JPH11510902A

JPH11510902A - 医療サンプルの分析におけるヘモグロビン干渉の排除方法

Info

Publication number: JPH11510902A
Application number: JP9541629A
Authority: JP
Inventors: ヴァイスハイト，ラルフ; プフィチュラー，エルク
Original assignee: ベーリンガーマンハイムゲーエムベーハー
Priority date: 1996-05-31
Filing date: 1997-05-30
Publication date: 1999-09-21
Also published as: WO1997045733A1; CZ389598A3; EP0906570A1; TW407202B; AU3093597A; HUP9903344A2; DE59702900D1; IL127275A0; ES2154463T3; EP0906570B1; DK0906570T3; DE19622090A1; KR20000010767A; NZ331491A; PL330220A1; CA2255851A1; ATE198670T1; CN1216614A

Abstract

(57)【要約】本発明は、主測定波長および第２測定波長で光学的二色測定による遊離ヘモグロビン含有サンプル中のアナライトの測定方法に関する。ヘモグロビンの吸収バンドを含む475nm以上の第２測定波長が用いられる。

Description

【発明の詳細な説明】医療サンプルの分析におけるヘモグロビン干渉の排除方法本発明は、測定が主波長および第２波長での光学的二色測定により行われることを特徴とする遊離ヘモグロビン含有サンプル中のアナライトの測定方法に関する。特に、本方法は、医療サンプル（例えば、血清または血漿サンプル）中のパラメーターであるアンモニア、クレアチンキナーゼおよびそのイソ酵素、ならびに乳酸デヒドロゲナーゼおよびそのイソ酵素の測定に好適である。溶血は、多くのアナライトの測定を、或る場合には顕著な程度に干渉することが一般に知られている。それにもかかわらず、誤りのない測定値を得るために、これまでに溶血の干渉を排除するための種々の方法が発表されている。これらの方法の１つは、自動分析装置で測定する際に、第１の波長（主波長）に加えて第２の波長（第２波長）を用いるものであり、このことにより、ヘモグロビン、ビリルビンおよび脂肪血症(lipaemia)のような干渉性物質の干渉の影響が排除されるかまたは少なくとも最小に抑えられる。そのための１つの要件は、第２波長において、測定すべき物質が可能な限り小さな吸収を有し、これに対して干渉性物質は主波長におけるレベルと可能な限り同じレベルの吸収を有することである("Ｐraxistechnik: Ｐhotometer fur die Ａrztliche Ｐraxis,Ｄeutscher Ａrzteverlag”1977,41〜42頁)。ＤＩＡ letter（Ｂoehringer Ｍannheim）Ｎo.70(1985)には、第２波長は主波長にできるだけ近くすべきである、と記載されている。その理由は、そのような場合、一般に干渉性物質は主波長と第２波長とにおいて同様の吸光度を有するからである。Ｃlin.Ｃhem.25/16、951〜959(1979)には、第２波長は、クロモゲン（色原体）の吸収極小点付近であって、かつ干渉性物質の吸収極大点付近であるように選定すべきであると指摘されている。これに関して、グルコースの測定には380nm の第２波長が推奨されている(主波長は340nm)。その理由は、この波長での干渉性物質の吸光度は340nmでの吸光度に近似しているからである。これに対して、Ｅur.Ｊ.Ｃlin.Ｃhem.Ｃlin.Ｂiochem.31/9,595-601(1993)では、 380nmの第２波長でＵＶ試験を測定することには問題があると考えられている。何故ならば、この場合、Ｈb-Ｏ₂がメト-Ｈbへ変換することにより380nmにおけるスペクトルに変化が生じ、そのため測定に誤差が生じるからである。したがって、ＮＡＤ(P)Ｈの増減の測定に基づく試験には、いわゆるソーレー領域よりも長波長の第２波長（例えば、475nm）が推奨されている。従来の方法は全て、溶血により生ずる誤った測定において干渉を排除することに関するものである。ヘモグロビンをベースとする代用血液の利用可能性により、天然もしくは合成ヘモグロビンまたはＨbに類似する化合物による干渉の排除の問題は、これまでよりもさらに一層深刻さを増している。代用血液療法では、血清または血漿のヘモグロビン含有量が最大で2000mg/dlであり得るので、そのような干渉は、非溶血性サンプル材料においても生じる一方で、天然の溶血の場合よりもその度合が顕著である。さらに、アンモニア、クレアチンキナーゼとそのイソ酵素、および乳酸デヒドロゲナーゼとそのイソ酵素のような特定のアナライトを測定する場合、475nmまたはそれ以上（例えば、480、505、600、660または700nm）の第２波長を用いることによってヘモグロビン干渉の十分な排除を達成することは容易にはできないことがわかった。これらのパラメーターは、心血管診断および緊急時の診断ならびに代用血液で治療された患者の診断にとって本質的に重要なので、本発明の目的は、特に上記のアナライトを測定する場合における、天然ヘモグロビンにより、または合成ヘモグロビンもしくはヘモグロビン類似化合物をベースとする代用血液により生じる干渉を排除するための簡単な方法を提供することである。