディング方法が利用され ようと、予め選択されたレセプターに選択的に結合するタンパク質は次に標準的 な方法、すなわち、当業者によく知られ完全に文書化されているリガンド／レセ プター結合アッセーを用いて同定することができる。例えば、Legerski et al． (1992)Biochem．Biophys．Res．Comm．183: 672-679; Frakar et al．(1978)Bio chem．biophys．Res．Comm 80 849-857; Chio et al．(1990)Nature 343: 266-2 69; Dahlman et al．(1988)Biochem．27: 1813-1817; Strader et al，(1989)J. Biol．Chem．264: 13572-13588; 及び D'Dowd et al,m(198 9)J．Biol．Chem．263: 15989-15992; を参照されたい。 一般的に、リガンド／レセプター結合アッセーで予め選択されたレセプターに 既知の定量化できる親和性を有する所望の鋳型ＴＧＦ−βスーパーファミリーの メンバーを、例えば放射線標識、色素標識、蛍光標識などのように検出可能な方 法で標識する。精製されたレセプター、レセプター結合ドメインフラグメント、 又はその表面に所望のレセプターを発現している細胞のアリコートを標識化した ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーを標識化されていない各種の濃度のモ ーフォンの存在下でインキュベートした。候補モーフォンの相対的結合親和性は 標識化した鋳型ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーとレセプターとの結合 阻害をする候補（標識化されていないモーフォン）能力を定量することにより測 定することができる。アッセーを行なうときに、固定された濃度のレセプターと ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーを標識化されていないモーフォンの存 在下及び不存在下にインキュベートする。標識化鋳型ＴＧＦ−βスーパーファミ リーのメンバーを加える前に、候補モーフォンと一緒にレセプターをインキュベ ートすることにより、感度を上昇させる。標識化競争者が加えられた後、十分な 時間で適当な競争者結合をさせ、フリー及び結合した標識化スーパーファミリー のメンバーが相互に分離され、測定される。 スクリーニング方法の実施に有用な標識は、放射線標識、すなわち¹²⁵Ｉ、¹³¹ Ｉ、¹¹¹Ｉ、又は⁷⁷Br、色素標識、Molecular Probes.Inc.,Eugene，OR によるHa ughland（1984）"Handbook of Fluorescent and Research Chemicals 5 ed"に記 載されているような分光学的標識、又は高ターンオーバー速度を有する 結合酵素、すなわちホースラディッシュパーオキシダーゼ、アルカリフォスファ ターゼ、又はβ−ガラクトシダーゼを化学発光もしくは蛍光性基質と一緒に用い たものが含まれる。 生物学的活性、すなわちできた構成物のアゴニスト的、拮抗剤的性質はＴＧＦ −βスーパーファミリーのメンバーの活性を測定するために開発された従来のin vivo 及びin vitroのアッセーを用いることにより特徴づけられる。しかしなが ら、用いるアッセーの型はモーフォンを基礎とするＴＧＦ−βスーパーファミリ ーのメンバーに依存する。例えば、天然のＯＰ−１タンパク質を基礎とするモー フォン構成物は、例えば後述されるようにＯＰ−１活性を測定するのに現在まで 開発された生物学的アッセーのいずれをも用いてアッセーすることができる。Ｖ．結合活性の昂進 リード化合物、すなわち鋳型ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーと正常 に結合するレセプターにすくなくとも基礎的な結合親和性を有するものが一度同 定されると、それらの親和性は、コンピューターを基礎とするタンパク質構造モ デルと理論的ドラッグデザイン技術の併用により昂進させることができる。例え ば、候補モーフォン構成物をコンピューターモデルを作成した後、フィンガーと ヒール領域の溶媒に暴露される表面又はリンカー配列が結合活性及び／又は特異 性を昂進、もしくは調節するように変異することができる。 そのような手法で検討をしている間に、いくらかの構造的要素を異なる構成物 で独立して変異させることができる。最も高い結合及び／又はは生物学的活性を 有するモーフォンを単離した後、活性を昂進させる各要素が分離でき特徴づけら れ、単一 の構成物に統合することができる。この種の手法は天然のヒト成長ホルモンより ４００倍もホルモンレセプターとの親和性を有するヒト成長ホルモンアナログの 生産に用いられて成功した(Wells et al．in "Advances in Gene Technologu：P rotein Engineering and Beyond" p105)。また、別には、タンパク質の複数の領 域で単一の実験で同時に修飾することができ、最も高い結合親和性、及び／又は 特異性を有する構成物を単離することができる。しかしながら、所望の親和性を 有する構成物が見いだされるまでには、何回かの変異とスクリーニングを繰り返 すことが理解される。 品質向上過程の重要な局面は、組換えＤＮＡ技術が用いられたとき所望のポリ ペプチドとそれをコードする核酸の間に物理的な関連を確立し維持することが必 要である。本発明のこの局面の実施に有用な系は、例えば、ファージディスプレ イ技術が含まれ、そこでは所望のペプチドがファージのコードタンパク質との融 合としてファージ表面に固定されている。Scott et al．(1990)Science 249：38 6-390; Parmely et al．(1988)Gene 73: 305-318; Devlin et al．(1990)Scienc e 249: 404-406; McCafferty et al．(1990)Nature 348: 552-554; Marks et al ．(1992)J.Biol．Chem．267: 16007-16010; Lowman et al．(1991)Biochem．30: 10832-10838; Wells et al．supra; Amberg et al．in Strategies in Molecul ar Biology 6: 2-4; 及び、ファルマシア、Ｐ−Ｌ−バイオケミカルのthe Recom binant Phage Antibody System instruction manualを参照するとよい。 簡単には、候補モーフォン構成物をコードするＤＮＡをファ ージ粒子表面で発現され、一般的にはファージマイナーコートタンパク質のＮ末 端融合物である。代表的な品質向上実験で合成遺伝子の特定の部分をコードして いるヌクレオチド、すなわち、リンカー配列をコードしているものはその領域に ランダムなアミノ酸配列を有する構成物をコードする核酸配列のライブラリーを 作るためにランダム化することができる（第3A節を参照）。モーフォンをコード するＤＮＡ分子のライブラリーが、一度産生されると、ＤＮＡをマイナーコート タンパク質をコードする遺伝子に隣接する位置のファージゲノムにライゲーショ ンする。できたＤＮＡはパッケージされ、宿主細胞で増幅されて、所望のタンパ ク質と融合したマイナーコートタンパク質を細胞表面に有する組換ファージ粒子 を産生するのに発現される。所望のレセプターとの所望の結合親和性及び／又は 特異性を有するモーフォン構成物を発現する組換ファージ粒子を数回の親和性向 上、引き続くファージ増殖により単離される。これらの手法を用いて、特異的な 生物学的活性を有するポリペプチドを発現する単一ファージ粒子を１０６ー１０ ８の以上のファージ粒子を含有するファージライブラリーから日常的に単離する ことができる。 親和性向上は、例えば、組換ファージ粒子を含有する溶液をレセプターに結合 する組換えファージ粒子の表面にモーフォンが発現されるような条件下で表面に 固定されたレセプターからなるクロマトグラフ用カラムを通過させることにより 達成できる。それから、残留した及び／又は非特異的に結合したファージを除去 するために、カラムを洗浄する。コンフォーメーション的に活性なモーフォンを 発現させるファージを特異的脱着、 例えば、過剰の鋳型ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーを加えたり、また は、非特異的脱着、例えば、ｐＨや極性低下剤、又はカオトロピック剤を用いて 溶出する。最も強く結合する粒子は、脱着誘導試薬の濃度勾配法で溶出され、最 も強く結合している粒子はその試薬の最も高い濃度で溶出される。最も強く結合 している粒子が一度溶出されると、再増幅され、所望のモーフォンをコードする 核酸が単離され配列分析される。従って、ＤＮＡ配列が、最も強く結合するモー フォンの配列が決定されると、品質向上プロセスが、例えば、分子の他の部分の 変異を、好ましい結合活性を有するモーフォン分子が産生されるまで繰り返され る。できた構成物は、次に、現在までに同定された各々の鋳型ＴＧＦ−βスーパ ーファミリーのメンバーにたいして開発されたin vivo 及びin vitroのアッセー を用いて生物学的活性を分析することができる。 有用なモーフォン構成物の同定に続いて、モーフォンは商業上有用な量、例え ば、所望のモーフォンを発現する細胞株を産生し、又は適当なアミノ酸配列を特 定する合成ペプチドを産生することにより、産生することができる。しかしなが ら、適当な細胞株を産生し、又は合成ペプチドを生産する従来の方法は当業者に はよく知られ、完全に文書化されているのでここでは詳説しない。VI ．製剤及び生物学的活性 できたモーフォン構成物は治療の一部として、ＴＧＦ−βスーパーファミリー のメンバー及び１以上のその同族のレセプターとのin vivo での結合相互作用を 昂進、阻害、又は調節するために患者に提供される。構成物は、以下に説明する とおり、 薬理学的組成で製剤化され、いずれの適切な手段好ましくは直接、全身性に、例 えば全身投与又は経口投与される。 モーフォン構成物は直接（例えば、注射のように、局所的に所望の組織部位へ ）又は全身性に、例えば静脈内、経皮、筋肉内、眼窩内、点眼、心室内、頭蓋内 、包内、脊椎内、槽内、腹腔内、バッカル、直腸、膣、鼻腔内、もしくはエアロ ゾル投与で提供されるところでは、治療組成物は水溶液部分を含有することが好 ましい。溶液は、所望の構成物を患者に投与するのに加えて溶液が患者の電解質 や容積バランスに悪影響しないように生理学的に許容できるものが好ましい。治 療分子の水溶性媒体はこのように、例えば、正常な生理食塩水(0.9％NaCl，0.15 M)、ｐＨ７−７．４、又はその薬理学的に許容できる塩を含有することが好まし い。 経口、全身投与に有益な溶液は製剤分野で公知の方法のいずれによっても調製 することができる。例えば、”Remington's Pharmaceutical Science”（Gennar o，A 編）Mack Pub.，1990を参照するとよい。製剤は、例えば、ポリエチレング リコールのようなポリアルキレングリコール、植物起源のオイル、水素化ナフタ レン等が含まれる。直接投与の剤型は、特にグリコールや他の高粘度の組成物を 含有することができる。生体適合性の、好ましくは生体内吸収性のポリマー例え ばヒアルロン酸、コラーゲン、リン酸３カルシウム、ポリ酪酸、ポリラクチド、 ポリグリコリドやラクチド／グリコリドのコポリマー等が in vivo でのモーフ ォンの放出を調節するのに有用な賦形剤である。他の潜在的に有用なコレラの治 療分子の全身性放出システムにはエチレンー酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧 ポンプ、 移植可能な注入システム及びリポソームが含まれる。吸入投与の製剤には賦形剤 として、例えばラクトースを含有することができ、また水溶液含有、例えばポリ オキシエチレンー９ーラウリルエーテル、グリココレートやデオキシコレート、 又は鼻腔ドロップの剤型で、又は鼻腔内投与としてのゲルとしての油溶液が含ま れる。 最後に、治療分子は単独で、又は組織形態形成に効果のある他の既知の分子、 すなわち組織修復及び再生ができ、及び／又は炎症を抑制することができる分子 との併用で投与することができる。