JPH11511005A - レトロウイルスベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 遺伝子治療に有用なレトロウイルスベクターが開示される。ベクターのパッケージ可能なＲＮＡゲノムはＤＮＡプロウイルス中に、調節因子、例えばＨＩＶ転写活性化タンパク質Ｔａｔによって誘導できる調節されたプロモーターと、その転写制御下にある少なくとも１つの選択された遺伝子とを付与する。ＤＮＡプロウイルス中に、制御されたプロモーターは５’末端反復配列（ＬＴＲ）中にレトロウイルスの５’ＬＴＲプロモーター機能の代わりに存在し、選択された遺伝子はＬＴＲｓの間に位置する。従って、宿主細胞中に挿入された場合、遺伝子はＤＮＡプロウイルスが調節因子に露出する場合にのみ発現するであろう。

Description

【発明の詳細な説明】 レトロウイルスベクター 本発明はレトロウイルスベクターと、レトロウイルスベクターのＲＮＡゲノム をコードするＤＮＡ構築体とに関する。特に、本発明は例えばＨＩＶのようなレ トロウイルス感染症の治療又は予防の遺伝子療法のためのレトロウイルスベクタ ーに関する。 熱心な研究努力にも拘わらず、ＨＩＶ感染症及びＡＩＤＳの治療法としての低 分子量化合物の開発における成功は限定されている。同様に、近い将来において 保護又は治療用ワクチンが開発されるようには思われない。この状況は、生物学 的治療法にさらに大きく重点を置くべきであるという最近の提案を生じており（ Ｌｅｈｒｍａｎ、１９９４）、ＨＩＶ−１感染の臨床アプローチとしての遺伝子 療法の見通しに現在非常に関心がもたれている。リボザイム、トランス−ドミナ ントタンパク質(trans-dominant protein)、ｓｃＦｖ分子、アンチセンス構築体 及びＴＡＲとＲＲＥデコイ（Ｙｕ等、１９９４に概要）を包含する、幾つかの分 子が抗ＨＩＶ治療法として提案されている。これらの分子は既に感染した細胞に 対する療法と、未感染細胞における保護“細胞内免疫感作”（Ｂａｌｔｉｍｏｒ ｅ、１９８８）との両方として作用すると考えられる。さらに、毒素（自殺遺伝 子(suicide gene)）又は免疫学的マーカーの使用も感染細胞を殺して、患者にお けるウイルス負担(viral load)を軽減する手段として提案されている。 これらの分子の多くに関して、発現が調節可能であることが望ましい。これは 明らかに自殺遺伝子の場合であるが、治療タンパク質の構成的発現も、幾らかの 細胞障害性を惹起するか又は宿主免疫反応を招来する可能性があるという点で望 ましくないと考えられる。さらに、インターフェロン反応の不適当な誘導を含め て、有害な副作用も細胞内のＲＮＡ分子の発現から起こりうる。ＨＩＶの場合に は、ウイルスＬＴＲプロモーター自体が誘導プロモーターである特徴を有して、 ウイルスコード化(virally encoded)Ｔａｔトランス作用因子タンパク質の不存 在下で低い基底転写レベルを誘導する（Ａｒｙａ等、１９８５）。Ｔａｔ誘導性 はＬＴＲのＵ３領域における配列及びＲ領域のＴＡＲ配列の性質である（Ｂｅｒ ｋｈｏｕｔとＪｅａｎｇ、１９９２）。それ故、ＨＩＶ ＬＴＲが治療遺伝子の 発現を誘導しうることは、その発現をＨＩＶによって感染された細胞に限定する と考えられる。幾つかのグループがＬＴＲのこの性質の利用方法の探求を開始し ており、ＨＩＶ感染時の遺伝子の誘導発現を実証している（Ｃａｒｕｓｏ等，１ ９９２、Ｂｒａｄｙ等，１９９４）。 ＭＬＶに基づくレトロウイルスベクターによってＴａｔ誘導治療遺伝子（ＴＩ ＴＧ）を送達するための現在の方法は、ＴＩＴＧをベクターの内部に入れること である。レトロウイルスＬＴＲ転写単位内に第２プロモーターを配置する（セン ス方向又はアンチセンス方向）ことの主要な欠点は、遺伝子発現の減少を生じる 可能性があることである（Ｋａｄｅｓｃｈ等，１９８６、Ｗｉｌｌｉａｍｓ等， １９８６、Ｍｃｌｖｏｒ等，１９８７、Ｂｏｗｔｅｌｌ等，１９８８）。活性プ ロモータから下流に配置されたときにプロモーターの活性がしばしば低下し（Ｃ ｕｌｌｅｎ等，１９８４、ＥｍｅｒｍａｎとＴｅｍｉｎ，１９８４、Ｅｍｅｒｍ ａｎとＴｅｍｉｎ，１９８６、Ｏｖｅｒｅｌｌ等，１９８８）、内部プロモータ ーはベクターＬＴＲ駆動遺伝子(LTR driven gene)を選択しない場合にも長期間 培養において不安定でありうることが判明しているので（Ｘｕ等，１９８９、Ｌ ｉ等，１９９２）、このことは驚くべきことではない。さらに、内部に配置され た遺伝子の発現が例えばＨＩＶ ＬＴＲのような調節されたプロモーターの制御 下にある場合には、上流レトロウイルスプロモーターからの転写読み通し(readt hrough)も問題になりうる。 ５’ベクタープロモーターからの読み通し又は干渉を防止するために幾つかの 方法が開発されている。読み通しによる望ましくない発現を防止するための最も 簡単なオプションはＴＩＴＧをベクターＬＴＲに対して逆方向に配置させること である（Ｂｒａｄｙ等，１９９４、Ｌｉｅｍ等，１９９３）。しかし、この形態 (configuration)は形質導入又は発現のレベルを低下させる可能性があり（Ｓｔ ｕｈｌｍａｎ等，１９８９、Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ等，１９９１）、ベクターＬＴ Ｒに由来するアンチセンス転写体による遺伝子発現を抑制すると考えられる。 他の可能性は、自己−不活化（ＳＩＮ）ベクターを用いることである（Ｙｕ等 ，１９８６）。この場合に、ベクタープラスミド中の３’Ｕ３配列の一部が欠失 し て、形質導入されたベクター中に非機能性プロモーターを生じる。残念ながら、 これらのベクターは低い力価のパッケージされたベクターを生じ（Ｈａｎｔｚｏ ｐｏｕｌｏｓ等，１９８９）、このようなベクターは現在の遺伝子療法用途に受 容されない。 第３方法は、形質導入後に遺伝子とプロモーターが両ＬＴＲに２重コピーで存 在するように（ＤＣベクター）、プロモーター−遺伝子カセットを３’ベクター ＬＴＲのＵ３領域にクローン化することである（Ｈａｎｔｚｏｐｏｕｌｏｓ等， １９８９）。上流単位からの転写はレトロウイルスプロモーターからの干渉をあ まり受けない。しかし、この形態はベクターの３’末端と５’末端とにおけるプ ロモーター−遺伝子カセットの存在を必然的に生じ、この場合にこれは残留５’ ベクターＬＴＲと内部構成プロモーターとの両方からの読み通し発現をまだ受け やすい。