JPH11511004A

JPH11511004A - ヒト白血球１２−リポキシゲナーゼおよび疾病状態の病因でのその役割

Info

Publication number: JPH11511004A
Application number: JP8533570A
Authority: JP
Inventors: ナドラー，ジェリー・エル; ナタラジャン，ラマ
Original assignee: City of Hope
Current assignee: City of Hope
Priority date: 1995-05-04
Filing date: 1996-05-03
Publication date: 1999-09-28
Also published as: WO1996034943A1; EP0824583A1; AU706241B2; CA2220156A1; AU5637796A

Abstract

(57)【要約】アテローム性動脈硬化症、乳癌、自己免疫性疾患および炎症性疾患、糖尿病性血管疾患および腎臓疾患並びにインスリン抵抗を含めたいくつかの主要な疾患状態または過程の病因論におけるヒト白血球型の１２−ＬＯ酵素の存在およびその役割に関する事実を記載する。ヒト白血球１２−ＬＯの発現または酵素活性化の遮断を含めた介在は、これら疾患状態を予防するまたは回復させる新規治療を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト白血球１２−リポキシゲナーゼおよび疾病状態の病因でのその役割関連出願本願は、米国特許出願番号０７／９３６，６６０（１９９２年８月２８に提出）の一部継続出願である、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０００８９（１９９４年１月４日に提出）の一部継続出願である、米国特許出願番号０８／４３４，６８１（１９９５年５月５日に提出）の一部継続出願である。政府権利供述本発明は、国立健康研究所（ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ）裁定の許可番号ＤＫ３９７２１ＲＯ１の政府援助で行われた。政府は、本発明について一定の権利を持つ。技術分野本発明は、ヒト白血球型の１２−ＬＯおよびそのいくつかの主要な疾病状態の病因への役割に関係する。略語ＡＡ＝アラキドン酸（Ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃａｃｉｄ）ＡII ＝アンギオテンシンII （Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ II）ＥＧＦ＝表皮増殖因子（ＥｐｉｄｅｒｍａｌＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｃｏｒ）ＦＮ＝フィブロネクチン（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）ＧＡＰＤＨ＝グリセルアルデヒド−３−リン酸デセドロゲナーゼ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３− ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）ＧＦ＝増殖因子（ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ）ＨＡＥＣ＝ヒト大動脈内皮細胞（ＨｕｍａｎＡｏｒｔｉｃＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＣｅｌｌｓ）ＨＥＴＥ＝ヒドロキシエイコサテトラエン酸（ＨｙｄｒｏｘｙｅｉｃｏｓａｔｅｔｒａｅｎｏｉｃＡｃｉｄ）１２ＨＥＴＥ＝１２−ヒドロキシエイコサテトラエン酸（１２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｉｃｏｓａ− ｔｅｔｒａｅｎｏｉｃＡｃｉｄ）ＨＧ＝高グルコース（ＨｉｇｈＧｌｕｃｏｓｅ）ｈｌ１２−ＬＯ＝ヒト白血球１２−リポキシゲナーゼ（ＨｕｍａｎＬｅｕｋｏｃｙｔｅ１２−Ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ）ｈｌ１５−ＬＯ＝ヒト白血球１５−リポキシゲナーゼ（ＨｕｍａｎＬｅｕｋｏｃｙｔｅ１５−Ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ）ＨＯＤＥ＝ヒドロキシオクタデカジエン酸（Ｈｙｄｒｏｘｙｏｃｔａｄｅｃａｄｉｅｎｏｉｃａｃｉｄ）１２−ＨＰＥＴＥ＝１２−ヒドロペルオキシエイコサテトラエン酸（１２−ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｙｅｉｃｏｓａ− ｔｅｔｒａｅｎｏｉｃＡｃｉｄ）ＨＳＭＣ＝ヒト大動脈平滑筋細胞（ＨｕｍａｎＡｏｒｔｉｃＳｍｏｏｔｈＭｕｓｃｌｅＣｅｌｌｓ）ＨＰＬＣ＝高圧液体クロマトグラフィー（ＨｉｇｈＰｒｅｓｓｕｒｅＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）ＩＬ−１＝インターロイキン−１（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１）ＬＤＬ＝低密度リポタンパク質（ＬｏｗＤｅｎｓｉｔｙＬｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）ＬＯ＝リポキシゲナーゼ（Ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ）１２−ＬＯ＝１２−リポキシゲナーゼ（１２−Ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ）１５−ＬＯ＝１５−リポキシゲナーゼ（１５−Ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ）ＭＡＰＫ＝分裂促進因子活性化キナーゼ（ＭｉｔｏｇｅｎＡｃｔｉｖａｔｅｄＫｉｎａｓｅ）ｍｍＬＤＬ＝最小限度修飾した低密度リポタンパク質（ＭｉｎｉｍａｌｌｙＭｏｄｉｆｉｅｄＬｏｗＤｅｎｓｉｔｙＬｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）ＭＯ＝単球（Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ）ＮＩＤＤＭ＝インスリン非依存性糖尿病（Ｎｏｎ−ｉｎｓｕｌｉｎＤｅｐｅｎｄｅｎｔＤｉａｂｅｔｅｓＭｅｌｌｉｔｕｓ）ＮＧ＝正常グルコース（ＮｏｒｍａｌＧｌｕｃｏｓｅ）ＰＤＧＦ＝血小板由来増殖因子（ＰｌａｔｅｌｅｔＤｅｒｉｖｅｄＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ）ＰＫＣ＝プロテインキナーゼＣ（ＰｒｏｔｅｉｎＫｉｎａｓｅＣ）ｐｌ１２−ＬＯ＝ヒト血小板１２−リポキシゲナーゼ（Ｈｕｍａｎｐｌａｔｅｌｅｔ１２−Ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ）ＰＶＳＭＣ＝ブタ血管平滑筋細胞（ＰｏｒｃｉｎｅＶａｓｃｕｌａｒＳｍｏｏｔｈＭｕｓｃｌｅＣｅｌｌｓ）ＲＴ−ＰＣＲ＝逆転写酵素ポリメラーゼ鎖反応（ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）ＳＭＣ＝平滑筋細胞（ＳｍｏｏｔｈＭｕｓｃｌｅＣｅｌｌｓ）ＴＧＦＢ＝トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒＢｅｔａ）ＴＮＦ＝腫瘍壊死因子１（ＴｕｍｏｒＮｅｃｒｏｓｉｓＦａｃｔｏｒ１）ＶＳＭＣ＝血管平滑筋細胞（ＶａｓｃｕｌａｒＳｍｏｏｔｈＭｕｓｃｌｅＣｅｌｌｓ）発明の背景３種類の哺乳動物のリポキシゲナーゼは、アラキドン酸（４）に酸素添加する炭素の位置（１、２または３）によって、名付けられる。ある種のＬＯ酵素は、ＬＤＬからそのアテローム形への酸化を誘導すること（５、６）、および平滑筋細胞の増殖または移動を増加させること（１、７−９）によって、アテローム性動脈硬化の病因となりこれを促進する、という証拠が増加してきている。さらに、証拠から、１２−ＬＯタンパク質は、アンギオテンシンII（ＡII）誘導性の血管および副腎の活動を仲介する役割を演ずる（１０−１２）ことが、示唆される。最近の研究では、少なくとも２つの型の１２−ＬＯ：即ち、ヒト赤白血病細胞からクローン化されたｐｌ１２−ＬＯ（２、１３）、ならびに；ブタ単核細胞、脳下垂体（１４）およびウシ気管細胞（１５）より分離されクローン化されたブタ白血球１２−ＬＯ：が存在することが、示されている。出願者は、ヒト副腎球状層細胞内に白血球型の１２−ＬＯが存在することを示した（３）。ヒト１５−ＬＯは、ヒトおよびウサギの網状赤血球から精製した（１６、１７）。ヒト血小板４２ーＬＯとブタ白血球型の１２−ＬＯは、６５％のアミノ酸相同性を共有する（１３）。しかしながら、ブタ白血球型の１２−ＬＯは、ヒト１５−ＬＯとの相同性も高い（８６％）（１４）。最近、１５−ＬＯは、ヒトのアテローム性動脈硬化症病変のマクロファージ内で発現しているが、刺激されていない単球内では発現していないことが示された（１８）。発明の概要本願は、ヒト白血球型の１２−ＬＯ酵素（ｈｌ１２−ＬＯ）の存在、ならびに、アテローム性動脈硬化症、乳癌、自己免疫病および炎症性疾病、糖尿病性血管疾病および糖尿病性腎臓病およびインスリン耐性を含む、いくつかの主要な病状の病因または進行へのその役割についての証拠を、記載している。このユニークな酵素は、いくつかの外観上異なる症状を結びつけることのできるいくつかの特徴を持つ。１．ｈｌ１２−ＬＯは、脂肪酸としてアラキドン酸およびリノール酸を基質に用いて、これらの疾病に共通に関係する重要なシグナル形質導入経路を活性化することのできるヒドロペルオキシドおよびその他の脂質メディエイタを生成することができる。これらのメディエイタには、（ａ）プロテインキナーゼＣおよび分裂促進因子活性化キナーゼ（ＭＡＰＫ）の特定の異性体のようなキナーゼ、（ｂ）炎症性疾病および自己免疫病、アテローム性動脈硬化、癌の増殖および転移への関わりが明らかなＮＦｋＢおよびオンコジーンのような転写因子、が含まれる。２．ｈｌ１２−ＬＯ酵素が活性化されると、それ自身が脂質およびタンパク質の酸化修飾を促進することの出来るフリーラジカルプロセスの伝播を導くことのできるスーパーオキシドアニオンを生成することができる。これらのプロセスには、炎症状態、腫瘍性状態、およびアテローム発生状態の病因が含まれる。３．ｈｌ１２−ＬＯ酵素は、戦略的に位置している。ヒト単球、大動脈血管平滑筋および内皮細胞、心筋細胞、骨格筋、腎臓および乳癌細胞、およびランゲルハンス島のベータ細胞内に、白血球型１２−ＬＯの存在を示す証拠が存在する。この酵素の活性のあるこれらの部位は、病的状態に導く組織に特異的な役割を果たす。例えば、ランゲルハンス島ベータ細胞では、炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１）によって１２−ＬＯ活住が活性化されると、膵臓のベータ細胞またはインスリン生成細胞が選択的に機能障害を受け破壊されることを、説明することが出来た。さらになお、ベータ細胞内グルコースによって１２−ＬＯ経路が活性化されるまたはその発現が増加すると、成人糖尿病の典型である型（インスリン非依存性糖尿病）でのインスリンの分泌機能障害を受けることを、説明することが出来た。４．１２−ＬＯの発現および活性を増加させる要因は、炎症性、アテローム性動脈硬化、腎臓および腫瘍性疾病と結びつく。１２−ＬＯの活注および発現の増加を実証する因子としては、（ａ）自己免疫病（糖尿病Ｉ型）アテローム性動脈硬化および腫瘍の成長に関連するインターロイキン−１β（ＩＬ−１）のような炎症性サイトカイン、（ｂ）血管および腎臓病の加速にかかわる血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）のような成長因子ならびにアンギオテンシンII（ＡII）、および（ｃ）微小血管（目、腎臓および神経）および微小血管（心臓発作、発作および末梢血管病）のＩ型II型両型の糖尿病合併症と結びつく高血糖症、が含まれる。５．出願者らは、試験した組織のすべてにおいて、糖尿病における後天的なインスリン耐性の原因となるグルコースが、１２−ＬＯの活性および発現を増加させることを発見した。それ故、１２−ＬＯの活性化は、グルコース誘導の酸化ストレスと終末器の機能不全または損傷の発生との間の一般的なつながりを提供することができた。本発明に従って、ｈｌ１２−ＬＯの発現または酵素の活性化の封鎖は、これらの疾病状態を予防するための新規の治療を提供する。正常なＨＳＭＣ、ＨＡＥＣおよびＭＯ内での１２−ＬＯの同定出願者らは、刺激されていないヒト大動脈平滑筋細胞（ＨＳＭＣ）、内皮細胞（ＨＡＥＣ）および単球（ＭＯ）内に存在するＬＯの詳細な型を、ここで評価した。さらになお、ＡIIは、ヒト副腎細胞内の１２−ＬＯの発現を増加させることが出来るので、出願者らは、また、ＨＳＭＣ内での１２−ＬＯの制御にかかわるＡIIの効果についても評価した。最終的に、出願者らは、アテローム性動脈硬化病変の免疫組織化学的分析によって、白血球型の１２−ＬＯの存在が証明されるかいなかについて決定した。ヒト副腎球状層で見いだされたのと同様の１２−ＬＯが正常なＨＳＭＣ、ＨＡＥＣおよびＭＯ内で発現していることが、結果から示された。さらに、この１２−ＬＯは、ＨＳＭＣ内ではＡIIによって顕著に亢進調節され、ヒトアテローム性動脈硬化病変の内にも存在している。図１から７までの簡単な説明図１Ａおよび１Ｂは、ＨＡＥＣ、ＨＳＭＣおよびＭＯ内の白血球１２−ＬＯＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析について説明している。図１Ａは、白血球に特異的な１２−ＬＯプライマーで４０サイクル増幅させたＲＮＡサンプルを示している。膜は、ブタの白血球１２−ＬＯオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせた。第１列は、マーカーであり、第２、５、８列は、鋳型を加えず行ったネガティブコントロールであり、第３列は、ＨＡＥＣからの全ＲＮＡをブタの白血球１２−ＬＯプライマーを加えて増幅したものであり、第４列は、ＧＡＰＤＨプライマーを加えて行ったものである。第６列は、ブタの白血球１２−ＬＯプライマーを加えて行ったＨＳＭＣからの全ＲＮＡを示し、第７列は、ＧＡＰＤＨプライマーを加えて行ったものである。第９列は、ＭＯからの全ＲＮＡをブタの白血球１２−ＬＯプライマーを加えて増幅したものを示す。第１０列は、ＧＡＰＤＨプライマーを加えて行ったものであり、第１１列は、ブタの白血球１２−ＬＯｃＤＮＡを用いたポジティブコントロールである。図１Ｂは、ヒト特異的１５−ＬＯプライマーを加えて４０サイクル増幅させた同じＲＮＡサンプルについて示している。膜は、ヒト１５−ＬＯオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせた。１５−ＬＯｃＤＮＡの増幅（ポジティブコントロール）から、３３３塩基対の生成物のみが示されている。図２は、正常なＨＡＥＣ、ＨＳＭＣおよびＭＯ内の白血球１２−ＬＯタンパク質（７２ｋＤ）の発現を説明している。ＨＡＥＣ、ＨＳＭＣおよびＭＯからの細胞質画分を、標準のブタ１２−ＬＯタンパク質と一緒に、電気泳動し、さらにウエスタンイムノブロッティングを行った。図３Ａは、ＨＳＭＣよる１２−ＨＥＴＥの遊離に関するＡIIの影響について説明している。ＨＳＭＣは、コンフルエントになるまで増殖させた。血清は除去し、細胞は０．４％の子牛血清（ＦＢＳ）および０．２％のＢＳＡを含む培地１９９で、１８時間インキュベートした。その後、細胞をＤＭＥ培養液で洗浄し、０．２％ＢＳＡを含むＤＭＥ培養液中で２０分間インキュベートした。１０^-9および１０^-8ｍｏｌ／Ｌの濃度で、ＡIIを、５分および１０分間、細胞に加えた。培養液を、ＨＥＴＥアッセイのために集めた。^* ｐ＜０．０５対コントロール（ｎ＝４）図３Ｂは、ＨＳＭＣ内の細胞関連１２−ＨＥＴＥレベルへのＡIIの影響について説明している。上澄み液を収集した後、細胞を氷冷したＰＢＳで洗浄し、さらに、細胞関連ＨＥＴＥのアッセイを行うため、スクレーピング（ｓｃｒａｐｉｎｇ）によって収集した。^* ｐ＜０．０２対コントロール（ｎ＝４）図４Ａおよび４Ｂは、ＨＳＭＣ内のＡIIによる白血球１２−ＬＯタンパク質の発現の制御について説明している。図４Ａは、ＡIIによる制御を示すイムノブロットである。図４Ｂは、図４Ａでのイムノブロットの濃度計分析の棒グラフ表示である。細胞は、２０％ＦＢＳを含む培地１９９内で増殖させ、０．４％ＦＢＳおよび０．２％ＢＳＡを含む培地１９９内に置くことによって、２４時間、血清を枯渇させた。濃度２ｘ１０^-7ｍｏｌ／ｌのＡIIで、２４から４８時間細胞を処理した。細胞は、ＰＢＳで洗浄し、スクレーピングによって収集した。細胞ペレットを溶解し、細胞質画分を電気泳動した。図５Ａおよび５Ｂは、ＨＳＭＣ内でのＡIIによる白血球１２−ＬＯの制御について、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、説明している。図５Ａは、１２−ＬＯオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズしたブロットのオートラジオグラムである。図５Ｂは、エチジウムブロミドで染色したアガロースゲルである。全ＲＮＡは、ＡII（２ｘ１０^-7ｍｏｌ／ｌ）を含む低血清状態で、示した異なる時間の間、インキュベートした培養ＨＳＭＣから抽出した。ＲＮＡサンプルは、白血球１２− ＬＯプライマーまたはＧＡＰＤＨプライマーで４０サイクル増幅させた。図６Ａおよび６Ｂは、広範囲のアテローム性動脈硬化の患者の膝下切断標本から得られた動脈の組織学的切片の顕微鏡写真を示す。アビジン−ビオチン複合体免疫組織化学技術を用いて、精製した特異的ウサギ抗血清を用いて１２−ＬＯを検出した。強く染色された内皮細胞（矢じり印）、厚くなった内皮内に存在する細胞（小さい矢印）、およびより少ない程度の平滑筋細胞（大きい矢印）を、図６Ａに示した。免疫前のウサギ血清を、ネガティブコントロールとして、同濃度で用いた（図６Ｂ）（ｘ２００拡大）。図７Ａおよび７Ｂは、１２−リポキシゲナーゼに対する抗体を用いたヒト冠状動脈病変の免疫染色を示している。１２−ＬＯ抗体（図７Ａ）または免疫前抗血清（図７Ｂ）のいずれかと反応させた、進行したアテローム性動脈硬化プラーク（コア領域のコレステロール結晶に注意の事）を持つヒトの左冠状動脈の横断切片を示す。最も暗く染まった免疫反応性は、血管周囲細胞と関連する血管外膜に見られる。中間平滑筋細胞もまた、免疫反応性を持つ。より明るい免疫反応性は、プラーク領域および非プラーク領域の内膜細胞に見られる。実験方法リポキシゲナーゼ（ＬＯ）の経路は、加速されたアテローム性動脈硬化の誘導にかかわっている。副腎球状層ランゲルハンス島内に発現した１２−ＬＯの正確な型は、出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／０００８９に記載されている。この出願では、詳細な型が同様のｈｌ１２−ＬＯが、刺激されていないヒト大動脈平滑筋細胞（ＨＳＭＣ）、内皮細胞（ＨＡＥＣ）および単球（ＭＯ）に存在することを、立証している。この研究では、特異的な逆転写酵素−ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ− ＰＣＲ）法を用いて、正常なＨＳＭＣ、ＨＡＥＣおよびＭＯ内に発現したＬＯｍＲＮＡの型を分析した。白血球型の１２−ＬＯに特異的なプライマーおよびプローブを用いると、３つの細胞の型のすべてにおいて、３３３塩基対のバンドが認められ、これらの細胞型の内には白血球型の１２−ＬＯ型の白血球が発現していることが示唆された。白血球型の１２−ＬＯに対するポリクローナルペプチド抗体を用いて、培養したＨＳＭＣ、ＨＡＥＣおよびＭＯについてウエスタンイムノブロッティング分析を行うと、白血球型の１２−ＬＯの分子量と同一の特異的な７２ｋＤのバンドが示された。アンギオテンシンII（ＡII）を正常なＨＳＭＣに加えると、１２−ＬＯの活性および発現が増加した。アテローム性動脈硬化病変の免疫組織化学分析もまた、白血球型の１２−ＬＯの存在を示した。これらの結果から、白血球型の１２−ＬＯＲＮＡが、ＨＳＭＣ、ＨＡＥＣおよびＭＯ内に発現していることが示される。また、ＡIIは、ＨＳＭＣ内での１２−ＬＯの活性および発現を亢進調節し、ヒト血管疾病でのこの１２−ＬＯ経路の役割を支持する。１．細胞および培養ＨＡＥＣおよびＨＳＭＣは、ＵＣＬＡ心臓移植プログラムにおける心臓ドナーから得られた大動脈標本から分離した。５−９継代のＨＡＥＣおよび３−７継代のＨＳＭＣを用いた。ＨＡＥＣは、ＥＣ増殖補助剤（ｇｒｏｗｔｈｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（２０ｍｇ／ｍｌ）およびヘパリン（９０μｇ／ｍｌ）を補充した２０％ＦＢＳを含む培地１９９内で増殖させた。ＨＡＥＣは、それらの典型的な丸石の形態、ファクターVIII−関連抗原の存在、および過塩素酸１，１’−ジオクタデシル−１−３，３，３’，３’−テトラメチルインド−カルボシアニン（Ｄｉｌ−アセチル−ＬＤＬ）で標識したアセチル化ＬＤＬの取り込みによって、同定された（１９）。ＨＳＭＣは、２０％ＦＢＳを含む培地１９９内で増殖させ、そして形態学的に免疫組織化学的に、同定した（免疫組織化学的には、ＨＨＦ３５を用いてその後蛍光標識した二次抗体によって可視化するか、またはビオチン−ストレプトアビジン複合体イムノペルオキシダーゼシステムを用い可視化した）（２０）。単球は、レカルデ（Ｒｅｃａｌｄｅ）の修飾法によって健康なドナーの大プールから得た（２１）。ＨＳＭＣおよびＨＡＥＣの単層培養細胞を、氷冷したＰＢＳで２回洗浄し、その後、以下に記載の方法に従ってＲＮＡ抽出またはウエスタン分析を行うために処理した。ヒドロキシエイコサテトラエン酸（ＨＥＴＥ）アッセイを行うために、実験のおおよそ２４時間前、培養液を０．４％ＦＢＳおよび０．２％ＢＳＡを含む培地１９９で置換した。２．ｃＤＮＡヒト網状赤血球１５−ＬＯのｃＤＮＡを含む組換えＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドは、Ｅ．Ｓｉｇａｌ博士（ＳｙｎｔｅｘＣｏ．，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）の御好意で御提供頂いた。ブタ白血球１２−ＬＯのｃＤＮＡを含むｐＵＣ１９プラスミドは、前述の方法に従って得られた（１４）。ヒト血小板１２−ＬＯのｃＤＮＡを含むＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドは、ＢｅｎｇｔＳａｍｕｅｌｓｏｎ教授（ＫａｒｏｌｉｎｓｋａＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）の御好意によりご提供頂いた（２）。３．ＰＣＲ用のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ β₂−マクログロブリンオリゴヌクレオチドは、ＰｅｒｒｉｎＷｈｉｔｅ博士（ＣｏｒｎｅｌｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ）からの親切な贈り物である。ヒトのグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）オリゴヌクレオチドを含むその他のオリゴヌクレオチドは、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）ＤＮＡ合成装置で合成し、さらにポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製した。オリゴヌクレオチドの配列を、表１に列挙した通りであり、これらは既知遺伝子配列（２、１４、２２、２３）を基に設計し、ブタ１２−ＬＯと１５−ＬＯとの配列の間で最も多くの相違を示す領域（１３）から選択した。４．ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて逆転写したＲＮＡの増幅培養したＨＳＭＣ、ＨＡＥＣおよび新鮮なＭＯからの全ＲＮＡは、ＲＮＡｚｏｌ（Ｃｉｎｎａ／ＢｉｏｔｅｃｘＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＩｎｃ．，Ｔｅｘａｓ）を用いてグアニジウムチオシアネート− フェノール−クロロホルムで抽出した。いくつかのＲＮＡサンプルは、ＲＮアーゼを含まないＤＮアーゼによって処理された。全ＲＮＡの３μｍｇを、ＰＣＲバッファー（１０ｍｍｏｌ／ｌＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍｍｏｌ／ｌＫＣｌ、１．５ｍｍｏｌ／ｌＭｇＣｌ₂、および０．００１％ゼラチン）、それぞれ２００μｍｏｌ／ｌの４つのデオキシヌクレオチドトリホスフェート、それぞれ２５ｐｍｏｌの５’−および３’−プライマー、２Ｕのアビジン骨髄芽球ウイルス逆転写酵素（２０Ｕ／μｌ、ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｔ．，Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ，ＦＬ）および２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）と、最終容量が５０ μｌになるように、混合した。いくつかの反応では、β₂ミクログロブリンまたはＧＡＰＤＨの５’−および３’−プライマー、それぞれ５ｐｍｏｌを、内部標準として加えた。ＲＴ反応を続けるために、サンプルを３７°Ｃのサーマルサイクラー内に８分間置いた。その後のＰＣＲに用いられた条件は、９４°Ｃに１分間の変性段階、５０°Ｃに２分間のアニーリング、そして７２°Ｃで２分間の伸長を、２４−４０サイクル行った。ＲＮＡ鋳型を加えないブランク反応は、ＲＴそしてＰＣＲ段階を通して行われた。ヒトの１５−ＬＯｃＤＮＡ、ブタ白血球の１２−ＬＯｃＤＮＡ、およびヒト血小板の１２−ＬＯｃＤＮＡの増幅は、それぞれ２００μｍｏｌ／ｌの４つのデオキシヌクレオチドトリスホスフェート、２５ｐｍｏｌの５’−および３’−プライマー、および２．５ＵのＴａｑポリメラーゼを含む５０μｌ容量中に２−５ｎｇのｃＤＮＡプラスミドを混合することによって行われた。ＰＣＲの条件は、前述の条件と同じにした。５．ゲル分析およびブロットハイブリダイゼーションＰＣＲ生成物から２０μｌを分取し、Ｔｒｉｓ酢酸ＥＤＴＡバッファー内、１．８％アガロースゲルで電気泳動にかけられた。エチジウムブロミドで染色して写真撮影した後、ゲルは、キャピラリーブロッティングによって、Ｚｅｔａ−プローブ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）上に移した。プローブとして用いたオリゴヌクレオチドは、［γ³²Ｐ］ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いて５’−末端を標識し、さらに６ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣには０．１５ｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、０．０１５ｍｏｌ／ｌのクエン酸ナトリウムを含む）、０．５％の脱脂粉乳および７％のＳＤＳ中、４２°Ｃで一晩、膜とハイブリダイズさせた。膜は、室温で１５分間、６ｘＳＳＣ中で１回、さらに６０°Ｃ、１５分間で一回、洗浄した。洗浄条件は、ブタ白血球の１２−ＬＯからのＰＣＲ生成物からヒトの１５−ＬＯのＰＣＲ生成物を識別するように考え出された。（３）膜は、−７０°Ｃで、増感板と一緒にしてＫｏｄａｋのＸ線フィルム（ＥａｓｔｍａｎＫｏｄａｋＣｏ．，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に晒した。