骨粗鬆症患者の骨組織増殖を促進する有益な コファクターの例として、限定するわけではないが、ビタミンＤ３、カルシトニ ン、プロスタグランジン、副甲状腺ホルモン、デキサメタゾン、エストロゲン、 ＩＧＦ−Ｉ又はＩＧＦ−IIが含まれる。神経組織修復及び再生に有用なコファク ターとしては、神経成長因子が含まれる。他の有用なコファクターは徴候軽減コ ファクター、防腐剤、抗生物質、抗ウイルス剤、抗菌剤及び鎮痛剤及び麻酔剤が 含まれる。 治療分子は、さらに、薬理学的に許容できる非毒性の賦形剤や担体と混合して 薬剤組成物に製剤化することができる。上記の如く、そのような組成物は、溶液 、懸濁液の剤型で全身投与用、特に錠剤、カプセルの剤型で経口投与用、粉剤、 鼻腔ドロップ、エアゾルの剤型で鼻腔内用に調製することができる。組織表面へ の接着が望まれるところでは、組成物はフィブリノーゲンートロンビン組成物に 分散された生合成構成物、例えば、PCT 出願US91/09275に開示されているように 生物学的接着剤が含まれる。この開示は参照することにより本明細書に援用する 。 組成物は所望の組織表面に塗布し、スプレーし、又は他の適用方法を用いること ができる。 組成物は治療的に有効な量、即ち所望の効果を誘導するのに十分な時間標的組 織に適当な濃度のモーフォンを提供する量のヒト又は他の哺乳動物へ全身もしく は経口投与用に製剤化することができる。 治療分子が組織又は器官保存溶液の一部からなるときには、いずれの市販で入 手できる保存溶液も有利に使用することができる。例えば当業者に公知の有用な 溶液として、コリン溶液、ウィスコンシン溶液、ベルツァー溶液、ユーロコリン 溶液や乳酸化リンゲル溶液が含まれる。保存溶液や有用な成分の詳細な説明は例 えば米国特許第5,002,965 号にあり、この開示は参照することにより本明細書に 援用する。 モーフォン構成物のいくつか、例えばＶｇ／ｄｐｐサブグループのメンバーを 基礎にしたモーフォンは担体マトリックス、すなわち不溶性ポリマーマトリック スと併用したときin vivo での最高の活性を示す。例えば、本発明で参考文献と して引用されている米国特許第5,266,683 号を参照するとよい。現在のところ好 ましい担体マトリックスとしては、もともと異種で、同種異系で、又はオートジ ェネシスである。しかしながら、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ酪酸、その 誘導体及びそのコポリマーからなる合成素材が適切な担体マトリックスを作るの に用いられる。好ましい合成の及び天然のマトリックス素材、それらの調製方法 、及び本発明の形態形成タンパク質とともに製剤化する方法についてここでは詳 説しない。例えば、米国特許第5,266,683 号を参照するとよい。 当業者の熟練者であれば理解できるように、治療組成物に開示されている化合 物の濃度は、投与される薬剤の投与量、用いられる化合物の化学的特徴（例えば 疎水性）、投与経路など多くの因子に依存して変わる。投与されるべき薬剤の好 ましい投与量は、病気や組織損傷、欠損のタイプや程度、特定の患者の全体的な 健康状態、選択された化合物の生物学的効能、化合物の剤型、剤型の中の賦形剤 の存在の有無及びタイプ、投与経路に依存するようである。一般的な言葉で、本 発明の治療的分子は、代表的な投与量としては約１０ｎｇ／ｋｇから１ｇ／ｋｇ 体重／１日の範囲で、さらに好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋ ｇ体重の範囲で、患者に投与することができる。 本発明の実施はさらに詳細に、例示の目的のみであるので、従って、いずれに しても、限定するものと解釈されてはならない以下の実施例から理解される。実施例１．ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバ−ＯＰ−１を基礎にしたモー フォンのデザインと産生 本発明の原理に従って設計され、配列番号２９の配列リストに特定されている ＤＮＡ配列を有し、配列番号３０の配列リスト（図１に示されている）に特定さ れているタンパク質配列をコードするＤＮＡを有する例示的なＯＰ−１を基礎に したモーフォンは上記のように標準的な組換えＤＮＡ技術で産生することができ る。例示的なＯＰ−１モーフォンをコードするＤＮＡ配列、配列番号２９、は必 要があれば、モーフォン構造の実験的な品質向上の以下のステップ、すなわち、 カセット変異を単純化する複数の制限酵素部位を含む。 配列番号３０に示されているＯＰ−１モーフォンタンパク質はＮ末端からＣ末 端を含み、ＯＰ−１フィンガー（配列番号30でアミノ酸残基1 ―32）、より大き いリンカー配列（配列番号30でアミノ酸残基33―44）、ＯＰ−１ヒール配列（配 列番号30でアミノ酸残基45―75）、より小さいリンカー配列（配列番号30でアミ ノ酸残基76―79）及びＯＰ−１フィンガー２配列(配列番号30でアミノ酸残基80 ―115)からなる。 ＯＰ−１モーフォン（配列番号30）をコードするＤＮＡ配列は、配列番号３０ で特定され、標準的な組換ＤＮＡ技術、例えば、合成ＤＮＡ配列を合成し、それ を適当な発現ベクターにライゲーションする。しかしながら、結合及び／又はア ゴニスト的性質を有するＯＰ−１モーフォン構成物の産生を高めるためには以下 の方法が用いられる。 簡単に説明すると、この方法は、ヒトＯＰ−１、Ｎ末端リンカー、Ｃ末端リン カー、フィンガー１とヒール領域を連結する大ループ、及びヒールとフィンガー ２を連結する小ループをコードするｃＤＮＡクローンを挿入するステップからな る。修飾ｃＤＮＡは、次に、そのベクターから取り出されファージディスプレイ ベクター、例えば、ファルマシアの製品のｐＣＡＮＴＡＢ５にライゲーションさ れ、それから、一連の独立した変異ステップ、ファージディスプレイ系でのスク リーニングと併用してリンカー領域はオリゴヌクレオチド特異的変異により一群 の候補モーフォン構成物を産生するのに変異される。ＯＰ−１と結合するモーフ ォン構成物をウイルス表面に発現するファージが単離されモーフォン構成物をコ ードする遺伝子の配列分析がされる。最も強く結合する患者の構成物から同定さ れたリン カー領域のみならず、フィンガーとヒール領域からなる最終の構成物は、最適化 されたＯＰ−１モーフォン構成物を産生するのに結合される。できたモーフォン 構成物がベクターから取り出され、大腸菌発現ベクター、例えば、New England BioLabs，Beverly，MA．Aの製品のｐＥＴに挿入された後で、Ｃ末端はオリゴヌ クレオチド特異的変異により、最適化されたモルフォン構成物に導入される。 配列番号２９で特定されているＯＰ−１のｃＤＮＡのＳｍａＩからＢａｍＨＩ までのフラグメント（Ozkaynak et al．(1990)EMBO J 9: 2085-2093）が予めＥ ｃｏＲＶとＢａｍＨＩで分解されたBluescript KS ＋（Stratagene Cloning Sys tem，Lajolla，CAから入手できる）にクローン化される。大腸菌に形質転換され ると、できたクローンは所望のクローンが青である青―白選択方法によりスクリ ーニングされる。正しいクローンは制限スクリーニングで以下のような制限酵素 分解のフラグメントを生じるので同定される。 制限酵素 フラグメントの大きさ（塩基対） ＥｃｏＲＩ ８４、７８９、３４２５ ＸｈｏＩ １６１、１２２３、２９１４ ＳａｃII ９７、６５０、３５５１ 合成オリゴヌクレオチド、ＰＣＲ，部位特異的変異技術のいずれかを用いて、 例えば、Knnkel（1985）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 822: 488L; Kunkel et al ．(1985)Meth．Enzymol．154: 367; 及び米国特許第4,873,192 号を参照すると よいが、特定のヌクレオチドがＯＰ−１ｃＤＮＡの中で、ＯＰー１遺伝子内に大 及び小ループを導入し、ＯＰ−１遺伝子の端にユニー クな制限部位を導入するために修飾される。以下の全ての修飾で、フレームシフ トもなく、従って、白コロニーを生じる変異生成物により形質転換された大腸菌 は配列に誤りがあることが示唆された。 最初のステップで、配列番号３４で示されるオリゴヌクレオチドを利用したオ リゴヌクレオチド特異的変異により大ループが導入される。大ループのオリゴヌ クレオチドは１５塩基対がＮ末端とＣ末端が重なり合い、取り込みのスクリーニ ングに使用されるユニークなＢａｍＨＩ制限酵素部位を導入するように設計され る。 それから、配列番号３３で示されるオリゴヌクレオチドを利用したオリゴヌク レオチド特異的変異により小ループが導入される。小ループのオリゴヌクレオチ ドは１８塩基対がＮ末端とＣ末端が重なり合い取り込みのスクリーニングに利用 できるユニークなＮｈｅＩ制限酵素部位を導入するよう設計される。 ＯＰ−１遺伝子のＣ末端は配列番号３５で示されるオリゴヌクレオチドを利用 したオリゴヌクレオチド特異的変異により修飾される。Ｃ末端はもともとあった 終止コドンを除去し、ファージディスプレイライブラリーを作るのに有用なベク ター、特にファルマシア製品のｐＣＡＮＴＡＢ５ファージミドにクローニングす るＮｏｔＩ部位を導入するために修飾される。この目的にデザインされたオリゴ ヌクレオチドは、Ｎ末端とＣ末端が１４塩基対で重なり合っており、ユニークな ＮｏｔＩ制限酵素部位及びユニークなＳｐｈＩ制限酵素部位を導入する。両方の 制限酵素部位は取り込みのスクリーニングに使用される。 ＯＰ−１遺伝子のＮ末端は配列番号３２で示されるオリゴヌ クレオチドを利用したオリゴヌクレオチド特異的変異により修飾される。Ｎ末端 はｐＣＡＮＴＡＢ５ファージミドにクローニングするＳｆｉＩ部位、及び最終的 には発現ベクターにクローニングするＮｄｅＩ制限酵素部位を導入するのに修飾 される。この目的に設計されたオリゴヌクレオチドはＮ末端とＣ末端が２２塩基 対で重なり合っており、ユニークなＮｏｔＩ制限酵素部位及びユニークなＳｐｈ Ｉ制限酵素部位を導入する。ＳｆｉＩ及びＮｄｅＩの両方の制限酵素部位は取り 込みのスクリーニングに使用される。 前記の４つの変異によりできたＯｐ−１ｃＤＮＡは配列番号３７で示されてい る。ＯＰ−１レセプターと結合するＯＰ−１モーフォン構成物を選択する効率を 改善するために、大及び小ループの変異は独立した反応で行なわれた。このステ ップを可能にするために、できたｃＤＮＡ（配列番号37）を制限酵素ＳｆｉＩ及 びＮｏｔＩで分解し、３７６塩基対のＳｆｉＩからＮｏｔＩフラグメントを、予 め制限酵素ＳｆｉＩとＮｏｔＩで分解されたｐＣＡＮＴＡＢ５に直接クローン化 する。 配列番号３８と３９で特定されているものと類似するオリゴヌクレオチドを用 いてオリゴヌクレオチド特異的変異により小ループに変異を導入する。配列番号 ４０、４１、４２及び４３に示されるものと類似するオリゴヌクレオチドを用い てオリゴヌクレオチド特異的変異により大ループに変異を導入する。配列番号４ ０及び４１で特定されるオリゴヌクレオチドが大ループを特定する最初の２０塩 基対に変化を導入し、一方、配列番号４２及び４３で特定されるオリゴヌクレオ チドはループの後半に変化を導入する。 別々のループ変異ステップにより産生されたビリオン表面タンパク質に発現す るファージのライブラリーを「組換えファージ抗体系」（ファルマシア）の使用 マニュアルに示されているプロトコルを利用してＯＰ−１レセプターとの結合活 性をスクリーニングする。簡単には、各別々のループ変異により産生されたｐＣ ＡＮＴＡＢ５ファジミドのクローンのライブラリーが競合する大腸菌ＴＧ１に形 質転換されＫＯ７ヘルパーファージの存在下で増殖する。このステップはその細 胞表面でＯＰー１モーフォンを発現するファージを産生する結果となる。できた ファージは、例えばAFFIGEL 15,Fractogel、プラスチック表面、又は磁気ビーズ （Hermanson et al．「固定親和性リガンド技術」(1992)Academic Press，Inc，Sa n Digo）のような固体表面に予め固定された、ＯＰ−１レセプターとの結合活性 をスクリーニングされる（Malpe et al．(1994)Biochem．Biophys．Res.Comm．2 01: 1140-1144; tenDijke et al．(1994)J．Biol．Chem．269: 16985-16988）。 