Ｕ３領域にプロモーターと遺伝子との両方を含めることは、ＬＴＲのサ イズの伸長が安定性の低下に関連するので、不安定性の問題をも招来する可能性 がある（Ｒｈｏｄｅ等，１９８７）。 それ故、レトロウイルス調節タンパク質−誘導プロモーターの転写制御下で宿 主細胞に遺伝子を導入することができる、新規で、より効果的なレトロウイルス ベクターが明らかに必要である。特に、ウイルス力価、即ち、パッケージされた ベクターの力価を低下させずにＴＩＴＧの排他的な５’配置を可能にする、例え ばＭＬＶに基づくベクターである、このようなベクターが必要である。さらに、 形態が遺伝子の、例えばＴａｔ依存性のような、その後の調節タンパク質依存性 の発現に有意に干渉すべきではない。さらに、１例としてのＭＬＶに特に関して は、ＭＬＶゲノムの５’末端における例えばＨＩＶプロモーターのような誘導プ ロモーターの導入は、ウイルスゲノムのシス作用性配列に依存する、ＭＬＶライ フサイクルの下記プロセスに有意に干渉してはならない： １．ＭＬＶレトロウイルスコアによるベクターゲノムのパッケージング； ２．ＭＬＶ逆転写酵素（ＲＶ）によるＲＮＡゲノムの逆転写； ３．ＭＬＶインテグラーゼ（ＩＮ）によるゲノムのＤＮＡコピーの組込み。 それ故、本発明は１態様において、ＤＮＡプロウイルスの形状であるときに宿 主細胞ゲノム中に挿入されることができ、ＤＮＡプロウイルス中に、 （ａ）調節因子によって誘導可能である調節されたプロモーターと、 （ｂ）（ａ）におけるプロモーターの転写制御下にある選択された遺伝子（単数 又は複数）と を与える配列を含むパッケージ可能なＲＮＡゲノムを含む、第１レトロウイルス に基づくレトロウイルスベクターであって、第１レトロウイルスの５’ＬＴＲプ ロモーター機能の代わりに、調節されたプロモーター（ａ）がプロウイルスの５ ’末端反復配列（ＬＴＲ）中に存在し、選択された遺伝子（単数又は複数）（ｂ ）がＬＴＲの間に配置されている上記レトロウイルスベクターを提供する。 他の態様では、本発明は、プロモーターの制御下において、本明細書に述べる レトロウイルスベクターのパッケージ可能なＲＮＡゲノムをコードするＤＮＡ構 築体を提供する。このＤＮＡ構築体において、選択された遺伝子（単数又は複数 ）は存在することも存在しないことも可能であるが、存在しない場合にも構築体 は選択された遺伝子（単数又は複数）をそれに挿入することができる挿入部位を 有する。 他の態様では、本発明は、本明細書に述べるようなＤＮＡ構築体によってトラ ンスフェクトされたパッケージング細胞ラインを含み、本明細書に述べるような レトロウイルスベクターを産生することができるレトロウイルスベクター産生系 を提供する。 さらに他の態様では、本発明は、本明細書に述べるようなレトロウイルスベク ターの遺伝子療法のための使用と、このような療法に由来する感染又は形質導入 されたターゲット細胞を提供する。 第１レトロウイルスはＭＬＶであることができる、ＭＬＶは最も広範囲に用い られているレトロウイルスベクター系であり、ヒト遺伝子療法用途に用いられて いる。しかし、この代わりに、他のレトロウイルスも用いることができ、この例 はＡＳＬＶ、ＳＮＶ及びＲＳＶを包含し、これらのレトロウイルスの全てがレト ロウイルスベクター産生系のためにパッケージング成分とベクター成分とに分割 されている。 明らかであるように、ベクターとして機能するためには、本発明によるレトロ ウイルスベクターは逆転写系（相容性の逆転写酵素とプライマー結合部位）と組 込み系（相容性のインテグラーゼと組込み部位）とを有して、プロウイルスへの 転換と、宿主細胞ゲノム中への二本鎖ＤＮＡの組込みとを可能にする必要がある 。さらに、ベクターゲノムはパッケージングシグナルを含有する必要がある。こ れらの系とシグナルとは以下でさらに詳細に説明するが、一般にベクターが基づ く第１レトロウイルスによって与えられる。本発明によるベクターは特定の第１ レトロウイルスに基づくが、これが遺伝的に又は他の方法で（例えば、パッケー ジング細胞系の特定の選択によって）変化した形(version)のレトロウイルスで あることができることも明らかである。例えば、第１レトロウイルスゲノムがパ ッケージされ、逆転写を受け、融合する(integrate)ことができるために必要で ない、第１レトロウイルスゲノムの部分は、排除することができる。また、例え ば異なるｅｎｖ遺伝子を使用することによってベクターを変化させて、ベクター の宿主範囲および感染又は形質導入される細胞種類を変化させることができる。 調節されたプロモーターはある一定の条件下においてのみ選択された遺伝子（ 単数又は複数）の発現を可能にする。本明細書に述べる好ましい実施態様では、 調節プロモーターは第２レトロウイルスからの調節タンパク質によって誘導可能 である。しかし、原則として、ある一定条件下でのみ活性である如何なる発現制 御要素も本発明によるベクターにおいて使用されて、このベクターによってコー ドされる遺伝子（単数又は複数）の条件付き発現を可能にすることは明らかであ る。このことは例えば遺伝子産物の特定細胞種類へのターゲッティングに有用で あると考えられる。核因子(nuclear factor)κＢエンハンサーはＴ細胞活性化に 応答するので、活性化Ｔ細胞をターゲットするのに用いることができる。遺伝子 の重金属誘導は、メタロチオネインプロモーターの成分を使用することによって 達成されることができる。ステロイドホルモンによる発現制御はもう１つの有用 なアプローチである。 既に考察した第２ウイルスは、調節された遺伝子応答を与えられることが望ま しくかつ誘導プロモーターに作用する、ＨＩＶ又は他の任意のレトロウイルスで あることができる。例はＭＭＴＶとＨＴＬＶ−１である。ＨＩＶ−１とＨＩＶ− ２とが明らかに重要な候補である。 プロモーター活性を誘導する調節因子は、第２レトロウイルスによって産生さ れ、プロウイルスＤＮＡ上の部位を介しての遺伝子発現を調節することができる 任意のタンパク質であることができる。ＨＩＶに関して、これはＴａｔであるこ とが好ましいが、この代わりに、例えばＲｅｖタンパク質であることができる。 ＴａｔはＲのＴＡＲ領域に作用するが、適当に機能するためにはＵ３領域の配列 をも必要とする。Ｕ３とＲの両方のある一定の区分は、効果的なＴａｔ応答要素 をなお残しながら、除去することができる。ＨＩＶ−２ Ｕ３における欠失は低 い基底転写レベルを有するプロモーターを生じるが、これらのプロモーターはま だ依然としてＴａｔに応答性である（Ｂｒａｄｙ等，１９９０）。