ブロットは、コンピューター化されたビデオデンシトメーターを用いて定量した。６．ウエスタンイムノブロッティング細胞ペレットは、ＰＢＳ（ｐＨ７．３）、１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍｍｏｌ／ｌのフッ化フェニルメチルスルホニル、５０μｍｏｌ／ｌのロイペプチン、および０．１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む溶解バッファー中で、溶解させた。溶解物を、１０，０００ｘｇで１０分間、遠心分離した。上澄み液（細胞質）の一部は、タンパク質評価のために取り、残りを、ウエスタンブロッティング分析用に、−７０°Ｃに保っておいた。Ｌａｅｍｍｌｉの方法に従って、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（１０％泳動用ゲル、４％濃縮用ゲル）を行った（２４）。ウエスタンブロッティングでは、ゲルは、転写バッファー（３５ｍｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ塩基、１９２ｍｍｏｌ／ｌグリシンおよび２０％メタノール、ｐＨ８．３）で平衡化し、その後、Ｔｏｗｂｉｎらに記載の方法（２５）に従って、半乾燥ポリブロット装置（ＡｍｅｒｉｃａｎＢｉｏｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）内で４０分間、ニトロセルロース（Ｈｙｂｏｎｄ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）に移した。非特異的部位は、４°Ｃで一晩、１０％のＦＣＳを含むＰＢＳでブロックした。次いで、膜をＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で２回洗浄し、さらに１％ＢＳＡおよび２０％（容量／容量）ＦＣＳを含むＰＢＳＴ中で、一次抗体と共に、２時間室温にインキュベートした。ブタ白血球の１２−ＬＯ配列のアミノ酸６４６−６６２の配列を持つ、ブタの１２−ＬＯペプチドに対するポリクローナル抗体が用いられた。この抗血清は、１：１００に希釈して用いられた。いくつかの研究では、Ｅ．Ｓｉｇａｌ博士（ＳｙｎｔｅｘＣｏ．，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）の御好意によりご提供頂いたヒト１５−ＬＯに対するポリクローナル抗体を用いた。洗浄した膜は、その後、アルカリホスファターゼ（１：５０００；Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）と複合させた二次抗体（ヤギ抗ウサギ）と共に、１時間インキュベートした。検出は、基質混合物［ニトロブルー（Ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ）テトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（Ｐｒｏｍｅｇａ）］を用いた呈色反応によって、またはＣＳＰＤ基質およびウエスタンライト（Ｗｅｓｔｅｒｎ−Ｌｉｇｈｔ）化学発光検出システム（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いた化学発光によってのいずれかで行った。非特異的結合は、正常なウサギの血清を用いて評価した。ウエスタンブロットは、コンピューター化されたビデオデンシトメーター（ＡｐｐｌｉｅｄＩｍａｇｉｎｉｎｇ，ＳａｎｔａＣｌａｒａ，ＣＡ；ＬｙｎｘＤＮＡｖｉｓｉｏｎ）を用いて定量し、そして値は任意の吸光度ユニットとして示された。７．１２−ＬＯ生成物の測定これらのアッセイは、以前に報告した方法（１０、１１）を用いて行われた。簡単に言えば、１２−および１５−ＨＥＴＥは、上澄み液および細胞より、Ｃ１８ミニカラム（ＡｎａｌｙｔｉｃｈｅｍＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＣＡ）を用いて抽出され、さらに、我々が有効にした逆相密度勾配ＨＰＬＣおよび（ＲＩＡ）方法を用いて測定された。８．ＨＳＭＣ内のリポキシゲナーゼ活性の測定コンフルエントになったＨＳＭＣは、実験前２４時間、培養液＋１０％ＦＣＳ内に置いておいた。細胞を収集し、洗浄し、１ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（２５ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ７．７）内に懸濁し、さらに氷上で超音波処理した。アッセイ混合物は、１．０ｍｌ中に、８００μｌの酵素（超音波処理）、１００ μｌのＣａＣｌ₂（１．５ｍｍｏｌ／ｌ）および５０μｌのグルタチオン（０．５ｍｍｏｌ／ｌ）を含んでいた。酵素ブランクも同時に反応させた。反応は、５０μｌのアラキドン酸ナトリウム（１６０μｍｏｌ／ｌ、ＮｕＣｈｅｃｋＰｒｅｐ，Ｅｌｙｓａｉｎ，ＭＮ）または０．２５μＣｉ¹⁴［Ｃ］リノール酸（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ）を加えて、３７°Ｃで開始した。１０分間のインキュベーション後、反応は、２ｍｌのイソプロパノール／１．２％酢酸、次いで２ｍｌのクロロホルムを加えて停止させた。低級有機層をろ過し、さらに出願者の密度勾配逆相ＨＰＬＣシステム（１０、１１）を用いてＨＰＬＣを行い、ＨＯＤＥｓまたはＨＥＴＥｓを検出した。１２−ＨＥＰＥのピークは、２３７ｎｍのＵＶ検出および標準との共移動（保持時間１８．３分）によって同定された。ピークの高さは、ＳｈｉｍａｚｕＣＲ５Ａインテグレーターを用いて定量した。放射性リノール酸代謝物である¹⁴［Ｃ］ＨＯＤＥｓを同定するために、標準の非放射性ＨＯＤＥｓと同じ保持時間で共移動するフラクション内の放射能を定量した。このＨＰＬＣシステムでは、９−および１３−ＨＯＤＥは両方共、同じ保持時間（１７．９分）を持つ。９．免疫組織化学用いた免疫組織化学法は、前記の通りである（２６）。簡単に言えば、末梢血管疾病のために切断された下肢またはアテローム性動脈硬化のプラークを示す冠状動脈から採取した組織サンプルの５ミクロン切片を、Ｓｉｌａｎｅ（３−アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）でコートしたスライド上に載せ、６０°Ｃで一晩乾燥させた。脱パラフィン化および脱水の後、それらを１０ｍｍｏｌ／ｌのクエン酸バッファー溶液（ｐＨ６．０）中に置き、電子レンジで５分間ずつ、２回沸騰させた。冷却後、切片を蒸留水で２回洗浄した。１％の過酸化水素／メタノール中で２０分間インキュベーションの後、スライドは、蒸留水で２回、さらにリン酸緩衝化塩類溶液（ＰＢＳ）で２回、洗浄した。これに続いて、ＰＢＳ中の正常なウマ血清１：２０（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｓ）でブロッキングした。デカントした後、切片をウサギペプチド抗白血球１２−リポキシゲナーゼ抗血清（１：１０００希釈）で覆い、湿気のある容器内、室温で一晩インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄後、１：６００希釈のビオチニル化抗−ウサギＩｇＧ（Ｅｌｉｔｅｋｉｔ，ＶｅｃｔｏｒＬａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を加えて、スライドを４０分間インキュベートした。さらに２回ＰＢＳ中で洗浄した後、１：２００希釈のＡＢ複合液（Ｅｌｉｔｅｋｉｔ，ＶｅｃｔｏｒＬａｂｓ）中で、切片をさらに４０分間インキュベートした。次いで、発色させるために、切片をジアミノベンジジン溶液に７分間晒した。さらに２回洗浄した後、切片を１％の硫酸銅中で５分間インキュベートすることによって、発色を強化した。全段階は、自動染色器（Ｔｅｃｈｍａｔｅ１０００，ＢｉｏｔｅｋＳｏｌｕｔｉｏｎｓ，ＳａｎｔａＢａｒｂａｒａ，ＣＡ）を用いて行った。末梢血管からの切片を再び洗浄し、６％のＭａｙｅｒのヘマトキシリン中で薄く対比染色し、洗浄し、脱水し、さらにカバーガラスをかけた。冠状動脈からの切片は、対比染色しなかった。コントロールのスライドは、抗−１２−リポキシゲンナーゼを同じ濃度の免疫化前ウサギ血清で置き換える事によって、調製した。１０．データ分析イムノブロットおよびオートラジオグラムは、コンピューター制御のデンシトメーター（ＡｐｐｌｉｅｄＩｍａｇｉｎｇ，ＳａｎｔａＣｌａｒａ，ＣＡ；ＬｙｎｘＤＮＡＶｉｓｉｏｎ）を用いて、分析した。示したデータは、２から３の実験を示している。１２−ＨＥＴＥを合成するためにＨＳＭＣをＡIIで処理して得られたデータは、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈコンピューターシステムの統計用パッケージを用いた複数サンプルのためのＡＮＯＶＡを用いて分析した。データは、平均±ＳＥとして示された。実験結果ＨＡＥＣ、ＨＳＭＣおよびＭＯ内での白血球型１２−ＬＯｍＲＮＡの発現ＨＡＥＣ、ＨＳＭＣおよびＭＯ内での１２−ＬＯｍＲＮＡの発現は、検出レベルがノーザン分析の感受性を下回るため、特異的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて評価した。図１Ａは、白血球型の１２−ＬＯｍＲＮＡに特異性の高い方法を用いて、正常なＨＡＥＣ、ＨＳＭＣおよびＭＯ内で白血球１２−ＬＯｍＲＮＡが発現していることを示している。目的とする３３３塩基対のバンドが、３つの細胞の型のすべてに認められた。図１Ｂは、同一ＲＮＡからのヒト１５−ＬＯｍＲＮＡの発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示している。これらの結果から、ヒト１５−ＬＯに特有なバンドの証拠は示されなかった。別の実験では、ＨＡＥＣ、ＨＳＭＣおよびＭＯからのＲＮＡを増幅させ、そして、血小板型の１２−ＬＯＲＮＡ用のプローブとした。ヒト血小板１２−ＬＯが発現している証拠は認められなかった（データは示していない）。ＨＡＥＣ、ＨＳＭＣおよびＭＯ内でのｈｌ１２−ＬＯタンパク質の発現白血球型の１２−ＬＯ酵素が血管内および循環血中のＭＯに発現しているかいなかを研究するために、１０，０００ｘｇの上清タンパク質を電気泳動し、ヒト副腎球状層内で見いだされた１２−ＬＯ配列と相同性を有するブタ白血球型１２ −ＬＯ内の配列から誘導されたポリクローナルペプチド抗体を用いて、ウエスタン分析を行った。この抗体は、血小板型１２−ＬＯとの交差反応性が欠損していることが以前から示されており、ヒト副腎細胞内に白血球型１２−ＬＯが存在することを示すことに成功した（３）。図２は、ＨＳＭＣ、ＨＡＥＣおよびＭＯでのウエスタン分析からの７２ｋＤの主要バンドを示している。ヒト１５−ＬＯタンパク質に直接対するポリクローナル抗体を用いて同様に行ったウエスタン分析では、これらの細胞からは予想される分子量の位置にバンドは示されなかった（データは示していない）。ＨＡＥＣおよびＭＯは、ＨＰＬＣおよびＲＩＡ分析と照らし合わせた結果、１２−Ｓ−ＨＥＴＥを生成していた（ＨＡＥＣ２３８６、ＭＯ８２０ｐｇ／１０⁶細胞）。ＨＳＭＣの結果は、以下に詳細に記載する。その結果、ＨＳＭＣ、ＨＡＥＣおよびＭＯは、ブタ組織およびヒト副腎球状層内に見いだされる白血球型１２−ＬＯと同様の１２−ＬＯタンパク質を発現していると思われる。ＨＳＭＣおよびある種のその他の組織内での１２−ＬＯ活性ならびに発現へのＡIIの影響本発明のもう一つの主な態様は、ＡIIがＨＳＭＣ内で１２−ＬＯのｍＲＮＡおよびタンパク質の活性ならびに発現を増加させることを発見したことである。図３Ａは、無血清培地内に１０^-8ｍｏｌ／ｌおよび１０^-9ｍｏｌ／ｌの濃度でＡII を加えてＨＳＭＣを５分間インキュベーションすると、１２−ＨＥＴＥの遊離が刺激される（対照：５９９±１０５；ＡII １０^-8Ｍ：１４６７±２７７；ＡII １０^-9ｍｏｌ／ｌ：１２９６±２６２ｐｇ／ｍｇタンパク質）ことを示している。ＡIIを加えて１０分間インキュベーションすると、１０^-8ｍｏｌ／ｌの濃度で明らかに１２−ＨＥＴＥの遊離が刺激された。ＡIIはまた、ＨＳＭＣ内の細胞関連１２−ＨＥＴＥレベルをも明らかに増加させた（図３Ｂ）。他の研究では、ＡIIに応答する１２−ＨＥＴＥのレベルは、ＬＯ阻害剤バイカレイン（ｂａｉｃａｌｅｉｎ）１０^-5ｍｏｌ／ｌによって減少させうることが、見いだされた（データには示していない）。ＡIIがＨＳＭＣ内の１２−ＬＯ酵素の発現を誘導するか否かを試験するために、細胞を、２ｘ１０^-7ｍｏｌ／ｌの濃度のＡIIで、２４または４８時間処理した。１２−ＬＯタンパク質は、精製した白血球型１２−ＬＯに特異的な抗体またはヒト白血球型１２−ＬＯ内に存在する既知配列より誘導したペプチド抗体を用いて、ウエスタンイムノブロッティングによって同定した。ブタ白血球型１２−ＬＯの報告された分子量である７２ｋＤに近い分子量を持つ、はっきりしたバンドが検出された（図４）。無血清培地中、ＡIIと共にＨＳＭＣを２４時間インキュベーションすると、７倍に近い１２−ＬＯタンパク質の発現増加が誘導された（図４）。他の実験では、ＡIIを４８時間加えると、同様に４−７倍の１２−ＬＯの発現が誘導された（データは示していない）。ＨＳＭＣ内での１２−ＬＯｍＲＮＡの具体的な発現および制御を評価するために、出願者らは、白血球型１２−ＬＯを著しく増加させるＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いた。ＰＣＲ増幅フラグメントの大きさは、１２−ＬＯおよび１５−ＬＯの両方とも３３３ｂｐである。それ故、厳密性を増加させさらに洗浄温度を６０ °Ｃに上昇させることによる、具体的な条件が、白血球型１２−ＬＯとヒト１５ −ＬＯとを識別するために用いられた。図５Ａに、２４時間無血清でその後指示された時間１０^-7ｍｏｌ／ｌのＡIIで処理したＨＳＭＣからのＲＴ−ＰＣＲ増幅生成物のサザンブロット分析を示す。この実験では、１２−ＬＯの非常に低い基礎的発現が認められた。