レセプターに結合しないファージはリン酸食塩緩衝液(PBS)を含有する緩衝液で 徹底的に（２０回以上）洗浄して除去し、さらに徹底的に（20回以上）０．０５ ％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有のＰＢＳで洗浄した。その後、特異的結合構成物 は０．１Ｍグリシン、ｐＨ３．０、及び０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有 の緩衝液で固体表面から溶出し、溶出物を１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０＜ ０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で中和した。ＯＰ−１に特定な親和性を有す るファージを収穫する。しかしながら、この段階で、溶出液は数種の異なるファ ージを含有し、各々のファージ粒子はＯＰ−１レセプターに結合する。 個別のファージ粒子を単離するために、大腸菌を再び溶出されたファージで感 染させ、感染したコロニーをミクロ滴定プレートに個別のコロニーができるよう に滴定した。それから、感染大腸菌はミクロ滴定プレートの各ウェルから収穫さ れ、できたファージの表面にＯＰ−１モーフォンの発現を減少させるＫＯ７ヘル パーファージで感染し、できた混合物を表面に固定化されたＯＰ−１レセプター を含んでいる２番目のミクロ滴定皿の個別のウェルに加えた。この手法を用いて 個別のファージが固定化されたＯＰ−１レセプターとの結合活性のスクリーニン グをすることができる。結合は、ファージ表面の抗原に結合特異性を有する抗体 にホースラディッシュパーオキシダーゼを結合したもので可視化できる。個別の ファージは、次に、ミクロ滴定皿のウエルの表面に結合されたＯＰ−１レセプタ ーから溶出され、それらからＤＮＡが単離される。配列分析をした後、特定の領 域、例えば、小及び大ループをコードし、高い結合親和性を生じるＤＮＡ配列は 一つのモーフォン構成物に統合される。 それから、リンカーが配列番号３６に示されるオリゴヌクレオチドを利用した オリゴヌクレオチド特異的変異により最後から２番目のモーフォン遺伝子のＣ末 端に導入する。リンカーはモルフォン遺伝子の末端「・・・ＲＡＣＧＳＨ」に抑 制できない終止コドンを導入し、終止コドンの後にユニークなＢｇｌII部位(AGA TCT)が続く。この変化がうまくできたかどうかは、輸出されたファージ（終止コ ドンが遺伝子３タンパク質の産生をブロックする）の不存在及びプラスミドＤＮ ＡをＢｇｌIIで分解できる能力により決定できる。そして、最適化されたＯＰー １毛フォン遺伝子はＮｄｅＩおよびＢｇｌIIで取り出され、予めＮｄｅＩ及びＢ ｇｌIIで分解されたｐＥＴベクター（New England Biolabs，Beverly，MA）にク ローニングされる。 モーフォン遺伝子産物を産生するモーフォン遺伝子の発現はＴ７ＲＮＡポリマ ラーゼの発現（λCE6 ファージによって感染されて開始される）の後に誘導され る。発現の間、ＯＰ−１モーフォンは、細胞ペーストから収穫される封入顆粒で 産生される。それからタンパク質は６Ｍグアニジン塩酸塩、０．２ＭＴｒｉｓ− ＨＣｌ、ｐＨ８．２、及び０．１Ｍ２−メルカプトエタノールに溶解し、６Ｍ尿 素、２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、及び１ｍＭ ＥＤＴＡで透析 する。２−メルカプトエタノールは最終濃度が０．１Ｍになるよう加えられ、溶 液を室温でインキュベーションする。それから混合物を２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ− ＨＣｌ，ｐＨ７．５及び１ｍＭＥＤＴＡを含有する緩衝液で、徹底的に透析する 。折りたたまれたＯＰー１モーフォンはそれから表面にＯＰ−１レセプターが固 定化されて充填されているカラムでアフィニティークロマトグラフィーにより精 製される。結合しないものは上記のように洗浄により除去され、ＯＰ−１レセプ ターに特異的に結合する物質が上記のように溶出される。実施例II．ＯＰ−１を基礎にしたモルフォンの結合活性の測定 その細胞表面でＯＰ−１レセプターを発現している細胞を、３５ｍｍ培養皿に 播種し４８時間ＤＭＥＭ培地（Dulbecco's修飾Eagle 培地）＋１０％ウシ胎児血 清で４８時間インキュベーションした。精製されたＯＰ−１、又はＯＰ−１アナ ログを、本質的には、Frolik et al．(1989)J．Biol．Chem．595: 109 95-11000のプロトコルにより、Ｎａ１２５でクロラミンＴ酸化によりヨウ素化、 好ましくは約５０−１００ｍＣｉ／ｍｇの比活性を有する。標識化ＯＰ−１又は ＯＰ−１アナログを標準的な操作、例えばクロマトグラフィー的な分離により精 製する。播種された細胞は、それから０．１％ＢＳＡ存在下、生理食塩緩衝液に より２回洗浄され、ＢＳＡ、緩衝液及び標識化ＯＰ−１(1ng)及びいろいろな濃 度の(例えば、10mg/ml)の非標識化競合物質、例えば非標識化ＯＰ−１、又は候 補ＯＰ−１を基礎にしたモーフォンの存在下で２２℃でインキュベーションされ る。結合に引き続き、細胞を３回冷緩衝液で洗浄し、０．５ｍｌの０．５Ｎ Ｎ ａＯＨに溶解し、皿から除去し、ガンマシンチレーションカウンターにより放射 活性を測定する。データを阻害％で表示し、ここで１００％特異結合の阻害とは 競合物質の存在しない時の結合と１００倍過剰の非標識化競合物質の存在下の結 合の差である。結合パラメーターは好ましくはＬＩＧＡＮＤ(Munsun et al．(19 80)Anal．Biochem.107: 220-259)のようなコンピュータープログラムを用いて測 定する。アッセーするときに、ＯＰー１を基礎にしたモーフォンはＯＰ−１レセ プターに特異的な結合活性を有することが意図されている。結合活性を確認する ときに、モーフォンは引き続き生物学的活性を測定される。実施例III ＯＰ−１を基礎にしたモルフォンの生物学的活性の測定 できたＯＰ−１を基礎にしたモーフォンの生物学的活性を、一般的には天然の ＯＰ−１活性を測定するのに使用される標準的な in vivo及びin vitroのアッセ ーで測定する。各種の例示 的なアッセーが以下に示される。Ａ．ラット及びヒト骨芽細胞に対する有糸分裂誘発効果 以下の実施例はＯＰ−１モーフォンのin vitroでの骨芽細胞の増殖を誘導する 能力を示すようにもくろまれている。骨芽細胞培養を含む、これ及び他の全ての 実施例にはラット骨芽細胞の初代培養が好ましくは使用される。 これらの培養は、個別の細胞が分化の異なる段階にあるという意味で不均一で あるが、培養は樹立された細胞株から得られる骨芽細胞培養より、in vivo での 骨芽細胞の代謝及び機能をより正確に反射しているものと考えられる。特に示さ れない限り、参考にした全ての化学試薬は標準的なもので、市販で入手でき、Si gma Chemical，Co.，St．Louis; Calbiochem．Corp.，San Diego 及び Aldrich Chemical Co.，Milwaukeeを含む多数のところから容易に入手できる。 簡単に説明すると、ラット骨芽細胞初代培養は、新生のラット頭蓋冠のコラゲ ナーゼ消化（例えば、1-2 日齢の動物から、Long-Evance 種、Charles River La boratories，Wilmington，MA）、例えばWong et al．(1975)Proc．Natl．Acad． Sci．USA 72: 3167- 3171に記載されているような標準的な操作で調製される。 ラット骨芽細胞単独の細胞懸濁液を１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、Ｌ−グルタ ミン及びペニシリン／ストレプトマイシン含有アルファＭＥＭ（修飾 Eagle培地 、Gibco,Inc.，Long Island ）で多穴プレート（例えば各ウエル50,000骨芽細胞 の濃度で24穴（ウエル）プレート）に播種する。細胞は３７℃で２４時間インキ ュベートされるが、そこでは、増殖培地を１％ＦＢＳ含有アルファＭＥＭ培地に 置換し、細胞が実験時に無 血清増殖培地にいるように、さらに２４時間インキュベートされる。 培養された細胞を以下の４群に分ける。(1)例えば、０．１、１．０、１０． ０、４０．０及び８０．０ｎｇのＯＰー１モーフォンのウエルと、(2)０．１、 １．０、１０．０及び４０．０ｎｇの天然のＯＰー１のウエルと、(3)０．１、 １．０、１０．０及び４０．０のＴＧＦ−β、及び(4)成長因子のない対照群、 である。細胞は、それから各ウエルが２ｍＣｉ／ウエルの３Ｈ−チミジンでパル ス化され、さらに６時間インキュベートされた後、さらに１８時間インキュベー トされる。過剰の標識は、０．１５Ｍの冷食塩溶液で洗浄され、２５０ｍｌの１ ０％トリクロロ酢酸を各ウエルに加えられ、各ウエルは室温で３０分間インキュ ベートされる。細胞はその後３回冷蒸留水で洗浄されて、２５０ｍｌの１％ドデ シル硫酸ナトリウム塩を加え、３７℃で３０分間分解する。できた細胞溶解物は 、標準的な方法で収穫され、細胞内ＤＮＡへの³Ｈ−チミジンの取り込みを液体 シンチレーションで細胞の有糸分裂誘発活性の指標として測定する。実験による と、ＯＰ−１モーフォン構成物が天然のＯＰ−１のようにＤＮＡへの³Ｈ−チミ ジンの取り込みを促進し、従って、骨芽細胞の増殖を促進することが意図されて いる。反対に、ＴＧＦ−βの効果は一時的で２相性であることが予測される。さ らに、より高い濃度では、ＴＧＦ−βは骨芽細胞の増殖には著しい効果はないこ とも意図されている。 骨芽細胞増殖に及ぼすＯＰ−１モーフォンのin vitroでの効果は、ヒト初代骨 芽細胞（通常の成人患者の骨組織から得られ上記の如く調製される）及びヒト骨 肉腫由来の細胞株を利用し て評価される。 Ｂ．幹細胞刺激 以下の実施例はＯＰ−１モーフォンの間葉系幹細胞の増殖を促進する能力を示 すためにもくろまれた。有用な繊細な幹細胞は多能幹細胞を含み、従来技術を利 用して(例えば、Faradji et al．(1988)Vox Sang．55(3): 133-138、又はBroxme yer et al．(1989)Proc．Natl．Acade．Sci．USA，86: 3828)、血液から得られ る繊細な幹細胞のみならず、骨髄又は臍帯血から単離される。別の方法では、胎 児細胞が用いられる（例えば培養中胚葉細胞株から）。 幹細胞を得、ＯＰ−１モーフォンの細胞増殖促進能力を測定する他の方法には in vivo起源から幹細胞を捕まえることである。例えば、移動性幹細胞の内向き フラックスを許容できる生体適合性のマトリックス物質を、移動性幹細胞の内向 きフラックスを許容できるのに十分長いin vivo の位置に移植することができる 。例えば、Sampath et al.(1989)Proc．Natl．Acad．Sci．USA，80: 6591-6595 又は米国特許第4,975,526 号に記載されているように製剤化された骨由来のグア ニジン抽出マトリックスを、本質的にはSampath et al.の方法に従って、ラット 皮下に移植することができる。３日後に、移植物を除去しマトリックスに結合し ている幹細胞を分散し、培養する。 しかしながら、得られた幹細胞は以下に述べられるような標準的な細胞培養条 件下で候補ＯＰ−１モーフォンとともに in vitro でインキュベートされる。外 部刺激なしで、幹細胞は培養でそれら自身では増殖しないか又はほんの僅かしか しない。しかしながら、ＯＰ−１のような生物学的に活性なＯＰ−１モ ーフォンの存在下では培養された幹細胞は増殖することが意図される。細胞増殖 は当業者に公知の標準的な方法で可視的に、又は分光学的に測定することができ る。Ｃ．モーフォゲン誘導細胞分化 各種のアッセーをＯＰ−１を基礎にしたモーフォン誘導細胞分化の測定に用い ることができる。（１）胎児間葉細胞分化 天然のＯＰ−１のように、ＯＰ−１モーフォンは細胞分化を誘導するのに用い られるのを意図している。ＯＰ−１モーフォンの細胞分化を誘導する能力はＯＰ −１モーフォンの存在下で初期間葉系細胞を培養し、当業者で公知の標準的な細 胞培養及び細胞染色技術を利用して、トルイジン・ブルーで染色して培養細胞の 組織学的検討をすることにより示すことができる。