本発明の目的は、ヘモグロビンの吸収バンドが位置する475nm以上の第２波長を用いることを特徴とする、主波長および第２波長での光学的二色測定による遊離ヘモグロビン含有サンプル中のアナライトの測定方法により達成される。本発明の方法にとって好ましい第２波長は、546±10nm（特に546±５nm）の範囲ならびに570±10nm（特に570±５nm）の範囲である。546nmおよび570nmの波長が最も好ましい。第２波長として本発明の上記波長を選定したことは予想外のことである。何故ならば、ヘモグロビンによる最大の干渉は、現在の技術水準（Boehringer Mannhaim/Hitachiで利用）から知られている405nmの第２波長において生じるものであり、ヘモグロビンの吸収はそこにおいても起こるからである。さらに、上記の文献Eur．J．Clin．Chem．Clin．Biochem.では、ヘモグロビンによる干渉を排除するためには、ソーレー領域（ヘモグロビンの主な吸収バンド）より長波長の第２波長を用いるべきであることが指摘されているので、全てのヘモグロビンの吸収バンドが全くない波長を第２波長として選択することしかせいぜい思い付かなかっただろう。本発明による干渉の排除方法は、アナライトが光学的測定、特にＵＶ域に存在する主波長での光学的測定により測定される方法に好適である。この方法は、特に好ましくは、サンプル中のNADHまたはNADPHの濃度の増減の測定に基づく試験のために行われる。この場合、好ましくは340±10nmの範囲の主波長が用いられる。本発明の方法は、遊離ヘモグロビンが存在するあらゆるサンプルの測定に好適である。そのようなサンプルの例は、溶血性血清もしくは血漿サンプル、または代用血液を含有するサンプルである。本発明の概念の範囲で「遊離ヘモグロビン」という用語に含まれる代用血液の例は、ヘモグロビン（特にヒトのヘモグロビンまたはウシのヘモグロビン）を誘導体化、重合、修飾または架橋した誘導体であり、例えばDCLヘモグロビン（ジアスピリン架橋ヘモグロビン；diaspirincros s-linked haemogliobin）および組換えにより製造されたヘモグロビンが挙げられる。本発明の方法の好ましい１つの実施態様では、アンモニア、クレアチンキナーゼおよびそのイソ酵素、ならびに乳酸デヒドロゲナーゼおよびそのイソ酵素からなる群から選ばれるアナライトの含有量が測定される。本発明の方法によるアンモニアの測定は、好ましくは、酵素的ＵＶ法［Da Fon seca-Wollheim F.，Z.Klin．Chem．Klin．Biochem．11（1973）421］に従って行う。クレアチンキナーゼ（CK）は、好ましくはドイツ臨床化学学会（German Socie ty for Clinical Chemistry）の「最適化標準法(optimized standard method)」 [J.Clin．Chem．Clin．Biochem．15(1977)，249]に従って測定する。クレアチンキナーゼのイソ酵素であるCK-MBは、好ましくは免疫学的ＵＶ法［Wurzburg U.ら、Klin．Wschr．54(1976)，357］により測定する。乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）または乳酸デヒドロゲナーゼのイソ酵素（HBDH ）（1-ヒドロキシ-ブチレートデヒドロゲナーゼ）の測定は、好ましくはドイツ臨床化学学会の「最適化標準法」[Z．Klin．Chem．Klin．Biochem．８(1970)，6 58および10(1972)，182]に従って行う。本発明の方法におけるサンプルとしては、血清または血漿サンプルを用いることが好ましく、特にヒトの血清または血漿サンプルが用いられる。本発明の方法の特に有利な点は、Boehringer Mannheim/Hitachi 704または717 アナライザーのような自動分析装置で行うことができることである。そのような分析装置では、546nmまたは570nmという特に好ましい第２波長を容易に設定することができる。以下の実施例により、本発明をさらに説明する。一般的方法ヘモグロビンを含有する溶液を血清プールの一部分に添加して、ヘモグロビン含有量が2000mg/dlに達するようにした。その血清プールの別の一部分を同量のN aCl溶液（154mmol/l）と混合した。次に、これら両部分を各種比率で混合して、 11個のサンプルからなるHb濃度系列を作成した。これにより、１つのサンプルは Hb を全く含有せず、最高濃度のサンプルは2000mg/dlのHbを含有していた。実施例１アンモニアの測定測定はBoehringer Mannheim/Hitachi 717アナライザーにて行った。以下の試薬を用いた。試薬１： 150mmol/lのトリエタノールアミン緩衝液、pH8.6； 15mmol/lのα-ケトグルタレート；1.5mmol/lのADP 試薬２： 150mmol/lのトリエタノールアミン緩衝液、pH8.5； 15mmol/lのα-ケトグルタレート；1.5mmol/lのADP； 0.31mmol/lのNADPH；＞24U/mlのグルタミン酸デヒドロゲナーゼ(GLDH) 試験手順は以下のようにした。