したがって、 ＨＩＶが第２レトロウイルスである調節タンパク質誘導プロモーターは好ましく はＨＩＶからのＵ３とＲの両方の機能性部分である。或いは、ＨＩＶ Ｔａｔタ ンパク質に応答する、他のレトロウイルスからのある一定のＵ３及び／又はＲ配 列又はそれらの部分（例えば、ＨＩＶからのＲに結合したＲＳＶからのＵ３）が 使用可能である。また、ＨＩＶ−２からのＵ３は第２レトロウイルスとしてＨＩ Ｖ−１と共に機能する。 調節されたプロモーターの制御下の選択された遺伝子は、特定の目的を果たす 遺伝子産物をコードする、例えば、これは検出可能な産物を生成することによっ てマーカーとして作用するか又は好ましくは、これはその産物が感染若しくは疾 患に対して、特に例えばＨＩＶのような第２レトロウイルスによる感染に対して 有効である治療遺伝子である。治療遺伝子は、例えばアンチセンスＲＮＡ、リボ ザイム、ターゲットタンパク質のトランスドミナント陰性(transdominant negat ive)突然変異体、毒素、条件付き毒素、抗体又はヘルパーＴ細胞又は細胞傷害性 Ｔ細胞を誘導する抗原、一本鎖抗体又は腫瘍サプレッサータンパク質をコードす ることができる。 ２個以上の遺伝子が存在し、調節されたプロモーターの転写制御下にある場合 には、例えばピコルナウイルスＲＮＡからの内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ ）が存在して、両遺伝子が単一転写体から翻訳されることを可能にする。ＩＲＥ Ｓ配列を組込むレトロウイルスは他人によって構築されている。 第２遺伝子又はさらなる遺伝子も別のプロモーターの制御下で存在することが できる。この遺伝子は例えば選択可能なマーカー又は、上記治療剤群に含まれる 他の治療剤をコードすることができる。この遺伝子の発現は構成的であることが でき；選択可能なマーカーである場合には、これはトランスフェクトが成功した (successfully transfected)パッケージング細胞、又は特に高い力価のレトロウ イルスベクターを産生しているパッケージング細胞を選択するために有用であり うる。或いは又はさらに、選択可能なマーカーは、レトロウイルスベクターによ る感染が成功し、それら自身のゲノムに組込まれたプロウイルスを有する細胞を 選択するために有用でありうる。遺伝子療法をおこなう１つの方法は、患者から 細胞を抽出し、抽出した細胞をレトロウイルスベクターによって感染させて、こ れらの細胞を患者に戻して再導入することである。患者に細胞を再導入する前に 、感染若しくは形質導入された細胞を豊富にする手段、又は感染若しくは形質導 入されたような細胞のみを陽性として選択する手段を提供するために、選択可能 なマーカーを用いることができる。この手段は療法の成功の機会を高めることが できる。選択可能なマーカーは例えば薬物耐性遺伝子、代謝酵素遺伝子、又は当 分野で既知の任意の他の選択可能なマーカーであることができる。 １より多くの調節された遺伝子の他に１より多くの構成的に発現された遺伝子 が存在しうることは理解されるであろう。 しかし、レトロウイルスベクターの多くの遺伝子療法用途に関して、マーカー 遺伝子の発現の選択が実現可能でも必然的でもないことは明らかであろう。実際 に、選択マーカーの発現が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究に便利であっても、ｉｎ ｖ ｉｖｏでは、外来マーカータンパク質に対して向けられる細胞傷害性Ｔリンパ球 （ＣＴＲ）の不適当な誘導のために有害でありうる。また、ｉｎ ｖｉｖｏ用途 に対しては、内部プロモーターを有さないベクターが好ましいと考えられる。内 部プロモーターの存在は例えば、パッケージング細胞ラインから得られる形質導 入力価と組込まれたベクターの安定性とに影響を与える可能性がある。したがっ て、二シストロン性(bicistronic)又は多シストロン性(polycistronic)であるこ とができ、１つ又は２つ以上の抗ＨＩＶ遺伝子をコードする単一転写単位ＴＩＮ ベクターが、ｉｎ ｖｉｖｏで用いるために好ましいベクター設計であると考え られる。 パッケージ可能なＲＮＡゲノムをコードする、本発明によるＤＮＡ構築体は好 ましくは、第１又は第２レトロウイルス以外のソースから生じるプロモーターを 含む。産生体細胞ライン(producer cell line)においてベクターＲＮＡの高レベ ルの発現を生じる、例えばＣＭＶプロモーターのような、強力なプロモーターが 特に好ましい。 次に、本発明を添付図面を用いてさらに説明する： 図１は本発明によるベクターの例示的形態を示す： （ａ）単一治療遺伝子を有する単一Ｔａｔ誘導転写単位； （ｂ）条件付き毒素と、薬物選択マーカー又は第２治療遺伝子用の構成的プロモ ーター（ＳＶ４０）とを有するＴａｔ誘導転写単位； （ｃ）２治療遺伝子とＩＲＥＳとを有する単一Ｔａｔ誘導転写単位；および （ｄ）２治療遺伝子を有し、１つはリボザイムである単一Ｔａｔ誘導転写単位。 図２は（Ａ）本発明によるＭＬＶに基づくＴａｔ誘導ベクターの原理と（Ｂ） ｐＴＩＮ４１４とを示し； 図３Ａと３Ｂとは本発明による特定の原型ベクターｐＴＩＮ５０２とｐＴＩＮ ４１４とを示し； 図４は実施例に用いた種々なレトロウイルスパッケージング成分とベクターと を示し； 図５は実施例２．３からの結果を示し：ＨＩＶ−１感染がＴＩＮベクター５’ ＬＴＲからの発現を誘導する； 図６は実施例２．４からの結果を示し：抗ＨＩＶ ＴＩＮベクターがＨＩＶ− １感染から保護する； 図７は実施例２．５からの結果を示し：単一転写単位ＴＩＮベクターによるＨ ＩＶ−１感染からの保護である。 ＭＬＶとＨＩＶとを含むベクターの特定の例を与える図２Ａは、本発明による ベクターを構築することができる要素を示す。図２Ａは５’末端から、第２レト ロウイルスのＲ領域の少なくとも機能的部分と、第１レトロウイルスのＵ５領域 の全て若しくは機能的部分と、第１鎖逆転写のための第１レトロウイルスの機能 的プライマー結合部位と、第１レトロウイルスの機能的ＲＮＡパッケージング部 位と、第２鎖逆転写のための第１レトロウイルスの機能的プライマー結合部位と 、 治療遺伝子がＤＮＡコピーに挿入されうる部位と、第１レトロウイルスの組込み 系によって認識される短い（１０〜１００ヌクレオチド）配列と、第２レトロウ イルスのＵ３領域の全て若しくは実質的な部分と、５’末端のＲ領域に相当する 第２レトロウイルスのＲ領域とを含むパッケージ可能なＲＮＡゲノムを示す。 