例えば、下顎骨になることに なっているラット間葉系の細胞はステージ１１で上にある上皮細胞から分離され 、標準的な組織培養条件下で、例えば、６７％ＤＭＥＭ（Dulbecco修飾Eagle 培 地）、２２％Ｆ−１２培地、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７、２ｍＭグルタミン 、５０ｍｇ／ｍｌトランスフェリン、２５ｍｇ／ｍｌインスリン、微量要素、２ ｍｇ／ｍｌオレイン酸と結合したウシ血清アルブミン、ＨＡＴ、０．１ｍＭヒポ キサンチン、１０ｍＭアミノプテリン、１２ｍＭチミジンを含有する、化学的に 特定された、無血清培地で in vitro で培養されるが分化を続けることはしない 。しかしながら、これらの同じ細胞は後さらに内皮に接触したままで、それらが ステージ１２細胞になった時にそれらは軟骨細胞を形成するために、in vitroで それら自身で分化を続ける。さらに、骨芽細胞への、最終的に は下顎骨への分化には、適当な局所的な環境、例えば血管新生環境が必要である 。 天然のＯＰ−１と一緒のように、例えば１０−１００ｎｇ／ｍｌのＯＰ−１モ ーフォンの存在下でin vitroで培養されたステージ１１間葉系細胞は、in vitro でそれらが重層の内皮細胞から収穫された細胞生成物と一緒に培養されると、そ れらが分化を続けるように、in vitroで軟骨細胞を形成するための分化を続ける ことが予測される。この実験は、異なる組織でのＯＰ−１モーフォンの細胞分化 の能力を示すために異なる間葉系の細胞で行なわれた。モーフォゲン誘導の細胞 分化の他の例として、骨芽細胞分化を誘導するＯＰ−１モーフォンの能力を、骨 芽細胞の初代培養、又は骨芽細胞様細胞株を用いてin vitroで示すことができ、 分化した骨芽細胞の表現型の特異的なマーカー、例えば、アルカリフォスファタ ーゼ活性、副甲状腺ホルモン調節のサイクリックＡＭＰ(cAMP)産生、オステオカ ルシン合成、及び昂進した石灰化速度等の各種の骨細胞マーカーをアッセーする 。（２）骨芽細胞のアルカリフォスファターゼ誘導 無血清培地で培養された骨芽細胞を例えば０．１、１．０、１０．０、４０． ０又は８０．０ｎｇのＯＰ−１モーフォン／ｍｌ培地の濃度範囲のＯＰ−１モー フォン、又は類似の濃度範囲の天然ＯＰ−１もしくはＴＧＦ−βとインキュベー トする。７２時間インキュベートした後、細胞層を０．５ｍｌの１％Ｔｒｉｔｏ ｎＸ−１００で抽出する。できた細胞抽出物を遠心分離し、抽出物１００ｍｌを ９０ｍｌのパラニトロソフェニルホスフェート(PNPP)／グリセリン混合物に加え 、３７℃の水浴 で３０分間インキュベートし、１００ｍｌの苛性ソーダで反応を停止させる。試 料をそれからアルカリフォスファターゼ活性の存在と量を測定するためにプレー トリーダー（例えば、DynatechMR 700プレートリーダー、ｐ- ニトロフェノール を標準にして４００nmの吸収が測定される）に通す。タンパク質濃度はＢｉｏＬ ａｄ法により測定される。アルカリフォスファターゼ活性は単位／ｍｇタンパク 質で計算される。ここで１単位とは３７℃、３０分で１ナノモルのｐ−ニトロフ ェノールを放出する 天然ＯＰ−１単独のように、骨芽細胞の分化した表現型の増殖と発現をそれに より促進する骨芽細胞のアルカリフォスファターゼの産生を促進することが意図 されている。 ラット骨芽細胞によるアルカリフォスファターゼの産生に及ぼすＯＰ−１の長 期的な効果も、以下のように示すことができる。 ラット骨芽細胞を上記のように調製し、多穴プレートで培養する。この実施例 で、６セットの２４穴プレートに各穴５００００ラット骨芽細胞に播種される。 各プレートの穴は上記のように調製され、３つの群に分けられる。例えば、(1) ウエルに培地１ｍｌ当たり１ｎｇg のＯＰ−１モーフォンを加える、(2)ウエル に培地１ｍｌ当たり４０ｎｇのＯＰ−１モーフォンを加える、及び(3)ウエルに 培地１ｍｌ当たり８０ｎｇのＯＰ−１モーフォンを加える、である。各プレート を異なる時間の長さインキュベートする。０時間（対照時間）、２４時間、４８ 時間、９６時間、１２０時間及び１４４時間である。各インキュベーション期間 の後、細胞層を０．５ｍｌの１％ＴｒｉｔｏｎＸ− １００で抽出する。できた細胞抽出物を遠心分離し、パラニトロソフェニルホス フェートを用いて上述のようにアルカリフォスファターゼ活性を測定する。天然 ＯＰ−１のように、ＯＰ−１モーフォンは骨芽細胞のアルカリフォスファターゼ の産生をＯＰ−１モーフォンの投与量を増加させるとアルカリフォスファターゼ の産生も増加するように用量依存的に促進することが意図されている。さらに、 処置された骨芽細胞でのＯＰー１モーフォンにより促進され、高いレベルのアル カリフォスファターゼが長期間維持されることも意図されている。（３）ＰＴＨ−介在のｃＡＭＰ この実験はin vitroでラット骨芽細胞での副甲状腺ホルモン介在のｃＡＭＰ産 生に及ぼすＯＰ−１モーフォンの効果を検査できるよにデザインされている。簡 単には、ラット骨芽細胞は上記の如く調製され多穴プレートで培養される。培養 された細胞は４群に分けられる。すなわち(1)例えば、ウエルに１．０、１０． ０及び４０．０ｎｇ／ｍｌ培地のＯＰ−１を加える、(2)例えば、ウエルに類似 の濃度範囲の天然ＯＰ−１を加える、(3)例えば、ウエルに類似の濃度範囲でＴ ＧＦ−βを加える、そして(4)ウエルには成長因子を加えない対照群でプレート をさらに７２時間インキュベートする、の４群である。７２時間の終わりに、細 胞は０．５％ウシ血清アルブミン(BSA)及び１ｍＭ ３ーイソブチルー１ーメチ ルキサンチンを含有する培地で２０分間処置し、さらに２００ｎｇ／ｍｌの濃度 でヒト組換え副甲状腺ホルモン(hPTH，Sigma，St Louis)を半分のウエルに加え ２０分間置く。細胞層を各ウエルから０．５ｍｌの１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ で抽出する。ｃＡＭＰレベルをラジオイムノ アッセーキット（例えば、Amersham，Arlington Illinois）を用いて測定する。 ＯＰ−１のように、ＯＰ−１モーフォン単独でＰＴＨ介在のｃＡＭＰ反応の増加 を促進しそれにより骨芽細胞の分化した表現型の増殖及び発現を促進する。（４）オステオカルシン産生の誘導 オステオカルシンは in vivoで骨石灰化速度に複合的な役割を果たす骨芽細胞 により産生される骨特異的タンパク質である。血清中のオステオカルシンの循環 レベルは in vivoでの骨芽細胞活性及び骨形成のマーカーに利用される。骨芽細 胞の多い培養でオステオカルシン産生の誘導はin vitroでのＯＰ−１モーフォン の効能を示すのに用いることができる。 ラット骨芽細胞が上記のように調製され、多穴プレートで培養される。この実 験では、培地は１０％ＦＢＳを補充され、細胞には、２日目に、新鮮な１０ｍＭ β−グリセロリン酸（Sigma,Inc.）で補充した新鮮な培地が供給される。５日 目に始まり、その後は１週間に２回、最終濃度が５０ｍｇ／ｍｌ培地になるよう 、上記の成分に新鮮なＬ（＋）−アスコルビン酸を含有する完全な石灰化培地を 細胞に供給される。ＯＰ−１モーフォンを直接ウエルに、例えば５ｍｌ以下のモ ーフォン／ｍｌ培地ｄｅ０．１％トリフルオロ酢酸を含有する５０％アセトニト リル（又は50％エタノール）で加える。対照には溶媒媒体のみを加える。細胞に それから再供給され、標準的なプロテアーゼ阻害剤を含有する標準的なラジオイ ムノアッセー緩衝液でコンディションドメディウムと試料を１：１に希釈し、オ ステオカルシンについてアッセーされるまでー２０℃で貯蔵する。オステオカル シン産生は市販で入手できるオステオカルシンー特異 的抗体を用いて、標準的なラジオイムノアッセーで測定する。 石灰化は固定した細胞層に改良ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色技術を利用して長期間 （13日）培養したものについて測定される。細胞は２３℃で１０分間新鮮な４％ パラホルムアルデヒドで固定され、引き続き冷０．９％ＮａＣｌですすぐ。固定 された細胞は、市販で入手できるキット(Sigma，Inc.)を用いて、ｐＨ９．５で １０分間、内因性のアルカリフォスファターゼを染色する。紫に染色された細胞 をそれからメタノールと空気で脱水する。暗室で３％ＡｇＮＯ３に３０分間イン キュベーションした後、水ですすがれた試料を２５４ｎｍの紫外光に３０秒間、 暴露し、黒色の銀染色リン酸節を進展させる。個別の石灰化巣（少なくとも20mm のサイズ）を解剖顕微鏡下でカウントし節／培養として表す。 天然のＯＰ−１のように、ＯＰ−１モーフォンは骨芽細胞培養でオステオカル シン産生を促進することが意図されている。さらに、ＯＰ−１モーフォンに反応 して増加したオステオカルシン産生は用量依存的に１３日のインキュベーション 後には基礎のレベルと比較して著しく増加することも意図されている。昂進した オステオカルシン産生はラットオステオカルシン特異的プローブを用いて、上昇 したオステオカルシンｍＲＮＡ（20倍上昇）を検出することで確認することがで きる。さらに、オステオカルシン産生の増加は石灰化節の出現の測定により長期 間の骨芽細胞培養での増加した石灰化と関連する。天然のＯＰ−１のようにＯＰ −１モーフォンは未処置の培養に比較して、初期石灰化速度を著しく増加させる 。（５）モーフォゲン誘導ＣＡＭ発現 ｖｇ／ｄｐｐサブグループのメンバーはＣＡＭ発現、特にＮ−ＣＡＭ発現を、 形態形成の誘導の一部として、誘導する（同時出願の米国出願SN922,813 参照） 。ＣＡＭは組織発達の本質的なステップとして全ての組織で同定されている形態 制御分子である。Ｎ−ＣＡＭ、これは少なくとも３つのアイソフォーム（N-CAM- 180 、N-CAM-140 及びN-CAM-120 でそれぞれ”180 ”と”140 ”及び”120 ”は SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定されたアイソフォームの見かけの分 子量を示す）があり、発達中の組織ではすくなくとも一時的に、神経組織では永 久に発現される。Ｎ−ＣＡＭー１８０及びＮ−ＣＡＭー１４０アイソフォームの いずれも発達中及び成人組織で発現される。Ｎ−ＣＡＭー１２０アイソフォーム は成人組織のみで発現される。他の神経ＣＡＭはＬ１である。 ＯＰ−１を基礎にしたモーフォンのＣＡＭ発現を促進する能力は、ＮＧ１０８ ー１５細胞を用いた以下のプロトコルを用いて示すことができる。ＮＧ１０８− １５は形質転換された融合細胞株（神経芽腫ｘ神経膠腫、American Type Tissue Culture(ATCC)，Rockville,MD）形態学的には形質転換された胎児ニューロンの 特性を示す。実施例Ｄで説明されるように、未処置のＮＧ１０８ー１５細胞は繊 維芽細胞的で、殆ど分化しない形態で通常発達中の細胞と関連するＮ−ＣＡＭの １８０及び１４０アイソフォームしか発現しない。ｖｇ／ｄｐｐサブグループの メンバーでこれらの細胞を処置すると、成人ニューロンの形態を示し全ての３つ の昂進したレベルＮ−ＣＡＭアイソフォームを発現する。 この実施例では、ＮＧ１０８ー１５細胞はＯＰー１モーフォ ンか天然ＯＰ−１のいずれかの増加した濃度の存在下で、４日間、標準的な培養 方法で培養され、全細胞抽出物について標準的なウエスタンブロットがなされる 。ＮーＣＡＭアイソフォームは全ての３つのアイソフォームと交叉反応する抗体 、ｍＡｂＨ２８．１２３，Sigma Chemical Co.,St．Louis から入手できて、異 なるアイソフォームは電気泳動ゲルでの異なる移動度で区別して検出される。対 照ＮＧ１０８−１５細胞（未処置）は、１００ｍｇまでのタンパク質を用いて、 ウエスタンブロットにより測定すると、１４０キロダルトン及び１８０キロダル トンのアイソフォームを発現するが１２０キロダルトンは発現しない。天然ＯＰ −１のように、ＯＰ−１モーフォンでＮＧ１０８−１５細胞を処置すると、用量 依存的に１８０キロダルトン及び１４０キロダルトンのアイソフォームの発現が 増加し１２０キロダルトンのアイソフォームも誘導されることが意図されている 。さらに、天然ＯＰ−１のようにＯＰ−１モーフォン誘導ＣＡＭ発現が組織学的 検索より細胞集合と関連あることも意図されている。Ｄ．ＯＰ−１モーフォン誘導の形質転換した表現型の再分化 天然ＯＰ−１のようにＯＰ−１モーフォンは形質転換した細胞を形質転換してい ない細胞の形態学的特性を有するものへの再分化を誘導することも意図されてい る。