しかしながら、様々なその他のドナーからの細胞を用いた他の実験では、基礎的な１２−ＬＯ発現は、２０−３０回のＰＣＲで検出可能になる。ＡIIは、インキュベーション時間１２時間で１２−ＬＯｍＲＮＡの発現を誘導し始め、最大の誘導は、ＡIIを加えての細胞のインキュベーション時間３６時間で現れる。図５Ｂは、内部マーカーとしてＧＡＰＤＨの増幅を示すエチジウムブロミドで染色したアガロースゲルを示している。血小板型の１２−ＬＯまたはヒトの１５−ＬＯのいずれかに特異的なＰＣＲ条件を用いた場合、特異的なＲＮＡのバンドは、検出されなかった（データは示していない）。それ故、無血清の基本的ＨＳＭＣは、ＡIIによって明らかにアップレギュレートされる白血球型の１２−ＬＯの低い発現を示す。また、白血球型の１２−ＬＯは、血小板型と異なり、リノール酸を代謝することが出来る。それ故、出願者らは、ＨＳＭＣは、アラキドン酸代謝生成物である１２−ＨＥＴＥに加えて、ＬＯの作用によるリノール酸代謝物である１３−ＨＯＤＥを形成することが出来るかいなかについて、評価した。これを成し遂げるために、出願者らは、ＨＳＭの適当な細胞質画分をＣ¹⁴リノール酸または非放射性アラキドン酸で処理し、さらにＨＳＭＣのＬＯ生成物を密度勾配逆相ＨＰＬＣシステムで分析する別の実験を行った。非放射性アラキドン酸で標識された細胞は、１２−ＨＥＴＥと共移動するＨＰＬＣピークを示した。細胞ブランクサンプルのピーク高は、１．５ｃｍであり、これは、ＨＳＭＣの超音波処理で３／５ｃｍに増加した。また、Ｃ¹⁴リノール酸を加えてインキュベートした細胞もまた、１３−ＨＯＤＥを生成した（ブランク６９５カウント／分に対してＨＳＭＣ超音波処理１０３８カウント）。白血球型の１２−ＬＯがアテローム性動脈硬化病変に存在するか否かを評価するために、ペプチド抗白血球型１２−ＬＯ抗体を用いて、免疫組織化学を行った。図６Ａは、末梢血管疾病の患者からの下肢切断標本から作成した切片の強拡大写真を示す。白血球型の１２−ＬＯに特異的な細胞質染色は、この病変の内皮および平滑筋層の両方で朋らかである。内膜新生領域もまた、白血球型の１２−ＬＯの染色を示している。図６Ｂは、免疫化前抗血清を加えて染色した同病変からの切片の強拡大写真を示す。この切片は、最小のバックグラウンド染色を示し、図６Ａの白血球型の１２−ＬＯの染色が特異的であることを示唆している。図７は、進行したアテローム性動脈硬化病変を示すヒト左冠状動脈からの典型的な切片である。図７Ａは、平滑筋および外膜領域ならびに内皮細胞内の１２−ＬＯタンパク質の限定的染色を示している。図７Ｂは、免疫化前抗血清での非常に低いバックグラウンド染色を示す、この抗体での免疫組織化学を示す。これらの結果は、ブタ白血球およびヒト副腎球状層（３）内で見いだされたそれと同様の１２−ＬＯＲＮＡおよびタンパク質もまた、ヒト血管細胞および循環血中単球内で発現していることを、示している。この結論を支持するために、いくつかの研究方法を、この研究に利用した。第一に、ブタおよびヒト型の白血球型の１２−ＬＯに共通な配列から誘導されたペプチド抗体は、ＨＳＭＣ、ＨＡＥＣおよびＭＯ溶解液中で特徴的な７２ｋＤのバンドを示した。この抗体は、血小板型の１２−ＬＯと交差反応しないが、ヒト１５−ＬＯとは部分的交差反応性を持っている（３）。第二に、特異性の高いＲＴ−ＰＣＲ法が、これらの細胞型内の１２−ＬＯｍＲＮＡを検出するために用いられた。以前に行った研究では、この技術を用いて、白血球型の１２−ＬＯがヒト副腎球状層およびＵ９３７細胞に見られる特有な（ｅｘｃｌｕｓｉｖｅｔｙｐｅ）の１２−ＬＯであることを示した（３）。本研究では、適当な白血球型１２−ＬＯのプライマーおよびプローブを用いた場合、特異的な３３３塩基対を増幅させたｍＲＮＡ生成物が、刺激されていないＨＳＭＣ、ＨＡＥＣおよびＭＯ内で見いだされた。第三に、３つの細胞型のすべてにおいて、ＨＰＬＣおよび特定のＲＩＡによって照合したところによると、１２−ＬＯ生成物である１２−Ｓ−ＨＥＴＥが形成されていた。ＨＳＭＣからの細胞質は、アラキドン酸およびリノール酸の両方と反応して、それぞれ１２−ＨＥＴＥまたは１３−ＨＯＤＥのいずれかを生成した。この反応は、白血球型の１２−ＬＯの特徴を示しており、アラキドン酸とのみ反応して１２− ＨＥＴＥを生成する血小板１２−ＬＯの特徴を示していない。網状白血球から独自にクローン化され且つヒト気管内で見いだされたヒトの１５−ＬＯは、ブタ白血球型の１２−ＬＯと相同性が高い（８６％配列相同性）（１４）。ここで用いたＰＣＲ技術は、白血球１２−ＬＯと１５−ＬＯとを識別することが出来る（３）。この研究方法の特異性は、増幅のための鋳型として、１２−ＬＯおよび１５−ＬＯｃＣＮＡを用いて、証明された。それ故、白血球１２−ＬＯプローブを用いたサザンブロットハイブリダイゼーションによって、認められたバンドが１２−ＬＯの増幅生成物であり、１５−ＬＯの増幅生成物ではないことを示す最も強力な証拠が提供される。これらの結果は、基礎的または刺激されたヒトの内皮細胞または刺激されていない単核細胞内に１５−ＬＯのｍＲＮＡが検出できないことを示した前研究と一致する（２７）。しかしながら、１５−ＬＯｍＲＮＡおよびタンパク質は、アテローム性動脈硬化血管病変のマクロファージに富む領域内およびＩＬ−４で刺激された単球内に見いだされ（２８）、このことは、１５−ＬＯが進行したアテローム性動脈硬化血管疾患および免疫の仲介する血管疾病内で作用しうることを示唆している。証拠の増加はまた、１２−ＬＯ酵素がいくつかのさらなる組織内でＡII誘導作用に重要な役割を演じていることを示唆する。研究から、アラキドン酸の１２− ＬＯ経路は、ラットおよびヒトの副腎球状層細胞内のＡII誘導アルドステロン合成を仲介できることが示唆される（１１、１２）。さらに、最近のデータは、Ａ IIの誘導する副腎細胞の増殖が、少なくとも部分的には、１２−ＬＯ酵素の活性化によって仲介されることを指摘している。ラットでのさらなる研究では、ＡII による血管収縮およびレニン阻害作用に１２−ＬＯ経路が関係していた（２９）。大動脈は、１２−ＨＥＴＥおよび１５−ＨＥＴＥを含むＬＯ生成物を生成する能力を持っている（３０）。最近のデータから、ＡIIおよび高グルコースの両方が、培養したブタ大動脈平滑筋細胞内の白血球型１２−ＬＯを亢進調節できることが、示された（３１）。ＡIIは、生体外（ｉｎｖｉｔｒｏ）および生体内（ｉｎｖｉｖｏ）における血管平滑筋細胞を増殖させることに主に影響している（１、７、３２−３４）。最近の報告では、シクロキシゲナーゼの阻害剤ではなく、比較的選択的な１２− ＬＯの阻割剤が、培養したブタ血管平滑筋細胞内でのＡII誘導の異常亢進的応答を完全に防ぎうることが認められた（３５）。さらに、これらの血管平滑筋細胞のタンパク質およびフィブロネクチン含有量において、１２−ＨＥＴＥは、ＡII と同様の増加を誘導した（３６）。１２−ＬＯ経路およびその生成物である１２ −ＨＥＴＥもまた、血管平滑筋細胞の移動と関係していた（９）。１０^-12Ｍ程度の低い濃度の１２−ＨＥＴＥが、平滑筋細胞の移動を導くことが示された。さらなる研究により、１２−ＬＯ生成物は、プロテインキナーゼＣの特定の異性体ならびにｒａｓ、ｃ−ｆｏｓおよびｊｕｎを含むオンコジーンを活性化できることが、示された（３６−３８）。それ故、ＡIIによって増加した１２−ＬＯの活性および発現は、ＡIIによって誘導されるヒトの高血圧性およびアテローム動脈硬化血管疾病に関する、以前には認識されていなかったメカニズムであろう。従って、本発明のもう一つの重要な態様は、ＡIIに関連する心臓血管疾病を減少させるための新規の治療法として、１２−ＬＯ経路の封鎖を必然的に伴う。ヒト血管壁および単球内の１２−ＬＯの経路は、アテローム性動脈硬化血管疾病の発生または進行に関連するその他のメカニズムに関係するであろう。最近の証拠では、血管壁内でのＬＤＬの酸化的修飾が、ＬＯ経路とも関係していた（３９−４１）。現在では、ＨＡＥＣ、ＨＭＳＣまたは単球は、天然のＬＤＬを、より強いアテローム性動脈硬化潜在能力を有する最小限修飾したＬＤＬに転化させる能力を持つことが、明らかになっている。マクロファージのコレステロール負荷が、本来、１２−ＨＥＴＥの生成を増加に導くことを示すデータは興味深い（４２）。最近の報告で、白血球型の１２−ＬＯおよび１５−ＬＯは両方とも、同じ様にリポタンパク質を酸化できることが、これまでに示された（４２）。興味深いことに、この同一の報告で、血小板１２−ＬＯがリポタンパク質を酸化する能力を欠くことも示された。ヒト血管内の白血球１２−ＬＯの存在および局在性のためのさらなる証拠を提供するために、２つのアテローム性動脈硬化病変の免疫組織化学分析を行った。結果から、白血球型の１２−ＬＯがアテローム性動脈硬化病変の内皮および平滑筋細胞内に特に発現するという免疫組織化学的証拠が提供され、アテローム性動脈硬化血管疾病の進行の初期においてこの経路が潜在的な役割を果たしていることを支持している。前研究では、血管組織および単球がＬＯ活性を持つことを示した（４２−４４）。ＡIIおよび１２−ＨＥＰＥが機能する経路ＡIIおよび１２−ＨＥＴＥの影響は、分裂促進性活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ活性を刺激することによって、細胞を変化させることが、これまでに発見された。具体的に言うと、ＡIIおよび１２−ＨＥＴＥは、ＥＲＫ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｒｅｇｕｌａｔｅｄｋｉｎａｓｅｓ）（細胞外制御キナーゼ）［例えば、ＥＲＫ１（Ｐ４４^MAPK）、ＥＲＫ２（Ｐ４２^MAPK）およびＥＲＫ３（Ｐ６２^MAPK）］を介してｆｏｓの転写活性を活性化することによって、ＪＮＫ（ｃＪｕｎキナーゼまたはストレス活性化キナーゼ）を介してｊｕｎを活性化することによって、および／または、ＪＡＫ（Ｊａｎｕｓキナーゼ、例えば、ＪＡＫ１およびＪＡＫ２）を活性化することによって、機能する。より具体的には、ＡIIおよび１２−ＨＥＴＥは、ＪＮＫを活性化するための重要な上流シグナルとしてかかわる、Ｐ−２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）を活性化する。実験方法ＥＲＫ活性：ＥＲＫ活性は、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８３：１３９− １４３（１９８９）に記載の基質−ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル法によって評価した。１００ｍＭの皿内のコンフルエントに達した細胞を無血清培地内で休止状態にし、その後、様々な期間、アゴニストで処理した。次に、細胞を溶解バッファー（１％ＮＰ４０、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、１００ｍＭ−ＮａＣｌ、５０ｍＭＴｒｉｓ、１０ｍＭ−ＥＤＴＡ、１ｍＭ−ＥＧＴＡ、アプロチニン、１００ｍｇ／ｍｌロイペプチン、０．１ｍＭ−ＰＭＳＦおよび１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）中で溶解した。溶解物を遠心分離して核をペレット状にし、細胞抽出物（１５−２０ｍｇタンパク質）を、ＥＲＫ基質としてミエリン塩基性タンパク質（０．５ｍｇ／ｍｌ）を含むＳＤＳポリアクリルアミドゲル（１０％）の電気泳動にかけた。その後、ＳＤＳを洗浄し、次に、変性させ、、再生させ、さらに［³²Ｐ］ＡＴＰでゲル上のタンパク質をリン酸化した。ＪＮＫ活性：プラスミドｐＧＥＸ−ｃＪｕｎ１／７９（Ｄｅｐｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．ＵＣＳＤ，ＬａＪｏｌｌａ）は、ｃＪｕｎのアミノ酸（１−７９）をコードするＧＳＴ−ｃＪｕｎ（１−７９）発現ベクターである。ＧＳＴ融合タンパク質発現ベクターで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を形質転換した。タンパク質は、０．１ｍＭ−ＩＰＴＧで誘導され、そしてグルタチオン−アガロースビーズへのアフィニティー結合によって精製した。刺激されなかったまたは刺激された細胞をＷＣＥＢ（２５ｍＭ−ＨＥＰＥｓ、ｐＨ７．７、０．３Ｍ−ＮａＣｌ、１５ｍＭ−ＭｇＣｌ₂、０．２ｍＭ−ＥＤＴＡおよび０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００）中で溶解した。約５０μｇのタンパク質抽出物は、ＧＳＴ−ｃＪｕｎ＋ＧＳＨアガロースと共に、一晩、４°Ｃでインキュベートした。リン酸化は、２０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、２０ｍＭｂ−グリセロホスフェート、１０ｍＭｐ−ニトロフェノールホスフェート、１０ｍＭ−ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ−ＤＤＴ、５０μｇＮａ₃ＶＯ₄、２０μＭＡＴＰ（非放射性）およびおおよそ０．５μｌの新規に購入したガンマ³²Ｐ−ＡＴＰの存在下、３０°Ｃで２０分間、行った。電気泳動サンプルバッファーと共に沸騰させた後、上澄み液を１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ＪＮＫ活性もまた、抗−ＪＮＫ抗体（ＰａｒｍｉｎｇｅｎＣｏ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ）を用いた免疫沈降法によって測定し、次に、活性は、Ｃｅｌｌ，８１：１１４７−１１５７（１９９５）に記載の方法に従って、基質として２μｇのＧＳＴ−ｃＪｕｎを用いて測定した。ＰＡＫ活性：細胞の溶解およびＰＡＫ活性の測定は、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９：２２１−２２３（１９９５）に記載の方法に従って、行われた。細胞は、プロテアーゼ阻害剤であるＰＭＳＦ、ロイペプチンおよびアプロチニンを含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＥＧＴＡ、５０ｍＭＮａＦ、１０ｍＭのピロリン酸Ｎａ、１％ＮＰ−４０、２．