図２Ａはさらに、逆転写とベクターの組込みとから得られる組込み済みプロウ イルスを示し、このプロウイルスはセンス鎖上に５’〜３’を表示する下記組成 ：第１レトロウイルスの組込み系によって認識される第１レトロウイルスからの 短い（１０〜１００ヌクレオチド）配列と、第２レトロウイルスのＵ３領域の全 て若しくは実質的な部分と、第２レトロウイルスのＲ領域の機能的部分と、第１ レトロウイルスの組込み系によって認識される、第１レトロウイルスのＵ５領域 の全て若しくは機能的部分と、第１レトロウイルスの機能的パッケージング部位 とプライマー結合部位と、治療遺伝子が第２レトロウイルスのＬＴＲプロモータ ーの制御下にあるように挿入されることができる部位と、第１レトロウイルスか らの機能的第２鎖合成プライマー部位と、第１レトロウイルスの組込み系によっ て認識される第１レトロウイルスからの短い配列（１０〜１００ヌクレオチド） （この短い配列は前の短い配列と同じである）と、第２レトロウイルスのＵ３領 域の全て若しくは実質的な部分（この成分は前のＵ３領域と同じである）と、第 ２レトロウイルスのＲ領域の機能的部分（この成分は前のＲ領域と同じである） と、第１レトロウイルスの組込み系によって認識される、第１レトロウイルスの Ｕ５領域の全て若しくは機能的部分とを有する。 形質導入後に５’ベクターＬＴＲとしてＴａｔ誘導プロモーターを含有するＭ ＬＶに基づくＴａｔ誘導（ＴＩＮ）ベクターの新規なシリーズを、我々は構築し た。ＴＩＮベクターは、ＭＬＶ機構(machinery)によるベクターゲノムの効率的 なパッケージングと、逆転写と、組込みとのために必要であることが予想される 特徴を有する。逆転写中に形成されたハイブリッドＨＩＶ−１／ＭＳＶ５’ＬＴ Ｒは、Ｔａｔの不存在下でヒト細胞中の低レベルの発現を指示するが、Ｔａｔ発 現プラスミドのトランスフェクション又はＨＩＶ−１による感染後には高度に誘 導されるというＨＩＶ−１プロモーターの特徴を有する。形質導入されたＴＩＮ ベクターがＨＩＶ−１感染後に高度に誘導されるというそれらの能力を少なくと も６か月間保有することを実証するデータを、我々は有している。さらに、産生 体細胞（標準ＭＬＶパッケージングライン又は我々の一過性トランスフェクショ ン系（Ｓｏｎｅｏｋａ等，１９９５））における高レベルのベクターゲノムの産 生を促進するために、我々は天然ベクターＭＬＶ ＬＴＲではなくＣＭＶプロモ ーターから駆動されるパッケージ可能なベクター転写体を設計している。 これらのベクターの幾つかの形態が考えられる（図１）。これらのベクターの 中の最も簡単なものはＨＩＶ ＬＴＲ（ａ、ｃ及びｄ）からの治療遺伝子及び／ 又は選択可能な遺伝子の排他的な発現を可能にする。我々は、５’遺伝子のＴａ ｔ誘導発現と、３’遺伝子の構成的発現とを可能にする２つのプロモーターベク ターのシリーズをも構築している（ｂ）。２つのプロモーターＴＩＮベクターは 例えば構成的に発現された薬物耐性遺伝子からの形質導入された細胞の選択と、 ＨＩＶ感染時の治療遺伝子のＴａｔ誘導発現とを可能にする。あるいは、これら のベクターを用いて、ＨＩＶに対する２段階アタックを開始して、１つの抗ＨＩ Ｖ分子の構成的発現と第２遺伝子のＴａｔ誘導発現の両方を可能にすることがで きる。このような使用の例は、トランスドミナントタンパク質の構成的発現と、 感染が細胞に固定するならば自殺遺伝子の“ラスト リゾート（last resort） ”発現である。ＴＩＮベクターにおける多重転写単位の使用はもちろん、多重翻 訳単位を有するが単一ＨＩＶ ＬＴＲ形態の使用も内部リボソーム侵入配列（Ｉ ＲＥＳ）を用いることによって可能である（ｃ）（Ａｄａｍ等，１９９１）。ｍ ＲＮＡの翻訳されない領域に付加的な抗ＨＩＶ成分、例えばリボザイム配列（ｄ ）を組込むことも単一Ｔａｔ誘導転写体の範囲内で可能であると考えられる。図 １において、ベクターの要素は次のように表される：ＨＩＶ−Ｔａｔ−誘導ＨＩ Ｖプロモーター；ＴＫ−チミジンキナーゼ；ＳＶ−ＳＶ４０プロモーター；ネオ 細菌ネオマイシン耐性遺伝子；ＩＲＥＳ内部リボソーム侵入配列；Ｒｚリボザイ ム。 我々はまた、Ｔａｔの不存在下でＨＩＶ ＬＴＲプロモーターからの低い基底 レベルの転写が下流の構成的プロモーターを干渉する問題を軽減し、形質導入済 み細胞における構成的遺伝子の安定な発現を容易にすることも予想している。Ｔ ａｔの不存在下におけるＨＩＶプロモーターの不活化も、これらのベクターの重 要な安全性であり、組込まれたベクターに隣接する下流細胞遺伝子の不適当な転 写の危険性を最小にする。 この系の明らかな利点は、標準的なＭＬＶに基づくベクターテクノロジーによ って形質導入されることができる単純な転写単位からの遺伝子発現のＨＩＶ制御 を達成することである。この系を生成するために必要な成分の組合せは今までに 組み立てられていない。ＭＬＶに基づくＴａｔ誘導（ＴＩＮ）ベクターの成分 我々は標準的ＭＬＶ成分によってパッケージ可能である一連のベクターを構築 しているが、これらは逆転写されることができ、細胞の感染又は形質導入後にＭ ＬＶ機構によって組み込むことができ、形質導入済みベクターから治療遺伝子の Ｔａｔ誘導発現を可能にする。このようなベクターの基本的成分は次のとおりで ある（図２）： １．Ｔａｔ誘導性．ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターのＴａｔ誘導性はこのプロモ ーターのＵ３領域における配列と、またＲにおけるＴＡＲ要素との性質である（ ＢｅｒｋｈｏｕｔとＪｅａｎｇ，１９９２）。さらに、ＨＩＶ−２からのＵ３領 域とＲＳＶとを包含する、幾つかの他のプロモーターもＨＩＶ−１ Ｕ３領域に 代わって、Ｔａｔトランス活性化を可能にする（Ｌｉｕ等，１９９４）。逆転写 後に５’ＬＴＲにおいてＵ３要素が出現するためには、Ｕ３要素がウイルスＲＮ Ａの３’ＬＴＲ中に存在しなければならない。それ故、このベクターはＨＩＶ Ｕ３と５’ＬＴＲにおけるＲ配列とを含有する。 ２．逆転写．ＭＬＶ ＲＴはプライマー結合部位（ＰＢＳ）において逆転写を 開始する。初期（−）鎖合成はＵ５及びＲ配列に伸長して、第１“ストロング ストップ(strong stop)”ＤＮＡ鎖を形成する。次に、ＲＴのＲＮＡｓｅＨ部分 がこのハイブリッド中のＲＮＡを分解し、暴露されたＤＮＡをプロウイルスの３ ’ＬＴＲ中の相同Ｒ領域とハイブリダイズすることを可能にする。