実施例は、以下にモーフォゲン誘導の神経系起源の形質転換したヒト細胞株 (NG108-15)、マウス神経芽腫細胞(NIE-115)及びヒト胎児悪性腫瘍細胞を、形質 転換されていない細胞の形態学的特性を有するものへの再分化の詳細を以下に提 供する。 上述の如く、ＮＧ１０８−１５は神経芽細胞と神経膠腫細胞 を融合して作成された形質転換されたハイブリッド細胞株(ATCC，Rockville，MD から入手できる）であり、形質転換された胎児ニューロンの形態学的特性、例え ば繊維芽細胞的形態、を示す。さらに詳細には、細胞は多角形の細胞体で、短い 、スパイク様プロセスを有しており、隣の細胞とは殆ど接触しない。ＮＧ１０８ ー１５細胞を化学的に特定された無血清培地で０．１−３００ｎｇ／ｍｌのＯＰ −１モーフォン、又は天然のＯＰ−１と一緒に４時間インキュベーションすると 細胞形態学的な変化を秩序よく用量依存的に誘導する。 例えば、ＮＧ１０８ー１５細胞はポリーＬ−リジンコートした６穴で培養され る。各ウエルは２．５ｍｌの化学的に特定された培地に４０−５００００細胞を 含有する。３日目に０．０２５％のトリフルオロ酢酸を含有する６０％エタノー ルで２．５ｍｌのＯＰ−１モーフォン、又は天然のＯＰ−１を各ウエルに添加す る。培地を毎日新しいアリコートのモーフォゲンで換える。ＯＰ−１のように、 ＯＰ−１モーフォンは用量依存的に形質転換した細胞の再分化、細胞体を丸くし 、相の明るさを増加させ、短い軸索の伸長や細胞性超構造の他の著しい変化を含 む、を誘導することも意図されている。数日後、処置された細胞は、顕微鏡検査 で可視的に観察されるように、上皮シートを形成し始め、それはそれから高度に 充填され、多層の集合体になることも意図されている。 さらに、形態学的変化が細胞分化やモーフォゲンの毒性による２次的なもので はないようにして、ＤＮＡ合成や細胞分裂、若しくは細胞生存性と関連する変化 を起こさずに再分化が起こることも意図されている。さらに、モーフォン誘導の 再分化が ３Ｈ−チミジン取り込みで測定した結果、同様な実験で形質転換され多細胞の分 化を促進することが分かっている酪酸、ＤＭＳＯ、レチノイン酸、Ｆｏｒｓｋｏ ｌｉｎとは異なり、細胞分裂を阻害しないことも意図されている。このように再 分化を誘導した後も、天然ＯＰ−１のように、ＯＰ−１モーフォンは細胞の安定 性、及び生存性を維持することも意図されている。 本明細書で開示されるモーフォゲンは、従って、神経系の腫瘍や腫瘍的病変の 治療、特に、網膜芽腫や神経膠腫を含む神経芽腫の治療に有用な治療薬を提供す る。Ｅ．表現型の維持 天然ＯＰ−１のようにＯＰ−１モーフォンは細胞の分化した表現型を維持する のにも使用することができる。この応用は、特に、老化した、又は休止した細胞 の表現型の連続した発現を誘導するのに有用である。（１）表現型維持のin vitroモデル モーフォゲンの表現型維持能力については既に測定されている。多数の分化し た細胞は、当業者で開示されてる標準的な組織培養条件下（例えば、Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques，C．R．Freshney 編、Willey， 1987）でin vitroで何回も継代すると老化するか休止する。しかしながら、これ らの細胞はin vitroでＯＰ−１のようなモーフォゲンと一緒に培養されると、細 胞は何回も継代しても、表現型の発現を維持するのを促進される。例えば、培養 骨芽細胞、例えば培養骨肉腫細胞や頭蓋冠細胞、のアルカリフォスファターゼ活 性は、in vitroで何回も継代した後では著しく減少する。しかしながら、細胞が ＯＰ−１の存在下で培養されると、アルカリ フォスファターゼ活性は長期間、維持される。同様に、筋細胞の表現型発現はモ ーフォゲンの存在下で維持される。 実験は実施例Ａで開示されているように骨 芽細胞を培養する。細胞はいくつかの群、異なる濃度のＯＰ−１モーフォン、天 然ＯＰ−１（例えば、0-300ng/ml）で複数回（例えば3-5 回）継代し、標準的な 技術を用いてインキュベートする、に分けられる。継代され多細胞は分化した細 胞の代謝機能の指標として、実施例Ｃに開示されているように、アルカリフォス ファターゼ活性を測定する。天然ＯＰー１のように、ＯＰ−１モーフォンの不存 在下での骨芽細胞の培養は、ＯＰ−１モーフォン、又は天然ＯＰ−１処置された 細胞と比較して、アルカリフォスファターゼ活性が減少することが意図されてい る。（２）表現型維持のin vivoモデル 表現型維持能力について、標準的なラット骨粗鬆症モデルを用いて示すことが できる。雌性Ｌｏｎｇ Ｅｖａｎｃｅラット（チャールズリバーLaboratories， Wilmington，MA）を、標準的な外科的技術を用いてシャム手術（対照動物）、及 びエストロゲン産生の低下からくる骨粗鬆症的状態を作成するために卵巣摘除術 を施した。手術に続いて、卵巣摘除後例えば２００日に、ラットはリン酸食塩緩 衝液(PBS)、又はモーフォゲン(例えばOP-1モーフォン又は天然OP-1、1-100mg)を ２１日間全身投与する（例えば、毎日、尾静脈に注射）。ラットは殺され血清ア ルカリフォスファターゼ、血清カルシウムレベル、血清オステオカルシンレベル を上述されたような標準的な技術で測定する。ＯＰ−１モーフォン処置ラット、 ＯＰ−１処置ラットのようにオステオカルシンやアルカリフォスファターゼ活性 のレベ ルが上昇することが意図されている。未処置の卵巣摘除されたラットと比較して 、ＯＰ−１モーフォンで処置された動物は、脛骨骨幹骨の組織形態学的検索で骨 量を改善していることも意図されている。Ｆ．幹細胞集団の増殖 幹細胞はin vivo 又はｅx vivoで増殖を促進される。細胞は患者にＯＰ−１モ ーフォンを含有する滅菌製剤を注射又は供給することにより、in vivo で刺激す ることができる。例えば、一人の患者の造血系の多潜能力の幹細胞集団は適当な 濃度のＯＰ−１モーフォンを患者の骨髄に注射、又は供給することにより増殖を 促進される。 幹細胞は、細胞の増殖を促進するのに十分な濃度及び時間で滅菌条件下で形態 形成的に活性なＯＰ−１モーフォンで昂進される集団の幹細胞と接触することに より、ex vivo で促進することができる。適当な濃度及び実験時間は実験的に決 定され、本質的には実施例Ａに開示されている方法に従う。約０．１−１００ｎ ｇ／ｍｌのＯＰ−１モーフォンの濃度、約１０分から約７２時間、より一般的に は２４時間、の刺激時間が一般的には１０⁴から１０⁶の細胞集団を刺激するのに 十分である。刺激された細胞は例えば、適当なin vivo の位置に細胞を注入する ことにより患者に提供される。適切な生体適合性の幹細胞は上述のような当業者 に既知の方法によって得られる。Ｇ．損傷又は病気の組織の再生 ＯＰ−１モーフォンは病気や損傷した哺乳動物の組織を修復するのにも使用で きる。修復されるべき組織は、最初に好ましくは過剰な壊死、又は干渉している 傷組織を、必要に応じて、 例えば、切除、又は医療分野でよく知られている外科的、化学的方法で除去する ことから対処される。 ＯＰ−１モーフォンを滅菌された生体適合性組成物の一部として、又は外科的 移植もしくは注射により組織の部位に直接供給することができる。モーフォンは 、また全身的に、経口、又は全身投与により供給することができる。別の方法と しては、形態形成的に活性なＯＰ−１モーフォンにより刺激された幹細胞を含有 する滅菌された生体適合性の組成物を組織の位置に供給することもできる。その 位置の組織は、病気であれ損傷であれ、幹細胞の増殖と組織特異的分化を許容す る適当なマトリックスを提供する。さらに、損傷、又は病気の組織の位置は特に 外科的手段によりさらに侵襲を受けたものは、形態形成的に許容できる環境を提 供する。ＯＰ−１モーフォンの全身的な供給はある適用には十分である（例えば 、実施例のように、骨粗鬆症や、他の骨リモデリングサイクルの病気の処置など ）。 ある状況下では、組織損傷が拡大しているところは特に、組織は細胞の内向き フラックスや増殖に十分なマトリックスを提供することができない。これらの例 として、以下に述べるように、いかなる手段で調製した適切な生体適合性の、剤 型化されたマトリックスに結合した組織の位置へＯＰ−１モーフォンで刺激され た幹細胞を提供することが必要である。マトリックスは好ましくは生分解性のも のがよい。また、マトリックスは組織特異的であるか、及び／又は７０−８５０ ｍｍ、好ましくは１５０−４２０ｍｍの範囲の、大きさの多孔性の粒子からなる ことができる。 ＯＰ−１モーフォンは外傷に続く免疫／炎症反応―介在の組 織損傷や瘢痕組織形成を防いだり、実質的に阻害するのに使用することができる 。ＯＰ−１モーフォンは新しく損傷を受けた組織部位に供給され、その部位で組 織形態形成を誘導し繊維芽細胞が非分化の結合組織へ移動して集合体を作ること を防ぐ。好ましくはＯＰ−１モーフォンは損傷の５時間以内に組織部位へ注入さ れる滅菌製剤として提供することができる。免疫／炎症反応が避けられないとか 、ゆっくり誘導されるところでは、例えば、外科的又は他の侵襲的な臨床的な治 療の一部として患者に、予防的に、治療の前に、又は一緒に提供することができ る。 以下のいくつかの実施例には、骨、肝、神経、ぞうげ質、セメント質、及び歯 周組織におけるＯＰ−１モーフォン誘導の組織形態形成芽示されている。（１）ＯＰ−１モーフォン誘導骨形態形成 タンパク質の形態形成活性を示し、評価するのに特に有用な哺乳動物の組織モ デル系波頭業者には公知の、例えば本明細書に参考文献として引用されている米 国特許第4,968,590 号に記載されている、内軟骨骨組織形態形成モデルである。 内軟骨性骨形成を誘導する能力は幹細胞の増殖と分化を誘導する能力、軟骨マト リックス形成、軟骨石灰化、骨リモデリングを誘導する能力、適当な血管新生や 造血系骨髄分化を誘導する能力も含まれる。 形態形成物質が置かれている局所 的な環境は組織形態形成には重要である。ここで用いられるように、「局所環境 」とは組織構造的なマトリックスや組織を囲んでいる環境を含むものと理解され る。例えば、それらの増殖に適当な固定する下層を必要とするのに加えて、モー フォゲンで刺激された細胞 はその分化の組織特性を指向する信号を必要とする。これらの信号は組織が異な ると変わり、細胞表面マーカーを含むことができる。さらに、新組織の血管新生 は血管新生を支持する局所的な環境が必要である。 ＯＰ−１モーフォン、及びＯＰ−１モーフォン含有組成物のin vivo での形態 形成的な利用を評価する各種の方法が以下に示されている。組成物は哺乳動物に 注入されるか、外科的に移植され、と業者には公知の多数の方法のいずれを用い ることができる。例えば外科的移植バイオアッセーは、Sampath et al．(1983)P roc．Natl．Acad．Sci．USA 80: 6591-6595 及び米国特許第4,968,590 号の方法 に本質的に従って達成される。 組織学的切片作成や染色は好ましくは特に組織修復過程でin vivoでの形態形 成の程度を決定することができる。摘出された移植物はＢｏｕｓｉｎ溶液で固定 され、パラフィン包埋され６ー８ｍｍの切片に切断される。トルイジン・ブルー 又はヘマトキシリン／エオシン染色は新組織の究極の発達を明確に示せている。 １２日間の移植で、通常、移植物に新しく誘導された組織が含まれるかどうかを みるのであれば十分な時間である。成功した移植は、組織特異的なことを同定し 、追跡するのを許容する誘導された組織の発達のステージを通じて制御された進 展を示す。例えば、内軟骨性骨化のステージは以下のものが含まれる。すなわち 、(1)１日目の白血球、(2)２、３日目に間葉系細胞の移動及び増殖、(3)５、６ 日目に軟骨細胞の出現、(4)７日目に軟骨マトリックス形成、(5)８日目に軟骨石 灰化、(6)９、１０日目に、血管侵襲、骨芽細胞の出現、及び新しい骨の形成、( 7)１２ー１８日目には破骨細胞の出現、骨リモデリングの開始及 び移植マトリックスの溶解、そして(8)２１日目には、できた小骨の中で造血系 骨髄の分化、である。 組織学的評価に加えて、生物学的マーカーも組織形態形成のマーカーに使用す ることができる。有用なマーカーとしては、移植物をホモジナイズした後その活 性をアッセー（例えば、分光学的に）できる組織特異的酵素も含まれる。これら のアッセーは動物から移植物が除去された後、組織形成の定量やその評価を早く 得たい時には有用である。例えばアルカリフォスファターゼ活性は骨形成のマー カーとして使用することができる。 