５％グリセロール、および１ｍＭＮａ₃ＶＯ₄（ｐＨ７．５）中、氷上で溶解させた。細胞を１０分間１０００ｇで遠心分離した。免疫沈降を行うために、上澄み液は、抗−ＰＡＫ１または抗ＰＡＫ２抗体（１：２５）（Ｄｅｐｔ．Ｉｍｍｕｎｏ．＆ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ，ＳｃｒｉｐｐｓＲｅｓ．Ｉｎｓｔｉｔ．，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）と共に、４°Ｃで２時間インキュベートし、次に６０μｌの１：１プロテインＡビーズを加えて６０分間インキュベーション、その後、１．０ｍｌ溶解バッファーで５回洗浄し、さらにキナーゼバッファー（５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、０．２ｍＭジチオスレイトール、２μ ｇミエリン塩基性タンパク質および１４μＭ［γ−³²Ｐ］ＡＴＰ）で、３０°Ｃで２０分間、二回洗浄した。反応はＳＤＳサンプルバッファーを加えて停止し、結果はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフによって可視化した。結果ＡIIの投与は、結果としてＭＡＰキナーゼの二段階の活性化を起こすことが発見された（ＭＡＰキナーゼの実験はすべて、ＣＨＯ−ＡＴ１ａ細胞内で行った。これはＡIIレセプターであるＡＴ１ａｃＤＮＡを、チャイニーズハムスター卵巣細胞に移入したものである）。ＡII（１０^-7Ｍ）は、５分で第一の活性ピーク（２−６倍）および３−４．５時間で後のピーク（１．５−３倍）を持つ二段階のＥＲＫ活性の刺激、ならびに、３０分でピークに達し１時間残存するＪＮＫ活性の刺激を誘導することが見いだされた。また、ＡII（１０^-7Ｍ）は、３０分に１回の主要ピーク（５倍）を持つＰＡＫの刺激を誘導することが認められた。また、１２−ＨＥＴＥ（１０^-7Ｍ）が、５分に第一のピークおよび３−４．５時間に第二のピークを持つ二段階のＥＲＫ活性の刺激、ならびに、３０分（２− ３倍）および３時間（２．５−５倍）にピークを持つ二段階のＪＮＫ活性の刺激を誘導することも、発見された。１２−ＨＥＴＥは、図２９に示すように、１０^-9 Ｍほどの低い濃度でＪＮＫ活性を刺激することが見いだされた。さらに、１２−ＨＥＴＥは、ＪＡＫ活性の刺激を誘導することが発見された。ＣＨＯ−ＡＴ_1a細胞を１２−ＨＥＴＥ（１０^-7Ｍ）で１０時間処理し、ホスホチロシン抗体で免疫沈降し、さらにＪＡＫ１およびＪＡＫ２に特異的な抗体を用いてイムノブロットした。図３０で見ることができるように、１２−ＨＥＴＥは、ＪＡＫ活性を増加させた。最後に、１２−ＬＯ阻害剤（例えば、ＣＤＣおよびバイカライン）は、濃度に依存して、ＡII−および１２−ＨＥＴＥの誘導する分裂促進性活住を減少させることが発見された。このように、１２−ＬＯ阻害剤の投与は、ＡIIおよび／または１２−ＨＥＴＥ誘導ＭＡＰキナーゼ活性を減少させ、それによって、ＡIIおよび／または１２−ＨＥＴＥが細胞の増殖および発生に持つ影響を減少させる。このデータに矛盾しないように、本発明の一つの態様は、１２−ＬＯ阻害剤の投与を通して、ＥＲＫ、ＪＮＫおよび／またはＪＡＫ活性の減少を含む、ヒトのＡII−または１２−ＨＥＴＥ−誘導疾病の治療法を必然的に伴う。特別な理論で結びつけられることを望むわけではないが、１２−ＨＥＴＥは、１２−ＨＥＴＥレセプターの亢進調節を通してＭＡＰキナーゼ活性を増加させると考えている。このように、ＡII−または１２−ＨＥＴＥ誘導疾病の治療法もまた、例えば、ＤｕＰ６５４のような、１２−ＨＥＴＥレセプターアンタゴニストの投与を通して分裂促進性の活性を減少させることを含む。１２−ＬＯ経路の阻害白血球型の１２−ＬＯ活性を減少させる様々な薬学的方法、アンチセンスまたはリボザイム法の利用は、出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／０００８９に記載されている。パナキシノール、すなわち朝鮮人参から分離したポリアセチレン化合物は、白血球１２−ＬＯの比較的選択的な阻害剤として同定されており（５５）、本発明の目的に有効である。乳癌細胞の増殖における１２−ＬＯ経路の役割出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／０００８９の実施例Ｖは、１２−ＬＯ経路の封鎖が有効なヒトの乳癌治療法を提供することを示している。乳癌細胞および組織での１２−ＬＯ活性および発現の制御のさらなる評価から、乳癌組織の増殖は１２−ＬＯ阻害剤によって阻害されることが確認される。具体的には、白血球型の１２− ＬＯｍＲＮＡ発現について、６人の患者からの癌を含まない正常乳房組織と癌を含む乳房組織のＲＮＡサンプルとを対比する、特異的逆転写酵素ＰＣＲ法によって研究した。６人の患者のそれぞれにおいて、癌含有切片は、比較対象である正常な切片より非常に高いレベルの１２−ＬＯｍＲＮＡ（３４０ｂｐＰＣＲ生成物）を示した（ＰＣＲ用の内部対照、ＧＡＤＰＨｍＲＮＡ２８４ｂｐによる標準化の後でも３−６倍高い）。１２−ＬＯｍＲＮＡのレベルもまた、正常な乳房上皮細胞株ＭＣＦ−１０Ｆと比較して、２種類のガン細胞株、ＭＣＦ− ７およびＣＯＨ−ＢＲ１では、７倍および１１倍より高かった。さらに、ＭＣＦ−７細胞の増殖は、三種類のＬＯ阻害剤、バイカライン（１０μＭ）、ＣＤＣ（１０^-5Ｍ）およびＮＤＧＡ（３０μＭ）によって明らかに阻害されたが、シクロオキシゲナーゼ阻害剤であるイブプロフェン（１０^-5Ｍ）によっては阻害されなかった。ＥＧＦで４時間、血清を枯渇させたＭＣＦ−７細胞を処理すると、１２−ＬＯ生成物である１２−ＨＥＴＥの形成は、濃度に依存して増加に導かれる（基準値２５７±１０ｐｇ／１０⁶細胞；ＥＧＦ５０ｎｇ／ｍｌでは４６２±１５ｐｇ；ＥＧＦ１００ｎｇ／ｍｌでは５９３±４６ｐｇ；両方共ｐ＜０．００１対基準値）。ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）もまた、１２−ＬＯタンパク質（７２ｋＤ）ならびに１２−ＬＯｍＲＮＡのレベルを、２４時間で著しい増加に導いた。これゆえ、１２−ＬＯ経路の活性化は、基準的およびＥＧＦ−誘導の乳癌細胞の増殖および発生に重要な役割を演じるものと思われる。乳癌におけるエストロゲンの作用への１２−ＬＯ経路の役割乳癌細胞の増殖および発生と関連するエストロゲンは、乳癌細胞において１２ −ＬＯ経路を活性化する役割を演ずることが、これまでに発見された。エストロゲンレセプター陽性の乳癌細胞株であるＭＣＦ−７から、無血清で且つフェノールレッドを含まない限定培地内で４時間、１７β−エステラジオールと共に、細胞を処理すると、細胞に関連した１２−ＬＯの生成物である１２−ヒドロキシエイコサテトラエン酸（１２−ＨＥＴＥ）のレベルが、濃度に依存して増加に導かれた（基準値１６１±２９ｐｇ／１０⁶細胞；１７β−エストラジオール、５ｎＭで７８４±１５０ｐｇ；１７β−エストラジオール、１０ｎＭで１０５６±１８７ｐｇ；両方ともｐ＜０．００１対基準値）。この１２−ＨＥＴＥへの１７β−エステラジオールの刺激効果は、エストロゲンレセプター陰性の細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１では発見されなかった。エストロゲンでＭＣＦ −７細胞を２２時間処理すると、同様に、１２−ＬＯペプチド抗体でのイムノブロッティングによる試験では、白血球型の１２−ＬＯタンパク質の発現の濃度に依存した増加が引き起こされた（１ｎＭおよび１０ｎＭの１７β−エステラジオールで、それぞれ、基準値の２．１倍および３倍に増加）。このように、１７β −エステラジオールは、ＭＣＦ−７細胞における１２−ＬＯの活性および発現を増加させた。それ故、１２−ＬＯ経路の活性化は、エストロゲンの誘導する乳癌細胞の増殖および発生に、重要な役割を演じると考えられる。このデータから、本発明の一つの態様は、１２−ＬＯ経路を阻害することを通して乳癌細胞の増殖および発生を減少させる治療法を伴う。そのような１２−ＬＯ経路の阻害は、とりわけ、エストロゲンが乳癌細胞胞の増殖および発生に及ぼす効果を減少させるであろう。ＶＥＧＦの形成における１２−ＬＯ経路の役割出願者らは、１２−ＬＯ経路が、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の形成にも役割を演じることを、発見した。ＶＥＧＦは、血管透過性および単球の移動性を増加させる内皮細胞に特異的な分裂促進因子である。ＶＥＧＦは、乳癌および肺癌を含む、多くの型の癌の主な血管新生の因子であると思われる。さらに、ＶＥＧＦは、増殖性糖尿病性網膜症ならびに糖尿病としばしば関連性を持つ進行した血管疾病の発生とも結びついていた。図８、９および１０の簡単な説明図８は、ＭＣＦ−７乳癌細胞内の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）タンパク質（４２ｋＤ）の発現への血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）の濃度依存的効果について説明している。ほぼコンフルエント状態のＭＣＦ−７細胞は、ＤＭＥ培地＋０．４％ＦＣＳおよび０．２％ＢＳＡ内に置くことによって、２４時間血清を枯渇させた。次いで、この培養液を新鮮なものに置き換え、そして細胞をさらに２４時間ＰＤＧＦと共にインキュベートした。インキュベーションの終わりに、単層の細胞を氷冷したＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ内でかきとり（ｓｃｒａｐｅｄ）、そして遠心分離によってペッレットにした。その後、細胞ペレットを溶解し、同量のタンパク質（５０μｇ）を電気泳動にかけ、ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙからの特異的抗体を用いて、ＶＥＧＦを検出するためにイムノブロットした。検出は、化学発光技術によって行った。ＰＤＧＦは、乳癌細胞内でのＶＥＧＦの発現において、濃度に依存して増加する原因となることが明らかに認められる。図９は、乳癌細胞株ＭＣＦ−７内でのＶＥＧＦタンパク質の発現への内皮増殖因子（ＥＧＦ）および１２−リポキシゲナーゼ生成物である１２−ＨＥＴＥの効果を説明している。ＭＣＦ−７細胞を、ＥＧＦおよび１２−ＨＥＴＥで２４時間処理し、図８の説明文に記載の方法に従って、ＶＥＧＦタンパク質を同定した。図は、ＶＥＧＦタンパク質の発現が、ＥＧＦのような乳房細胞の分裂促進因子によって誘導されるのみならず、１２−ＬＯ生成物である１２−ＨＥＴＥによっても誘導されることを示している。事実、１２−ＨＥＴＥは、ＶＥＧＦの誘導において、ＥＧＦよりさらに有力であると思われ、１２−ＨＥＴＥが有力な血管新生特性を持つことを指摘している。図１０は、不死化したヒトの大動脈平滑筋細胞株（ＡＩＨＳＭＣ）内でのＶＥＧＦタンパク質（４２ｋＤ）の発現における、１２−リポキシゲナーゼ生成物である１２−ＨＰＥＴＥの効果について説明している。細胞は２４時間血清を枯渇させ、その後１２−ＨＰＥＴＥを含む新しい培養液に置き換えた。細胞を５時間インキュベートし、その後、図８の説明文に記載した方法に従って、溶解した細胞内でＶＥＧＦタンパク質を同定した。第３列は、図で指摘されるように、第１列の対照と比較した場合、１２−ＬＯ生成物である１２−ＨＰＥＴＥがＰＶＳＭＣ内に血管新生物質であるＶＥＧＦの発現を増加させる原因となることを示している。図８および９は、１２−ＬＯ生成物である１２−ＨＥＴＥが１０^-7Ｍおよび１０^-8ＭでＶＥＧＦタンパク質の発現を増加させることを示す、二種類のヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７およびＭＤＡＭＢのデータを報告している。図１０は、１２ −ＨＥＴＥがＨＶＳＭＣ内でＶＥＧＦタンパク質を増加させうることを示している。図８−１０に表した仕事に加えて、ＡII、１２−ＨＥＴＥおよび高血糖症（ＨＧ）が、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）内のＶＥＧＦ生成を増加させることが、これまでに発見された。ブタおよびヒトのＶＳＭＣを、正常なグルコース（ＮＧ、５．５ｍＭ）条件下またはＨＧ条件下で、少なくとも二継代培養した。ＶＥＧＦタンパク質の発現は、ウエスタンブロッティングによって、さらにＶＥＧＦｍＲＮＡはノーザンブロットによって、定量した。ＨＧは単独で、ＶＥＧＦｍＲＮＡ（２．８倍）およびタンパク質（３．２倍）のレベルを増加させた。さらに、ＶＥＧＦタンパク質（４５Ｋ）およびｍＲＮＡ（３．７Ｋｂ）の発現は、ＡII （１０^-7Ｍ）での処理を４時間行うことによって、ＨＧ中で培養した細胞内で（それぞれ２．２倍および１．４倍に）、明らかに増加した。さらに、１２−ＨＥＴＥ（１０^-8Ｍおよび１０^-7Ｍで４時間）は、ＮＧ条件下ならびにＨＧ条件下の両方で培養した細胞内のＶＥＧＦタンパク質およびｍＲＮＡの発現を増加させる。さらに、ＨＧは、特異的ＥＩＡによって測定したところによると、培養液内へのＶＥＧＦの分泌を増加させた（５６．２±４ｎｇ／ｍｌＮＧ対７３±５ＨＧ、ｐ＜０．０２）。ＡIIおよび１２−ＨＥＴＥもまた、ＥＩＡによる測定では、それぞれ１．２４倍および１．４倍にＶＥＧＦの分泌を増加させた。このデータより、本発明の一つの態様は、ＶＥＧＦ生成を減少させることによって、例えば、ｈｌ１２−ＬＯ経路の阻害を通して、乳癌およびその他の癌の転移の可能住ならびに糖尿病に関係する苦悩（たとえば、増殖性糖尿病性網膜症および進行した血管疾病）を減少させる治療法を含む。糖尿病Ｉ型の病因における１２−ＬＯ経路の役割本発明のこの態様は、膵臓ベーダ細胞の機能障害における１２−ＬＯ経路の活性化、または糖尿病Ｉ型の病因にかかわるサイトカインに応答する細胞傷害性の役割を含む。図１１、１２および１３の簡単な説明図１１は、インスリンを生成するラットのベータ細胞株であるＲＩＮｍ５ＦにおけるＤＮＡ合成への１２−ＬＯ生成物の効果について説明している。