５’と３’Ｒ 領域の相同はポリメラーゼが鎖を切り替えて、３’ＬＴＲから（−）鎖に沿って 合成を続けることを可能にする。（＋）鎖ＤＮＡ合成はゲノムＲＮＡ鎖のＲＮＡ ｓｅ分解後のポリプリントラクト(tract)におけるＲＮＡフラグメントの選択的 保有によって開始される（ＫａｔｚとＳｋａｌｋａ，１９９４において考察）。 それ故、ベクターに含有されるＭＬＶポル指示(directed)逆転写のための最小必 要条件は（−）鎖ＤＮＡ合成を開始するためのＰＢＳと、（＋）鎖ＤＮＡ合成を 開始するためのＰＰＴと、第１鋳型切り替えを可能にするための同じ５’Ｒ配列 と３’Ｒ配列である。同じＲ配列のための必要条件は、５’ＬＴＲと３’ＬＴＲ の両方にＨＩＶ Ｒ配列を有することによって満たされる。さらに、５’Ｕ５領 域における第２構造も逆転写の開始のために重要であることを示唆する証拠が存 在するので（Ｃｏｂｒｉｎｋ等，１９９１）、我々はＭＬＶ Ｕ５配列を５’Ｌ ＴＲ中に維持している。３’Ｕ５配列はゲノムＲＮＡ転写体中に出現しないが； ゲノム転写中の３’Ｒ／Ｕ５ボーダーにおける正確な停止を保証するために、我 々は３’ＬＴＲにＨＩＶ Ｕ５領域を用いる。 ３．組込み．逆転写分子の末端は、レトロウイルスインテグラーゼが認識する ２〜２３ｂｐの短い、時には不完全な、逆位反復配列を含有する（ＫａｔｚとＳ ｋａｌｋａ，１９９４において考察）。ＭＬＶに関しては、線状モデル基質の末 端における９塩基のみでｉｎ ｖｉｔｒｏ組込み分析系におけるほぼ野生型レベ ルの組込みのために充分であることが実証されている（ＢｕｓｈｍａｎとＣｒａ ｉｇｉｅ，１９９０）。これらの配列はベクターの３’Ｕ３領域と５’Ｕ５領域 と末端から駆動される。この必要条件は３’Ｕ３の５’末端におけるＭＬＶ配列 の３６塩基と、ＭＬＶ５’Ｕ５領域の全体とを含有するベクターによって満たさ れる。 ４．パッケージング成分．レトロウイルス粒子中へのベクターゲノミの効率的 なパッケージングはシス作用性配列の数に依存する（ＬｉｎｉａｌとＭｉｌｌｅ ｒ，１９９０において考察）。最も重要な配列はパッケージングシグナル、即ち 、ゲノムの５’領域におけるＲＮＡの高度に組織化された領域(highly structur ed region)である。さらに、ｇａｇ ｐ１５における配列を含めて、ゲノムの他 の領域はパッケージング効率を高めることが判明している。この領域は例えばＬ ＸＳＮのような標準的ＭＬＶレトロウイルスベクターに包含され（Ｍｉｌｌｅｒ とＲｏｓｍａｎ，１９８９）、我々の構築体にも保持される。 ５．一過性トランスフェクション後の高力価レトロウイルスストック 我々は最近、一過性トランスフェクションによって高力価レトロウイルスベク ター（１０⁷／ｍｌ）を迅速に産生するための系を考案している（Ｓｏｎｅｏｋ ａ等，１９９５）。この系の重要な特徴は、強力なＣＭＶプロモーターが産生体 細胞ラインにおけるベクターＲＮＡの高レベル発現を駆動しており、ベクターＲ ＮＡの転写開始部位が通常のＬＴＲ指示開始部位と正確に同じであるように配置 されていることである。これを達成するために、我々は５’ＬＴＲにおけるＨＩ Ｖ Ｒ領域の開始に隣接するその転写開始部位までにＣＭＶプロモーターを配置 している。この原理は、レトロウイルス転写単位の統合性が維持される限り、他 の異種プロモーターにも適用されることができる。 この系はハイブリッドＭＬＶ−ＨＩＶベクターに関して述べられているが、同 じ原理が他のレトロウイルス組合せにも適用されることができ、この場合には１ つのレトロウイルスはトランスで与えられるそれ自身のパッケージング成分（例 えば、ＳＮＶ、ＲＳＶ、ＡＳＬＶ等）によって必要とされるシス作用性配列に寄 与し、他方のレトロウイルスはそのＬＴＲプロモーターの条件付き発現という性 質のために用いられる。このようなレトロウイルスプロモーターの他の例はＨＴ ＬＶ−１プロモーター（Ｔａｘタンパク質に依存する）とステロイド−ホルモン 誘導ＭＭＴＶ ＬＴＲ（Ｍａｊｏｒｓ，１９９０において考察）である。例えば 、自殺遺伝子の発現を指示するためのＨＴＬＶ−１ ＬＴＲの使用は、成人Ｔ細 胞白血病の治療法としての用途を見い出すことができる。 実施例 実施例１構築の詳細 これらの実施例に用いられる種々なレトロウイルスパッケージング成分とベク ターとを図４に示す。プラスミドｐＨＩＴ６０はＭＬＶｇａｇ−ｐｏｌ発現プラ スミドである（Ｓｏｎｅｏｋａ等，１９９５）。ｐＨＩＴ４５６はプラスミドＳ Ｖ−Ａ−ＭＬＶ−ｅｎｖに由来するＭＬＶアンホトロピックエンベロープ発現プ ラスミドであり（Ｐａｇｅ等，１９９０）、エコトロピック(ecotropic)発現構 築体ｐＨＩＴ１２３と本質的に同じである（Ｓｏｎｅｏｋａ等，１９９５）。レ トロウイルスベクターｐＨＩＴ１１１（Ｓｏｎｅｏｋａ等，１９９５）はＬＺＳ Ｎの誘導体であり（Ａｄａｍ等，１９９１）、ｐＴＩＮ４１４はＴＩＮベクター 同等物である。これに続くＴＩＮベクターは特有のＳｐｅｌ部位とＮｈｅｌ部位 との間の内部配列の置換によってｐＴＩＮ４１４から誘導された。Ｓｐｅｌ部位 はｌａｃＺ遺伝子の上流の翻訳されないｇａｇコーディング領域内に配置され、 Ｎｈｅ１部位はＭＬＶ配列とＨＩＶ−１配列の接合部における３’Ｕ３領域に存 在する。プラスミドｐＴＩＮ５００はｐＢＡＢＥｐｕｒｏからのＳｐｅｌ−Ｎｈ ｅｌ内部フラグメントを含有する。ベクターｐＴＩＮ５０１は、フランキングＥ ｃｏＲ１部位を組込み、ｐＴＩＮ５００の固有ＥｃｏＲＩクローニング部位中に 挿入されたＰＣＲプライマーを用いてプラスミドｐＭ１０（Ｍａｌｉｎ等、１９ ８９）から増幅されたＲｅｖＭ１０コーディング配列を含有する。ｐＴＩＮ５０ ２は、ｐＴＩＮ５０１からＳＶ４０プロモーターとプロマイシン（ｐｕｒｏ）耐 性遺伝子とをこのカセットに隣接するＡｃｃ１部位を用いて除去することによっ て生成された。 原型ＴＩＮベクターの２つを図３に示す。図３Ａは単純な１つの遺伝子ＴＩＮ ベクター、ＴＩＮ５０２を示すが、これはトランスドミナントＲｅｖタンパク質 ＲｅｖＭ１を発現する（Ｍａｌｉｍ等，１９８９）。図３Ｂは、内部ＳＶ４０プ ロモーターからのネオマイシン耐性を構成的に発現し、ＨＩＶ ＬＴＲの制御下 でＬａｃＺ発現を有する２つのプロモーターベクターＴＩＮ４１４を示す。ＴＩ Ｎ４１４の詳細な構築を例として以下に示す。図３Ａと３Ｂでは、ＨＩＶ−１配 列の番号付けはＨＸＢ２に関するＬｏｓ Ａｌａｍｏｓデータベース転換による ものである。