全身投与されたＯＰ−１モーフォンの取り込みは標識化タンパク質（例えば放 射線標識）を利用して新組織のその局在を測定したり、及び／又は標準的な標識 化プロトコルとパルスーチェイス方法を利用して循環系から消失するのをモニタ ーして、追跡することができる。ＯＰ−１モーフォンは組織特異的分子の目印を つけて供給することができ、その取り込みは、モニターすることができ、供給さ れたＯＰ−１モーフォンの濃度と相関する。例として雌性ラットの卵巣除去は骨 アルカリフォスファターゼを減少する結果になりラットに骨粗鬆症を誘発するこ とになる（実施例Ｅのように）。もし雌性ラットがＯＰ−１モーフォンを供給さ れたら、カルシウムの全身的な濃度の減少がみられ、それは供給されたＯＰ−１ モーフォンの存在と相関し、アルカリフォスファターゼの上昇に相当するものと 予測できる。（２）ＯＰ−１モーフォン誘導肝再生 他の例として、実質的に損傷した肝組織及び引き続き、ＯＰ−１モーフォンを 使用して部分的肝切除をした後の形態形成を誘導する方法が示されている。この 一般的なプロトコルの変化 として、他の異なる組織でのＯＰ−１モーフォンモーフォゲン活性を測定するの に有用である。一般的な方法として、組織の本質的に再生しない部分を切除し、 ＯＰ−１モーフォンを投与し、好ましくは摘出した組織部位に可溶性の製剤とし て、そして、傷を閉じ、時間が経過した後その部位を調べることが含まれる。骨 のように、肝は出産後傷の再生能力を有している。 ＯＰ−１モーフォンを、例えば１ｍｇ／ｍｌ，生体適合性溶液で、例えば精製 ＯＰ−１モーフォンを０．１％トリフルオロ酢酸、又は適合性の酸を含有する５ ０％エタノール、もしくは適合性のある溶媒に溶解する。注射可能なＯＰ−１モ ーフォン溶液は、例えば、一容のＯＰ−１モーフォン溶媒−酸貯蔵溶液と９容の ０．２％ラット血清アルブミン含有滅菌ＰＢＳ（食塩リン酸緩衝液）で希釈する 。 実験で、成長中のラット又は老化ラット(例えば、Long Evance，Charles Rive r Laboratories，Wilmington)をケタミンで麻酔する。肝の二つの葉（左及び右 ）が切断され（葉の約1/3）て、切断箇所に沿って、ＯＰ−１モーフォン多数の 部位に局所的に注入した。ＯＰ−１モーフォンの注入量は、例えば１００ー１０ ００μｌのＰＢＳ／ＲＳＡ（食塩リン酸緩衝液／ラット血清アルブミン）注入緩 衝液に２０−１００μｇである。プラセボサンプルは注入緩衝液のみを含有する 。実験的アッセーでは各群５匹のラットが好ましくは使用される。傷は閉じられ ラットは通常の餌を食べ水道水を飲むことが許容される。１２日後ラットは殺さ れ、肝再生を可視的に観察され、ＯＰ−１モーフォンの肝再生に対する効果を最 も効率よく評価する。ＯＰ−１モーフォン注入群は肝に少しも切断跡のない完全 な肝組織再 生を示す。反対に、ＰＢＳのみが注入された対照群は試料に切開部分が残り典型 的に殆ど再生がないことを示す。（３）ＯＰ−１モーフォン誘導ぞうげ質、セメント質、歯周組織再生 さらに他の例として、ＯＰ−１モーフォンのぞうげ質形成を誘導する能力につ いても示すことができる。現在までに、傷に対する歯髄組織の予想できない反応 は歯科領域で臨床的な問題である。サルが低級な非霊長類の哺乳動物より、ヒト 歯科生物学の分野でより指標的になると考えられるのでカニクイザルが霊長類モ デルとして選択される。 標準的な歯科外科的な方法を利用して歯髄の小さい領域(例えば2mm)を試料の 歯の歯髄のすぐ上のエナメル質及びぞうげ質を除去して（ドリルで）、外科的に 暴露し、冠歯髄組織の部分的切断をし止血を誘導し、歯髄処置の適用、標準的な 方法で密封、充填する。 使用された歯髄処置は以下のものが含まれる。すなわち担体マトリックスに分 散されたＯＰ−１モーフォン、担体マトリックス単独、そして無処置、である。 一動物当たり１２の歯（各処置に４つ）が調製され、２頭の動物が使用される。 ４週間で歯を抜きだし、ぞうげ質形成の組織学的検索のためのプロセスにかけ、 及び／又はぞうげ質石灰化を分析するために粉砕される。ＯＰ−１モーフォンの 骨様ぞうげ質の回復にたいする効果が対照試料と比較して可視的に観察される。 天然ＯＰ−１モーフォンのように、ＯＰ−１モーフォン担体マトリックスとで、 外科的に暴露された健常な歯髄に対して、修復的な、ぞうげ質様のブリッジの形 成および回復を誘導することができる。反対 に、担体マトリックスのみで処置された歯髄は修復的なぞうげ質を形成しない。（４）ＯＰ−１モーフォン誘導神経組織修復 さらに別の例として、中枢神経系(CNS)修復に対する再生効果の誘導が形態形 成活性のあるＯＰ−１モーフォンにより、ラット脳刺モデルを用いて示すことが できる。簡単には、雄性Ｌｏｎｇ Ｅｖａｎｃｅラットを麻酔し、頭部を手術の 準備をした。頭蓋冠は標準的な外科的方法で暴露し、各葉の中心の方へドリルで あけた穴を０．０３５Ｋ針金でちょうど頭蓋冠を通した。ＯＰ−１モーフォン(2 5mg)、又は天然ＯＰ−１モーフォン(25mg)、もしくはＰＢＳを癌揺する溶液をＨ ａｍｉｌｔｏｎシリンジを用いて各孔に供給する。溶液は表面から約３ｍｍ下の 深さの下層の皮質、脳梁、海馬に放出される。皮膚は縫合され動物を回復させる ようにする。 手術３日後にラットは脱血して殺され、脳を組織切片作成用にした。瘢痕組織 形成をグリア原繊維産生タンパク質のための経口免疫染色、グリア瘢痕のための マーカータンパク質により瘢痕形成の程度を定量的に測定するのに評価される。 天然ＯＰ−１モーフォンのように、ＯＰ−１モーフォンはＯＰ−１モーフォンで 処置された動物の組織切片でのグリア原繊維の産生タンパク質のレベルが減少す る結果になり、モーフォゲンのグリア瘢痕形成を阻害し、それにより、神経再生 を促進する能力がある証拠を示す。 抹消神経系軸索の長い距離に渡る成長に対するＯＰ−１モーフォンの能力は以 下のモデルを用いて示すことができる。抹消神経系のニューロンはその損傷に続 く突起の芽を伸ばすことが できるが、誘導がなければ、これらの発芽は一般的には適当に接続できず死ぬ。 例えば損傷が、５又は１０ｍｍより大きい場合は再生はほんのわづかか、又はな い。ＯＰ−１を用いた以前の実験で、モーフォゲンは抹消神経系の軸索の長い距 離に渡る成長を促進し、損傷した末梢神経回路の修復や再生をすることを示す。 この実施例でＯＰー１モーフォンの神経再生の促進は坐骨神経モデルを用いい て示すことができる。ラット神経モデルは、ひどい端に食塩水を充填した神経誘 導チャネルを挿入すれば、５ｍｍの間隔、時には１０ｍｍの間隔を一度に再生す ることができる。この実験では少なくとも１２ｍｍ間隔の神経再生が試験される 。 ２３０ー２５０ｇの体重の成長Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット(Charles River Laboratories，Inc.)にペントバルビタールナトリウム塩（30mg/kg 体重 ）を腹腔内注射し、麻酔する。尾部から大腿まで平行に皮膚切開術が施された。 外側広筋と鍵の間の無血管筋肉横断面を入れ、坐骨神経のまわりの弛緩された線 維疎水性の組織に続く。弛緩組織は縦にそって分けられ、それによって、どこの 部分も無血管にしないでその全長の坐骨神経を除去する。外科顕微鏡下に、坐骨 神経は大腿中部でマイクロ鋏で切断され神経断端を１２ｍｍ分け、ＯＰ−１モー フォンゲル移植片を移植する。移植領域は長さ２０ｍｍ、直径１．５ｍｍのシリ コンチューブに、その中にはモーフォン溶液が充填されているが、入れられる。 より詳細には、中心１２ｍｍのチューブは、約１００ｍｌのＭＡＴＲＩＧＥＬＴ Ｍ(Colla boratuve Research Inc.，Bedford，MA)と１ー５ｍｇの実質的 に純粋なＯＰ−１モーフォンを混合して調製されたＯＰ−１モーフォゲンゲル、 食塩リン酸緩衝液中にラミニン、タイプIVコラーゲン、ヘパリン硫酸、プロテオ グリカン及びエンタクチンを含む可溶化組織基底膜を含有する、マウス肉腫組織 由来の細胞外マトリックス抽出物からなる。モーフォン充填チューブはそれから 直接欠損部位に、各端４ｍｍ断端に挿入されるよう移植される。各断端はモルフ ォンゲルと隣接し、市販で入手できる外科用１０−０ナイロンで神経上膜、線維 束保護シース、を通して３針でシリコンチューブに固定される。 ＯＰ−１モーフォゲンゲル移植片に加えて、空のシリコンチューブの対照移植 片、ゲルのみ充填されたシリコンチューブ、逆「自己移植」、ここでは動物の坐 骨神経の１２ｍｍに切断された切片を縫合する前に１８０°回転させる（逆さま にする）が、これらも移植されるのが好ましい。全ての実験はｎ＝４で行われる のが好ましい。全ての傷は１０日後には除去されるクリップで閉じられるのが好 ましい。ラットの両足に移植することができる。３週間で、動物は殺され移植切 片は除去されドライアイスでただちに凍結させる。そして、凍結切片を移植部位 の至る所で切断し、フルロセインで標識化した抗ニューロフィラメント抗体（例 えば、Sigma Chemical Co.，St．Louis から入手できる）を用いた蛍光免疫染色 により軸索の再生を検査した。 空隙がＯＰ−１モーフォゲンで充填される場合は、全ての移植部位で１２ｍｍ の長さ全体に渡って坐骨神経の再生が起こることが意図されている。反対に、空 のシリコンチューブ、ゲルのみ、逆「自己移植」の場合は神経再生はおこらない 。 本発明は、その真意と範囲から離れずに他の特定の形でも実施できる。従って 、他の実施の態様も以下のクレームの範囲内である。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年６月２５日 【補正内容】 請求の範囲 １．Ｖｇ／ｄｐｐグループメンバー、ＧＤＰグループメンバー又はインヒビン グループメンバーにより決定されるアミノ酸配列を含み、及びアミノ酸が、フィ ンガー１、フィンガー２及びヒール領域を決定し、フィンガー１、フィンガー２ 及びヒール領域は一緒になってリガンドの結合する受容体、好ましくは前記のグ ループメンバーと結合する受容体、の相互作用的表面に相補的な表面を形成する 構成物であって、該構成物が前記の受容体に結合するとき、前記のグループメン バーの生物活性を模倣する、合成一本鎖アミノ酸バイオポリマー構成物。 ２．前記の受容体に結合する際、当該構成物が形態学的なカスケードを開始さ せる請求項１の構成物。 ３．フィンガー１領域のアミノ酸配列が折りたたまれて、ＮからＣ方向に、第 一βシート、らせんターン、ループ及び前記の第一βシートに実質的に逆平行に 配列される第二βシートより構成される二次構造が決定され、ヒール領域のアミ ノ酸配列が折りたたまれて、アルファらせんコイルより構成される二次構造が決 定され、かつ、フィンガー２領域のアミノ酸配列が折りたたまれて、ＮからＣ方 向に、βシート、ループ、及び前記の第一βシートに実質的に逆平行に配列され る第二βシートより構成される二次構造が決定される、請求項１の構成物。 ４．前記のフィンガー１とフィンガー２領域が、近隣に伸張 する逆平行のひだ状βシート、実質的に平行な軸、及び前記の平行軸を横断する 位置に配列するらせん状コイルよりなるヒール領域で構成される請求項１又は３ の構成物。 ５．フィンガー１の配列が下記のフィンガー１の配列グープから選択されるも のである請求１の構成物。 dpp 配列番号 6 残基 2から29、 Vg-1 配列番号 7 残基 2から29、 Vgr-1 配列番号 8 残基 2から29、 60A 配列番号 9 残基 2から29、 BMP-2A 配列番号 10 残基 2から29、 BMP-3 配列番号 11 残基 2から29、 BMP-4 配列番号 12 残基 2から29、 BMP-5 配列番号 13 残基 2から29、 BMP-6 配列番号 14 残基 2から29、 Dorsalin 配列番号 15 残基 2から29、 OP-1 配列番号 16 残基 2から29、 OP-2 配列番号 17 残基 2から29、 OP-3 配列番号 18 残基 2から29、 GDF-1 配列番号 19 残基 2から29、 GDF-3 配列番号 20 残基 2から29、 GDF-9 配列番号 21 残基 2から29、 Inhibin α 配列番号 22 残基 2から29、 Inhibin βA 配列番号 23 残基 2から29、及び Inhibin βB 配列番号 24 残基 2から29、 ６．ヒールの配列が下記のヒールの配列グループから選択されるものである請 求項１又は５の構成物。 