ＤＮＡ合成は、（１８−２４時間の実験で）最後の６時間に加えた³Ｈ−チミジンの取り込み（１μＣｉ／ｍｌ）を用いて、研究した。ＬＯ生成物を、完全増殖培地内の細胞に２４時間、加えた。示されているように、１２−ヒドロキシエイコサテトラエン酸（１２−ＨＥＴＥ、１０^-9Ｍ）および１２−ヒドロペルオキシエイコサテトラエン酸（１２−ＨＰＥＴＥ）は、³Ｈ−チミジンの取り込みを減少させ、このベータ細胞株内のＤＮＡ合成を減少させるそれらの効果を反映している。図１２は、インスリンを生成するラットのベータ細胞株であるＲＩＮｍ５Ｆから分離したタンパク質のイムノブロットについて説明しており、１２−ＬＯタンパク質発現へのインターロイキン−１βの効果について示している。これらの研究では、０．４％の血清減少含有培地単独で、またはこれにＩＬ−１β（０．１ｎｇ／ｍｌ）を加えて、１６時間増殖させた細胞から、２５μｇのタンパク質を分離した。結果は、ＩＬ−１で処理（第２列および４列）後、１２−ＬＯタンパク質の発現が２倍に増加することを示している。第７列は、１２−ＬＯ標準を示しており、ラット、ブタおよびヒトの形の白血球型の１２−ＬＯを認識する出願者らのペプチド抗体を用いて、特徴的な７２ｋＤの１２−ＬＯタンパク質のバンドを示す。図１３は、ラットのランゲルハンス島内の１２−ＨＥＴＥ生成へのＩＬ−１β の効果について説明している。出願者らは、１２−ＬＯ生成物である１２−Ｓ−ＨＥＴＥまたは１２−ＨＰＥＴＥの直接添加が、ラットの純粋ベータ細胞株であるＲＩＮ−Ｍ５Ｆ内への³Ｈチミジンの取り込みまたはＤＮＡ合成を減少させることによって確認されるように、直接的に細胞の増殖を減少させることを、発見した。図１１に示したように、１０^-9Ｍほどの低い濃度の１２−ＬＯ_生成物でさえ、ＤＮＡ合成を減少させる。図１２は、ヒトのＩＬ−１βが、０．２ｎｇで、これらのＲＩＮ細胞内の白血球１２−ＬＯタンパク質の発現をおおよそ２倍に増加させることを示している。図１３は、ＩＬ−１βが、２．５ｎｇ／ｍｌで、免疫反応性のある１２−Ｓ−ＨＥＴＥの遊離を増加させる（基準値９２ｐｇ／ｍｌ／４０ランゲルハンス島対２５０ｐｇ／ｍｌ／４０ランゲルハンス島）ことによって確認されるように、新たに分離されたラットの膵臓ランゲルハンス島内の１２−ＬＯの活性化を明らかに増加させることを、示している。ヒトの自己免疫、炎症障害およびアテローム性動脈硬化障害の進行への１２−ＬＯ経路の役割増加する証拠から、ＩＬ_1、ＩＬ₄およびＩＬ₈のようなサイトカインが、ヒトの自己免疫、炎症性障害およびアテローム性動脈硬化障害の発生に役割を演ずることが示唆される。図１４−２０の簡単な説明図１４Ａは、ブタの大動脈平滑筋細胞（ＰＶＳＭＣ）内での１２−ＬＯｍＲＮＡ発現における、サイトカインであるインターロイキン−１βの濃度依存効果について説明している。正常なグルコース培養液内でのコンフルエントのＰＶＳＭＣの増殖は、培地＋０．２％ＢＳＡ＋０．４％ＦＣＳ中に置くことによって、２４時間血清を枯渇させた。その後、この培養液を、ＩＬ−１βを含む新しいものと置き換えて、細胞をさらに２４時間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、ＲＮＡ−ＳＴＡＴを用いて、全ＲＮＡを細胞から抽出した。その後、このＲＮＡは、逆転写酵素ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行い、十分に確立された我々の技術を用いて、白血球型の１２−ＬＯｍＲＮＡ（３３３ｂｐのＰＣＲ生成物、上方パネル）を検出し定量した。ＧＡＰＤＨｍＲＮＡ（２８４ｂｐ、下方パネル）の発現は、ＰＣＲおよび定量のための内部対照として用いられた。図は、ＩＬ−１βでの処理が、内部対照であるＧＡＰＤＨｍＲＮＡの発現を大きく変化させないのに対して、１２−ＬＯｍＲＮＡの発現（３３３ｂｐのＰＣＲ生成物）を濃度に依存して増加に導くことを示している。図１４Ｂは、ＰＶＳＭＣ内での１２−ＬＯｍＲＮＡの発現におけるサイトカインＩＬ−４の効果について説明している。細胞をＩＬ−４とともに２４時間処理し、図１４Ａの説明文に記載の方法に従って、１２−ＬＯｍＲＮＡを定量した。ＩＬ−４もまた、ＩＬ−１βと同様に１２−ＬＯｍＲＮＡを増加させることが明らかに認められる。図１４Ｃは、ＰＶＳＭＣ内での１２−ＬＯｍＲＮＡの発現におけるサイトカインＩＬ−８の影響について説明している。細胞をＩＬ−８と共に２４時間処理し、図１４Ａの説明文に記載の方法に従って、１２−ＬＯを定量した。ＰＶＳＭＣのＩＬ−８による処理は、１２−ＬＯｍＲＮＡの発現を濃度依存性増加へと導くが、内部対照であるＧＡＰＤＨの発現には変化が見られないことを、図は示している。図１５は、内部マーカーであるＧＡＰＤＨについて分析した同一のＲＮＡについて説明している。図１６は、ＰＶＳＭＣ内での白血球型１２−ＬＯタンパク質の発現におけるＩＬ−４の効果について説明している。図１７は、ＰＶＳＭＣ内での白血球型１２−ＬＯタンパク質の発現におけるＩＬ−８の効果について説明している。図１８は、ＰＳＭＣ内での１２−ＬＯ活性へのＩＬ−４の影響について説明している。図１９は、ＰＳＭＣ内での１２−ＬＯ活性へのＩＬ−８の影響について説明している。図２０は、ＩＬ−１、ＩＬ−４およびＩＬ−８によるｈｌ１２−ＬＯの亢進調節を確認している。ランゲルハンス島についてのこの仕事に加えて、出願者らは、ＩＬ₁、ＩＬ₄およびＩＬ₈が、ブタおよびヒトの大動脈平滑筋細胞内の白血球型１２−ＬＯのｍＲＮＡの発現を増加させうることを、ここで示した。さらに、出願者らは、１２ −ＬＯタンパク質の発現がブタの血管平滑筋内で、これらのサイトカインによって同様に亢進調節されるという証拠を有している。細胞を、ＤＭＥ（正常グルコース）内で培養し、０．２％のＢＳＡおよび０．４％の血清を含む培地内で２４時間、サイトカインの存在下又は非存在下で処理した。細胞内の１２−ＬＯ酵素の活性は、ＨＰＬＣによって測定し、白血球型の１２−ＬＯタンパク質の発現はイムノブロッティングによって、そして１２−ＬＯｍＲＮＡは特異的逆転写酵素ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって測定した。３種類のサイトカイン（２．５ｎｇ／ｍｌ）はすべて、１２−ＬＯ酵素活性の明らかな増加の原因となり、ＩＬ−１、ＩＬ−４およびＩＬ−８に対する１２−ＨＥＴＥＨＰＬＣのピークで、それぞれ５１、４３および３６％増加する。さらに、３種類のサイトカインのすべて（１−５ｎｇ／ｍｌ）は、それぞれ１２−ＬＯｍＲＮＡの発現（３４０ｂｐＰＣＲ生成物）を、強い濃度依存性増加（２−５倍）へと導く。これらのサイトカインでの処理（０．５−５ｎｇ／ｍｌ）は、また、１２−ＬＯタンパク質（７２ｋＤ）の発現を増加へと（１．４−２．５倍）導く。さらに、三種類のサイトカイン（２．５ｎｇ／ｍｌ）はすべて、ＰＶＳＭＣのＤＮＡの合成を明らかに増加へと誘導することができた（ＩＬ−１、ＩＬ−４およびＩＬ− ８での³Ｈチミジンの取り込みにおいて、それぞれ１．２８±０．０８、１．６７±０．１１および１．３±０．０７倍の増加、ｐ＜０．０１）。ヒトの血管平滑筋細胞（ＨＳＭＣ）もまた、ＤＭＥ（正常グルコース）内で培養され、０．２％ＢＳＡおよび０．４％血清を含む培地内、ＩＬ₁、ＩＬ₄およびＩＬ₈で２４時間処理された。超音波処理した細胞の細胞内１２−ＬＯ酵素の活性をＨＰＬＣで、白血球型１２−ＬＯタンパク質の発現をイムノブロッティングで、そして１２−ＬＯｍＲＮＡを特異的逆転写酵素ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ −ＰＣＲ）で、測定した。ＩＬ−１、ＩＬ−４またはＩＬ−８（５ｎｇ／ｍｌ）で２４時間、低血清培地内でＨＳＭＣを処理すると、その結果、処理していない細胞と比較して、１２−ＬＯｍＲＮＡの発現が７−１０倍に増加した。同一実験からのＲＮＡはまた、特異的ＲＴ−ＰＣＲによって、ヒト１２−ＬＯの発現についても分析した。１５−ＬＯｍＲＮＡは、基準値またはサイトカイン追加後のいずれにおいても認められなかった。これらの結果から、これらの炎症性サイトカインは、ＶＳＭＣ内では分裂促進性効果を持ち、それらは、１２−リポキシゲナーゼ経路の強力な正のレギュレーターであることが示唆される。このように、これらのサイトカインに応答して強められた１２−ＬＯ活比および発現は、アテローム性動脈硬化で認められたサイトカイン誘導のＶＳＭＣの移動および増殖についての鍵となるメカニズムであろう。図１４は、正常な（５．５ｍＭ）および上昇させた（２５ｍＭ）グルコシド中で培養したＰＶＳＭＣ内の１２−ＬＯｍＲＮＡ発現へのＩＬ₁、ＩＬ₄およびＩＬ₈の効果について示している。図１５は、内部マーカー遺伝子ＧＡＰＤＨについて分析した同一のＲＮＡを示しており、すべての列が同量の内部標準ＲＮＡを持つことを示している。図１６および１７は、それぞれＩＬ₄およびＩＬ₆によってＰＶＳＭＣ内での１２−ＬＯタンパク質の発現が増加することを示し、また、図１８および１９は、それぞれＩＬ₄およびＩＬ₈で処理したＰＳＭＣ内の１２ −ＬＯタンパク質の活性が選択的に増加していることを示すＨＰＬＣの自己計量器記録を示している。図２０は、ＩＬ₁、ＩＬ₄およびＩＬ₈が、ヒト大動脈ＳＭＣ内の白血球型の１２−ＬＯを著しく亢進調節することができると言う証拠を示している。これらの同一の実験では、出願者らは、未処理またはサイトカイン処理のＨＳＭＣ内での１５−ＬＯの発現を証明することはできず、血管平滑筋内でのサイトカインの作用の潜在的仲介物質としての１２−ＬＯの選択的役割が証明された。糖尿病Ｉ型およびII型の病因における１２−ＬＯ経路の役割インスリン依存型糖尿病または糖尿病Ｉ型は、ランゲルハンス島内のインスリン生成細胞またはベータ細胞の完壁な破壊の結果起こる自己免疫病である。ＩＬ −１βのようなサイトカインは、この自己免疫の進行にかかわっていると考えられる。ＩＬ−１βは、ＲＩＮ−Ｍ５Ｆ細胞内では１２−ＬＯタンパク質およびｍＲＮＡの発現を、且つラットのランゲルハンス島では１２−ＬＯｍＲＮＡの発現を誘導することが発見された。ＩＬ−１β（２５、５０および１００ｎｇ／ｌ）で１６時間処理されたＲＩＮ−Ｍ５Ｆ細胞は、ブタの白血球型１２−ＬＯの発現を濃度に依存して２倍に増加させることがウエスタンブロットによって証明された。１２−ＬＯｍＲＮＡ発現の付随増加は、この時点で、感受性の高い競合ＰＣＲアッセイを用いて認められた。これらの転写および翻訳のイベントは、１２− ＨＥＴＥのラジオイムノアッセイによって測定した１２−ＬＯ経路の活性の増加に平行して進行した。さらに、誘導型ー酸化窒素合成酵素（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｓｙｎｔｈａｓｅ）（ｉＮＯＳ）の阻害剤であるＮ−モノメチルアルギニン（ＮＭＭＡ）（Ｎ−ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌａｒｇｉｎｉｎｅ）は、ＲＩＮＭ５Ｆ細胞内のＩＬ−１βによって誘導される１２−ＬＯタンパク質の発現の、増加を阻害することができず、このことは、誘導型ー酸化窒素（ＮＯ）に依存しない経路が存在すると言う仮説を支持する。単離されたＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットランゲルハンス島を用いる別実験でもまた、１２−ＬＯｍＲＮＡの発現および酵素活住の増加が示された。最後に、１２−ＬＯは、ＩＬ−１βなどのサイトカインによって転写および翻訳のレベルが調節されるβ細胞に特異的な酵素である。図２１−２４の簡単な説明図２１は、糖尿病ラットの膵臓ランゲルハンス島内での１２−ＬＯｍＲＮＡ発現の増加を表している。図２２は、糖尿病ＺＤＦラットの骨格筋内の１２−ＬＯｍＲＮＡの発現が、非糖尿病ＺＤＦラットのそれより高いことを示している。ＺＤＦラットモデルは、特発性ＮＩＤＤＭ（非インスリン依存性真性糖尿病）の卓越した動物モデルとして推薦された。図２３は、ヒトインスリンレセプターを過剰発現するラット繊維芽細胞に関するデータを示している。図２４は、様々な糖尿病群でのＨＥＴＥ／ＰＧＩ₂比の主な変化を表している。ＮＩＤＤＭは、筋肉へのグルコース輸送を誘導するインスリンの能力の減少（インスリン耐性）および膵臓ランゲルハンス島内でのグルコースの誘導するインスリン分泌の相対的減少と関係する遺伝的複合疾病である。本発明のもう一つの態様と一致して、１２−ＬＯ経路の活注および発現の増加は、１２−ＬＯ経路の封鎖がＮＩＤＤＭの発生を予防することができるように、これら異常性の両方に共通するメディエイタとして認識される。本供述書の原理には以下の１−５の事柄が含まれる。１．膵臓ランゲルハンス島および骨格筋内の白血球型１２−ＬＯの存在を証明する関連性の高いデータ。骨格筋のデータは、新しくそして関連性が高い。ラットの骨格筋ＲＮＡおよびヒトランゲルハンス島ＲＮＡから得られたデータは、ＰＣＲ分析を用いて、１２−ＬＯの発現について示している。２．１２−ＬＯｍＲＮＡの発現が、やせ型非糖尿病動物から肥満型前糖尿病動物および肥満型糖尿病動物までのラットの膵臓ランゲルハンス島で漸進的に増加するという証拠（図２１を参照のこと）。３．ラットの膵臓ランゲルハンス島に外因的に加えられた１２−ＬＯ生成物は、グルコース誘導インスリン分泌を減少させることができるというデータ（４５）。４．尿の１２−ＨＥＴＥレベルは、やせ型ＺＤＦの非糖尿病ラットと比較して、雄の肥満型糖尿病ＺＤＦラット（ＮＩＤＤＭモデル）では、遥かに高いと言う、生体内データ（表２を参照のこと）。興味深いことには、表現型から見ると、前糖尿病のヒトに似た雌の肥満型ＺＤＦラットは、尿中に中間レベルの１２− ＨＥＴＥを示す。５．糖尿病のＺＤＦラットの骨格筋内での１２−ＬＯｍＲＮＡの発現は、非糖尿病のＺＤＦラットからの骨格筋内でのレベルより著しく高いことを示すデータ（図２２の第１１列対第２１列）。興味深いことに、骨格筋内の１２−ＬＯｍＲＮＡレベルは、糖尿病になりやすいメスの肥満型ＺＤＦラットにおいてよりも高い。この図では、３１２ｂｐのバンドは、１２−ＬＯであるが、２８１ｂｐのバンドは、１２−ＬＯの競合剤である。このデータは、１２−ＬＯｍＲＮＡの真の競合ＰＣＲ分析を示している。