ＭＬＶ誘導配列は、ベクターＬＸＳＮ名称によって番号付けされた （Ａ）ベクターＬＸＳＮ（Ｇｅｒｂａｎｋ受入番号Ｍ２８２４８）と；（Ｂ）ベ クターＬＺＳＮ（Ａｄａｍ等，１９９１）からのものである。（Ａ）におけるＲ ｅｖＭ１０はＥｃｏＲ１制限部位を含有するプライマーを用いて、プラスミドｐ Ｍ１０（Ｍａｌｉｎ等，１９８９）から増幅された。ＴＩＮ４１４の詳細な構築 ＣＭＶプロモーターと、ＭＬＶベクターＬＺＳＮ（Ａｄａｍ等，１９９１）と ＨＩＶ−１プロウイルスクローンＷ１３（Ｋｉｍ等，１９８９）とに由来する配 列の位置(co-ordinate)が表示される。標準的組換えＤＮＡ技術とさらに、分子 の異なる部分の間の正確な接合を生成するための組換えＰＣＲとを用いて、分子 が生成される（Ｈｉｇｕｃｈｉ，１９９０）。 具体的には、 １．５’ＣＭＶ駆動ＬＴＲの構築 プラスミドｐＰＥ６１１（Ｂｒａｄｄｏｃｋ等，１９８９）はＨＩＶ−１ Ｒ 領域の始点（位置＋１〜＋８０）に正確に結合したヒトＣＭＶプロモーター（− ５２１から＋１まで）を含有する。このプラスミドからのＸｂａＩ−ＢａｍＨ１ フラグメントをクローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇ ｅｎｅ）に連結して、プラスミドｐＲＶ４０４を得た。鋳型としてプラスミドｐ ＬＮＳＸを用いて、プライマー５’−ｇｃｇａｇｃｔａｇｃｔｔｃｇａａｔｃｇ ｔｇｇｔｃｔｃｇｃｔｇｔｔｃｃｔｔｇｇ−３’−［配列番号：１］と５’−ｇ ｇｃｃｇｃｔａｇｃｇｔｔｃａｇａａｃｔｃｇｔｃａｇｔｔｃｃａｃｃａｃ−３ ’［配列番号：２］とを用いて、実施した。このようにして得られたＰＣＲ生成 物をＮｈｅＩによって消化させて、そのＮｈｅＩ部位においてｐＲＶ４０４に連 結して、プラスミドｐＲＶ４０５を得た。配列５’−ｔｔａａｇｃｃｔｃａａｔ ａａａｇｃｔｔｇｃｃｔｔｇａｇｔｇｃｔｔｃａｔｃ−３’［配列番号：３］と ５’−ｃｇｇａｔｇａａｇｃａｃｔｃａａｇｇｃａａｇｃｔｔｔａｔｔｇａｇｇ ｃ−３’［配列番号：４］の２つのオリゴヌクレオチドを一緒にアニールして、 ＡｆｌｌｌとＢｓｔＢ１の上に存在するオーバーハング(overhangs)に対応する いずれかの端部に一本鎖領域を含有する短い二重鎖（duplex）を形成した。この 分子をＡｆｌｌｌとＢｓｔＢ１によって切断されたプラスミドｐＲＶ４０５に連 結して、プラスミドｐＲＶ４０６を得た。 ２．３’ＬＴＲの構築 ｐＬＮＳＸからのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩフラグメントをクローニングベク ターｐＳＰ７２に連結して、プラスミドｐＲＶ４００を得た。プラスミドｐＢＸ ＋は、ＨＩＶ−１ゲノムからの全３’ＬＴＲを含有するＷ１３からのＢａｍＨＩ −ＸｂａＩフラグメントを含有する。ＰＣＲ増幅をプライマー５’−ｃｃｇｃｇ ｃｔａｇｃｇａｔａｔｃｃｔｔｇａｔｃｔｇｔｇｇａｔｃｔａｃｃａｃ−３’［ 配列番号：５］と５’−ｇｃｇａｇｇｇｔａｃｃｇｔｃｇａｃｔｇｃｔａｇａｇ ａｔｔｔｔｃｃａｃａｃｔｇａｃ−３’［配列番号：６］を用いてｐＢＸ＋上 で実施した。ＰＣＲ生成物をＫｐｎＩとＮｈｅＩとによって消化させて、Ｋｐｎ ＩとＮｈｅＩとによって消化されたプラスミドｐＲＶ４００に連結して、プラス ミドｐＲＶ４０１を得た。ｐＲＶ４０１のＣｌａＩ−ＫｐｎＩフラグメントを、 ＣｌａＩとＫｐｎＩとによって消化されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに連結して、 プラスミドｐＲＶ４０８を得た。 ３．内部配列の添加 ｐＲＶ４０６からのＳａｃＩＩ−ＳｐｅＩフラグメントをプラスミドｐＲＶ４ ０８に連結して、プラスミドｐＲＶ４１２を形成した。ｐＲＶ４１２からのＳｐ ｅＩ−ＮｈｅＩフラグメントをＬＺＳＮからのＳｐｅＩ−ＮｈｅＩフラグメント と置換して、ベクターｐＴＩＮ４１４を得た。 実施例２特徴付け １．ベクターＴＩＮ４１４は標準ＭＬＶ成分によって効率的に形質導入される 我々が以前に発表したプロトコール（Ｓｏｎｅｏｋａ等，１９９５）に従って ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって、レトロウイルスベクター を生成した。２つのプラスミド成分−ｇａｇ−ｐｏｌ発現プラスミド（ｐＨＩＴ ６０）とアンホトロピック又はエコトロピックエンベロープ構築体（それぞれ、 ｐＨＩＴ４５６又はｐＨＩＴ１２３）上に、ＭＬＶパッケージング成分をトラン スで供給する。ベクターゲノム成分は標準ＭＬＶベクター（ｐＨＩＴ１１１）又 は同等なＴＩＮベクター、ｐＴＩＮ４１４であった。トランスフェクションの４ ８時間後に培養上清を回収し、０．４５μｍフィルターに通して濾過して、８μ ｇ／ｍｌポリブレンの存在下でターゲット細胞に形質導入するために４時間用い た後に、新鮮な培地を添加した。トランスフェクションの４８時間後に得られた ウイルスストックを用いて、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（エコトロピックエンベロープ） 又はＨｅＬａ細胞（アンホトロピックエンベロープ）を感染させ、Ｇ４１８（０ ．４ｍｇ／ｍｌ）によって選択されたコロニーに安全に形質導入した。１０日間 の選択後に各レトロウイルスストックの力価を、Ｓｏｎｅｏｋａ等，１９９５の 記載に従って算出した（表１）。これらのデータから、ベクターＴＩＮ４１４が 関連するＭＬＶベクターＨＩＴ１１１と丁度同じように効率的に形質導入される こ とが理解できる。このことは、ＴＩＮベクター構築体がＭＬＶによって効率的に パッケージされ、逆転写され、組込まれることを実証する。 ２．形質導入済みベクターＴＩＮ４１４からのＬａｃＺ発現はＴａｔ誘導性であ る ベクターｐＨＩＴ１１１又はｐＴＩＮ４１４によって形質導入されたＧ４１８ 耐性ＨｅＬａ及びＮＩＨ３Ｔ３細胞の集団を上述したように製造して、ＨｅＬａ −１１１、３Ｔ３−４１４等と名付けた。これらの集団は内部ＳＶ４０プロモー ターからのネオマイシン耐性の発現のために、Ｇ４１８に対して十分に耐性であ った。β−ガラクトシダーゼ活性のレベルを４集団の全てにおいて、Ｔａｔ発現 プラスミド又は対照ＣＭＶベクタープラスミドによるトランスフェクション後に 測定した。表２に示す結果は、Ｔａｔの不存在下ではＴＩＮ４１４ＨＩＶＬＴＲ プロモーターからのβ−ガラクトシダーゼ活性レベルが低いが、ＨｅＬａ細胞中 のＴａｔによって発現が非常に増大することを実証する。