dpp 配列番号 6 残基 35 から65、 Vg-1 配列番号 7 残基 35 から65、 Vgr-1 配列番号 8 残基 35 から65、 60A 配列番号 9 残基 35 から65、 BMP-2 配列番号 10 残基 35 から64、 BMP-3 配列番号 11 残基 35 から66、 BMP-4 配列番号 12 残基 35 から64 BMP-5 配列番号 13 残基 35 から65、 BMP-6 配列番号 14 残基 35 から65、 Dorsalin 配列番号 15 残基 35 から65、 OP-1 配列番号 16 残基 35 から65、 OP-2 配列番号 17 残基 35 から65、 OP-3 配列番号 18 残基 35 から65、 GDF-1 配列番号 19 残基 35 から70、 GDF-3 配列番号 20 残基 35 から64、 GDF-9 配列番号 21 残基 35 から65、 Inhibin α 配列番号 22 残基 35 から65、 Inhibin βA 配列番号 23 残基 35 から69、及び Inhibin βB 配列番号 24 残基 35 から68、 ７．フィンガー２の配列が下記のフィンガー２の配列グループから選択される ものである請求項１又は５の構成物。 dpp 配列番号 6 残基 68 から98、 Vg-1 配列番号 7 残基 68 から98、 Vgr-1 配列番号 8 残基 68 から98、 60A 配列番号 9 残基 68 から98、 BMP-2A 配列番号 10 残基 67 から97、 BMP-3 配列番号 11 残基 69 から99、 BMP-4 配列番号 12 残基 67 から97 BMP-5 配列番号 13 残基 68 から98、 BMP-6 配列番号 14 残基 68 から98、 Dorsalin 配列番号 15 残基 68 から99、 OP-1 配列番号 16 残基 68 から98、 OP-2 配列番号 17 残基 68 から98、 OP-3 配列番号 18 残基 68 から98、 GDF-1 配列番号 19 残基 73 から103 GDF-3 配列番号 20 残基 67 から97、 GDF-9 配列番号 21 残基 68 から98、 Inhibin α 配列番号 22 残基 68 から101、 Inhibin βA 配列番号 23 残基 72 から102 及び Inhibin βB 配列番号 24 残基 71 から101 ８．フィンガー２の配列が下記のフィンガー２の配列グループから選択される ものである請求項６の構成物。 dpp 配列番号 6 残基 68 から98、 Vg-1 配列番号 7 残基 68 から98、 Vgr-1 配列番号 8 残基 68 から98、 60A 配列番号 9 残基 68 から98、 BMP-2A 配列番号 10 残基 67 から97、 BMP-3 配列番号 11 残基 69 から99、 BMP-4 配列番号 12 残基 67 から97 BMP-5 配列番号 13 残基 68 から98、 BMP-6 配列番号 14 残基 68 から98、 Dorsalin 配列番号 15 残基 68 から99、 OP-1 配列番号 16 残基 68 から98、 OP-2 配列番号 17 残基 68 から98、 OP-3 配列番号 18 残基 68 から98、 GDF-1 配列番号 19 残基 73 から103 GDF-3 配列番号 20 残基 67 から97、 GDF-9 配列番号 21 残基 68 から98、 Inhibin α 配列番号 22 残基 68 から101、 Inhibin βA 配列番号 23 残基 72 から102 及び Inhibin βB 配列番号 24 残基 71 から101 ９．フィンガー１の配列が下記の配列グループから選択されるものである請求 項１の構成物。 dpp 配列番号 6 残基 2から29、 Vg-1 配列番号 7 残基 2から29、 Vgr-1 配列番号 8 残基 2から29、 60A 配列番号 9 残基 2から29、 BMP-2A 配列番号 10 残基 2から29、 BMP-3 配列番号 11 残基 2から29、 BMP-4 配列番号 12 残基 2から29、 BMP-5 配列番号 13 残基 2から29、 BMP-6 配列番号 14 残基 2から29、 Dorsalin 配列番号 15 残基 2から29、 OP-1 配列番号 16 残基 2から29、 OP-2 配列番号 17 残基 2から29、 OP-3 配列番号 18 残基 2から29、 １０．ヒールの配列が下記の配列グループから選択されるものである請求項１又 は９の構成物。 dpp 配列番号 6 残基 35 から65、 Vg-1 配列番号 7 残基 35 から65、 Vgr-1 配列番号 8 残基 35 から65、 60A 配列番号 9 残基 35 から65、 BMP-2 配列番号 10 残基 35 から64、 BMP-3 配列番号 11 残基 35 から66、 BMP-4 配列番号 12 残基 35 から64 BMP-5 配列番号 13 残基 35 から65、 BMP-6 配列番号 14 残基 35 から65、 Dorsalin 配列番号 15 残基 35 から65、 OP-1 配列番号 16 残基 35 から65、 OP-2 配列番号 17 残基 35 から65、 OP-3 配列番号 18 残基 35 から65、 １１．フィンガー２の配列が下記の配列グループから選択されるものである請求 項１又は９の構成物。 dpp 配列番号 6 残基 68 から98、 Vg-1 配列番号 7 残基 68 から98、 Vgr-1 配列番号 8 残基 68 から98、 60A 配列番号 9 残基 68 から98、 BMP-2A 配列番号 10 残基 67 から97、 BMP-3 配列番号 11 残基 69 から99、 BMP-4 配列番号 12 残基 67 から97 BMP-5 配列番号 13 残基 68 から98、 BMP-6 配列番号 14 残基 68 から98、 Dorsalin 配列番号 15 残基 68 から99、 OP-1 配列番号 16 残基 68 から98、 OP-2 配列番号 17 残基 68 から98、 OP-3 配列番号 18 残基 68 から98、 １２．フィンガー２の配列が下記の配列グループから選択されるものである請求 項１０の構成物。 dpp 配列番号 6 残基 68 から98、 Vg-1 配列番号 7 残基 68 から98、 Vgr-1 配列番号 8 残基 68 から98、 60A 配列番号 9 残基 68 から98、 BMP-2A 配列番号 10 残基 67 から97、 BMP-3 配列番号 11 残基 69 から99、 BMP-4 配列番号 12 残基 67 から97 BMP-5 配列番号 13 残基 68 から98、 BMP-6 配列番号 14 残基 68 から98、 Dorsalin 配列番号 15 残基 68 から99、 OP-1 配列番号 16 残基 68 から98、 OP-2 配列番号 17 残基 68 から98、 OP-3 配列番号 18 残基 68 から98、 １３．フィンガー１の配列がＯＰ−１フィンガー１の配列〔配列番号16、残基 2 から29〕である請求項１の構成物。 １４．ヒールの配列がＯＰ−１ヒールの配列〔配列番号16、残基35から65〕であ る請求項１又は１３の構成物。 １５．フィンガー２の配列がＯＰ−１フィンガー２の配列〔配列番号16、残基68 から98〕である請求項１又は１３の構成物。 １６．フィンガー２の配列がＯＰ−１フィンガー２の配列〔配列番号16、残基68 から98〕である請求項１４の構成物。 １７．フィンガー１の配列がＯＰ−１フィンガー１の配列〔配列番号16、残基 2 から29〕であり、ヒールの配列がＯＰ−１ヒールの配列〔配列番号16、残基35か ら65〕であり、フィンガー２の配列がＯＰ−１フィンガー２の配列〔配列番号16 、残基68から98〕である請求項１の構成物。 １８．フィンガー１領域が、ＯＰ−１フィンガー１大ペプチド〔配列番号16、残 基 5から28〕、ＯＰ−１フィンガー１中ペプチド〔配列番号16、残基 7から26〕 及びＯＰ−１フィンガー１小ペプチド〔配列番号16、残基11から22〕のグループ よりなる群から選択された配列からなり、ヒール領域が、ＯＰ−１フィンガー１ 大ペプチド〔配列番号16、残基49から64〕、ＯＰ−１フィンガー１中ペプチド〔 配列番号16、残基52から64〕及びＯＰ−１フィンガー１小ペプチド〔配列番号16 、残基56から62〕 のグループよりなる群から選択された配列からなり、およびフィンガー２領域が 、ＯＰ−１フィンガー１大ペプチド〔配列番号16、残基75から91〕、ＯＰ−１フ ィンガー１中ペプチド〔配列番号16、残基77から89〕、ＯＰ−１フィンガー１小 ペプチド〔配列番号16、残基79から37〕のグループよりなる群から選択された配 列からなる請求項１の構成物。 １９．前記フィンガー領域、前記ヒール領域及び前記フィンガー２領域が一対の ポリペプチドリンカーで結合し、前記の一本鎖アミノ酸構成物を産生する請求項 １又は３の構成物。 ２０．前記リンカーが３から１３アミノ酸よりなる請求項１９の構成物。 ２１．前記の領域が下記のグループからなるアミノ酸配列から選択されたもので あり、Ｈは前記のヒール領域よりなるアルファらせん領域で、Ｆ１はフィンガー １領域を決定する一対の逆平行のβ鎖構成物よりなり、Ｆ２はフィンガー２領域 を決定する一対の逆平行のβ鎖構成物よりなり、各々のフィンガーとヒール領域 はシステイン残基で始まりまた終わり、各々のリンカーは３から１３のアミノ酸 からなり、そして、グループ(a)と(b)はさらに任意にＮ末端配列を包含する請求 項１の構成物。 (a) Ｆ１−リンカー−Ｆ２−リンカー−Ｈ； (b) Ｆ１−リンカー−Ｈ−リンカー−Ｆ２； (c) Ｆ２−リンカー−Ｆ１−リンカー−Ｈ； (d) Ｆ２−リンカー−Ｈ−リンカー−Ｆ１； (e) Ｈ−リンカー−Ｆ１−リンカー−Ｆ２；そして、 (f) Ｈ−リンカー−Ｆ２−リンカー：Ｆ１； ２２．Ｆ１が、ＮからＣの方向に、第一β鎖、らせんループ、及び第一β鎖に逆 平行の第二β鎖よりなる請求項２１の構成物。 ２３．Ｆ２が、ＮからＣの方向に、第一β鎖、ループ、及び第一β鎖に逆平行の 第二β鎖よりなる請求項２１の構成物。 ２４．請求項１、３又は２１に記載の構成物のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ 。 ２５．請求項２４のＤＮＡを発現する細胞株。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/36 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．合わせてＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーの受容体の相互作用を する表面に相補的であるフィンガー１、フィンガー２及びヒール領域を決定する アミノ酸配列及びＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーの構造を模倣するア ミノ酸配列で、当該構成物が前記受容体に選択的に結合するものよりなる合成一 本鎖アミノ酸バイオポリマー構成物。 ２．前記の受容体構造に結合する際、当該構成物がＴＧＦ−βスーパーファミ リーメンバーの生物活性を模倣する請求項１の構成物。 ３．前記の受容体に結合する際、当該構成物が形態学的なカスケードを開始さ せる請求項２の構成物。 ４．フィンガー１領域のアミノ酸配列が折りたたまれて、ＮからＣ方向に、第 一βシート、らせんターン、ループ及び前記の第一βシートに実質的に逆平行に 配列される第二βシートより構成される二次構造が決定され、ヒール領域のアミ ノ酸配列が折りたたまれて、アルファらせんコイルより構成される二次構造が決 定され、かつ、フィンガー２領域のアミノ酸配列が折りたたまれて、ＮからＣ方 向に、βシート、ループ、及び前記の第一βシートに実質的に逆平行に配列され る第二βシートより構成される二次構造が決定される、請求項１の構成物。 ５．前記のフィンガー１とフィンガー２領域が、近隣に伸張する逆平行のひだ 状ベータシート、実質的に平行な軸及び前記の平行軸を横断する位置に配列する らせん状コイルよりなる領域で構成される請求項１又は４の構成物。 ６．フィンガー１の配列が下記のフィンガー１の配列グループから選択される 請求項４の構成物。 