出願者らは、１２−ＬＯの発現もまた、糖尿病の心臓組織内でより高いことを示唆するＺＤＦ心臓内のデータも、保持している。この仕事に加えて、二種類のＮＩＤＤＭモデルであるＺＤＦ（Ｚｕｃｋｅｒ糖尿病性肥満）ラットおよびＧＫ（ＧｏｔｏＫｙｏｔｏ）ラット内の１２−ＬＯＲＮＡおよびタンパク質の発現を、評価した。特異的定量的ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）アッセイは、１２−ＬＯｍＲＮＡの発現を測定するために用いられ、そして、抗１２−ＬＯペプチド抗体を用いたウエスタンブロッティングは、１２−ＬＯタンパク質の発現を評価するために用いられた。ＮＩＤＤＭのＧＫラットモデルは、年齢のあったＷｉｓｔａｒ対照と比較して血中グルコース濃度の増加を証明した（８．７±０．７対４．８±０．２ｍＭ、ｐ＜０．０１）。しかしながら、血漿インスリンおよび体重は、ＧＫラットとＷｉｓｔａｒラットの間で同様であった。１２−ＬＯｍＲＮＡの発現は、Ｗｉｓｔａｒラットと比較してＧＫラットからの心臓内で４倍多かった［０．４８±０．１ｘ１０⁵分子／μ ｇＲＮＡ（Ｗｉｓｔａｒ中）対１．９±０．４ｘ１０⁵（ＧＫ中），ｐ＜０．０２］。足底（ｓｏｌｅｕｓ）筋肉内の１２−ＬＯｍＲＮＡの発現は、Ｗｉｓｔａｒラットに対して、ＧＫラットでは５倍以上多かった（０．６±０．１Ｗｉｓｔａｒ対３．１±０．７６ＧＫ）。肥満型ＺＤＦラットでは、やせ型ＺＤＦ対照と比較して、血中グルコース濃度および体重の増加が証明された（それぞれ、５５８±７５対１７０±５ｍｇ／ｄｌ、および３９０±７対３４３±７ｇ）。１２−ＬＯｍＲＮＡを、糖尿病ＺＤＦラットおよびやせ型ＺＤＦラットの心臓、赤および白四頭筋内で分析した。１２−ＬＯｍＲＮＡの発現は、やせ型ＺＤＦ対照と比較して糖尿病の肥満型ＺＤＦラットにおいて４−７倍に増加した。１２−ＬＯタンパク質の発現も同様に、やせ型ＺＤＦ対照に対して糖尿病のＺＤＦの心臓組織で増加した（５倍）。これらのデータは、筋肉での１２−ＬＯの発現が、ＮＩＤＤＭではやせ型ラットモデルおよび肥満型ラットモデルの両方で、著しく増加することを表している。６．Ｌ₆筋細胞中の１２−ＨＥＴＥ濃度は、グルコースの存在下で増加するということを示すデータ。Ｌ₆筋細胞は、インスリン作用の機序を研究するのに用いられてきたラットからの骨格筋細胞である。Ｌ₆筋細胞をキシロース（５．５ｍＭ）中でインキュベートすると、それらは、標準グルコース（５．５ｍＭ）または高グルコース（２５ｍＭ）中の細胞と比較した場合、インスリンに対してはるかに反応性である。下記の表３は、標準グルコース（Ｒｇ）または高グルコース（ＨＧ）条件での培地中（ｐｇ／ｍｌ）または細胞中（ｐｇ／全細胞）のより高い１２−ＨＥＴＥ放出濃度を示す。したがって、１２−ＨＥＴＥなどの増加した１２−リポキシゲナーゼ産物は、高グルコースによって引き起こされる低下したインスリン代謝作用において重要な役割を果たすと考えられる。７．選択的１２−ＬＯ阻害剤バイカラインは、グルコースに誘導されたインスリン抵抗を妨げることができる。これらの実験を行うために、出願人らは、ヒトインスリン受容体を含有するように遺伝子操作されたラット−１−繊維芽細胞を高グルコース（２５ｍＭ）中で１０日間培養した。最後の２４時間は、細胞を１０^-6Ｍバイカラインと一緒に培養した。顕著なバンドは、ヒトインスリン受容体のリン酸化したβサブユニットを示す（図２３）。そのバンドが薄くなるにつれて、それは、低下したインスリン作用を示す。列１は、列５（２５ｍＭグルコース）での低下したインスリン作用に対して、標準グルコース（５．５ｍＭ）中のインスリン受容体リン酸化を示す。列６は、１２−ＬＯ経路がバイカラインで遮断された場合の２５ｍＭグルコース中のインスリン受容体リン酸化を示し、インスリン受容体リン酸化の回復を示している。この研究に加えて、出願人らは、１２−ＨＥＴＥが、インスリンに誘導された受容体リン酸化を直接的に阻害することを発見した。図２７で示されたように、インスリン受容体の９７ｋＤβサブユニットのリン酸化の明らかな増加は、インスリンが存在する場合に起こる。これは、列１（対照、非インスリン処置）に対して、列４（インスリン処置）での９７ｋＤのより濃いバンドによって示される。１２−ＨＥＴＥ（１０^-7Ｍ濃度）は、基礎インスリン受容体リン酸化を直接的に変化させなかった（列２）。対照的に、１２−ＨＥＴＥは、ヒトインスリン受容体のβサブユニットのインスリンに誘導された受容体リン酸化を顕著に減少させた。これは、列４（１２−ＨＥＴＥ無添加）に対して、列５（１０^-7Ｍ１２ −ＨＥＴＥ）での低下したバンド強度によって示される。インスリン受容体リン酸化は、インスリン作用の初期の重要な段階の一つであるので、これらの結果は、１２−ＬＯ経路の生産物が、低下したインスリン作用をもたらしうることを示唆する。このデータは、１２−ＬＯ経路の増加した発現または活性が、インスリン非依存型の糖尿病でのインスリン抵抗において重要な役割を果たしていると考えられる。８．低下したインスリン作用および血管病によってグルコース毒性の主要メディエイタであると考えられているグルコサミンは、平滑筋細胞での１２−ＬＯ産物生成を増加させるということを示すデータ。インスリン抵抗をもたらす場合のグルコサミンの役割は、最近、完全な動物で（バロン（Baron）ら，J.Clin.In vest.,96:2792-2801(1995)）および in vitro のインスリン反応性組織（例えば、筋肉−ロビンソン（Robinson）ら，Diabetes,42:1333-46(1993)；および脂肪 −マーシャル（Marshall）ら，J.Biol.Chem.,266:4706-4712(1991)）で実証された。更に、グルコサミンは、グルコースに誘導された血管病の主要メディエイタであると考えられる（ダニエルズ（Daniels）ら，Mol.Endocrinol.,7:1041-1048 (1993)）。特定の理論によって拘束されたくはないが、グルコサミンは、グルコースを輸送するインスリン能力に関連した主要グルコース輸送体Ｇｌｕｔ４の正常な作用を阻止することによって、インスリンに誘導されたグルコース吸収を減少させると考えられる。ブタ血管平滑筋細胞（ＰＶＳＭＣ）を、グルコサミン（７．５ｍＭ）の存在下で２４時間培養した。次に、新しい培地をグルコサミン（７．５ｍＭ）と一緒に加え、２５分間培養した。細胞および培養上清を集め、そしてＲＩＡを用いて１２−ＨＥＴＥを測定した。グルコサミン中で培養された細胞では、標準グルコース中のものと比較して、培地中への１２−ＨＥＴＥ放出の極めて大きな増加（グルコサミン中に放出された２０．６±３．６ｐｇ／ｍｌに対して、標準グルコース中の１２−ＨＥＴＥ放出６．４８±１．２ｐｇ／ｍｌ，ｎ＝４）が観察された。更に、細胞に含まれた１２−ＨＥＴＥは、グルコサミン処理された細胞中においてより高かった（グルコサミン中の１２２５±１１２ｐｇに対して、標準グルコースでインキュベートした場合には７３５．９±６７ｐｇ／細胞）。これらのデータは、１２−ＨＥＴＥなどの１２−ＬＯ産物が、インスリン抵抗をもたらす重要な因子でありうることを示唆する。９．高脂肪供給は、筋肉中での減少したインスリン作用および１２−ＬＯタンパク質発現の誘導を同時にもたらすということを示すデータ。用いられたマウスモデルは、Ｇｌｕｔ４輸送体を過発現するトランスジェニックマウスであった（ファイザー・ファーマソイティカルズ（Pfizer Pharmaceuticals））。図２８で分かるように、高脂肪供給は、明らかに、減少したグルコース寛容性をもたらし、それは、それら動物がインスリン抵抗であったという明らかな指標である。図２８ａは、脂肪供給されたマウスでの経口グルコース試験曲線上のあらゆる点で、対照の場合より高いグルコース濃度を示す。図２８ｂの棒グラフは、高脂肪供給群において、対照の場合より有意に大きいグルコース寛容曲線下面積を示す。高脂肪食での４匹の動物において、心筋での１２−ＬＯタンパク質発現を評価し、そして対照食での動物における濃度と比較した。１２−ＬＯタンパク質発現は、１２−ＬＯペプチド抗体およびウェスタン・ブロッティングを用いて測定された。そのデータの概要を以下の表４で示す。顕著な結果は、（ブロットのデンシトメーター分析を用いて）高脂肪食での動物において、はるかに高い濃度の１２−ＬＯタンパク質を示す。これら in vivo 結果は、増加した１２−ＬＯ発現または活性が、インスリン抵抗をもたらす場合に重要な役割を果たすことを示唆している。１０．高マグネシウム（Ｍｇ）供給は、１２−ＬＯ遺伝子発現および１２− ＨＥＴＥ濃度を減少させるということを示すデータ。Ｍｇ欠乏は、実験的およびヒトインスリン抵抗に関係していた。更に、増加した規定食Ｍｇは、ＺＤＦラットにおいてもヒトにおいても、減少した糖尿病発症に関係しており、そしてＭｇ添加は、ＮＩＤＤＭのヒトにおいてインスリン応答および作用を向上させることができる。現在、高Ｍｇ供給は、１２−ＬＯ遺伝子発現および１２−ＨＥＴＥ濃度を顕著に減少させることが判っている。高Ｍｇ食（１％Ｍｇ含有プリナ（Purina）５００８規定食）を、ＺＤＦ肥満（糖尿病性脂肪質）雄ラットの一つの群に与え、対照食（０．２％Ｍｇを加えたプリナ５００８）を別の群に与えた。表５で判るように、高Ｍｇ供給群は、ＲＩＡ（J.Clin.Endocrin.Metab.,67:584-591(1988)および J.Clin.Invest.,80:1763-1769(1987)で記載された方法）によって測定したところ、対照群より有意に低い尿中１２−ＨＥＴＥ濃度を有した。高Ｍｇ供給はまた、糖尿病ＺＤＦラットからの筋肉での１２−ＬＯｍＲＮＡ発現を減少させた。値は平均±ＳＥである。ｎはラット数である。ＺＤＦ痩せ型群および高マグネシウム食でのＺＤＦ肥満型群の値は、それぞれ^aｐ＜０．００１および^bｐ＜０．０５でＺＤＦ肥満型群とは異なる。１１．ヒトのデータは、ＮＩＤＤＭの人々において、増加した尿中１２−ＨＥＴＥ濃度を示す。１２−ＨＥＴＥ濃度は、タンパク尿の徴候を示した糖尿病患者において特に高い。これらの結果は、１２−ＬＯ活性化が、糖尿病の場合の腎疾患に関与しうることを示唆している。糖尿病の動物およびヒトからの血管組織は、正常とは異なってアラキドン酸を代謝する。ＰＧＩ₂は、血管拡張薬、抗血栓薬およびレニン分泌促進薬であるが、１２−ヒドロキシエイコサテトラエン酸（１２−ＨＥＴＥ）は、前炎症性であり且つシクロオキシゲナーゼ（ＣＯ）を阻害する。出願人らは、初めに、低レニン血症性低アルドステロン症（ＨＨ）の糖尿病患者でのプロスタサイクリン（ＰＧＩ₂）欠乏を報告した（４６）。出願人らは、ＣＯ産物、ＰＧＩ₂およびリポキシゲナーゼ（ＬＯ）産物、正常な腎機能（ＮＲ）を有するＮＩＤＤＭ患者での１２−ＨＥＴＥ、ミクロアルブミン尿症（ＭｉＡ）、マクロアルブミン尿症（ＭａＡ）およびＨＨ患者でのそれらの生産を調べた。ＰＧＩ₂（６ケトＰＧＦ₁）および１２−ＨＥＴＥは、ＨＰＬＣに続いて、公表された方法を用いるＲＩＡによって尿中で測定された。結果は、次の通りである。 ≠ 予め貯蔵された試料から採取 ^* 対照に対してｐ＜０．０１ ^** 糖尿病患者に対してｐ＜０．０５このデータは、（１）１２−ＬＯ産物１２−ＨＥＴＥの増加が、腎疾患と共に進行する全てのＮＩＤＤＭで見られる；（２）アルブミン尿症を伴う糖尿病性腎疾患は、ＰＧＩ₂生産の抑制に関係している；および（３）ＨＨは、ＰＧＩ₂抑制および１２−ＨＥＴＥ過剰の障害であるということを示唆している。出願人の更に別の実験は、様々な程度の糖尿病性腎関与がある患者でのＰＧＩ₂ および１２−ＨＥＴＥ両方の尿中（腎血管）生産を測定した。クレアチニンクリアランスおよび尿中アルブミン測定値に基づく正常な腎機能を有するＮＩＤＤＭ患者の群において、ＰＧＩ₂排出は、正常な対照と異なっていなかった。ミクロアルブミン尿症の群は、高血圧および正常血圧を有するものに分けられた。しかしながら、ＰＧＩ₂排出の差は認められなかった。それにもかかわらず、ミクロアルブミン尿症群は、有意により低いＰＧＩ₂排出速度を有した。マクロアルブミン尿症および低下したクレアチニンクリアランスを有する患者は、同様に、ＰＧＩ₂排出を減少させた。ＰＧＩ₂排出速度は、マクロアルブミン尿症およびＨＨ群において低下した。１２−ＨＥＴＥ値は、正常な対照と比較して、ミクロアルブミン尿症のあるまたはないＮＩＤＤＭ患者において顕著に増加した。１２−ＨＥＴＥ排出値はまた、マクロアルブミン尿症群でもＨＨ群でも有意に増加した。低用量カルシウム注入は、従来、ＰＧＩ₂を、おそらくは組織ホスホリパーゼの活性化によって増加させることが示されている。グルコン酸カルシウムの３時間注入を正常対象に投与した場合、ＰＧＩ₂および１２−ＨＥＴＥが両方とも極めて有意に増加した。しかしながら、ミクロアルブミン尿症のあるＮＩＤＤＭ患者に投与した場合、ＰＧＩ₂の増加はなかったが、既に増加した１２−ＨＥＴＥ値が更に刺激された。これは、ＮＩＤＤＭではプロスタサイクリン形成に欠陥があるという概念を支持する。１２−ＨＥＴＥ／ＰＧＩ₂比率は、ＮＩＤＤＭの場合に、ＬＯ／ＣＯ経路の変化が存在するかどうかを確認するための更に別のアプローチとして計算された。図２４で示されたように、全ての糖尿病群においてＨＥＴＥ／ＰＧＩ₂比率に大きな変化が存在する。平均値は、正常な腎機能を有するＮＩＤＤＭ患者において有意に増加し、そしてマクロアルブミン尿症のある患者およびＨＨ患者では更に変化する。しかしながら、これらの違いは、各群内の変動のために、ＮＩＤＤＭ群間では有意の差がなかった。出願人らデータは、混乱したエイコサノイド排出値の原因として、腎機能自体、ＧＦＲまたは高血圧を除外すると考えられる。尿中のＰＧＩ₂および１２−ＨＥＴＥの由来は充分に確定されていないが、腎外ＣＯ阻害剤並びに全身注射後の微量のＰＧＩ₂および１２／１５−ＨＥＴＥの排出の不足を用いる実験は、腎臓が尿中のこれら化合物の主要源であることを示唆する（４７〜４９）。ＨＥＴＥは、血管組織中でも炎症細胞からも生じることができる。（５０〜５１）。しかしながら、初期の糸球体および血管病を有するＮＩＤＤＭでは、腎臓中へのマクロファージ／白血球浸潤の徴候がない。