予想されたように、Ｔ ａｔは齧歯類ＮＩＨ３Ｔ３細胞ライン中ではＨＩＶＬＴＲ活性に殆ど影響を与え なかった。このことは抗ＨＩＶ治療遺伝子のＴａｔ仲介誘導のモデル系を表す。 ３．ベクターＴＩＮ４１４からのＬａｃＺ発現はＨＩＶ感染によって誘導可能で ある ｐＴＩＮ４１４、ｐＨＩＴ６０及びｐＨＩＴ４５６又はｐＨＩＴ１１１、ｐＨ ＩＴ６０及びｐＨＩＴ４５６を上記のように２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし た。上清を用いて、前単球細胞ラインＵ９３７にｐＨＩＴ１１１（図５Ａ〜Ｃ） 又はｐＴＩＮ４１４（図５Ｄ〜Ｆ）によって形質導入した。Ｕ９３７細胞はＣＤ ４＋であり、ＨＩＶ−１によって効率的に感染されることができる。ネオマイシ ン耐性集団をＧ４１８によって１４日間選択して、十分に形質導入された集団を 得て、標準β−ガラクトシダーゼ染色方法を用いてＬａｃＺ発現に関して分析し た（図５Ｂと５Ｅ）。Ｕ９３７−ＨＩＴ１１１集団は高レベルのｌａｃＺ発現（ 約２．５％の細胞が目視可能に青色に染色）を示したが、Ｕ９３７−ＴＩＮ４１ ４集団は示さなかった（＜０．１％細胞が目視可能に青色）。各集団からの２ｘ １０⁶細胞をペレット化し、細胞を１ｍｌの６ｘ１０⁵ＴＣＩＤ５０含有ＨＩＶ_{11 1B} ウイルス（１μｇ／ｍｌｐ２４）中に再懸濁させることによってＨＩＶ−１ に感染させた。３７℃における２時間のインキュベーション後に、さらに５ｍｌ の培地を細胞に加えて、細胞を４日間インキュベートして、ウイルス拡散を可能 にした。上清のサンプルを３〜４日間毎に採取して、既述されたように（Ｃａｎ ｎｏｎ等，１９９４）Ｑｕａｎｔ−Ｔ ＲＴキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用い て逆転写酵素（ＲＴ）活性に関して分析した（図５ＡとＤ）。さらに、細胞のサ ンプルを種々な時点において採取して、固定細胞のＸ−ｇａｌ染色（図５ＢとＥ ）と細胞抽出物中の酵素活性に関する発光分析（図５ＣとＦ−ＲＬＵは相対的光 単位である）の両方を用いてβ−ガラクトシダーゼ発現に関して分析した。Ｕ９ ３７−ＨＩＴ１１１集団におけるβ−ガラクトシダーゼ発現は感染後１０日目ま で青色に見える約２．５％細胞に一定に留まり、１４日目に最大１１％までの上 昇が観察された。これとは対照的に、Ｕ９３７−ＴＩＮ４１４集団におけるβ− ガラクトシダーゼ発現はＨＩＶ−１感染後高度に誘導され、未感染集団における ＜０．１％の青色染色細胞から感染後１４日目の９６％まで上昇し、この集団に おけるＨＩＶ−１感染の拡散を示した。発光分析でモニターしたβ−ガラクトシ ダーゼ活性も同様に上昇した。１４日目における酵素活性量の比較はＵ９３７− ＨＩＴ１１１集団に関しては１．７の感染：未感染比を生じたが、Ｕ９３７−Ｔ ＩＮ４１４集団は感染細胞の１０２倍の増加を示した。これらのデータはＨＩＶ −１感染後のＴＩＮ４１４におけるＴＩＮベクター５’ＬＴＲからの発現の誘導 を実証する。ｌａｃＺを抗ＨＩＶ遺伝子に置換した場合には、細胞がＨＩＶに感 染すると、抗ＨＩＶ遺伝子も誘導されると考えられる。 ４．抗ＨＩＶ ＴＩＮベクターによるＨＩＶ−１感染からの保護 ｐＴＩＮ５０ １は、内部薬物選択カセット（プロマイシン）と共に、Ｔａｔ誘導プロモーター から駆動されるトランス−ドミナント突然変異タンパク質ＲｅｖＭ１０を含有す る（Ｍａｌｉｎ等，１９８９）。ＲｅｖＭ１０は、構成的に発現されたときに又 はＨＩＶ−１ ＬＴＲプロモーターの制御下にあるときの両方で、ＨＩＶ−１感 染から細胞を保護することが既に判明している。ｐＴＩＮ５０１の形質導入後に 、ＲｅｖＭ１０発現はＴａｔ誘導５’ベクターＬＴＲの制御の下にあると考えら れる。 ｐＴＩＮ５０１（■）と親ベクターｐＴＩＮ５００（□）をＵ９３７細胞に形 質導入し、１．５μｇ／ｍｌにおける１０日間のプロマイシン（Ｓｉｇｍａ）中 での選択によって安定な集団を得た。各集団からの２ｘ１０⁶細胞を５ｘ１０⁶Ｔ ＣＩＤ₅₀／ｍｌにおいて２０μｌ（Ａ）又は２００μｌ（Ｂ）のＨＩＶ−１_111B ウイルスストックで感染させ、この感染を３日間毎にＲＴ活性に関して培養上清 を分析することによってモニターした。ＴＩＮ５０１集団においてはＴＩＮ５０ ０集団に比べて、これらの細胞における抗ウイルスＲｅｖＭ１０タンパク質の誘 導のために、ウイルス複製速度は顕著に減少した（図６）。このことはこのＴａ ｔ誘導形態におけるＲｅｖＭ１０の保護効果を実証する。ＴＩＮベクターＬＴＲ における可能なＴａｔデコイの存在にも拘わらず、我々は非形質導入Ｕ９３７集 団（データ示さず）に比べてＴＩＮ５００形質導入した細胞の有意な保護を観察 しなかった。 ５．単一転写単位ＴＩＮベクター ベクターｐＴＩＮ５０２（■）をＵ９３７細 胞に、１回（図７Ａ）又は３回（図７Ｂ）連続ラウンドの形質導入によって投与 した。ｐＨＩＴ１１１を受容した同じ集団を用いて、１回ラウンドの形質導入の 形質導入度(transduction frequency)を細胞の１０〜３０％と推定した（データ 示さず）。さらに、対照Ｕ９３７集団をベクターｐＴＩＮ４１４（□）によって 形質導入した。多数回ラウンドの形質導入を用いた場合には、細胞を４８時間毎 に新鮮なレトロウイルスベクターストックに暴露させた。最終形質導入から４８ 時間後に、薬物選択の不存在下で、ＴＩＮ４１４形質導入集団とＴＩＮ５０２形 質導入集団の各々の２ｘ１０⁶細胞を５ｘ１０⁶ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌにおいて２００ μｌのＨＩＶ−１_111Bウイルスストックで感染させ、ウイルス拡散を数時間にわ たって培養上清中のＲＴ活性の分析によってモニターした（図７）。ＴＩＮ５０ ２−形質導入集団は対照のＴＩＮ４１４集団に比べて明らかに保護されたが（図 ７Ｂ）、これは多数回ラウンドの形質導入に依存し、ＴＩＮ５０２による１回の みの形質導入細胞の保護は存在しなかった。選択されたＴＩＮ５０１集団に比べ て多数回形質導入されたＴＩＮ５０２集団においても観察された低いレベルの保 護（図６）は、恐らく、ＴＩＮ５０２集団における形質導入されなかった細胞の 存在によると考えられた。 参考文献 Adam,M.A.,N.Ramesh,A.D.Miller and W.A.Osborne.(1991).J.Virol. 65:4985-4990. 