TGF-β1 配列番号 1 残基 2から29、 F-β2 配列番号 2 残基 2から29、 TGF-β3 配列番号 3 残基 2から29、 TGF-β4 配列番号 4 残基 2から29、 TGF-β5 配列番号 5 残基 2から29、 dpp 配列番号 6 残基 2から29、 Vg-1 配列番号 7 残基 2から29、 Vgr-1 配列番号 8 残基 2から29、 60A 配列番号 9 残基 2から29、 BMP-2A 配列番号 10 残基 2から29、 BMP-3 配列番号 11 残基 2から29、 BMP-4 配列番号 12 残基 2から29、 BMP-5 配列番号 13 残基 2から29、 BMP-6 配列番号 14 残基 2から29、 Dorsalin 配列番号 15 残基 2から29、 OP-1 配列番号 16 残基 2から29、 OP-2 配列番号 17 残基 2から29、 OP-3 配列番号 18 残基 2から29、 GDF-1 配列番号 19 残基 2から29、 GDF-3 配列番号 20 残基 2から29、 GDF-9 配列番号 21 残基 2から29、 Inhibin α 配列番号 22 残基 2から29、 Inhibin βA 配列番号 23 残基 2から29、及び Inhibin βB 配列番号 24 残基 2から29、 ７．ヒールの配列が下記のヒールの配列グループから選択される請求項４又は ６の構成物。 TGF-β1 配列番号 1 残基 35 から62、 TGF-β2 配列番号 2 残基 35 から62、 TGF-β3 配列番号 3 残基 35 から62、 TGF-β4 配列番号 4 残基 35 から62、 TGF-β5 配列番号 5 残基 35 から62、 dpp 配列番号 6 残基 35 から65、 Vg-1 配列番号 7 残基 35 から65、 Vgr-1 配列番号 8 残基 35 から65、 60A 配列番号 9 残基 35 から65、 BMP-2A 配列番号 10 残基 35 から64、 BMP-3 配列番号 11 残基 35 から66、 BMP-4 配列番号 12 残基 35 から64 BMP-5 配列番号 13 残基 35 から65、 BMP-6 配列番号 14 残基 35 から65、 Dorsalin 配列番号 15 残基 35 から65、 OP-1 配列番号 16 残基 35 から65、 OP-2 配列番号 17 残基 35 から65、 OP-3 配列番号 18 残基 35 から65、 GDF-1 配列番号 19 残基 35 から70、 GDF-3 配列番号 20 残基 35 から64、 GDF-9 配列番号 21 残基 35 から65、 Inhibin α 配列番号 22 残基 35 から65、 Inhibin βA 配列番号 23 残基 35 から69、及び Inhibin βB 配列番号 24 残基 35 から68、 ８．フィンガー２の配列が下記のフィンガー２の配列グループから選択される 請求項４又は６の構成物。 TGF-β1 配列番号 1 残基 65 から94、 TGF-β2 配列番号 2 残基 65 から94、 TGF-β3 配列番号 3 残基 65 から94、 TGF-β4 配列番号 4 残基 65 から94、 TGF-β5 配列番号 5 残基 65 から94、 dpp 配列番号 6 残基 68 から98、 Vg-1 配列番号 7 残基 68 から98、 Vgr-1 配列番号 8 残基 68 から98、 60A 配列番号 9 残基 68 から98、 BMP-2A 配列番号 10 残基 67 から97、 BMP-3 配列番号 11 残基 69 から99、 BMP-4 配列番号 12 残基 67 から97 BMP-5 配列番号 13 残基 68 から98、 BMP-6 配列番号 14 残基 68 から98、 Dorsalin 配列番号 15 残基 68 から99、 OP-1 配列番号 16 残基 68 から98、 OP-2 配列番号 17 残基 68 から98、 OP-3 配列番号 18 残基 68 から98、 GDF-1 配列番号 19 残基 73 から103 GDF-3 配列番号 20 残基 67 から97、 GDF-9 配列番号 21 残基 68 から98、 Inhibin α 配列番号 22 残基 68 から101、 Inhibin βA 配列番号 23 残基 72 から102 及び Inhibin βB 配列番号 24 残基 71 から101 ９．フィンガー２の配列が下記のフィンガー２の配列グループから選択される 請求項７の構成物。 TGF-β1 配列番号 1 残基 65 から94、 TGF-β2 配列番号 2 残基 65 から94、 TGF-β3 配列番号 3 残基 65 から94、 TGF-β4 配列番号 4 残基 65 から94、 TGF-β5 配列番号 5 残基 65 から94、 dpp 配列番号 6 残基 68 から98、 Vg-1 配列番号 7 残基 68 から98、 Vgr-1 配列番号 8 残基 68 から98、 60A 配列番号 9 残基 68 から98、 BMP-2A 配列番号 10 残基 67 から97、 BMP-3 配列番号 11 残基 69 から99、 BMP-4 配列番号 12 残基 67 から97 BMP-5 配列番号 13 残基 68 から98、 BMP-6 配列番号 14 残基 68 から98、 Dorsalin 配列番号 15 残基 68 から99、 OP-1 配列番号 16 残基 68 から98、 OP-2 配列番号 17 残基 68 から98、 OP-3 配列番号 18 残基 68 から98、 GDF-1 配列番号 19 残基 73 から103 GDF-3 配列番号 20 残基 67 から97、 GDF-9 配列番号 21 残基 68 から98、 Inhibin α 配列番号 22 残基 68 から101、 Inhibin βA 配列番号 23 残基 72 から102 及び Inhibin βB 配列番号 24 残基 71 から101 １０．フィンガー１の配列が下記の配列グループから選択される請求項４の構成 物。 dpp 配列番号 6 残基 2から29、 Vg-1 配列番号 7 残基 2から29、 Vgr-1 配列番号 8 残基 2から29、 60A 配列番号 9 残基 2から29、 BMP-2A 配列番号 10 残基 2から29、 BMP-3 配列番号 11 残基 2から29、 BMP-4 配列番号 12 残基 2から29、 BMP-5 配列番号 13 残基 2から29、 BMP-6 配列番号 14 残基 2から29、 Dorsalin 配列番号 15 残基 2から29、 OP-1 配列番号 16 残基 2から29、 OP-2 配列番号 17 残基 2から29、及び OP-3 配列番号 18 残基 2から29、 １１．ヒールの配列が下記の配列グループから選択される請求項４又は１０の構 成物。 dpp 配列番号 6 残基 35 から65、 Vg-1 配列番号 7 残基 35 から65、 Vgr-1 配列番号 8 残基 35 から65、 60A 配列番号 9 残基 35 から65、 BMP-2A 配列番号 10 残基 35 から64、 BMP-3 配列番号 11 残基 35 から66、 BMP-4 配列番号 12 残基 35 から64 BMP-5 配列番号 13 残基 35 から65、 BMP-6 配列番号 14 残基 35 から65、 Dorsalin 配列番号 15 残基 35 から65、 OP-1 配列番号 16 残基 35 から65、 OP-2 配列番号 17 残基 35 から65、 OP-3 配列番号 18 残基 35 から65、 ２．フィンガー２の配列が下記の配列グループから選択される請求項４又は１ ０の構成物。 dpp 配列番号 6 残基 68 から98、 Vg-1 配列番号 7 残基 68 から98、 Vgr-1 配列番号 8 残基 68 から98、 60A 配列番号 9 残基 68 から98、 BMP-2A 配列番号 10 残基 67 から97、 BMP-3 配列番号 11 残基 69 から99、 BMP-4 配列番号 12 残基 67 から97 BMP-5 配列番号 13 残基 68 から98、 BMP-6 配列番号 14 残基 68 から98、 Dorsalin 配列番号 15 残基 68 から99、 OP-1 配列番号 16 残基 68 から98、 OP-2 配列番号 17 残基 68 から98、 OP-3 配列番号 18 残基 68 から98、 １３．フィンガー２の配列が下記の配列グループから選択される請求項１１の構 成物。 dpp 配列番号 6 残基 68 から98、 Vg-1 配列番号 7 残基 68 から98、 Vgr-1 配列番号 8 残基 68 から98、 60A 配列番号 9 残基 68 から98、 BMP-2A 配列番号 10 残基 67 から97、 BMP-3 配列番号 11 残基 69 から99、 BMP-4 配列番号 12 残基 67 から97 BMP-5 配列番号 13 残基 68 から98、 BMP-6 配列番号 14 残基 68 から98、 Dorsalin 配列番号 15 残基 68 から99、 OP-1 配列番号 16 残基 68 から98、 OP-2 配列番号 17 残基 68 から98、 OP-3 配列番号 18 残基 68 から98、 １４．フィンガー１の配列がＯＰ−１フィンガー１の配列〔配列番号16、残基 2 から29〕である請求項４の構成物。 １５．ヒールの配列がＯＰ−１ヒールの配列〔配列番号16、残 基35から65〕である請求項４又は１４の構成物。 １６．フィンガー２の配列がＯＰ−１フィンガー２の配列〔配列番号16、残基68 から98〕である請求項４又は１４の構成物。 １７．フィンガー２の配列がＯＰ−１フィンガー２の配列〔配列番号16、残基68 から98〕である請求項１５の構成物。 １８．フィンガー１の配列がＯＰ−１フィンガー１の配列〔配列番号16、残基 2 から29〕であり、ヒールの配列がＯＰ−１ヒールの配列〔配列番号16、残基35か ら65〕であり、フィンガー２の配列がＯＰ−１フィンガー２の配列〔配列番号16 、残基68から98〕である請求項４の構成物。 １９．フィンガー１領域が、ＯＰ−１フィンガー１大ペプチド〔配列番号16、残 基 5から28〕、ＯＰ−１フィンガー１中ペプチド〔配列番号16、残基 7から26〕 及びＯＰ−１フィンガー１小ペプチド〔配列番号16、残基11から22〕のグループ よりなるものから選択されたものであり、ヒール領域が、ＯＰ−１フィンガー１ 大ペプチド〔配列番号16、残基49から64〕、ＯＰ−１フィンガー１中ペプチド〔 配列番号16、残基52から64〕及びＯＰ−１フィンガー１小ペプチド〔配列番号16 、残基56から62〕のグループよりなるものから選択されたものであり、 フィン ガー２領域が、ＯＰ−１フィンガー１大ペプチド〔配列番号16、残基75から91〕 、ＯＰ−１フィンガー１中ペプチド〔配列番号16、残基77から89〕及びＯＰ−１ フィンガー１小ププチド〔 配列番号16、残基79から37〕のグループよりなるものから選択されたものである 請求項１の構成物。 ２０．前記フィンガー領域、前記ヒール領域及び前記フィンガー２領域が一対の ポリペプチドリンカーによって結合し、前記の単鎖アミノ酸構成物を産生する請 求項１又は４の構成物。 ２１．前記リンカーが３から１３アミノ酸よりなる請求項20の構成物。 ２２．前記の領域が下記のグループからなるアミノ酸配列から選択されるもので あり、Ｈは前記のヒール領域よりなるアルファらせん領域で、Ｆ１はフィンガー １領域を決定する一対の逆平行のベータ鎖構成物よりなり、Ｆ２はフィンガー２ 領域を決定する一対の逆平行のベータ鎖構成物よりなり、各々のフィンガーとヒ ール領域はシステイン残基で始まりまた終わり、各々のリンカーは３から１３の アミノ酸からなり、そして、グループ(a)と(b)はさらに任意にＮ末端配列を包含 する請求項１の構成物。 (a) Ｆ１−リンカー−Ｆ２−リンカー−Ｈ； (b) Ｆ１−リンカー−Ｈ−リンカー−Ｆ２； (c) Ｆ２−リンカー−Ｆ１−リンカー−Ｈ； (d) Ｆ２−リンカー−Ｈ−リンカー−Ｆ１； (e) Ｈ−リンカー−Ｆ１−リンカー−Ｆ２；そして、 (f) Ｈ−リンカー−Ｆ２−リンカー−Ｆ１； ２３．Ｆ１が、ＮからＣの方向に、第一ベータ鎖、らせんループ、及び第一ベー タ鎖に逆平行の第二ベータ鎖よりなる請求項２２の構成物。 ２４．Ｆ２が、ＮからＣの方向に、第一ベータ鎖、ループ、及び第一ベータ鎖に 逆平行の第二ベータ鎖よりなる請求項２２の構成物。 ２５．請求項１、４又は２２に記載の構成物のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ 。 ２６．請求項２５のＤＮＡを発現する細胞株。