すなわち、20μｌのサンプルに200μｌの試薬１を添加し、５分後に50μｌの試薬２を添加した。さらに40秒後にアナライトを測定した。測定には、340nmの主波長と、405nm、480nm、505nm、600nm、660nmおよび700nm（比較）ならびに546nmおよび570nm（本発明）の第２波長とを用いた。この測定の結果を表１に示す。本発明による546nmおよび570nmの測定波長を用いた場合、他の波長を用いた場合よりも非常に改善された回収率(recovery)が達成されたことがわかる。実施例２クレアチンキナーゼの測定測定はBoehringer Mannheim/Hitachi 717アナライザーにて行った。以下の試薬を用いた。試薬１： 110mmol/lのイミダゾール緩衝液、pH6.7； 20.5mmol/lのグルコース;2.05mmol/lのEDTA: 2.5mmol/lのADP;6.1mmol/lのAMP； 12μmol/lのジアデノシン五リン酸;2.5mmol/lのNADP; 25mmol/l のN-アセチルシステイン；＞3.1U/mlのヘキソキナーゼ(HK)；＞ 1.8U/mlのグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ(G6P-DH) 試薬２： 25mmol/lのイミダゾール緩衝液、pH7.5; 20.5mmol/lのグルコース；2.05mmol/lのEDTA;61mmol/lのMg²⁺； 184mmol/lのクレアセチリン酸試験手順は以下のようにした。すなわち、250μｌの試薬１を、そして５分後に50μｌの試薬２を７μｌのサンプルに添加した。さらに２分後にアナライトを測定した。測定には、340nmの主波長と、405nm、480nm、505nm、600nm、660nmおよび700nm（比較）ならびに546nmおよび570nm（本発明）の第２波長とを用いた。この測定の結果を表２に示す。本発明による546nmおよび570nmの測定波長を用いた場合、他の波長を用いた場合よりも非常に改善された回収率が達成されたことがわかる。実施例３クレアチンキナーゼのイソ酵素CK-MBの測定測定はBoehrlnger Mannheim/Hitachi 717アナライザーにて行った。以下の試薬を用いた。試薬１： 110mmol/lのイミダゾール緩衝液、pH6.7；21mmol/lのグルコース；11mmol/lのMg²⁺；2.1mmol/lのEDTA；2.4mmol/lのADP； 6.0mmol/lのAMP；12μmol/lのジアデノシン五リン酸；2.4mmol/l のNADP；24mmol/lのN-アセチルシステイン；＞3.0U/mlのHK；＞1.8U/mlのG6P-DH；抗体、2000U/lまでのCK-Mに対する阻害能試薬２： 110mmol/lのイミダゾール緩衝液、pH6.7； 21mmol/lのグルコース；2.1mmol/lのEDTA；11mmol/lのMg²⁺；186mmol/lクレアチンリン酸試験手順は以下のようにした。すなわち、250μｌの試薬１を、そして５分後に50μｌの試薬２を12μｌのサンプルに添加した。さらに３分後にアナライトを測定した。測定には、340nmの主波長と、405nm、480nm、505nm、600nm、660nmおよび700nm（比較）ならびに546nmおよび570nm（本発明）の第２波長とを用いた。この測定の結果を表３に示す。本発明による546nmおよび570nmの測定波長を用いた場合、他の波長を用いた場合よりも非常に改善された回収率が達成されたことがわかる。実施例４乳酸デヒドロゲナーゼの測定測定はBoehringer Mannheim/Hitachi 717アナライザーにて行った。以下の試薬を用いた。試薬１： 68mmol/lのリン酸緩衝液、pH7.5；＞0.73mmol/lのピルベート試薬２：＞1.1mmol/lのNADH 試験手順は以下のようにした。すなわち、250μｌの試薬１を、そして５分後に50μｌの試薬２を５μｌのサンプルに添加した。さらに60秒後にアナライトを測定した。測定には、340nmの主波長と、405nm、480nm、505nm、600nm、660nmおよび700nm（比較）ならびに 546nmおよび570nm（本発明）の第２波長とを用いた。この測定の結果を表４に示す。本発明による546nmおよび570nmの測定波長を用いた場合、他の波長を用いた場合よりも非常に改善された回収率が達成されたことがわかる。実施例５ LDHのイソ酵素HBDHの測定測定はBoehringer Mannheim/Hitachi 717アナライザーにて行った。以下の試薬を用いた。試薬１： 68mmol/lのリン酸緩衝液、pH7.5； 3.7mmol/lのα-オキソブチレート試薬２：＞1.1mmol/lのNADH 試験手順は以下のようにした。すなわち、250μｌの試薬１を、そして５分後に50μｌの試薬２を５μｌのサンプルに添加した。さらに60秒後にアナライトを測定した。測定には、340nmの主波長と、405nm、480nm、505nm、600nm、660nmおよび700nm（比較）ならびに546nmおよび570nm（本発明）の第２波長とを用いた。この測定の結果を表５に示す。本発明による546nmおよび570nmの測定波長を用いた場合、他の波長を用いた場合よりも非常に改善された回収率が達成されたことがわかる。