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【手続補正書】特許法第１８４条の４第４項 【提出日】１９９６年１２月１７日 【補正内容】 請求の範囲 １．ＤＮＡプロウイルスの形状であるときに宿主細胞ゲノム中に挿入される ことができ、ＤＮＡプロウイルス中に（ａ）調節因子によって誘導可能である調 節されたプロモーターと、（ｂ）（ａ）におけるプロモーターの転写制御下にあ る選択された遺伝子（単数又は複数）とを与える配列を含むパッケージ可能なＲ ＮＡゲノムを含む、第１レトロウイルスに基づくレトロウイルスベクターであっ て、第１レトロウイルスのＵ３およびＲの５’ＬＴＲプロモーター機能の代わり に、調節されたプロモーター（ａ）がプロウイルスの５’末端反復配列（ＬＴＲ ）中に存在し、選択された遺伝子（単数又は複数）（ｂ）がＬＴＲの間に配置さ れている上記レトロウイルスベクター。 ２．調節されたプロモーター（ａ）が第２レトロウイルスから調節タンパク 質によって誘導可能である、請求項１記載のレトロウイルスベクター。 ３．選択された遺伝子が第１治療遺伝子である、請求項１又は請求項２に記 載のレトロウイルスベクター。 ４．調節されたプロモーターが第２レトロウイルスのＵ３とＲ、又はそれら の機能部分を含む、請求項２又は請求項３に記載のレトロウイルスベクター。 ５．第１レトロウイルスがＭＬＶである、請求項１〜４のいずれかに記載の レトロウイルスベクター。 ６．第２レトロウイルスがＨＩＶである、請求項２〜５のいずれかに記載の レトロウイルスベクター。 ７．構成プロモーターと、第２治療遺伝子又は選択可能なマーカー遺伝子と の発現カセットをさらに含む、請求項１〜６のいずれかに記載のレトロウイルス ベクター。 ８．同じ又は異なる転写単位上に存在する複数個の治療遺伝子を含む、請求 項１〜７のいずれかに記載のレトロウイルスベクター。 ９．調節因子の不在下において、ＤＮＡプロウイルスからの選択された遺伝 子（単数または複数）の低い基底発現が存在する、請求項１〜８のいずれかに記 載のレトロウイルスベクター。 １０．プロモーターの制御下にある、請求項１〜９のいずれかに記載のレト ロウイルスベクターに関してパッケージ可能なＲＮＡゲノムをコードするＤＮＡ 構築体。 １１．プロモーターが第１又は第２レトロウイルス以外のソースに由来する 、請求項１０記載のＤＮＡ構築体。 １２．プロモーターがＣＭＶプロモーターである、請求項１０又は請求項１ １記載のＤＮＡ構築体。 １３．選択された遺伝子が存在せず、構築体が選択された遺伝子（単数又は 複数）が挿入されうる挿入部位を有する、請求項１０〜１２のいずれかに記載の ＤＮＡ構築体。 １４．請求項１０〜１３のいずれかに記載のＤＮＡ構築体によってトランス フェクトされたパッケージング細胞ラインを含み、請求項１〜９のいずれかに記 載にレトロウイルスベクターを産生することができるレトロウイルスベクター産 生系。 １５．ターゲット細胞の感染又は形質導入の遺伝子療法のための、請求項２ 〜９のいずれかに記載のレトロウイルスベクターの使用。 １６．請求項１５記載の方法から生じるターゲット細胞。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:92） (72)発明者 キングスマン，スーザン・メアリー イギリス国オックスフォードシャー オー エックス５・２エスエフ，イスリップ，ミ ドル・ストリート，グレイストーンズ (72)発明者 キャノン，ポーラ・マリー アメリカ合衆国カリフォルニア州90033− 0800，ロサンジェルス，イーストレイク・ アベニュー 1441，ノリス・キャンサー・ センター，ユーエスシー・スクール・オ ブ・メディスン，ジーン・セラピー・ラボ ラトリーズ内

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＤＮＡプロウイルスの形状であるときに宿主細胞ゲノム中に挿入される ことができ、ＤＮＡプロウイルス中に（ａ）調節因子によって誘導可能である調 節されたプロモーターと、（ｂ）（ａ）におけるプロモーターの転写制御下にあ る選択された遺伝子（単数又は複数）とを与える配列を含むパッケージ可能なＲ ＮＡゲノムを含む、第１レトロウイルスに基づくレトロウイルスベクターであっ て、第１レトロウイルスの５’ＬＴＲプロモーター機能の代わりに、調節された プロモーター（ａ）がプロウイルスの５’末端反復配列（ＬＴＲ）中に存在し、 選択された遺伝子（単数又は複数）（ｂ）がＬＴＲの間に配置されている上記レ トロウイルスベクター。 ２．調節されたプロモーター（ａ）が第２レトロウイルスから調節タンパク 質によって誘導可能である、請求項１記載のレトロウイルスベクター。 ３．選択された遺伝子が第１治療遺伝子である、請求項１又は請求項２に記 載のレトロウイルスベクター。 ４．調節されたプロモーターが第２レトロウイルスのＵ５とＲ、又はそれら の機能部分を含む、請求項２又は請求項３に記載のレトロウイルスベクター。 ５．第１レトロウイルスがＭＬＶである、請求項１〜４のいずれかに記載の レトロウイルスベクター。 ６．第２レトロウイルスがＨＩＶである、請求項２〜５のいずれかに記載の レトロウイルスベクター。 ７．構成プロモーターと、第２治療遺伝子又は選択可能なマーカー遺伝子と の発現カセットをさらに含む、請求項１〜６のいずれかに記載のレトロウイルス ベクター。 ８．同じ又は異なる転写単位上に存在する複数個の治療遺伝子を含む、請求 項１〜７のいずれかに記載のレトロウイルスベクター。 ９．プロモーターの制御下にある、請求項１〜８のいずれかに記載のレトロ ウイルスベクターに関してパッケージ可能なＲＮＡゲノムをコードするＤＮＡ構 築体。 １０．プロモーターが第１又は第２レトロウイルス以外のソースに由来する 、請求項９記載のＤＮＡ構築体。 １１．プロモーターがＣＭＶプロモーターである、請求項９又は請求項１０ 記載のＤＮＡ構築体。 １２．選択された遺伝子が存在せず、構築体が選択された遺伝子（単数又は 複数）が挿入されうる挿入部位を有する、請求項９〜１１のいずれかに記載のＤ ＮＡ構築体。 １３．請求項９〜１２のいずれかに記載のＤＮＡ構築体によってトランスフ ェクトされたパッケージング細胞ラインを含み、請求項１〜８のいずれかに記載 にレトロウイルスベクターを産生することができるレトロウイルスベクター産生 系。 １４．ターゲット細胞の感染又は形質導入の遺伝子療法のための、請求項２ 〜８のいずれかに記載のレトロウイルスベクターの使用。 １５．請求項１４記載の方法から生じるターゲット細胞。