初めの方で引用された in vitro および動物モデル実験に一致して、出願人ら結果は、真性糖尿病の初期には、糖尿病性腎血管／糸球体病と共に低い値になる一定のプロスタサイクリン生産が存在することを示唆する。これは、ＬＯ産物１２−ＨＥＴＥが、ミクロアルブミン尿症の発症前の真性糖尿病の初期に増加する状況で起こる。これらの知見は、ＨＥＴＥが、分裂促進性前炎症性、血管収縮性であり、しかも血管形成を刺激するので、糖尿病性血管病の病因においてかなり重要でありうる（５２〜５３）。ＨＨ症候群に関して、出願人ら新規データは、増加したＨＥＴＥ生産が、ＰＧＩ₂形成並びにレニン生合成および分泌を抑制する場合の初期の異常でありうることを示唆する。血管病を説明する糖尿病の病因は知られていない。しかしながら、最近の研究は、高血糖自体が、プロテインキナーゼＣによって増加したエイコサノイド生成、およびＡＡ放出の主メディエイタであるカルシウム依存性ホスホリパーゼの活性化を含めた多数の代謝結果を有することを示唆している。要約すると、原因であれ作用であれ、糖尿病での極めて初期の腎関与が、血管毒性リポキシゲナーゼ産物１２−ＨＥＴＥの増加と共に、一定のまたは抑制されたプロスタサイクリン生産に関係している。この結論は、ここで、in vitro 実験でもヒトでの in vivo 実験でも示唆される。これは、この混乱を阻止するための糖尿病状態の初期の薬理学的介入を示唆する。ヒト大動脈内皮細胞に対するグルコースに誘導された単球結合における１２−リポキシゲナーゼ産物の役割アテローム性動脈硬化症の速度は、真性糖尿病（ＤＭ）のヒトにおいて促進される。出願人らは、最近、ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）の高グルコース（ＨＧ）暴露が、単球（ＭＯ）結合を選択的に増加させるが、好中球結合は増加させないことを公表した（５６）。ＥＣに対するＨＧ暴露は、アラキドン酸（ＡＡ）放出およびリポキシゲナーゼ（ＬＯ）生産形成を増加させることができる。最近の研究において、出願人らは、ＨＡＥＣに対するＭＯ結合における１２−および１５−ＬＯ産物の役割を評価した。２継代のＨＡＥＣのＨＧ（２５ｍＭ）中の培養物は、５．５ｍＭグルコース中で維持された細胞と比較して、ＭＯ結合を増加させた（細胞１１１±７個に対して、２３９±３０個／ＨＧ場、ｐ＜０．０５）。１２−ＬＯ経路の阻害剤フェニドン（１０^-6Ｍ）（ＨＧに誘導された結合の５０％阻害、ｐ＜０．０５）。ＨＡＥＣのＨＧ培養物は、出願人らＨＰＬＣおよびＲＩＡ法を用いると、１２−および１５−ヒドロキシエイコサトリエン酸（ＨＥＴＥ）Ｌ）両方を有意に増加させた。５．５ｍＭグルコース中で培養されたＨＡＥＣに対して加えられた１２（Ｓ）−ＨＥＴＥは、ＭＯ結合を増加させた（細胞１１４±４個１０^-10Ｍ１２−ＨＥＴＥに対して、６６±６個／場対照、ｐ＜０．０１）。もう一つの新規な１２−ＬＯ産物１２（Ｒ）−ヒドロキシエイコサトリエン酸は一層強力であり、１０^-11および１０^-12ＭでＭＯ結合に対する作用を示した。対照的に、１０^-6〜１０^-12Ｍの範囲の濃度で加えられた１５（Ｓ）− ＨＥＴＥは、ＨＡＥＣに対するＭＯ結合を刺激しなかった。要約すると、（１）高グルコースはＨＡＥＣに対するＭＯ結合を増加させ、そしてこの作用は、ＬＯ経路の遮断によって減少することができ；（２）１５ではなく１２−ＬＯ産物がＭＯ結合を増加させることができる。白血球型１２−ＬＯは、ＨＡＥＣで発現されるので、これらの結果は、ヒト内皮に対するグルコースに誘導されたＭＯ結合における１２−ＬＯ活性の役割を支持する。出願人らはまた、高脂肪「カフェテリア」食が、ラット心臓において白血球１２−ＬＯを増加させることおよび糖尿病（ＧＫ）ラットが正常（ウィスター（Wi star）動物と比較して、より高い心臓中１２−ＬＯを有することを実証した（図２５および２６を参照されたい）。診断検定ＰＣＴ出願／ＵＳ 94/00089 は、ｈｌ１２−ＬＯまたはＨＥＴＥ若しくは１２−ＨＰＥＴＥなどのその経路産物が病因物質である疾患状態を発症する危険がある患者において、抗体が循環するであろうということを報告する。したがって、本発明のもう一つの態様は、ｈｌ１２−ＬＯタンパク質またはＨＥＴＥなどの関連物質を免疫原として用いる、例えばＥＬＩＳＡ型の検定を包含する。このような試験は、ｈｌ１２−ＬＯの活性化または発現によって媒介されたいずれの疾患状態をも診断するのに有用である。文献一覧１． Geisterfer，A.A.，et al.，Circ ．Res.（1988）62:749-756．２． Izumi，T.，et al.，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA（1990）87:7477-7481 ．３． Gu，J.，et al.，Endocrinology（1994）143:70-77．４． Samuelsson，B.，Science（1987）237:1171-1176．５． Sparrow，C.P.，et al.，J ．Lipid Res.（1988）29:745-753．６． Steinberg，D.，New Eng ．J．Med.（1989）320:915-924．７． Berk，B.C.，Hypertension（1989）13:305-314．８． Schwartz，S.M.，Physiol ．Rev.（1990）70:1177-1209．９． Nakao，J.，et 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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 31/00 ６３５Ａ６１Ｋ 31/00 ６３５Ｂ６３７６３７ 31/045 31/045 31/155 31/155 31/20 ６０１ 31/20 ６０１６０２６０２ 33/06 33/06 38/00 45/00 38/46 48/00 45/00 Ｃ１２Ｎ 9/99 48/00 Ｇ０１Ｎ 33/573 ＡＣ１２Ｎ 9/99 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｇ０１Ｎ 33/573 37/54

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒト組織から単離され且つ精製されたヒト１２−リポキシゲナーゼであって、ヒト血小板中で見出されるものとは異なる且つヒト１５−リポキシゲナーゼとは異なる上記単離され且つ精製されたヒト１２−リポキシゲナーゼ。２．前記１２−リポキシゲナーゼが、ヒト血管平滑筋細胞、副腎細胞、内皮細胞または単球に由来する請求項１に記載の単離され且つ精製されたヒト１２− リポキシゲナーゼ。３．請求項１〜２に記載の１２−リポキシゲナーゼまたは１２−ＨＥＴＥが病因物質である患者の疾患状態を診断する方法であって、（ｉ）該患者から生理学的検体を入手し；そして（ii）該病因物質または該病因物質に対する抗体が該検体中に存在しているかどうかを確認することを含む上記方法。４．前記疾患状態が、炎症若しくは自己免疫症状、アテローム性動脈硬化症、癌増殖、癌転移、インスリン非依存型糖尿病での機能障害性インスリン分泌、グルコース誘導酸化性ストレスまたは終末器官機能障害若しくは損傷の発生である請求項３に記載の方法。５．前記疾患状態が、アテローム性動脈硬化血管病、ヒト乳癌またはII型糖尿病である請求項４に記載の方法。６．ｈｌ１２−リポキシゲナーゼまたは１２−ＨＥＴＥが病因物質である疾患状態に苦しむ患者を治療する方法であって、該ヒト患者に対して、該ｈｌ１２−リポキシゲナーゼの発現を遅らせるまたは阻害する有効量のｈｌ１２− リポキシゲナーゼ阻害剤を投与することを含む上記方法。７．前記疾患状態が、II型糖尿病または乳癌である請求項６に記載の方法。８．前記疾患状態が、インスリン非依存型真性糖尿病であり、そしてヒト１２−リポキシゲナーゼ阻害剤を、筋肉内でグルコース輸送を誘導するインスリンの能力およびランゲルハンス島でのインスリンの分泌を増加させる治療的有効量で投与する請求項６に記載の方法。９．前記阻害剤が、ＮＤＧＡ、ＣＤＣ、パナキシノール（panaxynol）、ビアカライン（biacalein）、ピオグリタゾン（pioglitazone）、アミノグアニジン（aminoguanidine）、またはｈｌ１２−リポキシゲナーゼｍＲＮＡを切断するリボザイムである請求項６に記載の方法。１０．ヒト患者での血管内皮成長因子生産を阻害するまたは減少させる方法であって、該患者に対して、ｈｌ１２−リポキシゲナーゼの発現を遅らせるまたは阻害する有効量のｈｌ１２−リポキシゲナーゼ阻害剤を投与することを含む上記方法。１１．サイトカインに媒介された自己免疫性疾患、炎症性疾患またはアテローム性動脈硬化疾患に苦しむヒト患者の治療方法であって、該患者に対して、ヒト血管平滑筋に対する該サイトカインの作用を媒介する治療的有効量のヒト１２− リポキシゲナーゼ阻害剤を投与することを含む上記方法。１２．前記サイトカインが、インターロイキン１、インターロイキン４またはインターロイキン８である請求項１１に記載の方法。１３．ヒト内皮細胞に対して結合する単球を減少させる方法であって、それを必要としている患者に対して、治療的有効量のヒト１２−リポキシゲナーゼ阻害剤を投与することを含む上記方法。１４．前記阻害剤が、ＮＤＧＡ、ＣＤＣ、パナキシノール、バイカライン（ba icalein）、ピオグリタゾン、アミノグアニジン、またはｈｌ１２−リポキシゲナーゼｍＲＮＡを切断するリボザイムである請求項１０、１１、１２または１３に記載の方法。１５．炎症性疾患および自己免疫性疾患、アテローム性動脈硬化症、癌増殖および転移に関係したシグナル伝達経路を活性化する脂質メディエイタを発生させる方法であって、該脂質メディエイタが、ヒドロペルオキシド、キナーゼ、マイトジェン活性化キナーゼ、転写因子および癌遺伝子であり、それを必要としている哺乳動物に対して、治療的有効量のアラキドン酸またはリノール酸を投与することを含み、ここにおいて、前記ヒト１２−リポキシゲナーゼが該酸を用いてこのような脂質メディエイタを発生させる上記方法。１６．前記脂質メディエイタが、ヒドロペルオキシド、マイトジェン活性化キナーゼまたはＮＦｋＢである請求項１５に記載の方法。１７．ヒト１２−リポキシゲナーゼの活性および発現を増加させる方法であって、ヒト患者に対して、治療的有効量の炎症性サイトカイン、成長因子またはアンギオテンシンIIを投与することを含む上記方法。１８．前記炎症性サイトカインがインターロイキン−１である請求項１７に記載の方法。１９．前記成長因子が血小板由来成長因子である請求項１７に記載の方法。２０．ヒト大動脈平滑筋細胞での１２−リポキシゲナーゼｍＲＮＡおよびタンパク質の活性および発現を増加させる方法であって、該活性および発現を増加させる有効量のアンギオテンシンIIを用いる該細胞の処置を含む上記方法。２１．アンギオテンシンIIに関係した心臓血管病の減少方法であって、それを必要としているヒト患者に対して、ヒト１２−ＬＯ経路を遮断するのに有効な薬物の治療的有効量を投与することを含む上記方法。２２．ヒト患者の乳癌組織の増殖を阻害する方法であって、該患者に対して、ヒト１２−ＬＯ発現または活性化を阻害する薬物の治療的有効量を投与することを含む上記方法。２３．前記ヒト１２−リポキシゲナーゼ阻害剤が、ＮＤＧＡ、ＣＤＣ、パナキシノール、バイカライン、ピオグリタゾン、アミノグアニジン、またはｈｌ１２−リポキシゲナーゼｍＲＮＡを切断するリボザイムである請求項２２に記載の方法。２４．乳癌細胞増殖および発生が、自然発生的（basal）、表皮成長因子に誘導されるまたはエストロゲンに誘導される請求項２２に記載の方法。２５．乳癌細胞増殖および発生に介在する方法であって、それを必要としている患者に対して、治療的有効量のヒト１２−リポキシゲナーゼ経路阻害剤を投与することを含む上記方法。２６．前記ヒト１２−リポキシゲナーゼ阻害剤が、ＮＤＧＡ、ＣＤＣ、パナキシノール、バイカライン、ピオグリタゾン、アミノグアニジン、またはｈｌ１２−リポキシゲナーゼｍＲＮＡを切断するリボザイムである請求項２５に記載の方法。２７．乳癌細胞増殖および発生が、自然発生的、表皮成長因子に誘導されるまたはエストロゲンに誘導される請求項２５に記載の方法。２８．アテローム性動脈硬化症で見られるサイトカインに誘導された血管平滑筋細胞移動および増殖を監視する方法であって、サイトカインでの処置で該細胞によるヒト１２−リポキシゲナーゼｍＲＮＡまたはタンパク質発現の変化を測定することを含み、ここにおいて、該発現の増加が該細胞移動および増殖を示す上記方法。２９．１２−ＨＥＴＥが病因物質である疾患状態を有する患者を治療する方法であって、該患者のマイトジェン活性を低下させることを含む上記方法。３０．マイトジェン活性の低下が、前記患者でのＥＲＫ、ＪＡＫおよび／またはＪＮＫ活性を低下させることに起因する請求項２９に記載の方法。３１．ＪＮＫ活性が、ＰＡＫ活性を低下させることによって低下する請求項３０に記載の方法。３２．マイトジェン活性が、患者に対してマイトジェン活性を低下させるのに充分な治療的有効量の１２−ＬＯ阻害剤を投与することによって低下する請求項２９に記載の方法。３３．疾患状態が、II型糖尿病または乳癌である請求項２９に記載の方法。３４．ＶＥＧＦが病因物質である疾患状態を有する患者を治療する方法であって、該患者のＶＥＧＦの量を減少させることを含む上記方法。３５．疾患状態が、増殖性糖尿病網膜症または糖尿病に関係した進行性血管病である請求項３４に記載の方法。３６．ＶＥＧＦの量が、患者に対して患者のＶＥＧＦを減少させるのに充分な治療的有効量の１２−ＬＯ阻害剤を投与することによって減少する請求項３４に記載の方法。３７．II型糖尿病を有する患者でのインスリン受容体リン酸化を増加させる方法であって、該患者に対して、インスリン受容体リン酸化を阻害することから１２−ＬＯ経路産物を阻害するのに充分な治療的有効量の１２−ＬＯ阻害剤を投与することを含む上記方法。３８．患者の１２−ＬＯ遺伝子発現および１２−ＨＥＴＥ濃度を減少させる方法であって、該患者に対して治療的有効量のＭｇを投与することを含む上記方法。