【手続補正書】【提出日】１９９８年１０月２６日【補正内容】（日本文明細書第２頁２８行目から第３頁７行目までの補正）第２波長として本発明の上記波長を選定したことは予想外のことである。何故ならば、ヘモグロビンによる最大の干渉は、現在の技術水準（例えば、クレアチンキナーゼを測定するための試薬についてのキット説明書の指示による Boehring er Mannhaim/Hitachi 717 アナライザーの計器設定、オーダーNo.1273248、Boehri nger Mannheim Diagnostica Catalogue 1997）から知られている405nmの第２波長において生じるものであり、ヘモグロビンの吸収はそこにおいても起こるからである。さらに、上記の文献Eur．J．Clin．Chem．Clin．Biochem.では、ヘモグロビンによる干渉を排除するためには、ソーレー領域（ヘモグロビンの主な吸収バンド）より長波長の第２波長を用いるべきであることが指摘されているので、全てのヘモグロビンの吸収バンドが全くない波長を第２波長として選択することしかせいぜい思い付かなかっただろう。

Claims

【特許請求の範囲】１．主波長および第２波長での光学的二色測定による遊離ヘモグロビン含有サンプル中のアナライトの測定方法であって、ヘモグロビンの吸収バンドが存在する 475nm以上の第２波長を用いることを特徴とする前記方法。２．546±10nmの範囲の第２波長を用いる、請求項１に記載の方法。３．570±10nmの範囲の第２波長を用いる、請求項１に記載の方法。４．前記サンプル中のNADHまたはNADPHの濃度の増減の測定に基づいた試験を行う、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。５．340±10nmの範囲の主波長を用いる、請求項４に記載の方法。６．アンモニア、クレアチンキナーゼおよびそのイソ酵素、ならびに乳酸デヒドロゲナーゼおよびそのイソ酵素からなる群から選ばれるアナライトの含有量を測定する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。７．アンモニアを測定する、請求項６に記載の方法。８．クレアチンキナーゼおよび／またはクレアチンキナーゼのイソ酵素CK-MBを測定する、請求項６に記載の方法。９．乳酸デヒドロゲナーゼおよび／または乳酸デヒドロゲナーゼのイソ酵素HBDH を測定する、請求項６に記載の方法。 10．代用血液を含有するサンプルを測定する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。 11．血清または血漿サンプルに対して前記測定を行う、請求項１〜10のいずれか１項に記載の方法。 12．自動分析装置を用いて前記測定を行う、請求項１〜11のいずれか１項に記載の方法。